NO154015B

NO154015B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av et krystallinsk, antibiotisk virksomt cefalosporinderivat.

Info

Publication number: NO154015B
Application number: NO772960A
Authority: NO
Inventors: Kenzo Naito; Kazuo Tsukamura; Haruo Sinbo
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1976-08-31
Filing date: 1977-08-26
Publication date: 1986-03-24
Also published as: NO154015C; NL7709614A; NL189355B; DK151340B; HK27784A; DE2738711C2; US4146710A; FR2364922A1; JPS603314B2; JPS5329913A; BE858296A; SE426069B; CA1102310A; MY8500266A; NL189355C; GB1589841A; SE7709745L; FR2364922B1; DK151340C; BG60439B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av

et krystallinsk, antibiotisk virksomt cefalosporinderivat med formelen:

hvor n er et tall fra 0,1 til 4.

Det er tidligere kjent at en forbindelse med formelen:

har utmerket antibiotisk aktivitet (norsk patent 150.083). En av ulempene med forbindelsen med formel (II) er at dens rensing er meget vanskelig p.g.a. nærværet av to basiske grupper, dvs. iminothiazolin og dimetylamino, og en karboksylgruppe i mole-' kylet, foruten dens høye vannoppløselighet. En annen ulempe er dens utilfredsstillende lagringstid ettersom det er ustabilt i form av fri syre (zwitter-ion) eller dens salt med en base.

Forbindelsen med formel I oppnås i meget stabil

tilstand, og forbindelsen kan utvinnes i krystallinsk form slik at de urenheter som ellers vanskelig lar seg fjerne ved vanlige rénsningsmetoder, nesten fullstendig er fjernet. Forbindelsen med formel I innbefatter ikke mer enn 4 molekyler vann. Det er fire forskjellige hydrater fra mono- til tetra-hydrater, det er også tilfelle hvor mindre enn et molekyl vann blir absorbert og/eller innbefattet, avhengig av fremstillingsbetingelsene,

og selv i slike tilfelle kan forbindelsen utvinnes og isoleres som krystaller. De krystallinske forbindelsene kan inneholde mindre enn et

molekyl av absorbert og/eller inkorporert vann. Normalt vil forbindelsen med formel I hvor vanninnholdet er bestemt ved Karl Fischer's metode til å være mer enn 1%, vise krystallinsk form i et pulver-røtgendiffraksjonsmønster, og forbindelsen med formel I hvor vanninnholdet er mer enn ca. 0, 3%, viser krystal-linsk form under observering i et polariserende mikroskop. Symbolet n i den krystallinske forbindelsen (I) er i området 0,1 < n < 4, fortrinnsvis 1 < n < 4, og det ifølge oppfinnelsen fremstilte krystallinske produkt er rent og stabilt. Sett fra et kommersielt synspunkt er slike produkter ønskelige hvor n-verdien er 1 eller 2. Forbindelsen med formel I kan også inneholde mindre mengder av et oppløsningsmiddel brukt under i"iaksj oiR-'M, f.eks. metanol, otan^i , propancl eller aceton.

Forbande i sene med forme 1 I et g-~'ab i ie , krystallinske 2 HCl-salter og er nye. I nevnte norske patent 150.083 beskrives farmasøytisk akseptable salter av utgangs-materiale (II) i foreliggende fremgangsmåte, men de angitte, stoffer er bare alkalisalter som ikke-toksiske kationiske salter, basiske aminosyresalter og polyhydroksyalkylaminsalter (forbindelse 28 i eksempel 23 er et natriumsalt), og omfatter ingen angivelse av forbindelsenes syreaddisjonssalter. Videre er alle de kommersielt tilgjengelige cefalosporinforbindelsene enten natriumsalter eller betainformer derav, og intet produkt i form av syreaddisjonssaltene er faktisk på markedet.

Det har vært en vanlig oppfatning at cefalo-sporinforbindelser inkludert utgangsmaterialene (II) var ustabile og tilbøyelige til å bli påvirket av syrer (se Journal of Antibiotic XXVII (197*0, 1000; J.M.C. 8, 22 (1965); J.M.C. 10, 966 (1967), og derfor ville ingen forutse oppnåelsen av forbindelsene med formel I ved omsetning av nevnte utgangs-forbindelser (II); som er sure forbindelser, og hvis vandige oppløsninger viser en pH-verdi på 5,8, med en sterk syre som HC1 (i dette tilfellet vil reaksjonssystemets pH-verdi være under 1,5).

Utgangsmaterialene (II) kan ikke anta noen krys tallinsk form i den frie syretilstand (som zwitter-ion) eller i salttilstand med et alkali slik som natriumsalt. De kan ikke krystalliseres selv etter fremstilling av salter med forskjellige syrer slik som f.eks. D-kamfer-10-sulfonsyre, vin-syre, sitronsyre, p-toluensulfonsyre, adipinsyre, metansulfon-syre, sulfonsyre, salpetersyre, eddiksyre, fosforsyre og trifluoreddiksyre, eller selv ved fremstilling av monohydrokloridet. Man har hor foretatt et forsøk som fremgår fra det senere angitte forsøk I. Kun dihydrokloridet antar en krystallinsk form (se se:-. -:'.gii-<- h ■ :;éV TT).

Utgangsmaterialet (II) har to basiske grupper

i dets acylradikal ved 7-stillingen:

og en basisk gruppe i dets 3-stilling, -CH2CH2N(CHy)2) og derfor kan dette materiale teoretisk reagere med tre syregrupper. Ikke desto mindre ble dihydrokloridet oppnådd som krystaller, hvilket virkelig var uventet.

Forbindelsen med formel I er meget stabil sammen-lignet med den frie form og alkalisaltformen av materialet (II)

(se senere angitte forsøk III), og har meget gode egenskaper egnet som legemiddel.

Forbindelsen med formel I fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at man (1) omsetter en forbindelse med formelen:

eller et salt derav, med minst to molekvivalenter HC1,

i nærvær av vann og eventuelt et organisk oppløsnings-middel for dannelse av et krystallinsk eller et amorft produkt, og (2) når et krystallinsk produkt dannes,

om nødvendig, fulgt av at man tørker produktet, og når et amorft produkt dannes, fulgt av at man bringer produktet i kontakt med vann eller damp og deretter tørker produktet og,

når produktet inneholder et organisk oppløsningsmiddel, eventuelt fjerner dette, hvoretter man om nødvendig tørker produktet.

Som utgangsforbindelse kan man f.eks. bruke (1) reaksjonsblandingen hvori forbindelsen med formel II er blitt syntetisert, (2) en oppløsning fremstilt for å fjerne meste-parten av urenheter fra denne reaksjonsblanding, (3) pulver oppnådd ved å blande oppløsningen oppnådd under avsnitt (2)

med et oppløsningsmiddel hvori forbindelsen med formel II er bare tungt oppløselig, og (4) pulver oppnådd ved å konsentrere til tørrhet eller å lyofilisere den oppløsning som er fremstilt under (2). Utgangsforbindelsen med formel II kan under-kastes den foreliggende reaksjon i fri form (zwitter-ion)

eller i form av et salt med et alkalimetall eller jordalkali-metall såsom natrium, kalium, litium, eller et organisk amin såsom trietylamin, di-n-butylamin eller dicykloheksylamin.

Den benyttede saltsyre kan oppnås som et biprodukt ved frem-stillingen av utgangsforbindelsen med formel II. Syren blir som nevnt brukt i mengder på minst 2 molekvivalenter, særlig 2-10 molekvivalenter, og fortrinnsvis 2-6 molekvivalenter. Enhver mengde mindre enn 2 mol pr. mol av utgangsforbindelsen vil gi visse vanskeligheter med hensyn til å oppnå homogene krystaller, mens for store mengder av syren vil frembringe en dekomponering av utgangsforbindelsen. Det organiske oppløsningsmiddel man bruker i reaksjonen kan være

(1) et oppløsningsmiddel hvori den ønskede forbindelse (I) bare er svakt oppløselig, og som er oppløselig i vann, f.eks. etanol, n-propanol, isopropanol, butanol, iso-butanol, aceton, metyletylketon, acetonitril, tetrahydrofuran eller dioksan; (2) en blanding av et oppløsningsmiddel av den type som er nevnt ovenfor under (1) og et oppløsningsmiddel hvori den ønskede forbindelse med formel (I) er lett opp-løselig, og som er oppløselig i vann, f.eks. metanol, dimetylsulfoksyd, formamid, N,N-dimetylformamid, N,N-dimetyl-acetamid eller metylcellosolve, eller (3) en blanding av et oppløsningsmiddel nevnt under (1) ovenfor eller en blanding som nevnt under avsnitt (2) ovenfor med et oppløsningsmiddel hvori den ønskede forbindelse med formel I bare er tungt oppløselig, og som er lite oppløselig i vann, f.eks. etylacetat, eter, diklormetan eller kloroform. Spesielt ønskelig er blandinger av vann med aceton, etanol, n-propanol, isopropanol, metyletylketon eller tetrahydrofuran. Reaksjonen utføres normalt ved temperaturer fra -10 til +40°C, fortrinnsvis fra 0 til 30°C. Under -10°C vil krystallveksten være meget langsom, mens temperaturer over 40°C er ufordelaktige ved at utgangsforbindelsen lett blir dekomponert. Reaksjonstiden vil være avhengig av renheten på utgangsforbindelsen og den type urenheter den eventuelt inneholder, men hvis man bruker forbindelser med en renhet på mer enn 80% slik man oppnår ved vanlige rensingsmetoder, f.eks. ved kromatografi på en absorberende kolonne, så kan reaksjonen utføres i et tidsrom fra 30 minutter til 4 timer. Reaksjonsproduktet kan f.eks. isoleres ved filtrering, sentrifugering eller lyofilisering.

Det følgende er foretrukne utførelser av oppfinnelsen .

(A) Forbindelsen med formel II eller dens salt blir oppløst i vann eller en blanding av vann og et av de

forannevnte hydrofile organiske oppløsningsmidler, hvoretter man tilsetter HC1. Etter at reaksjonen er fullstendig, kan man tilsette et organisk oppløsningsmiddel hvori den ønskede forbindelse med formel I bare er tungt oppløselig, og man gjør dette inntil oppløsningen blir svakt turbid. Den hen-

settes så i 1 til flere timer, hvoretter man gradvis til-

setter et organisk oppløsningsmiddel hvori den ønskede forbindelse med formel I bare er tungt oppløselig inntil man begynner å få en utskilling av krystaller. De utskilte krystaller blir utvunnet ved filtrering eller sentrifuge-

ring. Krystallene vil være forskjellige former av hydrater av utkrystalliseringsbetingelsene, f.eks. temperatur, oppløsningsmiddel og utkrystalliseringstid, men vil normalt være tri- til deca-hydrater. De fremstilte krystaller vil visse ganger inneholde mindre mengder av organisk opp-løsningsmiddel avhengig av reaksjonsbetingelsene, men slike oppløsningsmidler kan vanligvis fjernes ved tørking under redusert trykk, hvis dette er nødvendig. Visse typer av organiske oppløsningsmidler er imidlertid vanskeligere å fjerne ved enkel tørking under redusert trykk, og under slike forhold bør krystallene bringes i kontakt med vann eller damp inntil 5 eller 10 molekvivalenter av vann pr. mol av anhydratet av forbindelsen med formel I er blitt absorbert, hvorved det organiske oppløsningsmiddel blir fjernet. Det oppnådde vannholdige mellomprodukt kan så holdes under redu-

sert trykk (0-20 mm Hg), hvorved vannet gradvis fjernes slik at man får krystaller av heksahydrat, pentahydrat, tetrahydrat og så trihydrat i denne rekkefølge. Hvis tri-hydratkrystallene hensettes under redusert trykk som nevnt ovenfor og i nærvær av et tørkemiddel såsom fosforsyre-

anhydrid, så får man først krystallene av dihydratet, og så monohydratene, og deretter produkter hvor mindre enn 1 mol vann er til stede. Alternativt kan man oppnå blan-

dinger av forskjellige hydrater.

(B) Forbindelsen med formel II eller dens salt oppløses i vann inneholdende fra 5 til 35% MCI (hvor M betyr

natrium, kalium og litium) fulgt av en tilsetning av HCl. Ved avkjøling av oppløsningen vil den ønskede forbindelse I begynne å utfelle seg som krystaller. De fremstilte krystaller kan utvinnes ved filtrering eller sentrifugering. Ettersom krystallene blir tørket, oppnår man i rekkefølge pentahydratet, tetrahydratet,

trihydratet, dihydratet, monohydratet og produkter hvor mindre enn 1 mol vann er til stede (absorbert eller inkorporert).

De resulterende krystaller av forbindelsen med

formel I inneholder 2 mol HC1 pr. mol av utgangsforbindelsen, noe som kan bekreftes ved elementæranalyse og titrering eller kvantitativ analyse. Krystalliniteten av forbindelsen med formel I kan f.eks. fastslås mikroskopisk, ved hjelp av et polariserende mikroskop eller røntgendiffraksjonsanalyse. Det infrarøde absorpsjonsspektrum av produktet viser smale, skarpe topper i motsetning til de man får i ikke-krystallinske pulvere. Det er tilfeller hvor tegn til krystallinitet forsvinner fra pulverrøntgendiffraksjonsmønsteret når vanninnholdet i krystallene blir redusert til mindre enn 1 mol ved tørking, men interferensfarger (tegn på krystallinitet) kan dog observeres i et polariserende mikroskop.

Den angitte forbindelse med formel I kan brukes som injiserbare eller orale preparater sammen med et ikke-toksisk alkali- eller jordalkali-metallsalt, f.eks. natriumhydrogenkarbonat, natriumkarbonat, eller trinatrium-fosfat, dvs. etter justering til den ønskede pH, ionetype og ionestyrke. F.eks. kan en oppløsning av den angitte forbindelse (I) i en vandig oppløsning inneholdende en støkiometrisk ekvivalent mengde av natriumkarbonat (heretter kalt "C-oppløsningen") tilføres intramuskulært eller intravenøst til varmblodige dyr såsom mennesker, for behandling av infeksjonssykdommer som skyldes gram-positive bakterier (Staphylococcus aureus) eller gram-negative bakterier (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Proteus morganii, etc). For behandling av infeksjoner i urinveiene som kan frembringes av Escherichia coli kan "C-oppløsningen" inneholde fra 5 til 50 mg (på anhydratbasis) av forbindelsen (I) pr. kg kroppsvekt, og denne dose kan tilføres intravenøst daglig i tre porsjoner.

Referanseeksempel 1

Antibakteriell virkning (angitt i MIC) og toksisitet for den angitte forbindelse (I) på anhydratbasis.

(2) Akutt toksisitet (mus, intraperitonealt)

CD50^ 20 g/kg

Den akutte toksisitet er gjort på basis av en 1:1 (pr. mol) blanding av forbindelsen med formel I og natriumkarbonat .

Det skal bemerkes at den angitte forbindelse (I) kan anta tautomer form ved tautomerisering slik det er angitt nedenfor.

Det har vært gjort mange undersøkelser med hensyn til denne type tautomerisering, og den eksisterende litteratur refererer dels til thiazolin-formen av forbindelsen i visse tilfelle (Acta Crystallographica 2J_, 326, 1971)°S thiazolformen i andre tilfelle (Chemistry and Industry, 1966, p. 1634)• Resul-tatene av forskjellige bestemmelser har vist at den angitte forbindelsen (I) er stabil i thiazolinformen p.g.a. hydrogen-binding slik det er angitt i den følgende formel:

og følgelig hovedsakelig antar denne thiazolinformen.

Det er imidlertid mulig at denne likevekten vil kunne gå til en av sidene alt etter de forhold under hvilke forbindelsen opptrer, f.eks. med hensyn til pH og polaritet på opp-løsningsmidlet, temperatur og andre parametere.

Den angitte forbindelsen (I) vil her bli be-

tegnet på basis av sin thiazolinform, skjønt den selvsagt også

kan betegnes ifølge thiazolformen.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Alle temperaturer er ukorrigerte, og alle prosent-satser er pr. vekt hvis intet annet er angitt. De angitte NMR-spektra ble målt ved å bruke en Varian-modell HA 100 (100 MHz) eller T60 (60 MHz) spektrometer med tetrametylsilan som indre eller ytre referanse, og alle T-verdier er i ppm. Symbolet s står for singlett, d for dublett, t for en triplett, dd for en dobbel dublett, og m for en multiplett, og sh for en skulder. Vanninnholdet i de følgende eksempler ble alle bestemt ved hjelp av Karl Fischer's metode.

Eksempel 1

(l) 400 g 2-(N,N-dimetylamino)etylamin ble tilsatt 2,4 1 eter og etter avkjøling ble en blanding av 400 g karbon-disulfid og 4»0 1 eter tilsatt dråpevis ved l8-23°C i løpet av en time. Blandingen ble rørt ytterligere ved samme temperatur i en time, og de resulterende krystaller av 2-(N,N-dimetylamino)-etylamin-karbodithiosyre ble utvunnet ved filtrering og tørket.. Utbytte 695 g, prosentvis utbytte 93,3 %, smeltepunkt 156-157°C.

De ovennevnte krystaller ble tilsatt 4>41 vann

og under røring ved 8-13°C ble 4,32 1 IN KOH tilsatt dråpevis i løpet av 30 til 40 minutter. Deretter ved 0-5°C ble en blanding av 668 g metyljodid og 6,68 1 aceton tilsatt dråpevis i løpet av 30-40 minutter, fulgt av 30 minutters røring ved samme temperatur. Acetonen ble avdestillert under redusert trykk, og det vandige

lag ekstrahert med 3 1°g 2 1 porsjoner av etylacetat. Etylacetat-laget ble kombinert, vasket med 2 1 av en mettet vandig opp-løsning av natriumklorid, tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert. Det krystallinske residuum ble omkrystallisert ved å tilsette ^ 00 ml n-hexan. Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte fikk man fremstilt 575 g S-metyl-(2-(N,N-dimetylamino))etylamin-karbodithioat. Utbytte 75,5 f», smeltepunkt 6l-62°C. 520 g av de ovennevnte krystaller ble tilsatt 1,05 1 etanol, 190 g natrium-azid og 2,1 1 rent vann og blandingen ble kokt under tilbakeløp i 3 timer. Blandingen ble så tilsatt en oppløsning av 52 g

S-metyl-f 2-(N,N-dimetylamino))etylamin-karbodithioat-krystaller

i 100 ml etanol, og det hele ble kokt under tilbakeløp i en time. Blandingen ble avkjølt til 20°C, og etter tilsetning av 2,0 1 vann, ble pH justert til 2 til 2,5 med konsentrert saltsyre i en strøm av nitrogen. Etanolen ble avdestillert under redusert trykk, og residuet ført over "Amberlite IR-120" (H-form), hvoretter harpiksen ble vasket med rent vann inntil surheten var forsvunnet. De fraksjoner som ble eluert med 5 f"vandig ammoniakk ble kombinert og konsentrert. Som krystaller fikk man 35O g l-[2-(N,N-dimetylamino)-etylJ-5-merkapto-lH-tetrazol. Utbytte 69,3 f°>smeltepunkt 2l8-219°C.

NMR (i D20 med en støkiometrisk mengde av NaHCCJ T :

(2) 2,6 1 vann ble tilsatt 206 g 7P-{.2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamidoJ-3-acetyloksymetyl-3-cefem-4-karboksylsyre og under røring ble 86,5 g av nevnte l-(2-(N,N-dimetylamino) etyl)-5-mercapto-lH-tetrazol fremstilt under avsnitt (1) ovenfor tilsatt sammen med 42 g natriumhydrogenkarbonat. Blandingen ble rørt ved 65°C i 75 minutter og ble så avkjølt til 10°C. Blandingen ble justert til pH 2,0 ved å tilsette 25O ml 5N HC1, og de resulterende uoppløselige stoffer ble oppsamlet ved filtrering og vasket med vann. Filtratet og vaskeoppløsningen ble kombinert, justert til pH 5>2 med natriumhydrogenkarbonat og kjørt over på en kolonne av 10 1 "Amberlite XAD-2" (100-200mesh). Kolonnen ble vasket med 60 1 vann, og eluering utført med 20 % metanol og så med 40 % metanol. 11 liter fraksjoner inneholdende det ønskede produkt ble konsentrert til 5 1 og ført gjennom en kolonne av 300 g aktivert aluminiumoksyd (ca. 300 mesh) og en kolonne av 100 ml "Amberlite IR-120" (H-form). Kolonnen ble vasket med vann. De utstrømmende væsker og vaskeoppløsningen ble slått sammen og konsentrert til 2 1. Konsentratet ble avkjølt til 5°C

og rørt med 5 g aktivert trekull i 5 minutter, hvoretter trekullene ble avfiltrert. Filtratet ble så lyofilisert. Ved hjelp av oven-

nevnte fremgangsmåte fikk man 51,2 g 73- [2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamido-3- [l-(2-(N,N-dimetylamin6)etyl)-lH-l-5-ylJ thiometyl-3-cef em-4-karboksylsyre.

NMR (60 MHz, D20) T : 3,45 (s, thiazolin 5-H), 4,35 (d, 7-<H>),

4,88 (d, 6-H), 5,0-6,7 (m, 5xCH2), 6,95 (s, 2xCH3)

(3) I 1,0 1 vann oppløste man 263 g av et lyofilisat

av 7P-C2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamidoJ-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl)-thiometyl-3-cefem-4— karboksylsyre som ble fremstilt ved at man seks ganger gjentok fremgangsmåten som er beskrevet under avsnitt (2) ovenfor, og hvis renhet ble ved hjelp av hurtig væskekromatografi bestemt til 93 f°Pa anhydratbasis, fulgt av en tilsetning av 1,0 1 aceton og så 150 ml 12N HC1.

Etter tilsetning av 20 g aktivert trekull ble blandingen rørt ved 5°C i 10 minutter hvoretter trekullene ble frafiltrert. Filtratet ble tilsatt 5 1 aceton, og blandingen ble rørt ved 10°C i en time. Deretter ble ytterligere 2 1 aceton tilsatt og etter en times røring ble krystallene oppsamlet ved filtrering, vasket fire ganger med 500 ml porsjoner av aceton og så tørket. Ved ovennevnte fremgangsmåte fikk man 262 g krystaller av dihydroklorid-monohydratet av nevnte karboksylsyre (utbytte 9^% på basis av rent produkt).

IR(KBr)cm<_1>: I77O (P-lactam)

Elementæranalyse for C-LgH^NgO^S^HCl-H^

Beregnet C 35,06, H 4,47, N 20,45, S 15,60, Cl 11,50 Funnet C 34,87, H 4,52, N 20,01, S 15,33, Cl 11,24

NMR (60 MHz, D20)T: 3,20 (s, thiazolin 5-H), 4,25 (d, 7-H),

4,75 (d, 6-H), 4,9-6,5(m, 5xCH2), 6,85(3, 2xCH3)

Renheten på dette produkt ble ved meget hurtig væskekromatografi bestemt til 99,6 % basert på anhydratet, og et pulver-røntgendiffraksjonsmønster av produktet viste at det var krystallinsk.

Betingelser under væskekromatografi:

Skillekolonne: "Hitachi-ioneutbytningsharpiks 26l4", 2,1 mm x 50 cm, kolonne-temperatur 50°C, elueringsmiddel 0,3 M citratbuffer, pH 6,5, 0,2 ml/min., trykk 4,3 kg/cm p, skriverfølsomhet 10 mV, skriverpapirets hastighet 2,5 mm/min. (4) I nærvær av fosforsyréanhydrid ved 35°C ble 10 g av de krystaller hvis fremstilling er angitt under avsnitt (3) ovenfor, tørket i vakuum (2 mm Hg) i 3 timer, hvorved man fikk 9)8 g pulver av nevnte karboksylsyre-dihydroklorid 0,64 hydrat. Vanninnhold 1,9/».

På basis av sitt pulverrøntgendiffraksjonsmønster fant man at dette produkt var et ikke-krystallinsk pulver. Observasjon med et polariserende mikroskop viste at rotasjon av objektet ga interferensfarge gjennom kryssede Nicol-prisner, noe som viser optisk anisotropi, og følgelig at det er et krystallinsk pulver.

Eksempel 2

I 30 ml vann ble det oppløst 10 g 73-[2-(2-imino-4-tbiazolin-4-yl)acetamido]-3-tl-(2-(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel l-(2), og under røring ved 5°C tilsatte man 5,5 ml 12N HC1 og 150 ml metyletylketon. Blandingen ble rørt i 3 timer og så hensatt ved 5°C natten over. De resulterende krystaller ble oppsamlet ved filtrering, vasket fire ganger med 20 ml porsjoner av metyletylketon og tørket. Ved hjelp av denne fremgangsmåte fikk man 10,5 g krystaller av dihydroklorid-dihydratet av nevnte karboksylsyre.

Elementæranalyse for C^gH^N O^s^HCl^^O

Beregnet C 34,07, H 4,61, N 19,86, Cl 11,17

Funnet C 33,94 H 4,80, N 20,02, Cl 11,15

Eksempel 3

(1) I 50 ml vann ble det oppløst 5,26 g av et lyofilisat av 7&-[2-(2-imino-4-thiazolin-4-y1)acetamido]-3~[1-[2-(N,N-dimetylamino)ety1]-1H-tetrazol-5-yl]-thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel l-(2), idet man brukte 15 g i stedet for 5 g aktivert trekull (vanninnhold var 3,2% og dets zwitter-ione-komponent slik den kunne bestemmes ved hurtig væskekromatografi, var 95, 5%)- Ved lyofilisering fikk man 6,2 g av nevnte karboksylsyre 2HC1-1,5^0 i pulverform.

Vanninnhold: 4,2% (beregnet for C-^H^N^S^HCl- 1.5H20:4,3$) Elementæranalyse for C^H^NgO^S^HCl-ljS^O: Beregnet C 34,56, H 4,19, N 20,15, Cl 11,33

Funnet C 34,21, H 4,03, N 19,82, Cl 11,50

Renhet som anhydrat (bestemt ved hurtig væskekromatografi): 95,3% Pulver-røntgendiffraksj onsmønster: ikke-krystallinsk

Polariserende mikroskopi (kryssede Nicol-prismer): ingen interferensfarger ble observert når objektglasset ble rotert, noe som bekrefter at det er et Ikke-krystallinsk pulver.

(2) 2 g av produktet fremstilt som angitt oven-

for ble tørket i vakuum i en silisiumdioksydgel-tørker, hvorved man fikk 1,9 g av nevnte karboksylsyre.2HC1.0,17 H20

i pulverform (ikke ifølge oppfinnelsen).

Vanninnhold: 0,5% (beregnet for c1qE2^ 9°^ S3 . 2HC1. 0 ,17 H~20: 0,5%, renhet som anhydrat (bestemt ved hurtig væskekromatografi): 95,3%.•

Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: ikke-krystallinsk Polariserende mikroskopi: ingen interferensfarger (3) I 0,5 g rent vann ble det oppløst 1 g av lyofilisatet av 73~[2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)-acetamido]-3-[1-[2-(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]thiometyl-3-cef em-4-karboksylsyre . 2HC1.1, 5 H~20 fremstilt som angitt under avsnitt (1) ovenfor, og oppløsningen ble hensatt ved 5°C i 15 timer. Den ble tørket ved hjelp av fosforsyreanhydrid,

og man fikk 1,05 g krystaller av dihydroklorid-dihydratet av nevnte karboksylsyre.

Elementæranalyse for C-^H^NgO^S^ • 2HC1 • 2H20 :

Beregnet: C 34,07, H 4,61, N 19,86, S 15,16, Cl 11,17 Funnet: C 33,84, H 4,63, N 19,71, S 15,40, Cl 11,29

Vanninnhold: 6,00% (beregnet 5,68%)

IR (KBR cm ^: 1770 (3-lactam) med smale, skarpe topper karakteristisk for at krystallen kunne sees ved 1670, 1190 og 1170.

Eksempel 4

I 25 ml vann ble det oppløst 5,5 g av et lyofilisat av 73-[2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamido]-3-[1-[2-

(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel l-(2) (renhet 93% på anhydratbasis), hvoretter man tilsatte 25 ml aceton og så 4 ml 12N HC1. Etter at ytterligere 100 ml aceton var tilsatt, ble blandingen omrørt ved 15°C i en time, hvoretter man tilsatte 50 ml aceton. Blandingen ble rørt i en time og filtrert. Det faste produkt ble vasket 4 ganger med 10 ml porsjoner av aceton. Ved tørking fikk man 5,55 g krystaller og dihydroklorid-monokydratet av nevnte karboksylsyre.

Ut.byl te- på ha.;:; .-, , w<*,>produkt .

Elementæranalyse :or C^H^N^O^S^HCl-HgO

Beregnet C 35,06, H 4,41, N 20,45, .S 15,60, Cl 11,50 Funnet C 34,48, H 4,48, N 20,55, S 15,22,Cl 11,49

Røntgendiffraksjonsmønsteret av dette produkt viste at det var et krystallinsk pulver, og dets renhet slik denne kunne bestemmes ved hurtig væskekromatografi var 99,4 % på basis av anhydratet.

FK StMnp'^ 1 5

(1) 5,0 1 av en vandig oppløsning surgjort ved hjelp av 12N HC1 til pH 2,0 og inneholdende 510 g 50-(2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamidoJ -3-( l-(.2-(N ,N-dimetylamino) etyl) -1H-tetrazol-5-yl] thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt ved at man ti ganger gjentok fremgangsmåten fra eksempel l-(2), ble avkjølt til 10°C, og etter tilsetning av 7,0 g aktivert trekull blo oppløsningen rørt i fem minutter. Trekullet ble fjernet ved filtrering og vasket med 500 ml vann. Filtratet ble slått sammen med vaskeoppløsningene og konsentrert til 2,28 1 under redusert trykk og en temperatur fra 15 til 17°C. Den konsen-trerte oppløsningen ble igjen filtrert og vasket. Filtratet og vaskeoppløsningene ble 2,38 1 og inneholdt 478 g av nevnte karboksylsyre. Filtratet ble så tilsatt 0,2 1 aceton og deretter tilsatt 170 ml 12N HC1. Deretter ble 7 1 aceton tilsatt i løpet av 10 minutter. Oppløsningen ble rørt ved 5 til 10°C i 2 timer og deretter ytterligere tilsatt 7 1 aceton i løpet av 30 minutter og så rørt i ytterligere en time. Blandingenble hensatt over natten, og de resulterende krystaller ble innvunnet ved filtrering og vasket fire ganger med 1 liters porsjoner av aceton. En del av disse krystaller ble tatt ut og tørket i

et tørkekammer ved romtemperatur og ved JO mmHg i 30 minutter.

De tørkede krystaller inneholdt 8,9 % vann hvori det var inkorporert 2,2% aceton. De tørkede krystaller (det beregnede vanninnhold på basis av Cl8H23N9°4S3'2HC1'3H20 var 8'2^ ^ ble overfØrt t;L1 et separat glassfilter og en nitrogengass fuktet ved passasje gjennom en vannholdig flaske (vanntemperatur 25 til J0°C) ble ført gjennom sjiktet av krystallene med en hastighet på 8 l/min. i seks timer. Krystallene (vanninnholdet i en prøve var 19,5 %t beregnet vanninnhold basert på C-LgH2^NgO^S3'2HCl*8H20 er 19,41 %. Dette produkt inneholdt ikke noe aceton, og dets pulver-røntgendiffrak-sjonsmønster bekreftet at det var krystallinsk), ble spredd over i et sjikt så tykt som ca. 3 cm°g tørket ved J0°C ved et vakuum på 5 ™ Hg i 1,5 timer (vanninnhold i en prøve var 17,2 %, beregnet vanninnhold basert på C^H^NgO^S^HCWH^O var 17,41 %) . Krystallene ble ytterligere tørket under samme betingelser i

1,5 timer (vanninnholdet var 15,4 % > beregnet innhold basert på Cl8H23N9°4S3'2HC1'^H20 var 15,3 ^' og sa 1 ytterligere 1,5 timer (deretter var vanninnholdet 1,3,3 f°>mens beregnet vanninnhold basert på C-j^Hg^NgO^S^HCl-SHgO var 13,08 %) . Krystallene ble igjen tørket i 1,5 timer (vanninnholdet ble 10,5 f°> mens det beregnede vanninnhold basert på C-^gH^N^O^S^^HCl^^O var 10,75 %)• Etter tørking under samme betingelser i ytterligere 1,5 timer hadde krystallene følgende egenskaper. Vanninnhold: 8,50 % (beregnet vanninnhold basert på C^H^NQO.S^HCl^HgO: 8,28 %).

RøntgendifFraksjonsmønster: krystallinsk, Cl-innhold (bestemt

ved titrering med AgNO^) : 10,6 % (beregnet for C^H^NgO^Sy 2HC1«3H20: 10,8 %) .

(2) Krystallene fremstilt som angitt under avsnitt

(1) ovenfor ble tørket ved J0°C og ved 2 mm Hg i nærvær av fosforsyreanhydrid i 5 timer.

Ved hjelp av denne fremgangsmåte fikk man 510 g

av et krystallinsk produkt. Vanninnhold: 5>7f° (beregnet vanninnhold basert på C^Hg^NgO^S^HCl.aHgO var 5,68 %) .

Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: krystallinsk

IR(KBr)cm<-1>: 1770 (Ø-lactam) med smale topper karakteristisk

for krystaller ved I67O, II90 og II70.

(3) Krystallene fremstilt som angitt under avsnitt (2) ovenfor ble tørket ved 30°C og et vakuum ved 2 mm Hg i nærvær av fosforsyreanhydrid i 8 timer.

Ved hjelp av denne fremgangsmåte fikk man 495 g

av et krystallinsk produkt.

Vanninnhold: 3,12 % (beregnet for C^Hg^NgO^S^^HCl.HgO: 2,92 fo) Renhet som anhydrat (bestemt ved hurtig væskekromatograf i) : 99» 5 i°Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: krystallinsk

<E>lementæranalyse for C^H^NgO^S^HCl.HgO:

Beregnet C 35,06, H 4,41, N 20,45, S 15,60, Cl 11,50 Funnet C 34,78, H 4,51, N20,62, S 15,31, Cl 11,77

(a)<20>(C = 1 fo, H20) = + 67,0°

Gjenværende oppløsningsmiddel (aceton) - ikke mer enn 50PPm>Cl-innhold (bestemt ved titrering med AgNO^): 11,4 f°>

beregnet 11,50 fo,

Amaks (H?0) : 258 mu (£19.500)

Bioprøve : 865 mcg/ml

Bioprøven ved hjelp av sylindermetoden ble utført ved å bruke 7P-[2-(2-ånino-4-thiazolin-4-yl)acetamido)-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etylj-lH-tetrazol-5-yl] thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre• 2HCl-salt som standardprodukt mot Bacillus subtilis ATCC 6633

som prøveorganisme.

Virkningsgraden for denne vannfrie zwitter-ione-forbindelsen var 1000 mcg/ml. Den beregnede virkningsgrad for en prøve inneholdende 2 mol HC1 pr. mol zwitter-ione-forbindelse og intet av ikke-bundet saltsyre, vann, gjenværende oppløsnings-middel eller andre urenheter, var 878 mcg/ml.

Eksempel 6

I 20 ml vann ble det oppløst 5>26 g av et lyofilisat av 70-C2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamidoJ-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl)thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel l-(2) (vanninnhold: J, l fo, zwitter-ione-innhold slik det ble bestemt ved hurtig væskekromatograf i: 93>5f°) ' Oppløsningen ble tilsatt 20 ml aceton, fulgt av 4 ml ION HC1. Deretter ble 96 ml aceton tilsatt under røring ved 20°C i løpet av 10 minutter. Etter røring av blandingen i 2 timer ble 72 ml aceton tilsatt i løpet av 20 minutter. Deretter ble blandingen rørt i JO minutter, og de resulterende krystaller oppsamlet ved filtrering og vasket fem ganger med 15 ml porsjoner av aceton. Krystallene ble tørket i fuktig luft (relativ fuktighet 58 f") i 2 timer. Ved denne fremgangsmåte fikk man 6,0 g fuktige krystaller og vanninnholdet var 13 f>. Produktet ble ytterligere tørket under redusert trykk i 2 timer, man fikk 5>7S krystaller (nevnte karboksylsyre 2HC1«4H20). Vanninnhold: 10,9 f°

(beregnet for C^H^NgO^S^HCl^gO : 10,8fo) .

Renhet som anhydrat: (beregnet ved hurtig væskekromatograf i) : 99 > 6f>Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: krystallinsk

(2) I nærvær av fosforsyreanhydrid ble 3 g av krystallene fremstilt som angitt under avsnitt (1) ovenfor, tørket i et vakuum på 5 mm Hg ved 30°C i 2 timer og så ved 50°C i 5 timer. Fremgangsmåten ga 2,6 g pulver av nevnte karboksylsyre.2HC1'0,1H20. Vanninnhold: 0,3 fo (beregnet for C-^H^NgO^S^HCl^O.lH^: 0,3 fo) Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: Ikke-krystallinsk

Polariserende mikroskopi: Ettersom objektglasset ble rotert, kunne man observere interferensfarger igjennom kryssede Nicol-prismer,

og dette tilkjennegir at det er optisk anisotropi og følgelig at det er et krystallinsk pulver.

Renhet som anhydrat (bestemt ved hurtig væskekromatograf i): 99 > 6 fo Eksempel 7

(1) 5 ml av en vandig oppløsning inneholdende 7P_C2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamido)- J-[1-(2-(N,N-dimetylamino)etyl) - -lH-tetrazol-5-ylJthiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som i eksempel l-(2) (bestemt ved hurtig væskekromatografi inneholdt denne oppløsningen 1,05 g av ovennevnte karboksylsyre og 15 mg l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-5-mercapto-lH-tetrazol så vel som spor av andre urenheter) ble tilsatt 1,0 ml 4N HC1, og den resulterende oppløsningen ble gradvis og dråpevis tilsatt J00 ml aceton avkjølt til 5°C under røring. Det pulveraktige bunnfall ble oppsamlet ved filtrering, vasket fire ganger med 5 ml porsjoner av aceton og tørket under redusert trykk. Ved hjelp av denne fremgangsmåte fikk man 1,2 g av nevnte karboksylsyre.2HC1. I, 2^0 i pulverform.

Vanninnhold: 3,45fo(beregnet for C^H^NqO.So^HCl-l^^O: Cl-innhold (bestemt ved titrering med AgNO^) : 11,6 fo (beregnet

for Cl8H23Ng0^S3-2HCl'l,2H20: 11,4 f°)

renhet som anhydrat (bestemt ved hurtig væskekromatografi): 96,3$ Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: ikke-krystallinsk (2) 0,3 g av pulveret fremstilt som angitt under avsnitt (1) ovenfor ble spredd utover et glasskår og absorberte fuktighet i et lukket kar som inneholdt en mettet vandig oppløs-ning av NaBr ved 25°C over natten. Pulverne ble fuktet, og så ble de oljeaktige og så til slutt faste. De faste stoffer ble tørket under redusert trykk, og man fikk 0,3 g av nevnte karboksylsyre «2HC1«2,3H20 i krystallinsk form.

Vanninnhold: 6,6 fo (beregnet for ^gH^N^O^«2HC1 -2 , 3H20:

6,5 %)

Renhet: 95,<2>fo

Cl-innhold (bestemt ved elementæranalyse): 11,5 f° (beregnet:

II, 1 f)

Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: krystallinsk

Eksempel 8

(1) 1,1 liter diklormetan ble tilsatt 42,4 g 7-amino-3-[l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl) thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre, og under røring ved -10°C ble 59»8 g dicyklohexylamin tilsatt i løpet av 5 minutter. Etter røring i 20 minutter ble 154 g av en oppløsning av 4-klor-3~oxo-butyryl-klorid i diklormetan (1,4 mol/kg) tilsatt i løpet av 35 minutter.

Etter røring i 35 minutter ble 22 g av samme oppløsning tilsatt igjen, fulgt av røring i 20 minutter. Oppløsningen ble så tilsatt 300 ml vann sammen med 20 ml 5N HC1 og blandingen rørt ved 25°C i 30 minutter og så filtrert og vasket med vann. Filtratet ble slått sammen med vaskeoppløsningene og det hele vasket med diklormetan, hvoretter diklormetanlaget ble ekstrahert med vann. De samlede vannlag ble tilsatt 12,5 g thiourea, og blandingen ble justert til pH 5,0 med natriumhydrogenkarbonat og så hensatt ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble så hensatt ved 10°C over natten og så justert til pH 5,2 med natriumhydrogenkarbonat. Oppløsningen ble så ført gjennom en kolonne av "Amberlite XAD-2"

(100-200 mesh, 2,5 1) som ble vasket med 7>51 vann og så eluert med 4 1 15 f° metanol og så med 6 1 40 % metanol i 6 fraksjoner. Den andre til sjette fraksjon som ble eluert med 40 % metanol ble slått sammen, konsentrert og lyofilisert. Den ovennevnte fremgangsmåte gir 37,1 g 73-(2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acet-amidoj-3-[l-(2-(N,N-dimetylamino)-etyl)-lH-tetrazol-5-yl)thio-metyl-3-cefem-4-karboksylsyre.

IR (KBr) cm"<1>:<1>765 (3-lactam)

NMR (60 MHz, D20) T : 3,45 (s, thiazolin 5-H), 4,35 (Cl, 7-H),

4,88 (d, 6-H), 5,0-6,7(m, 5xCH2), 6,95 (s, 2xCH3) Cl-innhold (elementæranalyse): ikke mer enn 0,1 %

N -innhold (atom-absorpsjonsspektroskopi): ikke mer enn 100 ppm (2) Et lyofilisat av 7P-(2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)-acetamido)-3-(1-C2-(N,N-dimetylamino)etylj-lH-tetrazol-5-yl)-thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt under avsnitt (1) ovenfor, ble behandlet på lignende måte som angitt i avsnittene (3) og (4) i eksempel 1, hvorved man fikk nevnte karboksylsyre-dihydroklorid 0,64 hydrat i krystallinsk, pulveraktig form. NMR (60 MHz,D20) X '• 3>20 (s>thiazolin 5-H), 4,25 (d, 7-H),

4,75 (d, 6-H), 4,9-6,5 (m, 5 * CH2), 6,85 (s, 2 x CH^)

Eksempel 9

En rørt blanding av 3 ml 1,5N HC1 og 3 ml n-propanol ved 10°C ble tilsatt 0,53 g 7M 2-( 2-inino-4-thiazolin-4-yl) - acetamidoJ-3- (l-(2-(N,N-dimetylamino)-etylj-lH-tetrazol-5-ylJ-thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel 9~(1). Deretter ble det tilsatt 9 ml n-propanol og blandingen ble rørt ved 10°C i 5 timer og så ble 9 ml n-propanol igjen tilsatt. Blandingen ble så hensatt ved 5°C over natten. Krystallene ble oppsamlet ved filtrering, tørket i luft og så dehydratisert, hvorved man fikk 0,50 g av nevnte karboksylsyre-dihydrokloriddihydrat i krystallinsk form.

IR(KBr)cm<_1>: 1770(B-laktam), 1670, 1190, 1170

Elementæranalyse for C^H^ Ng0^S -2HC1-2H20:

Beregnet C 34,07, H 4,51, N 19,86, Cl 11,17

Funnet C 33,8l, H 4,50, N 20,11, Cl 10,98

Eksempel 10

2,49 g 73-[2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamido]-3-[l-[2-(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]-thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt i eksempel 8 ble oppløst i 10 ml 2N HC1 og deretter tilsatt 25 ml tetrahydrofuran. Etter henstand over natten ved 5-10°C ble krystallene frafiltrert og vasket med tetrahydrofuran. Tørking av krystallene i vakuum

1 2,5 timer ga 2,4 g krystaller av nevnte karboksylsyre.

2HC1-6H20.

Vanninnhold 15,1?

Pulver-røntgendiffraksjonsmønster: krystallinsk

Ved behandling på samme måte som i eksempel 5 (2) og (3) oppnås 2 HC1"2H00 og 2HC1,H20 som produkter i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Eksempel 11

2,Og 70-[2-(2-imino-2-thiazolin-4-yl)acetamido]-3-[1-[2-(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]-thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt under avsnitt (1) i eksempel 8, ble oppløst i 13 ml 30% vandig natriumkloridoppløsning ved 25°C. Etter tilsetning av 7 ml 2N HC1 ble oppløsningen omrørt i 4 timer ved 20°C. De resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering og vasket med kald 10% vandig natriumkloridoppløsning. Etter 2 døgns lagring i et tørkeapparat ved en relativ fuktighet som ble regulert til 58% ved hjelp av en vandig oppløsning mettet med natriumbromid-dihydrat, fikk man 1,8 g av nevnte karboksylsyre-2HC1-5H^0 i krystallinsk form.

Vanninnhold: 12,9

Pulver-røntgendif fraksjonsmønster viste at det var krystallinsk pulver.

Ved behandling på samme måte som i eksempel 5 (2) og (3) oppnås 2HC1-2H20 og 2HC1-H20 som produkter i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Eksempel 12

En blanding av 12,5 g 7(3-amino-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl}thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre og l80 ml diklormetan ble tilsatt 11,6 g di-n-butylamin under røring ved -10 til -15°C. Etter 15 minutter fikk man en klar oppløsning. Denne oppløsning ble tilsatt 39>0 ml 4-klor-3-oxo-butyrylklorid i diklormetan (1,54 mM/ml) ved -15 til -20°C i løpet av 5 min. og ved hjelp av røring. Etter røring i 15 min. ved -10°C ble 7P-(4-klor-3-oxobutyramido)-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl) thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre-hydroklorid ekstrahert med 40 ml og 25 ml porsjoner av IN HC1. De ekstraherte vannlag ble slått sammen og vasket to ganger med JO ml porsjoner av diklormetan. 5>7g thiourea og 455 ml aceton ble tilsatt vannlaget, og' blandingen ble rørt i 7 timer ved 20-22°C og så hensatt over natten. Filtrering og vasking med fire porsjoner 60 ml aceton og tørking i vakuum, ga 17,5 g krystaller av 7P-(2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamido)-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl)thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre•2HC1•4H20. Aceton-innholdet i disse krystallene kunne ved h£Lp av et NMR-spektrum påvises å være 0,25 mol pr. 1 mol av nevnte karboksylsyre.

NMR (60 MHz, D20) f : 3,20 (s, thiazolin 5-H), 4,25 (4, 7-<H>),

4,75 (d, 6-H), 4,9-6,5 (m, 5*CH2), 6,85 (s, 2xCH3),

7,70 (s, CH^fra aceton)

Vanninnhold: 10,5 1°

Pulver-røntgendiffraksjon viste at det var et krystallinsk produkt.

Eksempel 13

1,0 g 7B-(2-(2-iminothiaaolin-4-yl)acetamidoJ-3_[l_(2-(N,N-dimetylamino)etylJ-lH-tetrazol-5-yl)thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre fremstilt som angitt under avsnitt (1) i eksempel 8 ble tilsatt 46 ml vann og 4 ml IN HC1. Etter tilsetning av 500 ml aceton ble blandingen rørt i 2 timer hvoretter-man tilsatte ytterligere 700 ml aceton. Blandingen ble så hensatt over natten ved 5°C. De utfelte nåler ble frafiltrert, vasket med aceton og tørket i et tørkekammer i 15 timer ved

15-20°C i vakuum, og dette ga 0,4 g krystaller.

Elementæranalyse for C^H^NqO^S^HCl-HgO-O,^ aceton

Beregnet C 35.39. H 4.49. N20,20, S 15,38

Funnet C 34,78, H 4,53, N 19,87, S 15,38

Vanninnhold: 2,91 %

Pulver-røntgendiffraksjon viste at det var et krystallinsk produkt.

Eksempel 14

1,7 g 7B-(<2->(2-imino-4-thiazolin-4-yl)-acetamido)-3-(l-(2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl]thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre ble tilsatt 8 ml 2N HC1 og deretter 73 ml etanol. Etter henstand over natten ved 5°C hie det utfelte krystaller frafiltrert og tørket JO minutter i vakuum, og dette ga 1,0 g krystaller. Etanol-innholdet i disse krystaller kunne ved hjelp av NMR (60 MHz, D^O) viste seg å være 0,65 mol pr.

1 mol av den nevnte karboksylsyre.

Vanninnhold: 7,70 %

Beregnet for<C>1<gH>2^<NgO>^<S>^'<2>HCl*3H20'0,65 etanol: 7,92 # Pulverrørit gendif f raks jon viste at det var et krystallinsk produkt,

Prøve

En prøve av hver av de følgende forbindelser ble lagret i en lukket ampulle ved ^ >0°G i fire uker.

Natriumsaltet, zwitter-ionet og monohydrokloridet av 7B-[2-(2-imino-4-thiazolin-4-yl)acetamidoJ-3-(l-[2-(N,N-dimetylamino)etyl)-lH-tetrazol-5-yl)thiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre, så vel som lyofiliserte pulvere av nevnte syre-dihydroklorid (amorfe pulvere, eksempel 3~(2)), krystallene av nevnte syre-dihydroklorid (eksempel l-(3)) og de krystal-

linske pulvere fremstilt ved å tørke nevnte dihydroklorid-krystaller (eksempel l-(4)), fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse.

" sentvis rest er angitt i følgende tabell.

Forsøk I

S!2£§lSi§iii9§_§§lt§r_av_7 3rl2;12-imino-4-tia amido2-3-^l<->^<2->^N^N-dimetYlamino m^£Yil3;cef!=mli-k^rb^ks^lsYre (i det følgende betegnet "TTC")

(1) Fremstilling av TTC:

Til 1,1 1 diklormetan ble det tilsatt 42,4 g 7-amino-3-[1-[2-(N,N-dimetylamino)etyl]-lH-tetrazol-5-yl]tiometyl-3-cefem-4-karboksylsyre og, under omrøring ved -10°C, ble 59,8 g dicykloheksylamin tilsatt i løpet av 5 minutter. Etter omrør-ing i 20 minutter, ble 154 g av en oppløsning av 4-klor-3-okso-butyrylklorid i diklormetan (1,4 mol/kg) tilsatt i løpet av 35 minutter. Etter omrøring i 35 minutter, ble 22 g av den samme oppløsningen ytterligere tilsatt, fulgt av omrøring i 20 minutter. Til denne oppløsning ble det tilsatt 300 ml vann sammen med 20 ml 5NHC1 og blandingen ble omrørt ved 25°C i 30 minutter, deretter ble den filtrert og vasket med vann. Filtratet kombinert med vaskeoppløsningene ble vasket med diklormetan og diklormetanlaget ble ekstrahert med vann. Til de kombinerte vannlag ble det tilsatt 12,5 g tiourea og blandingen ble justert til pH 5,0 med natriumhydrogenkarbonat og ble hensatt ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen fikk ytterligere stå ved 10°C natten over og deretter justert til pH 5,2 med natriumhydrogenkarbonat. Denne oppløsning ble ført gjennom en kolonne av "Amberlite XAD-2" (100-200 mesh, 2,5 1) som ble skyllet med 7,5 1 vann og eluert med 4 1

15% metanol og deretter med 6 1 40% metanol i 6 fraksjoner. Fra og med den andre til og med den sjette fraksjon eluert med 40% metanol, ble kombinert, konsentrert og lyofilisert. Den ovenfor angitte fremgangsmåte ga 37,1 g TTC (renhet: 94,3%) .

IR(KBr)cm<-1>: 1765 (3-laktam)

NMR(60MHz, D20) x: 3,45 (s, tiazolin 5-H), 4,35 (Cl, 7-H),

4,88 (d, 6-H), 5,0-6,7 (m, 5xCH2>,

6,95 (s, 2xCH3);

Cl-innhold (elementæranalyse): ikke mer enn 0,1%;

Na+-innhold (atomabsorpsjonsspektroskopi: ikke mer enn 100 ppm).

(2) Fremstilling av TTC-salter med forskjellige syrer eller

natriumhydroksyd:

a) I 5,2 ml vann ble det oppløst 1,06 g (1,90 mM) av lyofilisatet av TTC oppnådd under (1) ovenfor og, under omrøring

ved 15°C, ble en eller fire molekvivalenter av en syre eller natriumhydroksyd pr. mol TTC tilsatt til oppløs-ningen fulgt av 21,2 ml aceton. Etter omrøring i 4 timer ved 15°C, ble reaksjonsblandingen hensatt i 32 timer ved 25°C.

b) I det tilfelle at det oppnådde produkt i den ovenfor angitte fremgangsmåte a) var i fast form, ble det faste

materiale oppsamlet ved filtrering og vasket fire ganger med aceton. Materialet ble deretter overført til et separat glassfilter og nitrogen som på forhånd var fuktet ved passasje gjennom en vannholdig strippingsflaske (vanntemperaturen ble gradvis øket fra 5 til 25°C), ble ført gjennom laget av materialet, fulgt av tørking ved 15-20°C under redusert trykk, dvs. 20-30 mmHg i 1 time i en eksikator med fosforpentoksyd.

(3) Resultat:

Observasjonene av produktene i de ovenfor angitte fremgangsmåter (2), a) og b) er angitt i nedenstående tabell I.

<*>: Krystalliniteten ble undersøkt ved hjelp av et polariserende mikroskop ifølge metoden beskrevet i "Code of federal regulations" (publisert av the Office of the Federal Register National Archives and Records Service General Services Administration; 21, Food and Drugs, Part 436 ,203) .

Produktet oppnådd i fremgangsmåte (2), a) og b) med bruk av 4 molekvivalenter HC1 pr. mol TTC, viste følgende fysikalske og kjemiske konstanter:

Utbytte: 0,8 6 g

IR (KBr)cnf<1>: 1770 (&-laktam)

NMR (60 MHz, D20) t: 3,20 (S, tiazolin 5-H), 4,25 (d,

7-H) 4,75 (d, 6-H), 4,9-6,5 (m, 5 x CH2) , 6,85 (S, 2 x CH3>

UV<E1%>(<H>2<0>) (Anm): 239 (259)

1 cm

Vanninnhold (Karl Fischer's metode): 8,04%

Cl-innhold (bestemt ved titrering av Ag NO^): 10,8%

I betraktning av disse fysikalsk-kjemiske konstantene ble dette produktet betegnet som TTC•2HC1•3H20.

Forsøk II

KlYstalliniteten_til_TTC-salt_med_2

A. Fremstilling av TTC 2HC1 med varierende vanninnhold

(1) Fremgangsmåte I:

I 104 ml vann ble det oppløst 21,2 g av lyofilisatet av TTC og under omrøring ved 15°C ble det tilsatt 12,7 ml (152 mM) 12N-HC1 fulgt av tilsetning av 424 ml aceton. Omrøringen ble fortsatt i 4 timer og det hele ble hensatt i 32 timer ved 25°C. Det resulterende materiale ble oppsamlet ved filtrering, vasket tre ganger med 76 ml hver gang med aceton. Materialet ble overført til et separat glassfilter og nitrogengass som på forhånd var fuktet ved passasje gjennom en vannholdig strippingsflaske (vanntemperaturen ble gradvis øket fra 5 til 25°C), ble ført gjennom materialaget ved en strømningshastighet på 1,7 l/min. i 6,5 timer. Det resul terende materiale ble tørket i 2 dager ved 15-20°C i en eksikator med en mettet vandig oppløsning av kaliumacetat.

(2) Fremgangsmåte II:

3,0 g av materialet oppnådd i den ovenfor angitte fremgangsmåte I ble tørket under redusert trykk (20-30 mmHg) ved 15-20°C i en eksikator med fosforpentoksyd i 0,5 timer.

(3) Fremgangsmåte III:

3,0 g av materialet oppnådd i fremgangsmåte I ble tørket under redusert trykk (20-30 mmHg) ved 15-20°C i en eksikator med fosforpentoksyd i 6,5 timer.

(4) Fremgangsmåte IV:

3,0 g av materialet oppnådd i fremgangsmåte I ble tørket under redusert trykk (20-30 mmHg) ved 15-20°C i en eksikator med fosforpentoksyd i 15 timer.

(5) Fremgangsmåte V:

3,0 g av materialet oppnådd i fremgangsmåte I ble tørket under redusert trykk (20-30 mmHg) ved 15-20°C i en eksikator med fosforpentoksyd i 4 dager.

B. Fysikalske og kjemiske konstanter for produktet. Produktene oppnådd i de ovenfor angitte fremgangsmåter I-V viste følgende utbytte og fysikalsk-kjemiske konstanter, respektivt: Utfra de fysikalske og kjemiske konstantene i tabell II ble produktene oppnådd i fremgangsmåten I-V betegnet som TTC.2HC1.4H20, TTC•2HC1•3H20, TTC • 2HC1 • 2H20, TTC2HC1-H20

og TCC.2HC1-0,1 H20, respektivt.

C. Krystallinitet for produktene

Produktene oppnådd i fremgangsmåte I-V viste seg å være krystallinske ved undersøkelse ved hjelp av metoden beskrevet i nevnte "Code of federal regulations", og ved hjelp av et polariserende mikroskop.

Forsøk III

§tabilitet_av_TTC

Natriumsaltet (lyofilisat, vanninnhold 0,48%), zwitter-

ion (lyofilisat, vanninnhold 0,50% og monohydroklorid (lyofilisat, vanninnhold 0,58%) av TTC, samt materialene oppnådd i fremgangsmåtene I-V i forsøk II, ble lagret i en forseglet ampulle ved 4 0°C i 3 måneder. Deretter ble den resterende prostentvise mengde TTC bestemt ved hjelp av høy-hastighet-væskekromatografi.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av et krystallinsk , antibiotisk virksomt cefalosporinderivat med følgende formel:

hvor n er et tall tra 0,1 til 4,karakterisert vedat man (1) omsetter en forbindelse med formelen: eller et salt derav, med minst 2 molekvivalenter HC1 i nærvær av vann og eventuelt et organisk oppløsningsmiddel, for dannelse av et krystallinsk eller et amorft produkt, og (2) når et krystallinsk produkt dannes, om nødvendig, fulgt av at man tørker produktet, og når et amorft produkt dannes, fulgt av at man bringer produktet i kontakt med vann eller damp og deretter tørker produktet, og, når produktet inneholder et organisk oppløsningsmiddel, eventuelt fjerner dette, hvoretter man om nødvendig tørker produktet.