NO151443B - Fremgangsmaate for fremstilling av fosforpeptider ved behandling av et kaseinbasert materiale - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider for anvendelse som nærings-eller legemidler ved behandling av et kaseinbasert materiale som inneholder fosforkaseinater.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider ved behandling av fosforkaseinater med enverdige kationer, eller deres derivater.

Man vet at kaseiner fra utgangsmaterialer som inneholder melk og spesielt melk, inneholder fosfoseriner som gir peptidene hvor de befinner seg, fysiokjemiske,teknologiske og fysiologiske interessante egenskaper. Man finner spesielt indikasjoner for proteiner i melk, i H.A. McKenzies (1971)

bok med tittel "Milk Proteins", vol. 1 og 2, Academis Press New York.

Ultrafiltrering på membraner er, på grunn av den fremgang som er gjort med hensyn til apparater og forståelse av de observerte fenomener, meget utbredt i melkindustrien for behandling av melk. (Se f.eks. J.L. Maubois, G. Mocquot

(1971) - "Préparation de fromage å patir de pré-fromages liquides obtenus par ultrafiltration du lait" - Revue "Le Lait" bind 51 508, 495-533). Når melk passerer gjennom et ultrafil-treringsmembran, går vann, oppløslige mineralsalter, laktose, nitrogenforbindelser med lav molekylvekt (peptider, frie aminosyrer), og vannoppløslige vitaminer gjennom membranet i form av et ultrafiltrat eller permeat, mens proteinene og deres assosierte forbindelser (kalsium, fosfor), fettkuler og lipofile elementer, holdes tilbake og konsentreres etterhvert som vannfasen fjernes. De utgjør filterresten eller protein-konsentratet. Tilveiebringelse av proteinkonsentrater med høy renhet gjør det nødvendig å benytte både en ultrafiltrering og en diafiltrering. I diafiltreringen tilsetter man vann eller en vandig oppløsning som inneholder salter, kontinuerlig eller diskontinuerlig, til filterresten fra ultrafiltreringen. Man fjerner samtidig eller gradvis en tilsvarende mengde permeat. En slik operasjon har som følge at filterresten utarmes på filtrerbare elementer. Fortrinnet ved ultrafiltreringsteknikken på membraner er å bevare melkepro-teinet i sin opprinnelige tilstand.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen trekker fordel av ultrafiltrering på membraner for å frembringe en fraksjonering av bestanddelene i kaseinbaserte utgangsmaterialer, men benytter sammen med denne ultrafiltreringen en enzymatisk hydrolyse .

Man kjenner et visst antall fremgangsmåter for hydrolyse av proteiner, f.eks. melkeproteiner. Syrehydrolyse er effektivt for å frembringe oppløsninger av frie aminosyrer, men ødelegger visse av disse. Basisk hydrolyse bevarer tryptofan, men medfører en oppløsliggjøring som sterkt redu-serer næringsverdien av de opprinnelige proteinkonsentrater.

Den enzymatiske proteolyse er kjent, og er lenge benyttet for analytiske eller næringsmessige formål, hvor hovedformålet er å oppløseliggjøre proteinene. Litteraturen vedrører hovedsakelig tallrike næringsmessige anvendelser av hydrolysater av soyaproteiner (se S. Arai, M. Noguchi, S. Kurosawa, H. Kato og M. Fujimaki (1970) "Applying proteolytic enzymes on soybean, 6-deodorization effect"), fiske-proteiner (se P.Hevia, J.R. Whitaker og H.S. Olcott (1976) "Solubilization of a fish protein concentrate with proteolytic enzymes", J. Agric. Fooc Chem. Vol 24 (2) 383-385) eller kål, ved påvirkning av animalsk, mikrobiell eller vegetabilske protease.

Anvendelse av disse fremgangsmåter på melkeproteiner

i industriell målestokk er imidlertid meget begrenset.

Den enzymatiske proteolyse har ikke de ulemper som følger kjemiske metoder. Hydrolysebetingelsene er moderate,

og bevarer således den næringsmessige verdi i produktene.

Vanligvis gir hydrolyse peptidene en fremtredende bitter smak. Denne egenskapen begrenser anvendelsen av disse hydrolysater som menneskelig næringsmiddel. Intensiteten av bittersmaken i et hydrolysat avhenger hovedsakelig av arten av det proteinholdige substrat, og den spesifikke virkning av enzymene. For å eliminere bittersmaken har man foreslått å benytte exopeptidaser. Se f.eks.S. Arai, M. Yahashita,

H. Kato, M. Fujimaki (1970) "Agric. Biol. Chem", 34 729, og likeledes K. M. Clegg, G. Smith og A.L. Walker (1974) "Pro-duction of an enzymatic hydrolysate of casein on a kilogram scale", J. Food Technol. 9, 425-431. Man har likeledes foreslått å modifisere peptidene ved tilsats av glutaminsyre før en mykgjøringsreaksjon. Det er likeledes mulig å fjerne hydrofobe aminosyrer.

Men alle disse fremgangsmåter som er kjent, er ikke tilfredsstillende og kan ikke svare til oppfinnelsens behov.

I virkeligheten vil en fremtredende oppløseliggjøring , forår-saket av anvendelsen av exopeptidase, øke innholdet av frie aminosyrer, og nærmere bestemt arginin, lysin, tyrosin, valin, fenylalanin, metionin og leucin, noe som kan direkte stenge transportsystemene på nivå med tarmbarrieren mot frie aminosyrer, og således medfører en redusert næringsmessig effektivi-tet hos hydrolysatene. Videre vil den iboende kvalitet på hydrolysatene modifiseres siden likevekten mellom aminosyrene selv forandres, noe som gjør det nødvendig med en tilsetning av frie aminosyrer.

På det teknologiske nivå benytter enzymatisk hydrolyse som regel et system med en diskontinuerlig reaktor. Enzymet tilsettes den proteinholdige oppløsning som skal behandles. Etter en kortere eller lengre oppholdstid under gunstige betingelser for den enzymatiske aktivitet og for påvirkning av substratet, modifiseres pH og en termisk behandling gjør enzymet inaktivt. En sentrifuger ing kan gjennom-føres for å fjerne den uoppløselige fraksjon som ennu ikke er oppløst. Men etter denne fremgangsmåten med enzymatisk hydrolyse i en diskontinuerlig reaksjon, er det vanskelig å benytte et høyt forhold mellom enzym og substrat. Men man kjenner til R.C.Robins (1978) "Effect of ratio of enzymes to substrate on amino acid patterns released from proteins in vitro". Internat. J.Vit.Nutr. Res., 48, 44-52, den avgjørende innflytelse forholdet mellom enzym og substrat har på

arten av frie aminosyrer, og peptidene som frigjøres under

proteolysen. Med en diskontinuerlig fremgangsmåte, må man bryte ned enzymene ved avslutningen av hydrolysen, når disse er i overskudd, noe som er uforenlig med de høye forhold som er nevnt foran.

Man har likeledes foreslått å benytte reaktorer med faste enzymer. Men dette fører til en rekke ulemper på det praktiske plan. De optimale betingelser for enzymaktivitet-ene, og spesielt pH-betingelsene, forskyver seg, slik at reaktoren ikke gir tilfredsstillende virkning hele tiden. Man kan konsta tere bakteriologiske problemer, tilstopning av festeplatene, og likeledes absorbsjon av proteiner på under-laget. Videre har den enzymatiske reaksjon en tendens til å hemmes i . løpet av tiden på grunn av at det dannes komplekser av enzym og proteinfragmenter. Hemmingen kan likeledes skyldes arten av underlag, Det er videre meget vanskelig å benytte systemer med flere enzymer på grunn av konkurransefenomener hos enzymene via a vis substratet, og forskjellig stabilitet hos enzymene i løpet av tiden.

Oppfinnelsen har dratt fordel av innretningene som allerede er kjent ved visse andre anvendelser, og som består av å benytte enzymatiske membranreaktorer. Man kan f.eks. henvise til artikkelen av C.de Cheftel (1972) "Solubilisation enzymatique continue du concentré protéique de poisson.

Essai de recyclage des enzymes". Ann. Technol. Agric. 21, (3) 423-433, som beskriver en membranreaktor som benyttes ved proteolyse av proteinkonsentrater fra fisk. Ultrafiltrer-ingsmembranet gjør det mulig å holde tilbake enzymet i opp-løsning i reaktoren sammen med proteinsubstratet. Bare hydro-lyseproduktene, peptidene, fjernes etterhvert som de dannes. Men i praksis vil anvendelsen av en slik reaktor ikke være enkel, som understreket av de Cheftel. Substratet bør være fullstendig oppløslig ved hjelp av enzymet, og den proteinholdige oppløsning bør ha en upåklagelig bakteriologisk kvalitet.

Som dokumenter som illustrerer den tekniske situa-sjon kan man videre sitere følgende referanser .

FR-PS 2 . 399 . 21 3 beskriver behandlincr av et hvdrolvsat ved ultrafiltrering, og deretter fulgt av elektrodialyse. Dette dokument viser at det er kjent å ultrafiltrere et proteinhydrolysat. Den beskrevne fremgangsmåte i patentet gjør det mulig å fremstille en ren oppløsning av naturlige aminosyrer.

FR-PS 2.292.435 vedrører tilveiebringelse

av fosforkaseinater av kalsium fra en ultrafiltrerings-rest av melk. Dette patentet vedrører således fremstilling av kalsiumfosforkaseinater med monovalente kationer eller deres derivater.

Referanse i Chemical Abstracts, vol, 87 nr. 19 av

7. november 1977, side 265, sammendrag 148 285p Columbus Ohio (USA) og J. Dairy Research, vol. 44 nr. 2 (1977) sidene 373-376, D.H.West "A simple method for the isolation of a phosphopeptide from bovine a sl-casein", beskriver tilveie-bringelsen av et fosforpeptid fra kaseinat. Fremgangsmåten omfatter en enzymatisk hydrolyse av trypsin, og fraksjonering ved filtrering på gel og kromatografi, men den begynner med en reaksjon medCNBr som fører til meget spesifikke produkter .

Referanse i Chemical Abstracts, vol. 91, nr. 21,

av 19. november 1979, side 523, sammendrag 173 597g, Columbus Ohio (US) og Enzyme Microb. Technol, vol. 1, nr. 2 (1979) sidene 122-124, J.P. Roozen et al, "Enzymic protein hydrolysis in a membrane reactor related to taste properties", beskriver hydrolyse i en enzymatisk reaktor, hvor formålet er å for-bedre smaken på proteinhydrolysatet. Dette dokumentet viser at enzymatisk reaktor er et kjent apparat.

Etter oppfinnelsen benyttes behandlingsmetoden på proteinoppløsninger som er uten toverdige ioner, så som kalsium og magnesium. Man benytter seg av denne grunn hovedsakelig av et kaseinbasert utgangsmateriale, som inneholder fosforkaseinater av enverdige kationer eller deres derivater.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider som anvendelse som nærings- eller legemidler ved behandling av et kaseinbasert materiale som inneholder fosforkaseinater av eneverdige kationer og deres derivater hvorved man underkaster det nevnte materiale cn hydrolyse ved hjelp av pankreatin eller blandinger derav med a-kymotrypsin og trypsin oa andre <p>roteo-lytiske enzymer, og underkaster det tilveiebragte hydrolysat minst en ultrafiltrering med membraner som lar alle peptider fra hydrolysatet gå gjennom til permeatet, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man til permeatet tilsetter minst ett salt av toverdige kationer for å danne aggregat med den fosforiserte fraksjon av de nevnte peptider, noe som fører til en oppløsning som hovedsakelig inneholder aggregater av fosforpeptider og ikke-fosfor-peptider, og ved at man ved hjelp av minst en ultrafiltrering skiller ikke-fosforpeptidene fra fosforpeptidene som har en større partikkelstørrelse, ved å bringe oppløsningen i kontakt med minst et membran som er i stand til å holde tilbake fosforpeptidene.

De kaseinbaserte utgangsmaterialene som kan behandles etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, inneholder fosforkaseinater med enverdige kationer, så som fosforkaseinater av natrium, kalium eller ammonium. Man kan likeledes behandle et utgangsmateriale som inneholder derivater av de nevnte fosforkaseinater, og spesielt parakaseiner. Alle disse forbindelser er kjent, og tilgjengelige i industriell målestokk. For f.eks. å fremstille en verdige kaseinater så som natriumkaseinat, fremstilles først kasein f.eks. fra melk ved utfelling ved isoelektriske punkt. Etter vasking av dette, tilsettes kaseinutfellingen natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniumhydroksyd, eller andre basiske forbindelser som inneholder enverdige ioner, og som er i stand til igjen å bringe kaseinet i oppløsning. Man får tilslutt en proteinoppløsning som inneholder de nevnte kaseinater av enverdige kationer, fortrinnsvis kaseinater av natrium eller kalium. Slike stoffer kan tjene direkte som utgangsmateriale for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Som en variant kan man anvende derivater av de nevnte kaseinater, og spesielt i form av parakasein. For å oppnå dette, behandler man på forhånd oppløsningen av fosforkaseinat med

enverdige kationer, ved å tilsette løype som frembringer

en hydrolysereaksjon. Hydrolyseproduktet inneholder parakaseinatet, og kaseinmakropeptider (CMP). Man gjennomfører

deretter utfelling av parakasein på kjent måte, fortrinnsvis ved surgjøring til pH 4,6 ved hjelp av en hvilken som helst organisk eller uorganisk syre, f.eks. saltsyre, fosforsyre, svovelsyre, eddiksyre, melkesyre eller tilsvarende syrer.

I praksis foretrekkes saltsyre. Man fraskiller deretter den ovenstående oppløsning som inneholder kaseinmakropeptidene fra parakaseinutfellingen. Den sistnevnte tjener i sin tur som utgangsmateriale for fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.

I denne varianten får man en oppløsning som inneholder kaseinmakropeptid som kan være et verdifullt produkt. For å rense og skille det ut, kan man nøytralisere den nevnte oppløsning med en basisk forbindelse, så som natriumhydroksyd. CMP kan fremstilles i form av konsentrat ved ultrafiltrering

av løsningen etter tilsetning av kalsiumklorid.

I en foretrukket utførelse av den variant som er beskrevet ovenfor, hydrolyseres natriumkaseinat i vannoppløs-ning (3%) ved hjelp av løype (20 ml/100 1). Parakaseinatet utfelles deretter ved tilsetninq av HC1 (pH 4,6) . Den ovenstående oppløsning som inneholder kaseinmakropeptid nøytrali-seres deretter (pH 7,0) ved hjelp av natriumhydroksyd og konsentreres ved ultrafiltrering etter tilsats av 0,5 gr CaCl2. Fra 1000 liter 3% oppløsning av kaseinat tillater denne varianten at man får mellom 30 og 4 0 liter 3% oppløsning av kaseinmakropeptid.

Alt etter det utgangsmateriale som benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, består det første trinn av enzymatisk hydrolyse ved hjelp av minst ett proteolytisk enzym som er i stand til å rekonstituere proteinfordøyelsen som finner sted in vivo i den menneskelige organisme. Som nevnt foran, utføres en slik hydrolyse fortrinnsvis i en inn-retning som omfatter et ultrafiltreringsutstyr kombinert med en enzymreaktor, som således gjør det mulig med en kontinuerlig utførelse.

I en slik utførelse, frembringes enzymhydrolysen kontinuerlig ved å tilføre det kaseinbaserte utgangsmateriale til en reaksjonssone for å bringe dette i intim kontakt med.enzymet, man fjerner kontinuerlig reaksjonsproduktet, og fører dette fra reaksjonssonen til en ultrafiltreringssone, hvorfra man likeledes kontinuerlig fjemer et permeat som utgjør peptidhydrolysatet.

Under en enzymhydrolyse, bør pH justeres til mellom 7 og 9. For dette formål tilføres kontinuerlig eller diskontinuerlig til reaksjonssonen en basisk forbindelse som kan være natriumhydroksyd eller-karbonat, kaliumhydroksyd eller -karbonat, ammoniumhydroksyd eller en blanding av disse produkter. Valget av basisk forbindelse avhenger spesielt av sluttanvendelsen av produktet.

Som enzym benyttes fortrinnsvis minst ett proteo-lytisk enzym som er i stand til å rekonstruere protein-fordøyelsen som finner sted in vivo i den menneskelige organisme. Man. benytter således fortrinnsvis pankreatin, som er en kompleks blanding som inneholder trypsin, chymotrypsin og andre sekundære proteolytiske enzymer. I praksis kan man benytte en naturlig pankreasekstrakt som er tilgjengelig på markedet, og lett å få tak i. Hvis der er et behov for det, kan man likeldes benytte enzymer som skriver seg fra en syntetisk blanding, f.eks. a -chymotrypsin og trypsin. Fortrinnsvis benyttes en syntetisk blanding, hvor sammensetningen nærmer seg prankreatin, og følgelig ved tilsats av kontinuerlig enzymer, som finnes i naturlig pankreasekstrakt. Det viser seg ifølge oppfinnelsen at ved pH mellom 7 og 9, og fortrinnsvis mellom 7 og 8,5, f.eks. 8, vil pankreatin og andre analoge enzymer svare til oppfinnelsens behov, og har maksi-mal stabilitet.

Man må likeledes passe på at temperaturbetingelsene overholdes strengt i den enzymatiske hydrolysesone. Man har kunnet konstatere at enzymaktiviteten påvirkes mer av temperaturen enn av pH. Prøver har spesielt vist at ifølge oppfinnelsen må den maksimale temperatur under den enzymatiske hydrolyse med trypsin ikke stige høyere enn 54°C, og med chymotrypsin bør denne temperatur ikke overstige 45°C. I praksis vil man, når man benytter pankreatin, ta hensyn til de optimale betingelser for proteolyse i tarmen in vivo (temperatur i størrelsesorden 37°C) og det forhold at høyere temperaturer er mindre gunstige for utvikling av basiller og gjør det mulig å få høyere utbytte av ultrafiltreringen. Vanligvis velges temperaturen mellom 37 og 40°C, fortrinnsvis ± nærheten av 37°C.

Det er underforstått at reaksjonsparametrene, dvs. pH-verdi og temperaturen for den enzymatiske hydrolyse er av-hengige av hverandre. De som kjenner de foreliggende teknikker, kan således velge betingelser som er Inest gunstige i hvert enkelt tilfelle.

For å få istand en optimal enzymatisk hydrolyse,

er det likeledes hensiktsmessig å velge ultrafiltreringsmem-braner som skal benyttes sammen med reaktoren med omhu. Membranene som benyttes er av hvilken som helst type, organisk eller uorganisk. En organisering av membranene som har gitt gode resultater, er moduler med kulefiber. Spesielt kan man benytte membraner fra Amicon som er tilgjengelig på markedet under betegnelsen H10P5 ( terskelverdi 5000) og H10P10 ( terskelverdi 10 000) , og likeledes med membraner fra Romicon som er tilgjengelige på markedet under betegnelsen PM2 (terskelverdi 2000) eller PM50 (terskelverdi 50 000). De eneste betingelser man må ta hensyn til, er at membranen effektivt holder tilbake enzymet, samtidig som den har tilfredsstillende egenskaper, spesielt når det gjelder levetid.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres i to separate trinn: Et første trinn består av den enzymatiske hydrolyse, og et annet trinn består av ultrafiltrering knyttet til den nevnte hydrolyse. Utstyret for å utføre hver av disse operasjonene kan være adskilte eller integrerte.

Som en variant kan fremgangsmåten likeledes utføres kontinuerlig, hvor de to trinn nevnt ovenfor utføres i et enkelt apparat. I den første tid av driften, f.eks. i den første timen, tilbakeføres permeatet (væsken som går gjenom membranen) mot hydrolysesonen for å få det ønskede hydrolyseutbyttet fra det kaseinholdige materiale. Etter hydrolysen, tilføres reaktoren det kaseinbaserte utgangsmateriale som skal behandles i en mengde som tilsvarer den mengde permeat som fremstilles.

En foretrukket form for utførelse ifølge oppfinnelsen består således i å kombinere og anvende kontinuerlig den enzymatiske hydrolyse og ultrafiltreringen på membranet, noe som gjør det mulig å gjenvinne alle peptidene fra hydrolysatet i permeatet. De karakteristiske trekk ved ultrafil-treringsmembranet som benyttes sammen med den enzymatiske hydrolyse, bør være slik at alle peptider fra hydrolysatet fritt passerer. Membranet med en terskelverdi på 50 000 eller mer, har vist seg å passe.

Ifølge et viktig karakteristisk trekk ved oppfinnelsen, tilsetter man deretter permeatet minst ett salt av toverdige kationer som kan danne aggregater med den fosforiserte fraksjon av peptidene. Man har konstatert at kompleksdannelsen med de toverdige kationer, letter agglomereringen av fosforpeptidene seg imellom, noe som gjør det mulig å skille dem fra de ikke-forforiserte peptider. Separering av fosforpeptider og ikke-fosfor-peptider etter den enzymatiske hydrolyse, baserer seg på fosforinenes evne til å la seg kompleksdanne med jord-alkalimetaller, og spesielt med kalsium og magnesiumioner. Siden hydrolysen ifølge fremgangsmåten finner sted i protein-oppløsninger som er uten kalsium og/eller magnesium, er det viktig å tilsette toverdige kationer av denne type som med-fører kompleksdannelse til de tilveiebragte peptidoppløsninger etter hydrolysen.

I praksis foretrekker man som toverdige kationer

for kompleksdannelse å benytte kationer som tilføres som kalsiumklorid. Mengden kompleksdannende midler med toverdige kationer som ifølge oppfinnelsen bør tilsettes peptidoppløs-ningen er ikke kritisk. I praksis vurderes mengder av kalsiumklorid i størrelsesorden 0,5 vekt-% i forhold til peptidopp-løsningen som passende.

Det er underforstått at de som kjenner foreliggende teknikker, kan velge de toverdige forbindelser og mengden som skal benyttes, likeledes under hensyntagen til de karakteristiske trekk ved det etterfølgende trinn hvor man skiller mellom aggregatene av fosforpeptider og ikke-fosforpeptider, hvor den nevnte separering ifølge oppfinnelsen finner sted ved hjelp av en ultrafiltrering. Med andre ord er det nødvendig å velge en terskelverdi for membranet i ultrafiltreringen slik at fosforpeptidaggregatene ikke- går gjennom membranet.

Ifølge en utførelse sem har gitt gode resultater, tilfører man mineralsk fosfat saumen med det kompleksdannende middel, så som natriumhydrogenfosfat Na2HP04. Nærværet av en slik fosfat-forbindelse kan favorisere kompleksdannelsen, og dannelsen av store fosforpeptidaggregater. Men i visse tilfeller og spesielt hvis man ønsker å frembringe fosforpeptidfraksjoner som ikke er sterkt anriket på fosfatmineral, kan man redusere mengden fosfat som tilsettes, eller totalt unngå dette, der-som man ved slutten av fremgangsmåten benytter et membran som er i stand til å holde tilbake fosforpeptidene, hvor terskel-verdien fortrinnsvis er mellom 2000 og 50 000, og helst mellom 2000 og 10 000.

Som man har nevnt foran, kan ultrafiltreringene følges av én diafiltrering hvorunder man kontinuerlig eller diskontinuerlig tilsetter en væske så som vann eller en saltoppløsning for å rense produktene fra ultrafiltreringen.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har vann vist seg å

være et passende diafiltreringsmiddel.

Som resultat av ultrafiltreringen og diafiltreringen som følger den enzymatiske hydrolyse, får man på den ene siden en peptidoppløsning som behandles etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og på den annen side en fraksjon (filterrest) som består av proteinrester og restenzymer.

Som resultat fra ultrafiltreringen og diafiltreringen som utføres ved slutten av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen,

får man på den ene siden som permeat ikke-fosfdr-pep-

tider, og på den annen side som filterrest, fosforpeptidene.

I en foretrukket utførelse fremstilles peptidfraksjonene fra en 6% oppløsning av natriumkaseinat. Hydro-

lysen i en enzymatisk reaktor utføres med pankreatin i en mengde på 4 g/l med pH 8 og 37°C. Innholdet i reaktoren diafiltreres deretter med vann. Peptidoppløsningen sur-gjøres deretter til pH 6,2, aggregeringen utføres ved tilsats av CaCl2 (0,5%) og Na2HP04 (0,2%). Peptidoppløsningen ultrafiltreres og diafiltreres deretter. Med utgangspunkt

i 1000 1 6%-oppløsning av natriumkaseinat får man 900 1 av en ikke-fosfor-peptidoppløsning på 45 g/l og 100 til 120 1

av en fosforpeptidoppløsning på 80 g/l.-

Fosforpeptidene tilveiebragt på denne måte ifølge oppfinnelsen, utgjør et meget interessant, verdifullt produkt. Det har et høyt innhold fosfoseriner, og et lite innhold av aromatiske aminosyrer (fenylalanin, tyrosin, tryptofan).

Den tilveiebragte fraksjon som er rik på fosfor-peptider, er således karakterisert ved sin spesielle sammensetning av aminosyrer, og likeledes ved sitt høye innhold av mineraliske stoffer (aske) i forhold til det totale nitro-geninnhold, siden fosforpeptidfraksjonen er kompleksdannet med de tilsatte salter.

Den etterfølgende tabell I angir hovedinnholdet i produktene ifølge oppfinnelsen i den første kolonnen, og innholdet i enverdig kaseinat som referanse..

Fosforpeptidene tilveiebragt ifølge oppfinnelsen kan ha en rekke anvendelser.

Produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen anvendes som næringsmidler og spesielt for mennesker, og ved terapeutisk ernæring. Man vet at i menneskemelk er organisk fosfor, dvs. knyttet til proteiner eller lipider, relativt høyere enn i andre melkeslag, og spesielt kumelk. Således er forholdet ca. 0,83 i menneskemelk, mot 0,34 i kumelk. Nærmere bestemt er forholdet

ca. 0,70 i menneskemelk, mot 0,36 i kumelk. Produktene i-"følge oppfinnelsen finner således anvendelse i det området som benevnes morsmelkstillegg.

Men på generell måte er det kjent at den essensielle kvalitet i melkeproteiner hos kvinnen sikrer en nitrogenana-bolisme, som på en bemerkelsesverdig måte er knyttet til en spesielt liten osmotisk nyrebelastning, og belastning av H+ -ioner.

Men sammenfallet mellom denne meget høye nitrogen-anabolisme og meget lave osmotiske nyrebelastninger og belastning i H+<->ioner er spesielt søkt i gjenopplivning og terapeutisk næring, hvor man ofte samtidig har høye anabolisme-behov og en utilstrekkelig nyrefunksjon.

Produktet som fremstilles ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å svare på disse behov. Produktene har for visse anvendelser et utilstrekkelig innhold av visse essensielle aminosyrer (fenylalanin, tyrosin, tryptofan, cystin). De kan derfor med hell tilsettes andre proteiner eller peptider eller homologe a-keto-syrer eller a-(OH)-syrer av essensielle aminosyrer for å gjenopprette en 9oå likevekt i aminosyrer som fører til en optimal biologisk verdi.

Man legger også merke til at slike produkter (fosforpeptider) har en høy affinitet, vis a vis makroelementer (kalsium, magnesium) og oligoelementer så som spesielt jern, sink, kobber, krom, nikkel, kobolt, mangan og selenium.

Fosforpeptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan med hell omdannes til salter av de nevnte elementer ved kjente fremgangsmåter. For å tilveiebringe et slikt organofosforsalt, kan man f.eks. benytte som diafiltreringsoppløsning under rensing av fosforpeptidene, en oppløsning av salt som inneholder det element som skal innføres, f.eks. en oppløsning':av jernklorid når det dreier seg om jern. Slike organofosforsalter er meget oppløslige og kan med hell benyttes som bærere for elementene det dreier seg om.

Produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen møter spesielle næringsbehov hos pasienter som lider av pankreassvikt, meta-bolske sykdommer, næringssvikt eller underernæring eventuelt

knyttet til en svikt i nyrefunksjonen eller en organisk

feil i nyrene, og spesielt når de er forbundet med peptider, essensielle aminosyrer eller homologe av essensielle aminosyrer.

Produktene finner således anvendelse direkte

som dietiske stoffer eller terapeutiske næringsmidler som fullstendig er assimilerbare av den menneskelige organisme.

Uansett hvilken kilde som benyttes for proteiner, peptider eller aminosyrer, vil disse fosforpeptidene gjøre det mulig på en meget ønskelig måte å regulere mengden av organisk fosfor som er knyttet til nitrogen, i det preparat man ønsker å skape.

Som nevnt ovenfor, finner fosforpeptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen og likeledes derivater og spesielt deres organofosforsalter som dannes med mineralske elementer,

så som kalsium eller magnesium og/eller sammen med oligo-elementer (Fe, Zn, Cu, Cr, Ni, Co, Mn,Se) en interessant dietisk anvendelse.

Produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan således benyttes i dietetiske preparater som inneholder en effektiv mengde av minst ett slikt fosforpeptid eller derivat av fosforpeptid, sammen med en passende bærer fra et næringsmessig synspunkt. Den effektive mengde kan variere innenfor vide grenser etter den effekt man ønsker. Som indikasjon kan man si at en mengde på 10 vekt-% i forhold til totalvekten av preparatet har vist seg å være gunstig i de fleste tilfeller.

Disse produktene kan likeledes finne en anvendelse som legemidler for mennesker og dyr.

Legemidlene passer for bekjempelse av alle lidelser som omfatter en mangel på organisk fosfor og visse mineralske elementer. Man gir i det etterfølgende illustrerende og ikke begrensende eksempler på slike anvendelser.

Mineralske derivater av fosforpeptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen som består av deres kalsiumsalter, utgjør et mineralsk og proteinholdig supplement rikt på organisk fosfor og kalsium. De finner anvendelse som legemiddel, f.eks. ifølgende tilfeller:

- rekalsifisering av ben etter brudd

- behandling av osteoporose

- kalsiumtillegg ved behandling av rakitt. Fosforpeptidderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen som består av magnesiumsalter gir et mineralsk og proteinholdig supplement rikt på organisk fosfor og magnesium. Det finner anvendelse som legemiddel for å bekjemte alle former for magnesiummangel, spesielt hos voksne, f.eks. i følgende tilfeller :

- Mg-behov som er sterkt øket på grunn av stress

- dårlig anvendelse av Mg i næringsmidler hos gamle

-økning av behovet for Mg hos svangre kvinner.

Legemidler som inneholder fosforpeptidderivater som består av blandede salter av kalsium og magnesium benyttes på samme måte som et mineralsk og proteinholdig supplement. Det er underforstått at tilsvarende anvendelse kan gjøres av forskjellige salter av f osf orpeptider som fremstilles ifølge oppfinnelsen, men i praksis er kalsium og/eller magnesium foretrukket.

Man legger merke til at fosforpeptidene som er tilveiebragt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, foreligger i form av sine toverdige kation-salter, og spesielt som salter av kalsium og/eller magnesium. Hvis det er behov for det, kan disse saltene gi nøytrale fosforpeptider ved å redusere pH i miljøet, f.eks. til ca. 4,6. Men i praksis er denne operasjon ikke nødvendig siden fosforpeptidslatene passer perfekt til sin anvendelse. Når fosforpeptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen således til-føres til dietetiske eller farmasøytiske preparater, foreligger de i form av salter, f.eks. av kalsium og/eller magnesium.

Makroelementene (kalsium og/eller magnesium) kan erstattes, ihvertfall delvis, av oligo-elementer.

Fosforpeptidderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen som inneholder oligo-elementer finner en tilsvarende anvendelse sem de spesielle oligo-elementer.

De generelle indikasjoner for medisinske preparater som inneholder fosforpeptidderivater og oligo-elementer er spesielt dårlig absorbsjon i tarmsystemet som medfører mangel på oligo-elementer (Fe, Zn, Cu, Cr, Ni, Mn, Se). Denne dårlige absorbsjon fremtrer spesielt ved betennelser i tarmsystemet, ved tarmoperasjon, tarmhulesykdommer og ved be-strålte tarmer. Som et eksempel vil mangel på sink kunne frembringe enteropatisk akrodermitt, diaré, en øket følsomhet overfor infeksjoner, og hypogonadisme. Mangel på jern kan medføre sideropen anemi.

Oppfinnelsen blir i det etterfølgende illustrert

ved den etterfølgende beskrivelse og de medfølgende tegninger. Fig. 1 viser skjematisk de forskjellige trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Fig. 2 viser en skjematisk reaktor som kan benyttes

i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Som vist i fig. 1, kan utgangsmaterialet A som inneholder enverdig kaseinat (natrium eller kalium) direkte underkastes fremgangsmåten (referanse 1) eller underkastes en alternativ for-behandling (referanse 2). Etter dette alternativ hydrolyseres utgangsmaterialet ved hjelp av løype for å frembringe en oppløsning som inneholder det tilsvarende parakaseinat (natrium eller kalium), og kaseinmakropeptid. Parakaseinet utfelles ved surgjøring (HCl). Man skiller deretter det ut-felte parakasein fra kaseinmakropeptid. Dette (CMP) utgjør et underpro-dukt, G, etter fremgangsmåten, som uten at disse operasjonene er vist, nøytraliseres med f.eks. natriumhydroksyd, og konsentreres deretter ved ultrafiltrering etter tilsetning av kalsiumklorid.

Utgangsmaterialet for fremgangsmåten er således enten kaseinat A eller derivatet parakasein.

Første trinn i fremgangsmåten er hydrolyse (referanse 3) i en enzymatisk reaktor. Man viser på tegningen tilsetning av en base som gjør det mulig å få pH 8 for å få en god gjennomføring av hydrolysen ved hjelp av et proteolytisk enzym som pankreatin. Produktet fra hydrolysen underkastes deretter en ultrafiltrering (4), og deretter en diafiltrering (5) med vann. Man får på den ene side en peptidfrak-sjon,E, og en restfraksjon, F, som inneholder proteiner og restenzymer. Det er peptidfraksjonen E som behandles komple-mentært i fremgangsmåten. Det etterfølgende trinn er en kompleksdannelse (referanse 6), hvor man tilsetter kalsiumklorid og eventuelt fosfat, Na2HP0^ til fraksjon E. Etter kompleksdannelsen eller aggregering av peptidene, underkastes produktet en ultrafiltrering, 7, og deretter en diafiltrering, 8, med vann. Man får så endelig en fraksjon, B, (permeat),

som er anriket på ikke-fosforpeptider, og en fraksjon C som er anriket på fosforpeptider.

Fig. 2 viser en enzymatisk reaktor med membran som kan benyttes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Den omfatter først et reaksjonskar med benevnelsen 15. Den kontinuerlige mating med fosforkaseinat foregår gjennom ledningen 16. Et apparat 17, virker på samme tid til å måle og opprettholde pH i reaksjonskaret og nøytrali-sere H+<->ioner som frigjøres når peptidbindingene brytes. Apparatet er en pH-stat Mettler som omfatter en potensial-forsterker, forvelger for likévektspunktet, og en automa-tisk byrette for fordeling av reaktant, og den siste er en basisk forbindelse som nevnt ovenfor. Man har ikke kunnet konstatere noen spesiell tilstopping av elektroden. Hydrolyseproduktet føres fra reaksjonskaret gjennom ledningen 18, og ved hjelp av en pneumatisk pumpe 19 til membranen. Et praktisk eksempel er pumpen av typen"Amicon LP 20 A", som er i stand til å gi 720 l/time ved 1,7 bar. Ved hjelp av pumpen passerer produktet gjennom en ledning 20, og føres til et forfilter 21, med en porøsitet på 150 ym. Referansen 22 betegner ultrafiltreringsmodulen. I det spesifikke eksempel, benytter man systemet "Amicon DC 10 S", som omfatter ultrafiltreringspatroner med hule fibere. Permeatet tas opp av en ledning 23, og består av det ønskede peptidhydrolysat. Filterresten fra modulen 22 føres fra ledningen 24 inn i en varmeveksler 25, og føres gjennom ledningen 26 for å re-sirkuleres til reaksjonskaret 15.

De benyttede membraner har hule fibre med følgende egenskaper:

EKSEMPEL 1

I dette eksemplet benytter man natriumkaseinat som utgangsmateriale.

Fremstillingen av kaseinmakropeptidpreparatene og peptidfraksjonene utføres i to trinn: 1) Natriumkaseinat i vandig 3%-oppløsninq hydrolyseres i karet med løype (20 ml/100 liter - løype av typen Boll 1/10 000) ved 37°C og pH 6,8 i 50 minutter. Parakasein utfelles deretter ved surgjøring til pH 4.6 med saltsyre 4 N; 440 ml syre for 100 1 serum er nødvendig..

Etter dekantering filtreres den overstående væske på plater, og sentrifugeres deretter (1000 g i 8 minutter) etter justering av pH 6,6 ved kaliumhydroksyd 2 N. Denne opp-løsning konsentreres deretter ved ultrafiltrering på membraner etter tilsetning av CaCl2 (0,5 q/l). Apparatet som benyttes er en modul av typen"Amicon DC 10" styrt med membraner av typen 'komicon Hollow Fiber" type XM 50 med overflate 1,4 m^.

Kjemiske analyser av de forskjellige tilveiebrakte produkter under denne fremstillingen er gjengitt i tabell II og III.

2) Natriumkaseinat i oppløsning med vann på 6,2% hydrolyseres i en enzym-reaktor med membran identisk med den som er vist i fig. 2. De benyttede membraner er av typen med hule fibre XM 50 med en overflate på 4,9 m<2>. Enzymet (pankreatin Sigma fra storfe med en aktivitet 4 NF) tilsettes i en konsentrasjon på 4 g/l. PH i reaktoren holdes på 8 ved tilsetnina av 2 N kaliumhydroksyd. Hydrolysen foregår ved 37 - 40°C. Permeatet, må, før det samles opp, resirkuleres til karet i en time. Permeatet tilveiebragt på denne måten inneholder fosforpeptider og ikke-fosfor-peptider. Permeatet surqjøres til pH 4,6, hvoretter man frembringer en aggregering av fosfor<p>eptidene ved tilsetning av CaCl2 (0,6%) og Na2HP04 (0,1%). Man fraksjonerer deretter de to peptidgrupper ved ultrafiltrering og diafiltrering med vann for å fjerne hele fraksjonen av ikke-fosfor-peptider. Operasjonene med konsentrasjon og diafiltrering utføres på membraner av typen XM 50 ved pH 6,5 og en temperatur på 8°C. Det diafil-trerte konsentrat korresponderer med fosforpeptidfraksjonen.

Analysen av de forskjellige produkter er gjengitt i tabell IV og V nedenunder:

Eksemplene som vedrører anvendelse av produktene ifølge oppfinnelsen, er angitt nedenunder.

EKSEMPEL 2.

Dette eksempel viser et gjenopplivningsprodukt som skal brukes: Ved tilførsel gjennom tarmen hos pasienter som krever en proteintilfør sel i størrelsesorden 7-15% av det totale energiopptak (TEO) f.eks. ved følgende lidelser: mucoviscidose eller cystisk fibrose i pankreas, nyresvikt, pasienter med infeksjon eller betennelse i tarmveggen, underernæring som krever intens anabolisme, redusert osmotisk nyrebelastning og belastning av H+ -ioner. Disse proteiner til-føres fortrinnsvis i oppløst form.

Eksempler på sammensetning av et preparat på 100 g ifølge oppfinnelsen:

- lipider:

blanding av like deler : - vitaminer - mineralske elementer

- destillert vann q.s.p. 100

EKSEMPEL 3.

Dette eksempel vedrører et produkt for gjenopp-living som skal brukes ved tilførsel gjennom tarmen hos pasienter som har behov for proteintilførsel i størrelses-orden 12-25% av det totale kaloriopptak i form av proteiner. En slik næringstilførsel passer i alle situasjoner hvor det er nødvendig med en stor nitroqenanabolisme, og en ekstra tilførsel av organisk P.

Eksempel på et preparat pr^ 100 g:

- blanding av små peptider som fremstilles ifølgs oppfinnelsen:

- lipider: — g]ycider: -vitaminer - mineralske elementer

- destillert vann q.s.p. 100

EKSEMPEL 4.

Dette eksempel vedrører et produkt for gjenopplivning som skal tilføres gjennom tarmen hos pasienter som har behov for et proteinopptak i størrelsesorden 7 til 12% av total kaloriop<p>tak, spesielt ved følgende lidelser: mucoviscidose eller cystisk fibrose i pankreas, nyresvikt, pasienter med infeksjon eller betennelse i tarmveggen, underernæring som krever intens anabolisme og en redusert osmotisk nyrebelastning og belastning på H+<->ioner. Disse proteiner tilføres fortrinnsvis i oppløst form.

Eksempler på preparat pr. 100 g:

- blanding av små peptider ifølge oppfinnelsen:

- lipider: - vitaminer: - mineralske elementer:

- destillert vann q.s.p. 100

Blandingen av peptider som inneholder fosforpeptidene ifølge oppfinnelsen, kan fortrinnsvis omfatte peptider tilveiebragt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i FR-PS 79.16.483 Man husker at et slik peptidhydrolysat praktisk talt ikke inneholder restproteiner og at 50% av peptidene inneholder 2 til 5 aminosyrer. Nærmere bestemt inneholder hydrolysatet 70 til 90% av nitrogenet som er tilstede i form av peptider med et aminosyretall på mindre enn 10. I en spesifikk form har hydrolysatet følgende aminogram:

Aminogram:

Fremgangsmåten for å frembringe et slikt hydrolysat består i først å utføre en ultrafiltrering av laktoserum, deretter enzymatisk hydrolyse av dette, og den er bemerkelsesverdig ved det at man bringer filterresten fra ultrafiltreringen i kontakt med et proteolytisk enzym som er i stand til å rekonstituere proteinfordøyelsen som finner sted in vivo i den menneskelige organisme, og dette enzym er fortrinnsvis pankreatin, hydrolysen utføres like til produktet ikke lenger inneholder restproteiner, dvs. at der ikke er tilstede utfell-bart nitrogen ved hjelp av trikloreddiksyre på 12%, hvoretter hydrolysatet samles opp, og dette representerer det totale ønskede, enzymatiske hydrolysat.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider som anvendelse som nærings- eller legemidler ved behandling av et kaseinbasert materiale som inneholder fosforkaseinater av enverdige kationer og deres derivater hvorved man underkaster det nevnte materiale en hydrolyse eller ved hjelp av pankreatin eller blandinger derav med a-kymotrypsin og trypsin og andre proteolytiske enzymer, og underkaster det tilveiebragte hydrolysat minst en ultrafiltrering med membraner som lar alle peptider fra hydrolysatet gå gjennom til permeatet, karakterisert ved at man til permeatet tilsetter minst ett salt av toverdige kationer for å danne aggregat med den fosforiserte fraksjon av de nevnte peptider, noe som fører til en oppløsning som hovedsakelig inneholder aggregater av fosforpeptider og ikke-fosforpeptider, og ved at man ved hjelp av minst en ultrafiltrering skiller ikke-fosforpeptidene.fra fosforpeptidene som har en større partikkelstør-relse, ved å bringe oppløsningen i kontakt med minst et membran som er i stand til å holde tilbake, fosforpeptidene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører enzymhydrolysen i en innret-ning som kombinerer et ultrafiltreringsutstyr og en enzym-reaktor, som således består av en enzymreaktor med membran.

3. Framgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at man justerer pH til mellom 7 og 9, fortrinnsvis mellom 7 og 8,5, f.eks. 8 under enzym-hydrolysen.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at hydrolyse-temperaturen velges mellom 37 og 45°C, fortrinnsvis mellom 37 og 4 0°C, og helst 37°C.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at man ihvertfall delvis erstatter de toverdige kationer i fosforpep-tidsaltene med jern, sink, kopper, krom, nikkel, kobolt, mangan eller selen, ved under rensingen av fosforpeptidene å benytte en oppløsning som inneholder det eller de kationer som skal innføres, noe som fører til organofosforsalter av tilsvarende kationer.