NO151442B - Fremgangsmaate for fremstilling av fosforpeptider eller salter derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for fremstilling av fosforpeptider eller salter derav, for anvendelse som nærings- eller legemidler, ved behandling av et kaseinbasert materiale som inneholder fosforkaseinater med toverdige kationer.

Den vedrører nærmere bestemt en fremgangsmåte for behandling av et slikt materiale som inneholder fosfor kasein-

ater med toverdige kationer, så som kalsium- og/eller magne-siumfosforkaseinater. Slike stoffer foreligger f.eks. i melk eller i melke-materialer så som filter-rester fra ultrafil-

trering av melk.

Man vet at kaseiner fra melkeprodukter, og spes-

ielt fra melk inneholder fosfoseriner som gir peptidene, hvor de finnes, interessante fysiokjemiske, teknologiske og fysiologiske egenskaper. Man vil spesielt finne angivelser over melkeproteiner i verket av H.A. Mc Kenzie (1971) med tittelen "Milk proteins" vol. 1 og 2, Academic Press New York.

Ultrafiltrering på membraner med utgangspunkt i

såvel de fremskritt som er gjordt når det gjelder apparater som forståelsen av de observerte fenomener, er det som er mest utbredt i meieri-industrien for behandling av melk (se f.eks.

J.L. Maubois og G. Mocquot (1971)-Preparation de fromages å

partir de pré-fromages liquides obtenus par ultrafiltration"

i tidsskriftet "Le Lait" bind 51, 508, 495-533). Når melken går gjennom ultrafiltrerings-membranet, vil vann, oppløselige mineralsalter, laktose, nitrogenforbindelser med liten molekylvekt (peptider, fri aminosyrer) og vannoppløselige vit-aminer gå gjennom membranet i form av et ultrafiltrat eller permeat, mens proteinene og de tilknyttede forbindelser (kal-

sium, fosfor) fettperler og lipofilelementer holdes tilbake og konsentreres etterhvert som vannfasen fjernes: disse utgjør filter-restene eller proteinkonsentratet. Frembringelsen av proteinkonsentrater med høy renhet, gjør det nødvendig å ben-

ytte ultrafiltrering såvel som diafiltrering. Ved diafiltreringen tilsettes vann eller vandige oppløsninger som inneholder salter kontinuerlig eller diskontinuerlig til ultra-

filtrerings-restene. Man fjerner samtidig eller etterhvert den tilsvarende mengde permeat. En slik operasjon har som følge å utarme filter-resten på filtrerbare elementer. For-delen ved ultrafiltrering på membraner er å bevare melke-proteinene i sin opprinnelige tilstand.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen drar fordel av ultrafiltrering på membraner for å frembringe en fraksjonering av bestand-delene i utgangsmaterialene som inneholder kasein, men kombinerer denne ultrafiltreringen med enzymatisk hydrolyse.

Man kjenner et visst antall fremgangsmåter for hydrolyse av proteiner, f.eks. melkeproteiner. Syrehydrolyse er effektiv for å frembringe oppløsninger av fri aminosyrer men ødelegger visse av disse. Basisk hydrolyse bevarer tryptofan men medfører en uoppløselig-gjøring som sterkt reduserer næringsverdien av de o<p>prinnelige protein-konsentrater.

Enzymatisk proteolyse er kjent og er blitt prak-tisert i lengre tid med henblikk på'analytiske stoffer eller næringsmidler hvor formålet er å oppløselig-gjøre protein. Litteraturen legger hovedsakelig vekt på de tallrike nærings-middelanvendelser av hydrolysater av soya-proteiner (se S. Arai, M. Noguchi, S. Kurosawa, H. Kato og M. Fujimaki (1970) "Applying proteolytic enzymes on soybean",6-Deodorization ef-fect) fiskeproteiner (se P. Hevia, J.R. Whitaker og H.S. Olcott

(1976)"Solubilazation og a fish protein concentrate with proteolytic enzymes',<1> J. Agric. Food Chem. vol. 24 (2) 383-385) eller raps ved påvirkning av animalske, mikrobielle eller vegetabilske proteaser.

Anvendelsen av disse fremgangsmåter på melkeproteiner i industriell målestokk.er imidlertid begrenset.

Enzymatisk proteolyse har ingen av de ulemper man får ved kjemiske metoder. Hydrolyse-betingelsene modereres og bevarer næringskvaliteten på produktene.

Vanligvis gir hydrolysen peptider med en utpreget bitter smak. Denne egenskapen begrenser anvendelsen av disse hydrolysater som næringsmidler for mennesker. Intensiteten på bittersmaken i hydrolysatet avhenger i hovedsaken av arten av protein-substrat og enzymenes spesifike egenskaper. For å eli-minere den bitre smaken, har man foreslått å benytte exo-peptidater. Se f.eks. S. Arai, M. Yamashita, H. Kato, M.

Pujimaki (1970)-"Agric. Biol. Chem." 34, 729, og likeledes

K.M. Clegg, G. Smith og A.L. Walker (1974) - "Production of

an enzymatic hydrolysate of casein on a kilogram scalé',

J.Food Technol. 9, 425-431. Man har likeledes foreslått

å modifisere peptidene ved tilsats av glutaminsyre før plast-reaksjonen. Det er likeledes mulig å anvende fjerning av de hydrofobe aminosyrene.

Men inqen av disse kjente fremgangsmåtene er helt tilfredsstillende og møter ikke oppfinnelsens behov. I virkeligheten vil en sterk oppløseliqgjøring forårsaket av anvendelse av expopeptidase øke innholdet av triaminosyrer og spesielt arginin, lysin, tyrosin, valin, fenylalanin, metio-

nin og leucin, noe som har som virkning direkte å sperre transportsystemene på nivå med tarmbarrieren for fri amino-

syre, og derfor medføre en redusert næringsvirkning av hydro-lysatene. Videre vil den iboende kvalitet for hydrolysatet modifiseres siden likevekten for aminosyrene selv forandres,

noe som gjør det nødvendig med ekstra tilsetning av frie amino-syrer.

På det teknologiske nivå, krever den enzymatiske hydrolyse vanligvis et diskontinuerlig reaktorsystem. Enzymet tilsettes proteinoppløsninger som skal behandles. Etter en kortere eller lengre oppholdstid, under gunstige betingelser for den enzymatiske aktivitet, og for å angripe substratet, modifiseres pH, og en lett vannbehandling fjerner den enzym-

atiske aktivitet. En sentrifugering kan utføres for å begrense den uoppløselige fraksjon som ikke lar seg oppløse. Men i følge denne fremgangsmåten med diskontinuerlig enzymatisk hydrolyse reaksjon, er det vanskelig å benytte et høyt forhold mellom enzym og substrat. Man vet imidlertid (se R.C. Robins

(1978) ILEffeet of ratio of enzymes to substrat on amino acid patterns released from proteins in vitro'} Internat.. J. Vit.

Nutr. Rea. _4J3, 44-52,) den avgjørende påvirkning på forholdet mellom enzym og substrat av arten av fri aminosyrer og peptider som frigjøres under proteolysen. Men en diskontinuerlig fremgangsmåte, må man destruere enzymene ved slutten av hydrolysen dersom disse finnes i overskudd, noe som er uforenlig med de foran nevnte høye forhold.

Man har likevel foreslått å benytte reaktorer med faste enzymer. Men disse representerer vesentlige ulemper på det praktiske plan. De optimale betingelser for den enzymatiske aktivitet og spesielt pH betingelsene, forskyver seg slik at reaktoren ikke permanent er tilfredsstillende.

Man kan likeledes konstatere bakteriologiske problemer, til-tetning av underlaget og likeledes adsorpsjon av proteiner

på underlaget. Videre har den enzymatiske reaksjon en tendens til å hemmes i løpet av tiden på grunn av det dannes komplekser mellom enzym og proteinfragmenter. Hemmelsen kan likeledes skyldes underlagets art. Det er likeledes vanskelig å benytte multi-enzymsystemer på grunn av konkurranse fenomener hos enzymene via-a-vis substratet og stabilitet som er for-skjellig hos enzymene i løpet av tiden.

Oppfinnelsen benytter visse innretninger som al-lerede er kjent i visse andre anvendelser og som består i å benytte enzymatiske membran reaktorer. En kan f.eks. referere til artikkelen av C. Cheftel (1972)-"Solubilisation enzymatique continue du concentré protéique de poisson. Essai de recyclage des enzymes"Ann. Technol. Agric. 2_1, (3) 423-433 som beskriver en membran reaktor som benyttes for proteolyse av protein-konsentrater. Ultrafiltrerings membranet gjør det mulig å holde tilbake enzym i oppløsningen i reaksjonen sammen med proteinsubstratet.

Bare hydrolyseproduktene, peptidene, fjernes etter hvert som de dannes. Men i praksis vil anvendelsen av en slik reaktor ikke være enkel, som understreket av Cheftel. Substratet bør kunne gjøres fullstendig oppløselig ved hjelp av enzymet og proteinoppløsningen bør ha en utmerket bakter-iologisk kvalitet.

Av dokumenter som illustrerer teknikkens tilstand kan man videre nevne de følgende referanser: FR-PS 2.292.435 vedrørende tilveiebringelse av kalsium-sforkaseinat fra en ultrafiltreringsrest av melk. Dette patent har således L formål å frembringe kalsiumfosforkaseinat uten at man angir innretninger for å fraksjonere dette;

FR-PS 2.399.213 beskriver behandling av et hydrolysat ved ultrafiltrering fulgt av elektrodialyse.

Dette dokumentet viser at det er kjent å ultrafiltrere et proteinhydrolysat. Den i patentet beskrevne fremgangs-

måte gjør det mulig å fremstille en ren oppløsning av naturlige aminosyrer.

Referansen Chemical Abstracts, vol. 87, nr. 19,

7 nov. 1977, side 265, abstrakt 148 285p Columbus Ohio (US)

& J.Dairy Research, vol. 44, nr. 2 (1977) sidene 373-376,

D.W.West "A simple method for the isolation of a phosphopeptide

from bovine a Sl-casein", beskriver tilveiebringelsen av et fosforpeptid fra kaseinat. Fremgangsmåten omfatter en enzym-

atisk hydrolyse ved hjelp av trypsin, og fraksjonering ved hjelp av filtrering på gel og kromatografi, men tar utgangs-

punkt i en reaksjon med CNBr som'fører til spesifikke produkter.

Referansen Chemical Abstracts, vol. 91, nr. 21,

19 nov. 1979, side 523, abstrakt 173 597g Columbus Ohio (US)

& Enzyme Microb.Technol. vol. 1, nr. 2 (1979), sidene 122-124

J.P. Roozen et al. "Enzymic protein hydrolysis in a membrane reactor related to taste properties" beskriver hydrolyse i enzymatisk reaktor for det formål å få bedret smaken av pro-

tein hydrolysater. Dette dokumentet viser at enzymatisk reak-

tor er et kjent apparat.

Foreliggende oppfinnelse har til formål å frem-

bringe en fremgangsmåte for behandling av et kasein basert materiale hvor de toverdige ioner så som kalsium og/eller magnesium er kompleksdannet med fosfoseriner noe som er tilfelle i melk, og av filterresten fra ultrafiltrering av melk. Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er basert på det forholdt at fosfbrinene har en tendens til å bli kompleksdannet med jordalkali-ioner som kalsium- oq/eller maqnesiuir.ion.er slik at man i produktene fra den enzymatiske hydrolyse kan separere fosforpeptidene og ikke-fosforpeptidene. Kompleksdannelsen med toverdige kationer letter agglomereringen av fosforpeptidene seg imellom, noe som gjør det mulig å separere dem fra ikke-fosfor-peptidene.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider eller salter derav for anvendelse som nærings- eller legemidler ved behandling av et kaseinatbasert materiale som inneholder fosforkaseinater med toverdige kationer, slik som, fosforkaseinater av kalsium og/eller magnesium, hvorved man underkaster materialet en hydrolyse ved hjelp av pankreatin eller blandinger derav med a-kymotrypsin og trypsin og andre proteolytiske enzymer, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man samler det tilsvarende hydrolysat og underkaster dette minst en ultrafiltrering med membraner som er istand til å holde tilbake fosforpeptidene, samtidig som peptidene passerer igjennom, idet ultrafiltratet således inneholder de ikke-fos- . foriserte peptider, og samler opp filterresten fra ultrafiltrering og utfører en desaggregeringsbehandling av fosfor-peptidene som finnes i filterresten ved tilsetning av en syre eller en kompleksdanner for kalsium og/eller magnesium, og underkaster denne minst en ny ultrafiltrering på membraner som ikke holder tilbake fosforpeptidene slik at disse skilles fra enzymet og kan samles som produkt.

Utgangsmaterialene sem kan benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kaseinbaserte stoffer av en hvilken som helst opp-rinnelse som inneholder fosforkaseinater med toverdige kationer. Naturlig melk utgjør en passende kilde hvori fosfor kaseinatene av kalsium og magnesium begge er tilstede. En mer renset form av utgangsmaterialet som passer for oppfinnelsens behov består av en ultrafiltrerings-rest av melk som også inneholder jordalkali-fosforkaseinater. Det er likeledes mulig å benytte som utgangsmateriale fosfor-kaseinater som på forhånd er renset på i og for seg kjent måte, så som jordalkali-f osf orkaseinater f .eks. av magnesium eller kalsium som kan behandles ifølge oppfinnelsen.

Hvis man benytter en ultrafiltrerings-rest av melk som utgangsmateriale i fremgangsmåten, behøver ikke ultrafiltreringen som foregår på forhånd og som frembringer filter-resten ikke å drives til høy konsentreringsgrad. F.eks. vil konsentrasjonsgrader i størrelsesorden 1,5 til 3 være passende. I praksis velger man en konsentrasjonsgrad i størrelsesorden 2. Man kan likeledes la den egentlige ultrafiltreringen følges av en diafiltrering som gjør det mulig å rense filter-resten og øke forholdet mellom proteiner oa tOrrstoff.

Uansett hvilket utgangs-materiale som benyttes, underkastes dette, i overensstemmelse med fremgangsmåten i følge oppfinnelsen, en enzymatisk hydrolyse ved hjelp av minst ett proteolytisk enzym. Som nevnt foran, utføres en slik hydrolyse fortrinnsvis i en innretning som kombinerer et ultraf iltrerings-utstyr med en enzymatisk reaktor som således tillater kontinuerlig drift.

Ved en slik gjennomføring, utføres den enzym-hydrolysen kontinuerlig ved å innføre kaseinbaserte materialer i en reaksjons-sone for å få en god kontakt med enzymet, og å trekke bort kontinuerlig reaksjonsproduktet og føre det fram til reaksjonssonen til en ultrafiltrerings-sone og man trekker fra . denne likeledes kontinuerlig et permeat som utgjør det peptid-iske hydrolysat.

Innenfor rammen av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen, utføres en enzym-hydrolyse på proteinoppl.ja.s-. ninger hvor de toverdige ioner og spesielt kalsium-og/eller magnesium-ionene er kompleksdannet med fosforiner. Under enzym-hydrolysen bør pH justeres til mellom 7 og 9. For dette formål innføres kontinuerlig eller diskontinuerlig til reak-sj ons-sonen en basisk forbindelse som kan være natriumhydroksyd eller-karbonat, kaliumhydroksyd eller-karbonat, kalsiumhydroksyd, ammoniumhydroksyd eller en blanding av disse produkter. Valget av basisk forbindelse avhenger spesielt av formålet med slutt-produktet.

Som enzym benyttes fortrinnsvis minst et proteolytisk enzym som er i stand til å rekonstituere proteinfor-døyelsen som finner sted in vivo i den menneskelige organismen. Man benytter således fortrinnsvis pankreatin, som er en kompleks blanding som inneholder trypsiri, chymotrypsin-og andre sekundære proteolyttiske enzymer. I praksis benyttes et naturlig pankreasekstrakt som finnes på markedet og er lett tilgjengelig. Alt etter behovet kan man imidlertid benytte enzymer i en syntetisk blanding f.eks. a-chvmotrypsin og trypsin. Fortrinnsvis benytter man en syntetisk blanding hvor sammensetningen nærmer seg pankreatin og følgelig med nærvær av sekundære enzymer som finnes i naturlige pankreas-ekstrakt. Man har fun-net i følge oppfinnelsen at ved pH mellom 7 og 9, fortrinns-

vis mellom 7 og 8,5 f.eks 8 v-n i ' j. ■ oa andre til-

b 'J KS" °> V11 pankreatin oa andre tilsvarende enzymer gi maksimal stabilitet.

Det er nødvendig å ha relativt strenge tempe-raturbetingelser i den enzymatiske hydrolysesonen. Man har i virkeligheten konstatert at den enzymatiske aktivitet på-virkes mer av temperaturen enn av pH. Prøver har spesielt vist at med trypsin bør den maksimale temperatur under hydrolysen i følge oppfinnelsen ikke være større enn 54°C, og med chymotrypsin bør temperaturen ikke overskride 45°C. I praksis, når man benytter pankreatin, vii man innta et kompromiss mellom de optimale betingelser ved tarm-proteolyse in vivo (temp.

i størrelsesorden 37°C), og det forhold at høyere temperaturer er mindre gunstig for utvikling av bakterier og gjør det mulig å få høyere ultrafiltreringsutbytter. Vanligvis velges temperaturer mellom 37 og 40°C, og fortrinnsvis i nærheten av 37°C.

Det er selvsagt at reaksjonsparametrene, d.v.s. pH og temperatur for den enzymatiske hydrolyse er forbundet.

De som kjenner de foreliggende teknikker kan således' velge

de mest gunstige betingelser i hvert tilfelle.

Por å utføre en optimal enzym-hydrolyse er det likeledes nødvendig å velge den ultrafiltreringsmembran som skal benyttes med omhu i forhold til den enzymatiske reaktor. De membraner som benyttes er av en hvilken som helst type, organiske eller uorganiske. Den organisering av membranene som har gitt gode resultater er moduler med hule fiber. Spesielt kan man anvende membranene fra Amicon som finnes på markedet under betegnelsen H10P5 ( terskelverdi 5000) og H10P10 ( terskelverdi 10000) og likeledes membraner fra

Romicon som finnes på markedet under betegnelsen PM 50 ( terskelverdi 50000) og PM 2 ( terskelverdi 2000). Den eneste betingelsen som må respekteres er at membranet under bruk ef-fektivt holder tilbake enzymer, samtidig som den har tilfredsstillende egenskaper spesielt med hensyn til varighet.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen kan utføres

i to adskilte trinn: et første trinn som består i enzymatisk

hydrolyse og et annet trinn som består av ultrafiltrering til-knyttet den nevnte hydrolyse. Utstyret for å utføre hver av disse operasjonene kan være adskilte eller integrerte. Men som en variant kan likeledes fremgangsmåten utføres kontinuerlig, hvor de to trinn foran utføres i et enkelt apparat.

I den første driftstiden, f.eks. i den første timen, resirkuleres permeatet (væsken som går gjennom membranet) til hydrolyse-sonen for å få det ønskede hydrolyse utbyttet fra det kasein baserte materialet. Etter hydrolysen, tilføres reaktoren det kaseinbaserte utgangsmaterialet som skal behandles i en mengde som tilsvarer permeatet.

I praksis kan man benytte helmelk eller skummet melk uansett opphav. Hydrolysen utføres fortrinnsvis i en enzym-reaktor ved 37°C i nærvær av 2 g pr. liter pankreas-enzym i helmelken eller skummet melken hvor pH er justert til 8 etter tilsats av natriumhydroksyd.

Som en variant kan man behandle helmelk eller skummet melk som på forhånd er konsentrert ved ultrafiltrering i et konsentrasjonsforhold på ca. 2. Man bringer pH i denne filter-resten til en verdi på ca. 8 ved tilsats av natriumhydroksyd og underkaster den hydrolyse i en enzymatisk■reak-tor ved 37°C i nærvær av 4 g/liter pankreasenzym.

Etter hydrolysen konsentreres restoppløsningen

i enzym-reaktoren ved ultrafiltrering. Under dette trinnet, bringes oppløsningen inn i reaktoren som inneholder emzymer, de ikke-hydrolyserte proteiner, uoppløselige fraksjoner og fosforpeptider knyttet til kalsium, i kontakt med en membran som kan holde tilbake fosforpeptidene samtidig som ikke-fosforpeptider føres igjennom. For dette formål benyttes hvilke som helst organiske eller uorganiske membraner, hvor terskelverdien er mellom 2000 og 50000.

Ultrafiltreringen som er knyttet til den-enzymatiske hydrolyse følges fortrinnsvis av en diafiltrering som gjør det mulig å trekke ut ikke-f osf omentidf raksionen. Under defiltrering, tilsettes produktet i kontakt med membranen vann eller en passende saltoppløsning. I praksis er det påvist at ultrafiltrat av melk fremstilt under en forangående operasjon, eller fra en annen kilde, med hell kan benyttes som oppløsning for diafiltreringen. For å få gode resultater kan man føre pH i dette ultrafiltratet til verdier mellom 7 og 8.

Resultatene fra de forangående operasjoner ved fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er på den ene siden en fraksjon (permeat) som inneholder ikke-fosforpeptidene og på den annen side en filter-rest som inneholder fosforpeptider. Separasjonen mellom ikke-fosforpeptidene og fosf orpeptidene er i yirkeliqheten utført _.under den enzymatiske hydrolysen. De etterfølgende trinn med ultrafiltrering og diafiltrering gjør det mulig å skille for-bindelsene fysisk.

I det etterfølgende trinn av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen, gjennomføres en desaggregerings behandling av fosforpeptidene kontinuerlig i den siste filterresten. I følge en utførelse som er foretrukket i praksis, frigjøres filter-resten for å oppløse de toverdige ioner som er kompleksdannet til fosforpeptidene. Som syrer kan det benyttes en hvilken som helst mineralsyre eller organisk syre som er forene-lig med formålet i følge oppfinnelsen og produktenes bruksom-råder. Man kan således med hell benytte syrer som er aksept-able innenfor næringsmiddelområdet. Passende syrer er salt-syre, fosforsyre, svovelsyre, melkesyre og eddiksyre og andre, tilsvarende syrer. Man får gode resultater med melkesyre. Man surgjør filter-resten inntil man får en pH i nærheten av 4.6,

på denne verdi er man sikker på at alle kalsium og/eller magnesium ionene er brakt i oppløsning.

Som en variant kan man i stedet for surgjøring frembringe desaggregering av f osf orpeptidene ved påvirkning av kompleks-dannere for kalsium og/eller magnesium. I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse forstår man med kompleksdannere forbindelser som har evnen til å binde kalsium og/eller magnesium når de bringes i kontakt med fosforpeptidene som inneholdes i filterresten. Det dreier seg generelt om forbindelser som har en gelat-dannende virkning. Alt etter .formålene med produktet som fremstilles ifrilae anof.innelsen Van man med hell benytte forbindelser som er anvendt innenfor nærings^iddol-frnrådene cm spesielt natrium- eller kaliumcitrater.

Når man går ut fra et 'kaseinbasert råmateriale som består av skummet helmelk eller en filterrest fra ultrafiltrering av en slik melk, har man fått bedre resultater ved kontinuerlig surgjøring i den enzymatiske reaktor ved hjelp av 50% melkesyre til en pH på 4,6.

Under siste trinn i fremgangsmåten i følge oppfinnelsen utskilles fysisk en fraksjon som inneholder fosforpeptidene ved at man foretar en ytre ultrafiltrering under betingelser som tillater at man får på den ene side fosforpeptider, og på den annen side underprodukter så som protein-rester og enzymrester. Under en slik operasjon er det foretrukket at ultrafiltreringen følges av en diafiltrering på

i og for seg kjent måte med sikte på gjenvinning av produktene. I dette tilfellet anses en diafiltrering med rent vann å være best.

Fosforpeptidene tilveiebrakt på denne måte fra fremgangsmåten i følge oppfinnelsen utgjør det mest interessante og verdifulle produkt. Det inneholder i virkeligheten et høyt innhold av fosfoseriner og et lite innhold av aromatiske aminosyrer (fenylalanin, tyrosin, tryptofan).

Den tilveiebrakte fraksjon som er rik på fosforpeptider kan således karakteriseres ved spesiell sammensetning med hensyn til amino-syrer og likeledes ved et høyt innhold av mineralske stoffer (aske) i forhold til det totale nitrogeninnhold, under forutsetning^ av at fosforpeptidfraksjonen inneholder mineraler knyttet til kaseinet i utgangsmaterialet (melk eller filterrester av melk).

Tabell I som følger definerer hovedegenskapene for de nye fosforpeptider som fremstilles i følge oppfinnelsen.

Den venstre kolonnen i tabell I angir de kores-sponderende verdier for melk for sammenligningens skyld.

De tilveiebrakte fosforpeptider i følge oppfinnelsen kan ha en rekke anvendelser innenfor næringsmiddel området.

Produktet i følge oppfinnelsen (fosforpeptidene) benyttes som matvarer og spesielt for mennesker og ved tera-peutisk næringstilførsel. Man vet at i menneskelig melk, vil såkalt organisk fosfor, d.v.s. knyttet til proteiner og lipider være relativt høyere enn i annen melk og spesielt kumelk. Således er forholdet

0,83 i menneskemelk mens forholdet er 0,34 i kumelk. Nærmere bestemt er forholdet

0,70 i menneskemelk og 0,36 i kumelk. Produktene som fremstilles i følge oppfinnelsen finner således anvendelse i kjente områder som be-

nevnes morsmelk-tillegg.

Men på generell måte er det kjent at hoved-kvaliteten på proteinene i kvinnemelk er å sikre en bemerkelsesverdig nitrogen anabolisme knyttet til en meget liten nyreosmotisk belastning og en meget liten belastning av H+<->ioner.

Denne forbindelse mellom meget høy nitroaen-anabolisme og liten nyreosmotisk belastning og belastning for "H+-ioner, er spesielt ønsket ved gjenopplivning og ved tera-peutisk næringstilførsel hvor man ofte samtidig har behov for høy anabolisme og en utilstrekkelig nyrefunksjon.

Produktene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har for visse anvendelser et utilstrekkeliq innhold av visse essensielle aminosyrer (fenylalanin, tyrosin, tryptofan, cystine). De kan således med hell forbindes med andre proteiner eller peptider eller homologe a-keto-syrer eller a (OH) syrer av essensielle aminosyrer for å gjenopprette en god likevekt mellom aminosyrene som fører til en optimal biologisk verdi. Man legger også merke til at slike produkter (fosforpeptider) har en høy affinitet vis-a-vis makroelementer (kalsium, magnesium) og oligoelementer som spesielt jern, sink, kobber,krom, nikkel, kobolt, mangan og selen.

Fos f orpeptidene som fremstilles i følae oppfinnelsen kan med hell omdannes til salter av slike elementer på i og for seg kjent måte. For å oppnå et slikt organo fosforsalt, kan man således benytte som oppløsning for diafiltreringen under rensingen av fosforpeptidene, en saltoppløsning som inneholder elementet som skal innføres, f.eks. en oppløsning av jernklorid når det dreier seg om jern. Disse organofosforsaltene er meget oppløselige og kan med hell benyttes som bærestoffer for elementene. Produktene som fremstilles i følge oppfinnelsen svarer til næringsbehovet for pasienter som lider av pankreas-insuf f isans, metabolisme-sykdommer eller underernæring som kan være forbundet med en eventuell svikt i nyrefunksjonen eller en organisk

feil i denne, og spesielt når de er forbundet med peptider, essensielle aminosyrer eller homologer av essensielle amino-syrer .

Produktene finner således direkte anvendelse som diétiske næringsmidler eller terapeutiske næringsprodukter som er fullstendig assimilerbare i den menneskelige organisme.

Uansett proteinkilde, eller peptider og amino-syrer som benyttes, tillater disse fosforpeptidene å regulere på den mest ønskelige måte innholdet av organisk fosfor knyttet til nitrogen i det preparat man ønsker å fremstille.

Som nevnt foran, vil fosfor fra peptidene som fremstilles i følge oppfinnelsen og likeledes deres derivater og spesielt organofosforsalter som de danner med mineralske elementer så som kalsium eller magnesium og/eller oligo-elementer (Fe, Zn, Cu, Cr, Ni, Co, Mn, og Se f.eks.) finne en interessant anvendelse i dietikken.

Produkter som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan således anvendes i dietiske preparater i en effektiv mengde sammen med en akseptabel bærer. Den effektive mengde kan variere innenfor store grenser, alt etter den ønskede effekt. Som en antydning kan en mengde på 10 vekt-% i forhold til totalen av preparatet være passende i de fleste tilfeller.

Disse produkter kan likeledes finne anvendelse som medikamenter for mennesker og dyr.

Medikamentene kan benyttes for å bekjempe lidelser som skyldes mangel på organisk fosfor og visse mineralske elementer. Man gir i det etterfølgende illustrerende eksempler på slik anvendelse.

Mineralske elementer av fosforpeptider som fremstilles i følge oppfinnelsen som består av deres kalsiumsalter, utgjør et mineralsk og proteinholdig element som er rikt på organisk fosfor og kalsium. Det finner anvendelse som legemiddel f.eks. i følgende tilfeller:

- rekalsifisering av ben etter brudd

- behandling av osteoporose

- kalsium-tillegg under behandling av rakitt.

Fosforpeptidderivatene som fremstilles i følge oppfinnelsen som består av deres magnesiumsalter utgjør et mineralsk og proteinholdig suplement som er rik på organisk fosfor og magnesium. Det finner anvendelse som legemiddel for å bekjempe alle former for magnesium-mangel og spesielt hos voksne,

f.eks. i følgende tilfeller:

- sterkt øket Mg behov på grunn av stress

- dårlig utnyttelse av Mg i næringsmidler hos gamle - økning av behov for Mg hos gravide kvinner.

Legemidler som inneholder fosforpeptid-derivater som består av blandede salter av kalsium og magnesium kan benyttes på samme måte som et mineralholdig og protein-holdig supplement. Det er dermed forstått at tilsvarende anvendelse kan gjøres for forskjellige salter av fosforpeptider som fremstilles i følge oppfinnelsen, selv cm i praksis_kalsium og/ eller magnesium saltene er foretrukket.

Man kan legge merke til at fosforpeptidene

som er tilveiebraqt ved fremqanqsmåten. i følge oppfinnelsen er nøytrale ved anqjeldende dH betingelser/ f. eks.

ved en pH i nærheten av 4,6. Under slike betingelser vil kationene som er tilstede i miljøet,f.eks. kalsium og/eller magnesium,ikke være knyttet til fosforpeptidene. Men ved bruksbetingelser, og spesielt når fosforpeptidene er til-ført diétiske eller farmasøytiske preparater, foreligger de i form av salter, f.eks. kalsium-og/eller maqnesiumsalter.

Makroelementene (kalsium og/eller magnesium, som er foretrukket) kan erstattes i hvert fall delvis av oligo-elementer.

Derivatene av fosforpeptider som fremstilles i følqe oppfinnelsen oq som inneholder oliqoelementer, finner en tilsvarende anvendelse som de angjeldende oligoelementene.

Generelle indikasjoner for legemidler som inneholder fosforpeptid-derivater og oligo-elementer er spesielt dårlig absorpsjon i fordøyelses-systemet som fører til mangel på oligoelementer (Fe, Zn, Cu, Cr, Ni, Mn, Se). Denne dårlige absorpsjonen i fordøyelses-systemet er spesielt fremtredende ved tarmbetennelse, ved tarmoperasjoner, og ved sykdommer i bukhulen og i tarmen. Som et eksempel vil mangel på sink kunne frembringe enteropatisk akrodermit, diareer, en øket mottakelighet for infeksjoner, hypogonadisme. Mangel på jern kan medføre jernmangelanemier.

Oppfinnelsen illustreres videre ved den etter-følgende beskrivelse og de konkrete eksempler på utførelser.

Den etterfølgende beskrivelse henviser til ved-heftede tegninger. Fig. 1 viser en skjematisk gjengivelse av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen anvendt på et kaseinbasert utgangsmateriale som består av melk. Fig. 2 er en tilsvarende skjematisk gjengivelse som i fig. 1 og som viser anvendelsen av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen på en filterrest av ultrafiltrering av melk. Fig. 3 viser en skjematisk fremstilling av en enzymatisk reaktor med membran som kan benyttes for oppfinnelsens formål. Fig. 1 er en skjematisk gjengivelse av en fremgangsmåte i følge oppfinnelsen og denne benyttes for behandling av et kasein-basert utgangsmateriale som består av skummet helmelk. Utgangsmaterialet benevnes her melk A. I følge oppfinnelsen underkastes melken en enzymatisk hydrolysereak-sjon i nærvær av minst et proteolytisk enzym så som pancréa-tin i et basisk miljø, f.eks. med pH i nærheten av 8. Temperaturen er fortrinnsvis 37°C. Man viser hydrolysetrinnet i den enzymatiske reaktor ved henvisningen 1.

Etter hydrolysen konsentreres oppløsningen fra reaktoren som inneholder enzym, ikke-hydrolyserte proteiner, uoppløselige fraksjoner og fosforpeptider knyttet.til kalsium ved hjelp av ultrafiltrering (referanse 2). Deretter utføres en diaf iltrering ved å bringe filterresten fra ultraf i.ltrering-en 2 i kontakt med en ultrafiltreringsmodul samtidig som man kontinuerlig tilsetter et ultrafiltrat av melk justert til pH 8. Diafiltreringen er vist i tegningen ved referansen 3 i fig. 1.

Ultrafiltratet fra operasjonene 1, 2 og 3 ovenfor føres sammen og utgjør sammen en fraksjon som består av ikke-fosforyliserte peptider (referanse B).

Filterresten fra diafiltreringen 3 underkastes først en desaggregering av fosforpeptidene som den inneholder, fortrinnsvis ved surgjøring til pH 4,6 og spesielt med melkesyre. Denne operasjonen er vist ved referansen 4. Deretter har man ved referansen 5 vist slutt-trinnet med ultrafiltrering som også omfatter en diafiltrering med vann, hvoretter man skiller ut på den ene side en fraksjon C med fosforpeptider, og på den annen side en fraksjon P som inneholder restenzymer og likeledes proteinrester.

Ved å gå ut fra 1000 liter melk vil man etter dette reaksjonsskjema kunne få 900 til 950 liter peptidopp-løsning på 27 g/l og ca. 50 liter fosforpeptider med et innhold på 80 g/l.

En variant vist i fig. 2, der skummet helmelk underkastes en ultrafiltrering (referanse 6) inntil man får en konsentrasjonsgrad på ca. 2. Man skiller deretter ut et permeat D og en filter-rest E. Det er filter-resten som deretter blir det kaseinbaserte utgangsmaterialet. Filterresten E føres til pH 8 ved tilsats av en basisk forbindelse og hydrolyseres i enzymreaktoren i nærvær av et proteolytisk enzym (f.eks. med 4 g/l pankreas-enzym ved en temperatur på 37°C). Som i fig. 1, er hydrolysetrinnet vist med referansen 1. Etter hydrolysen, konsentreres restoppløsningen fra enzymreaktoren ved ultrafiltrering (referanse 2)

og diafiltreres (referanse 3) med ultrafiltratet ved pH 7,0 for å trekke ut ikke-fosforpeptid-fraksjonen. De forskjellige ultrafiltrater fra ultrafiltreringen 1, 2 og 3 føres sammen og utgjør en ikke-fosforpeptid-fraksjon

B • .

Som i fig. 1, underkastes reaktorinnholdet en behandling for å desaggregere fosforpeptidene, fortrinnsvis med en surgjøring inntil pH 4,6 f.eks. ved tilsats av 50% melkesyre (referanse 4). Oppløsningen i reaktoren underkastes deretter en ultrafiltrering og en diafiltrering med vann, vist med referanse 5, noe som gjør det mulig å utskille fosforpeptidene (C) og en protein-enzym-restfraksjon (F').

Når man arbeider i følge reaksjons-skjemaet som er vist i fig. 2, og går ut fra 1000 liter melk, kan man få 400 til 450 liter peptidoppløsning med et innhold på 57 g/l og ca. 50 liter av en oppløsning med fosforpeptider på 80 g/l.

Fig. 3 viser en enzymatisk reaktor med membran som kan benyttes for fremgangsmåten i følge oppfinnelsen.

Den omfatter først et reaksjonskar 15. Den kontinuerlig mating med fosfor-kaseinater foregår gjennom ledningen 16. Et apparat 17 skal samtidig holde og opprettholde pH i reaksjonskaret ved å nøytralisere H+- ionene som frigjør-es ved oppsplittingen av peptidforbindelsene. Apparatet er et Mettler pH-meter som omfatter en potensial forsterker, en for-velger for likevektspunktet og en automatisk byrette for for-deling av reaktantet, og sistnevnte er en basisk forbindelse som nevnt nedenfor. Man har ikke kunnet konstatere noen særlig forurensing på elektrodene. Hydrolyse-produktet som føres inn i reaksjonskaret ved hjelp av ledningen 18 føres ved hjelp av en pneumatisk pumpe 19 til membranet. Et praktisk eksempel er en pumpe av modellen"Amicon LP 20 A<1>,' som er i stand til å tilføre 720 l/time ved 1,7 bar.. Ved hjelp av pumpen føres produktet i en ledning 20 til et forfilter 21 med en porøsitet på 150 ym.. Ultrafiltreringsmodulen er benevnt 22. I et spsifikt eksempel, har man benyttet sys-temet "Amicion DC 10 S" som omfatter ultrafiltreringspatron-er med hule fibre. Permeatet samles opp gjennom en ledning 23 og utgjør det ønskede peptid-hydrolysat. Filter-resten fra modulen 22 går inn i ledningen 24, og føres til en varm-veksler 25 og føres gjennom ledningen 26 for å resirkuleres til reaksjonskaret 15.

Membranene som benyttes er av typen med hule fibre med følgene egenskaper:

Eksempel 1

Dette eksempel vedrører anvendelse av melk som utgangsmateriale. Hel-melken hydrolyseres etter skumming i en enzymreaktor som tilsvarer den som er vist i fiq4 3; membranet som benyttes er-av typen XM 50 (hule fibre). Enzymet (pankreatin av storfe med en aktivitet på 4 NP) fra Sigma og har en konsentrasjon på 2 g/liter. pH i reaktoren holdes på 8 ved tilsats av natriumhydroksyd 2N. Hydrolysen utføres ved 37°C.

Ultrafiltratet som samles opp under hydrolysen utgjør fraksjonen med ikke-fosforpeptider. Ved av-slutningen av hydrolysen, konsentreres innholdet i reaktoren 3,4 ganger for å redusere volumet som skal diafiltreres. Diafiltreringen utføres med ultrafiltratet med behandling av melken på membran XM 50 ved 25°C og ved å innstille en pH på 8 med natriumhydroksyd 2N.. Diafiltreringen har til formål å trekke ut av reaktorinnholdet ikke-fosforpeptider. - Restoppløsningen i den enzymatiske reaktor inneholder enzym

og fosforpeptider som er agglomererte og dette surgjøres til pH 4,6 med tilsetning av melkesyre på 50%. De dissosierte fosfor peptider samles opp i permeatet.

Den kjemiske analyse av de forskjellige produkter som er tilveiebrakt under denne fremstillingen er gjengitt i tabell III og IV som følger.

Eksempel 2

Dette eksempel vedrører anvendelse av en ultrafiltrerings-rest av melk som utgangsmateriale.

Helmelken blir, etter skumming, konsentrert to ganger ved ultrafiltrering ved 25°G på membran XM 50, pH i filter-resten justeres deretter til 8 ved tilsats av natriumhydroksyd 2N. Filter-resten hydrolyseres deretter i den enzymatiske reaktor (fig. 3). Man benytter det samme enzym som det som ble benyttet i eksempel 1 og konsentrasjonen er 4 g/l. Hydrolysen utføres ved 37°C og pH i oppløsningen holdes på

8 ved tilsats av natriumhydroksyd 2N.

Ultrafiltratet samles opp under hydrolysen og utgjør fraksjonen med ikke-fosforpeptider. Ved av-slutningen av hydrolysen, konsentreres innholdet i den enzymatiske reaktor tre ganger ved ultrafiltrering; diafiltreringen utføres i dette tilfelle ved ultrafiltratet av melken ved pH 7 for å trekke ut av reaktor-oppløsningen ikke-fosforpeptider. Innholdet av reaktoren surgjøres deretter til pH 4,6 med melkesyre på 50%. De dissosierte fosforpeptider samles deretter opp i permeatet.

De kjemiske analyser og sammensetningene på amino-syrene i de forskjellige produkter er gjengitt i tabell V og VI i det etterfølgende.

Illustrerende eksempler på anvendelse av produkter i følge oppfinnelsen er gjengitt i det etterfølgende.-

Eksempel 3

Dette eksempel vedrører et gjenopplivnings-produkt som skal benyttes tilført gjennom tarmen hos pasienter som har behov for en protein-tilførsel på 7 til 15 % av det totale kalori- opptak (TKQ), f.eks. ved følgende lidelser: mucoviscidose eller cystisk pankreas-fibrose nyre-svikt, pasienter som har infeksjon eller betennelse i tarmveggen, underernæring som utviser en intens anabolisme, redusert nyreosmose og redusert belastning av H+ ioner. Disse proteinene tilføres fortrinnsvis i en på forhånd opp-løst form.

Eksempel på preparat, sammensetning pr. 100 g: blanding av små peptider fremstilt i følge oppfinnelsen

Eksempel 4

Dette eksempel vedrører et gjenopplivnings-produkt for bruk ved tilførsel gjennom tarmen hos pasienter som har et protein-behov i størrelsesorden 12 til 25 % av det>totale kalori-inntak i form av proteiner. En slik nær-ingstilførsel passer i situasjoner som krever en stor nitro-qenanabolisme og tilførsel av organisk P..

eksempel på preparat:

sammensetning pr. 100 g.

blanding av små peptider fremstilt i følge oppfinnelsen på 3 til 6,25 g

Eksempel 5

Dette eksempel vedrører et gjenopplivnings-produkt som skal tilføres gjennom tarmen hos pasienter som har behov for en proteintilførsel på 7 til 12 % av det totale kalori-inntak, og spesielt ved følgende lidelser: mucoviscidose eller cystisk fibrose i pankreas, nyre-svikt, pasienter med infeksjon eller betennelse i tarmveggen, underernæring som utviser intens anabolisme og redusert nyreosmose for H+<->ioner. Disse proteiner tilføres fortrinnsvis i en på forhånd oppløst form.

Eksempel på preparat, sammensetning pr. 100 g.

Blanding av små peptider fremstilt i følge oppfinnelsen

Blandingen av peptider som inneholder fosforpeptider som er fremstilt i følge oppfinnelsen kan fortrinnsvis omfatte peptider tilveiebragt i følge den fremgangsmåte som er beskrevet i FR-PS 7 9 16 483. Man erindrer at et slikt peptid-hydrolysat praktisk talt ikke inneholder rest-proteiner og at 5 0% av peptidene inneholder 2 til 5 aminosyrer. Nærmere bestemt inneholder hydrolysatet 7 0 til 90% av nitrogen som er tilstede i form av peptider som har et aminosyretall på mindre enn 10. I en spesifikk form har hydrolysatet følgende amino-gram:

Fremgangsmåten for å fremstille et slikt hydrolysat består først i å utføre en ultrafiltrering av laktoserum og deretter enzymatisk hydrolyse, og den er spesielt bemerkelsesverdig ved at man bringer ultrafiltrer-ingsresten i kontakt med et proteolytisk enzym som er i stand til å rekonstituere den protein-fordøyelse som finner sted in vivo i den menneskelige organisme, og dette enzym er fortrinnsvis pankreatin , hydrolysen utføres inntil produktet ikke inneholder rest-proteiner, d.v.s. ikke har noen nitroqen som kan utfelles ved hjelp av trikloreddik-syre på 12%, hvoretter man samler opp det tilveiebrakte hyd-rolisat som utgjør det totale, ønskede enzymatiske hydrolysat .

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av fosforpeptider eller salter derav for anvendelse som nærings- eller legemidler ved behandling av et kaseinatbasert materiale som inneholder fosforkaseinater med toverdige kationer, slik som fosforkaseinater av kalsium og/eller magnesium, hvorved man underkaster materialet en hydrolyse ved hjelp av pankreatin eller blandinger derav med a-kymotrypsin og trypsin og andre proteolytiske enzymer, karakterisert ved at man samler opp det tilveiebragte hydrolysat og underkaster dette minst en ultrafiltrering med membraner som er istand til å holde tilbake fosforpeptidene, samtidig som peptidene passerer igjennom, idet ultrafiltratet således inneholder de ikke-fosforiserte peptider, og samler opp filterresten fra ultrafiltrering og utfører en desaggregeringsbehandling av fosforpeptidene som finnes i filterresten ved tilsetning av en syre eller en kompleksdanner for kalsium og/eller magnesium, og underkaster denne minst en ny ultrafiltrering på membraner som ikke holder tilbake fosforpeptidene slik at disse skilles fra enzymet og kan samles som produkt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man utfører hydrolysen med enzymer i en innretning som kombinerer et ultrafiltreringsutstyr med en enzymreaktor som således utgjør en enzymreaktor med membran.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at man justerer pH til mellom 7 og 9, og fortrinnsvis mellom 7 og 8,5, f.eks. 8, under hydrolysen med enzymer..

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at hydrolyse-temperaturen velges mellom 37 og 45°C, fortrinnsvis mellom 37 og 4 0°C, og helst i nærheten av 37°C.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at man etter hydrolysen underkaster rest-oppløsningen i enzymreaktoren en ultrafiltrering med membraner som er i stand til å holde tilbake fosforpeptidene samtidig som ikke-fosforpeptidene får passere, f.eks. peptider hvor terskelverdien ligger mellom 2000 og 50 000.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at ultrafiltreringen etterfølges av en diafiltrering for å trekke ut ikke-fosforpeptidfraksjonen ved å tilsette vann eller en saltoppløsning og fortrinnsvis et ultrafiltrat av melk som har en pH på mellom 7 og 8 til produktet som bringes i kontakt med membranet.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at man under det siste trinn i fremgangsmåten ved ultrafiltrering fraskiller en fraksjon som inneholder ønskede fosforpeptider, protein-rester og resten av enzymet.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at man omdanner fosfor-peptidene til salter av fosforpeptider og kalsium og magnesium, ved å bringe de nevnte fosforpeptider i kontakt med kationene eller en blanding av kationer av de nevnte metaller, noe som fører til organo-fosfor-salter av kalsium og magnesium.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man i hvert fall delvis erstatter kalsium og magnesium med jern, sink, kobber, krom, nikkel, kobolt, mangan og selen ved under rensingen av fosfor-peptidene å benytte en oppløsning som inneholder det eller de elementer som skal tilføres, noe som fører til organo-fosfor-salter av tilsvarende elementer.