FI67655B - Foerfarande foer behandling av kaseinbaserat material som innehaoller bivalenta katjoner av fosfokaseinater - Google Patents

Description

67655

Menetelmä käsitellä kaseiinipohjäistä raaka-ainetta, joka sisältää fosfokaseinaattien bivalenttikationeja - Förfarande för behandling av kaseinbaserat material, som innehäller bivalenta katjoner av fosfokaseinater

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä käsitellä maitoa, maitoultrasuodatusretentaattia tai eristettyjä bivalenttikationifosfokaseinaatteja, kuten kalsium-ja/tai magnesiumfosfokaseinaatteja.

Tiedetään, että meijeriraaka-aineiden ja edullisimmin maidon kaseiinit sisältävät fosfoseriinejä, jotka antavat arvokkaita fysikaaliskemiallisia, teknologisia ja fysiologisia ominaisuuksia niille peptideille, joissa niitä esiintyy. Tietoja maitoproteiineista esiintyy mm. julkaisussa "Milk proteins" Mc Kenzie H.A. (1971) , voi. 1 ja 2, Academic Press New York.

Johtuen viimeaikaisesta kehityksestä sekä laitteiden että havaittujen ilmiöiden ymmärtämisen kohdalla on kal-voultrasuodatus hyväksytty laajalti maitoteollisuudessa maidon käsittelemiseksi (kts. esimerkiksi Maubois J.L., Mocquot G (1971)-Preparation de fromages ä partir de pre-fromages liquides obtenus par ultrafiltration du lait- "LE LAIT", nide 51 598,495-533). Maidon virratessa ultrasuodatuskalvon läpi vesi, liukenevat mineraalisuolat, laktoosi, molekyylipainoltaan vähäiset typpiyhdisteet (peptidit, vapaat aminohapot) ja vesiliukoiset vitamiinit virtaavat kalvon läpi ultrasuodoksena tai permeaattina, 2 67655 kun taas proteiinit ja niihin liittyvät komponentit (kalsium, fosfori), rasvapalloset ja lipofiiliset elementit jäävät jäljelle, jolloin niiden pitoisuus nousee vesi-faasin poistumisen edetessä; nämä muodostavat retentaatin tai proteiinikonsentraatin. Erittäin puhtaiden proteiini-konsentraattien aikaansaaminen vaatii sekä ultrasuodatus-vaiheen että diasuodatusvaiheen. Diasuodatusvaiheessa suoritetaan veden tai suolapitoisen vesiliuoksen lisäys jatkuvasti tai välillä keskeyttäen ultrasuodatusreten-taattiin. Samanaikaisesti tai tämän jälkeen poistetaan vastaava määrä permeaattia. Tämän toiminnan seurauksena retentaatti poistuu suodatettavista elementeistä. Kalvo-ultrasuodatustekniikan etuna on se, että maitoproteiinit pysyvät alkuperäisessä muodossaan.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään hyväksi kalvoultrasuodatusta kaseiinipohjäisten raaka-aineiden komponenttien fraktioimisen suorittamiseksi, mutta yhdistämällä mainittu ultrasuodatusvaihe entsymaattiseen hydrolyysivaiheeseen.

Useitakin menetelmiä tunnetaan proteiinien, esimerkiksi maitoproteiinien hydrolysoimiseksi. Itse asiassa happo-hydrolyysi mahdollistaa vapaiden aminohappoliuosten aikaansaamisen, mutta tuhoaa niitä jokin verran. Emäksinen hydrolyysi säilyttää tryptofäänin, mutta aiheuttaa liukenemattomuuden, mikä olennaisesti vähentää alkuperäisten proteiinikonsentraattien ravintoarvoa.

Entsymaattinen proteolyysi on tunnettu ja sitä on käytetty jo varsin kauan analyyttisiin- tai ravintotarkoituksiin, jolloin pääasiallisena tarkoituksena on saattaa proteiinit j 67655 liukeneviksi. Kirjallisuudessa on runsaasti raportteja soijapapuproteiinihydrolysaattien monistakin ravintokäytöistä (kts. ARAI. S. NGUCHI M.. KUROSAWA S., KATO H. ja FUJIMAKI M. (1970) Applying proteolytic enzymes on soybean, 6-Deodorization effect-/, of fish proteins: /kts. HEVIÄ P., WHITAKER J.R. ja 0LC0TT H.S. (1976)-Solubilization of a fish protein concentrate with proteolytic enzymes.

J. Agric. Food Chem. vol. 24 (2) 383-385 or of colza, by action of animal, microbial or vegetable proteases.

Näiden menetelmien soveltaminen maitoproteiineihin kaupallisessa mittakaavassa on kuitenkin edelleen varsin rajoittunutta.

Entsymaattiseen proteolyysiin ei liity kemiallisten prosessien haittapuolia. Hydrolyysiolosuhteet ovat kohtuulliset ja siis säilyttävät tuotteiden ravintoarvon.

Yleensä hydrolyysi johtaa peptideihin, joilla on korostuneen kitkerä maku. Tämä rajoittaa näiden hydrolysaattien käyttöä ihmisravinnoksi. Hydrolysaatin kitkeryysaste riippuu pääasiallisesti proteiinisubstraatin luonteesta ja tietyistä entsyymeistä. Kitkerän maun poistamiseksi on esitetty eksopeptidaasien toiminnan käyttämistä. Kts. esimerkiksi ARAI S., YAMASHITA M., KATO H., FUJIMAKI M* (1970) -Agric. Biol. Chem. 34, 729, sekä CLEGG K.M., SMITH G. ja WALKER A.L. (1974) - Production of an enzymatic hydrolyzate of casein on a kilogram scale. J. Food Technol. 425-431. Edelleen esitettiin peptidien modifiointia lisäämällä glutamiinihappoja ennen pehmennysreaktiota. On myös mahdollista toimia poistamalla hydrofobiset aminohapot.

Kaikki nämä tunnetut menetelmät ovat kuitenkin epätyydyttäviä eivätkä tyydytä keksinnön vaatimuksia. Itse asiassa ekso-peptidaasin käytön aiheuttama laaja liukenevuus lisää vapaiden aminohappojen määrää ja erityisesti arginiinia, * 67655 lysiiniä, tyrosiinia, valiinia, fenyylialaniinia, metioniinia ja leusiinia ja tuloksena tästä olisi järjestelmien rasittaminen vapaiden aminohappojen kuljetuksella sisäpuolisesti, jolloin hydrolysaattien ravintohyötysuhde heikkenee.

Toisaalta hydrolysaattien luontainen laatu muuttuu, koska itse aminohappotasapaino muuttuu, jolloin tämä vaatii lisää vapaita aminohappoja.

Tekniseltä kannalta entsymaattinen hydrolyysi suoritetaan tavallisimmin jaksottaisella reaktorijärjestelmällä.

Entsyymi lisätään käsiteltävään proteiinilluokseen. Sopivan mittainen viipymisaika tapahtuu olosuhteissa, jotka edistävät entsymaattista aktiviteettia ja substraattihyökkäystä ja tämän jälkeen pH modifoidaan ja entsyymi deaktivoidaan lievällä lämpökäsittelyllä. Linkous voidaan suorittaa sulamattoman liukenemattoman fraktion poistamiseksi.

Tämän jaksottaisen entsymaattisen hydrolyysireaktion tekniikan mukaisesti on kuitenkin vaikeata käyttää suurta entsyymi:substraatti-suhdetta. Nyt kuitenkin tiedetään (kts. ROBINS R.C. (1978) - Effect of ratio of enzymes to substrate on amino acid patterns released from proteins in vitro. Internat. J. Vit. Nutr. Res. 4(1, 44-52), että entsyymien suhteella substraattiin on ratkaiseva vaikutus proteolyysin aikana vapautuneiden vapaiden aminohappojen ja peptidien luonteeseen. Jaksottaisessa prosessissa entsyymit pitää tuhota hydrolyysin päättyessä silloin, kun niitä on liikaa, mikä olisi välttämättä asianlaita mainituilla suurilla suhteilla.

On myös ehdotettu reaktoreiden käyttöä kiinteillä entsyymeillä. Näihin liittyy kuitenkin huomattavia haittapuolia käytännön kannalta. Itse asiassa entsyymiaktiviteetin, erityisesti pH-olosuhteiden optimiolosuhteet muuttuvat siten, että reaktorin toiminta ei kaikin ajoin ole tyydyttävää. Lisäksi esiintyy bakteriologisia ongelmia, 5 67655 kiinnitysalustojen tukkeutumista sekä proteiinin absorptiota substraattiin. Lisäksi entsyymireaktio pyrkii ajan kuluessa estymään johtuen entsyymi-proteiinisirpalekompleksin muodostumisesta. Tämän estymisen saattaa myös aiheuttaa substraatin luonne. Edelleen on hyvin vaikeata käyttää monientsyymijärjestelmiä johtuen entsyymin kilpailuilmiöistä substraatin suhteen ja koska entsyymin stabiliteetti muuttuu ajan mukana. Keksinnössä käytettiin hyväksi joissain muissa sovellutuksissa jo tunnettuja keinoja, joissa käytetään kalvoilla varustettuja entsyymireaktoreita.

Tässä yhteydessä voidaan viitata esimerkiksi artikkeliin CHEFTEL C. (1972)- Solubilisation enzymatique continue du concentrfe proätique de poisson. Essai de recyclage des enzymes. Ann. Technol. Agric. _21, (3) 423-433, jossa on kuvattu kaivotyyppinen reaktori, jota on sovellettu kalaproteiinikonsentraattien proteolyysiin. Ultrasuo-datuskalvo mahdollistaa entsyymin pitämisen reaktorissa olevassa liuoksessa samoinkuin proteiinisubstraatissa.

Vain hydrolyysituotteet eli peptidit poistuvat niiden muodostumisen jatkuessa. Käytännössä kuitenkin tällaisen reaktorin käyttö ei ole helppoa, kuten CHEFTEL esittääkin. Substraatin pitäisi olla täysin entsyymiin liuotettavissa ja proteiiniliuoksen pitää olla moitteetonta bakteriologista laatua.

Tekniikan tasoa esittävinä asiakirjoina voidaan lisäksi mainita seuraavat viitteet:

Ranskalainen patentti 74 39311 (julkaisunumero 2,292,435) esittää kalsiumfosfokaseinaatin valmistuksen maitoultra-suodatusretentaatista. Tästä syystä tämän patentin tarkoituksena on kalsiumfosfokaseinaatin valmistus, mutta se ei mainitse mitään viimeksi mainitun fraktioimistavasta;

Ranskalainen patentti 77 24069 (julkaisunumero 2,399,213) esittää hydrolysaatin käsittelyn ultrasuodatuksella ja sen jälkeen sähködialyysin. Tästä asiakirjasta selviää 6 67655 todistettavasti se, että proteiinihydrolysaatin ultrasuodatus oli tunnettua. Tässä patentissa kuvattu menetelmä mahdollistaa luonnon aminohappojen puhtaan liuoksen valmistuksen;

Viite CHEMICAL ABSTRACTS, voi. 87, n:o 19, 7.11.1977, sivu 265, abstract 148 285p COLUMBUS OHIO (US) & J. Dairy Research, voi. 44, n:o 2 (1977), sivut 373-376, D.E.

WEST "A simple method for the isolation of a phospopeptide from bovine a s^-casein", kuvaa fosfopeptidin valmistusta kaseinaatista. Menetelmässä suoritetaan entsymaattinen hydrolyysi trypsiinillä ja fraktiointivaiheet geeli-suodatuksella ja kromatografialla, mutta se alkaa reaktiolla CNBr:n kanssa, mikä johtaa varsin tarkoin spesifioituihin tuotteisiin;

Viite CHEMICAL ABSTRACTS, voi. 91, n:o 21, 19.11.1979, sivu 523, abstract 173 597g COLUMBUS OHIO (US) & Enzyme Microb. Technol., voi. 1, n:o 2 (1979), sivut 122-124 J.P. ROOZEN et ai. "Enzymic protein hydrolysis in a membrane reactor related to taste properties" kuvaa hydrolyysiä entsymaattisessa reaktorissa tarkoituksena parantaa proteiinihydrolysaattien makua. Tämä viitejulkaisu todistaa siis sen, että entsymaattinen reaktori on tunnettu laite.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä käsitellä kaseiinipohjaista raaka-ainetta, jossa bivalentti ioni, kuten kalsium ja/tai magnesium, kompleksisoidaan fos-foseriineillä tapauksen mukaan esimerkiksi maito- ja maitoultrasuodatusretentaattia varten. Keksinnön mukainen menetelmä perustuu siihen, että fosfoseriinit kykenevät kompleksoimaan maa-alkali-ioneja, kuten kalsium- ja/tai magnesiumioneja siten, että entsymaattisesta hydrolyysistä saadut tuotteet, fosfopeptidit ja fosforyloimattomat peptidit voidaan erottaa. Bivalenttikationien kompleksointi helpottaa fosfopeptidien välistä aggregaatiota, jolloin ne voidaan erottaa fosforyloimattomista peptideistä.

7 67655

Keksinnön mukainen menetelmä on tunnettu siitä, että raaka-aine hydrolysoidaan entsymaattisesti pH-alueella 7-9 ja lämpötilassa 37 - 45°C, ainakin yhden proteo-lyyttisen entsyymin, kuten pankreatiinin, trypsiinin ja/tai alfakymotrypsiinin avulla, joka aikaansaa sellaisen proteiinipilkkoutumisen, joka tapahtuu in vivo ihmiskehossa; saatu hydrolysaatti otetaan talteen; mainittu hydrolysaatti ultrasuodatetaan ainakin kerran kalvoilla, jotka pidättävät fosfopeptidit päästäen samalla peptidit läpi, jolloin ultrasuodos sisältää fosforyloimattomat peptidit; ultrasuodatusretentaatti otetaan talteen ja retentaatissa olevat fosfopeptidit hajotetaan; ja mainittu retentaatti ultrasuodatetaan uudestaan ainakin kerran kalvoilla, jotka eivät pidätä fosfopeptidejä, jolloin nämä eroavat entsyymistä ja saadaan otetuksi talteen tuotteena.

Keksinnön mukaisella menetelmällä käsiteltävistä raaka-aineista luonnonmaito on arvokas lähde, jossa on läsnä sekä kalsium- että magnesiumfosfokaseinaatteja. vielä puhtaampi keksinnön tarkoituksiin sopiva raaka-ainemuoto on maitoultrasuodatusretentaatti, jossa on lisäksi maa-alkalifosfokaseinaatteja. Raaka-aineena voidaan myös käyttää edeltäkäsin jollakin alalla tunnetulla tavalla puhdistettuja fosfokaseinaatteja, jotka ovat maa-alkali-tyyppisiä, esimerkiksi magnesium- tai kalsiumfosfo-kaseinaatteja ja joita voidaan käsitellä keksinnön mukaisesti.

Mikäli menetelmässä käytetään raaka-aineena maitoultra-suodatusretentaattia, ei aikaisempaa ultrasuodatusta, jolla retentaatti valmistetaan, tarvitse jatkaa suur-konsentraatiotasolle. Konsentraatiotasot noin 1,5-5 8 67655 ovat esimerkiksi sopivia. Käytännössä valitaan konsentraa-tiotaso noin 2. Edelleen on mahdolista suorittaa varsinaisen ultrasuodatuksen jälkeen diasuodatus, jolla retentaatti puhdistetaan ja kuivaproteiiniainessuhde paranee.

Luonteestaan riippumatta käytetty raaka-aine saatetaan keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti entsymaattiseen hydrolyysiin ainakin yhden proteolyyttisen entsyymin avulla. Kuten aikaisemmin mainittiin, tällainen hydrolyysi suoritetaan edullisesti laitteessa, joka yhdistää ultra-suodatuslaitteet entsymaattiseen reaktoriin mahdollistaen siten jatkuvan toiminnan.

Tässä suoritusmuodossa entsymaattinen hydrolyysivaihe suoritetaan jatkuvasti syöttämällä kaseiinipohjäistä raaka-ainetta reaktiovyöhykkeeseen sen saattamiseksi perusteellisesti kosketukseen entsyymin kanssa, reaktio-tuotetta poistetaan jatkuvasti siirtämällä sitä reaktio-vyöhykkeestä ultrasuodatusvyöhykkeeseen, josta poistetaan myös jatkuvasti permeaatti, joka muodostaa peptidisen hydrolysaatin.

Keksinnön mukaisen menetelmän piirissä entsymaattinen hydrolyysivaihe tapahtuu proteiiniliuoksille, joissa bivalentti-ionit, erityisesti kalsium- ja/tai magnesium-ionit kompleksoidaan fosfoseriineillä. Entsymaattisen hydrolyysin pH:n säätämiseksi alueelle 7-9, reaktiovyöhykkeeseen syötetään jatkuvasti tai jaksottaisesti perusyhdistettä, joka voi olla natriumhydroksidi tai karbonaatti, kaliumhydroksidi tai karbonaatti, kalsiumhydroksidi, ammoniumhydroksidi tai niiden seos. Tietyn perusyhdisteen valinta riippuu lopputuotteen käyttötarkoituksesta.

Entsyyminä käytetään edullisesti ainakin yhtä proteolyyttistä 9 67655 entsyymiä, joka kykenee uusimaan ihmiskehossa in vivo tapahtuvan proteiinisulamisen. Tästä syystä voidaan edullisesti käyttää pankreatiinia, joka on kompleksinen seos ja sisältää trypsiiniä, kymotrypsiiniä ja muita sekundäärisiä proteolyyttisiä entsyymejä. Käytännössä voidaan turvautua luonnolliseen pankreaattiseen uutteeseen, jota on saatavissa kaupallisesti ja helposti. Mikäli kuitenkin niin halutaan, voidaan käyttää myös synteettisellä seoksella muodostettuja entsyymejä, esimerkiksi alfakymo-trypsiiniä ja trypsiiniä. Käytetyn synteettisen seoksen koostumus on edullisesti lähellä pankreatiinia ja käsittää tästä syystä sekundääriset entsyymit, jotka sisältyvät luonnolliseen pankreaattiseen uutteeseen. Keksinnön mukaisesti havaittiin, että pH-alueella 7 - 9 ja edullisesti 7 - 8,5, esimerkiksi 8, pankreatiini ja muut samanlaiset keksinnön vaatimukset tyydyttävät entsyymit olivat stabiliteetiltaan parhaimmillaan. Edelleen on edullista noudattaa entsymaattisella hydrolyysialueella varsin tiukkoja lämpötilaolosuhteita. Itse asiassa havaittiin, että entsyymiaktiviteettiin vaikutti voimakkaammin lämpötila kuin pH. Keksinnön mukaiset kokeet ovat osoittaneet, että trypsiinillä pitäisi maksimilämpötilan entsymaattisen hydrolyysin aikana olla korkeintaan 54°C ja kymotrypsiinillä mainitun lämpötilan ei pitäisi ylittää 45°C. Käytännössä käytettäessä pankreatiinia tehdään kompromissi ottamalla huomioon sekä suolistoproteolyysin in vivo optimiolosuhteet (lämpötila noin 37°C) ja se, että korkeammat lämpötilat ovat vähemmän edullisia mikrobien kasvulle ja sallivat suuremmat ultrasuodatustulokset. Yleensä valitut lämpötilat ovat noin 37 - 40°C ja edullisimmin edelleen lähellä 37°C.

Aivan ilmeisesti reaktioparametrit, eli pH ja entsymaattisen hydrolyysin lämpötila korreloivat keskenään. Tällöin on ammattimiehille luonnollista valita kaikkein edullisimmat olosuhteet kunkin tapauksen mukaan.

10 67655

Parhaan mahdollisen entsymaattisen hydrolyysin suorittamiseksi on myös edullista valita huolellisesti käytettävä ultrasuodatuskalvo yhdessä entsymaattisen reaktorin kanssa. Käytetyt kalvot voivat olla mitä ta ti ansa orgaanista tai epäorgaanista tyyppiä. Hyviä tuloksia antava kaivorakenne on ontoilla kuiduilla varustettu moduli. Ohjeena voidaan pitää yhtiön Soci§t6 AMICON kalvoja, joita on saatavissa kauppanimellä H10P5 (leikkauskynnys 5.000) ja H10P10 (leikkauskynnys 10.000) samoinkuin yhtiön Soci6t6 R0MIC0N kalvot, joita on saatavissa kauppanimellä PM2 (leikkauskynnys 2.000) tai PM50 (leikkauskynnys 50.000). Ainoa vaatimus, joka pitää tyydyttää, on se, että itse toiminnassa kalvon pitäisi tehokkaasti kiinnittää entsyymi ja suorittaa samalla tehtävänsä tyydyttävästi erityisesti, mitä tulee kalvon käyttöikään.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa kahdessa erillisessä vaiheessa: Ensimmäinen vaihe on entsymaattinen hydrolyysivaihe ja toinen vaihe on ultrasuodatusvaihe, johon liittyy mainittu hydrolyysi. Laitteet kummankin näiden vaiheiden suorittamiseksi voivat olla erilliset tai integraaliset. Vaihtoehtoisena suoritusmuotona voidaan mainita, että menetelmä voidaan suorittaa jatkuvasti siten, että molemmat mainitut vaiheet suoritetaan yhdessä ainoassa laitteessa. Alkutoimintavaiheen aikana, esimerkiksi noin 1 tunnin ajan, permeaatti (kalvon läpi virtaava neste) kierrätetään uudelleen hydrolyysivyöhykkeeseen kaseiinipohjaisen materiaalin halutun hydrolyysiasteen aikaansaamiseksi. Hydrolyysin jälkeen reaktoriin syötetään käsiteltävää kaseiinipohjäistä raaka-ainetta virtausnopeudella, joka vastaa permeaatin samaa nopeutta.

Käytännössä voidaan käyttää alkuperältään minkälaista tahansa käsittelemätöntä tai kuorittua maitoa. Hydrolyysi suoritetaan edullisesti entsymaattisessa reaktorissa 37°C lämpötilassa, jossa on läsnä 2 g per litra pankreaat- 11 67655 tista entsyymiä maitoa tai kuorittua maitoa kohti ja jolloin pH säädetään arvoon 8 lisäämällä natriumhydroksidia.

Erään vaihtoehtoisen suoritusmuodon mukaisesti käsittely voidaan soveltaa varsinaiseen maitoon tai kuorittuun maitoon, joka on edeltäkäsin väkevöity ultrasuodatuksella konsentraatiosuhteeseen noin 2. Tämän retentaatin pH nostetaan sen jälkeen arvoon lähes 8 lisäämällä natriumhydroksidia, ja mainittu retentaatti saatetaan hydrolyysiin entsymaattisessa reaktorissa 37°C lämpötilassa, jolloin läsnä on 4 g/1 pankreaattista entsyymiä.

Hydrolyysin jälkeen entsymaattisessa reaktorissa oleva jäteliuos väkevöidään ultrasuodatuksella. Tässä vaiheessa reaktorista saatu liuos sisältää entsyymin, hydrolysoi-mattomat proteiinit, liukenemattomat fraktiot ja kalsiumiin liittyvät fosfopeptidit, jonka jälkeen kyseinen liuos saatetaan kosketukseen kalvon kanssa, joka kykenee kiinnittämään fosfopeptidit päästäen samalla fosforyloimattomat peptidit läpi. Tätä tarkoitusta varten voidaan käyttää minkä tahansa tyyppisiä orgaanisia tai epäorgaanisia kalvoja, joiden kynnysarvot ovat välillä 2000 - 50.000.

Entsymaattiseen hydrolyysivaiheeseen liittyvää ultra-suodatus va ihetta seuraa edullisesti diasuodatusvaihe, jolla fosforyloimatori peptidifraktio voidaan poistaa. Diasuodatuksen aikana kalvon kanssa yhteydessä olevaan tuotteeseen lisätään vettä tai sopivaa vesiliuosta. Käytännössä havaittiin, että edellisen ajon aikana valmistettu tai jostain muusta lähteestä tuleva maitoultrasuodos voidaan edullisesti käyttää diasuodatusliuoksena. Tyydyttävien tulosten aikaansaamiseksi tämän ultrasuodoksen pH pitää nostaa arvoon 7-8.

Keksinnön mukaisen menetelmän aikaisemmista vaiheista seuraa toisaalta fraktio (permeaatti), johon kuuluu i2 67 65 5 fosforyloimattomat peptidit ja toisaalta retentaatti, joka sisältää fosfopeptidit. Itse asiassa fosforyloimattomien peptidien ja fosfopeptidien välinen ero suoritettiin entsymaattisen hydrolyysin aikana. Seuraavat ultrasuodatus-ja diasuodatusvaiheet mahdollistavat näiden yhdisteiden fyysisen eroamisen toisistaan.

Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavassa vaiheessa suoritetaan viimeisessä retentaatissa olevien fosfopeptidien desaggregaatio tai hajotuskäsittely. Käytännössä erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti retentaatti hapotetaan fosfopeptideillä täydennettyjen bivalentti-ionien saattamiseksi liukoisiksi. Happona voidaan käyttää mitä tahansa epäorgaanista tai orgaanista happoa, joka soveltuu esillä olevan keksinnön tarkoituksiin ja tuotteiden käyttötarkoituksiin. Tästä syystä voidaan edullisesti käyttää ravinto- ja lääkealalla hyväksyttyjä happoja. Esimerkkejä sopivista hapoista ovat kloorivetyhappo, fosforihappo, rikkihappo, maitohappo, etikkahappo ja muut vastaavat hapot. Hyviä tuloksia on saatu maitohapolla. Retentaattia hapotetaan, kunnes pH-arvo lähestyy lukemaa 4,6, joka arvo varmistaa sen, että kaikki kalsium- ja/tai magnesium-ionit on saatu liukeneviksi. Vaihtoehtoisesti hapottamisen sijasta voidaan fosfopeptididesaggregaatio aiheuttaa kalsiumin ja/tai magnesiumin kompleksoivien aineiden toiminnalla. Esillä olevassa keksinnössä termi kompleksoivat aineet tarkoittaa yhdisteitä, jotka sopivat sitomaan kalsiumia ja/tai magnesiumia saatettaessa ne kosketukseen retentaatissa olevien fosfopeptidien kanssa. Nämä aineet ovat tästä syystä yleensä gelatoivan vaikutuksen aikaansaavia aineita. Ottaen huomioon keksinnön mukaisten tuotteiden käyttötarkoitukset voidaan edullisesti käyttää ravinto- tai lääkealalla hyväksyttyjä yhdisteitä, erityisesti natrium-tai kaliumsitraatteja.

Lähdettäessä kaseiinipohjäisestä raaka-aineesta, joka 13 67655 muodostuu kuoritusta maidosta tai tällaisen maidon ultrasuo-datusretentaatista, saatiin parhaat tulokset hapottamalla entsymaattisen reaktion sisältö maitohapolla (50 %) pH-arvoon 4,6.

Keksinnön mukaisen menetelmän viimeisessä vaiheessa erotetaan fyysisesti fosfopeptidit sisältävä fraktio suorittamalla viimeinen ultrasuodatusvaihe sellaisissa.olosuhteissa, että toisaalta saadaan fosfopeptidit ja toisaalta sivutuotteita, kuten proteiinijäänteet ja jäljelle jäävä entsyymi. Tämän vaiheen aikana on edullista suorittaa ultrasuodatuksen jälkeen diasuodatusvaihe, joka on ammattimiehille tuttu ja suoritetaan tuotteiden talteenottamiseksi. Tämän vaiheen suhteen voidaan todeta, että parhaaksi osoittautui diasuodatus puhtaalla vedellä.

Tällä tavoin keksinnön mukaisen menetelmän päättyessä saadut fosfopeptidit muodostavat erittäin arvokkaan tuotteen. Itse asiassa tällä tuotteella on runsas fosforeinipitoisuus ja se sisältää vähäisen määrän aromaattisia aminohapoja (fenyyli-alaniini, tyrosiini, tryptofaani).

Tällä tavoin saatu runsaasti fosfopeptidiä sisältävä fraktio voi olla siis tunnettu sekä sen erityisestä aminohappokoostumuksesta että runsaasta mineraalipitoisuudestaan (tuhkaa) verrattuna typen kokonaismäärään, koska fosfopeptidinen fraktio sisältää alkuperäisessä raaka-aineessa (maito tai maitoreten-taatti) oleviin kaseiineihin liittyvän kokonaismineraali-fraktion.

Keksinnön mukaan valmistettujen uusien fosfopeptidien pääasialliset ominaisuudet on esitetty oheisessa taulukossa 1.

Taulukon 1 vasemmassa sarakkeessa on esitetty maidon vastaavat arvot vertailun vuoksi.

’ 14 67655 TAULUKKO 1

Maito Fosforyloimat- Fosfopeptidit ___tomat peptidit__

Aromaattisten aminohappojen 12 % 12 % 4 % kokonaismäärä____

Seriini 5,7 % 4 % 20 % _____ja 8 %_

Ca + P o,07 o,02 0'2 NT (1)

Vapaat aminohapot - 10 % 3 % (1) NT = kokonaistyppi x 6,38

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadut fosfopeptidit sopivat moniin käyttötarkoituksiin ravintoalalla.

Keksinnön mukaan saadut fosfopeptidit ovat käyttökelpoisia ravinnoksi, erityisesti ihmisravinnoksi ja lisäksi ne sopivat lääkinnälliseen ravitsemiseen, itse asiassa tiedetään, että ihmismaidossa nk. orgaanista fosforia, eli sidottuna proteiineihin ja sidottuna lipideihin, on verrattain paljon runsaammin kuin muissa maidoissa, erityisesti lehmänmaidossa. Tällöin suhde orgaaninen fosfori/kokonaisfosfori on noin 0,83 ihmismaidossa ja 0,34 lehmänmaidossa. Tarkemmin sanoen typpeen sitoutuneen orgaanisen fosforin suhde verrattuna epäorgaaniseen fosforiin on ihmismaidossa noin 0,70 ja lehmänmaidossa 0,36. Tästä syystä keksinnön mukaiset tuotteet ovat käyttökelpoisia nk. maitomatenisaatioalueella.

Mutta yleensä myönnetään, että naisen maitoproteiinien pääasiallinen hyvä ominaisuus on varmistaa huomattava typpianabolismi ja huomattavan pieniarvoiset munuais- 15 67655 osmoottinen kuormitus ja H+-ionikuormitus.

Tämä hyvin voimakkaan typpianabolismin ja alhaisen munuais-osmoottisen kuormituksen ja H+-ionikuormituksen yhdistelmä on erityisen edullinen elvytyksessä ja lääketieteellisessä ravitsemisessa, joilla aloilla esiintyy varsin usein rinnan huomattavat anabolismivaatimukset ja munuaistoiminnan vajavuutta.

Esillä olevan keksinnön mukaan valmistetut tuotteet vastaavat näitä vaatimuksia.

Tiettyjä käyttötarkoituksia silmälläpitäen keksinnön mukaan valmistetut tuotteet sisältävät liian vähän joitain tärkeitä aminohappoja (fenyylialaniini, tyrosiini, tryptofaani, kystiini). Ne voidaan tällöin edullisesti liittää muihin proteiineihin tai peptideihin tai joko tärkeiden aminohappojen alfaketohappoon tai alfa(OH)happohomologeihin hyvän amino-happotasapainon palauttamiseksi, josta seuraa biologinen optimiarvo.

Voidaan myös todeta, että näillä tuotteilla (fosfopeptidit) on voimakas affiniteetti makroelementteihin (kalsium, magnesium) ja oligoelementteihin, joita erityisesti ovat rauta, sinkki, kupari, kromi, nikkeli, koboltti, mangaani ja seleeni.

Keksinnön mukaan valmistetut fosfopeptidit voidaan edullisesti muuttaa näiden elementtien tai alkuaineiden suoloiksi tavanomaisin menetelmin. Tällaisen organofosforoidun suolan aikaansaamiseksi on mahdollista käyttää diasuodatusliuoksena fosfo-peptidejä puhdistettaessa suolaliuosta, joka sisältää lisättävän alkuaineen, esimerkiksi rautakloridiliuosta raudan ollessa kyseessä. Nämä organofosfonoidut suolat ovat hyvin liukenevia ja niitä voidaan edullisesti käyttää tiettyjen elementtien kantoaineina.

16 67655

Keksinnön mukaan valmistetut tuotteet vastaavat sellaisten potilaiden ravintotarpeita, jotka kärsivät pankreatiivisesta vajavuudesta, aineenvaihduntasairauksista, ravintovajavuudesta tai vaivoista, jotka saattavat mahdollisesti littvä munuaisten toiminta- tai elimelliseen vajavuuteen erityisesti silloin, kun tällaiset vajavuudet liittyvät peptideihin, tärkeisiin aminohappoihin tai tärkeisiin aminohappohomologeihin.

Tästä syystä keksinnön mukaan valmistettuja tuotteita voidaan käyttää välittömästi dieettiruoissa tai lääkeravinteissa, jotka ihmiskeho kykenee täysin yhteyttämään.

Riippumatta käytettyjen proteiinien, peptidien tai aminohappojen alkulähteestä nämä fosfopeptidit mahdollistavat sen, että muodostettavassa seoksessa voidaan typpeen sitoutuneen orgaanisen fosforin määrää erittäin edullisella tavalla säätää.

Kuten aikaisemmin mainittiin, keksinnön mukaan valmistettuja fosfopeptidejä ja niiden johdannaisia, erityisesti organo-fosforoituja suoloja, jotka ne muodostavat mineraalimakro-elementtien, kuten kalsiumin ja/tai magnesiumin kanssa ja/tai oligoelementtien (Fe, Zn, Cu, Cr, Ni, Co, Mn, Se esimerkiksi) kanssa, ovat erittäin käyttökelpoisia ravintoalallla.

Edullinen ravintoseos voidaan aikaansaada lisäämällä ravinto-opillisesti hyväksyttävään kantoaineeseen tehokas määrä ainakin yhtä keksinnön mukaan valmistettua fosfopeptidiä tai fosfopeptidin johdannaista. Tällainen tehokas määrä voi vaihdella laajoissa rajoissa halutun vaikutuksen mukaisesti. Yleisesti ottaen voidaan todeta, että tavallisissa tapauksissa sopiva määrä on 10 painoprosenttia seoksen kokonaispainosta.

Keksinnön mukaan valmistettuja tuotteita voidaan myös käyttää sellaisenaan ihmisten tai eläinten lääkkeinä. Kyseeseen tulevat lääkkeet sopivat kaikkien sellaisten sairauksien hoitoon, 17 67655 joihin liittyy orqaanisen fosforin ja tiettyjen mineraalialku-aineiden puute. Seuraavaksi esitetään keksinnön valaisemiseksi, mutta ei suinkaan sen rajoittamiseksi joitakin tiettyjä käyttöesimerkkejä.

Kalsiumsuoloistaan koostuvat keksinnön mukaan valmistetut fosfopeptidien mineraalijohdannaiset muodostavat mineraali-proteiinitäydennysaineen, jossa on runsaasti orgaanista fosforia ja kalsiumia. Niitä voidaan käyttää lääkkeinä esimerkiksi seuraavissa tapauksissa: - luiden luutuminen murtuman jälkeen, - osteoporoosikäsittely, - kalsiumlisäys riisitaudin hoidossa.

Keksinnön mukaan valmistettujen fosfopeptidien johdannaiset muodostuvat niiden magnesiumsuoloista ja muodostavat mineraa-liproteiinisen täydennysaineen, jossa on runsaasti orgaanista fosforia ja magnesiumia. Niitä voidaan käyttää lääkkeinä kaiken tyyppisiin, erityisesti aikuisilla esiintyviin magne-siumpuutoksiin, esimerkiksi seuraavissa tapauksissa: - stressin aiheuttama voimakas Mg-tarpeen lisäys, - vanhojen ihmisten heikko Mg-ruoankäyttö, - raskaana olevan naisen Mq-tarpeiden lisäys.

Fosfopeptidien johdannaisia sisältävät lääkkeet muodostuvat sekoitetuista kalsium- ja magnesiumsuoloista ja niitä käytetään samalla tavoin kuin mineraali-proteiinilisäainetta. On sanomattakin selvää, että vastaavia käyttötarkoituksia voidaan esittää keksinnön mukaisille eri fosfopeptidisuoloille, vaikkakin käytännössä edullisia ovat kalsium- ja/tai magnesiumsuolat.

Tässä yhteydessä voidaan todeta, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadut fosfopeptidit ovat neutraaleja mainituissa pH-olosuhteissä, esimerkiksi pH:n ollessa lähes 4,6. Näissä olosuhteissa väliaineessa, esimerkiksi kalsiumissa 18 67655 ja/tai magensiumissa läsnäolevat kationit eivät kytkeydy fosfopeptideihin. Kuitenkin käyttöolosuhteissa ja erityisesti silloin, kun fosfopeptidit sisältyvät ravinto- tai lääke-seoksiin, ne esiintyvät suolojen, esimerkiksi kalsium-ja/tai magnesiumsuolojen muodossa.

Makroelementit (edullisesti kalsium ja/tai magnesium) voidaan ainakin osittain korvata oligoelementeillä.

Oligoelementtejä sisältäviä keksinnön mukaisten fosfopepti-dien johdannaisia voidaan käyttää kyseisten oligoelementtien käytön mukaisesti. Yleisiä merkkejä fosfopeptidien johdannaisia ja oligoelementtejä sisältävistä lääkkeistä ovat mm. huonot ruoansulatusabsorptiot, jotka johtuvat oligoelementtien (Fe, Zn, Cu, Cr, Cr, Ni, Mn, Se) puutteesta. Mainittua huonoa ruoansulatusabsorptiota esiintyy erityisesti suolitu-kostulehdusten aikana, jolloin kyseessä voivat olla esimerkiksi suolileikkaukset, umpisuolitapaukset ja ummetus. Esimerkiksi sinkin puute saattaa aiheuttaa akrodermaattista suolistotulehdusta, ripulia, lisätä tulehdusherkkyyttä, aiheuttaa hypogonadismia. Raudanpuute saattaa aiheuttaa rauta-anemiaa.

Keksintöä selvitetään seuraavassa edelleen yksityiskohtaisemmin ja viittaamalla esimerkkeihin sen toteuttamiseksi.

Lisäksi keksinnön selityksessä viitataan oheisiin piirustuksiin, joissa:

Kuvio 1 on virtauskaavio, joka esittää keksinnön mukaista menetelmää sovellettuna kaseiinipohjäiseen raaka-aineeseen, joka on maito.

Kuvio 2 on samanlainen virtauskaavio kuin kuviossa 1 esitetty, esittäen keksinnön mukaisen menetelmän soveltamista maitoultrasuodatusretentaattiin.

i9 67655

Kuvio 3 on kaaviokuva kaivotyyppisestä entsymaattisesta reaktorista, jota voidaan käyttää keksinnön vaatimusten täyttämiseksi.

Kuvio 1 on kulkukaavio esittäen keksinnön mukaisen menetelmän soveltamista kaseiinipohjaisen raaka-aineen käsittelemiseksi, joka raaka-aine on kuorittu maito. Mainittu raaka-aine on esitetty viitemerkinnällä maito A. Keksinnön mukaisesti maito saatetaan entsymaattiseen hydrolyysireaktioon ainakin yhden proteolyyttisen entsyymin läsnäollessa, joka entsyymi voi olla esimerkiksi pankreatiini, reaktio tapahtuu emäksisessä perusaineessa, jonka pH on esimerkiksi noin 8. Lämpötila on edullisesti 37°C. Hydrolyysivaihe entsymaat-tisessa reaktorissa on esitetty viitemerkinnällä 1. Hyd-rolyysin päättyessä väkevöitiin reaktoriliuos ultrasuoda-tusvaiheella (viite 2), joka reaktoriliuos sisälsi entsyymin, hydrolysoimattomat proteiinit, liukenemattomat fraktiot ja kalsiumiin liittyvät fosfopeptidit. Tämän jälkeen suoritettiin diasuodatus saattamalla ultrasuodatuksesta 2 saatu retentaatti kosketukseen hapon kanssa lisäten siihen samalla jatkuvasti pH-arvoon 8 säädettyä maito-ultrasuodosta. Piirustuksessa diasuodatusvaihe on esitetty viitenumerolla 3.

Ultrasuodokset yllä kuvatuista vaiheista 1, 2 ja 3 kootaan yhteen ja ne muodostavat yhdessä fraktion, joka muodostuu fosforyloimattomista peptideistä (viitemerkintä B).

Ultrasuodatuksesta 3 saatu retentaatti käsitellään ensin siinä olevien fosfopeptidien hajottamiseksi edullisesti hapottamalla pH-arvoon 4,6, jolloin hapotukseen käytetään erityisesti maitohappoa. Tätä vaihetta esittää viitenumero 4. Sen jälkeen on kohdassa 5 esitetty lopullinen ultra-suodatusvaihe, johon kuuluu myös vesidiasuodatus ja jonka päättyessä suoritetaan toisaalta fosfopeptidifraktion C ja toisaalta fraktion F välinen erotus, jolloin viimeksi 2o 67655 mainittu fraktio F sisältää jäännösentsyymin sekä proteiini jäänteen.

Lähtöaineena käytetään 1000 litraa maitoa kuviossa 1 esitetyn kulkukaavion mukaisesti, jolloin voidaan saada 900 - 950 litraa peptidiliuosta 27 g per litra ja noin 50 litraa fosfopeptidejä 80 g per litra.

Kuviossa 2 esitetyssä vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa saatetaan kuorittu maito A ensin ultrasuodatukseen (esitetty kohdassa 6) konsentraatiosuhteeseen noin 2. Sen jälkeen permeaatti D ja retentaatti E erotetaan. Tämän jälkeen käytetään retentaattia kaseiinipohjaisena raaka-aineena. Retentaatti E saatetaan pH-arvoon 8 lisäämällä emäksistä yhdistettä ja hydrolysoidaan entsymaattisessa reaktorissa proteolyyttisen entsyymin läsnäollessa (esim. 4 g/1 pankreaattista entsyymiä lämpötilassa 37°C). Samoinkuin kuviossa 1 on hydrolyysivaihe esitetty kohdassa 1. Hyd-rolyysin päätyttyä entsymaattisesta reaktorista saatu jäljellä oleva liuos konsentroitiin ultrasuodatuksella (viitemerkintä 2), sen jälkeen diasuodatettiin (viitenumero 3) ultrasuodoksen pH:n ollessa 7,0 fosforyloimattoman peptidifraktion poistamiseksi. Eri ultrasuodokset ultra-suodatuksista 1, 2 ja 3 kootaan yhteen ja ne muodostavat fosforyloimattoman peptidifraktion EP.

Samoinkun kuviossa 1 saatetaan reaktorin sisältö käsittelyyn fosfopeptidien hajottamiseksi edullisesti hapottamalla pH-arvoon 4,6 lisäämällä esimerkiksi 50 % maitohappoa (viitenumero 4). Reaktorissa oleva liuos saatetaan sen jälkeen ultrasuodatukseen ja vesidiasuodatukseen, jotka molemmat on esitetty viitenumerolla 5, jolloin fosfopeptidit (C’ ) voidaan erottaa jäljelle jäävästä proteiini-entsyymi-fraktiosta (F').

Noudattamalla kuviossa 2 esitettyä rektion kulkua ja 2i 67655 käyttämällä aluksi 1000 litraa maitoa voidaan saada 400 - 450 litraa peptidiliuosta (57 g/1) ja noin 50 litraa fosfopeptidiliuosta (80 g/1).

Kuvio 3 esittää kalvotyyppistä entsymaattista reaktoria, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Mainittuun reaktoriin kuuluu ensiksikin viitenumerolla 15 esitetty reaktiosäiliö. Fosfokaseinaattien jatkuva syöttö tapahtuu kanavan 16 kautta. Laite 17 sekä mittaa pH:n että pitää sen vakiona reaktiosäiliössä neutraloimalla H'-ionit, jotka vapautuvat peptidisidosten rikkoutuessa.

Mainittu laite oli Mettler-pH-mittari, johon kuuluu jän- nitevahvistin , ekvivalenssipisteen esiasetuskytkin ja automaattipyretti reagoivan aineen syöttämiseksi, jolloin viimeksi mainittu on emäksinen seos, kuten yllä selvitettiin.

Liiallista elektrodivirhettä ei havaittu. Reaktiosäiliöstä kanavan 18 kautta poistettu hydrolyysituote kuljetetaan eteenpäin kalvotyyppisellä automaattipumpulla 19. Käytännön esimerkkinä voidaan mainita pumppu AMIC0N LP 20 A, jonka o teho on 710 1/h 1,76 kp/cm :11a. Poistuessaan pumpusta tuote virtaa kanavan 20 läpi ja syötetään esisuodattimeen 21, jonka huokoskoko on 150 mikronia. Viitenumero 22 esittää ultrasuodatusmodulia. Tässä tietyssä esimerkissä käytetty järjestelmä oli AMIC0N DC 10 S malli, jossa on onttoa kuitutyyppiä olevat ultrasuodatuspatruunat. Permeaatti otettiin talteen kanavan 23 kautta ja haluttu peptidihydrolysaatti muodostettiin. Retentaatti poistettiin modulista 22 kanavan 24 kautta, syötettiin sen jälkeen vaihtimeen 25 ja kuljetettiin kanavan 26 kautta uudelleen kierrättäen reaktiosäiliöön 15.

Käytetyt kalvot olivat onttokuitutyyppiä, joilla oli seuraavat ominaisuudet: 22 67655

TAULUKKO II

Tyyppi Erotuskynnys Alue Valmistaja H 10 P 5 5.000 0,9 m2 Amicon H 10 P 10 10.000 PM 2 2.000 1,4 m2 Romicon PM 50 50.000

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä raaka-aineena käytetään maitoa.

Kuorinnan jälkeen maito hydrolysoitiin kuviossa 3 esitettyä tyyppiä olevassa entsymaattisessa reaktorissa; käytetyt kalvot olivat XM 50 tyyppiä (ontot kuidut). Entsyymi (karja-alkuperää oleva pankreatiini, jonka aktiviteetti 4 NF) oli SIGMA-alkuperää ja sen pitoisuus oli 2 g/litra. pH pidettiin reaktorissa arvossa 8 lisäämällä natrium-hydroksidia 2 N. Hydrolyysi suoritettiin 37°C:ssa.

Hyrolyysin aikana kerätty ultrasuodos muodosti fosfory-loimattomien peptidien fraktion. Hydrolyysin päättyessä reaktorin sisältö väkevöitiin (3,4 kertaa) diasuodatukseen menevän tilavuuden pienentämiseksi. Diasuodatus suoritettiin maitokäsittelyllä saadulla ultrasuodoksella kalvolla XM 50 25°C:ssa ja saatettiin pH-arvoon 8 natriumhydroksidilla 2N. Diasuodatuksen tarkoituksena oli tyhjentää reaktorin sisältö fosforyloimattomista peptideistä. Entsymaattisesta reaktorista tullut jäännösliuos sisälsi entsyymin ja yhteenkootut fosfopeptidit ja tämän jälkeen se hapotettiin pH-arvoon 4,6 lisäämällä 50 % maitohappoa. Erotetut fosfo-peptidit kerättiin permeaattiin.

23 67655 Tämän suoritusmuodon mukaisten eri tuotteiden kemiallinen analyysi on esitetty seuraavissa taulukoissa III ja IV.

TAULUKKO III Kemiallinen seos (g/kg)

D.E.* NT** Ca P

Lähtömaito 90,0 29,3 1,20 1,02

Reaktorin sisältö hyd- rolyysin päcättyessä 88,5 31,2 1,20 1,02

Ultrasuorl otuksella v/ä-kevöity reaktorin sisältö 112,4 40,7 3,81 2,65

Reaktorin sisältö diasuodatuksen jälkeen 87,0 14,4 4,17 3,08

Fosforyloimattomat peptidit 80,0 27,0 0,14 0,35

Fosfopeptidit 89,0 8,2 3,40 2,40 * D.E. = kuiva uute ** N-j. = koko na is typpi x 6,38

2A

67655

-P Ή I “O

Ο Ή <4--p cocoiAcMOr-r^vo CO Q- LA ιΛ CT* CO ιΛ ΙΛ σ\ 0 0 ω λ ·* ·» vn *v «v «s ^

Ll. o. o Γ"· <3· —i <i i—i i—i

•H

O

H 4J P >% CO *H U E *0 O O -H

L- -P -P COrHCviCvlOsIMDMDOON

co -p a voo<fo\ONsriA^a O CD 0)

Ll- E Q. Q N <t CO <t <f Is· N ΓΛ

-P

0)

CO

JX. CO-P(DDPCDCOCOCT

Z} >v (1) rH CU SZ >*» ·Η P

E cps:H-4_ji—Q.-prc:<

D -P

^ -P -H

r: ta -D

^ O -H

o 0 ^

y ^ CL

ί ω “ C O.

0) O

:r ··-> o- cNiaaoooaoMDcM

X- O CO CMIACDCDCOI^CTS.-I

μ! CL O -------- Q_ Ll. CTv-d-rHinOCMCMP» 03 rH ΓΛ

il O

c

•H

E -P

< CO

E O -P -P CO E H O

i-H 4J >--ri P X)

0 -H

C(--p cm ιλ co o r-1 1—- 01 a 0Ninuva<tr^c30tn OH) --------

Ll_ Q_ VOr^Vl<VONONrH(S|LA

H

CLPPO3>sC0rH

toicajp'H—i>-«co <I-U)Q.UU<> 67655 25

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä käytettiin raaka-aineena maitoultrasuo-datusretentaattia.

Kuorinnan jälkeen maito väkevöitiin (2 kertaa) ultrasuoda-tuksella 25°C:ssa XM 50 kalvolla. Retentaatin pH säädetiin sen jälkeen arvoon 8 lisäämällä natriumhydroksidia 2N.

Tämän jälkeen retentaatti hydrolysoitiin entsymaattisessa reaktorissa (kuvio 3). Entsyymin rakenne ja luonne oli samanlainen kuin kuviossa 1 käytetyn ja väkevyys 4 q/1. Hydrolyysi suoritettiin 37°C:ssa ja pH pidettiin arvossa 8 lisäämällä natriumhydroksidia 2N.

Hydrolyysin aikana kerätty ultrasuodos muodosti fosfory-loimattoman peptidifraktion. Kun hydrolyysi oli suoritettu loppuun, entsymaattisen reaktorin sisältö väkevöitiin kolme kertaa ultrasuodattamalla; diasuodatus suoritettiin tässä tapauksessa maitoultrasuodoksella, pH 7, reaktori-liuoksen tyhjentämiseksi fosforyloimattomista peptideistä. Reaktorin sisältö hapotettiin sen jälkeen pH-arvoon 4,6 50 % maitohapolla. Hajotetut fosfopeptidit kerättiin sen jälkeen permeaatista.

Tällä tavoin saatujen eri tuotteiden kemialliset analyysit ja aminohappokoostumukset on esitetty oheisissa taulukoissa V ja VI.

Seuraavassa on esitetty valaisevia esimerkkejä keksinnön mukaisten tuotteiden käyttötarkoituksista.

26 67655 ο a r-~ ο ο ον

O VO On Γ~· <J· VO

Q- Ή i-H A CM O ·—I

AO On On O A

Ή ON O IA CM m ra - - ~

CJ I—I 1—I LA A O CM

cr>

^ O CO A A A A

I— O On A <t A A-

-5^ A A i—I A

g s 2 en 5 c rr <d — e 2 ^

_J · O ON A O O A

. t i I ·* r. «v ·». ev .2 * O CM CD CD <r p Ω On CM <t CD O A*

(D --H -M

e

H

en e >> 0

>> CO I

rH O

0 3 3 U -P (0

"D CO CO

>> "O Ή

_C O "O

3 -P

:θ CO ro CD

4J cd -+-> e ε H ¢-1 f-H 0 o :co -p :cd 0 -p

CO H CO -P -P

•H 3 ·Η »—f CD -H

•H CO CO ICO E “O

-P .*CD -«“ί Ή Ή -P C CO C O 4->

CO -H en -H e r-i -p CL

cd u to e p0 >^h to -p o >* o ocn p -o ci O e -P -P 0 P JC o Ή o *p ω p j* j* 3 epp c*_

•H P CO :c0 <*-* CD -P CO Q. CO

CD to 0 :CD :CD 0 CD O CD O

CC CC Q_ *r~j QC -O Lp CL U- 27 67655

CL

ω

CL

0 -P

U- -H ΟνγΗΓ^ιΑΟΟΓ^Ο

en “O W<tr^rHCMCOON<trH

O Ή λ**·'·»**#*·*·* U.-P r—I Γ^· U"\ I—I I—} <J" r—( CSi Ή 0

r-P -P -P

>s CO ·Η p ε o

Ο Ο -H

P- -p -P vo<tr^oOCQCJN<t<d· co p a \o<tr^r^o4aDr^cor- ο ω ω ·»·*·.·.·*·*·*·»·> L. E a acM-ctovtA^j-r^c^r^ 4->

CD

en C3 Cn-P(DDP(DCnCOD>

ε >>0^HO)>nJI>n-HP

3 usit—i _il·— CU-JXC

1_J -P > CO

O -P

0 ° 'H

2 Ό

1 H

5 C -P

. ω a ir --5 ω < O a

μ_ Q. O

a. U- CMCMCOCTNOr^iAtM

co co o <t o eg la f-- —I -d- .c o -------- O U_ 00<t—fCAMOfvjrOr' C iH eg

*H

ε <r

1 -P -P Ή CO "D

ε ή

•H -P O CL

I—I ω >* CL P

O -P

ct-co og\or^o·—iodvola CO E IALA0NfA\0C0>-)(7\ OO --------

Li- -P Γ-'^ίΓΑσΝΟ'—ΙΓΛιΛ eg

CLPPOrO^COrP CO.C CD P i—! <—I '—I CO

CP-LOCLCDCOCS» 28 67655

Keksinnön mukaan valmistettuja fosfopeptidejä sisältävään peptidiseokseen voi edullisesti kuulua peptidit, jotka on saatu julkaisussa EP-A-0022.019 kuvatulla menetelmällä. Tällainen peptidinen hydrolysaatti on olennaisesti vapaa jäljellä olevista proteiineista ja että 50 % peptideistä sisältää 2-5 aminohappoa. Tarkemmin sanoen mainittu hydrolysaatti sisältää 70 - 90 % hapesta läsnä peptideinä, joiden aminohappojen lukumäärä on pienempi kuin 10. Eräässä tietyssä muodossaan hydrolysaatti vastaa seuraavaa aminoqrammaa:

Aminogramma;

Ile 6,0 - Arq 2,7

Leu 9,9 - His 1,7

Lys 9,2 - Ala 4,9

Cys 1,8 - Asp 9,5

Phe 3,2 - Glu 17,6

Thr 6,7 - Gly 1,7

Tyr 3,6 - Pro 6,2

Trp 2,0 - Ser 5,5

Vai 5,5 - Met 2,0

Menetelmässä tällaisen hydrolysaatin valmistamiseksi suoritetaan ensiksi laktoseerumin ultrasuodatus, sen jälkeen sen entsymaattinen hydrolyysi ja erityisesti menetelmä on tunnettu siitä, että ultrasuodatusretentaatti saatetaan kosketukseen entsyymin kanssa, joka kykenee puhdistamaan ihmiskehossa in vivo tapahtuvan proteiinisulamisen,, jolloin mainittu entsyymi on edullisesti pankreatiini ja hydrolyysiä jatketaan, kunnes tuotteessa ei ole nää jäänneproteiineja, eli siinä ei ole enää lainkaan typpeä, joka voidaan sasotaa trikloorietik-kahapolla, 12 %, ja sen jälkeen otetaan talteen tällä tavoin valmistettu hydrolysaatti, joka muodostaa halutun entsymaat-tisen kokonaishydrolysaatin.

Claims (13)

67655 29

1. Menetelmä käsitellä maitoa, maitoultrasuodatusretentaattia tai eristettyjä bivalenttikationifosfokaseinaatteja, kuten kalsium- ja/tai magnesiumfosfokaseinaatteja, tunnettu siitä, että raaka-aine hydrolysoidaan entsymaattisesti pH-alueella 7-9 ja lämpötilassa 37 - 45°C, ainakin yhden pro-teolyyttisen entsyymin, kuten pankreatiinin, trypsiinin ia/tai alfakymotrypsiinin avulla, joka aikaansaa sellaisen proteiini-pilkkoutumisen, joka tapahtuu in vivo ihmiskehossa; saatu hydrolysaatti otetaan talteen; mainittu hydrolysaatti ultra-suodatetaan ainakin kerran kalvoilla, jotka pidättävät fosfo-peptidit päästäen samalla peptidit läpi, jolloin ultrasuodos sisältää fosforvloimattomat peptidit; ultrasuodatusretentaatti otetaan talteen ja retentaatissa olevat fosfopeptidit hajotetaan; ja mainittu retentaatti ultrasuodatetaan uudestaan ainakin kerran kalvoilla, jotka eivät pidätä fosfopeptidejä, jolloin nämä eroavat entsyymistä ja saadaan otetuksi talteen tuotteena.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raaka-aineena käytetään maitoultrasuodatuksella saatua retentaattia konsentraatiosuhteessa 1,5 - 3, edullisesti noin 2, jolloin mainittua ultrasuodatusvaihetta seuraa mahdollisesti diasuodatusvaihe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsymaattinen hydrolyysi suoritetaan laitteessa, jossa ultrasuodatuslaitteet liittyvät entsymaattiseen reaktoriin, jolloin muodostuu kalvolla varustettu entsymaattinen reaktori.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen hydrolyysi suoritetaan jatkuvasti 30 6 7 6 5 5 syöttämällä kaseiinipohjäistä raaka-ainetta reaktioalueeseen sen saattamiseksi voimakkaasti kosketukseen entsyymin kanssa, reaktiotuotetta poistetaan jatkuvasti siirtämällä sitä reaktio-alueelta ultrasuodatusalueelle, josta samoin poistetaan jatkuvasti permeaattia, joka muodostaa peptidisen hydrolysaatin.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH säädetään alueelle 7 - 8,5, esimerkiksi arvoon noin 8 mainitun entsymaattisen hydrolyysin aikana.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyyminä käytetään pankreatiinia luonnon pankreatiiniuutteen muodossa tai trypsiinin ja alfakymotrypsiinin synteettisiä seoksia.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolyysilämpötila pidetään alueella 37 - 40°C, edullisesti arvossa noin 37°C.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kalvotyyppisessä entsymaattisessa reaktorissa käytetään hyväksi kalvoja, jotka kykenevät estämään entsyymin läpimenon.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun hydrolyysin jälkeen entsymaattisen reaktorin jäljellä oleva liuos ultrasuodatetaan kalvoilla, jotka pidättävät fosfopeptidit, päästäen fosfory-loimattomat peptidit läpi, jolloin kalvojen erotuskynnys on alueella noin 2000 - 50.000.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua ultrasuodatusta seuraa diasuodatusvaihe 3i 67655 fosforyloimattoman peptidisen fraktion tyhjentämiseksi lisäämällä kalvon kanssa kosketukseen saatettuun tuotteeseen ioko vettä tai suolapitoista vesiliuosta tai edullisesti maitoultra-suodosta, jonka pH on nostettu arvoon noin 7-8.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että retentaatissa olevien fosfopep-tidien hajottaminen suoritetaan hapottamalla, erityisesti pH-arvoon noin 4,6, epäorgaanisella tai orgaanisella hapolla, joka on edullisesti ravinto- ja lääkealalla hyväksytty happo ja edullisesti maitohappo.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely retentaatissa olevien fosfopeptidien hajottamiseksi suoritetaan kalsiumin ja/tai kompleksointiaineiden, kuten sitraattien toiminnalla.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän viimeisessä vaiheessa suoritetaan ultrasuodatuksella halutut fosfopeptidit sisältävän fraktion erottaminen proteiinijäänteistä ja jäljellä olevasta entsyymistä. 67655 32