NL8320264A - Perfluorkoolstof-emulsies, hun bereiding en hun toepassing in de therapie. - Google Patents

Description

Λ /' 8 3 2 0 264 w

Perfluorkoolstof-emulsies, hun bereiding en hun toepassing in de therapie.

Achtergrond van de uitvinding.

Deze uitvinding betreft de sensibilise-ring van hypoxische tumorcellen voor de therapie, in het bijzonder methoden, preparaten en systemen voor het sensibiliseren van 5 hypoxische tumorcellen voor straling en/of bepaalde chemothera- peutica, of de therapie nu alleen toegepast wordt of in combinatie met stoffen die normale weefsels tegen beschadiging beschermen. De uitvinding betreft verder diagnosemethoden voor het ondersteunen van de sensibilisering en de therapie.

10 Gemakshalve worden in deze beschrijving de volgende en overeenkomstige termen soms op de volgende wijze afgekort: "PFV" - perfluor-verbinding "SS" - stralingssensibilisatie of radiosensibiliseren 15 "ST" - stralingstherapie of stralingstherapeutisch "CT" - chemotherapie of chemotherapeutisch "SB" - bescherming of beschermend tegen straling "CTB" - bescherming of beschermend tegen chemo-therapeutica 20 "RLB" - een radiologisch beeld gevend

Aan zuurstofgebrek lijdende (hypoxische) cellen kunnen tegen straling tot wel driemaal zo goed bestand zijn als goed beluchte cellen. Deze cellen komen in tumoren betrekkelijk veel voor maar zijn in normale weefsels zeldzaam, 25 waardoor de tumorcellen beter tegen straling bestand zijn dan men in normale weefsels waarneemt. Als een gevolg daarvan kan men vaak niet genoeg straling geven om de tumorcellen uit te roeien zonder een onaanvaardbaar hoog risico van zware schade aan normaal weefsel. Deze zelfde hypoxische cellen zijn vaak 8320264 - 2 - tegen die vormen van chemotherapie bestand die van zuurstof afhankelijk zijn. Bij zulke chemotherapie moet zuurstof vaak om andere redenen dan maximale celvernietiging aan hypoxische cellen aangevoerd worden: hypoxische cellen groeien niet actief 5 (vermenigvuldigen zich niet) en vele van de sterker werkzame chemotherapeutica kunnen cellen niet doden tenzij ze aan het groeien zijn. Verder hebben hypoxische cellen lage energie-reserves en daarom gelooft men dat zij minder goed in staat zijn bepaalde chemotherapeutica actief door hun membranen heen te 10 transporteren.

Het volgende draagt tot het betrekkelijk veel voorkomen van hypoxische cellen in tumoren bij: de bloed-aanvoer kan de groei der tumoren niet bijhouden; de bloedstroming door de vaten in het gezwel is traag; en de tumorcellen nabij de 15 bloedvaten verbruiken veel zuurstof en beperken daardoor de voor verder afgelegen cellen beschikbare hoeveelheid nog sterker.

Als men een middel kon ontwikkelen deze hypoxische gebieden weer beter van zuurstof te voorzien zou men een sterke toename in stralingsgevoeligheid mogen verwachten omdat de hypoxische tumor-20 gebieden in de buurt van het minimum van van zuurstof afhanke lijke stralingsgevoeligheid zitten. Dit zelfde geldt niet voor normale weefsels daar die onder natuurlijke omstandigheden reeds in de buurt van het maximum van van zuurstof afhankelijke stralingsgevoeligheid verkeren. Dezelfde of overeenkomstige overwe-25 gingen gelden ook voor het sensibiliseren van cellen voor chemo therapie .

Een voor de hand liggende benadering om de bestendigheid van hypoxische cellen voor behandeling tegen te gaan is een directe aanvoer van meer zuurstof naar de cellen.

30 Dit werd aanvankelijk beproefd door waterstofperoxyde te injicië- ren, waarvan men hoopte dat het op de plaats van de tumor zuurstof zou afgeven. Deze techniek is door de giftigheid van gein jicieerd waterstofperoxyde nooit praktisch van belang geworden.

Een mogelijk minder giftige maar overeen-35 komstige directe benadering bestond uit het laten ademen van de patiënt in 100 % zuurstof van 3 atmosfeer druk voor en tijdens de 8320264 Λ - 3 - stralingstherapie. Hoewel althans sommige resultaten bemoedigend waren heeft de giftigheid van zuurstof van hoge spanning deze techniek beperkt tot sub-optimale behandeling, d.w.z. met minder maar zwaardere stralingsdoses.

5 Een derde directe benadering werd aanvanke lijk door Belgrad c.s. beproefd (Radiology 133 (1979) 235-237). Deze onderzoekers verzadigden een zuiver monster perfluoroctyl-bromide (waarvan men weer dat het een zeer efficiënte zuurstof-transporteur is) enzuurstof en spoten deze verbinding als zodanig 10 in muizen met P388-leukemie. 24 uur later stelden ze de muizen over hun hele lichaam aan twee verschillende doses röntgenstraling bloot en vergeleken ze de overlevingstijden van deze muizen met overeenkomstig behandelde muizen die alleen met zout-oplossing ingespoten waren. De uitkomsten van dit onderzoek lieten geen 15 significante verbetering van de therapie zien, en plaatselijke toxische reacties werden in de buikholte waargenomen. Het onderzoek van Belgrad c.s. is niet nuttig als gids bij of suggestie voor het gebruik van perfluoroctylbromide of andere PFV bij de therapie van hypoxische tumorcellen. Dit onderzoek was klinisch 20 weinig relevant en ontmoedigde verder onderzoek dat tot klinische beproeving zou kunnen leiden. Men zou nooit in overweging nemen de buikholte te overspoelen (dat in tegenstelling tot plaatselijk toedienen) met een zuivere PFV of zelfs met een PFV in geëmulgeerde vorm. Verder biedt het met zuurstof beladen van een 25 PFV voordat dit toegediend wordt in combinatie met een stralings- behandeling 24 uur na die toediening de leukemiecellen bijna geen gelegenheid voor straling gevoeliger te worden. Tenslotte weet men van de hoogste door Belgrad c.s. toegepaste stralingsdoses dat ze voor muizen dodelijk zijn en dus blijft men gissen of 30 het perfluoroctylbromide onder die omstandigheden wel enig sensi biliserend effect had.

In pogingen om het toedienen van zuurstof als voornaamste wijze van sensibiliseren voor straling te ontwijken zijn stralingen toegepast waarvan het celdodend vermogen 35 minder afhankelijk is van de zuurstofvoorziening van de cel.

Zulke stralingen zijn sterk ioniserende of hoog-LET-stralingen η v 0 v k

\>)· ν' - iT

- 4 - maar toepassing daarvan wordt beperkt doordat het scherpstellen daarmee zo moeilijk is. Normale weefsels ontvangen van die stralingen per eenheid die in de tumor terecht komt meer dan met gebruikelijke stralingen het geval is, en die factor bleek op te 5 wegen tegen het verwachte voordeel van onafhankelijkheid van de zuurstofvoorziening. Een andere stralingsensibiliserende techniek onder vermijding van overspoelen met zuurstof is het gebruik van therapeutica die de aanwezigheid van zuurstof imiteren maar verder in het gezwel kunnen diffunderen doordat zij minder vlot 10 verbruikt worden door de cellen waarin zij dringen. Representa tief voor zulke therapeutica zijn metronidazool, misonidazool en de nitroimidazool-verbindingen die in de Amerikaanse octrooi-schriften 4.241.060 en 4.282.232 genoemd zijn. Zulke stoffen hebben, hoewel ze aanvankelijk veel belovend leken, klinisch geen 15 grote therapeutische winst opgeleverd doordat de voor significan te stralingsensibiliseren benodigde doses in patiënten ook onaanvaardbare neurotoxiciteit vertoonden.

In carcinomen en sarcomen vindt men onveranderlijk gebrek aan zuurstof, maar zelfs onder goedaardige om-20 standigheden (waar de hypoxische tumorcellen niet voortdurend in massa toenemen) is soms stralingstherapie en/of chemotherapie voorgeschreven om kankerachtige omstandigheden te voorkomen.

Deze uitvinding is daarom toepasbaar op zowel kwaadaardige als goedaardige hypoxische tumorcellen.

25 Zoals door Belgrad c.s. aangegeven zijn er perfluorkoolwaterstoffen bekend die goede zuurstofdragers zijn en daarom wel als bloedsurrogaten gebruikt zijn. Deslaniettemin kan deze eigenschap op zich ze niet nuttig maken als sensibiliserende stoffen bij stralingstherapie en/of van zuurstof afhanke-30 lijke chemotherapie. Behalve dat zulke verbindingen een goed zuur stof overdragend vermogen moeten vertonen moeten zij voor een doeltreffende ST of CT: 1. in staat zijn tot snelle overdracht aan dichte celpopulaties die hypoxische tumorcellen kenmerken of aan het vaatstelsel 35 daarvan, en ook om de zuurstof aan deze cellen af te geven, 2. gunstige verblijftijden in zoogdierensystemen vertonen, en dus 8320264 •s - 5 - niet een te snelle verwijdering door uitscheiding, transpiratie of metabolisme, en dus ook niet onmatig in het systeem accumuleren (zoals in levert of milt), en 3. geen toxiciteit of een normale toxiciteit voor normale 5 (euoxische) cellen vertonen.

In het ideale geval zal de zuurstofover-dragende verbinding bij systemisch gebruik snel door het vaatstelsel diffunderen, zuurstof in de longen opnemen, ongeveer 10 tot 12 dagen in het cardiovasculaire systeem blijven (om 10 herhaalde bestraling in beheerste doseringen toe te laten) en dan snel verwijderd worden, en ondertussen geen onaanvaardbare giftigheid vertonen. Onder die omstandigheden kunnen stralings-therapie en/of chemotherapie maximaal ingezet worden. Maar verblijftijden van slechts 2 tot 8 uur kunnen voldoende zijn als 15 slechts een kortdurende therapie nodig is. In de behandelings- protocollen moet men dus een behoorlijke uitloopruimte hebben, afhankelijk van soort tumorcellen, hun stand van deling en hun plaats, en andere overwegingen die de therapeuten kennen, zoals het type straling of chemotherapeuticum, bijwerkingen en wijze 20 van toediening.

Samenvatting van de uitvinding.

Volgens de uitvinding wordt een doeltreffende sensibilisering van hypoxische tumorcellen, als inleiding voor een zeer weldadige stralingstherapie en/of van zuurstof 25 afhankelijke chemotherapie bereikt door de cellen of hun vaatstel sel in contact te brengen met een zuurstofdragende perfluor-verbinding, waarbij de perfluorverbinding uniform in kleine deeltjesgrootte in een waterig medium gedispergeerd zit. De verkregen waterige dispersie wordt door toevoegen van zouten, 30 buffers of andere voor dat doel bekende stoffen isotoon (of an derszins fysiologisch aanvaardbaar) voor zoogdiercellen gemaakt voordat men ze als sensibiliseringsmiddel gebruikt.

Volgens een aspect van de uitvinding wordt de dispersie intraveneus ingespoten, door de longen geleid waar-35 in het zuurstof opneemt en dringt het dan door in het gebied van de hypoxische tumorcellen. De met de perfluor-verbinding meege- 8 3 ?. fi <: § 4 *.

- 6 - nomen zuurstof sensibiliseert de hypoxische cellen. Tegelijkertijd met het sensibiliseren of daarna worden de cellen bestraald en/of wordt een chemotherapeuticum toegediend. Het vernietigen van de cellen of de verminderde groei kan men doorbiopsie, 5 radiologisch of met andere technieken volgen. (Met "groei" wordt hier het vermenigvuldigen van cellen bedoeld, "vermindering van groei" en dergelijke termen duiden vernietiging van cellen of een verminderde groei aan").

Volgens een ander aspect van de uitvinding 10 worden de hypoxische tumorcellen met zuurstof onder verhoogde druk in contact gebracht, maar onder zuurstof-spanningen en/of gedurende tijden die aanzienlijk minder fors zijn dan gewoonlijk toegepast bij de behandeling van hypoxie, en het contact van de cellen of hun vaatstelsel met de perfluor-verbinding vult dan de 15 zuurstofoverdracht aan de cellen aan. Deze versterkte sensibili- sering wordt dan op gebruikelijke wijze gevolgd door of vergezeld van bestraling of chemotherapie.

Volgens nog een ander (diagnostisch) aspect van de uitvinding wordt het binnendringen van de perfluor-20 verbinding in de gebieden met hypoxische tumorcellen gevolgd door systemische toediening van een perfluor-verbinding die ook voor straling ondoorzichtig is, waardoor men een röntgenbeeld kan opnemen. Een variatie op deze benadering is het opnemen van een andere stof die eenRLB stof is in een dispersie van een zuur-25 stofdragende perfluor-verbinding zonderRLB-eigenschappen.

Bij andere aspecten van de uitvinding worden SB en/of CTB stoffen gecombineerd met de zuurstof dragende PFV in dispersie, of worden ze afzonderlijk naar de plek met hypoxie gebracht om een versterkte therapeutische respons moge-30 lijk te maken. Dat effect wordt bereikt doordat de perfluor- verbinding de tumorcellen kan sensibiliseren terwijl de SB en CTB stoffen, die niet door de tumorcellen geabsorbeerd worden, de normale weefsels tegen aantasting door straling resp. door CT stoffen beschermen. In sommige gevallen kan dezelfde stof 35 tegelijkertijd SB en CTB zijn.

In deze beschrijving hebben "zoogdier" en β 'T V ‘> i /: (TV ¢-- I.

- 7 - daarop lijkende termen de ruime betekenissen en omvatten ze alle dieren.

Gedetailleerde beschrijving.

De sensibilisator-dispersies.

5 Het sensibiliseringsmiddel volgens de uit vinding is een waterige dispersie van een zuurstofdragende per-fluor-verbinding en een dispersiemiddel (oppervlakactieve stof of emulgator) die doeltreffend is voor het uniform dispergeren van de perfluorverbinding in het waterige medium. Het dispersie-10 middel is nodig omdat de perfluor-verbindingen betrekkelijk hydro foob zijn en anders de neiging zouden hebben te agglomereren in de lichaamsvochten van de zoogdieren door welke zij moeten gaan en die dienen tot het dragen van de verbinding naar de hypoxische tumorcellen of hun vaatstelsels. Dus, hoewel de perfluorverbinding 15 als zodanig aanvankelijk wel in het lichaam injicieerbaar kan zijn zou zijn neiging tot agglomereren zijn toepassing als sen-sibilisator reeds na korte tijd verhinderen. Het waterige disper-siemedium laat ook toe reagentia toe te voegen om de dispersie isotonisch of anderszins fysiologisch aanvaardbaar voor de cellen 20 te maken.

In het algemeen zijn voor deze uitvinding nuttige perfluor-verbindingen en -dispersies materialen die in de octrooi- en andere technische literatuur als synthetische bloedvervangers aangegeven zijn. Voorbeelden van octrooi-25 literatuur die zulke bloedvervangingsmiddelen beschrijven zijn de Amerikaanse octrooischriften 3.641.167, 3.823.091, 3.911.138, 3.962.439, 3.993.581, 4.041.086, 4.105.798 en 4.325.972, waarnaar hier verwezen wordt.

Het zal uit een overzicht van de hierboven 30 genoemde octrooischriften en andere literatuur duidelijk zijn dat er een grote verscheidenheid van perfluor-verbindingen is die bij geschikte dispersie in een waterig medium voor het doel van deze uitvinding kunnen dienen. De perfluorverbindingen omvatten dus alifatische (met of zonder ringen) en aromatische ver-35 bindingen, en het kunnen alleen perfluorkoolwaterstoffen zijn of ook heteroatomen zoals zuurstof, zwavel en/of stikstof bevat- 8320264 - 8 - ten, en deze kunnen alleen of in mengsels van twee of meer gebruikt worden. De keuze van de volgens de uitvinding in bepaalde gevallen te gebruiken perfluorverbinding zal van een aantal factoren afhangen, waaronder of de behandeling in combinatie met 5 stralingstherapie, chemotherapie of beiden gebeurt, de aard en de plaats van de hypoxie, de sterkte van de perfluor-verbinding als sensibilisator, de toxiciteit van de perfluor-verbinding voor normale cellen van de gastheer, het vermogen om dispersies van kleine deeltjes en voldoend stabiele dispersie te geven zo-10 dat ze snel naar het gebied van de hypoxische cellen kunnen dif funderen, de verblijftijd in het zoogdier (waaronder ook de neiging tot accumulatie) en overeenkomstige overwegingen die voor deskundigen op het gebied van sensibiliseren bekend zijn. Begeleiding bij die keuze kan men krijgen uit het vak van de bloed-15 vervangingsmiddelen, vooral wat betreft het vermogen tot zuurstof- transport, deeltjesgrootte en stabiliteit van de dispersie, verblijftijd in de zoogdieren, en cytotoxiciteit. Daarnaast kan men, op basis van hierna te noemen en te bespreken onderzoekingen in vitro en in vivo, hulp hebben bij de keuze van de perfluor-20 verbinding en de behandelingsparameters voor specifieke gevallen van sensibilisering.

Hierin worden met "perfluor-verbinding" en "perfluorkoolstof" verbindingen bedoeld die in hoofdzaak of echt volledig gefluoreerd zijn, welke gewoonlijk maar niet nood-25 zakelijkerwijs bij gewone temperatuur en druk vloeibaar zijn.

Met "in hoofdzaak gefluoreerd" wordt hier bedoeld dat de meeste waterstofatomen van een verbinding door fluoratomen vervangen zijn, zodaig dat verdere substitutie niet tot een belangrijke verhoging van het zuurstoftransporterend vermogen van het mate-30 riaal leidt. Geloofd wordt dat dat bereikt wordt wanneer ten minste ongeveer 80-90 % van de waterstofatomen door fluoratomen vervangen is. Maar bij voorkeur is ten minste 95 % der waterstofatomen vervangen, beter ten minste 98 %, en het allerbeste 100 %. In de bovengenoemde Amerikaanse octrooischriften 35 3.911.138 en 4.105.798 is het vermogen zuurstof te transporteren gerelateerd aan de oplosbaarheid van gassen zoals zuurstof in 15 ï, ö 2 β 4

*N

- 9 - die materialen. Deze octrooischriften suggereren dat volledig gefluoreerde materialen bij 25°C en 760 mm kwik 10-100 ml zuurstof per 100 ml materiaal absorberen.

Representatief voor de perfluor-verbindin-5 gen die bij voorkeur bij deze uitvinding toegepast worden zijn de perfluor-derivaten van chemisch inerte polycyclische Cn-C,0- y io verbindingen zoals de bicyclononanen (bijv. bicyclo/ 3,3,1 /-nonaan, 2,6-dimethylbicyclo/ 3,3,1 /nonaan, 3-methylbicyclo-/ 3,3 , l_/nonaan, en trimethylbicyclo/ 3,3 ,l_/nonaan ; adamantaan 10 en C^-Cg-alkyladamantanen zoals methyl- en dimethyladamantaan, ethyl- en diethyladamantaan, trimethyladamantaan, ethylmethyl-adamantaan, ethyldimethyladamantaan en triethyladamantaan; methyldiadamantaan en trimethyldiadamantaan; methyl- en dimethyl-bicyclooctanen, tetrahydrobinor-S, pinaan, kamfaan, decalien 15 en alkyldecalienen zoals 1-methyldecalien; en 1,4,6,9-dimethano- decalien; bicyclo/ 4,3,2_/undecaan, bicyclo/ 5,3,0_/decaan, _ _ _ 2 6 — bicyclo/ 2,2,1 /octaan, tricyclo/ 5,2,1,0 ' _/decaan, methyl- ” 2 6- tricyclo/ 5,2,1,0 ' /decaan, en dergelijke, of mengsels daarvan . Onder de heteroatoom-perfluor-verbindingen vallen 20 F-tributylamine, F-tripropylamine en F-N,N-dimethylcyclohexyl- methylamine; perfluorethers zoals F-2-butyltetrahydrofuran, F-2-butylfuran, F-hydrofuran, de 1,2,2,2-tetrafluormethyl-ether van F-(2,5,8-trimethyl-3,6,9-trioxa-l-dodecaan), F-N-methyldecahy-drochinoline, F-l-methyloctahydrochinolizine, F-octahydrochino-25 lidine en F-N-cyclohexylpyrrolidine. Onder de aromatische en alifatische verbindingen vallen F-naftaleen, F-l-methyl-nafta-leen, F-n-methylmorfoline, F-n-heptaan en 1,2-bis-nonylfluor-butyletheen.

In de bovenstaande materialen kunnen som-30 mige fluoratomen door andere halogeenatomen zoals broom vervan gen zijn. Onder deze verbindingen vallen bijvoorbeeld mono-broom-verbindingen zoals l-broompentadecafluor-4-isopropyl-cyclohexaan, 1-broomtridecafluorhexaan, 1-broompentadecafluor-octaan en 1-broompentadecafluor-3-isopropylcyclopentaan en 35 perfluor-l-broombutylisopropylether, of polybroom-derivaten daarvan.

C· ί ' 4 - 10 -

Indien in de perfluor-verbindingen broom-of jodiumatomen optreden hebben de verbindingen de neiging voor röntgenstraling ondoorzichtig te zijn terwijl zij hun zuurstof transporterend vermogen grotendeels behouden. De ondoorzichtig-5 heid voor straling maakt deze verbindingen nuttig als KLB- stoffen, en daarom kunnen deze verbindingen in sommige gevallen niet alleen sensibiliserend maar ook als RLB-stoffen werken, alleen of in combinatie met andere sensibilisatoren en/of RLB-stoffen .

10 Het is bekend dat het tempo waarin lagere zoogdieren de perfluorkoolwaterstoffen uitzweten in de volgorde tricyclisch > bicyclisch > alkylmonocyclisch > paraffine is. Indien een hoog tempo van uitzweten de voorkeur verdient, bijvoorbeeld als slechts een korte bestralingsduur voorgeschreven 15 wordt, verdient een tricyclische perfluor-verbinding dan ook de voorkeur boven andere perfluor-verbindingen. Aan de andere kant, als een lang voortgezette stralingstherapie of chemotherapie wenselijk is, waarvoor een langere verblijftijd van de sensibili-sator nodig is, kan men een bicyclische of monocyclische per-20 fluor-verbinding kiezen.

De voor toepassing bij deze uitvinding op basis van relatieve inertheid (chemisch en biologisch) , goede dispergeerbaarheid en verblijftijd te bevoorkeuren per-fluor-verbindingen zijn de polycyclische C^-C^-koolwaterstoffen 25 volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.105.798, en in het bijzonder F-dimethyladamantaan, F-trimethylbicyclononaan, _ 26“ “ 26“ F-tricyclo/ 5,2,1,0 ' _/decaan, F-methyltricyclo/ 5,2,1,0 ' _/- decaan, F-bicyclo/ 5,2 ,0_/decaan en F-methylbicyclo/ 5,2,0_/de-caan alsmede de isomeren daarvan en de mengsels van zulke ver-30 bindingen, bijvoorbeeld mengsels van F-dimethyladamantaan met F-trimethylbicyclononaan met een gewichtsverhouding tussen 90/10 en 10/90.

De bevoorkeurde dispersiemiddelen voor het uniform dispergeren van de perfluorverbindingen in een waterig 35 medium zijn de niet-ionogene oppervlak-actieve stoffen. In som mige preparaten en systemen volgens de uitvinding, vooral voor 8320264 - 11 - die gevallen waarin de dispersies niet-systemisch gebruikt zullen worden zoals bij plaatselijke of lokale behandeling, kunnen ionogene of amfotere oppervlak-actieve stoffen gebruikt worden om de perfluor-verbindingen te dispergeren. Omdat er bij een 5 systemische behandeling zorgvuldige aandacht voor de fysiologi sche aanvaardbaarheid der verbindingen nodig is, zoals de iso-tone aard, zijn ionogene oppervlak-actieve stoffen minder wenselijk , hoewel het mogelijk is hun ionogene aard te compenseren of te matigen door de dispersies met elektrolyten of andere toesla-10 gen te formuleren.

Geschikte niet-ionogene oppervlak-actieve stoffen omvatten alifatische materialen zoals de blokcopolymeren van ethyleenoxyde en propyleenoxyde, die een hydrofoob propyleen-oxyde-deel in combinatie met één of meer hydrofiele ethyleen-15 oxyde-delen hebben, bijvoorbeeld de "Pluronics" (handelsmerk) van de firma BASF-Wyandotte, Inc. Hoewel minder wenselijk kunnen aromatische typen ook gebruikt worden, zoals de alkylfenoxypoly-ethoxyethanolen met alkyl-groepen met 7 tot 18 koolstofatomen en 1 tot 60 of meer oxyethyleen-eenheden, bijvoorbeeld heptyl-20 fenoxypolyethoxyethanolen, octylfenoxypolyethoxyethanolen, methyl- octylfenoxypolyethoxyethanolen, nonylfenoxypolyethoxyethanolen, dodecylfenoxypolyethoxyethanolen, e.d., polyethoxyethanol-derivaten van met methyleen verknoopte alkylfenolen, zwavel bevattende analoga van de hierboven genoemde stoffen, ethyleen-25 oxyde-derivaten van carbonzuren met lange ketens zoals laurine-, myristine-, palmitine- en oliezuur e.d. en mengsels van zulke zuren zoals men die in tallolie met 1 tot 60 oxyethyleen-eenheden per molecuul vindt, en de analoge ethyleenoxyde-condensaten van aminen met lange of vertakte ketens, zoals dodecylamine, 30 hexadecylamine en octadecylamine met 1 tot 60 oxyethyleen- groepen.

Van nature voorkomende emulgatoren en derivaten daarvan zijn ook nuttig. Hieronder vallen de alginaten, cellulose-derivaten zoals methylcellulose en carboxymethyl-35 cellulose, in water oplosbare gommen zoals arabische gom en tragacanth-gom, de fosfolipiden (zoals lecithine en dooier- §3202^4 - 12 - fosfolipide) en de sterolen.

Niet-ionogene fluor bevattende oppervlak-actieve stoffen verdienen bijzondere voorkeur. De fluoralkyl-esters vormen een klasse van dergelijke oppervlak-actieven, en 5 zijn onder de namen FC-93, FC-95, FC-128, FC-143, FC-430 en FC-431 bij de 3M Company te koop. De meer bevoorkeurde niet-ionogene, fluorbevattende oppervlak-actieven zijn, wegens hun uitzonderlijk vermogen dispersies te geven die gedurende lange tijden kleine deeltjesgrootten handhaven (van de grootte-orde 10 van 35 weken of een jaar of langer, zelfs bij kamertemperatuur) zijn de fluorbevattende amidoamineoxyden die in de Amerikaanse octrooischriften 3.828.085 en 3.547.995 beschreven zijn, waarnaar hier verwezen wordt. Deze verbindingen kunnen algemeen weergegeven worden door formule 1, waarin een perfluoralkyl-groep met 15 4 tot ongeveer 25 koolstofatomen of een perfluoroxyalkyl-groep is waarvan de alkoxy-groep 3 tot ongeveer 40 koolstofatomen kan hebben waarvan althans een groot deel volledig gefluoreerd is, en waarvan de alkyl-groep 2 tot ongeveer 40 al dan niet fluor-dragende koolstofatomen kan hebben, waarin Y waterstof of alkyl 20 met 1 tot 6 koolstofatomen is, R een alkyleen-groep volgens de formule ~c^2z~ ^"s (waarkij z een getal van 1 t/m 6 kan zijn) , en waarin Q een alifatische amineoxyde-groep volgens formule la is, waarbij Rr en R,. beide alkyl-groepen met 1 tot 6 koolstof-b b atomen of op hydroxy eindigende alkyl-groepen met 2 tot 6 kool-25 stofatomen zijn. In alle gevallen kunnen de alkoxy-, alkyl- en alkyleen-groepen vertakt of onvertakt zijn.

Bevoorkeurde onderklassen van oppervlak-actieven volgens de genoemde octrooischriften zijn die volgens formules 2 en 3, waarin n ten minste 3 is (bij voorkeur 3-10), 30 x ten minste 2 is (bij voorkeur 2-6), y ten minste 1 is (bij voorkeur 2-6), z ten minste 1 is (bij voorkeur 2-6) en R^ en onafhankelijk van elkaar alkyl-groepen met 1-6 koolstofatomen zijn.

Met name te noemen amidoamineoxyden vol-35 gens die formules zijn de produkten beschreven in voorbeelden 1 t/m 6 van het Amerikaanse octrooischrift 3.826.085, namelijk ® 5 2 G 2. C 4 *' - 13 - verbindingen volgens formule 4, 5, 6, 7, 8 en 9.

De waterige dispersies volgens de uitvinding kunnen met iedere techniek bereid worden die een uniform mengsel der bestanddelen geeft, en een ervaren formuleerder kan 5 deze bereiding gemakkelijk uitvoeren.

Bij het formuleren van de dispersies volgens de uitvinding voor systemische toediening is het belangrijk niet alleen elektrolyten en andere stoffen toe te voegen die de dispersies fysiologisch aanvaardbaar maken (zoals isotonisch met 10 de zoogdiercellen), maar ook om de pH waar nodig bij te stellen om de pH-verlaging in de buurt van de hypoxische cellen door de vorming van melkzuur door die hypoxische tumorcellen tegen te gaan. Een geschikt pH-traject is 7,2-7,4. Onder de toeslagen die gewoonlijk gebruikt worden om de vloeistoffen fysiologisch aan-15 vaardbaar te maken zijn buffers zoals natriumbicarbonaat en meng sels zoals de oplossing van Ringer. Andere stoffen die gewoonlijk in farmaceutische preparaten gebruikt worden en bij de ervaren formuleerder bekend zijn mogen ook aan de dispersies toegevoegd worden. Daaronder vallen viscositeitsregelaars, stabilisa-20 toren (tegen degradatie door bevriezen of tegen verontreiniging, bijvoorbeeld), anti-vries, verdunningsmiddelen, coderingsmidde-len, en dergelijke. Onder deze toeslagen kunnen glycerol, dimethyl sulfoxyde (DMSO), diverse soorten gelatine (zowel natuurlijk als synthetisch) en polyolen zoals sorbitol genoemd worden.

25 De perfluorverbinding en de oppervlak- actieve stoffen kunnen in alle mogelijke hoeveelheden met water gemengd worden die tot uniforme dispersies leiden. Representatieve hoeveelheden zijn 5 tot 50 % perfluor-verbinding (op het volume van het eindpreparaat) en 0,5 tot 10 % oppervlak-actieve 30 stof (betrokken op het totale gewicht van het preparaat). Bevoor- keurde verhoudingen zijn 10-30 vol.% perfluor-verbinding en 2-5 gew.% oppervlak-actieve stof, maar in bijzondere gevallen kan van deze verhoudingen afgeweken worden, afhankelijk van de dis-pergeerbaarheid van de PFV, de gewenste deeltjesgrootte, en dat 35 soort overwegingen.

De waterige dispersies zullen gewoonlijk 8320264 - 14 - emulsies zijn, bij voorkeur van het olie-in-water-type, maar water-in-olie-emulsies vallen daar ook onder. In sommige gevallen hebben de emulsies een zeer kleine deeltjesgrootte en lijken ze voor het ongewapende oog doorzichtig of oplossing-achtig.

5 De micro-emulsies die met de dispersiemiddelen volgens het Ameri kaanse octrooischrift 3.828.085 geformuleerd kunnen worden hebben dat karakter en verdienen de voorkeur. Hoewel bij deze uitvinding niet uitgesloten verdienen colloïdale suspensies minder de voorkeur, in het bijzonder voor systemische toediening, wegens hun 10 grotere deeltjes en hun mindere stabiliteit. De hierboven genoem de octrooischriften betreffende bloedsurrogaten en oppervlak-actieve stoffen zijn een uitstekende gids voor het formuleren van de dispersies, en voor dat doel wordt de aandacht op die octrooischriften gericht.

15 De sensibilisering.

De waterige dispersies die de zuurstof-transporterende perfluor-verbindingen bevatten kunnen, bij toepassing als sensibilisatoren volgens deze uitvinding, plaatselijk of op elke systemische wijze aan een zoogdier toegediend worden, 20 zowel intraveneus, subcutaan, intramusculair, parenteraal of intraperitoneaal als oraal. Bij voorkeur wordt systemisch toegediend op een plaats die mogelijk maakt dat de dispersie langs de longen gaat om daar zuurstof op te nemen en de zuurstof naar de hypoxische tumorcellen te transporteren. De dosering van de 25 dispersie wordt vooraf uitgezocht, gelet op de plaats en de aard van de hypoxie, of de behandeling aanvullend op een behandeling met zuurstof van hoge spanning is of niet, de systemische tolerantie (toxiciteit) van die formulering voor het zoogdier, en andere factoren die de therapeut wel kent. In het algemeen moet 30 de "fluorocrit" van de perfluor-verbinding (ml PFV per 100 ml bloed) in het traject van ongeveer 3-10 % liggen, hoewel lagere of hogere fluorocritten onder bepaalde omstandigheden voldoende of vereist kunnen zijn. Als de toediening aanvullend op een behandeling met overdruk-zuurstof of op een andere vorm van pri-35 maire zuurstof-bediening is hoeft de fluorocrit niet groter dan 3,5 % te zijn en kan de partiële zuurstof-spanning van de inge- 2 O 2 (i 4 - 15 - ademde lucht met 100 % zuurstof tot ongeveer 2 atmosfeer bedragen. In de meeste gevallen duurt de zuurstof-toediening onder overdruk maximaal 30 minuten bij 2 atmosfeer en 100 % zuurstof, en van deze omstandigheden weet men dat ze goed verdragen worden.

5 Maar de duur, gehalte en druk van een primaire zuurstof-bediening zal in bepaalde gevallen van diverse factoren afhangen, zoals de gezondheidstoestand van het zoogdier of de patiënt, de plaats van de hypoxie en andere omstandigheden waarmee de stralings-of chemotherapeut vertrouwd is.

10 Het contact van de PFV-dispersie kan met de hypoxische cellen zijn maar ook met de bloedvaten van de tumorcellen, zodanig dat de door de PFV getransporteerde zuurstof op het scheidingsvlak van tumor en bloedvat overgedragen kan worden. Met andere woorden, hoewel direct contact van de PFV-dispersie 15 met de hypoxische cellen ideaal zou zijn kan dit weleens onbe reikbaar zijn en is het in feite ook niet nodig, daar overmaat zuurstof, waar dat ook in de tumormassa zit, de neiging heeft door de gehele massa verdeeld te raken, en dus ook de hypoxische cellen te bereiken.

20 De dosering van het sensibiliserende mid del voor de bestraling en/of de chemotherapie wordt ook beheerst door diverse omstandigheden, waaronder het tempo waarmee de per-fluor-verbinding zich naar de hypoxische tumorcellen verplaatst, de gewenste mate van sensibilisering en de cardiovasculaire half-25 waardetijd van de dispersie in het cardiovasculaire systeem en in de hypoxische weefsels. Voor sommige behandelingen (zoals voor een kort durende bestraling) kan een cardiovasculaire (serum-) halfwaardetijd van slechts ongeveer 2 tot 4 uur voldoende zijn.

Die korte duur geeft aan dat de perfluor-verbinding snel naar de 30 hypoxische tumorcellen komt en daar zijn zuurstof aan de cellen overdraagt. In dit verband is een uiterst geringe deeltjesgrootte een uitstekende eigenschap van de bevoorkeurde dispersies volgens de uitvinding, welke kleine deeltjesgrootte over langere tijden gehandhaafd blijft. De geringe deeltjesgrootte maakt het 35 de dispersies mogelijk snel door de bloedvaten naar de plaats van de hypoxie toe te komen. Bijvoorbeeld is een gemiddelde deel- i 7 Q - ,

v» C \; L

- 16 - grootte van 0,05 tot 0,2 ^im waargenomen en meerdere maanden gehandhaafd, tot wel een jaar of langer toe.

Voor een infusie in het zoogdierlichaam kunnen de dispersies met zuurstof beladen worden, en dat kan 5 raadzaam zijn als de injectie op of nabij de plaats van hypoxie is en niet op een plaats waarbij men op zuurstofoverdracht uit de longen in de slagaderen rekent. Dit vooraf met zuurstof beladen kan op elke wijze gebeuren, zoals het doorspoelen of afdekken van een vat dat de dispersie bevat met zuurstof of lucht, of het 10 doorborrelen van zuurstof of lucht door de dispersie voordat die toegediend wordt. Als de behandeling aanvullend of een overdruk-behandeling met zuurstof is kan men vooraf met zuurstof voorzien op de beschreven wijze ook toepassen. In ieder geval van vooraf met zuurstof voorzien kan er echter zuurstofverlies optreden voor-15 dat de dispersie in het gebied van de hypoxische tumorcellen komt, te weten tijdens het vervoer van de dispersie naar de cellen; daarom verdient vooraf met zuurstof voorzien in het algemeen niet de voorkeur.

De soorten, uitvoeringsvormen en plaatsen 20 van stralingsbehandeling zijn voldoende bekend en behoeven geen gedetailleerde beschrijving. Het zal echter duidelijk zijn dat bestraling van buitenaf kan gebeuren of door het inwendig plaatsen van stralingsbronnen nabij de plaats van hypoxie. De straling kan dan ook met röntgenstralen, gamma-stralen, neutronen e.d. gebeu-25 ren, of met geïmplanteerde bronnen van radium, iridium of cesium.

Men kan een gebruikelijke stralingstherapie (200 rad per dag, 5 dagen per week, gedurende 6 tot 8 weken) maar dosering en totale duur van de behandeling kunnen onder bijzondere omstandigheden naar behoefte bijgesteld worden.

30 Het sensibiliseren volgens de uitvinding zal bij alle typen van hypoxische tumorcellen werken, of die cellen in suspensie verkeren (zoals bij leukemie) of in vaste vorm, maar de uitvinding is vooral doeltreffend op vaste tumoren. Doordat de systemische verdeling van de dispersies snel gaat, voor-35 namelijk dankzij de uiterst fijne en stabiele deeltjesgrootte van de bevoorkeurde dispersies volgens de uitvinding, kan hypoxie 8320264 - 17 - op praktisch iedere plaats volgens de uitvinding gesensibiliseerd worden.

Chemotherapie wordt vaak in combinatie met stralingstherapie gebruikt om hypoxische tumorcellen te 5 vernietigen of onder bedwang te krijgen, en daarom kunnen de sensibiliseringstechnieken volgens de uitvinding gelijktijdig of in serie met chemotherapie en stralingstherapie toegepast worden. Als een dubbele therapie ingesteld wordt zal men normaliter een sensibiliserende dispersie kiezen die een cardiovasculaire ver-10 blijftijd heeft lang genoeg om de duur van beide behandelingen te dekken, en als de verblijftijd kort is kan de dosering aan sensibilisator geschikt verhoogd of bijgesteld worden. Het is bekend dat sommige chemotherapeutica van zuurstof afhankelijk zijn doordat er zuurstof nodig is voor het actieve transport van de 15 CT stof in de cel, voor het beheersen van de cyclus binnen de cel of voor versterking van de CT stof. Dus moet zuurstof in vrije vorm of door middel van een drager aangeboden worden. Omdat de perfluor-verbindingen volgens deze uitvinding en hun dispersies in staat zijn grote hoeveelheden zuurstof te vervoeren mag men 20 verwachten dat chemotherapie op basis van zulke stoffen die van zuurstof afhankelijk zijn er voordeel van zullen hebben als die geneesmiddelen met een SS stof volgens de uitvinding geformuleerd worden of in serie met de SS en CT stoffen toegediend worden. Methotrexaat is een voorbeeld van een CT stof die geacht wordt 25 zuurstof nodig te hebben voor actief transport in de cel. Vin blastine en vincristine zijn farmaceutica die zuurstof vergen voor de cyclus van de cel.

CT farmaceutica die niet van zuurstof afhankelijk zijn kunnen ook in combinatie met de sensibiliserings-30 technieken van de uitvinding toegediend worden. Hieronder kunnen de androgenen, oestrogenen, anti-oestrogenen, progestinen en bijnier-steroiden genoemd worden, en de stikstof-mosterd-stoffen, Chlorambucil, fenylalanine-mosterd, Cyclofosfamide, Thio-TEPA, Busulfan, 6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, 5-Fluoruracil, 35 Cytosine-Arabinoside, Adriamycine, Dactinomycine, Daunomycine, Bleomycine, mithramcycine, Mitomycine-C, BCNU, CCNU, Methyl- 8 3 2 ff 2 6 4 - 18 - CCNU, DTIC, Hydroxyureum, "Cis-Platinum" (cis-platia(II)diammine-dichloride), Procarbazine, Hexamethylmelamine, L-Asparaginase en dergelijke.

Daarmee samenhangende behandelingen.

5 De perfluor-verbindingen die als SS stof fen nuttig maar ook voor straling ondoorzichtig zijn hebben voor de doeleinden van deze uitvinding bijzondere waarde. Onder zulke verbindingen vallen de gebromeerde perfluorkoolwaterstoffen zoals F-perfluoroctylbromide en de gebromeerde perfluorethers 10 zoals F-l-broombutylisopropylether, F-l-broomethylisopropyl- ethers en andere gebromeerde perfluorethers, bijvoorbeeld beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.453.333. De radiologische eigenschappen van zulke verbindingen maken het volgen van hun SS effecten en ook van hun toxiciteit voor de omgevende 15 normale cellen mogelijk, en dienen dus zowel als diagnostische middelen als voor hun SS. Maar als de perfluor-verbindingen niet tevens voor straling ondoorzichtig zijn kunnen de dispersies die de perfluor-verbindingen bevatten met andere, bekende radiologische stoffen geformuleerd worden om dezelfde kansen voor het vol-20 gen van de stralingssensibilisering te scheppen. De radiologie kan toegepast worden als bij gebruikelijke radiografie of als die met computer axial tomography (CAT), of met de nieuwere NMR-technieken. De broom-verbindingen kunnen als radiologische stoffen als zodanig of in waterige dispersie gebruikt worden, bij-25 voorbeeld als een olie-in-water- of water-in-olie-emulsie met ongeveer 10-90 vol.% water en ongeveer 0,5-10 gew.% dispersie-middel.

Bescherming tegen straling kan ook toegepast worden in combinatie met de sensibilisering volgens de uit-30 vinding voor straling. Tegen straling beschermende stoffen zijn die die normale weefsels preferent tegen stralingsschade beschermen. Bij toepassing met sensibilisering voor straling is het oogmerk de schade aan normale weefsels te beperken, welke schade kan optreden als de SS stoffen bij afwezigheid van SB stoffen 35 gebruikt worden. Sulfhydryl bevattende verbindingen staan alge meen bekend als werkzame SB stoffen, zoals aminoethylisothiuro- pi T <7 π r' t ï

(y i.' ( \ I

- 19 - nium of de fosforthioaat-derivaten van β-mercaptoethylamine; een overzicht hiervan geeft een artikel van J.M. Yuhas, "On the Potential Application of Radioprotective Drugs in Solid Tumor Radiotherapy", dat verschijnen zal in"Radiation - Drug 5 Interactions in the Treatment of Cancer", onder redactie van G.H. Sokol en R.P. Maickel, (John Wiley & Sons, Ine., 1980), blz. 113-135. Een andere SB stof is S-2-(3-aminopropylamino)-ethylthiofosforzuur, in de literatuur ookwel als "WR-2721" beschreven. Deze stof biedt zowel bij stralingstherapie als bij 10 chemotherapie bescherming, zoals beschreven is in het artikel van Yuhas c.s. dat in Cancer Clinical Trials 3_ (1980) 211-216 verschenen is.

De volgende voorbeelden zullen dienen tot verdere toelichting van de uitvinding zonder de strekking daar-15 van te beperken. Hoewel de proefuitkomsten van voorbeelden II, IV en VII in vitro verkregen werden is de in deze voorbeelden aangetoonde sensibilisering niet beperkt tot niet-zoogdier-sys-temen omdat men weet dat onderzoekingen aan MTS goed correleren met de responspatronen van cellen in zoogdieren. In het bijzon-20 der weet men dat de MTS bij kweken in het zoogdierlichaam over eenkomstig hetzelfde tumor reageren.

Voorbeeld I

Bereiding van PFV-dispersies (A) Een oppervlak-actieve oplossing werd 25 aangemaakt door in water zoveel oppervlak-actief amidoamine- oxyde volgens formule 6 te dispergeren dat men een 2 gew.% oplossing kreeg. In de trilkamer van een menger merk "Sonicator" (model 350 van de firma Heat-Systems Ultrasonics, Inc.) bracht men 27 ml 2 % oppervlak-actieve oplossing, gevolgd door een lang-30 zame toevoeging (over 3-4 minuten) onder laag vermogen van de sonicator van 3 ml PFV-mengsel dat een vloeibaar 80:20 mengsel van F-l,3-dimethyladamantaan en F-trimethylbicyclo/ 3,3,1 /nonaan was, wat 30 ml preparaat met 10 vol.% PFV gaf. (Het PFV-mengsel was vooraf aan CO^ verzadigd om vorming van fluoride-ionen te 35 voorkomen.) De sonicatorhoorn werd toen 1 minuut op vol vermogen gezet (stand 10 op een schaal van 1-10) en daarna was er een af- / 8320264 - 2 O - koelingsperiode. Deze cyclus werd ongeveer 15 maal herhaald of totdat een doorzichtige, uniforme dispersie verkregen was. Deze dispersie (hierna aangeduid als "dispersie "A") werd door een Millipore filter van 0,22 ^im gefiltreerd en tot gebruik in een 5 ijskast bij 4°C bewaard.

(B) Een tweede dispersie werd in hoofdzaak zoals in (A) bereid, behalve dat in plaats van het amido-amineoxyde een oppervlak-actief niet-ionogeen polyoxyethyleen-polyoxypropyleen-copolymeer met een molecuulgewicht van ongeveer 10 8200 (Pluronic F-68) gebruikt werd. Deze dispersie is hierna aangeduid als "Dispersie B".

(C) Een derde dispersie werd in hoofdzaak zoals beschreven in (A) bereid, behalve dat de PFV nu F-tributyl-amine was (FC-43 van de 3M Company) en dat de oppervlak-actieve 15 stof "Pluronic F-68" was (zie B). De verhoudingen waren steeds hetzelfde (10 vol.% PFV, 2 gew.% oppervlak-actieve stof). Deze dispersie is hierna aangeduid als "Dispersie C".

Voorbeeld II

Sensibilisering in vitro voor straling.

20 Veelcellige tumor-bolletjes ("MTS") wer den verkregen door 10^ MCa-11 muizenborstkankercellen in 10 ml basaal medium van Eagles ("EBME") (van de firma Grand Island Biological Co., catalogus nr. 420-1200) in een 100 mm Petrischaal te brengen die eerst bekleed was met 0,75 % "noble" 25 agar in EBME. Binnen 7-10 dagen ziet men bolvormige aggregaten van tumorcellen verschijnen en die zijn dan gereed voor het onderzoek. De te beproeven PFV-dispersie werd met weefselkweek-medium in poedervorm op een osmolariteit van 290milliosmol ingesteld en de pH werd met 0,1 N NaOH of HC1 op 7,2 tot 7,4 bijge- 30 steld. Andere details van de bereiding en het gebruik van de MTS vindt men in "A Simplified Method For Production And Growth Of Multicellular Tumor Spheroids" van J.M. Yuhas c.s. in Cancer Research 3_7 (1977) 3639-43 en in "In Vitro Analysis Of The Response Of Multicellular Tumor Spheroids Exposed To 35 Chemotherapeutic Agents In Vitro Of In Vivo" can J.M. Yuhas c.s.

in Cancer Research 38 (1978) 3595-98.

@3202^4 - 21 -

Of het standaardweefselkweekmedium (EMBE) of de PFV-dispersie wordt 15 minuten met 100 % zuurstof uitgespoeld en dan samen met de bolletjes in niet met heparine behandelde capillairen overgebracht die afgesloten worden. Op tijden 5 0 en 60 minuten worden de buizen aan toenemende doses 250 kV

röntgenstralen blootgesteld, en binnen 30 minuten daarna worden ze weggenomen, met medium uitgewassen en afzonderlijk samen met 1,5 ml medium in met agar beklede putjes van 16 mm gebracht. Driemaal per week worden de bolletjes onder een anatomische 10 microscoop bij 40 x opgemeten, en het medium wordt tweemaal per week ververst. Uit de groeicurven van elke groep wordt het aantal dagen berekend dat nodig is om de bolletjes te laten uitgroeien tot een doorsnede 200 of 150 ^im groter dan bij het begin van de straling. De vertraging in groei van de bolletjes die uit de 15 cijfers blijkt is een maat voor de SB-respons, hoe groter het verschil met de niet bestraalde blanco's hoe groter het RB-effect. Toxiciteit van de PFV wordt geëvalueerd in termen van groeivertraging, d.i. de vertraging in groei van de bolletjes na blootstellen aan PFV (zonder bestraling) ten opzichte van die bij 20 onbehandelde bolletjes.

Tabel I hierna laat de resultaten met dispersies A en B zien, en tabel II de resultaten met dispersie C.

Men zal opmerken dat dispersies A en B op hetzelfde peil van giftigheid en stralingsgevoeligheid kwamen. 25 De door dispersies A en B vertoonde toxiciteit lijkt te verwaar lozen en door het cardiovasculaire systeem wel te verdragen. De toxiciteit van dispersie C, hoewel hoger dan die van dispersies A en B, diskwalificeert dispersie C niet als sensibilisator voor zoogdieren; die toxiciteit heeft met diverse factoren te maken, 30 zoals het SB reagens en de stralingsdosis, het soort tumor en de plaats daarvan, en daarom is dispersie C niet noodzakelijkerwijs van klinische evaluering uitgesloten. De gegevens van tabellen I en II zijn niet direct met elkaar vergelijkbaar; in de proeven van tabel I werden grotere bolletjes gebruikt dan bij 35 die van tabel II. Maar met de grotere bolletjes (die moeilijker te sensibiliseren zijn) werkt men het effect van de proef tegen, 7 : ' f /, «.. i v. ί. v, t.

- 22 - en daarom geven de uitkomsten van tabel I een zeer gunstige sensibilisering aan.

Op het eerste gezicht zou het lijken dat dispersie C met meer effect voor straling sensibiliseert dan 5 zowel dispersie A als dispersie B. Om twee redenen is dat waar schijnlijk niet zo. Het onderzoek met dispersie C was voorlopig en daarbij gebruikte men MTS waarvan een kleiner deel ten tijde van de behandeling tegen straling bestendige hypoxische cellen waren dan in dispersies A en B het geval is. In de tweede plaats 10 was dispersie C zelf groeiremmend, en waarschijnlijk versterkte deze eigenschap op een of andere wijze de vernietiging van tumorcellen.

Tabel I

Systeem Bestraling Dagen voor Groeivertraging (dagen)_ 15 (rad) groei tot Toxici- Stralings- RB- _ _ 200 pm teit effect effect MTS/EBME 0 4,1 0& MTS/EBME 750 5,3 0b 1,2° MTS/EBME/ 20 Dispersie A0 4,4 0,3 MTS/EBME/

Dispersie A 750 9,0 0,3 4,6° 3,7 MTS/EBME/ d

Dispersie B 0 4,1 0 - 25 MTS/EBME/

Dispersie B 750 8,9 0 4,8° 3,6

Tabel II

Systeem Bestraling Dagen voor Groeivertraging (dagen)_ 30 (rad) groei tot Toxici- Stralings- RB- 150 ^μπι_ teit effect_ effect MTS/EBME 0 3,8 0a MTS/EBME 750 11,5 0b 7,7° MTS/EBME/ d 35 Dispersie C 0 8,4 4,6 MTS/EBME/ ,

Dispersie C 750 30 4,6 21,6 18,5 6320264 - 23 - a Per definitie k Verondersteld gelijk te zijn aan de niet bestraalde blanco

Q

Waargenomen tijd minus de tijd nodig bij de overeenkomstige niet bestraalde groep 5 Waargenomen tijd minus de tijd nodig bij de niet bestraalde blanco groep.

Voorbeeld III

In vivo onderzoek (verblijftijden).

Het tempo waarmee de PFV-dispersies A en 10 B uit de bloedsomloop verdwenen werd met zowel Fisher 344 ratten als met BALB/c muizen geëvalueerd (in beide gevallen vrouwtjes). De dispersies werden intraveneus geïnjicieerd in een PFV-dosis gelijk aan een derde van het omloopvolume, wat overeenkomt met 6 % van het lichaamsgewicht. Binnen 30 minuten na de injectie 15 komt het volume van het dier weer op de normale waarde, wat blijkt uit het feit dat de fluorocrit dan 3,1 % is, vergelijkbaar met de voor deze dispersies berekende waarde van 3,3 %. Gedurende 8 uur na de injectie werd met afgepaste tussenpozen bloed uit de sinus supraorbitales (holte boven de oogkas) in microcapillai-20 ren getrokken. Na 15 minuten centrifugeren op 12.000 x g werden de fluorocrit (PFV als % van het bloedvolume) en de hematocrit onder een microscoop afgelezen. De PFV vindt men als een sediment onderin de buizen, met daarboven de rode bloedlichaampjes en het plasma, in afzonderlijke lagen dus. Alle cijfers waren 25 genormaliseerd op 30 minuten centrifugeren en de mate waarin de fluorocrit afnam werd berekend op basis van een exponentiële uitputting uit één enkel compartiment, dus: -kt % overgebleven PFV = e 30 en mi ln 2

Bij het uitzetten van de uitkomsten in een grafiek bleek dispersie A superieur aan dispersie B (halfwaardetijden van respectievelijk 366 min. en 222 min.), waarschijnlijk doordat dispersie A 35 kleinere deeltjes had dan dispersie B. Met ratten en muizen wer- @ 3 2 & 2 ft 4 - 24 - den in wezen dezelfde uitkomsten verkregen. De uitkomsten laten zien dat de PFV in beide dispersies het cardiovasculaire systeem snel zal verlaten, en daarom zijn beide dispersies goede kandidaten voor klinisch onderzoek.

5 Voorbeeld IV

De MTS-proeven van voorbeeld II werden in alle essentiële aspecten met dispersie B herhaald, maar nu met bolletjes afgeleid van een menselijke tumor-lijn die bij het kweken als MTS hypoxische cellen bevatten. Zoals tabel III hierna 10 laat zien werd in alle gevallen enige toxiciteit waargenomen, maar de mate waarin lijkt betrekkelijk aanvaardbaar. Een gematigde sensibilisering voor straling bleek bij twee neuroblastoom-cellijnen, maar een heel sterke stralingsensibilisering bleek bij de melanoom-lijn. Dit laatste is een opvallend resultaat wegens 15 de frequentie van en hoge risico bekend bij deze vorm van hypo xische tumorcellen. Heel weinig SB effect werd bij de osteosarcoom-cellijn gevonden, maar deze uitkomsten waren slechts voorlopig en de straling was van een lage dosis.

20 ‘ ; i ' : t,

- 25 -Tabel III

Menselijke Straling Dagen voor Groeivertraging (dagen) tumorlijn Systeem (rad) groei tot Toxici- Stralings- SS- _ _ 200 ^μιη te it effect effect 5 NB-100

Neuroblastoom EBME/MTS 0 6,5 0 EBME/MTS 400 7,4 0 0,9 EBME/MTS/

Disp. B 0 6,6 0,1 - 10 EBME/MTS/

Disp. B 400 10,0 0,1 3,4 2,6 LAN-1

Neuroblastoom EBME/MTS 0 4,9 0 EBME/MTS 400 5,2 0 0,3 15 EBME/MTS/

Disp. B 0 5,2 0,3 EBME/MTS/

Disp.B 400 9,3 0,3 4,1 4,1

SAOS

20 Osteosarcoom EBME/MTS 0 8,6 0 EBME/MTS 250 12,9 0 4,3 EBME/MTS/

Disp. B 0 10,7 2,1 EBME/MTS/ 25 Disp. B 250 14,0 2,1 3,3 1,1 032

Melanoom EBME/MTS 0 7,9 0 EBME/MTS 750 10,5 0 2,6 EBME/MTS/ 30 Disp. B 0 8,4 0,5 EBME/MTS/

Disp. B 750 17,4 0,5 9,0 6,9

Voorbeeld V

35 Acute toxiciteit

Onderzoek werd verricht om de bruikbaarheid van PFV-emulsies voor intravasculaire toediening en zuurstof transport te bevestigen. De beproefde emulsie was dispersie B die tot gebruik bij 4°C bewaard was. Vlak voor gebruik werd 40 de osmolariteit met poedervormig kweekmedium (EBME) op ongeveer 300 milliosmol bijgesteld, en de pH met HCl of NaOH op 7,4, Tabel IV hierna laat de uitkomsten van het onderzoek naar de acute toxiciteit voor Fisher-344 ratten zien, waarbij uiteenlopende doses van de emulsie in de staartaders der ratten inge- 8320264 - 26 - spoten werden. Ratten die ten minste 10 dagen na de injectie nog in leven waren golden als "overlevend". Als er sterfte optrad was dat gewoonlijk tussen 4 en 24 uur. De uitkomsten laten zien dat de dieren in verhouding tot hun bloedvolume betrekkelijk 5 grote doses PFV-emulsie (60 tot 80 ml/kg) kunnen verdragen, ver geleken met de doses die normaal bij het bepalen van de stra-lingsensibilisering in vivo toegediend zouden worden, namelijk 20 tot 30 ml/kg. Bij de bepaling van de LD,.q i.v. werd vastgesteld dat de dodelijke dosis boven 60 ml/kg voor BALB/c muizen 10 ligt en boven 120 ml/kg voor Fisher-344 ratten. Deze waarnemin gen kloppen met die van andere onderzoekers, namelijk dat de PFV-dispersie een lage acute toxiciteit heeft, zelfs als men daarvan meer inspuit dan het normale bloedvolume van het dier. De bij hoge doses optredende sterfte was waarschijnlijk aan over-15 belasting met vloeistof te wijten en niet aan een inherente toxiciteit van de PFV-dispersies.

Tabel IV

Acute toxiciteit van dispersie B voor ratten als men er meer van inspoot dan het vloedvolume 20 van het dier.__

Dosis (ml/kg) Aantal doden _ Aantal dieren_ 20 0/11 40 0/3 25 60 0/3 80 0/3 100 0/2a 120 1/3 0 één dier stierf tijdens de injectie door mishandeling.

30 Voorbeeld VI

Sensibilisering in vivo voor straling.

Stralingssensibilisering van de 3M2N borstkanker in de rechter achterpoot van Fisher-344 ratten werd onderzocht. 10-14 dagen na subcutane transplantatie in de rat-35 ten waren de gezwellen 6-8 mm in doorsnede en rijp voor behande ling. De blanco dieren kregen of geen behandeling of diverse ©3 2 0 2. 6 4 - 27 - stralingsdoses. De andere dieren kregen i.v. een infuus van 20 ml/kg dispersie B (20 % w/v) en daarna liet men ze 30 minuten ademhalen in 95 % C>2/5 % C02 (onder 1 atm) , waarna ze diverse doses röntgenstraling kregen. Voor en driemaal per week na de 5 behandeling werden de doorsneden der gezwellen in twee dwars op elkaar staande richtingen in situ gemeten en gemiddeld. Tabel V hierna laat de uitkomsten van dit onderzoek zien, uitgedrukt in de tijd die de gezwellen nodig hadden om uit te groeien tot 8 mm groter dan ten tijde van de behandeling. Uit de cijfers 10 blijkt dat de met PFV-dispersie bereikte verlenging met de stra-lingsdosis toeneemt, en ook dat de groeivertraging per rad bij de met PFV behandelde groep groter is dan bij de blanco. Dat de verlenging te wijten is aan de combinatie van de PFV-dispersie en het ademhalen in het gasmengsel is duidelijk uit de hieronder 15 staande tabel VI doordat er bij de blanco behandeling helemaal geen vertraging van de groei was.

Tabel V

Stralingssensibilisering van 3M2N-tumoren in

ratten bij diverse stralingsdoses met dispersie B

20 Stralingsdosis Dagen om 8 mm te groeien_ _(rad)_ Blanco Dispersie B + veel zuurstof 0 11,5 ± 0,8 11,5 ± 1,1 500 10,9 ± 0,9 12,0 ± 0,9 1500 19,5 ± 0,9 24,9 ± 0,8 25 2500 25,2 ± 1,4 35,7 ± 1,3

Tabel VI

Effecten van diverse blanco-behandelingen op de groei van 3M2N tumoren in ratten 30 Geen 12,3 ± 1,4

Emulsie^ 12,9 +0,9 0,6 2500 rad 27,3 ±2,4 15,0 i 3.1

Zout-opl. + 2500 rad 25,3 ± 3,1 13,0 35 Emulsie ^ + 2500 rad 24,4 ± 2,8 12,1 95% 0/5 % CO + 2500 rad 29,8+3,1 17,5 - ? ;? · fr l - - 28 - (a) 20 ml/kg Dispersie B of een zelfde volume aan zout-oplossing.

Voorbeeld VII

Sensibilisering in vitro voor chemotherapie.

5 De potentiëring van chemotherapeutica door PFV-dispersies bleek uit het anti-tumor-effeet van methotre- xaat ("MTX") in NB-100 neuroblastoom-veelcellige tumorbolletjes ("MTS"). Bij dit onderzoek werden de bolletjes blootgesteld aan 0 tot 5 x 10 ^ M methotrexaat in blanco medium of in dispersie 10 B, beide in evenwicht gebracht met 95 % 0^ en 5 % CC^· uitkomsten (tabel VII hieronder) blijkt dat de PFV-dispersie het effect van MTX versterkte, zoals blijkt uit de vertraging in de groep ten opzichte van bolletjes die alleen met MTX behandeld waren. Hoewel met dit gasmengsel alleen reeds enige sensibilise- 15 ring van deze bolletjes voor MTX bereikt kon worden was daar een voorbehandeling van 1 tot 2 uur voor nodig, in tegenstelling tot slechts 30 minuten met de PFV-dispersie, wat duidelijk de zinvolheid van het evalueren van de therapeutische index van dit belangrijke geneesmiddel tegen kanker met PFV laat zien.

20 Tabel VII

Effecten van PFV-dispersie B en zuurstof op de respons _van NB-100 MTS op 24 uur blootstellen aan 5 ,um MTX_

Blanco's MTX PFV-dispersie _+ MTX_ 25 Dag 0 9,17 + 0,3la 9,83 ± 0,17 9,90 ± 0,23 1 10,23 9,74 9,77 4 13,78 10,69 9,66 6 15,72 11,76 9,83 8 17,17 13,93 10,90 30 12 18,93 15,81 15 21,83 19,0 18_23,5_ D8b_7,18_9,52_13,02_ a - afmetingen der MTS opgegeven in microscoop-eenheden, 1 een-35 heid = 25 ^im b - D8 is het aantal dagen dat de MTS nodig hebben om 8 eenheden of 200 ^im groter te worden dan hun begindoorsnede.

8 3 2 0 2 6 4 - 29 -

Voorbeeld VIII

Sensibilisering in vivo voor chemotherapie.

Het gecombineerde gebruik van een PFV-dispersie (dispersie B) en het ademen in een zuurstofrijke atmos-5 feer voorhet versterken van de anti-tumor-effecten van cyclo- fosfamide ("CYC") werd beproefd op MCa-11 borstkanker dat in de rechter achterpoot van vrouwelijke BALB/c muizen getransplanteerd was. Men liet de gezwellen tot 2 mm uitgroeien, en toen werden de dieren behandeld zoals in tabel VIII hieronder aange- 10 geven is. Cyclofosfamide, uit de handel verkregen, werd in ge destilleerd water opgelost en opgelost in een volume overeenkomende met 0,01 ml/kg lichaamsgewicht. Per behandelingsgroep werden 3 tot 6 dieren gebruikt. Op de dag van de behandeling en 3 tot 5 maal per week daarna werden de tumoren met schuifpassers ge- 15 meten.

Uit de proefuitkomsten (tabel VIII) is het duidelijk dat het met cyclofosfamide alleen (zonder zuurstof of PFV-dispersie) het anti-tumor-effect (groeivertraging) niet aantoonbaar versterkt werd door versterkte zuurstof-toevoer 20 (95 % % CO^) of door injectie van de PFV-dispersie gevolgd door versterkte zuurstof-toevoer, maar het werd wel doeltreffend versterkt door toevoeging van de PFV-dispersie in combinatie met het ademhalen van 95 % zuurstof.

Tabel VIII

25 Effecten van PFV ± en zuurstof op het anti-tumor- ef fect van cyclofosfamide.

Behandeling3 Aantal Dagen om 6 mm Groei- _muizen_te groeien_vertraging_ 30 Blanco 14 12,5

Cyclofosfamide 5 17,8 5,3 PFV + CYC 4 17,1 4,5

Zuurstof + CYC 5 16,6 4,1 PFV + 02 + CYC_6_20,8_8^3_ 35 a - Blanco = geen behandeling; cyclofosfamide = een enkele i.p.

dosis van 75 mg/kg cyclofosfamide; PFV = een enkele injectie van 20 ml/kg F-DAM/F-nonaan-2 uur voordat ze cyclofosfamide 8320264 - 30 - kregen; zuurstof = 2 uur voor en 2 uur na toediening van het cyclofosfamide onder 95 % + 5 % CC^ gehouden. Bij de combinatie PFV + 0^ + CYC werd de PFV toegediend vlak voor-dat de muizen onder 95 % zuurstof geplaatst werden.

5 b - aantal dagen nodig voor 6 mm groei werd gevonden door inter polatie van de groeikrommen uit de verkregen waarnemingen.

Voorbeeld IX

Bescherming tegen en sensibilisering voor chemotherapie in vivo.

Gecombineerde chemosensibilisering van 10 hypoxische gezwellen voor chemotherapeutica en bescherming van normale weefsels wordt bereikt met de werkwijze beschreven door Yuhas c.s. "Treatment of Tumors with the Combination of WR-2721 and Cis-dichlorodiammine platinum (II) of Cyclophosphamide", in Brit. J. Cancer 4_2 (1980) , 574-585 en daarin genoemde refe-15 renties, met de in voorbeeld VI hierboven beschreven modifica

ties van gelijktijdige infusie van 20 ml/kg PFV-dispersie (dispersie B), het ademen in gewone lucht of in 95 % C^/S % CO^, het meenemen van blanco's, en andere aanpassingen waar nodig. Voorbeeld X

20 Bescherming tegen en sensibilisering voor straling in vivo.

De sensibilisering van hypoxische gezwellen voor bestraling door behandeling met PFV-preparaten volgens de uitvinding in combinatie met bescherming van normale weefsels tegen straling in de omgeving van de behandeling wordt 25 bereikt met de methode beschreven door Yuhas c.s., "The Role of WR- 2721 In Radiotherapy and/of Chemotherapy" in Cancer Clinical Trials (1980) , 211-216 en daarin genoemde publikaties, met de in voorbeeld VI hierboven beschreven modificaties van gelijktijdige infusie van 20 mg/kg PFV-preparaat (dispersie B), ademen 30 in lucht of in 95 % 0^/5 % CC^, het meenemen van blanco's, en andere aanpassingen waar nodig.

Afgifte van lipofiele geneesmiddelen.

Tijdens onderzoek aan chemosensibilisering in vitro van het systeem van menselijke LAN-1 neuroblas-35 toom-bolletjes, in hoofdzaak uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld IV maar nu met adriamycine als chemotherapeuticum, werd opgemerkt dat de anti-tumor-werking van het adriamycine (o, 1:. r/ Π r· f: .'/ ö J I U L v - 31 - door het PFV (dispersie B) geremd werd. Dit deed veronderstellen dat het PFV het adriamycine fysiek zou kunnen binden, waardoor de voor absorptie door de bolletjes beschikbare hoeveelheid omlaag zou kunnen gaan. Dit werd beproefd door een radioactief 14 5 gemerkt analogon van adriamycine, C -daunomycine, in water op te lossen, dispersie B toe te voegen (of in andere proeven alleen dispersie B), 30 minuten te mengen, de PFV-fase van de waterfase te scheiden en de verdeling van het geneesmiddel over de fasen na te gaan. Tabel IX hieronder laat de uitkomsten van de 10 proef en overeenkomstige proeven met drie andere geneesmiddelen zien. Men zal opmerken dat het meer lipofiele daunomycine bij voorkeur in de PFV-fase ging zitten, terwijl de andere, minder lipofiele geneesmiddelen de voorkeur gaven aan de waterfase. De conclusie was dat, hoewel de PFV een remmende werking op minder 15 lipofiele geneesmiddelen kan hebben de afgifte van lipofiele geneesmiddelen door de PFV versterkt zal worden.

Tabel IX

De binding van vier geneesmiddelen tegen kanker door PFV-dispersie_ 20 Stof Lipofiliciteits- Stof in emulsie _ index*_ Stof in waterfase

Daunomycine 0,79 3,77

Misonidazool 0,43 0,04

Methotrexaat 0,014 0,07 25 WR-2721 0,002 0,05 * Lipofiliciteitsindex is de verdelingscoëfficiënt van de stof tussen octanol en water.

De preferente oplosbaarheid van lipofiele geneesmiddelen in PFV-preparaten geeft niet alleen een middel 30 de afgifte van deze geneesmiddelen aan dieren te versterken maar opent ook de mogelijkheid de verblijftijd van dat geneesmiddel in het dier te beheersen, bijvoorbeeld door de afgifte van het geneesmiddel uit circulerende PFV aan plasma of doel-organen te verlengen. Met andere woorden: door een geëigende 35 keuze van een geneesmiddel vanuit het standpunt van zijn lipo- filiciteit in betrekking tot een PFV-dispersie wordt een langer 8720264 - 32 - durende afgifte op lager niveau van een geneesmiddel aan een waterig transportsysteem mogelijk.

Voorbeeld XI

Versterking van chemotherapie.

5 Dit voorbeeld licht de versterking van de anti-tumor-werking van vincristine toe, een lipofiel geneesmiddel waarvoor gezwellen gewoonlijk bestand zijn, althans voor niet-lethale doses daarvan. De versterking wordt geacht te wijten te zijn aan de preferente oplosbaarheid van dat geneesmiddel 10 in de PFV.

De verdeling van vincristine over PFV en de waterige fase van dispersie B werd eerst vergeleken met die van daunomycine, zoals weergegeven in tabel X, waarbij "PFV" voor de PFV-fase van dispersie B staat.

15 Tabel X

PFV/H20(b)

Geneesmiddel Verdelingscoëfficiënt _ oc tanol:wate r (a) 1 uur 3 uur

Daunomycine 0,79 1,23 3,80 (c) 20 Vincristine 682 2,69 9,10 (a) Hoe hoger de verdelingscoëfficiënt octanol:water, hoe lipofieler de stof is (b) verhouding van concentraties in emulsie en waterfase 25 (c) bepaald door bioassay in het systeem van LAN-1 neuroblastoom-bolletj es.

Daarna werd in een MCa-11-borstkanker een chemosensibilisering uitgevoerd, in hoofdzaak zoals beschre-30 ven in voorbeeld VIII, behalve in het volgende:

Het MCa-11-borstcarcinoom werd getransplanteerd in de dij van BALB/c muizen en dat liet men uitgroeien tot een doorsnede van 6 mm, op welk tijdstip de muizen behandeld werden. Blanco muizen kregen een injectie van zout-oplossing, 35 terwijl de vincristine-behandeling uit één enkele intraperitoneaal toegediende dosis van 1,5 mg/kg vincristine bestond. De PFV-behan- 8 λ ? o 2: 0 k b 1 - 33 - deling bestond uit een i.v. injectie van 20 ml/kg dispersie B gevolgd door 2 uur "carbogeen" (95 % % CC^) inademen, en een injectie van vincristine in zout-oplossing, net als te voren, gevolgd door nogeens 2 uur carbogeen inademen. Waargenomen werd 5 dat de vincristine-behandeling alleen geen invloed op de tumor- groei had. Eveneens had toediening van PFV-emulsie alleen geen effect op de tumorgroei, maar in combinatie met de vincristine-injectie werd de groei van de tumor met ongeveer 5 dagen vertraagd. Het inademen van bijna zuivere zuurstof werd mee in deze 10 proef opgenomen om te waarborgen dat een eventuele stimulering van een actieve uitscheiding een eventueel gunstig effect via een betere afgifte van het geneesmiddel niet zou overheersen. Thans lopend in vitro onderzoek laat zien dat het voordeel van de PFV-vincristine-combinatie niet van zuurstof afhankelijk is.

15 Bovendien zag men geen versterkte toxiciteit van vincristine voor het gastdier bij combinatie met de PFV-dispersie. Het lijkt er dus op dat PFV-dispersies het inzicht hebben over langere tijden geneesmiddelen in lagere doseringen af te geven.

Het zal ook duidelijk zijn dat bij het 20 aanpassen van PFV aan geneesmiddelen op basis van hun betrekke lijke lipofiliteit het geneesmiddel in een aantal behandelingen op beheerste wijze doeltreffender kan worden. In sommige gevallen kan het effect een versterking van de werkzaamheid zijn. In andere gevallen kan een verlaagde werking of een langer durende 25 werking het gewenste resultaat zijn. Deze voordelen zijn bereik baar of het PFV-materiaal voor het zuurstoftransport gebruikt wordt of niet.

30 8320264

Claims (15)

1. Een waterig farmaceutisch preparaat dat een geëmulgeerde perfluorkoolstof en een lipofiel geneesmid- 5 del, een chemotherapeuticum, een tegen chemotherapeuticum be schermende stof of een tegen straling beschermende stof of een mengsel van twee of meer daarvan bevat.

2. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1 waarvan die perfluorkoolstof-verbinding een 10 geperfluoreerde cyclische koolwaterstof is.

3. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens conclusie 2 waarvan die geperfluoreerde cyclische koolwaterstof niet-aromatiseerbaar en polycyclisch is en ten minste twee koolstofatomen heeft die door een brug van ten minste één 15 koolstofatoom verbonden zijn.

4. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens een der voorafgaande conclusies waarvan de gemiddelde micel-afmetingen van de geëmulgeerde perfluorkoolstof binnen het traject van 0,05 tot 0,2 ^im ligt.

5. Een waterig farmaceutisch preparaat vol gens een der voorafgaande conclusies waarin een chemotherapeuticum aanwezig is, welk chemotherapeuticum methotrexaat is.

6. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens een der voorafgaande conclusies waarin een chemotherapeu- 25 ticum aanwezig is, welk chemotherapeuticum cyclofosfamide is.

7. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens een der conclusies 1 t/m 5 dat een lipofiel geneesmiddel bevat, welk geneesmiddel daunomycine is.

8. Een waterig farmaceutisch preparaat 30 volgens een der conclusies 1 t/m 5 dat een lipofiel geneesmiddel bevat, welk geneesmiddel vincristine is.

9. Waterig farmaceutisch preparaat volgens een der voorafgaande conclusies, dat bovendien een dispersie-middel bevat.

10. Een waterig farmaceutisch preparaat volgens conclusie 7, waarvan het dispersiemiddel gekozen is P T ?. Cs 2 i 4 ^ ‘ - 35 - 4 onder de condensatieprodukten van ethyleenoxyde en een adduct van propyleenoxyde aan propaandiol en de gefluoreerde amidoamine-oxyden.

11. Een waterig farmaceutisch preparaat 5 volgens een der voorafgaande conclusies dat bovendien een voor straling ondoorzichtige stof bevat.

12. Een waterige emulsie van een perfluor-koolstof, geschikt voor het versterken van de werking van lipo-fiele geneesmiddelen, van chemotherapie of van de chemotherapeu- 10 tische of stralingstherapeutische behandeling van kanker.

13. Werkwijze voor het bereiden van een waterige emulsie van perfluorkoolstoffen, geschikt om in een preparaat volgens een der conclusies 1 t/m 11 toegepast te worden, waarbij de perfluorkoolstof in twee stappen gedispergeerd 15 wordt, eerst in een waterige oplossing van een dispersiemiddel tot een emulsie met micel-afmetingen van 0,5 tot 1 ^im, en de aldus verkregen emulsie vervolgens in een tweede dispergering tot een emulsie met mieel-grootten van 0,05 tot 0,2 ^im.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, 20 waarbij het gebruikte dispersiemiddel gekozen wordt onder de condensatieprodukten van ethyleenoxyde en de adducten van propyleenoxyde met propaandiol, en de gefluoreerde amidoamineoxyden.

15. Werkwijze volgens conclusie 13 of 14, waarbij de perfluorkoolstof vooraf aan kooldioxyde verzadigd 25 wordt. ,'rV. Λ, C C