NL8204711A - N-(vinblastinoyl-23)derivaten van aminozuren, hun bereiding en therapeutische toepassing. - Google Patents

Description

Wf'· : ' ............ ^ N/31.242-Kp/Pf/vdM ->' * - 1 - N-(Vinblastinoyl-23)derivaten van aminozuren, hun bereiding en therapeutische toepassing.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe bisindoolalkaloiden. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op combinatieprodukten van aminozuur met derivaten van vinblastine, op een werkwijze voor hun bereiding, 5 hun toepassing als antitumormiddelen en op farmaceutische samenstellingen welke deze bevatten.

Deze nieuwe derivaten van vinblastine kunnen worden gebruikt bij de behandeling van leukemie en kwaadaardige tumoren bij mensen.

10 Bisindoolalkaloiden van het vinblastine-type zijn bekende verbindingen met het koolstofskelet volgens de algemene formule 1 van het formuleblad.

Als voorbeelden van deze verbindingen kunnen worden geciteerd: vincaleukoblastine (Amerikaans octrooischrift 15 3.097.137), leurocristine of vincristine en leurosidine (Amerikaans octrooischrift 3.205.220), vinglycinaat (Belgische octrooischrift 659.112) en vindesine (Belgisch octrooischrift 813.168).

De laatste verbinding wordt verkregen door che-20 mische modificatie van natuurlijk vinblastine (1, R^ = OCH^, R2 = COCH3), dat kan worden verkregen door extractie van de bladeren van Catharanthus roseus.

Vinblastine, vincristine en vindesine zijn com-merciëel verkrijgbaar voor gebruik in de menselijke therapie, 25 meer in het bijzonder voor de behandeling van leukemie en sommige vaste tumoren.

Gebleken is echter dat deze geneesmiddelen ongunstige neveneffecten bezitten. Vincristine vertoont neuro-toxische effecten en vinblastine een hoge toxiciteit voor zo-30 ver erytropoëtische weefsels betreffende.

Hun werkingsmechanisme is gelijk aan het mechanisme dat is gepostuleerd voor de antimitotische werking van colchicine. Deze geneesmiddelen zouden werken door remming van de polymerisatie van tubuline, onder oplevering van microtu-35 buli en bij gevolg tegenhouding van de celdeling in de meta- 8204711 ^ % - 2 - fase.

Het gebruik van 1:1-complexen van antitumor-tubiline/bisindoolalkaloiden is beschreven in het Belgische octrooischrift 854.053.

5 In sommige gevallen werden lagere toxiciteit en efficiëntere chemotherapeutische activiteit waargenomen dan voor de overeenkomstige vrije alkaloïden.

Andere chemische modificaties van vinblastine zijn beproefd. Zo is ook het vinglycinaatsulfaat (1, sulfaat, 10 = 0CH3, R2 COCH2N(CH3)2 - Cancer Research 1967, 27, 221- 227), beproefd in klinische testen, maar blijkt in het algemeen niet beter te zijn dan vinblastine of vincristine.

In het Belgische octrooischrift 813.168 worden Vindesine (1, R^ = NH2, R2 = H) en andere vinblastine-C3-car-15 bonamidederivaten beschreven. Latere verslagen bevestigden het therapeutische belang van vindesine of 3-carbonamide-4-0-deacetylvinblastine, maar deze verbinding bleek inactief te zijn voor de behandeling van muriene 1210-leukemie geënt in muizen (zie C.J. Barnett en anderen, J. Med. Chem. 2_1, 88, 20 1978).

De nieuwe in de onderhavige aanvrage beschreven verbindingen kunnen in aanzienlijke mate de dood uitstellen van muizen, die intraveneus geënt zijn met P 388- en L 1210-leukemieën.

25 Activiteiten ten opzichte van experimentele P

388-tomoren bleken geheel verrassend veruit superieur ten opzichte van de ermee vergeleken Vinca-alkaloiden. In talloze gevallen werd totale remissie waargenomen.

De verbindingen volgens de uitvinding vertonen 30 verder andere belangrijke en onverwachte voordelen, vergeleken met vinblastine en bekende analogen, in het bijzonder vindesine.

Meer in het bijzonder is de waargenomen toxiciteit in het algemeen lager dan de overeenkomstige toxiciteit 35 van vindesine of vincristine.

De nieuwe verbindingen volgens de onderhavige uitvinding zijn meer in het bijzonder die met de algemene formule 2 van het formuleblad, waarin R een α-aminozuurester is, 8204711 » i - 3 - (? -:...........................

welke evt. beschermd is, en gebonden is aan de vinblastin-23-oylrest door een amidebinding, waarbij de rechte of vertakte estergroep 2-9 koolstofatomen bevat en R^, een waterstofatoom of een hydroxygroep is, R2 een waterstofatoom, een formyl-5 groep of een C2-Cg-acylgroep is, Rg een waterstofatoom of een methylgroep of een formylgroep is, met dien verstande dat verbindingen, waarin Rg methyl is en R^ een β-hydroxygroep, zijn uitgesloten; of hun zuuradditiezouten met minerale of organische zuren.

10 In het bijzonder verdienen de voorkeur verbin dingen met formule 3 van het formuleblad, waarin R^ een hydroxygroep of een waterstofatoom is, R2 een waterstofatoom, een formylgroep of een C2~Cg-acylgroep, Rg telkens onafhankelijk bezien, een waterstofatoom, rechte of vertakte C^-Cg-15 alkyl, hydroxy-C^-Cg-alkyl, aminohydroxy-C^-Cg-alkyl, carbo-xy-C^-Cg-alkyl, amido-Cg-Cg-alkyl, guanadino-Cg-Cg-alkyl, amino-C^-Cg-alkyl, thiol-C^-Cg-alkyl, cysteinylmethyl, methyl-thioethyl, benzyl, hydroxybenzyl, of een groep met formule 4 of 5 van het formuleblad, of Rg te samen met het koolstof, 20 waaraan het is gebonden, en het stikstofatoom van de amido-groep, een azool- of een hydroxyazoolring vormt; Rg een waterstofatoom of een methylgroep of een formylgroep is en R^ een rechte of vertakte Cg-Cg-alkyl, of een benzylgroep is, met dien verstande dat verbindingen, waarin tegelijkertijd Rg 3 -25 OH en Rg -CHg is, zijn uitgesloten en waarbij -COOR^ bij voorkeur de carboethoxy- of de carbomethoxygroep is? of hun zuuradditiezouten met een mineraal of organisch zuur.

In een voorkeursuitvoeringsvorm stelt het struc-

R O

tuurgedeelte, j3 jj -nh-ch-cor4 30 in de algemene formule 3, een ester voor die is afgeleid van een van de natuurlijk voorkomende aminozuren en hun optische isomeren met D-configuratie, namelijk glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, asparginezuur, gluta-minezuur, aspargine, glutamine, arginine, lysine, cysteine, 35 cystine, methionine, fenylalanine, tyrosine, tryptofaan, proline, histidine, hydroxylysine of hydroxyproline.

De verbindingen kunnen worden aangeduid als 3-decarbomethoxy-0-4-deacetylvinblastine-3-carbonamide. Zij 8204711

* V

- 4 - zullen echter in het vervolg bij voorkeur worden aangeduid als N-(vinblastin-23-oyl)-of N-(vincristinoy1-23)-derivaten van aminozuren.

Verbindingen volgens de uitvinding met de alge-5 mene formule 2, welke in het bijzonder de voorkeur verdienen, zijn die waarin 1*2 waterstof is en de aminozuurresten zijn afgeleid van een van de volgende aminozuren: L- of D-trypto-faan, leucine, isoleucine, valine, alanine of fenylalanine. Hieronder zijn L-tryptofaan, L-isoleucine en L-alanine van 10 bijzonder belang.

De onderhavige uitvinding beschrijft meer in het bijzonder reactieprodukten van aminozuren met vincristine, 0-4-deacetylvincristine, deformyl-O-4-deacetylvincristine en deoxyvinblastine-B.

15 De laatste verbinding kan worden verkregen door hydrogenering van anhydrovinblastine, dat is verkregen door dehydratatie van vinblastine of door koppeling van vindoline aan catharantine (Potier e.a., JACS 98, 7017, (1976)).

De verbinding volgens de uitvinding met de 20 meeste voorkeur is het ethyl-N-(0-4-deacetyl-4'-deoxyvinblas-tin-23-oyl)-tryptofanaat.

Wanneer het aminozuur functionele groepen bevat in de zijketen (formule 3), zoals lysine of cysteine, kan het noodzakelijk zijn de functionele groepen te beschermen 25 volgens een bekende methode.

Bescherming kan worden bereikt, afhankelijk van de aard van de te beschermen groep, door een benzyl-, t-butyl-, benzyloxycarbonyl-, t-butoxytrifluoracetylcarbonyl- of trityl-radicaal te condenseren. Andere bekende beschermingsgroepen in 30 de peptidechemie kunnen met succes worden toegepast.

De verbindingen volgens de onderhavige uitvinding kunnen op de gebruikelijke wijze worden bereid uitgaande van overeenkomstige derivaten van vinblastine, door hydrazino-lyse, gevolgd door nitrosering en reactie met de aminozuur-35 ester overeenkomstig de reactievolgorde I, als weergegeven op het formuleblad.

De eerste trap van de werkwijze is de toevoeging van watervrij hydrazine in overmaat aan een oplossing van vin- 8204711 rr_; .......-- ....

- 5 - φ ψ blastinebase in watervrije methanol. De oplossing wordt verwarmd onder een inerte atmosfeer gedurende 12 h tot 12 d, bij een temperatuur van ca. 30-70°C. Met voorkeur wordt de temperatuur rond 60°C gehouden.

5 Het hydrazide van het bisindoolderivaat wordt daarop geïsoleerd door toevoeging van water, extractie met dichloormethaan en concentrering. De verbinding kan later worden gezuiverd door preparatieve chromatografie (neutraal silica).

In het geval van vincristine is het verkregen produkt het 10 O-4-deacetyldeformylvincristinecarbonhydrazide.

Gedurende de tweede trap wordt de hydrazide-functie van het gemodificeerde vinblastine omgezet in een acylazide. Deze omzetting wordt teweeg gebracht op bekende wijze door toevoeging van natriumnitriet aan het in een water/ 15 methanol/zuurmengsel opgeloste hydrazide.

Het te gebruiken zuur kan chloorwaterstofzuur zijn.

De reactietemperatuur wordt tussen 0 en 5°C gehouden. Na extractie met een met water niet mengbaar aprotisch 20 oplosmiddel, bij voorkeur dichloormethaan, wordt de organische fase gedeeltelijk geconcentreerd.

Het eigenlijke acylazide wordt bij voorkeur niet geïsoleerd, maar direct toegevoegd aan de aminozuurester, of evt. een beschermd derivaat ervan, opgelost in dichloormethaan.

25 De te gebruiken hoeveelheid aminozuur is onge veer 1-5 equivalenten van het gemodificeerde vinblastinecar-bonazide.

Het reactiemengsel wordt gehouden tussen -3 en +10°C gedurende 8-72 h en in het algemeen gedurende 15 h. Het 30 volgen van de reactie kan eenvoudig door middel van dunne-laagchromatografie plaatsvinden. Na concentrering kan de verbinding volgens de uitvinding met formule 2 worden omgezet in een sulfaatzout of een ander zout, afgeleid van een mineraal of organisch zuur door kristallisatie uit een methanolische 35 oplossing van het overeenkomstige zuur.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen volgens gebruikelijke technieken, zoals chromatografie of her-kristallisatie, worden gezuiverd.

8204 71 1

V V

- 6 -

Desgewenst kan het zo verkregen 4-0-deacetyl-vinblastinederivaat opnieuw geacyleerd worden, hetzij direct onder oplevering van het vinblastinederivaat 3, waarin R3 is COCH3 (J. Med. Chem. 22, 391, 1979), hetzij door de vooraf-5 gaande vorming van het 3,4-diacetoxyderivaat, gevolgd door selectieve hydrolyse van de 3-acetoxygroep in positie 3. De hydroxygroep in kan op gebruikelijke wijze worden veres-terd met andere geactiveerde zuurderivaten, welke 2-9 C-atomen bevatten. De 0-4-formylderivaten worden verkregen door formy-10 lering (mierezuuranhydride) van de overeenkomstige O-4-deace-tylverbindingen (zie het Belgische octrooischrift 660.843).

De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op de industriële en in het bijzonder farmaceutische toepassingen van de nieuwe bisindoolalkaloiden.

15 De verbindingen volgens de onderhavige uitvin ding vertonen in het bijzonder zeer nuttige antitumoreigen-schappen, die in de menselijke therapie kunnen worden toegepast.

Deze aminozuurderivaten kunnen worden gebruikt 20 voor de behandeling van leukemieën van het L 1210- of P 388-type, gliomen, lymfosarcomen en andere leukemieën of kwaadaardige tumoren. In de geneeskunde kunnen zij worden gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Hodgkin en voor andere vaste tumoren, die te behandelen zijn met vinblastine, vin-25 cristine of vindesine. De onderhavige verbindingen zijn tevens nuttig in de veeartsenijkunde voor de behandeling van tumoren bij dieren.

Andere interessante therapeutische toepassingen kunnen ook worden overwogen voor de nieuwe derivaten van bis-30 indoolalkaloiden. Beschreven is dat vinblastine gebruikt kan worden voor de behandeling van sommige vormen van gewrichtsontsteking (Amerikaans octrooischrift 4.208.411) en dat vincristine gebruikt kan worden voor de behandeling van psoriasis (Amerikaans octrooischrift 3.749.784).

35 Bij therapeutische toepassing worden de verbin dingen volgens de uitvinding, evt. in de vriesdroge vorm, bij voorkeur toegediend langs parenterale weg, opgelost in een farmaceutisch aanvaardbaar oplosmiddel, in de vorm van een 8204 71 1 '*. 0 ' .......................... , - 7 - base of van een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout.

Onder de zuuradditiezouten verdienen de niet-toxische en farmaceutisch aanvaardbare zouten, zoals anorganische zuurzouten als chloorwaterstofzuur-, fosforzuur- en zwavelzuurzouten, of 5 organische zuurzouten als azijnzuur-, propionzuur-, barnsteen-zuur-, wijnsteenzuur-, oxaalzuur-, methaansulfonzuur- en benzeensulfonzuurzouten de voorkeur.

Fysiologisch water en andere zoutoplossingen, die gebufferd zijn, bijv. met een fosfaat, zijn geschikte op-10 losmiddelen. In het algemeen kunnen de verbindingen in de menselijke therapie worden gebruikt op een wijze analoog aan de techniek en met de begrenzingen bij het gebruik van andere alkaloïden van het Vinca-type.

De actieve stof wordt in het algemeen toegediend 15 onder een posologie variërend tussen 0,01 mg tot ca. 5 mg/kg, afhankelijk van het derivaat en het toegepaste therapeutische schema. Totale wekelijkse doses zullen in het algemeen liggen tussen 0,1 en 35 mg/kg.

De samenstellingen overeenkomstig de uitvinding 20 worden bereid in de vorm van eenheidsdoseringen van 2-900 mg.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen alleen worden gebruikt of in combinatie met andere carcino-statische middelen, waaronder bijv. de alkylerende middelen, de anti-metabolieten, zoals methotrexaat, 5-fluoruracil, 6-25 mercaptopurine, 6-thioguanine, de cystosinearabinosiden en antibiotica, zoals actinomycine D, daunorubicine, adriamycine en cis-dianininedichloorplatina. De nieuwe vinblastinederivaten kunnen in het bijzonder in combinatie worden gebruikt.

De volgende specifieke voorbeelden lichten op 30 niet-beperkende wijze de werkwijze voor het verkrijgen van de verbindingen volgens de uitvinding toe.

VOORBEELD I

1. Bereiding van O-4-deacetyl-N-deformylvincris- tinemonohydrazide-A.

35 In een mengsel van 10 ml watervrij hydrazine en 10 ml methanol werd 985 mg vincristinebase opgelost. Het reac-tiemengsel werd gedurende 22 h onder roeren op 60°C gehouden. Daarop werd het reactiemengsel behandeld met water en daarna 8204 71 1 - 8 - met met NaCl verzadigd water. De waterige oplossing werd 8 maal geëxtraheerd met 15 ml dichloormethaan. De samengevoegde organische fasen werden behandeld met 20 ml water, daarna met 25 ml met NaCl verzadigd water en tenslotte gedroogd over 5 Na2S0^. Na filtratie en vacuumconcentratie werd 900 mg 0-4-deacetylvincristinemonohydrazide (zuiverheid boven 90 %) verkregen .

NMR-spectrum (CDCl^, 360 MHz) 9,76 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,53 10 (d, 1H), 7,24 en 7,07 (m, 3H), 6,82 (s, 1H), 6,22 (s, 1), 5,87 (dd, lh), 5,67 (d, 1H), 5,43 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,86 (s, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,52 (s, 3H), 2,82 (s, 2H), 2,51 (s, 1H), 0,93 (2t, 2 x 3H).

Massaspectrum (electronische ionisatiestoot) 15 154, 294, 355, 413, 524, 555, 695, 710, 723, 736, 739, 755 (M + 1) - 768, 769, 782; berekend voor ^42^54^6^7 : 754,942.

2. Bereiding van het zuurazide van gemodificeerd vincristine.

20 Een oplossing van 850 mg vincristinemonohy- drazide-A in 20 ml methanol werd behandeld met 63 ml IN HC1 en 175,5 mg natriumnitriet gedurende 15 min bij 0°C.

De op 0°C gehouden oplossing werd daarop geneutraliseerd met NaHCO^ bij 0°C en daarna 3 maal geëxtraheerd 25 met dichloormethaan. De samengevoegde organische fasen werden gedroogd over Na2SO^, gefiltreerd en onder vacuum geconcentreerd zonder verwarming, totdat een oplossing van ca. 10 ml werd verkregen.

3. Reactie met ethyltryptofanaat.

30 Daarop werd 300 mg ethyltryptofanaat onder roeren bij ca. 4^C toegevoegd en werd de reactie door middel van dlc gevolgd. Na 10 dagen werd het reactieprodukt gezuiverd door chromatografische scheiding (40 g silicagel 60, elutie-oplosmiddel ether/met NH^ verzadigde methanol 96:4 vol/vol).

35 Fracties van 15 ml werden verzameld, die door middel van dlc werden gecontroleerd. Het niet-gereageerde aminozuur werd het eerst opgevangen (fractie 30 tot 40). Het elutiemiddel werd veranderd (ether/met NH^ verzadigde methanol 86:14) en de 8204 71 1 - 9 - gereageerde derivaten werden opgevangen in de vorm van drie fracties: fracties 44-45: 30 mg; fracties 46-53: 257 mg; fracties 54-60: 115 mg).

Het tweede deel was ethyl-N-(O-4-deacetyldeformylvincristin-5 23-oyl)tryptofanaat, Ia, dat volgens dlc homogeen was.

Massaspectrum: 984, 970, 956 (M+ + 1), 913, 912, 899 (DCI isobutaan), berekend voor C55Hg6Ngo9: 955,181. UV-spectrum (CH-jOH): max: 282 (4,20) - 290 (4,18) - 322 (3,96 10 min: 254 - 287 - 305 IR-spectrum: (cm"1) 3400 - 2920 - 1720 - 1660 - 1610 - 1485 - 1450 - 1370 - 1345 - 1330 - 1290 - 1220 - 1165 - 1130 - 1025 - 1005 - 920 - 885 - 830 - 740 15 NMR-spectrum (CDCl^) 360 MHz (ppm) 8,50 (s, 1H), 8,03 (s/2H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 5,89 (dd, 1H), 5,78 (d, 1H), 4,75 (q, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,67 (s, 3H), 1,23 (t, 3H), 0,98 (t, 3H), 0,89 (t, 3H).

20 Ethyl-N-(0-4-deacetylvincristine-23-oyl)tripto- fanaat Ib.

Het gedeformyleerde derivaat Ia (257 mg) werd opnieuw geformyleerd door toepassing van de werkwijze volgens het Belgische octrooischrift 811.110.

25 Het zo verkregen ruwe produkt werd gezuiverd door chromatografische scheiding onder toepassing van een kolom van 20 cm (silicagel, 30 g) en achtereenvolgens 3 elu-tiemiddelen: ether/met NH^ verzadigde methanol 92:8; 88:12; 86:14. De afstromende vloeistof werd in fracties van 15 ml 30 opgevangen. De fracties 44-54 (34,1 mg) bevatten het opnieuw op het N-atoom geformyleerde derivaat Ib.

Massaspectrum (isobutaan DCI): 1011, 997, 983 (M+ + 1), 970, 982, 996, 998, 999, 1012

Berekend voor C56Hg6N6°10 = 9f*3,192 35 UV-spectrum (CH^OH) max: 270 (4,18) - 290 (4,11) plateau 280 (4,12) schouder (4,03) IR-spectrum (KBr)

* ..ijimulilUI

8204711 - 10 - banden bij 3400 - 3040 - 2960 - 2920 - 2880 -2850 - 1735 - 1725 - 1680 - 1670 - 1665 - 1610 - 1490 - 1450 -1225 - 745.

VOORBEELD II

5 Ethyl-N-(0-4-deacetyldeoxy-4'-vinblastin-23-oyl- B)tryptofanaat, lc.

Het O-4-deacetyldeoxyvinblastinehydrazide werd bereid volgens de werkwijze beschreven in het Amerikaanse oc-trooischrift 4.203.898 (overgedragen aan Ely Lilly Co., kolom 10 24, regel 51 en volgende).

Daarna werd 500 mg van het hydrazide in 12 ml methanol gedurende 15 min bij 0°C behandeld met 37 ml IN HC1 en 104 mg NaN02»

De oplossing werd daarna geneutraliseerd met 15 NaHCO^ en zes maal geëxtraheerd met 15 ml dichloormethaan. De organische fasen werden gedroogd over Na2SO^ en geconcentreerd tot een volume van ca. 10 ml werd verkregen.

Het opgeloste azide werd daarop in contact gebracht met ethyltryptofanaat (300 mg) onder roeren bij 4°C.

20 De reactie werd gevolgd door middel van dlc (ether, MeOH). Na 6 d was de reactie voltooid en werd het reactieprodukt gezuiverd door middel van kolomchromatografie over silicagel (18 cm, 30 g), elutie in 15 ml fracties.

De volgende elutiemiddelen werden achtereenvol- 25 gens gebruikt: ether 96 met NH^ verzadigd MeOH 4 fracties 1-49 92 8 fracties 50-57 86 14 fracties 71-90.

De fracties 50-57 bevatten het gewenste reactie-30 produkt lc (108 mg).

Het sulfaat werd bereid door precipitatie met ether (2 % /ethanol).

UV-spectrum van het sulfaat (CH^OH) max: 224 (4,63) - 272 (4,32) 35 min: 247 (4,03) schouders :286 (4,22) - 312 (3,72) IR-spectrum (KBr) van het sulfaat: 3420 - 3060 - 2960 - 2930 - 2880 - 2600 (zwak) - 8204 71 1 F-..................... . ' ,.., . .......

- 11 - 1725 - 1660 - 1615 - 1500 - 1455 - 1430 - 1375 - 1230 - 1105 -1060 - 1015 - 920 - 745 cm”1.

NMR-spectrum (CDClg) 360 MHz van de base in ppm; 9,46 (s, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,67 5 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,30 (d, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,04 (s, 1H), 4,94 (q, 1H) , 4,18, (d, 1H), 4,05 ( q, 2H) , 3,77 (s, 3H)/ m ongeveer s-gecentreerd rond 5,81.

VOORBEELD III

Ethyl-N-(0-4-deacetyl-4'-deoxyvinblastin-23-10 . oyl-B)-isoleucinaat.

Een oplossing van 0-4-deacetyl-4'-deoxyvinblas-tine-B-hydrazide (0,6 g, 0,79mnol- zie Amerikaans octrooi-schrift 4.203.898, kolom 24, regel 51) in een mengsel van 15 ml CH^OH en 45 ml IN HC1 werd tot -7°C gekoeld. Aan de oplos-15 sing werd NaNOj (0,15 g) toegevoegd en het roeren bij -7°C werd gedurende 13 min voortgezet. Na toevoeging van een waterige verzadigde oplossing van NaHCO^ totdat een pH-waarde van 9 werd bereikt, werd de verkregen oplossing vier maal geëxtraheerd met CH2CI2· De samengevoegde organische fasen werden ge-20 wassen met verzadigde waterige NaCl-oplossing en gedroogd over MgSO^.

De oplossing werd geconcentreerd tot een volume van 15 ml en ethylisoleucinaat (1,25 mmol) werd toegevoegd.

Het reactiemengsel werd gedurende 4 d in een koelkast achter-25 gelaten. Het oplosmiddel werd onder verminderde druk afgedampt. Het residu werd gezuiverd door kolomchromatografie (Si02, 60 g) en geëlueerd met ether/CH3OH/NH3 (96:4). Zo werd 0,25 g amorf produkt (opbrengst 35 %) verkregen.

Massaspectrum: (moleculaire ionisatie isobutaan) 30 880 (M+), 894, 836, 849, 832, 445, 391, 355 cm"1

Smeltpunt; 180-190°C.

aD = 104° (c = 0,154) IR (CHC1-) 3470, 2970, 1728, 1655, 1612, 1502 cm"1 35 UV (CH30H) 289, 268, 216 nm NMR (CDC13)ï 7,9 (NH), 654 en 6,06 Hg, Ηχ2, 5,81 (H14-Hl5), 4,60 (CHC02(NH)), 3,76 O^CH^ 3,58 0Η3~Ο, 3,33 en 2,85 (H3A en H3B), 2,73 (N-CH3), 0,69 (H-15').

8204711 - 12 -

Acute toxiciteitsbepaling van LD,.q

De acute toxiciteit van de verbinding van voorbeeld II: ethyl-N-(0-4-deacetyldeoxy-4'-vinblastin-23-oyl-B)-tryptofanaat werd bepaald op vrouwelijke NMRl-muizen. Toene-5 mende doses van het geneesmiddel werden intraveneus geënt via een enkele injectie. Het mortaliteitspercentage werd bepaald als functie van de tijd. De LD^-waarden voor de boven genoemde verbinding (deoxy VTrpE) en een vergelijkingsprodukt: deoxyvinblastine (deoxy VBL) zijn hieronder weergegeven.

10 geneesmiddel ~50

Deoxy-VBL 20

Deoxy-VTrpE (d.w.z. 91,5 verbinding lc)

De verbinding deoxy-VTrpE is dus minder toxisch 15 dan de vergelijkingsverbinding.

Antitumoractiviteit

De chemotherapeutische activiteit van het sul-faatzout van deoxy-VTrpE werd bestudeerd met betrekking tot de lymfoblastische leukemie L 1210 en P 388.

20 1. L 1210 4

Vrouwelijke DBA2“muizen werden geënt met 10 leukemische cellen. Het produkt werd op de dag na de enting toegediend langs intraveneuze weg in een dosis van 50 mg/kg.

De mortaliteit van de dieren werd gevolgd als functie van de 25 tijd. In tabel A zijn de verkregen resultaten met de verbinding volgens voorbeeld II (lc) weergegeven. Bij de beproefde dosis is de verbinding actiever dan vinblastine. Deze superioriteit werd bevestigd ten opzicht van deoxyvinblastine.

2. P 388 30 Vrouwelijke DBA,-muizen werden intraveneus 4 z geënt met 10 leukemische cellen. De produkten werden op de dag na de enting i.v. toegediend. De mortaliteit van de dieren werd waargenomen als functie van de tijd. De resultaten worden weergegeven in Tabel A. Deoxy VTrpE is duidelijk actiever dan 35 de vergelijkingsverbinding en laat een hoger percentage overlevende proefdieren zien op lange termijn.

8204 71 1 I.............

.-13- <u c

0) -d <D

O' G U O _ .

id 0) <0 VO ^ · 4J ^ -H **03 c a; -d εη ο ο ο ΟΟΟΓ2!Γ°2 Si 0)1-114(0 in t"- >£> o 0) 0 u β) ·ΰ ft U a) 0 & ID > 1 Οι σ>

Du O Dj 0 ψ

Q

• c 0) G ® 0)-0 0) ^ 01 fi Ρ O -ft Λ a) a) _ ® +j > -H ooo ooor-r^oo o 00)-001 vo oo ω σι 0) H H ld ® Ο Μ ffl -ο -ft Μ 0) 0 2 ο) > u α ® α ο α ο •g 0) · λ -ο ο c 0) 0) 0Ρ ιΗ «Η νο νο Γ"· Ό Q » * - ft 0) J r^rHO ΙΟ Ν 00 Η Η (Ν (Ν I O1 E4 «noir** in ν in οι οι η η οθ) I π η ηι in ή 0 •Ρ 0) η Ε 0) H3 J» 00 Ν ΙΟ 00 in .2 Q ~ ~ ~ Ο1 Ο irf ο ο ο m ή m ld νο ο ο ο ο α) Ό S η r-j r4 ι-u iHmnmn 3

j D

M J 2 3 . 0) n S -H tn 3 ^ _j e 0) 0 o φ ra O1 -o ÜJVu ooo m m o m m o o O1 P ra

£ m r-j r-J —J iHiHiHi-Hi-4 CO) G

ra -η ra a; a) ra -d --1 ^ jjj -μ 0) h c -o :0) a)

O G V

CO tJI *H

-iHCOOlO TT oo o o o in o 3 m H in ΓΟ Ί1 m ιΛ Ό Ö 51 · ra o 0) o u > -O -d 3 3 ° u 3 ω

0) · -O E

3 > w ra

• O1 G

G 1-1 G (U

μ H 0) Ή O

Cu Dj Ν Μ > -P

P M J P S’ ® E4 0Q6u 3 3 H 0) 3 > >> E ra ρ ή •o I II ι -“· ® 2 O >1 >1 CN k> 3 p 5? KK < £ o p

Djh)h)0iJ00 S ® C

CQ PQ <Ü η φ Φ Q -ö 5) d)

> > Ό > Q a mmSH

o) o) ra p x 3 -η ra •η T3 Dj •h g ω

H 0) E II

O 0) H

μ rH 00 3 0) II <#* O om ω 3 2 _ _

g ih on O -d Q Q

3 1 rl O J

4j Oj > Ë S E4 m o on o

r-4 rH CN

8204711

Claims (11)

1. Vinblastinederivaten met de algemene formule 2 van het formuleblad, waarin R een aminozuurester is, die eventueel beschermd is, gebonden aan de vinblastin-23-oylrest 5 door een amidebinding, waarbij de rechte of vertakte ester-groep 2-9 koolstofatomen bevat en een waterstofatoom of een hydroxygroep is, R2 een waterstofatoom, een formylgroep of een C2~Cg-acylgroep is, Rg een waterstofatoom of een methyl-groep of een formylgroep is, met dien verstande dat verbin-10 dingen waarin tegelijkertijd Rg methyl en R^ een β-groep is zijn uitgesloten; of hun additiezouten met minerale of organische zuren.

2. Vinblastinederivaten met de algemene formule 3 van het formuleblad, waarin R^ een hydroxygroep of een wa-15 terstofatoom is, R2 een waterstofatoom, een formylgroep of een C2-Cg-acylgroep is, Rg, telkens onafhankelijk beschouwd, een waterstofatoom, rechte of vertakte C^Cg-alkyl, hydroxy-C^Cg-alkyl, aminohydroxy-C^Cg-alkyl, carboxy-C^Cg-alkyl, amido-Cj^-Cg-alkyl, guanadino-C^Cg-alkyl, amino-C^-Cg-alkyl, thiol-20 Cj^-Cg-alkyl, cysteinylmethyl, methylthioethyl, benzyl, hydro-xybenzyl, of een groep met formule 4 of 5 van het formuleblad is, of Rg te samen met het koolstof waaraan het gebonden is en het stikstofatoom van de amidogroep, een azool of een hydroxyazoolring vormt; Rg een waterstofatoom of een methyl-25 groep of een formylgroep is en R4 een rechte of vertakte C^ Cg-alkyl, of een benzylgroep is, waarbij de gelijktijdige betekenissen Rx is β-ΟΗ en Rg is -CHg zijn uitgesloten; of hun zuuradditiezouten met minerale of organische zuren.

3. Ethyl- of methyl-N-(O-4-deacetylvincristin-30 23-oyl)-L-tryptofanaat of hun additiezouten met farmaceutisch aanvaardbare zuren.

4. Ethyl- of methyl-N-(0-4-deacetyldeformyl-vincristin-23-oyl)-L-tryptofanaat of hun additiezouten met farmaceutisch aanvaardbare zuren.

5. Ethyl-N-(0-4-deacetyldeoxyvinblastin-23-B- oyl)-L-tryptofanaat of zijn additiezouten met farmaceutisch aanvaardbare zuren.

6. Verbindingen volgens een der conclusies 1-5, 8204 71 1 - 15 - met het kenmerk, dat het additiezout het 1:1 additiezout met zwavelzuur is.

7. Farmaceutische samenstelling voor toepassing in de geneeskunde of veeartsenijkunde voor behandeling van 5 neoplastische ziekten, met het kenmerk, dat het één of meer van de verbindingen volgens een der conclusies 1-6 bevat.

8. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 7, in een toedieningsvorm, waarin de actieve verbinding 10 in een hoeveelheid van ca. 2-900 mg voor een eenheidsdosis aanwezig is.

9. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 7, waarin de actieve verbinding ethyl-N-(0-4-deacetyl-vincristin-23-oyl)-L-tryptofanaat of zijn additiezout met een 15 farmaceutisch aanvaardbaar zuur is.

10. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 7, waarin de actieve verbinding ethyl-N-(0-4-deacetylde-formylvincristin-23-oyl)-L-tryptofanaat of zijn additiezout met een farmaceutisch aanvaardbaar zuur is.

11. Farmaceutische samenstelling volgens conclu sie 7, waarin de actieve verbinding ethyl-N-(0-4-deacetyl-deoxyvinblastin-230-oyl)-L-tryptofanaat of zijn additiezout met een farmaceutisch aanvaardbaar zuur is. 25 8204711