NL8002082A

NL8002082A - Werkwijze voor de thermische destabilisatie van microbisch stremsel.

Info

Publication number: NL8002082A
Application number: NL8002082A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1979-04-09
Filing date: 1980-04-09
Publication date: 1980-10-13
Also published as: FR2453896B1; ES490362A0; IT1148253B; ES8103932A1; FI801029A; FR2453896A1; CH648347A5; DK145779A; CA1135639A; FI66727B; US4591565A; NZ193350A; SE8002643L; BE882690A; GB2045773B; DE3013207A1; IT8048359A0; SE446540B; NL191024C; GB2045773A

Description

H.O. 28.964 1 ♦

V

Werkwijze voor de thermische destabilisatie van microbisch stremsel.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de thermische destabilisatie van microbisch stremsel. Stremsel is een aanduiding voor een melkcoagulerend enzymprodukt.

Bij de bereiding van kaas wordt de melk gecoaguleerd teneinde in 5 staat te zijn de wrongel van de wei te scheiden. Produkten, die rennine bevatten, dat een melkcoagulerend enzym is geïsoleerd uit de kalfsmaag, zijn lang voor dit doel gebruikt. In het verleden kon aan de vraag voor stremsel voldaan worden met kalfsstremsel; evenwel zijn in de laatste jaren verschillende vervangingsmiddelen voor kalfsstremsel ontwikkeld, 10 met inbegrip in het bijzonder van de microbische stremsels uit Mucor miehei en Mucor pusillus. Mucor miehei stremsel verdient de voorkeur bij de kaasbereiding vanwege de lage kosten, de lage niet specifieke proteolytische activiteit en de sterke gelijkenis met rennine betreffende de gevoeligheid voor calciumionen ervan. De uitstekende houdbaar-15 heid van Mucor miehei stremsel is een andere voordelige eigenschap, die ten minste ten dele wordt toegeschreven aan de grote thermische stabiliteit ervan.

Een deel van de gepasteuriseerde wei wordt gebruikt als een toevoegsel aan volle melk, bijvoorbeeld in de vorm van weipoeder, om ver-20 rijkte melk voort te brengen, bijvoorbeeld als babyvoedsel. De gepasteuriseerde wei afkomstig van kaas bereid met Mucor miehei stremsel kan nog een ondergeschikte hoeveelheid stremselactiviteit bevatten, ten gevolge van de grote thermische stabiliteit van Mucor Miehei stremsel.

Eventueel achtergebleven stremselactiviteit in het weipoeder is onge-25 wenst, aangezien proteïnecoagulatie niet langer gewenst wordt. Dit zou kunnen plaatsvinden, wanneer het weipoeder gebruikt wordt voor de bereiding van verrijkte melk als babyvoedsel. De verrijkte melk kan klonteren, voordat het in de maag van de baby komt, bijvoorbeeld in de voe-dingsfles, waardoor een belemmering veroorzaakt wordt om de melk uit de 30 fles te doen stromen.

In Biochem. Biophys. Acta 271, (1972) 93-101 (W.S. Rickert,

Structural and Functional Determinants of Mucor miehei protease, I. Modification of the NH2 terminus and lysine residues by carbamylation) is beschreven dat Mucor miehei protease (de actieve com-35 ponent van Mucor miehei stremsel) met kaliumcyanaat gecarbamyleerd kan worden en dat het gecarbamyleerde produkt een geringe mate van thermische destabilisatie vertoont.

Praktische proeven hebben getoond, dat de thermische destabilisatie van 800 2 0 82 . 2 * het gecarbamyleerde enzym te klein is om het hiervoor vermelde probleem van stremselactiviteit in gepasteuriseerde wei op te lossen. Een andere benadering wordt in de Belgische octrooiaanvrage 6/47048, ingediend 24 december 1979 beschreven, waarin acylering van het enzym voor desta-5 bilisatiedoeleinden wordt gesuggereerd.

Een benadering, die verband houdt met de praktijk van de onderhavige uitvinding, is de behandeling van microbisch stremsel met waterstofperoxide, hetzij als zodanig, hetzij in situ gevormd. Deze benadering is beschreven in de Britse octrooiaanvrage 2.024.828 A, gepubliceerd 16 10 januari 1980.

Het oogmerk van de onderhavige uitvinding is een economisch geschikte werkwijze te verschaffen voor het thermisch destabiliseren van microbisch stremsel tot een zodanige mate, dat de nadelen, die afkomstig zijn van de microbische stremselrestactiviteit in gepasteuriseerde 15 wei in hoofdzaak worden overwonnen.

Volgens de uitvinding werd gevonden, dat het door toepassing van een speciaal gekozen groep peroxyverbindingen, die een chemisch karakter vertoont, dat verschilt van dat van de peroxyverbindingen' voorgesteld in de hiervoor vermelde Britse octrooiaanvrage, mogelijk is de 20 thermische destabilisatie uit te voeren met een molaire hoeveelheid peroxyverbinding in verhouding tot de totale hoeveelheid aanwezig proteïne, die aanzienlijk lager is dan de overeenkomstige hoeveelheid van het waterstofperoxide, dat in de hiervoor geciteerde Britse octrooiaanvrage wordt gebruikt.

25 Dientengevolge heeft het eerste aspect van de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het verminderen van de thermische stabiliteit van microbisch stremsel door chemische modificatie ervan, bestaande uit de behandeling van het microbische stremsel in een water bevattend milieu met een peroxyzuur, zoals anorganische peroxyzuren en alifatische per-30 oxyzuren met een klein aantal koolstofatomen, of zouten ervan.

In de beschrijving en conclusies heeft de uitdrukking alifatisch peroxyzuur met een klein aantal koolstofatomen betrekking op een per-oxyzuurderivaat van een alifatisch carbonzuur met een rechte of vertakte alkylgroep van ten hoogste 6 en bij voorkeur ten hoogste 4 koolstof-35 atomen.

Voorbeelden van alifatische peroxyzuren met een klein aantal koolstofatomen zijn peroxymierezuur, peroxyazijnzuur, peroxypropionzuur en peroxyboterzuur.

Voorbeelden van zouten van anorganische peroxyzuren zijn kaliumper-40 oxysulfaat en natriumperoxyfosfaat.

800 2 0 82

3 I

r

Terwijl de behandeling in de hiervoor geciteerde Britse octrooiaanvrage wordt uitgevoerd met H2O2, hetzij als zodanig hetzij gevormd in situ, wordt aangenomen, dat het mechanisme van de reactie uitgevoerd volgens de onderhavige uitvinding niet H2O2 insluit. Eveneens wordt 5 aangenomen, dat dit verschil de reden is, waarom het volgens de uitvinding mogelijk is een bevredigende thermisch destabilisatie te verkrijgen door toepassing van een molaire hoeveelheid van de peroxyverbinding in verhouding tot de totale hoeveelheid aanwezig proteïne, wat slechts een fractie is, dat wil zeggen van de ordegrootte van ongeveer een 10 tiende van de overeenkomstige molaire hoeveelheid H2O2, die wordt toegepast in de hiervoor geciteerde Britse octrooiaanvrage.

De drastische vermindering van de hoeveelheid toegepast reagens brengt ten minste twee voordelen met zich mee. In de eerste plaats wordt de anderszins verplichte inactivering van overmaat reagens onder-15 vangen. Ten tweede dient ten gevolge van het feit, dat het microbische stremsel gebruikt wordt in verband met artikelen voor menselijk consumptie, verontreiniging daarvan door vreemde reagentia op het laagst mogelijke niveau te worden gehouden.

Gebleken is, dat het microbische stremsel gemodificeerd volgens de 20 uitvinding aanzienlijk gedestabiliseerd, is en dat de mate van destabilisatie voldoende is om aan de eisen voor weigebruik, zonder sterk nadelig effect op de houdbaarheid van het stremselpreparaat, te voldoen. Verrassenderwijze werd gevonden, dat het volgens de uitvinding mogelijk is, een destabilisatieniveau (zoals hierna gedefinieerd) van ten minste 25 8°C, bij voorkeur 10 - 13°C te verkrijgen, wat in het voorkeurstraject de thermische stabiliteit van het gemodificeerde enzym doet overeenkomen met die van kalfsstremsel, waarbij de gunstige eigenschappen van· het kalfsstremsel gecombineerd worden met de gunstige eigenschappen van het microbische stremsel.

30 De stremselactiviteit wordt gemeten volgens de Britse norm 3624: 1963 (methode voor de bepaling van het melkcoagulerend vermogen van stremsel).

Aangezien de onderhavige uitvinding betrekking heeft op een geregelde thermische destabilisatie van microbisch stremsel, wordt 35 hierna enige uitwerking gegeven over technieken voor het meten van de thermische stabiliteit en het kwantificeren van de vermindering in thermische stabiliteit, dat wil zeggen de destabilisatie, welke destabilisatie wordt uitgedrukt in °C.

Onder ideale omstandigheden kan een enzym gedenatureerd worden bij 80 0 2 0 82 4 een geschikt (hoog) temperatuurniveau op een zodanige wijze, dat de Testactiviteit van het enzym afneemt als functie van de tijd langs een exponentiële vervalkromme, dat wil zeggen met een goed gedefinieerde halfwaardetijd, welke halfwaardetijd een functie is van de temperatuur 5 (°C). De halfwaardetijd 1\/2 kan berekend worden volgens de formule (t2"tl) ln2

Tl/2 - _ 10 lnAi - lnA2 waarin de enzymactiviteit is gemeten na verwarming tot een gespecificeerde temperatuur gedurende de tijd t]_, terwijl A2 de enzym-15 activiteit is gemeten na verwarming tot dezelfde gespecificeerde temperatuur gedurende de tijd t2· De halfwaardetijd zal korter zijn naarmate de temperatuur hoger is, waarbij de overige omstandigheden gelijk zijn. Voor vele enzymen zal een verandering in de pH van de enzymoplos-sing en de ionensterkte, en de aanwezigheid van bepaalde zouten de 20 halfwaardetijd aanzienlijk beïnvloeden. Voorts kan chemische derivaat-vorming van het enzym de halfwaardetijd aanzienlijk'veranderen. Wanneer een chemische afleiding van een bijzonder enzym thermische destabilisatie van het enzym veroorzaakt, wordt de destabilisatiegraad als N°C vermeld, wanneer het oorspronkelijke (niet afgeleide) enzym en het af-25 geleide enzym dezelfde halfwaardetijd hebben bij N°C respectievelijk (N-n)°C.

Opgemerkt wordt echter, dat de destabilisatiewaarden tot een bepaalde mate benaderd zijn ten gevolge van het benaderde karakter van de waarde van de halfwaardetijd. Alle destabilisatiewaarden in de be-30 schrijving zijn gemeten bij een pH van 6,0, aangezien de resultaten van de meting van de destabilisatie pH afhankelijk zijn.

Gewoonlijk gaat de behandeling volgens de uitvinding vergezeld van een activiteitsverlies. Gebleken is, dat op economische gronden de de-stabilisatiereactie niet moet worden uitgevoerd beneden de trap, die 35 overeenkomt met een begeleidend activiteitsverlies van ongeveer 50%, bij voorkeur ongeveer 30%, meer bij voorkeur minder dan 10%.

In een normaal geval schijnt de destabilisatie van ongeveer 10 of 11°C met een activiteitsverlies beperkt tot minder dan 10% een aanvaardbaar compromis te zijn tussen de hiervoor vermelde conflicterende 40 factoren.

800 2 0 82 5 * * ·

Het peroxyzuur dient in een zodanige concentratie te worden gebruikt, dat de gewenste destabilisatiegraad verkregen wordt in een redelijke tijdperiode, die van enkele minuten tot 48 uren of zelfs een week kan zijn. De verhouding peroxyzuur tot totaal proteïne in het en-5 zymprodukt is belangrijk voor de resultaten. Wanneer de concentratie * van het peroxyzuur te klein is, zal de destabilisatie te gering zijn en wanneer de concentratie van het peroxyzuur te groot is, zal het activi-teitsverlies te groot zijn. De optimale concentraties komen gewoonlijk overeen met een molverhouding tussen het middel en de totale hoeveel-10 heid proteïne in het enzympreparaat van ongeveer 0,1 tot 25 mmol peroxyzuur per gram totaal proteïne. Wanneer het microbische stremselpre-paraat gezuiverd is tot een groot eenheidsactiviteitsniveau, kan de hoeveelheid peroxyzuur verminderd worden tot 0,05 mmol peroxyzuur per gram totaal proteïne.

15 De reactietemperatuur is niet kritisch wanneer de reactietemperatu- ren op niveaus gehouden worden, bijvoorbeeld beneden ongeveer 30°C, waarbij de stabiliteit van het enzym bevredigend is. Echter dient de stabiliteit van het enzym te worden vergroot door aanwezigheid van bekende proteïnestabilisatoren, bijvoorbeeld -NaCl in een hoeveelheid van 20 5 tot 20% van het enzympreparaat, of sorbitol in de gebruikelijke en- zymstabiliserende hoeveelheden. Het voorkeurstemperatuurtrajeet bedraagt 0 - 30°C.

Het destabilisatieniveau van ten minste 8°C, bij voorkeur 10°C tot 13°C, en het begeleidende activiteitsverlies van niet meer dan 30%, bij 25 voorkeur minder dan 10%, worden beschouwd als grenzen bij de praktijk van de onderhavige uitvinding.

Een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, omvat behandeling van het microbische stremsel met peroxyazijnzuur of peroxypropionzuur.

30 Een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, omvat behandeling van het microbische stremsel met monopersulfonzuur.

Bij een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, is het microbische stremsel Mucor ' 35 miehei stremsel.

Bij een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding die de voorkeur verdient, wordt de behandeling uitgevoerd met een molaire verhouding in het reactiemengsel tussen het peroxyzuur en de totale hoeveelheid proteïne in het enzympreparaat tussen 0,1 en 25 mmol 800 2 0 82 6 peroxyzuur per gram proteïne, bij voorkeur tussen 0,5 en 5 mmol peroxy-zuur per gram proteïne.

Bij een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, heeft het water bevattende milieu een 5 pH waarde tussen 2 en 9.

Bij een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, heeft het water bevattende milieu een temperatuur tussen 0 en 30°C.

Het tweede aspect van de uitvinding omvat het gedestabiliseerde 10 microbische stremsel, bereid door middel van de werkwijze volgens de uitvinding.

Het derde aspect van de uitvinding omvat een werkwijze voor de bereiding van kaas, waarbij het gemodificeerde stremsel volgens de uitvinding gebruikt wordt voor de coagulatie van melk.

15 In de praktijk is gebleken, dat de toepassing van thermisch gedestabiliseerd stremsel de voorkeur verdient voor de bereiding van kazen met grote houdbaarheid.

Het destabilisatieproces kan worden uitgevoerd en wordt bij voorkeur uitgevoerd als de eindtrap bij de bereiding van het microbische 20 stremsel. In feite kan (in de handel verkrijgbaar) zuiver microbisch stremsel of stremselconcentraat toegepast worden bij de uitvoering van de onderhavige uitvinding. Derhalve wordt bijvoorbeeld de pH van een gestabiliseerde microbische stremseloplossing, die anderszins gereed is voor de gebruikelijke laatste bewerkingen,- voorafgaande aan de afgifte, 25 ingesteld op het voorafbepaalde behandelingsniveau (bijvoorbeeld pH 5) en daarna onder roeren bij omgevingstemperatuur gemengd met een oplossing van het peroxyzuur, waarbij de hoeveelheid peroxyzuur ligt binnen het hiervoor vermelde polaire verhoudingstraject van totaal proteïne in de microbische stremseloplossing. Het mengsel wordt vervolgens bewaard 30 om te reageren tot het gewenste destabilisatieniveau bereikt is, bijvoorbeeld gedurende 4 uren. Het thermisch gedestabiliseerde enzympro-dukt kan onderworpen worden aan de gebruikelijke afwerkingsbehande-lingen, bijvoorbeeld filtratie, instelling van de pH en eenheidenzymac-tiviteit op de gestandaardiseerde niveaus, enzovoort.

35 De uitvinding zal nu meer gedetailleerd beschreven worden onder verwijzing naar de volgende voorbeelden.

Het uitgangsprodukt in de volgende voorbeelden is een stremselconcentraat bereid zoals aangegeven in "2. Pilot plant experiment" in het Britse octrooischrift 1.108.287, alleen werd de cultuurvloeistof gecon 800 2 0 82 7 ' : centreerd tot een activiteit, die nagenoeg overeenkomt met een 1-pro-cents oplossing van het zuivere enzym (Comptes Rendus des Traveaux du Laboratoria Carlsberg, 371 (1970) No. 14, 301-325). Kortheidshalve zal dit concentraat hierna worden aangeduid als "RENNILASE 46”. De activi-5 text van het concentraat is ongeveer 50.000 stremseleenheden per ml (of 50.000 S eenheden/ml).

Voorbeeld I

5 ml Rennilase 46 worden verdund tot 15 ml tijdens toevoeging van NaCl tot een concentratie van 12% in het mengsel. Vervolgens worden 50 10 50 /ul 37-procents peroxyazijnzuur (dat 3,8% H2O2 bevat) toege voegd, waarbij tegelijkertijd de pH met 4 N zoutzuur op 2,5 wordt ingesteld. Na een reactietijd van 1 uur bij 25°G wordt het mengsel geneutraliseerd tot een pH van 7,0 met 4 N natriumhydroxide. Het activi-teitsrendement is ongeveer 20% en de halfwaardetijd bij 55°C onder de 15 hiervoor vermelde omstandigheden is kleiner dan 5 minuten, overeenkomend met een destabilisatie van ten minste 13°G.

Voorbeeld II

150 ml Rennilase 46 werden verdund met 150 ml water en verdeeld in drie porties van 100 ml, waarvan de pH waarden werden ingesteld op~res-20 pectievelijk 3, 5 en 7. Bij omgevingstemperatuur en onder krachtig roeren werden 300 ml van een 25-procents peroxyazijnzuur (1 mmol) uit de handel aan elk van de drie porties toegevoegd en de pH werd tegelijkertijd opnieuw ingesteld door toevoeging van 4 N natriumhydroxide. De monsters werden één nacht bij 4°C opgeslagen, voordat analyse plaats 25 vond. Het experiment werd herhaald, maar deze keer werd de dosering van peroxyazijnzuur verminderd tot 0,5 mol door de toevoeging van 750 /ul van een 5-procents peroxyazijnzuuroplossing.

De resultaten blijken uit de volgende tabel.

800 2 0 82 f 8 pH dosering activiteits- halfwaardetijd destabili- mmol rendement bij 55°C, satie

peroxyazijn- % pH 6,0, °C

5 zuur minuten 3 0,5 105 4,9 13 5 0,5 106 5,6 13 7 0,5 84 7,4 12 10 3 1, 86 3,0 14 5 1 103 3,0 14 7 1 84 3,7 14

15 Voorbeeld III

150 ml Rennllase 46 werden verdund met 150 ml water en verdeeld in drie porties van 100 ml, waarvan de pH waarden respectievelijk op 3, 5 en 7 werden ingesteld. Bij omgevingstemperatuur en onder roeren werd 1 ml 1 molair kaliummonopersulfaat aan elk van de drie porties toegevoegd 20 en de pH werd opnieuw ingesteld. De monsters werden één nacht bij 4°C bewaard, voordat geanalyseerd werd.

De proef werd herhaald, maar deze keer werden 2 ml van de 1 molaire kaliummonopersulfaatoplossing aan elke portie toegevoegd.

25 pH dosering activiteits- halfwaardetijd destabili- mmol rendement bij 55°C, satie

peroxyazijn- % pH 6,0, °C

zuur minuten 3 1 105 53 8 30 5 1 112 58 8 7 1 103 41 8 3 2 102 32 9 5 2 106 30 9 7 2 97 16 10

35 Voorbeeld IV

Zes porties van 50 ml Rennilase 46 werden verdund met 50 ml water en de pH waarde werd ingesteld op 5. Respectievelijk 75, 150, 300, 450, 600 en 750 /ul van een 5-procents perazijnzuur (met 0,6% H2O2) 80 0 2 0 82 9 ‘ * werden aan de hiervoor vermelde zes porties onder krachtig roeren toegevoegd en tegelijkertijd werd de pH waarde opnieuw op 5 ingesteld met 4 N natriumhydroxide. Na 1 uur op omgevingstemperatuur gehouden te zijn werden monsters van 1 ml voor analysedoeleinden onttrokken.

5 De resultaten blijken uit de volgende tabel.

dosering rendement halfwaardetijd destabilisatie

perazijnzuur % bij 55°C, °C

mmol pH 6,0 10 minuten 0,05 104 1045 1 0,1 106 313 4 0,2 105 45 8 •15 0,3 106 14 11 0,4 102 8 12 0,5 102 6 13

20 Voorbeeld V

Drie porties van 50 ml Rennilase 46 werden met 50 ml water verdund en de pH waarde werd op 5 ingesteld. Aan éin portie werd 0,55 ml en aan de tweede portie werd 1,0 ml van een ongeveer 0,46 molair permierezuur (0,1 molaire H2O2) onder krachtig roeren toegevoegd en tegelijker-25 tijd werd de pH op 5 ingesteld met 4 N natriumhydroxide. Aan de derde portie werden 2,2 ml van een ongeveer 0,45 molair permierezuur toegevoegd, dat geneutraliseerd was met koud 4 N natriumhydroxide.

Na 2,5 uren op omgevingstemperatuur gehouden te zijn werden monsters van 1 ml onttrokken voor analysedoeleinden.

30 De resultaten zijn in de volgende tabel opgenomen.

800 2 0 82 10 * dosering opbrengst halfwaardetijd destabilisatie

permierezuur % bij 55°C, °C

mmol pH 6,0 5 minuten 0,25 (zuur) 86 8,8 12 0,.5 (zuur) 70 3,4 14 1,0 (neutraal) 97 6 13 10

Voorbeeld VI

Twee porties van 50 ml Rennilase 46 werden met 50 ml water verdund en de pH werd op 5 ingesteld. Aan ién portie werden 5 ml van een ongeveer 0,2 molair perpropionzuur (0,1 molair H2O2) onder gelijkt!j-15 dige pH instelling met 4 N natriumhydroxide toegevoegd. Aan de tweede portie werden 5 ml van het ongeveer 0,2 molair perpropionzuur toegevoegd, dat vooraf geneutraliseerd was.

De proef werd herhaald, alleen werden porties van 5 ml van een ongeveer 0,2 molair perboterzuur (0,1 molair H2O2) als reagens ge-20 bruikt.

Na 2 uren omgevingstemperatuur gehouden te zijn werden monsters van 1 ml ontrokken voor analysedoeleinden.

De resultaten blijken uit de volgende tabel.

25 dosering opbrengst bij destabilisatie

mmol % 55°C, pH 6,0 eC

reagens ongeveer minuten perpropionzuur 1 88 <3 >14 30 perpropionzuur 1 106 <3 >14 neutraal perboterzuur 1 82 C3 >14 perboterzuur 1 102 3 >14 neutraal 800 2 0 82

Claims

11 % A

1. Werkwijze voor het verminderen van de thermische stabiliteit van microbisch stremsel door chemische modificatie ervan, met het kenmerk, dat men het microbische stremsel in een water bevattende 5 milieu behandelt met een peroxyzuur, zoals één of meer anorganische peroxyzuren en/of alifatische peroxyzuren met een klein aantal koolstofatomen of zouten ervan.

2. Werkwijze volgens conclusie l,met het kenmerk, dat men als peroxyzuur peroxyazijnzuur of peroxypropionzuur toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie l,met het kenme r k, dat men als peroxyzuur monopersulfonzuur toepast.

4. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 3, m e t het kenmerk, dat men als microbisch stremsel Mucor miehei toepast.

5. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 4,met het 15 kenmerk, dat men de behandeling uitvoert met een molaire verhouding in het reactiemengsel tussen het peroxyzuur en de totale hoeveelheid proteïne in het enzympreparaat tussen 0,1 en 25 mmol peroxyzuur per gram proteïne, bij voorkeur tussen 0,5 en 5 mmol peroxyzuur per gram proteïne.

6. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 5, m e t het kenmerk, dat men een water bevattend milieu met een pH tussen 2 en 9 toepast.

7. Werkwijze volgens conclusie 1 tot 6, m e t het kenmerk, dat men een water bevattend milieu met een temperatuur 25 tussen 0 en 30°C toepast.

8. Gedestabiliseerd microbisch stremsel verkregen met toepassing-van één of meer van de werkwijzen van één of meer van de voorafgaande conclusies.

9. Werkwijze voor het bereiden van kaas, m e t h e t 30 kenmerk, dat men het stremsel volgens conclusie 8 gebruikt voor de coagulatie van melk. asaea 800 2 0 BZ