NL7903379A - Bacteriecelaggregaat met verhoogde hardheid. - Google Patents

Description

« ï + 1 ~“ — Λ * vo 7585

Miles Laboratories, Ine.

Elkhart, Indiana Verenigde Staten van .Amerika

Bacteriecelaggregaat met verhoogde hardheid. .

Glucoseiscmerase is een enzym, dat kan worden gebruikt voor het katalyseren van de omzetting van glucose in fructose. Het is bekend, dat glucoseiscmerase kan worden verkregen door een fermentatie van bepaalde organismen, zoals Strentcmyces flavovirens, Streptcmyces 5 echinatur, Strentcmyces achromogenus, Stre-ptomyces albus, Strento- myces olivaceus, Bacillus coagulans è.d. , in passende voedingsbodems. Glucoseiscmerase wordt gevoimd binnen de bacteriecellen, die tijdens dit productieproces groeien. De cellen kunnen worden af gefiltreerd uit de omringende vloeistof en direct als een glucoseïsomerasebron 10 worden gebruikt. Een direct gebruik van dit soort enzym bevattende bacteriecellen stuit echter op een aantal moeilijkheden. De enzym-activiteit gaat tijdens het gebruik van de cellen teloor, waardoor de toepassingsduur van de cellen betrekkelijk kort is. Deze moeilijkheid werd gedeeltelijk overwonnen door een behandeling van de 15 bacteriecellen met glutaaraldehyde als beschreven in Amerikaans oc-trooischrift .3.TT9.869. Verdere technieken voor het vastleggen van de enzymactiviteit in de bacteriecellen, alsmede de vorming van aggregaten van dit soort enzymhoudende bacteriecellen is b.v. be- «·» schreven in Amerikaans octrooischrift 3.821.086 en zijn reissue 20 29.130 en 29.136 alsmede in het Zuidafrikaanse octrooischrift 73/5917· De genoemde Amerikaanse octrooischriften betreffen het gebruik van bepaalde anionogene en kationogene polyelectrolyt-uit-vlokkingsmiddelen. Eet Zuidafrikaanse octrooischrift betreft diverse ccmbinaties van bindmiddelen, versterkingsmiddelen en verknopings-25 middelen. Hoewel de genoemde technieken bacteriecelaggregaten opleveren, die gewoonlijk hun enzymactiviteit tijdens hun gebruik goed handhaven, bestond er behoefte aan een verhoging van de hardheid van deze aggregaten, zodat ze ook technisch zouden kunnen worden gebruikt in reactorbedden met grotere diepten. Amerikaans octrooi- 7903379 2 F * schrif '3'..935·θ69 geeft de toevoeging weer van bepaalde metaalverbindingen in combinatie met polyelectrolyt-uitvlokkingsmiddelen ter verbetering van de hardheid. Deze techniek heeft evenwel beperkte toepasbaarheid.

5 Een verdere ontwikkeling ter verbetering van de hardheid van bactefie celaggregaten is beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage 89Ο.5ΟΟ van 27 maart 1978» waarin een massa bacteriecellen met de gewenste enzymactiviteit wordt behandeld met een verkncpingsprodukt van (l) glutaaraldehyde, cyanuurhalogenide of combinaties daarvan, en 10 (2) een in water oplosbaar kationogeen polymeer verkregen door een polymerisatie van een epihalohydrine met een alkyleenpolyamine, gevolgd door het winnen van het verkregen, aggregaat. De verkregen, aggregaten kunnen worden geëxtrudeerd of anderszins tot gevozmde aggregaten worden verwerkt met een verbeterde hardheid. Wanneer evenwel dit 15 soort gevormde proönkten in een kolom worden gebruikt voor een enzymatische reactie, is een nog verder verbeterde hardheid, voor het verminderen van verliezen gewenst.

Bij de vervaardiging van gevormde bacteriecelaggregaten ont- staat een bepaalde hoeveelheid fijnverdeeld materiaal met deeltjes-20 grootten,, die te klein zijn voor technisch, gebruik. Diverse technieken voor het toepasbaar maken van dit poeder zijn voor'gesteld. Amerikaans octrooischrift'1+.060.1+56 geeft de recirculatie van dit soort poeders naar een uitvlokêank weer, waar een uitvlokmiddel wordt gebruikt voor het vormen van bacteriecelaggregaten. Hoewel dit geschrift een 25 gebruik van gerecireuleerd fijn materiaal naar een flocculerings- * inrichting weergeeft, kan men hierin geen aanwijzing vinden, dat deze behandeling de hardheid beïnvloedt. Gebruik van gerecirculeerde enzymdragers is weergegeven in de Amerikaanse octrooischriften !+.002.576, U.078.970 en I+.O8T.33O,. maar nergens wordt de suggestie 30 gedaan, dat dit soort gerecirculeerde materialen behulpzaam kunnen zijn bij het verbeteren van de hardheid van gevormde produkten.

' Volgens de uitvinding werd nu.een werkwijze gevonden voor het verbeteren van de hardheid van een gevormd bacteriecelaggregaat, waarbij tevoren verkregenfgedroogd,fijnverdeeld bacteriecelaggregaat 35 aan bacteriecelaggregaat wordt toegevoegd na zijn vorming maar voor 7903379 t -s 3 zijn vormgeving. De uitvinding is speciaal bruikbaar wanneer het verkregen aggregaat wordt gedroogd en vervolgens voor gebruik wordt ger ehydr ateer d.

De onderhavige ’werkwijze kan worden gebruikt met diverse enzym-5 bevattende bacteriecellen. Als voorbeeld zijn bacteriecellen met glucoselscmeraseactiviteit gekozen.

De bacteriecellen met glucoseiscmeraseactiviteit die volgens . de uitvinding kunnen worden behandeld, kunnen op bekende wijzen worden geproduceerd. De voorkeursenzymhoudende cellen worden verkregen door 10 het kweken onder submerse aerobe voorwaarden van Strentomyces olivaceus HEEL 3583 of mutanten daarvan en wel in een medium met passende voedingsstoffen. Dit is beschreven in Amerikaans octrooi-schrift 3.625.828. De resulterende bacteriecellen worden uit de voedingsbodem afgefiltreerd of afgecentrifugeerd.

15 De als uitgangsmaterialen gebruikte bacteriecelaggregaten kunnen eveneens op bekende wijzen worden verkregen. Dit soort aggregaten worden bij voorkeur verkregen door een behandeling van de genoemde bacteriecellen met glutaaralcühyde overeenkomstig Amerikaans octrooischrift 3.7T9*869. De voorkeursaggregaten worden verkregen door een behandeling 20 van deze bacteriecellen met een verknopingsprodukt van (l) glutaar- aldehyde, cyanuurhalogenide of combinaties daarvan, alsmede (2) een in water oplosbaar kation-polymeer verkregen door een polymerisatie van een epihalohydrine met een alkyleenpolyamine. Deze behandeling is beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage 890.500.

25 De bij dit aggregatieprccede gebruikte stoffen zijn in de handel.

Glutaaraldehyde en cyanuurhalogeniden, zoals cyanuurtrichloride, cyanuurtribrcmide of cyanuurtrijodide zijn in de handel of kunnen worden bereid volgens bekende technieken. Het specifieke epihalo-hydrine-polyaminepolymeer is in de handel onder de naam EETZ ll80 30 van Betz Laboratories Ine., te Trevose. BEDS 1180 heeft een molecuul- gewicht van minder dan 1.000.000, bevat ca. 0,288 millimol amino-groepen per gram oplos sing (ninhydrinepr oef) en wordt verkocht als een oplossing met 30 gew.$ droge stof, berekend op het gewicht van de totale oplossing. Deze verbinding is weergegeven in Amerikaans oc-35 trooischrift 3.915-90¼. De verbinding is daarin beschreven als een 790337? r ψ in water oplosbaar kationogeen polymeer verkregen door een polymerisatie van een epihalohydrine met een alkyleenpolyamine met de formule· R^gNEIHg, waarbij R een alkyleengroep met 2-6 koolstof at amen, en R.j en R^ alkyl met 1-6 koolstofatamen voorstellen, waarbij de mol-5 verhouding van epihalohydrine tot polyamine tussen 0,6. : 1 en 2,T : 1 is gelegen, waarbij gepolymeriseerd wordt door een onzetting van 50-90 % van. de te polymeriseren hoeveelheid epihalohydrine met het alkyleenpolyamine,. deze reactie wordt, voortgezét tot het reactiemedium een nagenoeg uniforme viscositeit heeft verkregen; en. vervolgens de 10 resterende hoeveelheid. epihalohydrine portiesgewij ze met het verkregen produkt wordt omgezet in een kationogeen. polymeer, waarbij de temperatuur van de polymerisatie tussen 60 en 12.0°C is gelegen. Dit ' materiaal wordt hieronder aangeduid als "polyamine-polymeer".

Het voor de vorming van het bacteriecelaggregaat gebruikte ver-15 knopingsreactieprodukt kan een van drie magelijke samenstellingen bezitten. Het polyaminepolymeer kan met glutaaraldehyde of cyanuur-halogeni.de danwel· met zowel glutaaraldehyde als cyanuurhalogenide worden omgezet.

Het glutaaraldehyde en/of cyanuurhalogenide, dat gezamelijk wordt 20 aangeduid als. component 1 wordt angezet met het polyaminepolymeer, dat wordt aangeduid als component 2 en wel bij een pH van ca. 6-10, een temperatuur tussen Q en 30°C en gedurende \ tot 2\ uur. Het totale verknopingsreactieprodukt bevat 12 - TT gew.$ component 1 en 23 - 88 gew.$ aan component 2, berekend op het totale gewicht van de beide 25 ingrediënten. Het glutaaraldehydegehalte van het reactieprcdukt ligt tussen 0 en TT gew.$ en het cyanuurhalogenidegehalte tussen 0 en 22 gew.$, berekend, op het totale gewicht van de beide ingrediënten.

De reactie tussen glutaaraldehyde en polyaminepolymeer wordt bij voorkeur uitgevoerd bij pH 8-9 en 18-25°C, en wel gedurende 0,5 uur.

30 Het glutaaraldehyde moet in een molverhouding van tenminste 1 mol per mol aminogroep in het polyaminepolymeer aanwezig zijn om ongewenste verknoping van het polyaminepolymeer met glutaaraldehyde te voorkomen.

De reactie tussen cyanuurhalogenide alleen en het polyaminepolymeer wordt bij voorkeur uitgevoerd bij pH 8-9 en 0-10°C, gedurende 35 1 tot 2 uren. Het cyanuurhalogenide moet in een molverhouding van ten- 7903379 t r . 5 minste 1 mol per mol aminogroep in het polyaminepolymeer aanwezig zijn cm ongewenste verknoping van het polyaminepolymeer met cyanuur-halogenide te voorkanen. Cyanuurhalogeniden, zoals cyanuurtrichloride, hehten drie reactieve halogeengroepen» Een van deze groepen zal hij 5 0°C of hoger reageren. Fa omzetting van de eerste groep, zal de twee de reageren "bij 30-50°C en het laatste reageren bij 90-100°C. Het is gewenst cm aanvankelijk alleen de eerste groep van het· cyanuurhalo-genide met het polyaminepolymeer cm te zetten.' Wanneer het verkregen verknopingsprodukt vervolgens wordt omgezet met de bacteriecellen 10 en tijdens drogen op hogere temperaturen wordt verhit, zullen de overige reactieve groepen aan het cyanuurhalogenide vervolgens met het polyaminepolymeer reageren, waardoor verdere verknoping van hét bacteriecelaggregaat wordt bereikt.

De reactie tussen het polyaminepolymeer en de ccmbinatie van 15 glutaaraldehyde en cyanuurhalogenide wordt'in’'trappen uitgevoerd.

Eerst wordt het cyanuurhalogenide met het polyaminepolymeer gedurende 1-2 uren bij pH 8-9 en 0-10°C omgezet. Bij voorkeur worden hierbij de reactanten in een molverhouding van 1 mol cyanuurhalogenide op 2 mol aminogroepen aan het polyaminepolymeer toegepast. Een overmaat 20 hoeveelheid glutaaraldehyde wordt vervolgens toegevoegd en de reactie voortgezet bij dezelfde pïï en temperatuurvoorwaarden en wel gedurende ca. 0,5 uur.

• Het bij gle productie van het voorkeursbacteriecelaggregaat gebruikte verknopingsproduct is niet een kationogeen polyelectrolyt, 25 aangezien de aminogroepen aan het polyaminepolymeer dat aanvankelijk kationogene eigenschappen heeft, zijn omgezet met het glutaaraldehyde en/of cyanuurhalogenide en dus niet langer vrij beschikbaar zijn.

Bacteriecelaggregaten worden verkregen door een massa bacteriecellen met het bovenbeschreven verknopingsprodukt om te zetten 30 en wel gedurende 0,5 tot 1,5 uur bij pH 8-9 en 0-30°C. Het gebruikte verknopingsprodukt wordt in zodanige hoeveelheden en concentraties toegepast, dat de bacteriecellen in contact kamen met ca. U,5 tot 60 gew. % van de actieve verknopende stoffen, berekend cp het droge gewicht van de cellen.

35 Fa afloop van de genoemde reactie wordt de verkregen bacterie- 7903379 * f 6 celaggregaatsuspensie meestal aangebracht in een voorraadtank -voor de filtreerapparatuur, b.v. een roterend vacuumfilter. De suspensie wordt vervolgens gefiltreerd tot een filterkoek, van vochtige bacterie-celaggregaten. Dit vochtige bacteriecelaggregaat wordt vervolgens ge-5 extrudeerd of anderszins in de gewenste vorm gebracht en vervolgens enige uren bij 60°C gedroogd. Het aldus verkregen gedroogde aggregaat wordt gemalen en gezeefd tot de aggregaatdeeltjes een zodanige grootte hebben, dat ze kunnen passeren door een zeef van ruim 1 mm en blijven liggen op een zeef van ca. 0,6 mm. Het te grove materiaal wordt op-10 nieuw gemalen en het product met een te kleine diameter en een vochtgehalte van ca. 12% wordt volgens de uitvinding, gerecirculeerd.

Het tevoren geproduceerde, gedroogde fijnverdeelde bacterie— celaggregaat of het fijne poeder, dat door een zeef met gaatjes van 0,6 mm is gegaan, wordt aan het bacteriecelaggregaat toegevoegd na 15 zijn vorming maar voor zijn vormgeving, b.v. door extrusie. Dit wordt bij voorkeur· gedaan op tenminste twee verschillende manieren. Volgens een methode worden de fijne materialen met de bacteriecelaggregaat-suspensie in de voorraadstank voor het filter gemengd; volgens de andere methode worden de fijne materialen met het vochtige bacterie-20 celaggregaat gemengd alvorens dit de extruder binnenkomt .

Het gedroogde fijnverdeelde bacteriecelaggregaat wordt toegevoegd aan het bacteriecelaggregaat'· in een hoeveelheid tot 70 gew.$, berekend op het totale gewicht van de mengsel-vaste stoffen.· Bij voorkeur worden de fijne materialen aan het bacteriecelaggregaat toe-25 gevoegd m een hoeveelheid van 5-70 gew. %, berekend op het totale gewicht van de vaste stoffen. In het bijzonder worden de fijnverdeelde , materialen toegevoegd in een hoeveelheid van 30 gew./? berekend op het totale gewicht.

Het mengsel van fijne materialen en vochtig bacteriecelaggregaat 30 wordt vervolgens in een vorm gebracht, bij voorkeur door extruderen door een mondstuk met een verminderde doorsnede, het aldus gevormde mengsel of extrudaat gedroogd en het gedroogde aggregaat gemalen en de gewenste deeltjesgrootte afgescheiden. Eventueel verkregen te fijn materiaal kan overeenkomstig de uitvinding worden gerecirculeerd.

35 Een extrusieopening met een diameter van 1,6 tot 3,2 mm verdient de 7903379 T -* τ voorkeur.

Het verkregen gedroogde aggregaat kan worden opgeslagen tot het nodig is voor een enzymatisch proces. Op dit tijdstip-wordt het gedroogde aggregaat gerebydrateerd en voor gebruik geschikt gemaakt, 5 b.v. overeenkomstig Amerikaans octrooischrift 3· 97^--036.

4

Een "belangrijk voordeel van de uitvinding is de verhoging van de hardheid van de bacteriecelaggregaten na rehydratatie vergeleken met bekende "bacteriecelaggregaten. De hardheid wordt uitgedrukt in relatie tot de weerstand tegen samendrukken van de bacteriecel-10 aggregaatdeeltjes. Een Ihstron Universal Tester Model 1102 werd op een zelfde wijze gebruikt als beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.935.069. Dit instrument wordt verkocht door Instron Corporation te Canton, Massachusetts.

De bij deze Instrontester gebruikte proefcel bestaat uit een 15 transparante cylinder van acrylplastic met een inwendige diameter van b,3T cm, een uitwendige diameter van 6 ,k5 cm en een hoogte van 21,8 cm. De bodem bezit een trap van 0,6U cm dikte met een opening van 3,8 cm die de steun vormt voor een microfilter,Eaageschikte micro-filter is een spinneret die gebruikt wordt bij textielspinnen met 20 1^.500 gaatjes van elk ca. 0,2 mm.

Een roestvrij stalen zuiger (type 30h-) met een diameter van U,3 cm en een lengte van 13,7 cm is zodanig bevestigd, dat hij coaxiaal in de gênoemde cylinder kan bewegen. Passende indexen zijn aangebracht langs de cel cm een monsterdiepte van 10,2 cm aan .te 25 geven. Voorzieningen worden tevens getroffen voor het aahbrengen van een verminderde' druk of een vacuum op de bodem van de cel en voor het opvangen van eventuele vloeistof die door het microfilter passeert,

Iadien een monster bacteriecelaggregaat in de genoemde cel 30 wordt gebracht en druk via de zuiger op het monster wordt aangebracht, dan wordt dit monster gecomprimeerd. De druk die nodig is cm het monster tot een gegeven hoeveelheid te comprimeren is een indicatie omtrent de hardheid van het monster.

Hieronder volgt de rehydratatiehardheid-proefprocednre die 35 gebruikt wordt bij de voorbeelden volgens de uitvinding: 7903379 . 8 • ♦

Een waterige oplossing ran glucose van 33 gew.$ wordt op pH

8,1 getracht. Een portie ran 130 g gedroogd tacteriecelaggregaat 3 wordt-met 1300 cm van deze glucoseoplossing gemengd door 1 uur bij 2k°C zachtjes te roeren. Het verkregen mengsel wordt gedurende 30 sec 5 van vocht ontdaan via een. zeef met gaten van 0,9 mm. De vaste stoffen worden vervolgens her suspendeer d in een verse hoeveelheid glucose-oplossing en wederom 5 minuten hij 2U°C geroerd. De verkregen suspensie laat men 5 minuten bezinken waarna op de boven weergegeven wijze opnieuw wordt gedroogd. Vaste stoffen worden dan hersuspendeerd in 10 een verse portie van de glucoseoplossing en opnieuw 5 minuten bij 2k°C geroerd. Ca. de helft van de verkregen suspensie wordt vervolgens in de proef cel gegoten tot een hoogte van 10,2 cm. Een verminderde druk van 2,5b cm kwik wordt vervolgens- op de bodem van de proef cel gedurende 3 minuten aangebracht, waardoor vloeistof door het micro-15 filter wordt gezogen. De plunjer wordt vervolgens cmlaaggedrukt tot hij de bovenkant van het monster raakt. De kruiskop op het Instron-instrument wordt aan de plunjer bevestigd en langzaam naar beneden bewogen met een snelheid van 1,27 cm/min en stilgezet bij een penetratie van 2,5b cm. De weergavekaartsnelheid wordt ingesteld op 20 12,7 cm/min. Ha afloop van de penetratie laat men de plunjer precies 1 minuut los. Vervolgens wordt de plunjer wederom in contact gebracht met de bovenkant van. het monster en het Instroninstrument wederom stilgezet na een penetratie van 2,$k cm. De druk benodigd voor de * tweede penetratie is een maat voor de monsterhardheid.

25 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

Voorbeeld I

Een oplossing van polyaminepolymeer werd bereid door verdunning van 1750 g van een BETZ 1180-oplossing met daarin 525 g actief materiaal en wel met gedestilleerd water tot 15 1 was verkregen. De pH werd 30 op 9 gebracht. Een oplossing van glutaaraldehyde werd bereid door

O

2670 cnr 25 gew.$ glutaaraldehyde met 667 g actief materiaal met gedestilleerd water tot 15 1 te verdunnen. Ook hier werd de pH op 9 gebracht, De twee oplossingen werden samengevoegd en gedestilleerd water toegevoegd tot een totaal van b2 1. De reactie vond plaats 35 bij pH 9 en een temperatuur van ca. 25°C en duurde ca. 0,5 uur. Het 7903379 9 verkregen produkt werd gevormd uit een reactiemengsel met 56 gev.% glut aar aide hyde en ^ gev.% polyaminepolymeer berekend op het totale gewicht van de beide droge stoffen.

Een cultuur van een mutant van Streptomyees olivaceus NER1 5 3583 werd gekweekt in een geroerde en beluchte gistingstank met een hXs * passende hoeveelheid voedingsbodem,/beschreven in .Amerikaans octrooi-schrift 3.625.828. De verkregen fermentatievloeistof met een grote massa bacterie cellen werd door een toevoeging van passende buffer-materialen cp pH 8-9 gebracht. De als boven verkregen oplossing werd

O

10 aAn de gistingsvloeistof toegevoegd in een hoeveelheid van 6 cm /g droog cellengewicht, waardoor 1T gev.% totaal reactieprodukt, berekend op het droge gewicht van de bacteriecellen,verd toegevoegd. Ha ca.

30 minuten reageren bij 25°C en pH 8-9 werd de behandelde gistingsvloeistof met het bacteriecelaggregaat in een voorraadstank gebracht, 15 van waaruit zij werd geleid naar een roterend vacuumfilter. De ver kregen vochtige filterfkoek werd in kleine stukjes gesneden van ca-2 1 cm . De gesneden filterkoeks tukjes met een vochtgehalte van ca.

76 gev.% werden vervolgens in k porties verdeeld. Een portie werd vervolgens geëxtrudeerd via een mondstuk met openingen van 3,18 mm 20 onder toepassing van een non-ccmpresssie-extruderschroef met 100 toeren/min. Het verkregen geëxtrudeerde bacteriecelaggregaat werd vervolgens U-6 uren bij 60°C gedroogd en vervolgens gemalen.

De gemalen deeltjes werden geklasseerd en de fractie die passeert door een zeef met openingen van ruim 1 mm maar werd tegengehouden 25 door een zeef met openingen van 0,6 mm geselecteerd. Het fijne ma teriaal, dat ook door deze laatste zeef liep werd opgevangen en voor verder gebruik terzijde gesteld. De fractie van 0,6-1 mm wordt aangeduid als controle. Zijn glucoseiscmeraseactiviteit werd gemeten door de prcefmethode weergegeven in Amerikaans octrooischrift 30 3«779*369 en bleek ^30 glucoseisamerase-eenheden per gram te bedragen.

De hardheid ervan werd eveneens gemeten en wel met de bovenbeschreven procedure.

De overige drie porties aan vochtig bacteriecelaggregaat filterkoek werden afzonderlijk gemengd in een menginrichting met bekende 35 hoeveelheden tevoren bereid gedroogd Strentomyces olivaceus bacterie- 7903379 ♦ * • ' 10 celaggregaat met een deeltjesgrootte van minder dan· 0,6 mm en een vochtgehalte van 12 gev.$. Eli van de drie gemengde porties (monsters IB, 1C en ID) werden vervolgens afzonderlijk geëxtrudeerd, gedroogd, gemalen en als boven voor de controle gescheiden, waarbij porties 5 bacteriecelaggregaat met deeltjesgrootten die passeren door een zeef van 1 mm en gorden tegengehouden door een zeef van 0,6 mm, werden verkregen. De hardheid en enzymactiviteit- van elke produktportie werden vervolgens gemeten. De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

De hardheid van het monster is uitgedrukt als een percentagetoename 10 boven de hardheid van de controle.

\ 7903379 4- * 11 -p .

•Η 0 δ£ •η · ο σ\ m η t» Η <η ia on <η •η . -a· -sf -=f cu -μ Η ο · << ο 0 *0 VO γ-I ΙΑ Μ -3 Ο Η Ο >0 <» ·» « - ο ·η cu σν «η Λ 0 I 3Τ -3 ΓΟ f-t jö Η 0 Ό ► a >«. Λ

Jd 0 ο ,y ΟΝ Ον Η η η a

0 Ο Η ON CU

<i 0+3 o t- on cu

+3 Η H

i—ΐ 0 ·Η 0 Vt P 0

03 öO

&4 O h μ 0 Ό Ό 0

H O

o3 Pc , , Λ ¢3 Η H 0\

Λ · AAA

O o o CO o t- +3 ' CU NO C—

•H

"6S. O ♦

• 0 £ M 0 <u &0 bO

0t s cd

S

0 H bc O IA IA 1Λ

rf +3 ^¾. A A A A

sj n . vo On vo cn +3 0^ t- VO IA 3 O O 0 & > Ö0 ^ 0 r-i

O

u

-P

t* a 0 o P o 0 '

o <3 PQ O O

S Η Η Η H

7903379 12 .

De vermindering in enzymactiviteit bij monster: ^ ID wordt waarschijnlijk. veroorzaakt door een inactivering door verhoogde temperatuur en druk ontstaan in de extruder.·,door het lagere vochtgehalte. Uit de tabel blijkt, dat een toevoeging van fijn poeder tot ca. 70 gev./£ 5 op het geheel kan worden toegepast zonder dat de enzymactiviteit terugloopt.

Voorbeeld II

Voorbeeld I werd herhaald met de volgende veranderingen.

Drie porties van de vochtige filterkoek werden afzonderlijk gemengd 10 met tó,8" gew.$ gerecirculeerd bacteriecelaggregaatpoeder berekend op het totaal droge stof. Deze drie porties werden vervolgens afzonderlijk geextrudeerd door mondstukken met zes openingen van 3,18 mm, acht. openingen van 1,59 mm. en tien openingen van 1,19 mm diameter. De resultaten zijn weergegeven in tabel B.

*·* % 7903379 - 13 p •Η <υ öo •w * t» a vo cm ¢- on •H · c- .a- un on +3 H trv ir\ ir\ trv

o * ed O

W 00 w

.. (Μ ΙΛ <D

rj · AAA

tj r· VO on — m I CO ΙΛ ri

Vt. P

s

<2 CO CO OV OV

φ · g H rK ION rn

gig A A A A

o -ri on on <-i h S <ö

0 WWW

^ ^ AAA

cq ho o on on on

·Η Ο Ο ΙΑ 1Λ IA

H Pt 5-C P H

0 Ο O

P -P

aj lö id !h & a o 0 Ο Ό

S

Ο Ο O

^ ft

Ο Ό P

H b _ CO CO CO

>& S-4 A A Λ

. § ·Η ► O VO VO VO

lï-p o — — — 0) o o 60 P 60 s 0 60 OJ t— C— C— +3 ^ on oo co oo

A A A A

o > o on on on Ο 0 CO 6— t— t— ·> 60 ©

H

p

M

P

U S

o o p o tn —-

O C ffl O Q

;g W W W W

7903379 ill·.

%

De voorkeursmondstukdiamet er van 3,18 mm tot 1,59 nun levert een hoogste gewenste duidelijke verhoging vat betreft de hardheid zonder verlies aan activiteit.

Voorbeeld III

5 Voorbeeld I verd herhaald met de volgende veranderingen. Drie porties van de vochtige filterkoek werden afzonderlijk gemengd met 60,1 gev.$ gerecirculeerd bacteriecelaggregaatpoeder berekend op het totaal droge stof. Alle vier de porties werden vervolgens ge-extrudeerd door acht openingen van 1,59 mm. De controleporties (monster 10 3A) werd geëxtrudeerd onder toepas sing van een niet comprimerende schroef, roterend met een snelheid van βθ toeren/minuut. Een eerste portie (3B) gemengd met het fijne poeder werd onder dezelfde voor-waarden geëxtrudeerd als de controle. Een. tweede portie (3C) gemengd met het poeder werd geëxtrudeerd onder toepassing van een. single flight 15 3:1 campressieschroef met een snelheid van Uo toeren/minuut. Een derde portie (3D) gemengd met het poeder werd geëxtrudeerd met een double flight 3:1 campressieschroef en wel met 30 toeren/minuut.

De resultaten zijn weergegeven in tabel C.

»*» % 7903379 15 •μ •ri 0 SO -μ ^ •Η · Ο VO t— }> Η ΙίΝ Ο Η Ο J ·Η · vo ΙΓν ΙΛ Λ -μ Η α · 0 ö » d yj Ο Φ CO ο Η Ο ·Η ΙΑ ΟΙ Ο rj ή) λ λ λ u ö -μ- c- co 0 τ! Η Η t— t> I Η Η Η 0} SA ff ff Φ Ο ^ σ\ ο. α\

^ Α Λ A

<ϋ ο σ\ σ\ σ\ -μ ο η η <<ι γ-1 Η •Η Si ?4 Ο Η 0 0 Η 0 0 0 -μ Ο ,Ω Oft 0 -μ ft Εη Ο · ι—1 Η Η p4 -U Ο ΑΛΑ Ο αΐ U Ο ο Ο Ο •Η VO VO νο &S. 0 0 • S0 0 ίϊ Ο ^ φ U 0

SOd SO

♦· ff 0 so +3 3¾ O H H r-i Λ · CO 1—1 Η Η ζϊ ^ Λ Λ Λ η Ο 0 αο οο co αο > ft) t— 1Λ ΙΑ ΙΑ 0 Η ο Μ -Ρ u a 0 ο -μ ο m —' Ο <! PQ ο fi g on co m 00 7903379 - 16-

Alle monsters met gerecirculeerd fijn poeder hadden een duidelijk verhoogde hardheid en een gelijke activiteit.

Voorbeeld IV

Voorbeeld I werd herhaald met de volgende wijzigingen. Een portie 5 (h-B) van de vochtige filterkoek werd gemengd met 1+6,8 gew.$ gere circuleerd poeder berekend op totaal droge stof. Een volgende portie (1+C) werd 10 minuten bij 6o°C gedroogd alvorens te extruderen.

Een verdere portie (1+D) werd 20 minuten bij 60°C gedroogd alvorens te extruderen. De daaropvolgende portie (1+E) werd 30 minuten bij 10 60°C gedroogd alvorens te extruderen. De· laatste portie (1+F) werd 1+0 minuten bij 60°C gedroogd alvorens te extruderen. De onbehandelde controle (Ua) en de andere behandelde porties werden allen ge— extrudeerd door openingen van 1,59 mm onder toepassing van een niet comprimerende schroef die draaide· met een snelheid van 80 15 toeren/minuut. De resultaten zijn weergegeven in tabel D.

p- 7903379

IT

-Ρ •ri 0 ÖÜ -P ^ "Soa o o vo ia H 04

•H · J J· J VO t- 1A

+3H -=t- -S' -=* o ·

«Ö O

ΙΛ J* VD 0\ OJ t— •ri rl * CVI W (Π . 0 «* Η λ n n.

rt .0 I tO 01 Μ Ο O

?4 lf\ I · H

0 > a3 Λ -¾¾ 0 o g °i οι o on ο ο ο o

o -p OIAOOOO

Η Η r—l Η Η H

ιΗ H *H

0 0 4-1 P ¢3

α3 -P O

-p ¢-1 o u ft-P 4) o a fl 0 ΤΛ 0 0 _ • bo a oo £ o * 0 !h O VO _

MO fn O -3· Ο Ο Ο O

Ή ' 0 0 0

M

Λ 0 bQ _

-P ^ VO Ον Ο Ο Ο O

p . m \o ον οι η o Q >5 η Λ Λ λ ft « Ο 0 _3· r-f 00 t~- ΙΑ t—

> 60 t-VOVOVOVOlA

0 r-ί Ο k -Ρ

u S

0 Ο -ρ ο a *— Ο «ή Ρ5 Ο Ο Η (¾ a J- .=* -a- 7903379 *** · 18 * *

Uit deze cijfers -volgt dat alleen maar het drogen van een filterkoek zonder toevoeging van fijn poeder de hardheid niet verhoogt, \ dj.e met een dergelxjk fijn poeder vel vordt "bereikt.

Bij alle veergegeven voorheelden verd het gerecireuleerde poeder //

5 aan de vochtige filterkoek toegevoegd vlak voor de extrusie. Het volgende voorbeeld geeft het effect weer van een toevoeging van gereeirculeerd poeder aan bacteriecelaggregaat alvorens te filtreren. Voorbeeld V

Voorbeeld I verd vedercm gevolgd voor het bereiden van de 10 suspensie van het bacteriecelaggregaat in de voorraadtank alvorens verd gefiltreerd. Gereeirculeerd poeder van bacteriecelaggregaat. verd vervolgens aan een deel van de taakinhoud in een hoeveelheid van 30 gev.% berekend op totaal droge stof toegevoegd. Het resulterende mengsel en de onbehandelde portie werden afzonderlijk gefiltreerd, 15 geëxtrudeerd door gaten met een diameter van 1,59 nna onder toepassing van een niet comprimerende schroef die draaide met een snelheid van 80 toeren/min, vervolgens gemalen en volgens voorbeeld I geklasseerd. De behandelde portie met gereeirculeerd poeder had een hardheid die h5,15% hoger was dan de onbehandelde controle.

20 Hieruit volgt, dat toevoeging van gereeirculeerd poeder aan bacteriecelaggregaat na de vorming daarvan maar alvorens een bacteriecelaggregaat te extruderen de hardheid van de resulterende gevormde aggregaatdeeltje-s duidelijk verbetert.

De als boven bereide bacterieaggregaten varen alle bijzonder 25 geschikt voor een omzetting van glucose in fructose. De glucose-iscmeraseactiviteit werd door het gebruik van dit nieuwe procédé niet ongunstig beïnvloed.

7903379

Claims (8)

1. Werkwijze voor liet bevorderen van de hardheid van een gevormd, bacteriecelaggregaat, met het kenmerk, dat men tevoren bereid fijnverdeeld bacteriecelaggregaat aan het bacteriecelaggregaat toevoegt nadat dit is gevormd maar alvorens het in een vorm te 5 brengen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1» met het· kenmerk, dat het gedroogde fijnverdeelde bacteriecelaggregaat een deeltjesgrootte heeft van minder dan 0,6 mm.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het. kenmerk, dat het 10 gedroogde fijnverdeelde bacteriecelaggregaat wordt- toegevoegd aan. het bacteriecelaggregaat in een hoeveelheid van ten hoogste 70 gew.#, berekend, op het totale gewicht van de droge stoffen. k. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gedroogde fijnverdeelde bacteriecelaggregaat wordt toegevoegd aan 15 het verdere bacteriecelaggregaat in een hoeveelheid van 5-70 gew.#, berekend op totaal droge stof.

5· Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het fijn verdeelde bacteriecelaggregaat wordt toegevoegd aan het andere bacteriecelaggregaat in een hoeveelheid van ca. 30 gev./J berekend 20 op totaal droge stof.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de bac-teriecellen van Strentomyces olivaceus zijn.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het bacteriecelaggregaat werd gevormd <Sor een massa bacteriecellen: in * 25 contact te brengen met een verknopingsreactieprodukt van (l) glutaaraldehyde, cyanuurhalogenide of combinaties daarvan en (2) een in water oplosbaar kation-polymeer verkregen door een polymerisatie van een epihalohydrine met een alkyleenpolyamine met de formule R-jRgïIMHg, waarbij R alkyleen met 2-6 koolstof at omen en 30 R1 en Rg alkyl met 1-6 koolstofatcmen voorstellen, waarbij de mol-verhouding van epihalohydrine tot polyamine 0,6-2,7 : 1 bedraagt, welke polymerisatie wordt uitgevoerd door het alkyleenpolyamine eerst met 50-90 gew. % van de totale hoeveelheid epihalohydrine cm 7903379 / · 20 / vW Ï / / / ................ . ________ .. ................................. ....... . ., . .......... r te zetten., de reactie te laten verlopen tot een nagenoeg uniforme viscositeit is verkregen en het restant epihalohydrine in porties verder toe te voegen, tot het kation-polymeer is verkregen, -waarbij de polymerisatietemperatuur op l60-120°C wordt gehouden, een en 5 ander gevolgd door winning van het verkregen aggregaat.

8. Werkwijze volgens conclusie 7s waarbij het verknopingsprodukt resulteert uit een reactie van 12-77 gew.% van component 1 en 23-88 gev.% aan component 2 berekend op het totale gewicht van de actieve stoffen in de componenten 1 en 2. 10 9· Werkwijze voor het bereiden van een geëxtrudeerd bacteriecel- aggregaat met verbeterde hardheid, met het kenmerk, dat men een bacteriecelaggregaat vormt, aan dit bacteriecelaggregaat een portie tevoren geproduceerd, gedroogd, fijnverdeeld bacteriecelaggregaat van dezelfde algemene samenstelling toevoegt ter vorming, van een 15 bacteriecelaggregaatmengsel, dit mengsel door een mondstuk van verminderde doorsnede extrudeert, het extrudaat droogt en maalt en het extrudaat klasseert, waarbij de gewenste deeltjesgrootte wordt geïsoleerd.

10. Werkwijze voor het uitvoeren van enzymatische reacties, 20 met het kenmerk, dat men een volgens conclusies 1-9 verkregen bac teriecelaggregaat daarbij toepast. « 7903379