DK151638B

DK151638B - Fremgangsmaade til fremstilling af et formet bakteriecelleaggregat

Info

Publication number: DK151638B
Application number: DK377679AA
Authority: DK
Inventors: Anthony Hing Chen; Yun-Chi Jao
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1978-09-11
Filing date: 1979-09-10
Publication date: 1987-12-21
Also published as: NL188952C; HU180266B; DE2936486A1; IL56952A0; US4251632A; IT7949183A0; BE876083A; NL7903379A; DK377679A; IT1120423B; ES479854A1; AU4791179A; FR2435525A1; PL216816A1; JPS5741239B2; GB2029856A; AR225283A1; DK151638C; SE7903700L; AU514883B2

Description

DK 151638 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et formet aggregat af bakterieceller, ved hvilken fremgangsmåde en bakteriecellemasse kontaktes med et tværbindingsmiddel. De fremstillede bakteriecelleaggregater kan finde anvendelse 5 til udførelse af enzymatiske processer, især hvis bakteriecellerne indeholder glucoseisomeraseaktivitet.

Glucoseisomerase er et enzym, som kan anvendes til at katalysere omdannelsen af glucose (dextrose) til fruktose (lævulose).

Det er kendt, at glucoseisomerase kan fremstilles ved fermentering 10 med visse organismer, såsom Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, Bacillus coagulans og lignende i passende næringsmedier. Glucoseisomerasen dannes inden i bakteriecellerne, som vokser, medens det produceres. Cellerne kan filtreres fra 15 fermentationsmediet og anvendes direkte som glucoseisomerasekilde.

Direkte kommerciel anvendelse af sådanne enzymholdige bakterieceller har imidlertid været besværliggjort af en væsentlig ulempe. Cellerne mistede enzymaktiviteten under anvendelsen, og derved reduceredes cellernes brugstid. Denne ulempe blev overvundet ved at behandle 20 bakteriecellerne med glutaraldehyd som beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.779.869. Andre metoder til immobilisering af enzymaktiviteten i bakterieceller samt til dannelse af aggregater af disse enzymholdige bakterieceller er beskrevet f.eks. i beskrivelsen til US patent nr. 3.821.086 og US reissue patent nr. 29.130 og 25 29.136 samt i beskrivelsen til sydafrikansk patent nr. 73/5917.

Beskrivelserne til ovennævnte US patenter angår anvendelsen af visse anioniske og kationiske polyelektrolytflokkuleringsmidler. I beskrivelsen til det sydafrikanske patent omtales forskellige kombinationer af bindemidler, forstærkningsmidler og tværbindings-30 midler. Skønt ovennævnte teknik tilvejebragte bakteriecelleaggregater, der almindeligvis bevarede deres enzymaktivitet under anvendelsen, var der stadig behov for at øge aggregaternes hårdhed, således at de kunne anvendes kommercielt i reaktionslag med større dybde. I beskrivelsen til US patent nr. 3.935.069 er der 35 beskrevet en tilsætning af visse metalliske forbindelser i forbindelse med polyelektrolytflokkuleringsmidler til forbedring af hårdheden.

Denne teknik har imidlertid begrænset anvendelighed.

Ved fremstillingen af formede bakteriecelleaggregater dannes en vis mængde findelt produkt, der har en partikelstørrelse, som er for

DK 151638 B

2

Mile til kommerciel brug. Forskellige metoder til udnyttelse af disse smlpartikler er blevet foreslået. I beskrivelsen til US patent nr. 4.060.456 er der omtalt en recirkulation af produktpartikler til en flokkuleringstank, hvor der tilsættes et flokkuleringsmiddel til 5 dannelse af bakteriecelleaggregater. Medens denne teknik tilvejebringer en anvendelse af recirkulerede småstykker ved fremstilling af et flokkuleret aggregat, er der ikke nævnt noget om nogen effekt på produktets hårdhed. Anvendelse af recirkulerede enzymbærere er også omtalt i beskrivelserne til US patenterne nr. 4.002.576, 10 4.078.970 og 4.087.330, men i intet tilfælde er der en omtale af eller et forslag om, at sådanne recirkulerede materialer kan hjælpe med til at forbedre hårdheden af de formede produkter.

Det har nu vist sig, at hårdheden af et formet bakteriecel leaggregat kan forbedres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som 15 er ejendommelig ved, at bakteriecellemassen kontaktes med et tværbindingsmiddel, som er et reaktionsprodukt af (1) et materiale udvalgt fra klassen bestående af glutaraldehyd, cyanursyrehalid eller kombinationer heraf og (2) en vandopløselig kationpolymer opnået ved polymerisation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin, der 20 har formlen (^Ι^ΝΙ^ΝΙ^, hvor R er en alkylengruppe, der har fra 2 til ca. 6 carbonatomer, og og R£ hver er en alkylgruppe med fra 1 til:ca. 6 carbonatomer, hvor molforholdet epihalohydrin til polyamin er på fra ca. 0,60:1 til ca. 2,7:1, hvilken polymerisation omfatter, at der med alkylenpolyaminen omsættes fra ca. 50 til ca. 90% af den 25 mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reaktionen får lov til at fortsætte, indtil reaktionsmediet opnår en i alt væsentligt jævn viskositet, og at den resterende portion af epihaiohydrinet omsættes trinvis til opnåelse af den kationiske polymer, idet polymerisationstemperaturen er på fra ca. 60°C til ca. 120°C, hvorpå det 30 resuftrende aggregat tilsættes en portion tidligere fremstillet, tørret findelt bakteriecelleaggregat af samme sammensætning med en partikelstørrelse mindre end 0,71 mm sigtemaskestørrelse, hvorefter blandingen formes, tørres, formales og adskilles til frembringelse af de ønskede partikler med en partikelstørrelse over ca. 0,71 mm 35 sigtemaskestørrelse og partikler med en partikelstørrelse under ca.

0,71 mm sigtemaskestørrelse, som recirkuleres.

Fremgangsmåden er navnlig nyttig, når det resulterende aggregat tørres og derefter rehydreres til efterfølgende brug.

I beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1223/79 er der be-

DK 151638B

3 skrevet en fremgangsmåde til fremstilling af et aggregat af bakterieceller, ved hvilken fremgangsmåde en bakteriecellemasse kontaktes med et tværbindingsmiddel, hvorpå det resulterende aggregat udvindes og, om ønsket, tørres, hvorhos tværbindings-5 midlet er et reaktionsprodukt af (1) et materiale udvalgt fra en klasse betstående af glutaraldehyd, cyanursyrehalid og kombinationer heraf og (2) en vandopløselig kationisk polymer tilvejebragt ved polymerisation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin, som har formlen R-jF^NRNHg, hvor R er en alkylengruppe, der har fra 2 til 10 ca. 6 carbonatomer, og R^ og R2 hver er en alkylgruppe med fra 1 til ca. 6 carbonatomer, hvor molforholdet epihalohydrin til polyamin er på fra ca. 0,60:1 til ca. 2,7:1, hvilken polymerisation omfatter, at der med alkylenpolyaminen omsættes fra ca. 50 til ca. 90% af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reaktionen får 15 lov til at fortsætte, indtil reaktionsmediet opnår en i alt væsentligt jævn viskositet, og at den resterende portion epihalohydrin omsættes trinvis til opnåelse af den kationiske polymer, hvor polymerisationstemperaturen er på fra ca. 60°C til ca. 120°C. - Denne fremgangsmåde udgør dog kun § 2.2.2. teknik i forhold til den foreliggende 20 opfindelse.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til forskellige enzymholdige bakterieceller, og resten af beskrivelsen vil angl anvendelse af fremgangsmåden til bakterieceller indeholdende glucoseisomeraseaktivitet.

25 De glucoseisomeraseaktivitetsholdige baktericeller, der er an vendelige ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan tilvejebringes ved velkendte procedurer. De foretrukne enzymholdige celler frembringes ved under submerse, aerobe forhold at dyrke en kultur af Streptomyces olivaceus NRRL 3583 eller mutanter 30 heraf i et medium, der indeholder passende næringsstoffer. Dette er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.625.828. De resulterende baktericeller separeres fra fermentationsmediet ved filtrering eller centrifugering.

De ingredienser, som anvendes ved tværbindingen er let 35 opnåelige. Glutaraldehyd og cyanursyrehalid, såsom cyanursyretri-chlorid, cyanursyretribromid, cyanursyretriiodid og lignende, er kommercielt tilgængelige eller kan fremstilles ved velkendte metoder.

Den specielle epihalohydrin-polyaminpolymer, der anvendes ved tværbindingen, er kommercielt opnåelig under varemærket BETZ 1180 fra

DK 151638 B

4

Betz Laboratories, Inc. Trevose, Pennsylvania. BETZ 1180 har en molekylvægt på mindre end en million, indeholder ca. 0,288 millimol aminogrupper pr. gram opløsning (baseret pi en ninhydrinanalyse) og markedsføres som en opløsning, der indeholder 30 vægtprocent 5 tørstof baseret på opløsningens samlede vægt. Denne forbindelse er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.915.904. Forbindelsen er deri beskrevet som en vandopløselig kationisk polymer, der opnås ved polymerisation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin, som har formlen R^R^NRNf^/ hvor R er en lavere alkylen med fra 2 til 10 ca. 6 carbonatomer, og R^ og hver er et lavere al kyl på fra ca.

1 til ca. 6 carbonatomer, hvor molforholdet epihalohydrin til polyamin er på fra ca. 0,60:1 til ca. 2,7:1, hvilken polymerisation omfatter, at der med alkylenpolyaminen omsættes fra ca. 50 til ca. 90 procent af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reak-15 tionen fir lov til at fortsætte indtil reaktionsmediet opnår en i alt væsentligt jævn viskositet, og at den resterende portion af epihalohydrinen omsættes trinvis til opnåelse af den kationiske polymer, idet polymerisationstemperaturen er på fra ca. 60°C til ca.

120°C. Dette materiale vil herefter blive omtalt som "polyamin-20 polymeren".

Glutaraldehydet og/eller cyanursyrehalidet, som kollektivt identificeres som komponent (1), omsættes med polyaminpolymeren, der identificeres som komponent (2), ved et pH omkring 6 til 10 og ved ca. 0° til 30°C i ca. 0,5 til 2,5 timer. Det samlede 25 tværbindende reaktionsprodukt indeholder fra ca. 12 til 77 vægtprocent af komponent (1) og fra ca. 23 til ca. 88 vægtprocent af komponent (2) baseret på den samlede vægt af de aktive bestanddele i komponenterne (1) og (2). Reaktionsproduktets glutaraldehyd-indhold er på fra ca. 0 til ca. 77 vægtprocent, og cyanursyrehalid-30 indholdet er på fra ca. 0 til ca. 22 vægtprocent baseret på den samlede vægt af de aktive bestanddele i komponenterne (1) og (2).

Reaktionen mellem glutaraldehyd og polyaminpolymeren udføres fortrinsvis ved pH 8 til 9 og ved ca. 18° til 25°C i ca. 0,5 time. Glutaraldehydet bør være til stede i et molforhold på mindst ét mol 35 pr. mol aminogruppe i polyaminen for at undgå uønsket tværbinding af polyaminpolymeren med glutaraldehyd.

Reaktionen mellem cyanursyrehalid alene og polyaminpolymeren udføres fortrinsvis ved pH 8 til 9 og ved 0° til 10°C i ca. 1 til 2 timer. Cyanursyrehalidet bør være til stede i et molforhold på mindst

DK 151638B

5 ét mol pr. mol aminogruppe i polyaminpolymeren for at undgå uønskelig tværbinding af polyaminpolymeren med cyanursyrehalid. Cyanursyrehalider, såsom cyanursyretrichlorid, har tre halogenreaktive steder. Et af disse steder vil reagere ved 0°C eller 5 derover. Efter omsætning ved det første sted vil det andet sted reagere ved 30° til 50°C, og det sidste sted vil reagere ved 90° til 100°C. Det er ønskeligt indledningsvis kun at omsætte det første sted på cyanursyrehalidet med polyaminpolymeren. Når det resulterende tværbindende reaktionsprodukt senere omsættes med 10 bakteriecellerne og opvarmes til højere temperaturer under tørring vil de tilbageværende reaktive steder på cyanursyrehalidet derpå reagere med polyaminpolymeren til tilvejebringelse af yderligere tværbinding til bakteriecelleaggregatet.

Reaktionen mellem polyaminpolymeren og kombinationen af gluta-15 raldehyd og cyanursyrehalid udføres i trin. Først omsættes cyanursyrehalidet med polyaminpolymeren ved pH 8 til 9 og 0° til 10°C i ca. 1 til 2 timer. I denne situation har reaktanterne fortrinsvis et molforhold på 1 mol cyanursyrehalid til 2 mol aminogrupper på polyaminpolymeren. Derpå tilsættes en overskydende mængde glutaral-20 dehyd, og reaktionen fortsættes ved samme pH- og temperaturbetingelser i ca. 0,5 time.

Det tværbindende reaktionsprodukt, som anvendes ved dannelsen af bakteriecelleaggregatet, er ikke en kationisk polyelektrolyt, eftersom de aminogrupper på polyaminpolymeren, der initialt tilveje-25 bragte den kationiske karakter, er blevet omsat med glutaraldehydet og/eller cyanursyrehalidet og således ikke længere er til rådighed.

Bakteriecel leaggregaterne fremstilles ved at kontakte en bakteriecellemasse med det tværbindende reaktionsprodukt, der er fremstillet som beskrevet ovenfor, ved pH ca. 8 til 9 og ved ca. 0° 30 til 30°C i ca. 0,5 til 1,5 time. Det tværbindende reaktionsprodukt anvendes i en sådan mængde og koncentration, at bakteriecellerne kontaktes med fra ca. 4,5 til ca. 60 vægtprocent af de aktive bestanddele i det tværbindende reaktionsprodukt baseret på cellernes tørvægt.

35 Efter at ovennævnte reaktion har fundet sted, anbringes den resulterende bakteriecelleaggregatopslæmning fordelagtigt i en opbevarings- eller strømmetank anbragt opstrøms for et filtreringsapparat, såsom et roterende vakuumfilter. Opslæmningen filtreres derefter til dannelse af en filterkage af fugtigt bakteriecel leaggregat.

DK 151638B

6

Dette fugtige bakteriecelleaggregat bliver derefter udpresset eller på anden måde formet til de ønskelige former og derefter tørret ved omkring 60°C i adskillige timer.

Det ovenfor fremstillede tørrede aggregat sønderdeles og 5 størrelsessorteres til frembringelse af de ønskede aggregatpartikler med en størrelse, der passerer gennem en sigte med maskeåbninger på 1,19 mm, men tilbageholdes af en sigte med maskeåbninger på 0,71 mm. Det produktmateriale, der har en partikelstørrelse, som er større end 1,19 mm, sønderdeles igen, medens det produktmateriale, 10 der har en partikelstørrelse mindre end ca. 0,71 mm og et fugtindhold på omkring 12 vægtprocent, recirkuleres i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

Det tidligere fremstillede tørrede findelte bakteriecelleaggregat eller -findele, som passerer igennem 0,71 mm sigten, tilsættes til 15 bakteriecel leaggregatet efter at det er dannet, men før det formes, såsom ved udpresning. Dette kan bekvemt opnås på i det mindste to måder. Ved en procedure blandes findelene med bakteriecelle-aggregatopslæmningen i opbevarings- eller strømmetanken anbragt opstrøms for filteret. Ved en anden procedure kan findelene blandes 20 med det fugtige bakteriecelleaggregat, før det kommer ind i strengpressen.

Det tørrede findelte bakteriecelleaggregat tilsættes til bakteriecel leaggregatet i en mængde på op til omkring 70 vægtprocent baseret på den samlede vægt af blandingstørstofferne. Fortrinsvis 25 tilsættes findelene til bakteriecel leaggregatet i en mængde på fra omkring '5 til omkring 70 vægtprocent baseret på den samlede vægt af blandingstørstofferne. Allerhelst tilsættes findelene i en mængde på fra omkring 30 vægtprocent, baseret på den samlede vægt af blandingstørstofferne.

30 " Blandingen af findelt og fugtigt bakteriecelleaggregat formes, fortrinsvis ved at extrudere denne blanding gennem en matrice med reduceret tværsnitsareal, den formede blanding eller extrudat tørres, og det tørrede aggregat sønderdeles og adskilles til frembringelse af det ønskede parti kel størrelsesområde. Alle frembragte småpartikler 35 kan ifølge denne opfindelse recirkuleres. En extruderingsmatrice, der har åbninger på omkring 3,18 mm (1/8 in.) til omkring 1,59 mm (1/16 in.) foretrækkes på nuværende tidspunkt.

Det resulterende tørrede aggregat kan opbevares indtil det skal bruges i en enzymatisk proces. På dette tidspunkt rehydreres det 7

DK 151638 B

tørrede aggregat og konditioneres til brug. En illustrativ konditionen ngsproces er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.974.036.

En hovedfordel ved den foreliggende opfindelse er en forøgelse 5 af hårdheden af bakteriecelleaggregatet efter rehydrering sammenlignet med de hidtil kendte bakteriecelleaggregater. Hårdheden sættes i relation til bakteriecelleaggregatpartikiernes modstand mod komprimering. En Instron Universal Tester Model 1102 blev brugt på lignende måde som det er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr.

10 3.935.069. Dette instrument kan leveres fra Instron Corporation,

Canton, Massachusetts.

Den belastnings- eller prøvecelle, der blev anvendt til den ovenfor nævnte Instron Tester består af en gennemsigtig acrylsyre-plastcylinder, der har en indre diameter pi 4,37 cm, en 15 yderdiameter pi 6,45 cm og en højde pi 21,8 cm. Bunddelen har en afsats med en tykkelse på 0,635 cm og en åbning på 3,81 cm, som danner en støtte for et mikrofilter. Et bekvemt mikrofilter er en spindeplade, der anvendes til tekstilspinding, og som har 14500 åbninger med en diameter på omkring 0,2032 mm.

20 Et 304-type rustfri stålpressestempel med en diameter på 4,3 cm og en længde på 13,66 cm monteres således, at den bevæger sig koaksialt ind i den ovenfor nævnte cylinder. Passende mærker er anbragt langs belastningscellen til at vise en prøvedybde på 10,17 cm. Der er også draget omsorg for at kunne påføre bunden af 25 belastningscellen reduceret tryk eller vakuum og for at kunne opsamle eventuel væske, der passerer gennem mi krofilteret.

Hvis en prøve af bakteriecelleaggregat placeres i den ovenfor nævnte belastningscelle og prøven påføres tryk gennem pressestemplet, vil prøven blive komprimeret. Det tryk, der behøves 30 for at komprimere prøven i et vist omfang, er en indikation for prøvens hårdhed.

Det efterfølgende er genhydreringshårdhedsprøveproceduren, som den anvendes i eksemplerne i nærværende beskrivelse:

En 33 vægtprocent vandig opløsning af glucose justeres til pH 35 8,1. En portion på 130 g tørret bakteriecelleaggregat blandes med 1300 ml af denne glucoseopløsning ved forsigtig omrystning ved 24°C i en time. Den resulterende blanding drænes over en sigte med maskeåbninger på 0,84 mm i omkring 30 sekunder. De faste stoffer resuspenderes derefter i en frisk portion af den ovenfor nævnte

DK 151638B

8 glucoseopløsning og omrøres i fem minutter ved 24°C. Den resulterende opslæmning bundfældes i 5 minutter og drænes derefter som ovenfor beskrevet. De faste stoffer resuspenderes derefter i en frisk portion af den ovenfor nævnte glucoseopløsning og omrøres i 5 5 minutter ved 24°C. Omkring halvdelen af den resulterende opslæmning hældes derefter over i prøvecellen til en højde af 10,17 cm.

Et reduceret tryk eller vakuum på 2,54 cm kviksølv påføres bunden af prøvecellen i 3 minutter for at suge væsken gennem mi krofilteret. Pressestemplet bliver derefter sænket indtil det netop rører toppen 10 af prøven. Krydshovedet på I nstron instrumentet sættes fast på pressestemplet og den bliver sat til at bevæge sig nedad med en hastighed på 1,27 cm/min og stopper ved en indtrængning på 2,54 cm. Optegningspapirhastigheden sættes til 12,7 cm /min. Efter indtrængningen tillades pressestemplet en hvileperiode på nøjagtig 1 15 minut. Pressestemplet placeres igen i kontakt med toppen af prøven og I nstron instrumentet sættes til at stoppe ved en indtrængning på 2,54 cm. Det tryk, der er nødvendigt for at opnå den anden indtrængning, er målet for prøvens hårdhed.

Opfindelsen bliver beskrevet i yderligere detaljer i de efter-20 følgende illustrative eksempler.

EKSEMPEL 1

En opløsning af polyaminpolymer blev tilberedt ved at fortynde 1750 g af en BETZ 1180 opløsning indeholdende 525 g af aktivt materiale med destilleret vand til frembringelse af ialt 15 liter. pH 25 Blev justeret til 9. En opløsning af glutaraldehyd blev tilberedt ved at fortynde 2670 ml af en 25 vægtprocent glutaraldehyd indeholdende 667 g aktivt materiale med destilleret vand til ialt 15 liter. pH Blev justeret til 9. Disse to opløsninger blev derefter sammenblandet og destilleret vand blev tilsat til ialt 42 liter. Reaktionen fandt sted ved 30 et pH på omkring 9 og en temperatur på omkring 25°C i ca. 0,5 time. Det resulterende produkt blev dannet fra en reaktionsblanding indeholdende 56 vægtprocent glutaraldehyd og 44 vægtprocent polyaminpolymer baseret på den samlede vægt af glutaraldehyd (komponent 1) og polyaminpolymeren (komponent 2).

35 En kultur af en mutant af Streptomyces olivaceus NRRL 3583 blev dyrket i en omrystet, gennemluftet fermentor indeholdende et passende næringsmedium som beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.625.828. Den resulterende fermentorsuppe indeholdende en bakteriecellemasse blev justeret til pH 8-9 ved tilsætning af passende

DK 151638 B

9 puffermateriale. Den ovenfor nævnte opløsning blev tilsat til fermen-torsuppen i en mængde på 6 ml pr. gram celletørvægt for at give 17 vægtprocent totalreaktionsprodukt baseret på tørvægten af bakteriecellerne. Efter en reaktionstid på ca. 30 min. ved 25°C og pH 8-9 5 blev den behandlede suppe indeholdende bakteriecelleaggregatet anbragt i en opbevaringstank, fra hvilken den blev ført videre til et . roterende vakuumfilter. Den resulterende våde filterkage blev skåret i mindre stykker på omkring 1 cm i en ituskærer. De ituskårne fugtige filterkagestykker, der havde et fugtighedsindhold på omkring 10 76 vægtprocent, blev derefter opdelt i 4 portioner. En portion blev derefter extruderet gennem en matrice med 6 åbninger med en diameter pi 3,18 mm (1/8-in.) under anvendelse af en ikke-komprimerende extruderingssnegl med en skruerotation på 100 omdr/min. Det resulterende extruderede bakteriecel leaggregat blev 15 derefter tørret ved 60°C i 4 til 6 timer og formalet. De sønderdelte partikler blev derefter adskilt til opsamling af den ønskede fraktion, som passerede gennem en sigte med maskeåbninger på 1,19 mm, men som blev tilbageholdt på en sigte med maskeåbninger på 0,71 mm.

Findelene, som passerede gennem 0,71 mm sigten, blev opsamlet til 20 efterfølgende brug. -1,19 mm + 0,71 mm Fraktionen blev betegnet som "kontrol". Dens indhold af glucoseisomeraseaktivitet blev ved anvendelse af den analysemetode, der er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.779.869, målt til at være 430 glucoseisomerase-enheder (G.I.U.) pr. gm. Dens hårdhed blev også målt ved den 25 ovenfor beskrevne genhydreringshirdhedsprøveprocedure. De resterende 3 portioner fugtig bakteriecelleaggregatfilterkage blev derefter individuelt blandet i en blander med kontrolleret mængde af tidligere tørret Streptomyces olivaceus bakteriecelleaggregat, der havde en partikelcelle på mindre end omkring 0,71 mm, og som havde 30 et fugtindhold på 12 vægtprocent. Hver af de tre blandede portioner (prøve 1B, 1C og 1D) blev derefter individuelt extruderet, tørret, sønderdelt og adskilt som ovenfor beskrevet for kontrollen til dannelse af portioner af bakteriecelleaggregat, der havde en partikelstørrelse, som passerede gennem en sigte med maskeåbninger på 1,19 35 mm og blev tilbageholdt på en sigte med maskeåbninger pi 0,71 mm.

Hårdheden og enzymaktiviteten af hver portion produkt blev derefter målt. Resultaterne er vist nedenfor i tabel I.

Prøvernes hårdhed er udtrykt som procentforøgelse i forhold til hårdheden af kontrolprøven.

DK 151638B

—λ _1 —λ —Λ “Q

□ ο ro > -s ro.

/~N < 7Γ (0

O

3 - Γ+

"S

— < H

^ tø % tQ m i» W O) Ni V .

ω m (fl σι -s 3» ^ ^ ^ o c

cn cn cn o o iQ

ro <+ 3 i rr o_ o.

3 ro < 3 » »

Q. 0. [Q

CD -5 r+ •vi 05 ro O Tn 7T Ό vi o co c "s

'I ^ N — O

CD —1 —5 (DO -i

"5 (D O

8. 3- φ σ

CD

(Λ

(D

CD

p+ ao H rf > -n o ro = Sf m

r+ SL I-CD

"5 r+ — ro to vi o -j ro cd —i o g cn ' ' ' « r+

—5 CD CD ro O

—h ro "5

O

o

CD

3 r+ “h

O

ro

(Q

. ® —5 r+ ω ji. 4^ i ω cd ro rr

- · n QJO

—1 O 4^ -S

cn -» C7) Q_ -j.

CD

α > 7Γ rt <‘ r+ Φ Γ+

G

N i. 45 (5 — co ω cn ω '

-5 co cd o C

\

[Q

3 11

DK 151638 B

Reduktionen af enzymaktiviteten i prøve 1D formodes at skyldes inaktivering forårsaget af forhøjet temperatur og tryk frembragt i extruderen ved det lavere fugtighedsindhold. Det fremgår, at en 5 tilsætning af findele på op til omkring 70 vægtprocent baseret på total tørstof kan benyttes uden at svække enzymaktiviteten.

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med følgende ændringer. Tre portioner af den fugtige filterkage blev individuelt 10 blandet med 46,8 vægtprocent recirkuleret bakteriecelleaggregat-findele baseret på total tørvægt. Disse tre portioner blev derefter separat extruderet gennem matricer med 6 åbninger med en diameter på 3,18 mm (1/8-in.), 8 åbninger med en diameter på 1,59 mm (1/26 in.) og 10 åbninger med en diameter på 1,19 mm ( 3/64-in.).

15 Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel II.

20 25 30 35

DK 151638 B

ro ro ro ro -u D Π oo > 3 as <

7Γ <D

O

3 rt i. < ti ~ Si rt ET.

si vj si OO V 3 w co w o 2 a O -τ- ΟΟ CO CO GO O =i s| s| s| |\) Φ H.

S a CD < ® tø 2. Ω IT r+ js. 4s. O 2 Ό CD O) CD C -5 - - > a o

CO 00 00 rt O

1¾ 3 3 * Λ CT -1 cd Qj ro cd 55

(D

T

(D

r+ Ό tao Γ+ 3S,

_i T B H

on cn U1 O (D “ >

CO CO CO O s rt DO

--- -r- -Q.

ro ro ro m τ ΕΠ Q m r- ICD o - —h —1 —1 co co 13 t/) - - - - =3 rt _i tn —1 -i 1= Φ co co oo oo 3 Ό Φ α 55' A AS AS AS AS 3 CO —1 1 /η 's. -s. \ \ 2 H·

Q J 00 CO Q. (D

Jlk (!) v O' “ ~i

s^ s_/ V

3· "U

mo i

“5 O

α o

3· CD

s. - o’ -i cn CO I “5 J5» CO CD Ό.

--- (Q

oo cn ro a) ro oo ro π· CD > • JC rt C < • rt N m a η· cn CD CD cn ? w cn sj CO Sl N O) 13

DK 151638 B

Den foretrukne matricediameter på 3,18 mm (1/8-in.) til 1,59 mm (1/16-in.) giver en ønskelig høj forøgelse af hårdheden uden samtidig tab af aktivitet.

5 EKSEMPEL 3

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med følgende ændringer. Tre portioner af den fugtige filterkage blev individuelt blandet med 60,1 vægtprocent recirkulerede bakteriecelleaggregat-findele baseret på samlet tørstof. Alle 4 portioner blev derefter 10 extruderet gennem 8 åbninger med diameter på 1,59 mm (1/16-in.). Kontrolportionen (prøve 3A) blev extruderet ved at bruge en ikke komprimerende snegl roterende med 60 omdr/min. Den første portion (prøve 3B) blandet med findele blev extruderet under de samme betingelser som kontrollen. En anden portion (prøve 3C) blandet med 15 findele blev extruderet under anvendelse af et enkeltgevind 3:1 kompressionssnegl ved 40 omdr/min. En tredie portion (prøve 3D) blandet med findele blev extruderet under anvendelse af et dobbeltgevind 3:1 kompressionssnegl' ved 30 omdr/min. Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel III.

20 25 30 35

DK 151638 B

co co co co TJ

Ό o ro > 3 Ή < 7Γ ®

O

3 r+

"S

— Ti

'ή C

ui in oi n| η.

oo oo oo oo -· » N ·» * 3 _i -i _i co Cl ni ni ni ny·

O

CL

» <

® IB

2. ID

S £+

O) U) ffl O 7Γ D

O O O c "5

> S S _ O

—i —i (DO

"5 (D

(D 3 Q. r+ (D T* CT £» -h qj

5' S

m ® ro π) (D ^ Ό 0)0 §

SL

—i TI "S

CO CO CO O -· -s —I

(O CO CO O (n " - - ro cf n CO CO CO -5 O 03 *· m ro r-

D

ro — u — -i o o

(D

3 «+

Hi 0 1 •Θ.

Ώ ro c+ _i _i _1 i >vl -η Ή ΖΓ 00 Nj il QJ0

•.NS. T

o ro cn q.

_i o oo 5=

(D

CL

> < r+ cn cn cn % 00 -η o cn " 1 μ ro o φ

C

s.

D

13 15

DK 151638 B

Alle prøver med recirkulerede findele havde ønskelige forøgelser af hårdheden under bibeholdelse af acceptable aktivitetsniveauer.

EKSEMPEL 4 5 Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med følgende ændringer. En portion (prøve 4B) af den fugtige filterkage blev blandet med 46,8 vægtprocent recirkulerede bakteriecelleaggregat-findele baseret på samlet tørvægt. En anden prøve (prøve 4C) blev tørret ved 60°C i 10 min forud for extrudering. En yderligere prøve 10 (prøve 4D) blev tørret ved 60°C i 20 min før extrudering. Endnu en anden del (prøve 4E) blev tørret ved 60°C i 30 minutter før extrudering. En slutprøve (prøve 4F) blev tørret ved 60°C i 40 min før extrudering. En ubehandlet kontrol portion (prøve 4A) og de andre behandlede prøver blev alle extruderet gennem 8 åbninger med 15 en diameter på 1,59 mm (1/16-in.) ved at anvende en ikke-komprimerende snegl med 80 omdr/min. Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel IV.

20 25 30 35

DK 151638 E

¢, -b ii TJ

*n m σ n cd > i /-N < 7T ® 0 3 r+ 1 < ? ~ i s

r+ £J

^ X ** ** N > O

5 α

Ti < S ® 0. to -5 f+ o o o o jo» o yr Ti æ r "5 s _ o

oo (DO

-s CD

<D 3 Q. r+ ® σ -h Q) 05 5' w n ro

S' "J

<D (i) (D ^ Ό

Oio rf

"Π O

—* r+ i S SL 5 ® £ _4 "5 ro

o o o o tn o !» i [E

o o o o ω o (Q«n K a <

•O

"5

O

o

(D

□ r+ θ’ s.

to

(D

i rt· -i ro tn i CO to N J CO 3" s ». s ». ». Qjo w ro ro oo -» -s svi ro to tn ΐ» o.

T

(D

O.

> 7Γ r+ < <+ 45» 45» 4!» 45» 45» 45» % tn Ό 05 45» 45» i» ro tn σ» o o q c \ to 13 17

DK 1516 3 8 B

Det ses af de ovenfor anførte data, at alene tørring af filterkagen, uden recirkulerede findele, ikke kan præstere den forøgede hårdhed, der frembringes ved kontrolleret tilsætning af 5 findele.

I alle de ovennævnte eksempler er recirkulerede findele tilsat den fugtige filterkage lige før extrudering. Det efterfølgende eksempel beskriver effekten af at tilsætte recirkulerede findele til bakteriecel leaggregater før filtrering.

10 EKSEMPEL 5

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev fulgt til fremstilling af en bakteriecelleaggregatopslæmning i en opbevaringstank før filteret. Recirkulerede findele af bakteriecel leaggregat blev derefter tilsat til en portion af tankens indhold i en mængde på 30 vægtprocent 15 baseret på den samlede tørvægt. Den resulterende blanding såvel som den ubehandlede portion blev separat filtreret, extruderet gennem 8 huller med en diameter på 1,59 mm (1/16-in.) under anvendelse af en ikke-komprimerende snegl med 80 omdr/mm, tørret, formalet og adskilt ifølge eksempel 1. Den behandlede prøve, der fik 20 tilført recirkulerede findele, havde en hårdhed der var 45,15% større end den ubehandlede kontrol. Det ses således, at tilsætning af recirkulerede findele af bakteriecelleaggregat efter dannelsen og før extrudering af et bakteriecelleaggregat væsentligt kan forbedre hårdheden af de resulterende, formede aggregatpartikler.

25 Bakterieaggregater fremstillet på den måde, der er beskrevet ovenfor, var alle i stand til at omdanne glucose til fructose. Glucose-isomeraseaktiviteten var ikke svækket ved brug af denne nye metode.

30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et formet bakteriecelleaggregat, hvor en bakteriecellemasse kontaktes med et tværbindings- 5 middel, kendetegnet ved, at bakteriecellemassen kontaktes med et tværbindingsmiddel, som er et reaktionsprodukt af (1) et materiale udvalgt fra klassen bestående af giutaraldehyd, cyanur-syrehalid eller kombinationer heraf og (2) en vandopløselig kationpoiymer opnået ved polymerisation af en epihalohydrin med en 10 alkylenpolyamin, der har formlen R-jRgNRNl·^/ hvor R er en alkylen-gruppe, der har fra 2 til ca. 6 carbonatomer, og R-j og Rg hver er en alkylgruppe med fra 1 til ca. 6 carbonatomer, hvor molforholdet epihalohydrin til polyamin er på fra ca. 0,60:1 til ca. 2,7:1, hvilken polymerisation omfatter, at der med alkylenpolyaminen omsættes fra 15 ca. 50 til ca. 90% af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reaktionen får lov til at fortsætte, indtil reaktionsmediet opnår en i alt væsentligt jævn viskositet, og at den resterende portion af epihalohydrinet omsættes trinvis til opnåelse af den kationiske polymer, idet polymerisationstemperaturen er på fra 20 ca. 60°C til ca. 120°C, hvorpå det resulterende aggregat tilsættes en portion tidligere fremstillet, tørret findelt bakteriecelleaggregat af samme sammensætning med en partikelstørrelse mindre end 0,71 mm sigtemaskestørrelse, hvorefter blandingen formes, tørres, formales og ' adskilles til frembringelse af sigtede ønskede partikler med en 25 partikelstørrelse over ca. 0,71 mm sigtemaskestørrelse og partikler med en partikelstørrelse under ca. 0,71 mm sigtemaskestørrelse, som recirkuleres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det tørrede, findelte bakteriecelleaggregat tilsættes til bakterie- 30 celleaggregatet i en mængde på op til ca. 70 vægtprocent baseret på blandingens samlede tørstofvægt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det tørrede, findelte bakteriecelleaggregat tilsættes til bakteriecel leaggregatet i en mængde på fra ca. 5 til ca. 70 vægtprocent 35 baseret på blandingens samlede tørstofvægt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det tørrede, findelte bakteriecelleaggregat tilsættes til bakterie-celleaggregatet i en mængde på omkring 30 vægtprocent baseret på blandingens samlede tørstofvægt. DK 151638 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bakteriecellerne er af arten Streptomyces olivaceus.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tværbindingsmidlet er fremkommet ved omsætning af fra ca. 12 til 5 ca. 77 vægtprocent af komponent (1) og fra ca. 23 til ca. 88 vægtprocent af komponent (2) baseret på den samlede vægt af de aktive ingredienser i komponenterne (1) og (2). 10 15 20 25 30 35