CN115386145B

CN115386145B - 复合海绵及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115386145B
Application number: CN202210519036.5A
Authority: CN
Inventors: 周祺惠; 邵天意; 闫铭喆
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-05-13
Also published as: CN115386145A

Abstract

本发明提供了一种复合海绵及其制备方法和应用，涉及高分子复合材料技术领域，本发明提供的复合海绵，包括负载有消炎药物的壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物，其中，壳聚糖/磷酸钙微花内富含钙、磷为成骨分化提供原料，复合海绵内的海藻酸钙可以促进钙离子的释放促进生理性止血过程，消炎药物可以实现高效抗菌。本发明创造性地选择壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物，能够通过Ca²⁺交联、冻干和静电吸附相互作用，增强抗菌、止血和成骨功能，特别是能够有效预防拔牙后干槽症的发生。

Description

复合海绵及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子复合材料技术领域，尤其是涉及一种复合海绵及其制备方法和应用。

背景技术

拔牙是牙科的一种常规手术，通常会造成很大的牙槽伤口。特别是对于严重的牙周炎患者，拔牙往往会导致大量出血、术后感染和骨吸收，从而影响后续的修复和种植治疗，增加干槽症的风险。干槽症，也称为局限性牙槽骨炎，常常发生在血凝块不能收缩或纤维蛋白溶解时，可引起下颌骨至耳颞区明显疼痛，并可引起局部淋巴结炎、口臭，影响患者咀嚼及口腔卫生的维持。患者在拔牙后经常常规口服甲硝唑(MD)7-14天，可促进细菌DNA螺旋结构的破裂，阻断细菌DNA的复制，杀死细菌，达到抗菌的目的。然而，长期口服大剂量MD可发生食欲减退、恶性肿瘤、呕吐、腹泻、便秘、腹部绞痛等不良反应。为了预防干槽症，人们对许多生物有机材料进行了研究，如洗必泰凝胶和富血小板纤维蛋白(PRF)。洗必泰凝胶具有明显的抗菌性能，但由于其流动性强，容易从牙槽内流出。PRF则因为制备难度大受到限制。因此，开发具有良好抗菌、止血和成骨能力的生物多功能材料，以保护牙槽创面，防止拔牙后牙槽干燥是临床应用的迫切需要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种复合海绵，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的目的之二在于提供上述复合海绵的制备方法。

本发明的目的之三在于提供上述复合海绵的用途。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种复合海绵，包括负载有消炎药物的壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物。

进一步的，所述消炎药物包括甲硝唑。

本发明还提供了上述的复合海绵的制备方法，包括如下步骤：

(a)向壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入钙盐溶液后冷冻干燥，得到壳聚糖/磷酸钙微花；

(b)将步骤(a)得到的壳聚糖/磷酸钙微花加入海藻酸盐溶液中得到混合溶液，冷冻干燥后，得到第一海绵；

(c)将步骤(b)得到的第一海绵放入钙盐交联剂内交联后冷冻干燥，得到第二海绵；

(d)将消炎药物加入步骤(c)得到的第二海绵内，冷冻干燥，得到所述复合海绵。

进一步的，步骤(a)中用一锅法制备壳聚糖/三聚磷酸钠溶液；

优选地，将壳聚糖溶于乙酸溶液中得到壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液内加入三聚磷酸钠并搅拌，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液；

优选地，将0.1～0.5g壳聚糖溶于1～5％v/v乙酸溶液中得到壳聚糖溶液，向150mL所述壳聚糖溶液内加入120～130mg/mL三聚磷酸钠60mL，室温下搅拌，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液；

优选地，将0.3g壳聚糖溶于1％v/v乙酸溶液中得到2mg/mL的壳聚糖溶液，向150mL所述壳聚糖溶液内加入125mg/mL三聚磷酸钠60mL，室温下搅拌10min，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

进一步的，步骤(a)中，所述钙盐包括CaCl₂；

优选地，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入CaCl₂溶液，离心后用双蒸水清洗三次，然后冷冻干燥，得到所述壳聚糖/磷酸钙微花；

优选地，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入8～15mg/mL CaCl₂溶液 210mL；

优选地，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入11mg/mL CaCl₂溶液210 mL，在5500rpm下离心20min，用双蒸水清洗三次，然后在-50℃下冷冻干燥48h，得到所述壳聚糖/磷酸钙微花。

进一步的，步骤(b)中，所述海藻酸盐溶液的浓度为1～5％w/v，优选为2％w/v；

优选地，将1～5g壳聚糖/磷酸钙微花加入300mL海藻酸盐溶液中得到混合溶液；

优选地，所述壳聚糖/磷酸钙微花的加入量为4g。

进一步的，步骤(b)还包括将混合溶液倒入模具中的步骤；

优选地，所述模具包括石蜡制作的牙根模具。

进一步的，步骤(c)中，所述钙盐交联剂包括含CaCl₂、甘油和乙醇的交联剂，优选CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为1～10:1～5:80～100，优选为 7:3:90；

优选地，将步骤(b)得到的第一海绵放入CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为7:3:90的钙盐交联剂内浸泡4h，用双蒸水清洗三次后在-50℃下冷冻干燥48h，得到第二海绵。

进一步的，步骤(d)中，所述消炎药物包括甲硝唑，优选为5～15mg/mL 的甲硝唑溶液，更优选为10mg/mL的甲硝唑溶液。

此外，本发明还提供了上述的复合海绵或采用上述的制备方法制备得到的复合海绵在口腔外科中的应用，优选在制备止血、抗菌和促进成骨分化的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的复合海绵，包括负载有消炎药物的壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物，其中，壳聚糖/磷酸钙微花内富含钙、磷为成骨分化提供原料，复合海绵内的海藻酸钙可以促进钙离子的释放促进生理性止血过程，消炎药物可以实现高效抗菌。本发明创造性地选择壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物，能够通过Ca²⁺交联、冻干和静电吸附相互作用，增强抗菌、止血和成骨功能，特别是能够有效预防拔牙后干槽症的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1中的A为止血过程图片，B为540nm下双蒸水OD值检测，*表示p＜0.05，***表示p＜0.001；

图2中的A为琼脂平板上与海绵和细菌共培养的金黄色葡萄球菌菌落， B为海绵对金黄色葡萄球菌杀灭效果的定量分析，C为海绵对大肠杆菌杀灭效果的定量分析，*表示p＜0.05；

图3中的A为复合海绵共培养7和14d后，MC3T3-E1细胞胞内ALP 染色，B为复合海绵共培养7和14d后，MC3T3-E1细胞胞内ALP活性定量分析，*表示p＜0.05，***表示p＜0.001；

图4中的A为海绵孔隙率定量分析，B为海绵溶胀率定量分析；

图5为CA/CM@MD海绵宏观图片；

图6为扫描电镜(SEM)下拍摄的图片(A)CM(B)CA(C)CM@CA(D) CM@CA/MD。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

海藻酸钙(CA)具有生物相容性好、成本低、吸水率高、与红细胞(RBC) 聚集止血、活化血小板和凝血因子(VII、IX、X)等优点，被广泛应用于组织工程、给药、创面敷料等领域。但仍存在一些不足，如大出血时止血效率不高、无法抑制病原体感染和无法促进成骨分化等。海洋多糖具有优良的生物降解性、细胞相容性和出色的固有理化功能，是一种很有前途的创面修复材料候选材料，其中壳聚糖(CS)通过在红细胞膜表面聚阳离子和阴离子的结合，使红细胞凝集，激活血小板聚集，从而实现快速止血。此外，表面聚正离子与微生物膜的负电荷相互作用，导致细菌中蛋白质等细胞成分的泄漏，产生抗菌作用。然而，无论是CS粉还是CS海绵都没有合适的机械性能支持直接拔牙后治疗。

壳聚糖/磷酸钙微花(CM)作为一种分层多孔微/纳米结构材料，其中的钙、磷提供了成骨所必需的元素，有利于促进成骨分化。CM的主要基底物质壳聚糖(CS)拥有优异的生物相容性和止血、抗菌性能，并通过离子凝胶与三聚磷酸钠(TPP)交联，组成CM的核心部分，使其拥有更高的刚度和硬度，并使得磷酸钙晶体在其表面不断附着生长，形成微花状粒子。与沸石等无机止血材料相比，CM具备多孔结构孔隙率高，比表面积大，与水接触时无放热反应等优点。

基于此，第一方面，本发明提供了一种复合海绵，包括负载有消炎药物的壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物。

其中，壳聚糖/磷酸钙微花内富含钙、磷为成骨分化提供原料，复合海绵内的海藻酸钙可以促进钙离子的释放促进生理性止血过程，消炎药物可以实现高效抗菌。本发明创造性地选择壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物，能够通过Ca²⁺交联、冻干和静电吸附相互作用，增强抗菌、止血和成骨功能，特别是能够有效预防拔牙后干槽症的发生。

需要说明的是，本发明所述“壳聚糖/磷酸钙微花”中的壳聚糖不限于壳聚糖本身，其他具备特殊拓扑结构的壳聚糖基止血材料、止血药物、含血小板类止血材料也可以起到止血的效果。

为了进一步增强本发明提供的复合海绵的抗菌能力，同时更适于口腔外科应用，优选甲硝唑、红霉素或氧氟沙星作为消炎药物。

根据本发明的第二个方面，提供了上述复合海绵的制备方法，包括如下步骤：

本发明提供的复合海绵的制备方法，工艺简单，操作方便，对专业技术及设备均要求较低，适合工业化大规模生产。并且，通过静电吸附、钙离子交联以及冷冻干燥原理制备得到的复合海绵，实现了拔牙后有效的抗菌、止血与成骨分化，为拔牙后预防干槽症提供了一种新的治疗方法。

在一些优选的实施方式中，步骤(a)中用一锅法制备壳聚糖/三聚磷酸钠溶液，具体地，将壳聚糖(CS，脱乙酰度90％)溶于乙酸溶液中得到壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液内加入三聚磷酸钠(TPP)并搅拌，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

其中，所述壳聚糖的用量为0.1～0.5g，例如可以为，但不限于0.1g、0.2 g、0.3g、0.4g或0.5g；乙酸溶液的浓度为1～5％v/v，例如可以为，但不限于1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v或5％v/v；三聚磷酸钠的浓度为120～130 mg/mL，例如可以为，但不限于120mg/mL、122mg/mL、125mg/mL、128mg/mL或130mg/mL。

更优选地，将0.3g壳聚糖溶于1％v/v乙酸溶液中得到2mg/mL的壳聚糖溶液，向150mL所述壳聚糖溶液内加入125mg/mL三聚磷酸钠60mL，室温下搅拌10min，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

在本实施方式中，加入TPP的目的是为壳聚糖/磷酸钙微花的形成提供核心，同时部分TPP分解产生P₂O₇ ^4-离子吸附于CS-TPP复合物上，在下一步与Ca²⁺一起形成Ca₂P₂O₇晶体，从而生长为微花。

在一些优选的实施方式中，步骤(a)中，所述钙盐包括CaCl₂，加入 CaCl₂的目的是使Ca²⁺离子与P₂O₇ ^4-结合形成Ca₂P₂O₇晶体，并在CS-TPP 网格上各向异性地生长形成微花。

其中，CaCl₂溶液的浓度为8～15mg/mL，例如可以为，但不限于8 mg/mL、10mg/mL、12mg/mL或15mg/mL；CaCl₂溶液的加入量为210mL。

优选地，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入11mg/mL CaCl₂溶液 210mL，在5500rpm下离心20min，用双蒸水清洗三次，然后在-50℃下冷冻干燥48h，得到所述壳聚糖/磷酸钙微花。

在一些优选的实施方式中，步骤(b)中，所述海藻酸盐溶液的浓度为 1～5％w/v，例如可以为，但不限于1％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v或 5％w/v，优选为2％w/v；所述海藻酸盐溶液的用量为300mL。所述壳聚糖 /磷酸钙微花的加入量为1～5g，例如可以为，但不限于1g、2g、3g、4g 或5g，优选为4g。

优选地，将4g壳聚糖/磷酸钙微花加入浓度为2％w/v的300mL海藻酸盐溶液中得到混合溶液。

在一些优选的实施方式中，步骤(b)还包括将混合溶液倒入模具中的步骤，在模具中直接形成复合海绵，省去后期额外的成型步骤，有效节约时间成本，操作更便捷。并且，在模具内冷冻干燥还能够使得到的复合海绵贴合拔牙后的伤口。优选地，所述模具包括石蜡制作的牙根模具，牙根形状的复合海绵，可以更好的跟牙槽窝贴合而发挥止血、抗菌和促进成骨的作用。

在一些优选的实施方式中，步骤(c)中，所述钙盐交联剂包括含CaCl₂、甘油和乙醇的交联剂，优选CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为1～10:1～5:80～100，例如可以为，但不限于1:1:80、1:5:80、10:1:100、5:2:90等，优选为7:3:90。当选择特定组成和配比的钙盐交联剂时，能够进一步提升壳聚糖/磷酸钙微花与第一海绵的交联效果。

作为优选，可以将步骤(b)得到的第一海绵放入CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为7:3:90的钙盐交联剂内浸泡4h，用双蒸水清洗三次后在-50℃下冷冻干燥48h，得到第二海绵。

在一些优选的实施方式中，步骤(d)中，所述消炎药物包括甲硝唑 (MD)，加入MD的目的是提升复合海绵的抗菌能力。优选为5～15mg/mL 的甲硝唑溶液，例如可以为，但不限于5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12 mg/mL或15mg/mL，更优选为10mg/mL的甲硝唑溶液。

通过上述各用量参数的筛选和优化，制备得到的复合海绵具有更优良的性能。

基于本发明提供的复合海绵具有优良弹性、高孔隙率和高比表面积的优异结构特征，同时负载消炎药物所带来良好的抗菌功能，本发明还提供了该复合海绵在口腔外科中的应用，尤其是在制备止血、抗菌和促进成骨分化的产品中的应用。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1

本实施例提供了一种复合海绵，通过如下方法制备得到：

a、采用一锅法制备壳聚糖/磷酸钙微花。将0.3g壳聚糖(CS，脱乙酰度90％)溶于1％v/v乙酸溶液中得到2mg/mL的壳聚糖溶液，向150mL 壳聚糖溶液内加入125mg/mL三聚磷酸钠(TPP)60mL，室温下搅拌10min。

b、在搅拌的同时向步骤a得到的溶液中加入11mg/mL CaCl₂溶液210 mL，在5500rpm下离心20min，用双蒸水清洗三次，然后在-50℃下冷冻干燥48h。

c、用石蜡制作牙根模具。向每100mL双蒸水中加入2g海藻酸盐(AG)，得到2％w/v的AG溶液。在搅拌条件下将4g微花加入300mLAG溶液内，溶液倒入模具内后冷冻干燥，得到第一海绵。

d、将步骤c制得的第一海绵放入含CaCl₂/甘油/乙醇质量比例为7:3:90 的交联剂内浸泡4h，用双蒸水清洗三次后在-50℃下冷冻干燥48h，得到第二海绵(CA@CM海绵)。

e、将10mg/mL的MD溶液滴加到交联剂处理过的海绵内，再次冷冻干燥，最终得到复合海绵(CA@CM/MD海绵)。

对比例1

本对比例提供了一种复合海绵，通过如下方法制备得到：

a、100mL双蒸水中加入2gAG，得到2％w/v的AG溶液，溶液导入模具内后冷冻干燥。

b、将步骤a制得的海绵放入含CaCl₂/甘油/乙醇质量比例为7:3:90的交联剂内浸泡4h，用双蒸水清洗三次后在-50℃下冷冻干燥48h，得到CA海绵。

对比例2

本对比例提供了一种复合海绵，通过如下方法制备得到：

实验例1.止血效果检测

将200μL血液滴加至海绵表面，在37℃下孵育15min后向血块边缘轻轻滴加5mL双蒸水，将未凝固的红细胞溶解后在540nm波长下检测吸光度(OD)值，OD值越低则代表双蒸水中残留血红蛋白越少，止血效果越好。

如图1中的A显示，与CA和CA@CM组相比，CA@CM/MD组水中血迹较浅，残留面积较小，血液凝固效果最好。如图1中的B显示CA@CM 组OD值低于CA组，加入MD的CA@CM/MD组OD值更低，表明止血能力进一步提高，这可能与Ca²⁺释放增多有关。

实验例2.抗菌效果检测

将浓度为1×10⁶CFU/mL的黄金葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于海绵上，37℃下孵育8h后将10μL菌液接种于胰蛋白酶大豆肉汤和LB培养基琼脂平板上，37℃培养24h后计数菌落数量。

如图2中的A显示，经过CA@CM/MD处理后，黄金葡萄球菌和大肠杆菌菌落数量相较于CA和CA@CM组明显变少。如图2中的B与C显示， CA@CM/MD对金黄色葡萄球菌的杀灭率在50％以上且对大肠杆菌的杀灭率在99％以上，抗菌能力远高于CA和CA@CM组。

实验例3.成骨趋势检测

将海绵在成骨诱导培养基中浸泡24h，过滤得到提取液。将MC3T3-E1 细胞以2×10⁴个/孔的密度接种在孔板中，在37℃，5％CO₂条件下在提取液孵育7与14d，随后进行碱性磷酸酶染色与碱性磷酸酶表达的定量分析。

胞内碱性磷酸酶(ALP)在染色中呈蓝色沉淀，如图3中的A显示， CA@CM和CA@CM/MD组胞内ALP的表达高于空白组和CA组；引入 CM后，CA@CM和CA@CM/MD组之间没有显着差异。经过14d的培养，各组ALP的表达量均较7d有所增加。值得注意的是，CA@CM和 CA@CM/MD的ALP表达区域多于空白组和CA组。如图3中的B显示， CA@CM和CA@CM/MD组胞内ALP的表达远远高于空白和CA组。微花含有的钙和磷元素为成骨分化提供了重要的矿物质元素，促进了成骨分化过程。

实验例4.机械性能检测

采用液体置换法测量海绵的孔隙率。测量海绵体积(V)后将其置于真空环境中干燥(35℃，30min)，称量海绵的质量(W1)，然后将样品浸入无水乙醇内至饱和，记录饱和后的质量(W2)。根据如下公式计算孔隙率：

Porosity(％)＝(W₂-W₁)/(p×V)×100％,ρ为无水乙醇密度。

通过复合海绵在磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中的重量变化计算最大溶胀率。记录海绵初始质量为W_s，将海绵浸入PBS内2h，充分溶胀后取出样品，记录其质量为W_d，根据如下公式来计算溶胀率：

Swelling ratio(％)＝(W_s-W_d)/W_d×100％

如图4中的A显示，CA海绵的孔隙率为54.73±11.43％。随着CM的引入，定量分析表明CA@CM和CA@CM/MD的孔隙率增加，高孔隙率有利于保持湿润的环境，促进与血液的相互作用，快速止血，形成有效覆盖伤口的血凝块，阻止病原微生物通过物理屏障与伤口和神经接触，还有利于细胞成骨分化，加速伤口愈合。

如图4中的B显示，加入CM后复合海绵的溶胀率明显降低，可能的原因是CM不具备吸水性并增大了材料的密度，但所有复合海绵的最大溶胀率仍然在750％以上，其优异的溶胀能力不仅可以有效吸收创面渗出液，促进营养物质的扩散，还可以通过浓度梯度促进MD释放，避免污染，促进创面愈合。

实验例5.CA@CM/MD海绵形貌特征

在制作过程中，海绵的成型在牙根型模具内完成，如图5显示， CA/CM@MD海绵具有牙根的形状，能够很好地贴合牙槽骨，防止血液渗漏。

在扫描电子显微镜下对各合成阶段的材料进行表征。如图6A显示， CM直径在3-6μm范围内，表现出均匀的3D微花结构。图6B-D显示，所有海绵均为3D多孔结构，有利于MD的储存，加入CM后出现球状凸起，加入MD后球状凸起仍然存在，表明CM结合并覆盖于CA表面，并且不会因为MD的加入而丢失。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种复合海绵，其特征在于，包括负载有消炎药物的壳聚糖/磷酸钙微花与海藻酸钙的交联物；

所述消炎药物包括甲硝唑、红霉素或氧氟沙星；

所述复合海绵的制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(a)中用一锅法制备壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

3.根据权利要求2所述的复合海绵，其特征在于，将壳聚糖溶于乙酸溶液中得到壳聚糖溶液，向所述壳聚糖溶液内加入三聚磷酸钠并搅拌，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

4.根据权利要求3所述的复合海绵，其特征在于，将0.1～0.5g壳聚糖溶于1～5％v/v乙酸溶液中得到壳聚糖溶液，向150mL所述壳聚糖溶液内加入120～130mg/mL三聚磷酸钠60mL，室温下搅拌，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

5.根据权利要求4所述的复合海绵，其特征在于，将0.3g壳聚糖溶于1％v/v乙酸溶液中得到2mg/mL的壳聚糖溶液，向150mL所述壳聚糖溶液内加入125mg/mL三聚磷酸钠60mL，室温下搅拌10min，得到所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液。

6.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(a)中，所述钙盐包括CaCl₂。

7.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(a)中，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入CaCl₂溶液，离心后用双蒸水清洗三次，然后冷冻干燥，得到所述壳聚糖/磷酸钙微花。

8.根据权利要求7所述的复合海绵，其特征在于，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入8～15mg/mL CaCl₂溶液210mL。

9.根据权利要求8所述的复合海绵，其特征在于，向所述壳聚糖/三聚磷酸钠溶液中加入11mg/mL CaCl₂溶液210mL，在5500rpm下离心20min，用双蒸水清洗三次，然后在-50℃下冷冻干燥48h，得到所述壳聚糖/磷酸钙微花。

10.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(b)中，所述海藻酸盐溶液的浓度为1～5％w/v。

11.根据权利要求10所述的复合海绵，其特征在于，所述海藻酸盐溶液的浓度为2％w/v。

12.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(b)中，将1～5g壳聚糖/磷酸钙微花加入300mL海藻酸盐溶液中得到混合溶液。

13.根据权利要求12所述的复合海绵，其特征在于，所述壳聚糖/磷酸钙微花的加入量为4g。

14.根据权利要求10所述的复合海绵，其特征在于，步骤(b)还包括将混合溶液倒入模具中的步骤。

15.根据权利要求14所述的复合海绵，其特征在于，所述模具包括石蜡制作的牙根模具。

16.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，步骤(c)中，所述钙盐交联剂包括含CaCl₂、甘油和乙醇的交联剂。

17.根据权利要求16所述的复合海绵，其特征在于，所述CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为1～10:1～5:80～100。

18.根据权利要求17所述的复合海绵，其特征在于，所述CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为7:3:90。

19.根据权利要求1所述的复合海绵，其特征在于，将步骤(b)得到的第一海绵放入CaCl₂、甘油和乙醇的质量比为7:3:90的钙盐交联剂内浸泡4h，用双蒸水清洗三次后在-50℃下冷冻干燥48h，得到第二海绵。

20.根据权利要求1-19任一项所述的复合海绵，其特征在于，步骤(d)中，所述消炎药物包括甲硝唑。

21.根据权利要求20所述的复合海绵，其特征在于，步骤(d)中，所述消炎药物包括5～15mg/mL的甲硝唑溶液。

22.根据权利要求21所述的复合海绵，其特征在于，步骤(d)中，所述消炎药物包括10mg/mL的甲硝唑溶液。

23.权利要求1～22任一所述的复合海绵在制备止血、抗菌和促进成骨分化的产品中的应用。