CN109701070A - 一种抗菌杂化纳米花止血材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌杂化纳米花止血材料及其制备方法,所述方法首先利用磷酸根和钙离子在三聚磷酸钠(TPP)‑壳聚糖(CS)纳米复合物表面的有序自组装制备杂化纳米花,然后在其表面构筑仿贻贝聚多巴胺涂层,并利用聚多巴胺的还原性原位生成银纳米颗粒。花状多级结构能够提供高的比表面积和高孔隙率,结合表面的聚多巴胺涂层,使其具有超高亲水性和优异的组织黏附性,在快速吸收血液中水分、增大血小板浓度、止血性能显著提高的同时不会产生过多热量。同时,聚多巴胺直接还原在纳米花表面原位生成银纳米颗粒,赋予材料高效抗菌作用,在高效止血的同时,降低出血创面感染。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域,涉及一种止血材料及其制备方法,具体涉及一种抗菌杂化纳米花止血材料及其制备方法。
背景技术
局部战争、自然灾害、交通事故以及手术中引起的大量出血会严重威胁伤者生命,因此,开发快速、有效的止血剂对受伤初期的出血进行控制一直是创面治疗的关键挑战。目前,止血材料主要包括海绵状、织物、无纺布、水凝胶及粉末状材料等。粉末状止血剂由于便于携带、使用简单方便、对伤口贴合度高等优点而拥有不错的使用效果。目前最常用的无机粉末状止血材料为沸石类和粘土类,其中最常见的是沸石介孔类止血剂。沸石介孔类止血剂可通过快速吸收血液中的液体,使血小板、红细胞聚集,加速凝血因子的释放,从而达到快速止血的目的。然而,该类材料遇水、沾湿后会产生灼热感,在使用前需应用纱布预先清除伤口处的水分、血液等液体,此外该类止血剂湿黏附性弱,仅适用于轻、中度出血。为了降低材料的放热和提高组织粘附性,CN 108721682 A提出使用漆酚修饰介孔二氧化硅微球,赋予其具有组织粘附性的儿茶酚基团,得到一种具有良好湿粘附性的止血材料;CN104013990中公开了一种通过将壳聚糖与多巴胺或具有儿茶酚基结构的化合物反应,制备具有儿茶酚结构的壳聚糖材料,据称制成的止血海绵具有很好的组织亲合性;CN107998442 A公开了一种纳米二氧化硅/聚多巴胺黏附型止血材料,对于不同基底具有非常好的黏附性能,同时对血液具有较强的黏附性能。但以上专利报道的止血材料不同时具有抗菌活性,当发生大量出血时,往往同时伴随暴露的伤口区域,这个暴露的区域很容易被细菌侵入,导致严重的菌血症反应甚至危及生命。
发明内容
本发明为了解决现有无机介孔类止血材料容易放热灼烧皮肤组织、粘附性差以及无抗菌活性等问题,提供了一种抗菌杂化纳米花止血材料及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,包括如下步骤:
步骤一:称取壳聚糖溶解于乙酸水溶液中,得到浓度1~5mg/mL的壳聚糖水溶液,控制乙酸水溶液中乙酸的浓度为0.5~3wt%,壳聚糖脱乙酰度在70%以上;使用蒸馏水配制浓度为50~250mg/mL的三聚磷酸钠水溶液;使用蒸馏水配制浓度为50~200mM的氯化钙水溶液;
步骤二:将步骤一配制的三聚磷酸钠水溶液逐步滴加到壳聚糖水溶液中搅拌孵育,得到纳米复合物悬浮液;控制三聚磷酸钠水溶液/壳聚糖水溶液的体积比为15/85~60/40;孵育的温度为10~40℃,时间为5~30min;
步骤三:将步骤二得到的纳米复合物悬浮液逐步滴加到步骤一配制的氯化钙水溶液中搅拌孵育,得到白色沉淀,离心并用蒸馏水冲洗,然后冷冻干燥,得到壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料;控制纳米复合物悬浮液/氯化钙水溶液的体积比为25/75~40/60;孵育的温度为10~40℃,时间为10~20min;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa;
步骤四:配制多巴胺浓度为0.8~2mg/mL的乙醇/水溶液,加入三羟甲基氨基甲烷,调节pH值在8.3~8.6之间;控制乙醇/水的体积比在60/40~20/80之间;
步骤五:将步骤三得到的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料放入步骤四所得溶液中搅拌孵育,离心并用蒸馏水冲洗,得到黑色沉淀,然后冷冻干燥,得到聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料;控制孵育的时间为12~36h,温度为10~40℃;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa;
步骤六:将步骤五所得聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料浸入浓度为0.2~2mg/mL的硝酸银水溶液中浸渍,离心,蒸馏水冲洗,然后冷冻干燥,得到抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料;控制浸渍的时间为5~10h,温度为10~30℃;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa。
本发明首先利用磷酸根和钙离子在三聚磷酸钠(TPP)-壳聚糖(CS)纳米复合物表面的有序自组装制备杂化纳米花(图1),然后在其表面构筑仿贻贝聚多巴胺涂层,并利用聚多巴胺的还原性原位生成银纳米颗粒(图1、图2)。相比于现有技术,本发明具有如下优点:
1、花状多级结构能够提供高的比表面积和高孔隙率,结合表面的聚多巴胺涂层,使其具有超高亲水性和优异的组织黏附性,在快速吸收血液中水分、增大血小板浓度、止血性能显著提高的同时不会产生过多热量。
2、聚多巴胺直接还原在纳米花表面原位生成银纳米颗粒,赋予材料高效抗菌作用,在高效止血的同时,降低出血创面感染。
3、制备原料以壳聚糖、氯化钙等常见材料为主,所得材料杂质少,纯度高,生物安全性好。
4、制备过程以水作为溶剂,条件温和、绿色环保、成本低廉,可大批量工业生产,具有良好的应用和商业前景。
附图说明
图1为抗菌杂化纳米花止血材料SEM照片;
图2为抗菌杂化纳米花止血材料EDS照片;
图3为抗菌杂化纳米花止血材料细胞毒性测试结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1:
本实施例中,抗菌杂化纳米花血材料的制备方法按照以下步骤进行:
步骤(1)称取脱乙酰度为85%的壳聚糖溶解于1wt%乙酸水溶液中,得到浓度1mg/mL的壳聚糖水溶液;使用蒸馏水配制浓度为150mg/mL的三聚磷酸钠水溶液;使用蒸馏水配制浓度为100mM的氯化钙水溶液;
步骤(2)将步骤(1)配制的三聚磷酸钠水溶液逐步滴加到壳聚糖水溶液中,控制三聚磷酸钠水溶液/壳聚糖水溶液的体积比为30/70,在25℃下搅拌孵育10min,得到纳米复合物悬浮液;
步骤(3)将步骤(2)得到的纳米复合物悬浮液逐步滴加到步骤(1)配制的氯化钙水溶液中,控制纳米复合物悬浮液/氯化钙水溶液的体积比为25/75,在25℃下搅拌孵育10min得到白色沉淀,离心并用蒸馏水冲洗,然后在温度为-40℃、真空度为15Pa的条件下冷冻干燥,得到壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(4):配制多巴胺浓度为1mg/mL的乙醇/水溶液,其中乙醇/水的体积比为50/50,加入三羟甲基氨基甲烷,调节pH值为8.5。
步骤(5):将步骤(3)得到的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料放入步骤四所得溶液中,在25℃下搅拌孵育24h后,离心并用蒸馏水冲洗,得到黑色沉淀,在温度为-40℃、真空度为15Pa的条件下冷冻干燥,得到聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(6):将步骤(5)所得聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料浸入浓度为0.5mg/mL的硝酸银水溶液中,在25℃下浸渍5h后离心,蒸馏水冲洗,并在温度为-40℃、真空度为15Pa的条件下冷冻干燥,得到抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
实施例2:
本实施例中,抗菌杂化纳米花血材料的制备方法按照以下步骤进行:
步骤(1)称取脱乙酰度为75%的壳聚糖溶解于1.5wt%乙酸水溶液中,得到浓度2mg/mL的壳聚糖水溶液;使用蒸馏水配制浓度为100mg/mL的三聚磷酸钠水溶液;使用蒸馏水配制浓度为80mM的氯化钙水溶液;
步骤(2)将步骤(1)配制的三聚磷酸钠水溶液逐步滴加到壳聚糖水溶液中,控制三聚磷酸钠水溶液/壳聚糖水溶液的体积比为40/60,在28℃下搅拌孵育20min,得到纳米复合物悬浮液;
步骤(3)将步骤(2)得到的纳米复合物悬浮液逐步滴加到步骤(1)配制的氯化钙水溶液中,控制纳米复合物悬浮液/氯化钙水溶液的体积比为30/70,在28℃下搅拌孵育20min得到白色沉淀,离心并用蒸馏水冲洗,然后在温度为-30℃、真空度为10Pa的条件下冷冻干燥,得到壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(4):配制多巴胺浓度为2.0mg/mL的乙醇/水溶液,其中乙醇/水的体积比为30/70,加入三羟甲基氨基甲烷,调节pH值为8.4。
步骤(5):将步骤(3)得到的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料放入步骤四所得溶液中,在28℃下搅拌孵育12h后,离心并用蒸馏水冲洗,得到黑色沉淀,在温度为-40℃、真空度为15Pa的条件下冷冻干燥,得到聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(6):将步骤(5)所得聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料浸入浓度为1mg/mL的硝酸银水溶液中,在28℃下浸渍8h后离心,蒸馏水冲洗,并在温度为-40℃、真空度为15Pa的条件下冷冻干燥,得到抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
实施例3:
本实施例中,抗菌杂化纳米花血材料的制备方法按照以下步骤进行:
步骤(1)称取脱乙酰度为80%的壳聚糖溶解于2.5wt%乙酸水溶液中,得到浓度3mg/mL的壳聚糖水溶液;使用蒸馏水配制浓度为200mg/mL的三聚磷酸钠水溶液;使用蒸馏水配制浓度为150mM的氯化钙水溶液;
步骤(2)将步骤(1)配制的三聚磷酸钠水溶液逐步滴加到壳聚糖水溶液中,控制三聚磷酸钠水溶液/壳聚糖水溶液的体积比为35/65,在15℃下搅拌孵育15min,得到纳米复合物悬浮液;
步骤(3)将步骤(2)得到的纳米复合物悬浮液逐步滴加到步骤(1)配制的氯化钙水溶液中,控制纳米复合物悬浮液/氯化钙水溶液的体积比为35/65,在15℃下搅拌孵育15min得到白色沉淀,离心并用蒸馏水冲洗,然后在温度为-30℃、真空度为10Pa的条件下冷冻干燥,得到壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(4):配制多巴胺浓度为1.5mg/mL的乙醇/水溶液,其中乙醇/水的体积比为40/60,加入三羟甲基氨基甲烷,调节pH值为8.5。
步骤(5):将步骤(3)得到的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料放入步骤四所得溶液中,在15℃下搅拌孵育24h后,离心并用蒸馏水冲洗,得到黑色沉淀,在温度为-30℃、真空度为10Pa的条件下冷冻干燥,得到聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
步骤(6):将步骤(5)所得聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料浸入浓度为0.8mg/mL的硝酸银水溶液中,在15℃下浸渍10h后离心,蒸馏水冲洗,并在温度为-30℃、真空度为10Pa的条件下冷冻干燥,得到抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
亲水性测定实验:将样品悬浮液均匀涂覆在硅片表面,放入烘箱干燥以后,采用接触角测量仪测试其表面亲水性。测试结果表明,实施例1、2、3样品涂层的水接触角均趋于0°,表明其具有优异的亲水性。
止血效果的评价:
体外凝血实验:从新西兰大兔中采血,储存在抗凝管中备用。将抗凝全血加入含有50mg样品的试管中,加入CaCl2(0.25mol L-1),然后快速固定在静音混合器上,以45°在5rmp处摆动。记录凝结时间,每个样品重复三次。
动物止血实验:根据GB/T 16886.2-2011规定饲养和管理动物。将大鼠胸部打开,在大鼠右肝叶上切出0.5cm×0.5cm的切口,然后立即将200mg样品置于肝脏切口处,开始记录时间,不使用任何止血材料的条件下,重复上述实验操作,作为空白对照。使用红外测温仪测试创面温度。
表1体外凝血时间和大鼠肝脏止血时间
由表1试验结果证明,本发明制备的抗菌杂化纳米花止血材料的止血时间比沸石止血剂在体外凝血和大鼠肝脏止血中分别至少快39.4%和19.8%,证明抗菌杂化纳米花止血材料具有更优异的止血性能,能使止血时间大大缩短,达到快速止血的效果。此外,通过红外测温仪检测,大鼠肝脏创面使用实施例1-3制备的抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料以后无明显发热情况。
细胞毒性测试:选用成纤维细胞L929细胞,每孔按4×103个接种至96孔板中,每组设置8个复孔,置于细胞培养箱中培养,待细胞贴壁后转染相应质粒,继续培养48h后,弃含药培养基,每孔加入新鲜配制的含10μL的毒性检测液CCK8,置于培养箱中继续培养4h后,用酶标仪测波长为450nm的OD值。由图3所示结果表明:实施例1-3制备的抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料对细胞几乎无明显毒性,生物相容性好。
抗菌性能测试:将200mg样品置于无菌锥形瓶中,加入70mL磷酸盐缓冲液(0.03molL-1)和5mL金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的菌液,待液体渗入培养基中后,37℃培养45h进行菌落计数。抑菌率计算公式:X=(A-B)/A×100%,其中X为抑菌率,A为样品振荡前平均菌落数,B为样品振荡后平均菌落数。
表2抗菌实验结果
金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | |
实施例1产品 | 96% | 95% |
实施例2产品 | 98% | 98% |
实施例3产品 | 97% | 96% |
由表2可知,本发明制备的抗菌杂化纳米花止血材料具有优异的抗菌性能。
Claims (9)
1.一种抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
步骤一:称取壳聚糖溶解于乙酸水溶液中,得到浓度1~5mg/mL的壳聚糖水溶液;使用蒸馏水配制浓度为50~250mg/mL的三聚磷酸钠水溶液;使用蒸馏水配制浓度为50~200mM的氯化钙水溶液;
步骤二:将步骤一配制的三聚磷酸钠水溶液逐步滴加到壳聚糖水溶液中搅拌孵育,得到纳米复合物悬浮液;
步骤三:将步骤二得到的纳米复合物悬浮液逐步滴加到步骤一配制的氯化钙水溶液中搅拌孵育,得到白色沉淀,离心并用蒸馏水冲洗,然后冷冻干燥,得到壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料;
步骤四:配制多巴胺浓度为0.8~2mg/mL的乙醇/水溶液,加入三羟甲基氨基甲烷,调节pH值在8.3~8.6之间;
步骤五:将步骤三得到的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料放入步骤四所得溶液中搅拌孵育,离心并用蒸馏水冲洗,得到黑色沉淀,然后冷冻干燥,得到聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料;
步骤六:将步骤五所得聚多巴胺涂覆的壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料浸入浓度为0.2~2mg/mL的硝酸银水溶液中浸渍,离心,蒸馏水冲洗,然后冷冻干燥,得到抗菌壳聚糖-磷酸钙杂化纳米花止血材料。
2.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤一中,乙酸水溶液中乙酸的浓度为0.5~3wt%。
3.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤一中,壳聚糖脱乙酰度在70%以上。
4.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤二中,三聚磷酸钠水溶液/壳聚糖水溶液的体积比为15/85~60/40;孵育的温度为10~40℃,时间为5~30min。
5.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤三中,纳米复合物悬浮液/氯化钙水溶液的体积比为25/75~40/60;孵育的温度为10~40℃,时间为10~20min;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa。
6.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤四中,乙醇/水的体积比在60/40~20/80之间。
7.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤五中,孵育的时间为12~36h,温度为10~40℃;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa。
8.根据权利要求1所述的抗菌杂化纳米花止血材料的制备方法,其特征在于所述步骤六中,浸渍的时间为5~10h,温度为10~30℃;冷冻干燥的温度为-56~-20℃,真空度为10~20Pa。
9.根据权利要求1~8任一权利要求所述的制备方法得到的抗菌杂化纳米花止血材料。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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