CN107899077A - 一种稳定性增强的复合抗菌涂层及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种稳定性增强的复合抗菌涂层的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)利用壳聚糖水溶液对胶原基材进行浸泡，然后水洗去除未结合的壳聚糖；其中，壳聚糖的分子量为5万‑50万；(2)用纳米银水溶液对步骤(1)所得物进行浸泡，然后水洗去除未结合的纳米银；(3)利用EDC和NHS的混合溶液对步骤(2)所得物进行浸泡，然后水洗，之后干燥，即得所述稳定性增强的复合抗菌涂层。本发明所得复合抗菌涂层具有阻抗细菌黏附、释放杀菌剂杀菌和接触杀菌三种抗菌功能，抗菌性能优异；同时，本发明所述的复合抗菌涂层还具有优异的稳定性，适用于各种复杂的环境，尤其适用于医疗器械的表面抗菌。

Description

一种稳定性增强的复合抗菌涂层及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗菌技术领域，具体涉及一种稳定性增强的复合抗菌涂层及其制备方法和应用。
背景技术
胶原基医疗器械由于优异的生物相容性和可降解性，备受临床的青睐。国内上市的胶原基医疗器械主要有：胶原止血海绵、创伤敷料、胶原基骨修复材料及胶原基组织工程支架。但是这些医疗器械在临床使用过程中经常会引起细菌性感染，称之为生物材料相关感染，每年在全球范围内导致数十万人死于该类相关感染，已成为生物医学领域面临的严峻问题。细菌在医疗器械表面的黏附、繁殖并与其分泌的细胞外基质共同形成生物膜，是引起细菌性感染的根本原因(左彦.具有抗菌黏附和杀菌性能的高分子材料研究.南京：南京理工大学.2015)。因此，赋予医疗器械的表面抗菌性，避免细菌生物膜的形成，是解决院内感染的根本途径，也具有极其重要的意义。
依据细菌的结构特征和入侵机制一般将目前医疗器械抗菌涂层表面分为抗细菌黏附表面、接触式杀菌表面及释放抗菌剂的表面三种(Acta Biomaterialia,2015,16,1-13)。但是目前为止，上述任何一种单一涂层都不能真正达到有效抗菌的目的。抗菌黏附表面只能够阻抗细菌在医疗器械表面的黏附，但无杀菌功能。接触杀菌表面虽具有杀菌功能，但往往存在毒性大、生物相容性差的缺陷，不适合作为医疗器械的抗菌涂层。释放杀菌剂的表面可以进行局部缓释杀菌剂，但又不具备抗菌黏附的能力，依旧难于抑制细菌生物膜的形成。最重要的是，医疗器械抗菌涂层的在表面结合的稳定性依旧是一难题，长时间后，涂层容易因外力因素而被破坏和脱落，造成最终抗菌失效。因此，在医疗器械表面，特别是胶原基医疗器械表面通过简单的交联技术稳定构建同时具有阻抗细菌黏附、接触杀菌和释放杀菌剂功能抗菌涂层，能有望解决抗菌涂层的有效抗菌性。另外，除了在抗菌性能有所要求之外，由于医疗器械使用环境的特殊性，还要求抗菌涂层具有很好的抗酸洗、抗反复水浸-干燥以及抗高温等性能。在发明人的认知范围内，尚未获知可满足上述要求的抗菌涂层的报道。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种稳定性增强的复合抗菌涂层的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)利用壳聚糖水溶液对胶原基材进行浸泡，然后水洗去除未结合的壳聚糖；其中，壳聚糖的分子量为5万-50万；
(2)用纳米银水溶液对步骤(1)所得物进行浸泡，然后水洗去除未结合的纳米银；
(3)利用EDC和NHS的混合溶液对步骤(2)所得物进行浸泡，然后水洗，之后干燥，即得所述稳定性增强的复合抗菌涂层；
所述纳米银的制备方法为：
将吖内脂与多巴胺置于二甲基亚砜中，在氮氛围下，于110℃反应1h，得到产物A，再将没食子酸、产物A与硝酸银溶液按摩尔比为0.5:0.1:1进行混合，然后再逐滴滴加到冰水浴过后的浓度为硝酸银溶液6倍的NaBH4溶液中，快速搅拌，滴加完后进行陈化，即得；
所述吖内脂的化学结构式如式<Ⅰ>所示：
本发明利用了已知的具有良好抗菌性能的物质为抗菌涂层提供了良好的抗菌性。本发明抗菌涂层之所以能产生良好的抗菌性的原因在于：
由于细菌、真菌等微生物细胞膜带有负电荷，因静电排斥作用，不易黏附在多羧基的表面，所以本发明的复合涂层首先可以起到阻抗细菌黏附功能；而纳米银则可以通过缓慢释放银离子，然后银离子凋亡细菌，起到释放杀菌剂杀菌功能；复合涂层中的内层为壳聚糖，其分子链骨架上含有大量的氨基，氨基可以通过破坏细菌细胞膜而凋亡细菌，起到接触杀菌功能。这样，本发明所制备的复合涂层就有机地集成和协同了阻抗细菌黏附、释放杀菌剂杀菌、接触杀菌三种抗菌功能，从而获得了良好的抗菌性能。
不过，发明人发现，利用常规的纳米银进行抗菌涂层的制备时，其耐酸洗、耐水洗和耐高温的性能较差。通过反复的摸索之后，发明人发现，利用本发明的纳米银与壳聚糖在EDC和NHS的交联作用下，可以大幅度的提高抗菌涂层的耐酸洗、耐水洗和耐高温的性能。
不能理解的是，由于本发明的抗菌涂层具有优异的抗菌性和稳定性，其在胶原基医疗器械上特别适用。
优选的，步骤(1)中，所述壳聚糖水溶液的浓度为2～10mg/mL。
优选的，步骤(1)中，所述壳聚糖水溶液的pH值为4.0。
优选的，步骤(2)中，所述纳米银水溶液的浓度为20～200ppm。
优选的，步骤(2)中，所述纳米银水溶液的pH值为7.0。
优选的，步骤(3)中，EDC和NHS的混合溶液中，EDC与NHS的摩尔比为1:1.2。所述EDC的浓度为1～10mg/mL。
步骤(1)和/或步骤(2)中所述浸泡的时间为2～6小时；和/或，步骤(3)中所述浸泡的时间为6～12h。
本发明的另外一个目的在于提供由上述方法制备得到的稳定性增强的复合抗菌涂层。
本发明的还有一个目的在于提供上述稳定性增强的复合抗菌涂层在制备抗菌制品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明所得复合抗菌涂层具有阻抗细菌黏附、释放杀菌剂杀菌和接触杀菌三种抗菌功能，抗菌性能优异；同时，本发明所的复合抗菌涂层还具有优异的稳定性，适用于各种复杂的环境，尤其适用于医疗器械的表面抗菌。
附图说明
图1是胶原基底的FE-SEM照片；
图2是实施例1制得的胶原基底的FE-SEM照片；
图3(a)是实施例2制得的胶原基底FE-SEM照片，(b)是实施例2制得的胶原基底XPS图谱，(c)是Ag 3d的XPS谱图。
图4是实施例1、2制得的胶原基底的循环接触杀菌率；其中：(a)是胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌的循环接触杀菌率，(b)是胶原基底一小时内对大肠杆菌的循环接触杀菌率；
图5是实施例2、3制得的胶原基底的皂洗接触杀菌率；其中：(a)是胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌的接触杀菌率，(b)是胶原基底一小时内对大肠杆菌的接触杀菌率；
图6是实施例2、3制得的胶原基底的耐摩擦色牢度；
图7是实施例2、3制得的胶原基底进行往复式干摩擦1000次后宏观形貌图；其中：(a)为实施例2制得的胶原基底进行往复式干摩擦1000次后宏观形貌图，(b)为实施例3制得的胶原基底进行往复式干摩擦1000次后宏观形貌图；
图8是实施例2、3制得的胶原基底进行往复式干摩擦1000次后，胶原基底半小时内对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的接触杀菌率；
各图中，CS表示实施例1中制备得到的胶原基底，AgNP/CS表示实施例2中制备得到的胶原基底，EDC/AgNP/CS表示实施例3制备得到的胶原基底。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，除特别说明，“实施例1制备的胶原基底”表述的含义为经实施例1所述步骤制备得到的产物，其它地方，如“实施例1、实施例2中制备的胶原基底”、“实施例2中制备的胶原基底”、“实施例3中制备的胶原基底”均同此理解。
实施例1
将胶原基底浸泡至分子量为20万的壳聚糖酸性水溶液中，壳聚糖浓度为5mg/ml。浸泡4小时后，将基底取出，用去离子水充分清洗，洗掉物理吸附的壳聚糖，真空条件下干燥后，则在胶原基底上构建了第一层壳聚糖涂层。其SEM图如图2所示，胶原基底的SEM如图1所示。图1中胶原纤维束疏松多孔，具有明显的立体感；而图2中胶原纤维束由于CS的沉积包裹，胶原纤维束粘结在一起，使得胶原纤维束较图1平整，可以推断出在胶原基底上构建了一层壳聚糖涂层。
实施例2
纳米银的制备：按摩尔浓度比5:1的比例，将吖内脂与多巴胺置于二甲基亚砜中，在氮氛围下，于110℃反应1h，得到产物A，再将没食子酸、产物A与硝酸银溶液按摩尔比为0.5:0.1:1进行混合，然后再逐滴滴加到冰水浴过后的浓度为硝酸银溶液6倍的NaBH4溶液中，快速搅拌，滴加完后进行陈化，即得。
将实施例1中制备的胶原基底浸泡至纳米银水溶液中，纳米银的浓度为100ug/mL。浸泡2小时后，将基底取出，用去离子水充分清洗，洗掉物理吸附的纳米银，真空条件下干燥后，则在胶原基底上构建了第二层纳米银涂层。其SEM图如图3(a)所示，图3(a)中胶原基底表面出现大小不一的颗粒，表面较图2更粗糙，这是由于纳米银的大量沉积形成的。其XPS图如图3(b)所示，图3(b)中不仅存在Ag的吸收峰，还有Ag的特征吸收峰；Ag的特征吸收峰如图3(c)所示，图3(c)中，Ag 3d5/2出现在368.17eV处，Ag 3d3/2出现在374.16eV处，Ag 3d的双分裂峰相差5.99eV，这是典型的Ag的吸收峰。结合SEM/XPS分析结果，可以准确推断出在胶原基底上构建了第二层纳米银涂层。
实施例3：
将实施例2中制备的胶原基底浸泡至EDC/NHS的混合水溶液中，其中EDC与NHS的摩尔比为1:1.2，EDC的质量浓度为1.5mg/mL，浸泡交联8h后，充分用去离子水冲洗，经真空干燥处理后，最终获得交联的壳聚糖/纳米银复合抗菌涂层。
实施例4：
(1)将实施例1、2中制备的胶原基底剪成约1cm×1cm碎片，分别称取1.0g装入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡1h，分别取20uL振荡0h和振荡1h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
(2)将(1)中的胶原基底碎片取出，置于盛有20mL无菌水的锥形瓶中，37℃水浴振荡器中200r/min振荡30min。取出并放入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡1h，分别取20uL振荡0h和振荡1h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
(3)将(2)中的胶原基底碎片取出，置于盛有20mL无菌水的锥形瓶中，37℃水浴振荡器中200r/min振荡30min。取出并放入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡1h，分别取20uL振荡0h和振荡1h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
(4)将(3)中的胶原基底碎片取出，置于盛有20mL无菌水的锥形瓶中，37℃水浴振荡器中200r/min振荡30min。取出并放入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡1h，分别取20uL振荡0h和振荡1h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
实施例1、2中制备的胶原基底对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的循环接触杀菌率如图4(a)所示，对大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率如图4(b)所示。随着循环次数的增加，实施例1中制备的胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌的循环接触杀菌率从93％减少到82％，对大肠杆菌的循环接触杀菌率从94％减少到85％；而实施例2中制备的胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的循环接触杀菌率，虽然略有减少，但杀菌率仍能达到99％以上。实施例2中制备的胶原基底明显比实施例1中制备的胶原基底对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的循环接触杀菌效果要好，这是由于实施例2中制备的胶原基底涂层的最外层带有高密度羧基，而细菌细胞膜带有负电荷，因静电排斥作用，不易黏附在多羧基的表面，可以起到阻抗细菌黏附的功能；另外，复合涂层中的内层为壳聚糖，其分子链骨架上含有大量的氨基，氨基可以通过破坏细菌细胞膜，起到接触杀菌功能，外层的纳米银则可以通过缓慢释放银离子，起到释放杀菌剂杀菌功能，这样实施例2中制备的胶原基底就有机地集成和协同了阻抗细菌黏附、释放杀菌剂杀菌、接触杀菌三种抗菌功能。
实施例5：
(1)将实施例2、3中制备的胶原基底按照ISO 105-C10:2006标准分别洗涤0次、10次、20次、30次，真空条件下干燥。
(2)将(1)中的胶原基底剪成约1cm×1cm碎片，分别称取1.0g装入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡1h，分别取20uL振荡0h和振荡1h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
实施例2、3中制备的胶原基底按照ISO 105-C10:2006标准分别洗涤0次、10次、20次、30次后，对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的循环接触杀菌率如图5(a)所示，对大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率如图5(b)所示。随着洗涤次数的增加，实施例2中制备的胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌的循环接触杀菌率从100％减少到78％，对大肠杆菌的循环接触杀菌率从100％减少到82％；而实施例3中制备的胶原基底一小时内对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的循环接触杀菌率，虽然略有减少，但杀菌率仍能达到99％以上。实施例3中制备的胶原基底明显比实施例2中制备的胶原基底对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的循环接触杀菌效果要好，这是由于实施例3中制备的胶原基底通过EDC/NHS的催化作用将壳聚糖/纳米银复合涂层共价交联至胶原基底上，使复合涂层不易水洗掉，能够提供持久的抗菌功效。
实施例6：
(1)将实施例2、3中制备的胶原基底按照QB/T2537-2001标准分别进行往复式干摩擦20、50、100、200、500、1000次。然后以标准灰色样卡为尺度衡量基底摩擦后的色差。
(2)将(1)中往复式干摩擦1000次的胶原基底剪成约1cm×1cm碎片，分别称取1.0g装入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡0.5h，分别取20uL振荡0h和振荡0.5h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
如图6所示，实施例2中制备的胶原基底经往复式干摩擦20、50、100、200、500、1000次后，从4-5级降为1级，而实施例3中制备的胶原基底从5级降为2-3级；如图7(a)所示，实施例2中制备的胶原基底经往复式干摩擦1000次后，从黑色变为灰色，胶原基底表面涂层大部分被摩擦掉，而实施例3中制备的胶原基底如图7(b)所示，只有少许被摩擦掉；实施例2、3中制备的胶原基底按照QB/T2537-2001标准经往复式干摩擦1000次后，实施例2中制备的胶原基底半小时内对金黄色葡萄球菌的接触杀菌率从100％减少到78％，对大肠杆菌的循环接触杀菌率从100％减少到82％；而实施例3中制备的胶原基底半小时内对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的循环接触杀菌率，虽然略有减少，但杀菌率仍能达到95％以上；结合图6、7、8，实施例3中制备的胶原基底的耐磨色牢度明显比实施例2中制备的胶原基底强，这是由于经EDC/NHS共价交联后，复合涂层不易因摩擦被破坏和脱落，具有良好的稳定性。
对照例：
纳米银的制备方法为：将没食子酸和多巴胺作为稳定剂与醋酸银溶液按摩尔比为0.4：0.6:1进行复合，然后再逐滴滴加到冰水浴过后的浓度较醋酸银6倍的双氧水溶液中，快速搅拌，滴加完后陈化一段时间后即得。除此之外，其余内容与实施例1～3一致。
(1)配置pH为4.0的溶液，对实施例1～3所得的复合抗菌涂层和对照例所得复合抗菌涂层进行浸泡1h，之后水洗调节pH至7.0，重复该操作10次，然后干燥。
(2)将(1)中处理后的胶原基底剪成约1cm×1cm碎片，分别称取1.0g装入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡0.5h，分别取20uL振荡0h和振荡0.5h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
对照例制备的复合抗菌涂层半小时内对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的接触杀菌率从100％减少到62％，对大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率从100％减少到77％；而实施例3中制备的复合抗菌涂层半小时内对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)及大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率仍能达到95％以上。
(3)将实施例1～3所得的复合抗菌涂层和对照例所得复合抗菌涂层于60℃下，湿度为92％的环境下，放置10小时，之后取出干燥。
(4)将(3)中处理后的胶原基底剪成约1cm×1cm碎片，分别称取1.0g装入无菌锥形瓶中，再加入19.8mL的无菌生理盐水和0.2mL浓度为106cfu/mL的菌液，37℃水浴振荡器中200r/min振荡0.5h，分别取20uL振荡0h和振荡0.5h的菌悬液于无菌培养基平板上，涂布均匀，然后置于恒温培养箱中37℃倒置培养24h。采用活菌计数法进行培养计数，并计算抑菌率。
对照例制备的复合抗菌涂层半小时内对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的接触杀菌率从100％减少到72％，对大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率从100％减少到82％；而实施例3中制备的复合抗菌涂层半小时内对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)及大肠杆菌(ATCC25922)的循环接触杀菌率仍能达到98％以上。

Claims (10)

1.一种稳定性增强的复合抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)利用壳聚糖水溶液对胶原基材进行浸泡，然后水洗去除未结合的壳聚糖；其中，壳聚糖的分子量为5万-50万；
(2)用纳米银水溶液对步骤(1)所得物进行浸泡，然后水洗去除未结合的纳米银；
(3)利用EDC和NHS的混合溶液对步骤(2)所得物进行浸泡，然后水洗，之后干燥，即得所述稳定性增强的复合抗菌涂层；
所述纳米银的制备方法为：
按摩尔浓度比5:1的比例，将吖内脂与多巴胺置于二甲基亚砜中，在氮氛围下，于110℃反应1h，得到产物A，再将没食子酸、产物A与硝酸银溶液按摩尔比为0.5:0.1:1进行混合，然后再逐滴滴加到冰水浴过后的浓度为硝酸银溶液6倍的NaBH4溶液中，快速搅拌，滴加完后进行陈化，即得；
所述吖内脂的化学结构式如式<Ⅰ>所示：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳聚糖水溶液的浓度为2～10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳聚糖水溶液的pH值为4.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纳米银水溶液的浓度为20～200ppm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纳米银水溶液的pH值为7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，EDC和NHS的混合溶液中，EDC与NHS的摩尔比为1:1.2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述EDC的浓度为1～10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)中所述浸泡的时间为2～6小时；和/或，步骤(3)中所述浸泡的时间为6～12h。
9.由权利要求2～8任一项所述方法制备得到的稳定性增强的复合抗菌涂层。
10.权利要求9所述的稳定性增强的复合抗菌涂层在制备抗菌制品方面的应用。
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