NL7901767A - Microaggregaten voor het radio-actief zichtbaar maken van reticuloendotheliale systemen. - Google Patents

Description

·* V

New England Nuclear Corporation, te Boston, Massachusetts, Ver.St.v.Amerika

Microaggregaten voor het radio-actief zichtbaar maken van reticuloendo-theliale systemen.

Deze uitvinding betreft een hulpstof voor het radioactief zichtbaar maken van het reticuloendotheliale systeem (BES) van gewervelden, in het bijzonder van primaten, in bijzonder in de lever, milt en het beenmerg. Meer bijzonder gaat het om een preparaat 99m 5 dat met Tc-gemerkte microaggregaat-complexen van een reducerend metaal en albumine (in het bijzonder menselijk serum-albumine) bevat, en ook gaat deze uitvinding over het nog niet radio-actief gemerkte complex als zodanig en in voor gebruik gerede verpakte vorm, alsmede de toepassing daarvan.

10 Vroeger was met gelatine gestabiliseerd radio-actief colloidaal goud (deeltjesgrootte van 0,001-0,05 ym) de meest gebruikte- -hulpstof voor het zichtbaar maken van RES; na intraveneuze injektie wordt het uit de bloedstroom weggevangen en hoopt het zich op in het RES, en vormt daar dus een radio-actief beeld dat met geeigende apparatuur 15 zichtbaar gemaakt kan worden.

99m

Dit werd verdrongen door met Tc gemerkt colloidaal zwavel dat ook met gelatine gestabiliseerd wordt, in het algemeen met deeltjesgrootte van < 0,1-1,0 |*m, en dat tegenwoordig het meest toegepast wordt als radio-actieve hulpstof voor het zichtbaar maken van het RES, 20 ondanks de volgende nadelen: a) men heeft een betrekkelijk groot aantal bestanddelen nodig, (b) de gebruiker moet ter plaatse gaan koken en neutraliseren, en (c) het is biologisch niet afbreekbaar. De meeste in de handel verkrijgbare preparaten van dit soort geven geen scherpe simultanen beelden van lever en 25 milt.

99m

Ook is een met Tc gemerkt colloidaal stannohydroxyde als RES-hulpstof op de markt gebracht, maar dit had het nadeel dat het moeilijk was de groei der colloidale deeltjes na het merken tegen te houden 790 1 7 67 % ή \ 2 tenzij de gebruiker ter plaatse nog extra stabilisatoren toevoegde (wat ze voor toepassing onplezierig maakt), met andere woorden t.het was niet stabiel).

Andere EES-hulpstof die in kleine hoeveelheden 99m 5 verkocht is is een met Tc gemerkt stannophytaat, dat, naar men aanneemt, door het calcium in de bloedstroom in een onoplosbaar colloid omgezet wordt, dat dan door het EES uit de bloedstroom weggenomen wordt. Met dit preparaat had men echter moeite tegelijkertijd van de milt en de normale, gezonde lever een klinisch aanvaardbaar, helder en scherp beeld 10 te krijgen. Het heeft dan ook geen brede toepassing gevonden.

Nu is gevonden hoe men een zeer stabiel, biologisch afbreekbaar preparaat voor het zichtbaar maken van het EES verkrijgt, dat men uit minder bestanddelen kan samenstellen dan het bovengenoemde colloidale zwavel-preparaat, dat de gebruiker niet ter plekke hoeft te 15 verhitten of te neutraliseren, en waaraan hij niets ander hoeft te doen 99m dan een Tc-pertechnetaat-oplossing aan toe te voegen, en dat toch tegelijkertijd van lever en milt klinisch aanvaardbare, heldere en scherpe beelden geeft.

— ' Dit wordt bereikt door anaerobe microaggregatie 20 van een albumine (bij voorkeur menselijk serum-albumine) in aanwezigheid van een complex gebonden reducerend metaal (hierna kortsheidshalve "reducerend metaal" genoemd), bij voorkeur stannochloride, -bromide, -jodide of -fluoride, waardoor colloidale microaggregaten van albumine en het reducerende metaal ontstaan, die hetzij direct hetzij na vriesdrogen en 99m 25 bewaren in een steriele en pyrogeen-vrije ampul met Tc gemerkt worden door er een radio-actieve pertechnetaat-oplossing aan toe te voegen.

Bij voorkeur gebeurt de microaggregatie in aanwezigheid van nog een andere complex-vormer, bij voorkeur in water oplosbare vorm, om het reducerende metaal tegen voortijdig neerslaan te beschermen.

30 Bevoorkeurde complex-vormers zijn de difosfonaten, in het bijzonder methyleendifosfonaat, hydroxyethyleendifosfonaat en aminoethaandifosfonaat; de fosfaten, de polyfosfaten, zoals de pyrofosfaten de aminocarboxylaten zoals de diethyleentriaminepentaacetaten de polyhydroxycarboxylaten, zoals glucoheptonaat, en de polycarboxylaten, zoals de zouten van 35 carboxymethylcellulose. Tot nu toe voldeden de difosfonaten het beste 790 1 7 67 3 * * maar andere bekende, physiologies en toxicologies verenigbare complexvormers zijn ook bruikbaar. Gevonden is dat bepaalde zouten van de reducerende metalen, bijvoorbeeld stannofluoride, zo stabiel zijn dat dan geen aanvullende complex-vormer nodig is; het fluoride is zelf al 5 voldoende complex-vormend voor het stanno-ion.

In de preparaten volgens de uitvinding heerst de volgende deeltjesgrootte-verdeling: ten minste 90-95%, bij voorkeur tenminste 98% van de activiteit is geassocieerd met deeltjes niet groter dan 5 pm.

Voor een gelijktijdig goede afbeelding van de milt en de lever moet niet 10 meer dan 40-60% bij voorkeur niet meer dan 40-50% en het allerbeste niet meer dan 10-40% van de activiteit geassocieerd zijn aan deeltjes groter dan 0,1 μπι, nog beter 0,2 μπι. Bij voorkeur is voor een gelijktijdige goede afbeelding van lever en milt minstens 40-60%, en het allerbeste meer dan 50% van de activiteit geassocieerd met deeltjes tussen 0,2 jam, 15 en 5 jim, bij voorkeur ongeveer 3 μιη. Goede afbeeldingen kreeg men met preparaten waarin 60-100% van de activiteit geassocieerd was aan deeltjes tussen 0,2 jam en 3 μιη, mits 90-98% geassocieerd was aan deeltjes niet-groter dan 5 jam. Goede afbeeldingen van de lever maar dan tevens wat minder goede afbeeldingen van de milt krijgt men met preparaten waarin 20 slechts 5-20% van de activiteit geassocieerd is aan deeltjes tussen 0,2 μιη en 5 μπι indien niet meer dan 90-98% aan deeltjes groter dan 5 μιη bezit, waarbij de rest dan voornamelijk te vinden is aan deeltjes kleiner dan 0,2 μπι.

De verdeling van de radio-activiteit over deeltjes van 25 verschillende grootten kan men vinden door een bekend aliquot van een 99m verdunde suspensie van met Tc gemerkte microaggregaten door een serie filtermembranen van polycarbonaat te leiden (bijvoorbeeld de onder de naam "NUCLEPORE" door de Nuclepore Corporation verkochte membranen in de daarvoor bedoelde filterhuizen en opgestapeld in volgorde van 30 afnemende porie-doorsnede, waarna men de radio-activiteit van elk filter en van het laatste filtraat op bekende wijze meet. Men moet er aan denken het te bepalen monster voldoende te verdunnen om verstoppen van de filter-porien te voorkomen, wat tot een onjuiste uitkomst zal leiden. De bevoor-keurde techniek voor het verdunnen van het monster zal hierna nog 35 beschreven worden. Alle hierna te noemen deeltjesgrootten werden met deze 790 1 7 67

i S

4 techniek bepaald.

Hoewel goede afbeeldingen van de lever bereikt worden met preparaten waarvan praktisch alle deeltjes kleiner dan 0,2 jam zijn, is de afbeelding van de lever dan vaak niet zo goed. Daarom verdient het 5 de voorkeur dat zoveel mogelijk deeltjes tussen 0,1 of 0,2 jam en 5 jam vallen, het beste tussen 0,2 jam en 3 jam.

Voor een nauwere aanduiding; ter gelijkertijd krijgt men goede afbeeldingen van lever en milt als de deeltjesgrootte als volgt is: niet meer dan 4-10% aan deeltjes groter dan 5 jam, niet meer dan 15 10 aan deeltjes groter dan 3 jam, tenminste 20% groter dan 1 jam (meestal 1-3 jam), minstens 80-90% groter dan 0,2 ym en bij voorkeur minstens 40-50% tussen 0,4 en 3,0 jam, met niet meer dan 5-10%, het beste niet meer dan 5-8% vrij (aan oplosbare stoffen van betrekkelijk laag molecuulgewicht).

Reeds minder dan 15 min. en tot wel langer dan 60 min. na in-15 jectie worden zowel milt als lever goed afgeheeld, zonder noemenswaardige verdeling over niet bedoelde organen bij een optimaal contrast voor het bedoelde weefsel. De verdeling van het beenmerg, vooral in de wervels en in de buikstreek, kan men te zien krijgen als men gaat afbeelden na tijden langer dan optimaal voor het afbeelden van lever en milt, hetgeen ook geldt 20 voor preparaten op basis van colloidaal zwavel.

Een oplossing van het albumine en van het reducerende metaal, bij voorkeur met nog een andere complex-vormer daarin, wordt bij een bepaalde pH tot een zekere temperatuur verhit, waardoor de micro-aggregaten ontstaan. De hierboven besproken deeltjesgrootteverdeling wordt voorname-25 lijk beheerst door de concentraties der uitgangsstoffen, de pH en de wijze van verhitten, zoals hierna nog nader beschreven zal worden. Het reducerende metaal wordt daarbij aan het albumine gebonden (er ontstaat een fysisch of chemisch complex) hetgeen de selectieve binding van het Tc-99m aan het gedenatureerde albumine verhoogt wanneer men de micro-aggregaten 30 radioactief gaat merken.

De functie van de aanvullende complex-vormer is het verhogen van de hoeveelheid reducerend metaal die tegen hydrolyse (tot onoplosbare hydroxyden) gestabiliseerd kan worden voordat het met het albumine kan reageren. Geloofd wordt, dat bij het denatureren door verhitting verande-35 ringen in de conformatie van het albumine-molekuul optreden waardoor 790 1 7 67 * · 5 reactieve groepen blootkomen, die de affiniteit van het albumine voor het reducerende metaal verhogen, waardoor meer reducerend metaal aan de micro-aggregaten gebonden wordt dan zonder de aanvullende complex-vormer het geval zou zijn, of als men het reducerende metaal pas na micro-aggre-5 gatie aan het albumine zal toevoegen. In ieder geval draagt de aanvullende complex-vormer belangrijk bij aan de uitstekende radioactieve afbeelding van het RES. Maar als het anion van het in water oplosbare zout van het reducerende metaal voldoende affiniteit voor dat metaal heeft, zoals met fluoride het geval is, heeft men die aanvullende complex-vormer na-10 tuurlijk niet nodig.

Indien de micro-aggregaten voor bewaren gevriesdroogd moeten worden, mengt men ze bij voorkeur eerst met een stabiliserende oplossing van oplosbaar, niet gedenatureerd albumine, zodat de vaste deeltjes later gemakkelijker in de pertechnetaat-oplossing gedispergeerd worden.

15 Bij een bij voorkeur de uitvoeringsvorm bevat de stabilisator-oplossing ook een niet ionogene oppervlak-actieve stof (bij voorkeur Pluronic F-68), wat de dispersie van de vaste deeltjes in de pertechnetaat-oplossing alleen maar ten goede kan komen.

Ook worden buffers zoals natriumfosfaat toegevoegd (bij voor-20 keur samen met het niet gedenatureerde serum-albumine en de oppervlak-actieve stof), zodat men een pH instelt voldoende verre van het isoelek-trische punt af om het opnieuw met water aangemaakte preparaat te stabiliseren wanneer men pertechnetaat-oplossing aan de gevriesdroogde deeltjes toevoegt waar het beste is die buffer in ieder geval toe te voegen, 25 ook als het product zonder vriesdrogen toegepast zal worden.

Tot de beste complex-vormers behoren de difosfonaten; daaronder genieten methyleendifosfonaat en hydroxyethyleendifosfonaat de voorkeur, maar alle in het Amerikaanse octrooischrift 4.032.625 en de Duitse octrooiaanvrage 2.424.296 beschreven difosfonaten zijn ook bruik-30 baar.

Onder de fosfaten genieten pyrofosfaat (vooral natriumpyro-fosfaat) de voorkeur, maar orthofosfaat, de onvertakte polyfosfaten en de organische fosfaten zoals inositolhexafosfaat zijn ook bruikbaar.

Onder de aminocarboxylaten moeten vooral de zouten van ethyleendiamine-35 tetraazijnzuur en van diethyleentriaminepentaazijnzuur genoemd worden.

790 1 7 67

• V

6

Hoewel de polyhydroxycarboxylaten en polycarboxylaten ook complex-vormend zijn, zijn het maar zwakke complex-vormers en minder geschikt dan de zonet genoemde. De bruikbaarheid van complex-vormers voor deze uitvinding wordt alleen beperkt door hun vermogen het reducerende metaal vol-5 doende te stabiliseren en door toxicologische overwegingen.

Bij toepassing in mensen verdient onder de albuminen menselijk serum-albumine de voorkeur, hoewel voor diagnose in andere soorten de albuminen van andere primaten gebruikt kunnen worden.

Hoewel als reducerend metaalion het tweewaardige tin de 10 voorkeur verdient, kunnen tweewaardig ijzer en eenwaardig koper ook gebruik worden, maar iets minder goede resultaten.

Om in een oplossing van het albumine, een complex-vormer en een reducerend metaalmicro-aggregaat te bewerkstelligen wordt het snel verhit tot een temperatuur tussen 70°en 100°C, bij voorkeur tussen 80 en 15 100°C en het alle beste tussen 85°en 99°C. Optimale resultaten zijn be reikt met temperaturen tussen 90° en 99°C. Hogere temperaturen kunnen ook toegepast worden mits de druk zodanig verhoogd wordt, dat het mengsel niet tot koken komt. De verhittingsduur kan variëren van enkele seconden tot enkele uren, afhankelijk van de temperatuur en de wijze van verhitten. 20 Als men bijvoorbeeld m.b.v. microgolven of radiostraling of door inductie verhit, heeft men slechts enkele seconden nodig, terwijl verwarmen door onderdompelen in kokend water of door doorleiden door verwarmings-spiralen wel minuten kost. De maximale verhittingsduur· wordt bepaald door het feit, dat voortgaande verhitting tot verder uitgroeien van de aggre-25 gaten tot boven 5 yum en/of tot het ontstaan van oplosbare afbraakpro-ducten leidt. De minimum verhittingstijd en -temperatuur worden bepaald door de temperatuur en de tijd nodig voor het bereiken van de eerder geschetste wenselijke deeltjesgrootte-verdeling. De maximale verhittingstijd en -temperatuur zijn die, voor bij welke de deeltjes groter dan 5 30 yum worden of afbraak gaat optreden. Met deze richtlijnen, kan men de optimale verhittingstemperatuur en -tijd gemakkelijk met eenvoudige voorproefjes vinden, afhankelijk van het te behandelen preparaat en de wijze van verhitten. Uitstekende resultaten zijn bereikt met 3 tot 10 min. verhitten tot een temperatuur tussen 90 en 99°C indien dat met een heet 35 waterbad gebeurde, en aanvaardbare resultaten zijn bereikt met 2 tot 5 790 1 7 67 7 min. verhitten in een dergelijk bad van een dergelijke temperatuur.

Geloofd wordt, dat tegelijkertijd met het ontstaan van de micro-aggregaten het albumine gedenatureerd wordt.

Het doen ontstaan der micro-aggregaten door verhitting ge-5 beurt bij een pH voldoende ver van het isoelektrische punt van het albumine om de bovengenoemde deeltjesgrootte-verdeling te verzekeren. In dit opzicht is van belang, dat het serum-albumine van de handel uit een mengsel van albuminen bestaat met een zekere spreiding in isoelektrische punten. Daarom kan het isoelektrische punt van de ene partij op de andere 10 enigszins variëren; ze schijnen tussen 4,8 en 5,5 te liggen, maar de aanwezigheid van ionen die neiging hebben met het albumine te associëren kan het isoelektrische punt belangrijk verschuiven.

Hoe dichter de pH bij het isoelektrische punt ligt, hoe groter de aggregaat-deeltjes zijn, en bij het isoelektrische punt treedt 15 een onbeheerste aggregatie op. Naarmate de pH verder van het isoelektrische punt ligt, worden de ontstaande deeltjes kleiner en kleiner.

De optimale pH hangt ook af van de aanvullende complex-vormer, die aanwezig is. Gevonden is, dat de gewenste deeltjesgrootte-verdeling ter micro-aggregaten over een zeker pH-traject bereikt kan worden, afhanke-20 lijk van die complex-vormer. De meest geschikte complex-vormer is die, die voor het bereiken van de gewenste deeltjesgrootte-verdeling het breedst mogelijke pH-traject toelaat, want dat betekent een gevoelig en goed reproduceerbaar systeem. Ook heeft de ionensterkte een zekere invloed; door een neutraal zout zoals NaCl toe te voegen, kan de pH waar-25 bij de beste deeltjesgrootte-verdeling optreedt verder van het isoelektrische punt af komen liggen. Bij voorkeur bevat het mengsel naast albumine, reducerend zout en aanvullende complex-vormer geen andere stoffen die de ionensterkte verhogen dan zuur of base voor het instellen van de gewenste pH. Dit geldt echter alleen bij voorkeur, het is niet strikt 30 noodzakelijk.

Hoewel de gewenste deeltjesgrootte-verdeling ook aan de zure kant van het isoelektrische punt bereikt kan worden, voert men dat toch bij voorkeur aan de alkalische kant daarvan uit, daar aan de zure kant andere moeilijkheden kunnen optreden.

35 Aan de zure kant van het isoelektrische punt kan de pH varie- 790 1 7 67 « *.

s ren tussen 3,5 en 4,5, en aan de alkalische kant tussen 5,4 en 9,5, beter tussen 5,5 en 7,0 en het allerbeste tussen 5,6 en 6,5, afhankelijk van de aanvullende complex-vormer, het isoelektrische punt van het gebruikte albumine en de concentraties der bestanddelen. Als het schijnbare iso-5 eletrische punt echter door de aanwezigheid van een ionogene stof tot beneden 4,5 verschoven is, kan de optimale pH ook wel slechts 4,5 bedragen .

Met methyleendifosfaat als complex-vormer zijn goede resultaten bereikt met pH tussen 5,4 en 6,6, beter nog tussen 5,6 en 6,5 en de op-10 timale resultaten bij een pH tussen 5,7 en 6,35. Bij toepassing van pyro-fosfaat zijn optimale resultaten bereikt met een pH tussen 5,9 en 6,1.

Welke pH men precies moet instellen, kan men in ieder gegeven geval gemakkelijk met eenvoudige proefjes vinden.

Het reducerende zout, bijvoorbeeld stannochloride, kan zowel 15 als vaste stof als in de vorm van een oplossing aan de oplossing van het albumine en de complex-vormen toegevoegd worden. De maximale hoeveelheid reducerend zout is meer dan die waarbij neerslag optreedt voordat het albumine aggregeert. De minimum hoeveelheid is die nodig voor het reduceren en vastleggen van genoeg Tc-99m aan het geaggregeerde albumine om een 20 voldoend sterk preparaat te krijgen. Deze hoeveelheden kan men gemakkelijk met eenvoudige voorproefjes vinden. Zeer weinig reducerend zout zijn voldoende voor een voldoende reductie en vastleggen van het Tc-99m, 2+ te weten minder dan 8 tin -ionen per mol albumine, maar omdat tweewaardig tin gemakkelijk geoxydeerd raakt, kunnen preparaten met de minimale 25 hoeveelheid daarvan bij bewaren en hanteren hun doeltreffendheid verliezen. Daarom neemt men een overmaat ten opzichte van de hoeveelheid die net genoeg is voor het vastleggen, van de juiste hoeveelheid Tc-99m. Met toenemende hoeveelheden reducerend zout komt men bij een bepaalde combinatie van uitgangsstoffen op een punt waarbij het vastleggen van het 30 Tcl99m aan het albumine niet verder toeneemt, noch direct, noch na 24 uur wachten. Met dit in gedachte kan de molverhouding tussen reducerend |"| metaalion (in het bijzonder Sn ) en albumine over een breed traject variëren, zo tussen 8:1 en 80:1, bij voorkeur tussen 30:1 en 50:1. Die molverhouding moet bij voorkeur niet boven 80:1 komen. Uitstekende resul- ++ 35 taten zijn bereikt met molverhouding Sn /albumine tussen 30:1 en 50:1.

790 1 7 67 4 » 9

De minimale hoeveelheid aanvullende complex-vormer is die nodig om de vorming van noemenswaardige hoeveelheden onoplosbare hydroxy-de van het reducerende metaal onder de gegeven omstandigheden te voorkomen. De maximum hoeveelheid is die boven welte het merkbaar met het 5 albumine gaat concurreren om het Tc-99m wanneer de micro-aggregaten met het pertechnetaat gemengd worden. Overmaat aan dergelijke complex-vormers, vooral die met een hoge affiniteit voor het technetium, kunnen met het Tc-99m reageren tot complexen, die beendermerg, nieren en andere onbedoelde weefsels opzoeken, waarbij het EES er minder van kan opnemen en 10 het preparaat minder doeltreffend wordt voor het zichtbaar maken van het EES. Men moet dus niet belangrijk meer van de complex-vormers nemen dan nodig is voor het stabiliseren van het reducerende metaalion. Minimum en maximum hoeveelheden complex-vormers kan men gemakkelijk met eenvoudige voorproefjes vinden (of er hydroxyden neerslaan of niet) en ook 15 door hun effect op het opnemen van radioactiviteit door beenderen, nieren en andere onbedoelde weefsels na te gaan. Verder hoe hoger de concentratie aan complex-vormer, hoe nauwer het pH-traject kan zijn waarbij de gewenste deeltjesgrootte-verdeling optreedt. Daarom is het voor optimale resultaten wenselijk maar weinig meer dan de minimumhoeveelheid complex-20 vormer voor het handhaven van het reducerende metaal-ion in oplossing te nemen.

De concentratie aan aanvullende complex-vormers en de minimum en maximum hoeveelheden daarvan hangen ook af van de aard van de complex-vormer, daar sommige bij lagere ionensterkten een groter bindend 25 vermogen (hogere stabiliteitsconstante) hebben dan andere. Een complexvormer die voor de gewenste deeltjesgrootte-verdeling het breedste pE-traject toelaat, is de meest wenselijke. De difosfonaten, in het bijzonder methyleendifosfonaat en hydroxyethyleendifosfonaat, vallen in deze categorie. De maximum en minimum hoeveelheden complex-vormer hangen ook 30 af van de pH waarbij het aggregeren uitgevoerd wordt.

De optimale hoeveelheid aanvullende complex-vormer is te klein om noemenswaardige bufferend effect te hebben of doel/niet-doel-verhouding noemenswaardig te bevinvloeden. Zelfs als de complex-vormer erom bekend staat de niet-bedoelde weefsels op te zoeken. Het is inte-35 ressant op de te merken dat de toevoeging van een complex-vormer die 790 1 7 67

» V

10 bekend staat als niet bedoelde weefsels op te zoeken de doel/niet-doel-verhouding verhoogt.

De beste hoeveelheid complex-vormer is sterk afhankelijk van de aard daarvan. Voor methyleendifosfonaat, dat betrekkelijk hoge stabili-5 teitsconstanten heeft, moet de verhouding difosfonaat/reducerend metaal-ion tussen 0,6:1 en 1,2:1 liggen, voor glucoheptonaat, dat betrekkelijk lage stabiliteitsconstanten heeft, moet men 2 tot 2½ maal zoveel nemen.

Met methyleendifosfonaat en stannochloride heeft men bij een pH van 5,4 en 6n6 goede resultaten bereikt met een gewichtsverhouding tussen MDP en 10 SnC^.2^0 tussen 0/5:1 en 1:1. Als de pH tot boven 6,6 verhoogd wordt, moet men meer MDP nemen om dezelfde verdeling over de verschillende weefsels te bereiken. Men ziet dat aard van en concentratie aan complex-vormer en de optimale pH onderling samenhangen.

Bij een bij voorkeur de uitvoeringsvorm van de uitvinding 15 gebeurt de aggregatie in aanwezigheid van een in water oplosbaar, facma-cologisch en toxicologisch aanvaardbare oppervlak-actieve stof van hetzelfde soort als dat bij voorkeur in de stabilisator-oplossing opgenomen wordt. Hoewel goede resultaten bereikt zijn zonder zo'n oppervlak-actieve stof tijdens de aggregatie verdient de aanwezigheid daarvan de voorkeur, 20 daar dit een aanvullende beveiliging is, men gelooft dat het de reproduceerbaarheid en de stabiliteit van de verkregen preparaten ten goede op.

Een grote verscheidenheid van oppervlak-actieve stoffen is toepasbaar. Bij voorkeur zijn ze niet-ionogeen en vast bij kamertempera-25 tuur. Geschikte oppervlak-actieve stoffen zijn die, die niet toxisch zijn voor bloed-bestanddelen en weefsels en bij voorkeur hebben ze een hydrofiel/lipofiel balans (HLB) tussen 14 en 40, nog beter tussen 27 en 30,5. Indien bij het aggregeren een oppervlak-actieve stof toegevoegd wordt, neemt men daarvan als regel slechts een heel klein beetje. Bij 30 voorkeur neemt men tussen 0,1 % en 10 % op het gewicht aan albumine, het beste tussen 2 en 8 gew.%.

De in de stabilisator-oplossing opgenomen oppervlak-actieve stof bevordert, zoals reeds gezegd, een snelle dispersie van het gevriesdroogde albumine-metaal-aggregaat in de pertechnetaat-oplossing als men 35 dit gaat toepassen. De hoeveelheid oppervlak-actieve stof in de stabilisa- 790 1 7 67 11 tor-oplossing is gewoonlijk veel groter dan de hoeveelheid, die men bij het aggregeren gebruikt. Bij voorkeur bevat de stabilisator-oplossing tussen 0,2 % en 20 gew.%, en bij voorkeur tussen 1 % en 10 gew.% opper-vlak-actieve stof, berekend op gevriesdroogde stof.

5 Geschikte oppervlak-actieve stoffen, zowel bij het aggregeren als in de stabilisator-oplossing zijn ondermeer Polysorbate 80 (ÜSP), de polyethyleenglycolen met hogere molekuulgewichten zoals de door Union Carbide gemaakte Carbowaxen, en de ethyleenoxyde-propyleenoxyde-blokco-polymeren, bijvoorbeeld de door de BASF in de handel gebrachte"Pluronic". 10 Zie "Detergents and Emulsifiers" van McCutcheon (North American Edition, 1973) blz. 213-217, waar vele in de handel verkrijgbare oppervlak-actieve stoffen met HLB-waarden tussen 14 en 40 opgenoemd zijn. De meeste voorkeur gaat uit naar d Pluronic, vooral Pluronic F-68 dat een molekuulge-wicht omstreeks 8350 en een HLB van 29,0 heeft, en bij kamertemperatuur 15 vast.

De volumeverhouding tussen de stabilisator-oplossing (met niet-geaggregeerd albumine en eventueel oppervlak-actieve stoffen en buffers) en het geaggregeerde serum-albumine kan over een breed traject variëren. Uitstekende resultaten zijn bereikt met verhoudingen tussen 20 1:1 en 1:3, met voorkeur voor een verhouding van 1:2. Betrokken op het uiteindelijke gevriesdroogde preparaat kan de verhouding tussen oplosbaar albumine en geaggregeerd albumine liggen tussen 3:1 en 20:1, bij voorkeur tussen 5:1 en 15:1.

De buffer wordt aan het geaggregeerde preparaat toegevoegd 25 hetzij als onderdeel van de stabilisator-oplossing, hetzij (indien zo'n oplossing niet gebruikt wordt) als zodanig, en daarmee wordt, om eerder genoemde redenen, de pH tussen 7 en 9 ingesteld, bij voorkeur tussen 7,5 en 8,5. Iedere verenigbare, farmacologisch en toxicologisch aanvaardbare buffer kan hiervoor gebruikt worden. Geschikte buffers zijn onder-30 meer de natrium-zouten van orthofosforzuur.

In sommige gevallen kan het wenselijk zijn voor het bijregelen van de ionensterkte voor het aggregeren een elektrolyt toe te voegen, bijvoorbeeld NaCl.

De maximum hoeveelheid Tc-99m (pertechnetaat) die men aan 35 de albumine-micro-aggregaten toevoegt, wordt bepaald door het feit, dat 790 1 7 67 • * 12 iedere noemenswaardige overmaat boven de hoeveelheid die aan de micro-aggregaten gebonden wordt geen gunstig effect heeft en om redenen die niet met de uitvinding te maken hebben, vermeden moeten worden (men moet de in het lichaam geïnjecteerde hoeveelheid radio-activiteit natuurlijk 5 minimaal houden). Een kleine overmaat dan die die aan de micro-aggregaten gebonden wordt, mag echter toegepast worden. Uitgaande van speurwerk aan primaten mag men stellen dat tot 10 % vrij pertechnetaat de toepasbaarheid waarschijnlijk niet nadelig beïnvloedt. De minimum hoeveelheid pertechnetaat wordt natuurlijk bepaald door de hoeveelheid waarmee men nog 10 duidelijke beelden krijgt. Per molekuul serum-albumine (op basis van voor het aggregeren) kan men 0,25 mol Tc-99m of meer gebruiken.

De hoeveelheid radio-activiteit die men aan de micro-aggregaten volgens de uitvinding toevoegt, kan variëren van 0,01 tot 50 milli-curie per patient. Bij voorkeur voegt men aan een al dan niet gevries-15 droogd preparaat 1 tot 10 ml, bij voorkeur 1 tot 8 ml pertechnetaat-op-lossing toe, welke 1 tot 300 of meer, bij voorkeur 5 tot 50 millicurie per mg gedenatureerd albumine bevat. De pertechnetaat-oplossing zal gewoonlijk het eluaat van een gebruikelijke Tc-99m-generator zijn, maar noodzakelijk is dat niet.

20 Een beter binden van het reducerend metaalion aan het serum- albumine en beter homogenen voor aggregaten worden bereikt (met minder oxydatie van het reducerende metaalion) door het reducerende zout en de aanvullende complex-vormers voor het aggregeren aan het serum-albumine toe te voegen. Geloofd wordt, dat dit tot een inniger contact van het redu-25 cerende metaalion en de albumine-molekulen leidt, daar deze laatste tijdens de verhitting opengaan en daarbij verse bindingsplaatsen bloot komen te liggen die voor en tijdens het aggregeren met het metaalion kunnen reageren, zodat dit een intergrerend deel der micro-aggregaten wordt.

30 In ieder geval is, zoals reeds gezegd, gevonden, dat betere resultaten bereikt worden als het serum-albumine in aanwezigheid van het reducerende metaalion geaggregeerd wordt. Maar de aanwezigheid van het reducerende metaal tijdens de aggregatie geeft problemen die niet optreden als dat bij afwezigheid van het reducerende metaalion gebeurt, 35 en die overwonnen worden door dan ook nog een aanvullende complex-vormer 790 1 7 67 * * 13 aanwezig te laten zijn, de pH daarbij juist in te stellen en bij dit alles anaerobe omstandigheden te handhaven. Eén zo'n probleem: hoe bereik ik de juiste deeltjesgrootte-verdeling, een ander is het inbouwen van de gewenste hoeveelheid reducerend metaal in het gedenatureerde al-5 bumine, en nog een ander is: hoe voorkom ik de vorming van onoplosbare hydroxyden van het reducerende metaalion.

Het water voor de diverse oplossingen die bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt worden, is bij voorkeur pyrogeen-vrij gedestilleerd water dat zodanig behandeld is, dat het geen of weinig 10 zuurstof meer bevat. Verder worden alle stappen van de werkwijze bij voorkeur onder anaerobe omstandigheden uitgevoerd, d.w.z. bij afwezigheid van zuurstof, bijvoorbeeld onder stikstof.

Bij de bij voorkeur de uitvoeringsvorm wordt het mengsel van stabilisator-oplossing, dat ook de aanvullende complex-vormer bevat en 15 de micro-aggregaten van gedenatureerd albumine met reducerend metaalion op gebruikelijke wijze gevriesdroogd in steriele pyrogeen-vrije ampullen, die daarna dichtgesmolten worden; deze worden als stellen op de markt gebracht, gereed voor gebruik als men er de voorgeschreven hoeveelheid radio-actief pertechnetaat aan toevoegt.

20 Voor het bepalen van de verdeling van de radio-activiteit over deeltjes van uiteenlopende afmetingen bestaat een geschikte techniek uit het verdunnen van monster met Tc-99m gemerkte micro-aggregaten en het leiden van deze suspensie door een serie filters. Men gaar uit van een mengsel van bijvoorbeeld 1 gew.dl. gemerkte aggregaten op 9 delen 25 verdunde stabilisator-oplossing, en deze suspensie wordt naar behoefte verder verdund. Dan wordt over een serie filters met af nemende, bekende porie-doorsneden gefiltreerd. De in deze beschrijving opgegeven deeltjes-grootte-verdelingen werden op die wijze bepaald. Andere technieken kunnen ookwel toegepast worden.

30 Hoewel de stabilisator-oplossing niet nodig is als de micro- aggregaten zonder vriesdrogen gebruikt worden (dan kan de buffer als zodanig toegevoegd worden) verdient het de voorkeur in ieder geval de stabilisator-oplossing met buffer toe te voegen om de deeltjesgroote-verdeling na toevoeging van het pertechnetaat te stabiliseren.

35 De werkwijze volgens de uitvinding kan zowel in porties uit- 790 1 7 67

f V

14 gevoerd worden als continu of semi-continu, en dan met een betrekkelijk hoge verhouding tussen verwarmend oppervlak en volume.

Bij voorkeur worden de oplossingen voor het aggregeren gefiltreerd door een steriliserend membraan, bijvoorbeeld met porie-doorsneden 5 van 0,22 ytan, en evenzo de stabilisator-oplossing die na het aggregeren toegevoegd wordt. Ook wordt de suspensie van micro-aggregaten bij voorkeur gefiltreerd, en wel door een filter van poriën van 3 yum, om te grove deeltjes te verwijderen. Pas daarna wordt het in ampullen gebracht en gevriesdroogd.

10 De suspensie volgens de uitvinding ziet er melkachtig tot troebel uit, afhankelijk van de omstandigheden tijdens de micro-aggrega-tie. Bij de lagere pH-waarden binnen de toegestane trajecten kan hij zelfs ondoorzichtig zijn. Bij het verhogen van de pH wordt de suspensie dan wat lichter en iets doorschijnend.

15

Voorbeeld I

Aan 90 ml zuurstofarm water werd achtereenvolgens het volgende toegevoegd: 0,6 ml 25 % menselijk serum-albumine (USP, zoutarm), 3 ml natriummethyleendifosfonaat-oplossing (0,5 g methyleendifosfonzuur opge-20 nomen in 100 ml 0,5 NaOH) , 11,15 ml 0,05 NaOH voor het instellen van de pH, 0,5 ml stannochloride-oplossing (4,2 g SnC^.21^0 en 1,5 ml 12n ECl gemengd en met zuurstofarm water tot 100 ml verdund) en 0,6 ml l %

Pluronic F-68-oplossing. De pH van deze oplossing van 6,1. Aliquoten van deze oplossing werden anaëroob door een 0,22 yum steriliserend mem-25 braan gefiltreerd en 3,5 min. in een waterbad van ongeveer 99°C verwarmd, wat een melkachtige suspensie van micro-aggregaten gaf.

Aan ongeveer 50 ml zuurstofarm water werden anaëroob 5,7 g Na2PO^.7^0, 12 ml 25 % menselijk serum-albumine en 0,33 g Pluronic F-68 toegevoegd. Nadat alles in oplossing gegaan was, werd deze oplos-30 sing met zuurstof aan water aangevuld tot 100 ml en anaëroob door een steriliserend filter gehaald.

Van deze steriele stabilisator-oplossing werd 3,3 ml anaëroob gemengd met 6,7 ml van de bovengenoemde steriele melkachtige suspensie.

Van dit mengsel, dat een pH van 8 had, werden 1 ml aliquoten aseptisch 35 in steriele, pyrogeen-vrije ampullen van 10 ml gebracht. Deze werden 790 1 7 67 15 op gebruikelijke wijze gevriesdroogd- Dit gaf vaste preparaten van gede-natureerd menselijk serum-albumine die Sn bevatten, en wel in elke ampul 1 mg micro-aggregaten, 10 mg niet gedenatureerd serum-albumine, 0,1 mg SnCl2, 0,1 mg MDP, 10 mg Na^H^O^ en 1,14 g Pluronic F-68.

5 Om hieruit met Tc-99m gemerkte aggregaten te verkrijgen, werd 5 ml vers bereide radio-actieve natriumpertechnetaat-oplossing (ongeveer 100 mCi, een behoorlijke merking had ook verkregen kunnen worden met minder dan 1 mCi en ook met meer dan 300 mCi), dat als steriel pyrogeen-vrij eluaat uit een steriele Tc-99m-generator in 0,9 % zout-oplossing 10 verkregen was, werd aseptisch aan elke ampul toegevoegd. Door schudden van de ampullen werd als in oplossing gebracht en werden homogene suspensies verkregen. Alle handelingen werden aseptisch uitgevoerd, en alle uitgangsstoffen waren steriel en pyrogeenvrij.

15 Verdeling van de radio-activiteit over micro-aggregaten van uiteenlopende grootte;

Deeltj esgrootte % op totaal > 5 pan 0,5 3-5 pan 1,5 20 0,2 - 3 pan 71,1 < 0,2 yum 26,9

Van deze gemerkte micro-aggregaten werden 1 tot 5 mCi intraveneus in volwassen muizen geïnjecteerd. 15 min. later werden de muizen 25 afgemaakt en werden de radio-activiteiten van de verschillende organen (lever, milt, enz.) met een gebruikelijke γ-teller bepaald. Dit leidde tot de volgende uitkomsten:

Orgaan % van de geinjiceerde doses 30 lever 87,8 milt 2,6 longen 0,5 karkas (incl. beendermerg) 5,8 nieren 1,0 35 maagdarmkanaal 0,6 de rest 1,6 790 1 7 67 » s 16

Van overeenkomstige preparaten werd 1 tot 5 mCi intraveneus in bavianen geïnjecteerd. Op gebruikelijke wijze werd 30 min. na de injectie een beeld van lever en milt opgenomen, met behulp van een 'γ-scintil-latie-camera (Pieker Dyna Camera II). Tegelijkertijd werden van lever en 5 milt scherpe, heldere beelden met lagere achtergrond verkregen. De opname van radio-activiteit door longen en zachte weefsels was minimaal. Met geëigende langere incubatie-tijden kunnen ook uitstekende beelden van het beendermerg verkregen worden, even goed als met gemerkt colloidaal zwavel, en klinisch toepasbaar voor een goede diagnose.

10 Hoewel men uit de verdeling van de radio-activiteit in muizen uitspraken kan doen over de selectiviteit van de opname door het RES als geheel (lever, milt en beendermerg) en over het contrast tussen de opname door het RES en de overige organen, correleert deze opname niet met die van lever en milt in primaten, en dus ook niet met de kwaliteit van de 15 afzonderlijke afbeeldingen van lever en milt in primaten. Zie hiervoor Int. J. of Applied Radiation and Isotopes, 28, (1977) 123-130. Om een voorspelling te kunnen doen over deze verdeling en de kwaliteit van de afbeeldingen bij mensen is het wel nodig proeven met primaten zoals apen en bavianen te doen.

20 De hierboven beschreven bio-verdeling in muizen en de ver kregen radio-actieve afbeeldingen van het RES in primaten laat zien, dat de tin en radio-activiteitbevattende microaggregaten volgens de uitvinding uitstekende hulpstoffen zijn voor het afbeelden van het reticuloendotheliale systeem, waarbij lever en milt tegelijkertijd be-25 hoorlijk afgeheeld worden,

In wezen dezelfde resultaten werden bereikt toen het vriesdrogen nagelaten werd; even goede resultaten zijn mogelijk als het tin bevattende gedenatureerde albumine direct, zonder vriesdrogen en zonder toevoegen van stabiliserende albumine-Pluronic-oplossing gebruikt wordt.

30 Als echter de miero-aggregaten gevriesdroogd worden zonder dat zo'n stabilisator-oplossing toegevoegd was, is het moeilijk ze bij het toevoegen van de pertechnetaat-oplossing weer goed in dispersie te krijgen.

Of de micro-aggregaten nu gevriesdroogd zijn of niet, bij afwezigheid van stabilisatie met de buffer kan de deeltjesgrootte op ongecontrol-35 leerde wijze toenemen.

790 1 7 67 17

In de volgende voorbeelden werd al het mengen en filtreren anaëroob uitgevoerd, net als in voorbeeld I, en steeds ondergingen de in steriele, pyrogeen-vrije ampullen gebracht aliquoten van 1 ml dezelfde bewerkingen als in het bovenstaande voorbeeld, d.w.z. dat de gemerkte 5 aliquoten onderzocht werden op de verdeling van de radio-activiteit over de fracties, en dat de opname van de radio-activiteit door diverse organen in muizen en apen bepaald werd.

Voorbeeld II

10 Aan 45 ml zuurstof arm water werd achtereenvolgens het volgen de toegevoegd: 0,3 ml 25 % menselijk seurm-albumine, 0,25 ml SnC^-oplos-sing, 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-oplossing, 11,2 mg diethyleentriamine- Λ pentaazijnzuur en 1,65 ml 0,lNNaOH. De pH van deze oplossing van 6,54. Aliquoten hiervan werden door een 0,22 yum steriliserend membraan gefil-15 treerd en 3,5 min. op ongeveer 99°C verhit, wat een licht melkachtige suspensie van micro-aggregaten gaf.

Van de in voorbeeld I genoemde stabilisator-oplossing werd 3,3 ml gemengd met 6,7 ml van deze suspensie, en 1 ml aliquoten van dit 'mengsel, met een pH van 8, werden in steriele, pyrogeen-vrije ampullen 20 van 10 ml gebracht. Bij het meten van de verdeling van de radio-activiteit over de verschillende fracties werden de volgende uitkomsten gevonden:

Deeltj esgrootte % op totaal 25 ^ 5 yum 1,1 3-5 yum 1,1 0,2 - 3 yum 68,4 < 0,2 yum 29,5

30 Voorbeeld III

Aan 45 ml zuurstofarm water werd het volgende toegevoegd: 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-oplossing, 0,3 ml 25 % menselijk serum-albumine, 0,25 ml SnC^-oplossing (4,2 g SnCl^.ZH^O en 3 ml 12N HC1 met zuurstof-arm water tot 100 ml verdund). Van deze oplossing werd 16,7 ml gemengd 35 met 1 ml 1 % natriumpyrofosfaat (10,2 mg Na^P^O^.ÏOH^O) en 0,55 ml 0,025 7901767 18

NaOH. De pH van het mengsel was 5,85. Aliquoten daarvan werden door een steriliserend membraan met poriën van 0,22 ^um gefiltreerd en daarna 3½ min. in kokend water verhit, wat een melkachtige suspensie van micro-aggregaten gaf.

5 Aan ongeveer 50 ml zuurstofarm water werden 5,7 g Na^HPO^.

7^0, 12 ml 25 % menselijk serum-albumine en 0,33 g Pluronic F-68 toegevoegd. Nadat alles opgelost was, werd deze oplossing met zuurstofarm water tot 100 ml aangevuld en door een steriliserend filter gehaald.

Hiervan werd 3,3 ml anaëroob gemengd met 6,7 ml van de boven-10 genoemde melkachtige suspensie. Hiervan werden 1 ml aliquoten, met een pH van 8, in ampullen van 10 ml gebracht. Bij het bepalen van de verdeling van de radio-activiteit over verschillende fracties werden de volgende uitkomsten gevonden: 15 Deeltjesgrootte % op totaal > 5 yum 1,0 3-5 yum 1,0 0,2 - 3 yum 69,0 < 0,2 yum 29,0 20

Voorbeeld IV

Aan 290 ml zuurstofarm water werd het volgende toegevoegd: 1 ml oplossing met daarin 0,04 g Pluronic F-68, 4 ml 25 % menselijk serum-albumine, 3 ml stannochloride (4,64 g SnC^-2^0 en 2 ml 12N HC1, 25 met zuur stof arm water tot 100 ml aangevuld), 0,66 g Na^HPO^. 7^0 in 15 ml zuur stof arm water, en 4,04 ml 4M NaCl. De pH van het geheel was 6,5.

Na anaerobe filtratie door een steriliserend membraan van 0,22 yum werd deze oplossing achtereenvolgens en continu door twee warmtewisselaars geleid, wat een semi-continue methode voor het aggregeren betekent, welke 30 geheel continu gemaakt kan worden door de samenstellende oplossingen continu in een mengkamer te leiden en de uitlaat daarvan met het steriliserende filter en met de warmtewisselaars te verbinden. De eerste warmtewisselaar wordt door een vloeistof op ongeveer 99°C gehouden, en de tweede wordt met water van kamertemperatuur gekoeld; het effluent van deze 35 laatste wordt anaëroob opgevangen. De verblijfstijd van de vloeistof in beide warmtewisselaars varieert van 3 tot 8 min., en men verkrijgt een 790 1 7 67 19 melkachtige suspensie van micro-aggregaten.

Aan 10 ml fosfaat-oplossing (9,5 g Na2HP04.7H20 per 100 ml) werden 2 ml 25 % menselijk serum-albumine, 6,25 ml 4 % Pluronic F-68-oplossing en water tot een totaal van 35 ml toegevoegd. Na goed mengen, 5 ontluchten en steriliserend filtreren werd hieraan 15 ml van de zojuist genoemde melkachtige suspensie toegevoegd, gevolgd door nogeens grondig mengen.

Van dit mengsel werden 1 ml porties in ampullen van 10 ml gebracht, en bij het bepalen van de verdeling van de radio-activiteit 10 over de verschillende fracties werden de volgende uitkomsten gevonden: deeltj esgrootte % op totaal > 3 yum 7 1-3 yum 16 15 0,2 - 1 yum 57 < 0,2 yum 18

Verdeling binnen muizen, 15 min, na intraveneuze toediening:

Orgaan % van de geinjiceerde dosis 20 Lever 89,3

Milt 1,1

Longen 1,0

Karkas 7,7

Nieren 0,5 25 Maagdarmkanaal 0,2 de rest 0,2

Voorbeeld V

Aan 45 ml zuurstofarm water werd het volgende toegevoegd: 30 0,3 ml 25 % menselijk serum-albumine, 0,25 ml stannochloride-oplossing (4,2 g SnCl2.2H20 en 3 ml 12N HCl met zuurstofarm water tot 100 ml verdund) , 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-oplossing en 3,7 ml 1 % Na2HP04~oplossing (als in voorbeeld III). De pH van dit mengsel van 5,71. Aliquoten hiervan werden gefiltreerd door een steriliserend membraan van 0,22 yum en 35 daarna 20 sec. blootgesteld aan verhittingobor micro-golven, wat een 790 1 7 67 y % 20 melkachtige suspensie van micro-aggregaten gaf.

Deze melkachtige suspensie werd met een oplossing van menselijk serum-albumine, NagHPO^ en Pluronic F-68 geformuleerd tot een mengsel met een pH is 8, dat over ampullen verdeeld en overeenkomstig voor-5 beeld III met 7 ml 99m-Tc-natriumpertechnetaat gemerkt werd. Bij het bepalen van de verdeling van de radio-activiteit over de fracties, en, 15 min. na intraveneuze toediening in muizen, over de verschillende organen werd dit gevonden: 10 Deeltjesgrootte % op totaal ^ 5 2,1 3-5 yum 3,1 0,2 - 3 yum 84,0 < 0,2 yum 10,8 15

Orgaan % van de geinjiceerde dosis

Lever 85,9

Milt 4,3

Longen 0,5 20 Karkas 5,3

Nieren 1,0

Maagdarmkanaal 0,7 de rest 2,3

25 Voorbeelden VI en VII

Aan 417 ml zuurstofarm water werd het volgende toegevoegd: 16,3 ml 4,6 % gezuiverd menselijk serum-albumine (door aanzuren en behandelen met actieve kool van^ievrijd, zoals beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage 783.633, gevolgd door ultra-filtratie), 2,5 ml stanno-20 chloride-oplossing (4,2 g SnC^ - 2^0 en 3 ml 12N HC1 met zuurstof arm water tot 100 ml verdund) en 3 ml 1 % Pluronic F-68-oplossing. Het geheel werd goed gemengd met 25,6 ml 1 % NaoHP0.-oplossing (als in voorbeeld 2, 4 III) en met 34,2 ml 0,025M NaOH. Van deze oplossing werd 150 ml door een steriliserend membraan met poriën van 0,22 yum gefiltreerd. Dit filtraat, 25 met een pH van 5,62, werd voor voorbeeld VI gebruikt.

790 1 7 S7 21

Aan de resterende oplossing werd onder roeren nog 3,4 ml 0,25N NaOH toegevoegd, de pH was nu 6,11. Daarna werd net als hierboven gefiltreerd. Deze tweede oplossing werd voor voorbeeld VII gebruikt.

Porties van beide oplossingen werden 3,5 min. in water van 5 99°C verhit, zodat micro-aggregaten ontstonden. De suspensie van voor beeld VI was melkachtig, die van voorbeeld VII slechts licht troebel.

Beide suspensies werden overeenkomstig voorbeeld III met stabilisator-oplossing aangevuld en met 5 ml 99m-Tc-natriumpertechnetaat gemerkt. Bij het bepalen van de verdeling van de radio-activiteit over de 10 fracties en, 15 min. na intraveneuze toediening aan muizen, over de verschillende organen werd het volgende gewonnen: % op totaal

Deeltjesgrootte Voorbeeld VI Voorbeeld VII

> 5 yUm 1,9 0,7 15 3 - 5 yum 2,8 1,3 1 - 3 yum 32,7 1,3 0,2 - 1 ^im 50,5 4,6 < ,2 yum 12,2 92,1 20 Orgaan % van de geinjiceerde dosis

Voorbeeld VI Voorbeeld VII

Lever 86,0 88,3

Milt 3,3 2,2

Longen 0,8 0,6 25 Karkas 6,2 7,3

Nieren 1,0 0,7

Maagdarmkanaal 1,0 0,3 de rest 1,7 0,6

30 Na toediening aan apen gaf het preparaat van voorbeeld VI

goede afbeeldingen van lever, milt en beendermerg; het preparaat van voorbeeld VII gaf goede afbeeldingen van lever en beendermerg, maar niet van de milt. Dit moet samenhangen met de veel kleinere deeltjes van dit laatste preparaat.

790 1 7 i7 4 *> 22

Voorbeeld VIII

Aan 75 ml zuurstofarm water werd het volgende toegevoegd: 0,3 ml 25 % menselijk serum-albumine, 1,5 ml hydroxyethyleendifosfonaat-oplossing (0,21 g HEDP in 30 ml), 0,25 ml stannochloride-oplossing (4,2 g 5 SnC^.Sl^O en 3 ml 6,15N HCl met zuurstof arm water tot 100 ml verdund), 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-oplossing en 5,72 ml 0,05N NaOH. De pH van het geheel was 5,90. Porties hiervan werden door een steriliserend membraan van 0,22 yum gehaald en 3,5 min. in een waterbad van 99°c verhit, wat een melkachtige suspensie van micro-aggregaten gaf.

10 Overeenkomstig voorbeeld III werd deze suspensie met een stabilisator-oplossing geformuleerd (de pH was nu 8), in ampullen gebracht, en met 5 ml 99m-Tc-oplossing gemerkt. Bij het bepalen van de verdeling van de radioactiviteit over de fractie en, 15 min. na intraveneuze toediening aan muizen, over de organen werd dit gevonden: 15

Deeltj esgrootte % op totaal s 5, 3 yum 8,9 1,3 yum 2,1 0,2 - 1 yum 61,2 20 < 0,2 yum 27,8

Orgaan % van de geinjiceerde dosis

Lever 92,8

Milt 2,6 25 Longen 0,4

Karkas 5,1

Nieren 0,5

Maagdarmkanaal 0,5 de rest 2,3 30

Het gevriesdroogde, tinbevattende, gedenatureerde albumine volgens onderhavige uitvinding kan zeer lang bewaard worden, minstens een jaar bij kamertemperatuur (onder bescherming tegen licht). Na radioactief merken is het ook minstens 24 uur stabiel, hoewel het uit een 35 oogpunt van veiligheid voor de patient bij voorkeur binnen 8 uur na 790 1 7 67

Claims (22)

1. Preparaat, geschikt om, na merken met Tc-99m, gebruikt te worden voor het radio-actief afbeelden van het reticuloendotheliale systeem, met het kenmerk, dat het micro-aggregaten van albumine en een reducerend metaalion bevat.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 10 bovendien een aanvullende complex-vormer voor dat metaalion bevat.

3. Preparaat volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de complex-vormer een fosfonaat, fosfaat, aminocarboxylaat, polyhydroxyear-boxylaat en/of polycarboxylaat is.

4. Preparaat volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het 15 reducerende metaalion tweewaardig tin is en dat de complex-vormer een difosfonaat is.

5. Preparaat volgens een der conclusies 2, 3 of 4, met het kenmerk, dat tenminste 9 % der micro-aggregaten niet groter dan 5 yum in doorsnede is.

6. Preparaat volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat ten minste 40 % der micro-aggregaten afmetingen tussen 0,2 yum en 5 ^jm heeft.

7. Preparaat volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat tenminste 70 % der micro-aggregaten afmetingen tussen 0,2 yum en 3 yum 25 heeft.

8. Preparaat volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het reducerende metaalion tweewaardig tin is en dat het grootste deel der micro-aggregaten afmetingen tussen 0,2 yum en 3 yum heeft.

9. Preparaat volgens een der conclusies 5 t/m 8, 30 met het kenmerk, dat niet meer dan 50 % der micro-aggregaten kleiner dan 0,2 yum is.

10. Preparaat volgens een der conclusies 2 t/m 9, met het kenmerk, dat het albumine menselijk serum-albumine is en dat het reducerende metaalion tweewaardig tin is.

11. Preparaat volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het 7901767 t V met niet-gedenatureerd albumine en een buffer gestabiliseerd is.

12. Preparaat volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het bovendien een niet-ionogene oppervlak-actieve stof bevat.

13. Preparaat volgens een der conclusies 10, 11 of 12, 5 met het kenmerk, dat het serum-albumine daarin bij een pH tussen 4,5 en 9,5 (maar aan de alkalische zijde van het schijnbare iso-elektrische punt van het albumine) gedenatureerd was.

14. Preparaat volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de pH tijdens het denatureren tussen 5,4 en 7,0 lag.

15. Preparaat volgens een der conclusies 10 t/m 14, met het kenmerk, dat het de vorm van een gevriesdroogde vaste stof heeft.

16. Preparaat volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat het albumine menselijk serum-albumine is, dat het reducerende metaalion tweewaardig tin is, dat het preparaat gestabiliseerd 15 is met niet-gedenatureerd menselijk serum-albumine en een buffer, dat het ontstaan der micro-aggregaten bij een pH tussen 5,4 en 9,5 gebeurde, en dat het preparaat gevriesdroogd is.

17. Preparaat voor het afbeelden van het reticuloendotheliale systeem, met het kenmerk, dat het uit een preparaat volgens een der voor- 20 afgaande conclusies bestaat en Tc-99m bevat.

18. Werkwijze voor het bereiden van een preparaat dat, na merken met Tc-99m, geschikt is voor het radio-actief afbeelden van het reticuloendotheliale systeem, met het kenmerk, dat albumine in aanwezigheid van een reducerend metaalion tot micro-aggregatie gebracht wordt.

19. Een oplossing van menselijk serum-albumine, na micro- aggregatie en radio-actief merken geschikt voor het radio-actief afbeelden van het reticuloendotheliale systeem, met het kenmerk, dat het een oplossing is van niet-gedenatureerd menselijk serum-albumine, een reducerend metaalion, en een stabiliserende complex-vormer voor dat metaal- 30 ion, welke oplossing een pH tussen 4,5 en 9,5, maar aan de alkalische kant van het iso-elektrische punt van het albumine heeft, waarbij de hoeveelheid complex-vormer voldoende is om het reducerende metaalion tegen voortijdig neerslaan te stabiliseren, maar niet zoveel, dat de micro-aggregaten later onbedoelde weefsels gaan opzoeken.

20. Oplossing volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat de pH daarvan tussen 5,4 en 7,0 ligt. 790 1 7 67

21. Oplossing volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het reducerende metaalion tweewaardig tin is.

22. Oplossing volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat de complex-vormer methyleendifosfonaat en/of hydroxyethyleendifosfonaat is, 5 en dat de pH daarvan tussen 5,6 en 6,5 ligt. 790 1 7 67