DE2909355A1

DE2909355A1 - Albumin-mikroaggregate zur radioaktiven darstellung von retikulo-endothelialen systemen

Info

Publication number: DE2909355A1
Application number: DE19792909355
Authority: DE
Inventors: Eugene L Saklad
Original assignee: New England Nuclear Corp
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1979-02-22
Filing date: 1979-03-09
Publication date: 1980-09-11
Also published as: FR2450611A1; GB2042887A; NL7901767A; SE431286B; FR2450611B1; JPS55130921A; NL190050B; DE2909355C2; NL190050C; GB2042887B; JPH0343254B2; SE7902009L

Description

Patentanwälte 2309355

Dipl-lng	Dipl.-Chem.	Dipl-lng.
E. Prinz	Dr. G. Hauser	G. Leiser
	Ernsbergerstrasse 19
	8 München 60

New England Nuclear Corporation 8. Februar 1979

549 Albany Street

Boston, Massachusetts 02118 / V.St.A.

Unsere Zeichen: N 676

Albumin - Mikroaggregate zur radioaktiven Darstellung von Retikulo-endothelialen Systemen

Die Erfindung betrifft Mikroaggregate eines Komplexes von

1. Albumin, insbesondere menschlichem Serumalbumin und

2. einem metallischen Reduktionsmittel, insbesondere einem Zinn-II-Reduktionsmittel,

der vorzugsweise in Gegenwart eines stabilisierenden Liganden gebildet wird. Dieser Komplex bildet bei Markierung mit Technetium-99m ein ausgezeichnetes Mittel zur Abbildung von Retikulo-endothelialen Systemen (RES), insbesondere der Leber, der Milz und des Knochenmarks. Die Erfindung betrifft auch Methoden zur Herstellung und Verwendung der Mikroaggregate, sowie einen (physikalischen oder chemischen) Komplex von Technetium-99m mit diesen Mikroaggregaten und Methoden zur Verwendung des Komplexes.

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur radioaktiven Abbildung des Retikulo-endothelialen Systems (RES) von Wirbeltieren, insbesondere Primaten, vorwiegend der Leber, der Milz und des Knochen-

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marks. Derartige Mittel werden manchmal als radioaktive RES abbildende bzw. darstellende Mittel bezeichnet. Insbesondere betrifft die Erfindung ein RES-Mittel, bestehend aus einem Tc-markierten Mikroaggregat-Komplex aus einem reduzierenden Metall und Albumin, insbesondere menschlichem Serumalbumin (HSA), den nicht markierten Mikroaggregat-Komplex als solchen, sowie in Form eines üntersuchungssatzes (Kit), sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und ein Verfahren zu deren Verwendung zur RES-Darstellung.

Eine Zeitlang war das gebräuchlichste handelsübliche RES-darstellende Mittel ein Radio-Kolloid (Teilchengröße von 0,001 - 0,05 Mikrometer bzw. jUtr) von Gold, stabilisiert mit Gelatine, das nach Injektion in den Blutstrom durch das RES entfernt und darin angesammelt wird, unter Bildung eines latenten radioaktiven Bildes davon, das durch eine geeignete Vorrichtung in ein sichtbares Bild umgewandelt werden kann.

Dieses darstellende Mittel wurde verdrängt durch ein mit demarkiertes Schwefel-Kolloid, das mit Gelatine stabilisiert wurde, von dem der größte Teil eine Teilchengröße von <£0,1 - 1,0 Atm hat und bei dem es sich um das gegenwärtig noch am meisten verwendete radioaktive RES darstellende Mittel handelt, trotz seiner Nachteile, die darin bestehen, daß es

a) eine relativ große Anzahl von Bestandteilen erfordert,

b) während der Verwendung am Ort der Verwendung Koch- und Neutralisierstufen zur Markierung erfordert und

c) nicht biozersetzlich ist.

Die meisten der Schwefel-Kolloid-RES-Mittel, die sich auf dem Markt befinden, ergeben cfleichzoitigscharfe klare Bilder der Leber und der Milz.

Im Handel befand sich auch ein ^mTc-markiertes Zinn-II-Hydroxid-Kolloid als RES-Mittel; jedoch weist es den Nachteil auf, daß es

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schwierig ist, das Wachstum der kolloidalen Teilchen nach der Markierung zu verhindern, ohne daß anschließend bei der Verwendung am Ort der Verwendung Stabilisatoren zugesetzt werden, wodurch diese Mittel für die RES-Darstellung nicht zufriedenstellend sind, d. h. sie sind nicht stabil.

Von einem weiteren RES-Mittel, das in geringen Mengen auf den Markt gebracht wurde und bei dem es sich um einen Tc-markierten Zinn-II-Phytat-Komplex handelt, wird angenommen, daß es durch Calcium im Blutstrom, aus dem es anschließend durch das RES entfernt wird, in ein unlösliches Kolloid umgewandelt wird. Jedoch war es mit diesem Mittel schwierig, ein klinisch brauchbares klares scharfes Bild der Milz gleichzeitig mit der normalen gesunden Leber darzustellen. Aus diesem Grunde hat sich seine Verwendung nicht durchgesetzt.

Durch die Erfindung wird ein hochstabiles biozersetzliches RES-Mittel bereitgestellt, das weniger Bestandteile erfordert, als das Schwefel-Kolloid-RES-Mittel, das bei der Verwendung am Ort der Verwendung keine Erwärmungs-Neutralisations- oder andere Stufen, außer der Zugabe einer ^mTc-Pertechnetatlösung erfordert und das dennoch klinisch brauchbare klare scharfe Bilder von sowohl der Leber, als auch der Milz gleichzeitig ermöglicht,· durch die Erfindung wird auch eine neue Verfahrensweise zur Herstellung des Mittels sowie zur Verwendung des Mittels bereitgestellt.

Man erzielt dies durch anaerobe Mikroaggregation von Albumin, vorzugsweise von menschlichem Serumalbimin (HSA) in Anwesenheit eines reduzierenden Metalls in ionischer oder physikalisch oder chemisch komplexer Form (im folgenden zur Vereinfachung als reduzierendes Metall bezeichnet), vorzugweise eines Zinn-II-Chlorids, Zinn-II-Jodids, Zinn-II-Fluorids oder Zinn-II-Bromids, unter Bildung von kolloidalen Teilchen des Albumins und des reduzierenden Metalls in Form von Mikroaggregaten, die entweder mit ^mTc durch Vermischen mit radioaktiver Pertechnetatlösung direkt markiert sind oder die gefriergetrocknet und in einem sterilen pyrogenfreien Fläschchen verschlossen und bis zum Gebrauch gelagert wer-

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den und dann am Ort der Verwendung durch Vermischen mit einer radioaktiven Pertechnetatlösung mit Tc markiert werden.

Vorzugsweise führt man die Mikroaggregation auch in Anwesenheit eines zusätzlichen Liganden durch, vorzugsweise in einer in Wasser löslichen Form, zur Stabilisierung des reduzierenden Metalls gegen die Ausfällung vor der Aggregation. Bevorzugte Liganden sind die Diphosphonate, vorzugsweise Methylendiphosphonat, Hydroxyäthylendiphosphonat und Aminoäthandiphosphonat; die Phosphate, wie die Polyphosphate, z. B. die Pyrophosphate; die Aminocarboxylate, wie Diäthylentriaminpentaacetatsalze; die Polyhydroxycarboxylate, wie Glucoheptonat; und die Polycarboxylate, wie die Salze von Carboxymethylcellulose. Bisher haben sich die Diphosphonate als am bevorzugtesten erwiesen. Es sind jedoch andere bekannte physiologisch und toxikologisch brauchbare Liganden für das spezielle reduzierende Metall verwendbar. Es wurde gefunden, daß das Anion bestimmter brauchbarer reduzierender Metallsalze, wie Zinn-II-Fluorid, selbst, eine ausreichend hohe Stabilitätskonstante aufweist, um die Notwendigkeit eines zusätzlichen Liganden auszuschließen. In einem derartigen Falle dient das Fluoridanion selbst als stabilisierender Ligand für das Zinn-II-Ion.

Erfindungsgemäß liegt die radioaktive Verteilung durch die Teilchengröße der kolloidalen Teilchen in Form von Mikroaggregaten wie folgt vor: mindestens 90 - 95, vorzugsweise mindestens 98 % der Aktivität liegt in Verbindung mit Teilchen von nicht über 5 lim vor. Für eine gute Milzdarstellung gleichzeitig mit der Leber sind nicht über 40 - 60 %, bevorzugter nicht über 40 - 50 % und nocht bevorzugter nicht über 10 - 40 % an Teilchen von weniger als 0,1, vorzugsweise 0,2 Mm, assoziiert. Bevorzugter sind für eine gute gleichzeitige Darstellung von Milz und Leber mindestens 40 - 60 % und bevorzugter über 50 % (der Hauptteil) der Aktivität an Teilchen zwischen 0,2 ^m und 5, besonders bevorzugt 3 um assoziiert. Gute gleichzeitige Milz- und Leberbilder wurden erzielt, wenn zwischen 60 und 100 % der Aktivität an Teilchen zwischen 0,2 und 3 Mm. gebunden waren, vorausgesetzt, daß über 90 98 % mit solchen assoziiert waren, die nicht größer als 5 Mm sind.

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Gute Bilder der Leber bei gleichzeitig schlechteren Milzdarstellungen können erzielt werden, wenn nur 5 - 20 % der Aktivität an Mikrogrößen-Teilchen zwischen 0,2 und 5 Mm assoziiert sind, vorausgesetzt, daß über 90 - 98 % nicht größer als 5 um sind, wobei der Rest der Aktivität vorwiegend mit Teilchen von unter O',2yt*m. assoziiert ist.

Die radioaktive Verteilung durch die Teilchengröße erzielt man, wenn man einen bekannten aliquoten Teil einer verdünnten Suspension, der mit Tc-markierten Mikroaggregattexlchen durch eine Reihe von Polycarbonat-Filtermembranen leitet (z. B. Membranen mit den Handelsnamen NUCLEPORE der Nuclepore Corporation, angeordnet in NÜCLEPORE-Piltergehäusen, entsprechend den Angaben des Herstellers, und in Serie angeordnet in einem Stapel mit abnehmender Porengröße, was manchmal als Serien- bzw. als Reihenfiltrationstechnik bezeichnet wird), worauf man die Radioaktivität der filtrierten Teilchen innerhalb jedes Filtergehäuses und des zuletzt erhaltenen Filtrats durch übliche Meßtechniken bestimmt, jede Menge durch die Gesamt-Radioaktivität dividiert und mit 100 multipliziert, um den Prozentsatz zu erhalten. Der aliquote Teil wird ausreichend verdünnt, um ein Verstopfen der Filterporen durch die deren wirksame Größe verringert würde, was zu einer ungenauen Bestimmung führen würde, zu verhindern oder auf ein Minimum herabzusetzen. Eine bevorzugte Technik zur Verdünnung des aliquoten Teils wird im folgenden beschrieben.Alle Teilchengrößen, auf die hier Bezug genommen wird, werden nach dieser Technik bestimmt.

Zwar erzielt man eine gute Leberdarstellung, wenn tatsächlich alle Teilchen unter 0,2,*<m betragen, jedoch ist häufig die gleichzeitige Milzdarstellung schlecht.

Dementsprechend ist es bevorzugt, eine Teilchengrößenverteilung zu erzielen, bei der soviele Teilchen wie möglich zwischen 0,1 oder 0,2 M.m und 5 .*m, vorzugsweise zwischen 0,2 A.m und 3 Mm liegen.

Weiter zerkleinert wurden gute gleichzeitige Milz- und Leberdar-

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Stellungen mit folgender Teilchengrößenverteilung erzielt: nicht über 4 - 10 % größer als 5 mso., nicht über 15 % größer als 3 Mm, mindestens 20 % über 1 .^m (meistens 1-3 am) , mindestens 80 90 % über 0,2 Mm und vorzugsweise mindestens 40 - 50 % zwischen 0,4 und 3,0 um, wobei nicht über 5 - 10 %, vorzugsweise nicht über 5 - 8 % bei Salzlösungs-ITLC mobil sind (lösliche Anteile mit relativ geringem Molekulargewicht)/(ITLC = unmittelbare Dünnschichtchromatographie) .

Bei unter 15 Minuten bis über 60 Minuten nach der Injektion erzielt man eine ausgezeichnete Sichtbarmachung von sowohl Milz, als auch Leber, bei unbedeutender, ungezielter Verteilung und optimaler Erfassung des Zielgewebes. Die Verteilung des Marks, insbesondere in der Wirbel- und der Beckengegend kann durch eine Erfassung während Zeiten abgebildet werden, die unter denen liegen, die optimal für die Leber und die Milz sind, was auch für die Kolloidalen-Schwefel-RES-Mittel zutrifft.

Eine Lösung des Albumins und des reduzierenden Metalls, vorzugsweise mit einem zusätzlichen Liganden in der Lösung wird bei gesteuertem pH-Wert und gesteuerter Temperatur, unter Bildung der Mikroaggregate erhitzt.

Die vorstehende Teilchengrößenverteilung erzielt man vorwiegend durch Steuerung der Konzentrationen der Bestandteile, des pH-Werts und der Erwärmungsbedingungen, wie im folgenden genauer beschrieben.

Das reduzierende Metall wird an das Albumin gebunden (es wird angenommen, daß ein physikalischer oder chemischer Komplex gebildet wird), wodurch die selektive Bindungswirksamkeit des Tc-99m an das denaturierte Albumin in Form von Mikroaggregaten erhöht wird, wenn die Mikroaggregat-Albumin-Teilchen anschließend markiert werden, um so eine erhöhte RES-Aufnähme und klare RES-Darstellung zu ergeben.

Die Funktion des zusätzlichen Liganden liegt darin, die Menge des reduzierenden Metalles zu erhöhen, die vor der Mikroaggregation

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gegen Hydrolyse stabilisiert werden kann (Bildung von unlöslichen Hydroxiden oder hydratisieren Oxiden des reduzierenden Metalls) . Es wird angenommen, daß im Verlauf der Denaturierung des Albumins, die durch Erhitzen bewirkt wird, Konformationsänderungen in dem Albumin· reaktive Gruppen freisetzen, die die Affinität des Albumins für das reduzierende Metall erhöhen, wodurch wesentlich grössere Mengen des reduzierenden Metalls an die und in den Mikroaggregaten gebunden werden, als dies anderweitig in Abwesenheit des zusätzlichen Liganden oder im Vergleich mit der Reaktion des reduzierenden Metalls mit dem Albumin nach dessen Mikroaggregation erzielt werden könnte. Auf jeden Fall trägt der zusätzliche Ligand wesentlich zu der ausgezeichneten radioaktiven Darstellung des RES bei. Falls jedoch, wie vorstehend erwähnt, das Anion des wasserlöslichen reduzierenden Metallsalzes eine ausreichend hohe Stabilitätskonstante zur Stabilisierung des Reduktionsmittels gegen die Hydrolyse aufweist, wie dies bei dem Fluorid der Fall ist, so besteht keine Notwendigkeit für einen zusätzlichen Liganden. In diesen Fällen ist das Anion tatsächlich ein stabilisierender Ligand für das reduzierende Metall.

Sollen die Mikroaggregate (^««.AA) zur Lagerung vor der Anwendung gefriergetrocknet werden, so werden sie vorzugsweise vor der Gefriertrocknung mit einer Stabilisatorlösung eines löslichen nicht denaturierten (unaggregierten) Albumins (HSA) vermischt, um die Dispersion · (Rekonstitution) der festen, gefriergetrockneten Teilchen in der Pertechnetatlösung zu unterstützen, wenn letztere zugesetzt wird, um die Mikroaggregate zu deren Verwendung mit Tc-99m zu markieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enhält die Stabilisatorlösung auch ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Pluronic F-68), um die Dispersion der festen gefriergetrockneten Teilchen in der Pertechnetatlösung weiter zu unterstützen.

Auch Puffer, wie Natriumphosphat, werden zugesetzt (vorzugsweise mit dem nicht-aggregierten HSA und oberflächenaktiven Mittel als ein Teil der Stabilisatorlösung),' um einen pH-Wert zu erzielen, der ausreichend vom isoelektrischen Punkt der Teilchen entfernt

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ORIGINAL INSPECTED

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ist, um das wieder aufbereitete, bzw. rekonstituierte Präparat gegen ein Teilchenwachstum zu stab.i"" isieren, wenn die Pertechnetatlösung anschließend zu den gefriergetrockneten Teilchen gefügt wird, um die Tc-markierten Albumin-Sn -Mikroaggregate, dispergiert in einer Salzlösung oder einem anderen pharmazeutisch und pharmakologisch brauchbaren Träger zur Injektion in den Patienten zu bilden. Es ist daher vorteilhaft, eine derartige gepufferte Stabilisatorlösung zusammen mit der Markierung zuzusetzen, selbst wenn das Produkt ohne Gefriertrocknung verwendet werden soll.

Zu den bevorzugtesten Liganden gehören die Diphosphonate; von diesen sind Methylendiphosphonat (MDP) und Hydroxyäthylendiphosphonat (HEDP) bevorzugt, jedoch kann jedes der in der US-PS 4 032 625 und in der DE-OS 2 424 296 beschriebenen Diphosphonate verwendet werden.

Von den Phosphaten ist Pyrophosphat (bevorzugt Natriumpyrophosphat) bevorzugt. Jedoch können auch Orthophosphate, die linearen Polyphosphate und organische Phosphate, wie Inosit-hexaphosphate verwendet werden.

Zu den verwendbaren Aminocarboxylaten gehören Äthylendiamintetraessigsäure-(EDTA)-salze und Diäthylentriaminpentaessigsäure-(DTPA) salze.

Zwar können Polyhydroxycarboxylate und Polycarboxylate als schwache Liganden wirken, jedoch sind sie nicht so geeignet, wie die vorstehend genannten.

Die verwendbaren Liganden sind nur durch die Fähigkeit, das reduzierende Metall ausreichend gegen Hydrolyse zu stabilisieren, und durch toxikologische Betrachtungen begrenzt.

Das bevorzugteste Albumin für die Anwendung am Menschen ist menschliches Serumalbumin, jedoch können auch Albumine anderer Primatenspezies für diagnostische Anwendungszwecke für die jeweiligen Spezies verwendet werden.

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Zwar ist das Zinn-II-Ion (Sn ) als reduzierendes Metall bevorzugt, jedoch können auch das Eisen-II-Ion (Fe ) und das einwertige Kupferion (Cu ) verwendet werden, jedoch mit nicht so guten Ergebnissen. Alle diese reduzierenden Metalle können in mindestens zwei kationischen Redox-Zuständen vorliegen, von denen eine niedrigere Wertigkeitsladung zur Reduktion des Pertechnetats für die anschließende Markierung erforderlich ist.

Zur Mikroaggregatbildung werden eine Lösung eines Gemischs des Albumins, des Liganden und des reduzierenden Metallls rasch auf eine Temperatur von 70 - 100°C, vorzugsweise von 80 - 100⁰C und besonders bevorzugt von 85 - 99°C erhitzt. Optimale Ergebnisse wurden bei Temperaturen von 90 - 99°C erzielt. Es können auch höhere Temperaturen angewendet werden, vorausgesetzt, daß der Druck ausreichend erhöht wird, um ein wesentliches Sieden der Reaktionsmasse zu verhindern. Die Erwärmungszeit kann zwischen Sekunden und Stunden liegen, je nach der Temperatur und der Art und Weise des Erwärmens. Beispielsweise erfordert die Erwärmung durch Mikrowellenenergie oder die Erhitzung mittels Radiofrequenz oder durch Induktionsheizung nur Sekunden, wohingegen das Erwärmen durch Eintauchen in siedendes Wasser oder durch Leiten durch Heizspiralen Minuten erfordert. Die maximale Erwärmungszeit wird von der Tatsache bestimmt, daß eine fortgesetzte Erwärmung nach der Bildung der Mikroaggregate ( α,ΑΑ) zu einer Zunahme der Teilchengröße des HSA-reduzierenden Metall-Komplexes über 5 u, m und/ oder zur Bildung vonlöslichen Abbauprodukten führen kann. Auch ein Sieden scheint zu einer Zunahme der Teilchengröße zu führen. Die minimale Erwärmungszeit und -temperatur werden von der Zeit und der Temperatur bestimmt, die erforderlich sind, um eine ausreichende Aggregation zur Bildung der wie vorstehend angegeben gewünschten Mxkrotexlchengrößenverteilung zu erzielen. Die maximale Erwärmungszeit und -temperatur werden von der Zeit und der Temperatur bestimmt, über die hinaus zu viele der Teilchen grosser als 5^t.m werden oder eine Zerstörung auftritt. Unter Berücksichtigung dieser Richtlinien können die optimale Erwärmungstemperatur und -zeit leicht durch Routineuntersuchungen jeglicher vorgegebenen Zusammensetzung für jegliche vorgegebene Erwärmungsart

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ermittelt werden, um die gewünschte Teilchengrößenverteilung zu ergeben. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden mit Erwärmungszeiten von 3-10 Minuten bei Erwärmungstemperaturen von 90 - 99°C erzielt, wobei die Erwärmung in einem Heißwasserbad erfolgte/ brauchbare Ergebnisse erzielte man bei Erwärmungszeiten während 2-5 Minuten, unter Verwendung eines derartigen Bades und derartiger Temperatur.

Es wird angenommen, daß das Albumin während dieser Erwärmungsstufe denaturiert wird, d. h. die Denaturierung erfolgt gleichzeitig mit der Mikroaggregatbildung.

Die Mikroaggregatbildung durch Erwärmen führt man bei einem pH-Wert durch, der sich in einem ausreichenden Abstand vom isoelektrischen Punkt des Albumins befindet (bei dem sich eine Ladung O oder nahe 0 auf den Molekülen befindet), unter Bildung der vorstehend genannten Teilchengrößenverteilung. In dieser Hinsicht besteht handelsübliches HSA aus einem Gemisch von Albuminen mit einer Verteilung der isoelektrischen Punkte. Dementsprechend können die isoelektrischen Punkte des Gemische von Ansatz zu Ansatz variieren. Es wurde berichtet, daß sie im Bereich von 4,8 bis 5,5 liegen; jedoch kann die Anwesenheit geladener Verbindungen, die zu einer Assoziation mit dem Albumin neigen, deren scheinbaren isoelektrischen Punkt beträchtlich verschieben. Es wird angenommen, daß sie diesen Effekt ausüben, entweder dadurch, daß sie ihre eigene Ladung auf das Albumin übertragen, oder durch Neutralisation einiger positiv oder negativ geladener Gruppen auf diesem Protein.

Je näher der pH-Wert am isoelektrischen Punkt liegt, desto größer sind die Aggregatteilchen. So tritt beim isoelektrischen pH-Wert eine Makroaggregation oder ungesteuerte Aggregation ein. Wird der pH-Wert vom isoelektrischen pH-Wert zur sauren Seite hin und zur alkalischen Seite hin wegbewegt, so werden die Teilchen kleiner und kleiner. Der optimale pH-Wert der vorliegenden Erfindung variiert mit dem zusätzlich verwendeten Liganden. Es hat sich gezeigt, daß die gewünschte Teilchengrößenverteilung der Mikroaggre-

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te über einen weiten Bereich von pH-Werten erzielt werden kann, der wiederum von dem speziellen zusätzli.ch verwendeten Liganden abhängt, wobei der günstigste Ligand der ist, der die gewünschte Teilchengröße über den breitesten pH-Wertbereich ergibt, wodurch das am wenigsten empfindliche und am leichtesten reproduzierbare System erhalten wird. Es wurde auch gefunden, daß die zunehmende Ionenstärke, z. B. der Zusatz eines neutralen Salzes, wie NaCl, während der Aggregation, den pH-Wert, bei dem die gewünschte Teilchengrößenverteilung erhalten wird, weiter vom isoelektrischen Punkt weg verschiebt. Vorzugsweise sind neben dem zusätzlichen Liganden und dem reduzierenden Salz die einzigen anderen vorhandenen Materialien, die die Ionenstärke der Präaggregat-Massen-Lösung (das Gemisch, das der Aggregation unterzogen wird) die Säure, z. B. HCl oder Base, z. B. NaOH, die zur Einstellung des pH-Werts verwendet werden. Jedoch können auch andere Materialien vorhanden sein, die die Ionenstärke beeinflussen.

Zwar kann die gewünschte Teilchengrößenverteilung in einem pH-Wertbereich auf der sauren Seite des isoelektrischen pH-Werts und auf der alkalischen Seite erzielt werden, jedoch ist letztere bevorzugt, da die Mikroaggregatbildung auf der sauren Seite andere Schwierigkeiten mit sich bringt.

Auf der sauren Seite des isoelektrischen Punkts kann der pH-Wert im Bereich von 3,5 - 4,5 liegen, und auf der alkalischen Seite des isoelektrischen Punkts kann er im Bereich von etwa 5,4 - 9,5, bevorzugter zwischen 5,5 und 7,0 und besonders bevorzugt zwischen 5,6 und 6,5 liegen, je nach dem zusätzlichen verwendeten Liganden, dem isoelektrischen Punkt des speziellen verwendeten Albumins und den Konzentrationen der Komponenten. Wurde jedoch der scheinbare isoelektrische Punkt durch die Anwesenheit einer geladenen Verbindung, wie vorstehend erwähnt, auf unter 4,5 verringert, so kann der optimale pH-Wert bei einem niedrigen Wert, wie 4,5, liegen.

Unter Bedingungen, die mit MDP untersucht wurden, wurden erfolgreiche Ergebnisse über einen pH-Wertbereich von 5,4 - 6,6, beson-

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ders bevorzugt von 5,6 - 6,5, erzielt, und optimale reproduzierbare Ergebnisse erzielte man in einem pH-Wertbereich von 5,7 6,35. Unter mit Pyrophosphat untersuchten Bedingungen erhielt man optimale Ergebnisse in einem pH-Wertbereich von 5,9 - 6,1.

Der optimale pH-Wert für jeden speziellen Liganden in jeder speziellen Konzentration kann leichtund routinemäßig durch Aggregation bei verschiedenen pH-Werten, die nicht beim isoelektrischen Punkt liegen, bestimmt werden, bis die gewünschte Teilchengrößenverteilung erzielt ist.

Das resultierende Metall, z. B. Zinn-II-Chlorid kann zu dem Albumin und der Liganden-Lösung als Feststoff gefügt werden, oder kann es als Lösung zugesetzt werden.

Die maximale Menge des reduzierenden Metalls liegt jenseits der Menge, bei der dessen Ausfällung vor der Aggregation des Albumins eintritt. Die minimale Menge ist die zur Reduktion und zur ausreichenden Bindung von ¹⁰Tc an das Albuminaggregat zur Bildung einer klinisch brauchbaren RES-Aufnähme, erforderliche. Diese Mengen können leicht für spezielle Gemische durch Routineuntersuchungen bestimmt werden. Sehr geringe Mengen an resultierendem Metall sind wirksam für eine entsprechende Reduktion und Bindung des Tc an das Albuminaggregat, z. B. weniger als ein 8:1-Molverhältnis von Zinn-II zu Albumin; da es jedoch leicht oxidiert wird, können Zusammensetzungen unter Verwendung der minimal erforderlichen Menge ihre Wirksamkeit während eines gewissen Lagerungs-Handhabungs- oder VerwendungsZeitraums verlieren. Dementsprechend wird ein Überschuß über die minimale Menge zur adäquaten Bindung des ^mTc verwendet. Wird die Menge des reduzierenden Metalls erhöht, so scheint ein Punkt für jede vorgegebene Kombination der Ausgangsmaterialien vorhanden zu sein, bei dem die Bindungswirksamkeit des Tc an das Albumin nicht weiter erhöht wird, entweder sofort oder als Funktion der Zeit bis zu 24 Stunden oder darüber nach der Markierung.

Berücksichtigt man dies, so kann das Molekulargewichtsverhältnis

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von reduzierendem Metall, insbesondere Sn , zu Albumin über einen weiten Bereich variieren, d. h. von 8:1 bis 80:1, vorzugsweise von 30:1 bis 50:1. Vorzugsweise überschreitet das Molekulargewichtsverhältnis von Sn zu Albumin 80:1 nicht. Ausgezeichnete Ergebnisse erzielte man mit Molverhältnissen von Sn zu Albumin von etwa 30:1 bis 50:1.

Die minimale Menge des zusätzlichen Liganden ist die zur Vermeidung der Bildung wesentlicher Mengen des unlöslichen Hydroxids oder hydratisierten Oxids des reduzierenden Metalls für jede vorgegebene Zusammensetzung durch Bindung des reduzierenden Metalls erforderliche. Die maximale Menge ist die Menge, über die hinaus es wesentlich mit dem Albumin in eine Konkurrenzreaktion mit dem

^mTc einzutreten beginnt, wenn die Mikroaggregate mit dem Pertechnetat vermischt werden. Derartige Liganden können, wenn sie im Überschuß zur für die Stabilisierung des resultierenden Metalls erforderlichaiMenge vorliegen, insbesondere solche mit einer hohen Affinität für Tc, mit dem ^Tc reagieren, unter Bildung von Komplexen, die zu Knochen, Nieren oder anderen nicht angestrebten Geweben wandern, wodurch die ungezielte Aufnahme auf Kosten der RES-Aufnahme erhöht wird und die Wirksamkeit der Mikroaggregate als RES-Mittel verringert wird. Dementsprechend sollte die Menge des Liganden nicht in wesentlichem Überschuß über die Menge vorliegen, die zur Stabilisierung des reduzierenden Metalls erforderlich ist. Die minimalen und maximalen Mengen des Liganden können leicht durch Routineuntersuchurigen auf unlösliche Hydroxide vor der Aggregation sowie durch Beobachtung der Wirkung auf die Aufnahme durch Knochen, die Aufnahme durch Nieren, durch die Ausscheidung im Urin und andere nicht angestrebte Verteilungen durch das Aggregationsprodukt bestimmt werden. Darüber hinaus kann, je größer die Konzentration des Liganden ist, der pH-Wertbereich, in dem die gewünschte Teilchengrößenverteilung während der Aggregation erzielt wird, enger werden. Dementsprechend ist es zur Erzielung optimaler Ergebnisse wünschenswert, wenig mehr als die minimale Menge des Liganden zu verwenden, die notwendig ist, um das reduzierende Metall vor der Aggregation in Lösung zu halten.

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Die Konzentration des zusätzlichen Liganden und dessen maximale und minimale Mengen hängen ebenfalls von dem verwendeten Liganden ab, da manche Liganden, wie MDP, eine größere Bindungskapazität (eine höhere Stabilitätskonstante) und eine geringere Ionenstärke als andere aufweisen. Ein Ligand, der den weitesten pH-Wertbereich bereitstellt, in dem die gewünschte Teilchengrößenverteilung er-' zielt wird, ist am günstigsten. Die Diphosphonate, insbesondere MDP und HEDP, fallen unter diese Kategorie. Die maximalen und minimalen Mengen des Liganden hängen auch von dem speziellen pH-Wert ab, bei dem die Aggregation durchgeführt wird.

Die optimale Menge des zusätzlichen Liganden ist zu gering, um eine nennenswerte Pufferwirkung auszuüben, oder das Verhältnis von gezielter zu nicht gezielter Aktivität zu verringern, selbst wenn es sich bei dem Liganden um einen handelt, der bekanntlich ungezielte Gewebe aufsucht. Interessanterweise läßt sich feststellen, daß der Zusatz eines Liganden, von dem es bekannt ist, daß er ungezielte Gewebe aufsucht, das Verhältnis von gezielt zu ungezielt erhöht.

Da der komplexbildende Rest des Liganden zur Bindung des reduzierenden Metalls fungiert, wird die Konzentration des Liganden am besten als Molekulargewichtsverhältnis dieses Rests zu dem reduzierenden Metallion, z. B. Sn , ausgedrückt. Dieses Verhältnis hängt stark von der Wahl des Liganden ab. Für einen, wie Methylendiphosphonat, der eine ziemlich hohe Stabilitätskonstante aufweist, liegt dieses Verhältnis vorzugsweise bei 0,6:1 bis 1,2:1; für einen wie Glucoheptonat, der eine ziemlich geringe Sta.V>ilitätskonstante aufweist, ist etwa das 2,5fache dieses Verhältnisses bevorzugt.

Bei Verwendung von MDP und Zinn-II-Chlorid und einem pH-Wertbereich von 5,4 - 6,6 wurden erfolgreiche Ergebnisse mit einem Liganden: SnCl₂-2H₂O-Gewichtsverhältnis von 0,5:1 bis 1:1 erzielt. Wird der pH-Wert über diesen Bereich hinaus erhöht, so kann die Konzentration von MDP erhöht werden, um die gleiche Bioverteilung zu erzielen.

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Aus dem vorstehenden ist ersichtlich, daß eine funktioneile, wechselseitige Abhängigkeit zwischen der Wahl und der Konzentration des Liganden und dem optimalen pH-Wert zur Erzielung von Teilchen mit dem geeigneten Größenbereich während der Aggregation besteht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung führt man die Aggregation in Anwesenheit eines wasserlöslichen, pharmakologisch und toxikologisch brauchbaren, oberflächenaktiven Mittels der gleichen Art durch, die vorzugsweise in die Stabilisatorlösung eingebracht wird. Zwar wurden gute Ergebnisse ohne Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels während der Aggregation erzielt, jedoch ist dessen Verwendung als zusätzliche Sicherheit bevorzugt, da angenommen wird, daß es die Reproduzierbarkeit und die Stabilität der Aggregate hinsichtlich der Teilchengröße verbessern kann.

Zur Anwendung in der Aggregationsstufe und in der Stabilisatorlösung sind zahlreiche oberflächenaktive Mittel geeignet. Vorzugsweise sind die oberflächenaktiven Mittel vom nicht-ionischen Typ und sind bei Raumtemperatur Feststoffe. Geeignete oberflächenaktive Mittel sind solche, die nicht-toxisch gegenüber den Bestandteilen vom Blut oder Geweben sind und die vorzugsweise ein Hydrophil/Lipophil-Gleichgewicht (HLB) von etwa 14 bis etwa 40, besonders bevorzugt von etwa 27 bis 30,5 aufweisen. Verwendet man ein oberflächenaktives Mittel in der Aggregationsstufe, so wird dies gewöhnlich nur in einer sehr geringen Menge eingesetzt. Vorzugsweise liegt ein gegebenenfalls in der Präaggregatmasse verwendetes oberflächenaktives Mittel in einer Menge von etwa 0,1 % bis etwa 10 % des Albumins in einer derartigen Präaggregat ionsmas se, besonders bevorzugt von etwa 2 - 8 %, bezogen auf das Gewicht, vor.

Das in der Stabilisatorlösung gelöste oberflächenaktive Mittel unterstützt, wie vorstehend erwähnt, die rasche Dispersion (Rekonstitution) des gefriergetrockneten Albumin-reduzierendes Metall-Aggregats in der Pertechnetatlösung, wenn letztere Lösung für die

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Verabreichung an den Patienten zugesetzt wird. Die in der Stabilisatorlösung verwendete Menge des oberflächenaktiven Mittels ist im allgemeinen größer als die in der Aggregationsstufe verwendete Menge·

Vorzugsweise liegt das oberflächenaktive Mittel in der Stabilisatorlösung in einer Menge von etwa 0,2 - 20 %, besonders bevorzugt von 1 - 10 % der lyophilisierten Zusammensetzung (Feststoffbasis) vor.

Geeignete oberflächenaktive Mittel zur Anwendung während der Aggregation und in der Stabilisatorlösung umfassen Polysorbat 80, U. S. P., Polyäthylenglykole mit höherem Molekulargewicht, wie Carbowaxe der Union Carbide, und molekulare Kombinationen von Polyoxyäthylen und Polyoxypropylen (Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymeres), z. B. die Pluronics der BASF Wyandotte. Vgl. hierzu auch McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1973) , Seiten 213 - 217, wo verschiedene handelsübliche oberflächenaktive Mittel mit HLB-Werten von etwa 14 - 4o aufgeführt sind. Besonders bevorzugt sind die Pluronics, insbesondere Pluronic F-68, das ein Molekulargewicht von etwa 8350, eine HLB-Zahl von 29,0 aufweist und bei Raumtemperatur fest ist.

Das Volumenverhältnis von nicht-aggregierter Albuminstabilisatorlösung (die gegebenenfalls oberflächenaktive Mittel und Puffer enthält) zu dem menschlichen Serumalbumin in Aggregatform (Aggregat-Masse) kann über einen weiten Bereich variieren. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden mit Verhältnissen von 1:1 bis 1:3 erzielt, wobei ein Verhältnis von 1:2 bevorzugt ist.

Bezogen auf die endgültige lyophilisierte feste Zusammensetzung kann das Verhältnis von löslichem Albumin zu aggregiertem Albumin im Bereich von etwa 3:1 bis 20:1, bevorzugt von 5:1 bis 15:1 liegen.

Die Pufferverbindung wird zu der Masse in Aggregatform entweder als ein Teil der Stabilisatorlösung, oder, falls eine derartige

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Lösung nicht verwendet wird, als solche zugesetzt, um den pH-Wert auf 7-9, vorzugsweise 8-0,5 aus dem vorstehend angegebenen Grund anzuheben. Jegliche pharmakologisch verträgliche und toxikoligisch brauchbare Pufferverbindung kann verwendet werden. Geeignete Puffer umfassen Mischungen von Säuren und Salzen schwacher Säuren, wie die geeigneten Natriumsalze von Orthophosphorsäure.

In einigen Fällen kann es günstig sein, zu der voraggregierten Masse einen Elektrolyten zu fügen, wie lösliche Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, ζ. B. NaCl, um die Ionenstärke einzustellen.

Die maximale Menge an Tc (Pertechnetat), die zu den Albuminaggregaten zugesetzt wird, bezogen auf denaturiertes und aggregiertes HSA, wird durch die Tatsache bestimmt, daß jeglicher wesentliche Überschuß über die Menge, die an die Mikroaggregate gebunden wird, keine günstige Wirkung aufweist und aus Gründen vermieden werden sollte, die nichts mit der Erfindung zu tun haben, nämlich da die Menge an in den Körper injiziertem radioaktivem Material auf dem erforderlichen Minimum gehalten werden sollte. Jedoch kann ein geringer Überschuß über die Menge, die an die Mikroaggregate gebunden wird, verwendet werden. Basierend auf Untersuchungen an Primaten, stören bis zu 10 % freies Pertechnetat voraussichtlich die klinische Brauchbarkeit nicht. Die minimale Menge wird durch die Menge bestimmt, die erforderlich ist, um klinisch brauchbare Bilder bzw. Darstellungen zu ergeben. Das Molekulargewichtverhältnis von Tc zu aggregiertem HSA (bezogen auf das Molekulargewicht des HSA vor der Aggregation) kann aroß sein, beispielsweise 0,25 oder größer.

99m
Die radioaktive Dosis der mit Tc markierten Mikroaggregate in der Erfindung kann von 0,037 · 10 bis 185 · 10 1/s (bzw. 0,01 bis 50 mCi = Millicuries) pro Patient, vorzugsweise von 3,7 · bis 185 · 1O⁷ 1/s (1 - 8 mCi) variieren.

Vorzugsweise kann das Volumen der zu der endgültigen Masse als solcher oder nach der Gefriertrocknung zugesetzten Pertechnetatlösung von 1 - 10, vorzugsweise von 1 - 8 ml variieren, die 3,7 · 10 bis

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11 IO · 10 1/s (1 - 300 mCi) oder mehr, vorzugsweise 18,5 · 1O⁷ bis 185-10 1/s (5 - 50 mCi) pro Milligramm denaturiertes Albumin enthält. Die Pertechnetatlösung stellt gewöhnlich das Eluat eines üblichen ^mTc-Generators dar, dies ist jedoch nicht notwendigerweise so.

Eine bessere Bindung des reduzierenden Metalls an HSA und homogenere Mikroaggregate erzielt man bei geringerer Oxidation des reduzierenden Metalles durch dessen Vermischung mit dem zusätzlichen Liganden mit HSA vor der Aggregation, woraus eine verbesserte RES-Darsteilung resultiert. Es wird angenommen, daß ein inniger Kontakt zwischen HSA und reduzierendem Metall erzielt wird, da sich HSA während des Erhitzens öffnet, und dessen frisch freigesetzte Bindungsstellen mit dem reduzierenden Metall vor und während der Aggregation reagieren und das reduzierende Metall zu einem innigen Teil der Mikroaggregatteilchen wird.

Wie vorstehend erwähnt, hat es sich gezeigt, daß verbesserte Ergebnisse erzielt werden, wenn HSA in Anwesenheit des reduzierenden Metalls aggregiert wird. Jedoch führt die Anwesenheit des reduzierenden Metalls während der Aggregation zu Problemen, die sich nicht ergeben, wenn die Aggregatbildung von HSA in Abwesenheit des reduzierenden Metalls erfolgt und die durch die Anwesenheit des Liganden während der Aggregatbildung, durch Steuerung des pH-Werts und der Erwärmungsbedingungen während der Aggregation sowie durch die Erhaltung anaerbber Bedingungen während des Vorgangs ausgeglichen werden.

Ein derartiges Problem liegt in der Erzielung der gewünschten Teilchengrößenverteilung; ein weiteres in der Bindung der erforderlichen Menge an reduzierendem Metall an das denaturierte Albumin; darüber hinaus liegt ein Problem in der Vermeidung der Bildung von unlöslichen Hydroxiden oder hydratisierten Oxiden des reduzierenden Metalls.

Das Wasser oder die anderen pharmazeutisch brauchbaren Träger', das zur Bildung der verschiedenen Lösungen verwendet wird und in

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dem die Mikroaggregatbildung erfolgt, ist vorzugsweise apyrogenes destilliertes Wasser, das zur Verringerung seines Sauerstoffgehalts behandelt wurde.

Vorzugsweise werden auch alle Stufen des Verfahrens unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, d. h. in Abwesenheit von Sauerstoff, wie beispielsweise unter einer Stickstoffatmosphäre.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch der Stabilisatorlösung und der denaturierten HSA-reduzierendes Metall-Mikroaggregate, das gegebenenfalls den Liganden enthält, in üblicher Weise, in sterilen, nicht-pyrogenen Behältern oder Fläschchen gefriergetrocknet, die verschlossen werden und in Form eines Reagenssatzes (Kit) auf den Markt gebracht werden, der an dem Ort der Verwendung durch Zusatz der vorgeschriebenen Menge des radioaktiven Pertechnetats in das Fläschchen angewendet werden kann.

Was die Technik zur Bestimmung der radioaktiven Verteilung der Mikroaggregate durch die Teilchengröße betrifft, so besteht eine verwendbare Technik, die zur Verdünnung der aliquoten Teile von

Tc-markierten Mikroaggregaten zum Durchlauf durch die in Reihe angeordneten Filter verwendet wurde darin, zu den markierten Mikroaggregaten, d. h. dem Produkt, das aus der Zugabe der Pertechnetatlösung zu den lyophilisierten Aggregaten resultiert, eine Verdünnung der Stabilisatorlösung in einem Gewichtsverhältnis von 9 Teilen verdünnte Stabilisatorlösung zu 1 Teil markierter Aggregate, zu fügen. Dieses Verhältnis kann über einen weiten Bereich variieren, so lange der endgültig verdünnte aliquote Teil die Poren der Filtermembranen nicht übermäßig verstopft. Die Stabilisatorlösung wird verdünnt durch Zusatz einer ausreichenden Menge an Salzlösung, um sie auf etwa- die gleiche Feststoffkonzentration, wie die cles markierten Produkts, zu bringen. Die hier erwähnten Teilchengroßenverteilungen wurden durch diese Technik erhalten. Es können jedoch auch andere Techniken verwendet werden.

Zwar ist die Stabilisatorlösung nicht erforderlich, wenn die Postaggregat-Masse ohne Gefriertrocknung verwendet werden soll,(in die-

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sem Falle kann der Puffer als solcher zugesetzt werden), jedoch fügt man vorzugsweise die Stabilisatorlösung mit dem Puffer zu, um die Teilchengröße bei Zusatz der Pertechnetatlösung zu stabilisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, als halbkontinuierliches Verfahren oder als kontinierliches Verfahren, unter Anwendung eines relativ großen Verhältnisses von Erwärmungsoberfläche zu Volumen durchgeführt werden.

Vorzugsweise wird die Präaggregatmasse durch eine sterilisierende Membrane filtriert, z. B. eine 0,22 Mm sterilisierende Membrane, bevor die Aggregation erfolgt, und die Stabilisatorlösung wird durch ein sterilisierendes Filter filtriert, bevor sie zu der Postaggregatmasse gefügt wird.

Vorzugsweise wird auch die endgültige Masse (das Gemisch der Postaggregatmasse und der Stabilisatorlösung) durch ein 3 Filter geführt, um Teilchen zu entfernen, die größer als 3 Mm sind, worauf sie in Fläschchen verteilt und lyophilisiert wird.

Die Postaggregatmasse bzw. Nachaggregationsmasse der Erfindung weist ein milchiges bis trübes Aussehen auf, je nach den in der Agggregationsstuf angewendeten Bedingungen. Bei niedrigeren pH-Werten innerhalb des verwendbaren pH-Wertbereichs kann sie opak sein. Wird der pH-Wert gegen die Mitte dös Bereich angehoben, so wird sie leicht- · milchig mit einer leichten Durchschein barkeit und bei weiter steigenden pH-Wert-Bedingungen innerhalb des Bereichs wird sie trüb.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

zu 90 ml Mischwasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt fügt man unter anaeroben Bedingungen folgende Bestandteile: 0,6 ml menschliches Serumalbumin, 25 % (25 g/100 ml) Salzarm U.S.P., wobei das HSA 0,15 g wiegt, 3 ml Natriunmiethylendiphosphonat-(MDP)-Lösung (0,5 g Methy1endiphosphonsäure, gelöst in 100 ml 0,05 η-Natriumhydroxid), 11,15 ml 0p5 η-Natriumhydroxid zur Einstellung des pH-Werts, 0,5 ml Zinn-II-Chloridlösung (4,2 g Zinn-II-Chloriddihydrat plus 1,5 ml 12 η-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt) und 0,6 ml einer 1 %igen wässrigen Lösung von Pluronic F-68, einem Äthylenoxid-Propylenoxid-Copolymeren, das ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist. Der pH-Wert der Lösung beträgt 6,1. Aliquote Teile dieser Lösung werden anaerob durch eine 0,22Mm sterilisierende Membrane filtriert und 3,5 Minuten in einem Wasserbad auf etwa 99°C erwärmt, wobei man eine milchige Suspension von Mikroaggregaten des HSA und Sn erhält.

Zu etwa 50 ml Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt fügt man unter anaeroben Bedingungen 5,7 g Dinatriumorthophosphat-heptahydrat (Puffer), 12 ml 25 % HSA uid 0,33 g Pluronic F-68. Nach Auflösen der Feststoffe wird die Stabilisatorlösung mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml verdünnt und anaerob durch ein sterilisierendes Filter geleitet.

3,3 ml der vorstehenden sterilen stabilisierenden Lösung werden anaerob mit 6,7 ml der sterilen milchigen Suspension der Mikroaggregate vermischt. Aliquote Teile von 1 ml dieser Formulierung, die einen pH-Wert von 8 aufweist, werden antiseptisch in sterile, pyrogenfreie 10 ml Serum-Fläschchen eingefüllt. Die Fläschchen werden in üblicher Weise und unter antiseptischen Bedingungen zur Entfernung des Wassers gefriergetrocknet (lyophilisiert). Man erhält so feste Mikroaggregate des Komplexes (chemisch oder physikalisch) von denaturiertem HSA und Sn . Jedes Fläschchen enthält 1 mg Mikroaggregatteilchen von komplexem, denaturiertem und aqgregiertem HSA, 10 mg nicht-aggregiertes HSA, 0,1. mg SnCl₂

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0,1 mg MDP, 10 mg Phosphatpuffer (ausgedrückt als Dinatriumorthophosphat) und 1,14 mg Pluronic F-68-oberflächenaktives Mittel.

Die Fläschchen werden verschlossen und gelagert bis zum Gebrauch) bei dem das darin enthaltene Zinn-II-Mikroaggregat-Albumin mit ¹¹Vc markiert wird.

Zur Herstellung der mit Tc markierten Aggregate werden 5 ml

frisches, radioaktives Natriumpertechnat (etwa 370 · 10 1/s bzw. 100 mCi, obwohl eine wirksame Markierung auch mit weniger als 3,7 · 10⁷ 1/s bzw. 1 mCi bis über 1110 * 10⁷ 1/s bzw. 300 mCi erzielt wird), die von einem sterilen, pyrogenfreien Eluat aus einem sterilen NEN- ^Tc-Generator in einer 0,9 %igen Salzlösung erhalten werden, antiseptisch in jedes Fläschchen gefügt. Das Fläschchen wird zur Auflösung der löslichen Bestandteile und zur Dispersion der Mikroaggregatteilchen in der Salzlösung geschüttelt wodurch das gefriergetrocknete Produkt rekonstituiert und die Mikroaggregate markiert werden.

In allen Stufen werden antiseptische Techniken und sterile, pyrogenfreie Bestandteile und Behälter verwendet.

Die durch die Teilchengröße der Mikroaggregate bewirkte Aktivitätsverteilung ergab in einem derartigen Präparat folgende Ergebnisse:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

V 5 j* m 0,5

3-5^m 1,5

0,2 - 3 jam 71 ,1

S 0,2 **m 26,9

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3,7 * 10 bis 18,5 · 10 1/s (bzw. 1-5 mCi) dieser Dispersion von mit ^mTc markierten Zinn-II-Mikroaggregaten wurden erwachsenen Mäusen intravenös injiziert.

15 Minuten nach der intravenösen Injektion wurden die Mäuse getötet und die verschiedenen Organe (Leber, Milz usw.) wurden mittels üblicher /-Strahlen-Zähltechniken zur Bestimmung der ¹Vc-AUfnähme durch jedes Organ untersucht.

Bioverteilung in den Mäusen, 15 Minuten nach der intravenösen

Injektion

Organ % der injizierten Dosis pro Organ

Leber 87,8

Milz _u · 2,6

Lungen 0,5

Skelett 5,8 (einschließlich

Knochemark)

Nieren 1,0

Gastointestinaltrakt 0,6

Rest 1,6

3,7 * 10⁷ bis 18,5 * 1O⁷ 1/s (bzw. 1 - 5 mCi) ähnlicher Präparate wurden intravenös Primaten (Paviane) injiziert. Eine Leber-Milz-Darstellung wurde in Üblicher Weise während dar 30 Minuten nach

,1

der Injektion unter Anwendung einer ^ -Scintillationskamera (Picker Dyna Camera II) durchgeführt.

Man erhielt gleichzeitig scharfe klare Bilder der Leber und der Milz mit schwachem Hindergrund. Die Aufnahme durch die Lunge und die weichen Gewebe war minimal. Es können auch ausgezeichnete Darstellungen des Knochenmarks bei entsprechend längerer Einwirkung als der für die Leber und Milz angewendeten erhalten werden. Diese Darstellungen waren ebenso gut, wie die mit einem Schwefelkolloid-

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RES-Mittel erhaltenen und sind klinisch für genaue diagnostische Zwecke geeignet. Zwar ist es durch die Bioverteilung der Radioaktivität in den Mäusen möglich, die selektive Aufnahme durch das RES insgesamt (Leber, Milz und Knochenmark) in Primaten und den Gegensatz zwischen der Aufnahme des RES insgesamt und der Aufnahme durch die anderen Organe vorherzusagen, jedoch geht sie nicht mit dem Leber-Milz-Aufnahmeverhältnis in Primaten und daher mit der Qualität der individuellen Milz-Darstellung und gleichzeitig der Leber-Darstellung in Primaten einher (vgl. hierzu Int. J. of Applied Radiation and Isotopes 1977, Band 28, Seiten 123 - 13o). Dementsprechend ist es zur Vorhersage des Verhältnisses und der Qualität beim Menschen notwendig, das RES eines Primaten, wie eines Affen oder eines Pavians darzustellen.

Die vorstehende Bioverteilung bei Mäusen und die radioaktive RES-Darsteilung bei Primaten zeigen, daß die radioaktiv markierten Zinn-II-Albumin-Mikroaggregatpräparate des Beispiels ausgezeichnete RES-Mittel bei ausgezeichneter gleichzeitiger Milz-Leber-Definition sind.

Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielte man, wenn die Gefriertrocknungsstufe ausgelassen wurde. Auch können gute Ergebnisse erzielt werden, wenn das Zinn-II-Albumin-Mikroaggregat direkt verwendet wird, ohne Gefriertrocknung und ohne Zusatz der stabilisierenden gepufferten HSA-Pluronic-F-68-Lösung, jedoch mit Zusatz von ausreichend Puffer, um den gleichen pH-Wert zu erzielen. Werden jedoch die Mikroaggregate ohne Zusatz einer derartigen Stabilisatorlösung gefriergetrocknet, so ist es schwierig, sie erneut durch Zusatz der Pertechnetat-Lösung zu disnergieren. Unabhängig davon, ob die Mikroaggregate gefriergetrocknet werden, kann ohne Stabilisierung durch den Puffer die Teilchengröße in der Pertechnetat-physiologische Salz-lösung in ungesteuerter Weise zunehmen .

In jedem der folgenden Beispiele werden sämtliche Misch-, Filter- und Erwärmungsstufen anaerob, wie in diesem Beispiel, durchgeführt, und in jedem Falle werden aliquote Teile von 1 ml dispergiert in 10 ml

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sterilen, pyrogenfreien Fläschchen, den gleichen Stufen, wie in Beispiel 1 unterzogen, d, h. die aliquoten Teile können gefriergetrocknet und markiert werden oder sie können ohne Gefriertrocknung markiert werden, und der markierte aliquote Teil wird auf die Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße wie vorstehend untersucht. Die Bioverteilung in Mäusen und die radioaktiven Darstellungen von Affen werden bei Durchführung dieser Untersuchungen, wie in jedem Beispiel angegeben, in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 2

Zu 45 ml eines Gemischs von Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden folgende Bestandteile gefügt: 0,3 ml 25 % HSA (75 mg HSA) 0,25 ml Zinn-II-Chlorid-Lösung (wie in Beispiel 1), 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-Lösung, 11,2 mg Diäthylentriaminpentaessigsäure und 1,65 ml 0,1 η-Natriumhydroxid. Der pH-Wert der Lösung beträgt 6,54. Aliquote Teile dieser Lösung, filtriert durch eine 0,22 .am sterilisierende Membran und erwärmt während 3,5 Minuten auf etwa 99 C, ergeben eine leicht milchige Suspension von Mikroaggregaten des denaturierten HSA und Sn

3,3 ml einer stabilisierenden Lösung, zusammengesetzt wie im Beispiel 1, werden anaerob mit 6,7 ml der milchigen Suspension vermischt. Aliquote Teile von 1 ml dieser Formulierung, die einen pH-Wert von 8 aufweisen, werden in sterile, pyrogenfreie 10 ml Serumfläschchen, wie in Beispiel 1, verteilt. Die Testdaten eines derartigen Präparats, das wie in Beispiel 1 verarbeitet und markiert wurde, sind im folgenden aufgeführt:

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Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

> 5/cm 1,1

3 - 5 ,um 1,1

0,2 - 3 /*m 68,4

ν 0,2 ydm 29,5

Beispiel 3

Zu 45 ml Mischungswasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt fügt man folgende Bestandteile: 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-Lösung, 0,3 ml 25 % HSA (75 mg HSA), 0,25 ml Zinn-II-Chlorid-Lösung (4,2 g Zinn-Il-Chlorid plus 3 ml 12 η-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt). 16,7 ml dieser Lösung werden mit 1 ml einer 1 %igen wässrigen Lösung von Natriumpyrophosphat (10,2 mg Na₄P₃O₇-IOH₂O) und 0,55 ml 0,025 n-Natriumhydroxidlösung vermischt. Der pH-Wert der Lösung beträgt 5,85. Aliquote Teile dieser Lösung, filtriert durch eine 0,22 ^m sterilisierende Membran und erwärmt während 3,5 Minuten in siedendem Wasser, ergeben eine milchige Suspension von Mikroaggregaten aus denaturiertem HSA.

Zu etwa 50 ml Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden 5,7 g Na₃HPO₄·7H₂O, 12 ml 25 % HSA und 0,33 g Pluronic F-68 gefügt. Nach Auflösen der Feststoffe wird diese stabilisierende Lösung mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml verdünnt und durch ein sterilisierendes Filter geleitet.

3,3 ml der vorstehenden stabilisierenden Lösung werden anaerob mit 6,7 ml der milchigen Suspension vermischt. Aliquote Teile von 1 ml dieser Formulierung, die einen pH-Wert von 8 aufweist, werden in 10 ml Serumfläschchen verteilt. Die Untersuchungsergebnisse eines

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derartigen Präparats, verarbeitet und markiert, wie in Beispiel 1" beschrieben, sind im folgenden aufgeführt:

Aktivitätsvertexlung durch die Teilchengröße:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

^ 5 /*.m 1 ,0

3-5 /«.m 1 ,0

0,2 - 3 /»m 69,0

«^ 0,2 y^m 29,0

Beispiel 4

Zu 290 ml von Mischwasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden folgende Bestandteile gefügt:

1 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,2 g Pluronic F-6 8 pro 5 ml, 4 ml 25 % HSA (1 g HSA), 3 ml einer Zinn-II-Chloridlösung (4,64 g Zinn-II-Chloriddihydrat plus 2 ml 12 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml), 0,66 g Na₂HPO₄-TH₃O in 15 ml Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt und 4,04 ml 4-molare Natriumchloridlosung. Der pH-Wert der Lösung beträgt 6,5. Nach anaerobem Filtrieren durch eine 0,22 /itm sterilisierende Membran wird sie nacheinander und kontinuierlich durch zwei Wärmeaustauscher geleitet. Dies stellt eine halbkontinuierliche Methode zur Aggregation dar, die durch Anwendung geeichter und kontinuierlicher Ströme des Compoundierungs-Materials in einer Mischkammer mit"kontinuierlichem Abstrom daraus durch das Filter und die Wärmeaustauscher kontinuierlich gemacht werden kann, wobei der Austritt aus dem Wärmeaustauscher kontinuierlich in eine Mischkammer eingemessen wird, in die die Stabilisatorlösung kontinuierlich eingemessen und vermischt wird, wobei das resultierende Gemisch kontinuierlich durch das 3 Am-Filter

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geleitet und in Fläschchen verteilt wird, die kontinuierlich in den Gefriertrockner beschickt werden können. Der erste Wärmeaustauscher wird durch ein auf etwa 99 C gehaltenes Fluid erwärmt, und der zweite, aus dem die aggregierten Produkte anaerob gewonnen werden, wird durch ein Fluid auf Raumtemperatur gekühlt. Die durchschnittliche Verweilzeit der Masse in jedem Wärmeaustauscher beträgt 3-8 Minuten und führt zu einer milchigen Suspension von Mikroaggregaten von Zinn-II-denaturiertem HSA.

Zu 10 ml Natriumphosphatlösung (9,5 g Na₃HPO₄ *7H_O pro 100 ml) fügt man 2 ml 25 % HSA (0,5 g HSA), 6,25 ml Pluronic F-68-Lösung (4,0 g pro 100 ml) und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 35 ml Stabilisatorlösung. Nach gutem Vermischen, Befreien von Sauerstoff und sterilisierender Filtration werden 15 ml der milchigen Suspension zugesetzt, worauf erneut sorgfältig vermischt wird.

Aliquote Teile von 1 ml dieser Formulierung, die einen pH-Wert von 8 aufweist, werden in 10 ml Serumfläschchen verteilt. Die üntersuchungsergebnisse eines derartigen Präparats, das wie in Beispiel 1 markiert wurde, sind im folgenden aufgeführt:

Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

> 3 ,Um 7

1 - 3 /im 16

0,2 - 1 _/itm 57

0,2 ^ttm 18

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— O / —

Bioverteilung in Mäusen, 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:

Organ	% der injizierten Dosis
	pro Organ
Leber	89,3 -
Milz	1,1
Lungen	1,0
Skelett	7,7
Nieren	0,5
Gastrointestinaltrakt	0,2
Rest	0,2

Beispiel 5

Zu 45 ml Mischwasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt fügt man folgende Bestandteile:

0,3 ml 25 % HSA (75 mg HSA), 0,25 ml Zinn-II-Chlorid-Lösung (4,2 g Zinn-II-Chlorid-Dihydrat plus 3 ml 12 η-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml), 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-Lösung und 3,7 ml 1 % Natriumpyrophosphatlösung (hergestellt wie im Beispiel 3). Der pH-Wert beträgt 5,71. Aliquote Teile dieser Präaggregations-Massen-Lösung, filtriert durch eine 0,22 ^m sterilisierende Membran und ausreichend durch Mikrowellen erhitzt, z. B. während 20 Sekunden, ergeben eine milchige Suspension von Mikroaggregaten von Zinn-II-denaturiertem HSA.

Die milchige Suspension wird mit einer HSA-Natriumphosphat-Pluronic F-68-Stabilisator-Lösung, unter Bildung einer Formulierung vom pH-Wert 8 formuliert, worauf sie in Fläschchen verteilt und mit 7 ml Tc-Natriumpertechnetat, wie in Beispiel 3, markiert wird. Ein derartiges Präparat ergab folgende Untersuchungsergeb-

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- 38 nisse:

Aktivitätsverteilung durch Teilchengröße:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

> 5 ^m 2,1

3 - 5 _/m. m 3,1

0,2 - 3 ^m 84,0

^ 0,2 yc^rn 10,8

Bioverteilung in Mäusen, 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:

Organ % der injizierten Dosis pro Organ

Leber	85,9
Milz	4,3
Lungen	0,5
Skelett	5,3
Nieren	1,0
Gastrointestinaltrakt	0,7
Rest	2,3

Beispiele 6 und 7

Zu 417 ml Mischwasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden folgende Bestandteile gefügt:

16,3 ml (0,75 g) gereinigtes HSA (von Lipiden befreit durch Ansäuern und Aktivkohlebehandlung, wie in der der US-PS 4 094 bzw. der entsprechenden Patentanmeldung P 28 14 038.7 beschrieben, gefolgt durch Ultrafiltration, unter Bildung einer

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Albuminkonzentration von 4,6 %) , 2,5 ml Zinn-II-Chloridlösung (4,2g Zinn-II-Chlorid-Dihydrat plus 3 ml 12 n-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml) und 3 ml 1 % Pluronic F-68-Lösung. Die resultierende Lösung wird gut mit 25,6 ml einer 1 %igen wässrigen Lösung von Natriumpyrophosphat (hergestellt wie in Beispiel 3) unJ 34,2 ml 0,025 η-Natriumhydroxid vermischt. 150 ml der resultierenden Lösung werden durch eine 0,22Mm sterilisierende Membran filtriert. Diese filtrierte Präaggregations-Masse mit einem pH-Wert von 5,62 wird für das Beispiel 6 zurückgelegt.

Weitere 3,4 ml 0,25 η-Natriumhydroxid werden zu der verbleibenden Lösung gefügt, wobei weiter gerührt wird. Der pH-Wert beträgt 6,11. Es wird wie vorstehend filtriert. Diese Präaggregations-Masse wird für das Beispiel 7 zurückgelegt.

Aliquote Teile beider Präaggregations-Massen werden während 3,5 Minuten in einem heißen Wasserbad zur Bildung von Mikroaggregaten

auf 99°C erwärmt.	Beispiel 6	Beispiel 7
Aussehen	X	X
milchig trüb

Bei Formulierung mit Stabilisatorlösung (der pH-Wert der stabilisierten Lösung beträgt 8), verteilt in Fläschchen und markiert mit 5 ml ^Tc-Natriumpertechnetat, jeweils wie in Beispiel 3 beschrieben, erhielt man folgende Ergebnisse:

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Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße:

	% des	Gesamtwerts
Teilchengröße	Beispiel	6 Beispiel 7
> 5 _/fc m	1,9	0,7
3-5 ^m	2,8	1,3
1-3 fn. m	32,7	1,3
o, z — ι A^,m	50,5	4,6
/ 0,2 m	12,2	92,1

Bioverteilung in Mäusen, 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:

Organ % der injizierten Dosis pro Organ

Beispiel 6 Beispiel 7

88,3 2,2

0,6 7,3 0,7 0,3 0,6

Darstellung bei Affen:

Organ Bildqualität

Beispiel 6 Beispiel 7

Leber gut gut

Milz gut schlechter

Knochenmark gut gut

Leber	86,0
Milz	3,3
Lungen	0,8
Skelett	6,2
Nieren	1,0
Gastrointestinaltrakt	1,0
Rest	1,7

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Eine Verschlechterung der Qualität der Milzdarstellung, die durch eine starke Verringerung der Teilchengröße, bedingt durch Erhöhen des pH-Werts im Beispiel 7, erhalten wird, ergibt sich aus einem Vergleich der Beispiele 6 und 7 hinsichtlich der Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße (die sich auch in dem Aussehen der Aggregations-Massen widerspiegelt) und der Bildqualität bei gesunden Primaten.

Beispiel 8

Zu 45 ml Mischwasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden folgende Bestandteile gefügt:

0,3 ml 25 % HSA (75 mg HSA), 1,5 ml Hydroxyäthylendiphosphonat-(HEDP)-Lösung (eine wässrige Lösung, die 0,21 g HEDP in 30 ml enthält) , 0,25 ml Zinn-II-Chloridlösung (4,2 g Zinn-II-Chlorid-Dihydrat plus 3 ml 6,15 η-Chlorwasserstoffsäure, verdünnt mit Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt auf 100 ml), 0,3 ml 1 % Pluronic F-68-Lösung und 5,42 ml 0,05 n-Natriumhydroxidlösung. Der pH-Wert der Lösung beträgt 5,90. Aliquote Teile dieser Präaggregations-Massen-Lösung, filtriert durch eine 0,22 etm sterilisierende Membran und erwärmt während 3,5 Minuten in einem heißen Wasserbad auf 99 C, bilden eine milchige Suspension von Mikroaggregaten.

Formuliert mit einer Stabilisierungslösung (der pH-Wert der Formulierung beträgt 8), verteilt in Fläschchen und markiert mit 5 ml ^Tc-Natriumpertechnetat, jeweils wie in Beispiel 3 beschrieben, erhielt man folgende Ergebnisse:

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Aktivitätsverteilung durch die Teilchengröße:

Teilchengröße % des Gesamtwerts

> 3 ^m 8,9

1,3 /Ata 2,1

0,2 - 1 ^m 61 ,2

^ 0,2 um 27,8

Bioverteilung in Mäusen, 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:

Organ % der injizierten Dosis pro Organ

Leber	92,8
Milz	2,6
Lungen	0,4
Skelett	5,1
Nieren	0,5
Gastrointestinaltrakt	0,5
Rest	2,3

Das erfindungsgemäße lyophilisierte Zinn-II-Albumin-Mikroaggregat weist eine lange Lagerungsdauer von mindestens einem Jahr bei Raumtemperatur (bei Lichtschutz) auf. Es ist auch während mindestens 24 Stunden nach der Markierung stabil, obwohl es vorzugsweise innerhalb von 8 Stunden nach der Markierung bei Lagerung unter Kühlung verwendet wird, aus Gründen der Sicherheit für den Patienten, da es kein Konservierungsmittel enthält.

Mit Tc-markif--»rte biozersetzliche Zinn-II-Makroaggregate (größer als 5_/ttm)von HSA, das bei oder nahe beim isoelektrischen Punkt des HSA makroaggregiert wurde, in denen die Teilchen eine Ladung von 0 oder in der Nähe von 0 haben (erzielt durch Aggregation beim isoelektrischen pH-Wert von etwa 4,8 - 5,5 und bei relativ hoher

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Ionenkonzentration) wurden handelsüblich zur radioaktiven Darstellung der Lungen verwendet. Sie werden auch in der Patentliteratur beschrieben, vgl. hierzu die US-PSen 3 987 157, 3 863 004 und 3 872 226. Jedoch sind derartige Mittel nicht als RES-Mittel geeignet, da diese größeren Teilchengrößen aus dem Blutstrom durch die Lungen entfernt werden, bevor sie die Leber, die Milz und das Knochenmark erreichen (vgl. auch die US-PS 4 024 233 und United States Pharmacopia XIX, Seite 488) .

Ein RES-Abtast-Reagenssatz (Kit) von Zinn enthaltenden mit ¹¹¹Tcmarkierten Min imikro Sphären (mittl. Durchmesser von 1 ,um und 98 Gew.-% weniger als 3 um) von HSA, die mit einem Glycin-HCl-Puffer beim pH-Wert 2,4 gehalten werden und die angeblich 3M angeboten werden, wird in Journal of Nuclear Medicine, Band 16, Nr. 6, 1975, Seite 543 beschrieben. Es wird angenommen, daß diese Minimikrosphären aus einer flüssigen HSA-Emulsion mit einem Ölbad ausgefällt werden. Es ist nicht bekannt, zu welchem Zeitpunkt das Zinn zugesetzt wird. (Vgl. auch die US-PS 3 937 668 und Int. J. of App. Rad. and Isotopes, 1970, Band 21, Seiten 155 - 167).

In der Literatur wurde auch empfohlen, radiojodierte und mit ^mTc markierte Makroaggregate von HSA durch Ultraschall zu Teilchen von Mikrogröße zu desintegrieren (J.N.M. Band 13, 1972, Seiten 260 - 65; J.N.M. Abstract, Band 12, Nr. 6, 1971, Seite 373; J.N.M. Abstract Band 10, Nr. 6, Seiten 453 - 4; Int. J. of Applied Radiation and Isotopes, 1975, Band 26, Seiten 31 - 32). In diesen Berichten wird jedoch nicht auf die Anwesenheit eines reduzierenden Metalls während der Aggregation oder eines Liganden dafür hingewiesen, und derartige Produkte erfordern eine Desintegrationsstufe.

In J.N.M., Band 12, Nr. 6, beginnend auf Seite 372 und endend auf

131 Seite 373, werden auch mit Tc-99m und I markierte Mikroaggregate von Albumin beschrieben, jedoch liegt kein Hinweis auf die Anwesenheit eines reduzierenden Metalls und eines Liganden dafür vor; auch wird keine Lehre für die Bildung der Mikroaggregate gegeben .

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In J.N.M, Band 10, Nr. 6, 1969, Seite 454 werden Methoden zur Markierung von Makro- und Mikroaggregaten von Serumalbumin unter Verwendung von Eisen-III-Ionen und Ascorbinsäure beschrieben, wobei jedoch keine Lehre dafür gegeben wird, wie die Mikroaggregate gebildet werden und kein Hinweis auf das Vorhandensein eines reduzierenden Metalls oder eines Liganden dafür vorliegt.

In J.N.M., Band 9, Nr. 9, 1968, Seiten 482-5 wird eine Methode zur Herstellung von HSA-Mikroaggregaten mit anschliessender Radiojodierung beschrieben. Ein Hinweis auf ein reduzierendes Metall und einen Liganden dafür findet sich nicht. In J.N.M., Band 11, Nr. 6, 1970, Seite 387 wird eine Methode zur Herstellung von mit Tc-99m markierten Mikroaggregaten von Albumin mit einer Teilchengröße von etwa 0,5Am beschrieben, bei der die Mikroaggregate offenbar aus mit Tc-99m markiertem nicht-aggregiertem Albumin gebildet werden (das nicht-aggregierte Albumin wurde mit Tc-99m unter Verwendung von Eisen-III-Chlorid, Ascorbinsäure und Acetatpuffer markiert) ; es findet sich kein Hinweis auf das Vorhandensein eines reduzierenden Metalls und eines Liganden dafür.

In J.N.M., Band 12, Nr. 6, 1971, Seiten 467-8 wird eine kolloidale mit Tc-99m markierte Zinn-II-Hydroxid-Suspension beschrieben, die zur Darstellung der Leber verwendet wird, jedoch werden dort weder HSA noch ein stabilisierender Ligand bei der Herstellung erwähnt.

In J.N.M., Band 11, Nr. 10, Seiten 580 - 85, 1970 wird die Mikroaggregation von HSA mit anschließender Markierung durch Technetium beschrieben, das mit Eisen-III-Chlorid und Ascorbinsäure vorreduziert wurde. Es liegt kein Hinweis auf die Anwesenheit eines reduzierenden Metalls oder Liganden dafür während der Aggregation vor.

Die folgenden Literaturstellen beschreiben jodierte HSA-Aggregate: Br. J. Exp. Path, Band 38, 1957, Seiten 35 - 48; Report of Scientific Exhibit t Titel "Colloidal Radioalbumin Aggregates For Organ Scanning" 10th Annual Meeting, Nuclear Medicine Society,

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Montreal, Canada, June 26 - 29, 1963; J.N.M., Band 5, Seiten 259 -. 275, 1964; J. Lab. & Clin. Med., Band 51, Nr. 2, Seiten 230 - 39, 1958; "Dynamic Clinical Studies With Radioisotopes" USAEC Division of Tech. Info., Seiten 285 - 317, Juni 1964; Invest. Radiol. Band 1, 1966, Seiten 295 - 300; Bericht von G. V. Taplan et al, mit dem Titel "Preparation of Colloidal Suspensions of Human Serum

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Albumin I For Estimating Liver Blood Flow and Reticulo-endothelial System Functions in Man", UCLA Bericht Nr. 481 Biology and Medicine, Juni 23, 1961, University of California, Los Angeles School of Medicine.

Die US-PS 4 054 645 beschreibt die Anwendung eines Zinn-II-Fluorld-Reduktionsmittels mit einer Anzahl von verschiedenen Ziele suchenden Liganden, von denen einer Albumin ist, jedoch wird keine Lehre zur Mikroaggregation von Albumin in Anwesenheit eines Zinn-II-Salzes und eines zusätzlichen kein-Ziel-suchenden Liganden gegeben.

In der US-PS 4 057 615 wird die Anwendung des Reduktionsmittelkomplexes mit verschiedenen Ziel suchenden Exzipienten (ein schlecht gewählter Ausdruck für Ziel suchende Liganden) beschrieben, in dem die Assoziationskonstante des Reduktionsmittelanions für Technetium geringer ist als die des Exzipienten. Eine Lehre für die Mikroaggregation in Anwesenheit eines reduzierenden Metalles und eines nicht-Ziel-suchenden Liganden wird nicht gegeben.

Zwar beziehen sich einige der. vorstehend genannten Literaturstellen auf mit Tc-99m-markierte Mikroaggregate von Albumin als radioaktive darstellende Mittel, jedoch befindet sich kein derartiges Mittel gegenwärtig für die Darstellung des RES auf dem Markt, und kolloidaler Schwefel stellt weiterhin das hauptsächlich verwendete RES-Mittel dar, trotz seiner Nachteile,und trotz der Verwendung von mit Tc-99m-markierten Makroaggregaten als Hauptfaktor der praktischen Lungendarstellung.

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ORiGIiSlAL INSPECTED

Claims

Dipl -Ing

E. Prinz

Patentanwälte

Dipl.-Chem

Dr. G. Hauser

Ernsber gerstrasse 19

8 München 60

Dipl -Ing

G. Leiser

New England Nuclear Corporation 549 Albany Street

Boston, Massachusetts 02118 / V.St.A.

8. Februar 1979

Unser Zeichen: N 676

Patentansprüche

1. Zusammensetzung zur Markierung mit ^mTc für die radioaktive Darstellung, enthaltend Mikroaggregate von Albumin und ein reduzierendes Metall.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich einen stabilisierenden Liganden für das reduzierende Metall enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe eines Phosphonats, eines Phosphats, eines Aminocarboxylats, eines Polyhydroxycarboxylats und von PoIycarboxylaten.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der das reduzierende Metall Sn ist und der Ligand ein Diphosphonat ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der mindestens 90 % der

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Mikroaggregate eine Teilchengröße von nicht über 5 ^m aufweisen.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der mindestens 40 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2-5 u.m aufweisen.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der mindestens 40 % der Mikroaggregate bei 0,2-3 Atm liegen.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das reduzierende Metall Zinn-II ist und mindestens der Hauptanteil der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2 - 3 Atm aufweist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der nicht über 50 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von weniger als 0,2 x*m aufweisen.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 2,° in der das Albumin menschliches Serumalbumin ist und das resultierende Metall Zinn-II ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, stabilisiert mit nicht-denaturiertem Albumin und einem Puffer.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, die auch ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel enthält.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, in der die Mikroaggregatbildung bei einem pH-Wert von 4,5 - 9,5, jedoch auf der alkalischen Seite des scheinbaren isoelektrischen Punktes des Albumins erfolgte.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, bei der der dort genannte pH-Wert bei 5,4 - 7,0 liegt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 10, in der Form eines gefriergetrockneten Feststoffs.

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16. Zusammensetzung nach Anspruch 1,mindestens 90% der Mikroaggregate eine Teilchengröße von nicht über 5 M.ia aufweisen.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, in der mindestens 40 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2 - 5 Mv\ aufweisen.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, in der nicht über 50 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße unter 0,2 Mm aufweisen.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Albumin menschliches Serumalbumin ist, das resultierende Metall Zinn-Il ist, die Zusammensetzung mit nicht-denaturiertem menschlichem Serumalbumin und einem Puffer stabilisiert ist, die Mikroaggregate bei einem pH-Wert von 5,4 - 9,5 zu Mikroaggregaten geformt wurden und die Zusammensetzung gefriergetrocknet wurde.

20. Radioaktives Darstellungsmittel, enthaltend mit ¹⁰Tc markierte Mikroaggregate von Albumin und ein reduzierendes Metall.

21. Mittel nach Anspruch 20, enthaltend zusätzlich einen stabilisierenden Liganden für das reduzierende Metall.

22. Mittel nach Anspruch 21, in dem das Albumin menschliches Serumalbumin ist, das reduzierende Metall Zinn-II ist und der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphonaten, Phosphaten, Aminocarboxylaten, Polyhydroxycarboxylaten und Polycarboxylaten.

23. Mittel nach Anspruch 21, in dem der Ligand ein Diphosphonat ist.

24. Mittel nach Anspruch 23, in dem der Ligand Hydroxyäthylendiphosphonat ist.

25. Mittel nach Anspruch 23, in dem der Ligand Methylendiphosphonat ist.

26. Mittel nach Anspruch 21, in dem mindestens 90 % der Mikro-

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_ 4 aggregate eine Teilchengröße von nicht über 5 Atm aufweisen.

27. Mittel nach Anspruch 26, in dem nicht wesentlich mehr als 50 % der Mikroaggregate kleiner als 0,2 <<m sind.

28. Mittel nach Anspruch 26, in dem mindestens 40 % der Mikroaggregate bei 0,2-5 /Um liegen.

29. Mittel nach Anspruch 26, in dem mindestens 40 % der Mikroaggregate bei 0,2-3 Aim liegen.

30. Mittel nach Anspruch 26, in dem der Hauptanteil der Mikroaggregate bei 0,2 - 3,0 t4.m liegt.

31. Mittel nach Anspruch 21, vermischt mit nicht-aggregiertem Albumin, Puffer und oberflächenaktivem Mittel.

32. Mittel nach Anspruch 20, in dem das Albumin menschliches Serum-Albumin ist, das reduzierende Metall Zinn-II ist, mindestens 90 % der Mikroaggregate eine Teilchengröse von nicht über 5 yum aufweisen und nicht wesentlich mehr als 50 % der Mikroaggregate unter 0,2 /Km liegen.

33. Mittel nach Anspruch 32, stabilisiert mit nicht-aggregiertem menschlichem Serumalbumin und Puffer, in dem die Mikroaggregate bei einem pH-Wert von 4,5 - 9,5, jedoch auf der alkalischen Seite des scheinbaren isoelektrischen Punktes des Albumins mikroaggregiert wurden.

34. Mittel nach Anspruch 33, in dem der dort genannte pH-Wert bei 5,4 - 7,0 liegt.

35. Mittel nach Anspruch 33, das Methylendiphosphonat enthält und bei dem der dort genannte pH-Wert bei 5,6 - 6,5 liegt.

36. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Markierung mit

¹¹Tc zur radioaktiven Darstellung, dadurch gekennzeichnet,

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daß man Albumin in Anwesenheit eines reduzierenden Metall einer Mikroaggregation unterzieht.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation in Anwesenheit eines stabilisierenden Liganden für das reduzierende Metall durchführt.

38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man als Albumin menschliches Serum-Albumin verwendet, als reduzierendes Metall Sn einsetzt und den Liganden auswählt aus der Gruppe von einem Phosphonat, einem Phosphat, einem Aminocarboxylat, einem Polyhydroxypolycarboxylat und einem Polycarboxylat.

39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation bei einem pH-Wert durchführt, bei dem mindestens 90 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von nicht über 5 Mm. aufweisen.

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation bei einem pH-Wert durchführt, bei dem nicht wesentlich mehr als 50 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von unter 0,2 yU-m aufweisen.

41. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregation bei einem pH-Wert durchgeführt wird, bei dem mindestens 40 % eine Teilchengröße von 0,2 - 5 Mm aufweisen.

42. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation bei einem pH-Wert durchführt, bei dem mindestens 40 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2 - 3 Mm aufweisen.

43. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation bei einem pH-Wert durchführt, bei dem mindestens der Hauptanteil der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2 - 3 Am aufweist.

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44. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation bei einem pH-Wert von 4,5 - 9,5, jedoch auf der alkalischen Seite des scheinbaren isoelektrischen Punktes des Albumins durchführt.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 5,4 - 7,0 arbeitet.

46. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden ein Diphosphonat verwendet.

47. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden Hydroxyäthylendiphosphonat einsetzt.

48. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man als Liganden Methylendiphosphonat einsetzt.

49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation durchführt durch Erwärmen bei einem pH-Wert von 5,4 - 6,6, bei dem mindestens 90 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von nicht größer als 5 ,^m und mindestens 50 % eine Teilchengröße von 0,2 - 3 ^<m aufweisen, als reduzierendes Metall Zinn-II und als Albumin menschliches Serumalbumin eingesetzt werden.

50. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation durchführt, durch Leiten einer Lösung von nicht-denaturiertem menschlichem Serumalbumin und von dem reduzierenden Metall durch mehrere in Reihe angeordnete Wärmeaustauscher in semikontinuierlicher Weise.

51. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man als reduzierendes Metall Zinn-II und als Albumin menschliches Serumalbumin einsetzt und daß man die Aggregation bei einem pH-Wert durchführt, bei dem mindestens 90 % der Mikroaggregate eine Teilchengröße von nicht über 5 Am und nicht wesentlich mehr als 50 % eine Teilchengröße unter 0,2 ^m aufweisen.

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52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroaggregation durchführt durch Erwärmen bei einem pH-Wert von 4,5 - 9,5, jedoch auf der alkalischen Seite des scheinbaren isoelektrischen Punktes des Albumins, bei dem mindestens der Hauptanteil der Mikroaggregate eine Teilchengröße von 0,2 - 3,0 Mm aufweist.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 5,4 - 7,0 arbeitet.

54. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 5,4 - 6,6 arbeitet.

55. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation durch Erwärmen des Albumins und des reduzierenden Metalls durch Radiofrequenzerwärmung bewirkt.

56. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation durch Erwärmen des Albumins und des reduzierenden Metalls durch Mikrowellenerhitzung durchführt.

57. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregation durch Erwärmen des Albumins und des reduzierenden Metalls durch Induktionsheizung bewirkt.

58. Verfahren zur Darstellung des RES eines Primaten, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Primaten "Vc-markierte Mikroaggregate von HSA und einem reduzierenden Metall injiziert, um die "Vc-markierten Mikroaggregate in dem RES zu konzentrieren.

59. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zusammensetzung einsetzt, die einen stabilisierenden Liganden für das reduzierende Metall enthält.

60. Verfahren nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß man als reduziere
nat einsetzt.

als reduzierendes Metall Sn und als Liganden ein Diphospho-

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61. Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroaggregate einsetzt, von denen mindestens 90 % eine Teilchengröße von nicht über 5 um und mindestens 40 % eine Teilchengröße von 0,2 - 3 /Um aufweisen.

62. Masse im Präaggregatzustand, enthaltend menschliches Serumalbumin, das zu Mikroaggregaten für die radioaktive Markierung zur Anwendung als ein RES darstellendes Mittel aggregiert werden soll, enthaltend eine Lösung von nicht-aggregiertem und nicht-denaturiertem menschlichem Serumalbumin, reduzierendem Metall und stabilisierendem Liganden für das reduzierende Metall, wobei die Masse einen pH-Wert von 4,5 9,5, jedoch auf der alkalischen Seite des isoelektrischen Punkts des Albumins aufweist, die Menge des Liganden ausreicht, um die Zinn-II-Ionen zu stabilisieren und deren Ausfällung vor der Mikroaggregation zu verhindern, die jedoch nicht ausreicht, um jegliche wesentliche nicht auf das RES abzielende Eigenschaften zu verleihen, wenn die anschließend aus der Masse gebildeten Mikroaggregate radioaktiv markiert und für die Darstellung des RES verwendet werden.

63. Masse nach Anspruch 62, in der der pH-Wert bei 5,4 - 7,0 liegt.

64. Masse nach Anspruch 63, in der das Metall Zinn-II ist.

65. Masse im Voraggregatzustand nach Anspruch 64, in der der Ligand ein Diphosphonat ist, ausgewählt aus der Gruppe von Methylendiphosphonat und Hydroxyäthylendiphosphonat und der pH-Wert bei 5,6 - 6,5 liegt.

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