Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung
für die Markierung mit Tc-99m zur Herstellung einer optischen Darstellung, unter Ausnützung der Radioaktivität.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von derartigen Zusammensetzungen und ferner Mittel zur Darstellung eines optischen Bildes, unter Ausnützung der Radioaktivität, die entsprechende mit Tc-99m markierte Zusammensetzungen enthalten.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Mittels, bei dem die entsprechende erfindungsgemässe Zusammensetzung mit Tc-99m markiert wird.
Erfindungsgemässe Zusammensetzungen stellen dann, sobald sie mit Tc-99m markiert sind, Mittel zur radioaktiven Bilddarstellung des Retikulo-endothelial-Systems (RES) von Wirbeltieren, insbesondere Primaten, dar. Sie dienen insbesondere zur radioaktiven Bilddarstellung der Leber, der Milz und des Knochenmarkes.
Derartige Mittel werden manchmal als radioaktive RES Darstellungsmittel bezeichnet.
In früherer Zeit war das verbreitete handelsübliche RES Darstellungsmittel ein Radio-kolloid (Teilchengrösse von 0,001-0,5 ym) von Gold, das mit Gelatine stabilisiert war, und welches nach Injektion in den Blutstrom vom RES aus diesem entfernt und in diesem angesammelt wurde, wodurch man ein latentes radioaktives Abbild erhielt welches sodann in ein sichtbares Bild mittels geeigneter Instrumente übergeführt werden konnte.
Dieses Darstellungsmittel wurde später durch 99mTc-markiertes Schwefel-kolloid, das mit Gelatine stabilisiert war, ersetzt, wobei ein Grossteil dieses Materials eine Teilchengrösse von weniger als 0,1-1 ,am aufwies, und welches zur Zeit noch immer das meist verbreitete radioaktive RES Darstellungsmittel ist, obwohl es Nachteile aufweist, wie zum Beispiel (a) die Erfordernis einer relativ grossen Anzahl von Kompo nenten, (b) die Erfordernis des Kochens und Neutralisierens zur Mar kierung durch den Benützer am Anwendungsort, und (c) die Eigenschaft, dass das Material nicht biologisch abbau bar ist.
Die meisten Schwefel-kolloid RES-Darstellungsmittel, die auf dem Markt sind, ergeben scharfe klare, gleichzeitige Darstellung der Leber und der Milz.
Ein 99mTc-markiertes Zinn(II) Hydroxyd-kolloid wurde ebenfalls als RES-Darstellungsmittel vertrieben, aber es zeigte den Nachteil dass es schwierig ist das Wachstum der kolloidalen Partikel nach der Markierung zu verhindern, ohne dass der Anwender dem Anwendungsort Stabilsatoren zufügt, was dazu führt, dass sie für die RES-Darstellung nicht zufriedenstellend sind. d.h. dass sie nicht stabil sind.
Ein anderes RES-Darstellungsmittel, welches in kleinen Mengen vertrieben worden ist, ist ein 99mTc-markierter Zinn(II) Phytatkomplex von welchem angenommen wird, dass er in ein unlösliches Kolloid durch das Calcium im Blutstrom übergeführt wird, aus welchem es sodann durch das RES entfernt wird. Bei diesem Darstellungsmittel war es jedoch schwierig klinisch akzeptable klare, scharfe Darstellungen der Milz gleichzeitig mit der normalen gesunden Leber zu erreichen. Dementsprechend wurde die Anwendung dieses Mittels nicht sehr weit verbreitet.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein neues hochstabiles biologisch abbaubares RES-Darstellungsmittel für die Markierung mit Tc-99m Verfügung zu stellen. Dieses Mittel soll am Anwendungsort einfach mit Tc-99m markierbar sein, indem man es ohne irgendwelche zusätzlichen Arbeitsschritte mit einem Tc-99m liefernden Material vermischt, beispielsweise einer Tc-99m-Pertechnetatlösung.
Ferner soll das Mittel in markierter Form klinisch akzepta ble, klare, scharfe Bilder, sowohl der Leber als auch der Milz gleichzeitig ergeben.
Überraschenderweise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele durch eine Zusammensetzung erreicht werden können, die Mikroaggregate von Albumin und einem reduzierenden Metall enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zusammensetzung für die Markierung mit Tc-99m zur Herstellung einer optischen Darstellung unter Ausnützung der Radioaktivität, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Mikroaggregate von Albumin und einem reduzierenden Metall enthält.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemässe Zusammensetzung zusätzlich einen stabilisierenden Liganden für das reduzierende Metall. Dieser Ligand wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Phosphonaten, Phosphaten, Aminocarboxylaten, Polyhydroxycarboxylaten und Polycarboxylaten ausgewählt.
Ein bevorzugter derartiger Ligand ist ein Diphosphonat, vorzugsweise ein Methylendiphosphonat, Hydroxyäthylendiphosphonat oder Aminoäthandiphosphonat.
Das in den erfindungsgemässen Zusammensetzungen enthaltene reduzierende Metall ist vorzugsweise ein zweiwertiges Zinn, wobei Zinn(II)-chlorid, Zinn(Il)-jodid, Zinn(II)-fluorid oder Zinn(II)-bromid speziell bevorzugt sind.
In den erfindungsgemässen Zusammensetzungen sollen zweckmässigerweise mindestens 90% der genannten Mikroaggregate eine Teilchengrösse von nicht mehr als 5 m aufweisen.
Speziell bevorzugt ist es dabei, wenn mindestens 40% der genannten Mikroaggregate eine Teilchengrösse zwischen 0,2 und 3 I m aufweisen. Des weiteren ist es speziell bevorzugt, wenn nicht mehr als 50% der genannten Mikroaggregate eine Teilchengrösse von weniger als 0,2 ym aufweisen.
Als Albumin wird in den erfindungsgemässen Zusammensetzungen vorzugsweise Humanalbumin eingesetzt. Eine speziell bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung enthält als Albumin ein Humanserumalbumin, als reduzierendes Metall zweiwertiges Zinn und sie ist ferner mit undenaturiertem Humanserumalbumin und einem Puffer stabilisiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Zusammensetzungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Albumin in Gegenwart eines reduzierenden Metalls mikroaggregiert.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Darstellung eines optischen Bildes unter Ausnützung der Radioaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es erfindungsgemässe Mikroaggregate von Albumin und einem reduzierenden Metall enthält, wobei diese Mikroaggregate mit Tc-99m markiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses Mittels, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine erfindungsgemässe Zusammensetzung mit Tc-99m markiert.
Gemäss einer speziell bevorzugten Ausführungsart dieses Verfahrens wird eine in trockener Form in einer sterilen, pyrogenfreien Ampulle verschlossen aufbewahrte Zusammensetzung markiert, indem man sie unmittelbar vor der Verwendung mit Tc-99m markiert, indem man sie nach der Öffnung der Ampulle mit einer radioaktiven Pertechnetatlösung vermischt.
Bei der Herstellung des erfindungsgemässen Mittels wird das Albumin vorzugsweise unter anaeroben Bedingungen mikroaggregiert. Speziell bevorzugt ist es, dabei menschliches Serumalbumin, also Humanserumalbumin (HSA), in Gegenwart eines reduzierenden Metalls in ionischer, physikalischer oder chemischer Komplexform (im folgenden einfach als reduzierendes Metall bezeichnet), zu mikroaggregieren. Man erhält so ein Produkt, welches mikroaggregierte kolloidale Teilchen das Albumins und des reduzierenden Metalls enthält, und welches direkt mit Tc-99m durch Vermischen einer radioaktiven Pertech netatlösung markiert werden kann.
Es ist jedoch auch möglich, dieses Produkt einer Gefriertrocknung zu unterwerfen und es kann dann in einer sterilen Pyrogen-freien Ampulle verschlossen und aufbewahrt werden, zum benötigten Zeitpunkt am Anwendungsort dann mit Tc-99m markiert werden, beispielsweise indem man es mit einer radioaktiven Pertechnetatlösung markiert. In der Folge wird das zur Markierung herangezogene Tc-99m auch mit 99"'Tc bezeichnet.
Bei der Herstellung der erfindungsgemässen Mittel wird die Mikroaggregation mit Vorteil in Gegenwart eines zusätzlichen Liganden ausgeführt, und zwar vorzugsweise in einer wasserlöslichen Form, um das reduzierende Metall gegenüber Niederschlagsbildung vor der Aggregation zu stabilisieren. Bevorzugte Liganden sind die Diphosphonate und vorzugsweise Methylendiphosphonat, Hydroxyäthylendiphosphonat und Aminoäthandiphosphonat; Diphosphate wie zum Beispiel Polyphosphate, beispielsweise Pyrophosphate; Diaminocarboxylate, wie zum Beispiel Diäthylentriaminpentaacetatsalze; Polyhydroxycarboxylate wie zum Beispiel Glucoheptonat; und Polycarboxylate wie zum Beispiel die Salze von Carboxymethylcellulose. Bisher haben sich die Diphosphonate als die am meisten zu bevorzugenden herausgestellt.
Es sind jedoch auch andere bekannte physiologisch und toxikologisch verträgliche Liganden für das jeweilige reduzierende Metall geeignet. Es hat sich herausgestellt, dass das Anion von bestimmten reduzierenden Metallsalzen, wie zum Beispiel Zinn(ll)-fluorid, selbst eine ausreichend hohe Stabilitätskonstante aufweist um die Notwendigkeit eines zusätzlichen Liganden auszuschliessen. In derartigen Fällen wirkt das Fluoridanion selbst als stabilisierender Ligand für das Zinn(ll)-ion.
Im allgemeinen ist die Radioaktivitätsverteilung über die Teilchengrösse der mikroaggregierten kolloidalen Teilchen wie folgt: Mindestens 90 bis 95um0, und vorzugsweise mindestens 980in, der Radioaktivität haftet an Teilchen welche nicht mehr als 5 ym Teilchengrösse aufweisen. Für eine gute Milzdarstellung gleichzeitig mit einer Darstellung der Leber sollen nicht mehr als 40 bis 60%, und vorzugsweise nicht mehr als 40 bis 50%, und insbesonders bevorzugterweise nicht mehr als 10 bis 40% der Radioaktivität an Teilchen haften, welche eine Teilchengrösse von weniger als 0,1, und vorzugsweise weniger als 0,2 ym aufweisen.
Insbesonders bevorzugt ist für eine gute gleichzeitige Darstellung von Milz und Leber dass mindestens 40 bis 60%, und insbesonders bevorzugt mehr als 500i0 (der Hauptanteil) der Aktivität an Teilchen haftet, welche zwischen 0,2 und 5 ,am und insbesondere zwischen 0,2 und 3 zm gross sind.
Gute gleichzeitige Darstellungen von Milz und Leber wurden erreicht, wenn zwischen 60 und 1000in der Aktivität an Teilchen auftrat, welche eine Teilchengrösse von 0,2 bis 3 ym aufwiesen wenn gewährleistet ist, dass mehr als 90 bis 98% der Aktivität an Teilchen vorhanden war, die nicht grösser waren als 5 ym. Gute Bilder der Leber mit einer schlechteren gleichzeitigen Milzdarstellung wurden erhalten wenn nur 5 bis 20% der Aktivität an Mikro-teilchen einer Teilchengrösse von 0,2 bis 5 zm vorhanden waren, wenn gewährleistet war dass mehr als 90 bis 98% der Teilchen nicht grösser waren als 5 jim, und wobei der Rest der Aktivität hauptsächlich an Teilchen gebunden war, welche eine Teilchengrösse von weniger als 0,2 sm aufwiesen.
Die Radioaktivitätsverteilung über die Teilchengrösse wird bestimmt indem man ein bekanntes Aliquot einer verdünnten Suspension der mit 99nTc-markierten mikroaggregierten Teilchen durch eine Reihe von Polycarbonatfiltermembranen [beispielsweise Membranen die unter dem Namen NUCLEPORE von der Nuclepore Corporation vertrieben werden, und die in NUCLEPORE -Filterbehälter gemäss den Anweisungen des Herstellers eingebaut sind und in Reihe miteinander verbunden sind, wodurch man eine Folge mit abnehmender Porengrösse erhält (manchmal als serielle Filtrationstechnik bezeich net)j durchtreten lässt,
und sodann die Radioaktivität der filtrierten Teilchen in jedem Filtergehäuse und im schlussendlichen Filtrat mittels üblicher Messverfahren bestimmt und die jeweilige Aktivitätsmenge durch die Gesamtradioaktivität dividiert und mit 100 multipliziert, wodurch man den Prozentsatz erhält. Das Aliquot wird ausreichend verdünnt um einen Verschluss der Poren der Filter zu verhindern oder auf einem minimalen Wert zu halten, was deren wirksame Grösse vermindern würde und dementsprechend unkorrekte Messergebnisse ergäbe.
Die bevorzugte Technik zur Verdünnung des Aliquotes wird im folgenden beschrieben. Alle Teilchengrössen die hier angegeben werden sind nach dieser Technik bestimmt worden.
Obwohl eine gute Leberdarstellung erreicht wird wenn anscheinend alle Teilchen eine Teilchengrösse von weniger als 0,2 pm aufweisen, ist die gleichzeitige Darstellung der Milz im allgemeinen mangelhaft.
Dementsprechend ist es bevorzugt eine Teilchengrössenverteilung zu erhalten, in welcher so viele Teilchen wie möglich in einen Grössenbereich zwischen 0,1 oder 0,2 und 5 ym fallen und vorzugsweise zwischen 0,2 und 3 pm.
Näher erläutert werden gute gleichzeitige Milz- und Leberdarstellungsresultate, welche mit der folgenden Teilchengrössenverteilung erhalten werden: nicht mehr als 4 bis 10% grösser als 5 pm, nicht mehr als 15% grösser als 3 pm, mindestens 20% über 1 ym (meistens 1 bis 3 ym), mindestens 80 bis 90% über 0,2 ym und vorzugsweise mindestens 40 bis 50% zwischen 0,4 und 3,0 ym, wobei nicht mehr als 5 bis 10% und vorzugsweise nicht mehr als 5 bis 8% mobile Anteile (relativ niedrigmolekulargewichtige lösliche Anteile) aufgrund einer Dünnschichtchromatographie mit Kochsalzlösung als Laufmittel.
Von weniger als 15 Minuten bis mehr als 60 Minuten nach Injektion wird eine ausgezeichnete Sichtbarmachung sowohl der Milz als auch der Leber erreicht mit einer unbedeutenden, nicht erwünschten Verteilung bei optimaler Aufnahme durch das Zellgewebe. Die Verteilung im Knochenmark, und insbesonders in der Wirbelsäule und im Beckenbereich kann dargestellt werden mittels Aufnahmezeiten die länger sind, welche optimal sind für Leber und Milz, wie das auch der Fall ist bei kolloidalen Schwefel-RES-Darstellungsmitteln.
Eine Lösung des Albumin und des reduzierenden Metalls, vorzugsweise mit einem zusätzlichen Ligand in der Lösung, wird bei einem geregelten pH-Wert erwärmt, und die Temperatur wird so ausgewählt, dass sich die Mikroaggregate bilden.
Die oben genannte Teilchengrössenverteilung wird in erster Linie erreicht, indem man die Konzentrationen der Komponenten, den pH-Wert und die Erhitzungsbedingungen genau einregelt, wie das weiter unten näher erläutert wird.
Das reduzierende Metall wird an das Albumin gebunden (man nimmt an, dass ein physikalischer oder chemischer Komplex gebildet wird) was die selektive Bindungswirksamkeit des Tc-99m an das denaturierte mikroaggregierte Albumin verbessert, wenn die mikroaggregierten Albuminteilchen anschliessend markiert werden, wodurch man eine verbesserte Aufnahme durch das RES und eine klare Darstellung des RES erhält.
Die Funktion des zusätzlichen Liganden besteht darin, die Menge von reduzierendem Metall zu erhöhen welche gegenüber Hydrolyse (Bildung von unlöslichen Hydroxiden oder hydratisierten Oxiden des reduzierenden Metalls) vor der Mikroaggregation stabilisiert werden kann. Während der Denaturierung des Albumin, welche durch Hitze erfolgt, wird angenommen, dass konformationelle Änderungen des Albumines reaktive Gruppen zur Verfügung stellen, welche die Affinität des Albumines für das reduzierende Metall erhöhen und dementsprechend werden wesentlich grössere Mengen des reduzierenden Metalls an und innerhalb der Mikroaggregate gebunden als dies erreicht würde in Abwesenheit des zusätzlichen Liganden oder im Vergleich zur Reaktion des reduzierenden Metalls mit dem Albumin nach der Mikroaggregierung.
In jedem Fall trägt der zusätzliche Ligand wesentlich zu der ausgezeichneten bildlichen Darstellung des RES mittels Radioaktivität bei. Wenn jedoch, wie bereits früher gesagt, das Anion des wasserlöslichen reduzierenden Metallsalzes eine ausreichend hohe Stabilitätskonstante aufweist um das reduzierende Mittel gegenüber Hydrolyse zu stabilisieren, wie das im Falle des Fluorides der Fall ist, entfällt der Bedarf nach einem zusätzlichen Liganden. In solchen Fällen ist das Anion effektiv ein stabilisierender Ligand für das reduzierende Metall.
In den Fällen, in denen die Mikroaggregate (uAA) für die Lagerung gefriergetrocknet werden sollen bevor sie angewandt werden, werden sie vorzugsweise vor dem Gefriertrocknen mit einer Stabilisierlösung vermischt, und zwar von löslichem undenaturiertem (unaggregiertem) Albumin (HSA) um die Dispersion (Wiederherstellung der Dispersion) der Feststoffe der gefriergetrockneten Teilchen in der Pertechnetatlösung zu erleichtern, wenn die letztere zugegeben wird um die Mikroaggregate mit Tc-99m zu markieren um sie gebrauchsbereit zu machen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Stabiliserlösung ebenso ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Pluronic F-68) um die Dispersion der festen gefriergetrockneten Teilchen in der Pertechnetatlösung weiter zu unterstützen.
Ebenso können Puffer, wie zum Beispiel Natriumphosphat, zugesetzt werden (vorzugsweise zusammen mit unaggregiertem Humanserumalbumin und oberflächenaktivem Mittel als Teil der Stabilisierlösung) um einen pH-Wert einzustellen, der ausreichend weit vom isoelektrischen Punkt der Teilchen entfernt ist, um die wieder- dispergierte Formulierung gegen Wachstum der Teilchen zu schützen wenn die Pertechnetatlösung anschliessend zu den gefriergetrockneten Teilchen zugegeben wird, um die 99mTc-markierten Albumin-Sn+ + Mikroaggregate in Kochsalzlösung oder pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Trägermaterial zu dispergieren um sie dem Patienten zu injizieren.
Dementsprechend ist es vorteilhaft eine derartige gepufferte Stabilsatorlösung im Zusammenhang mit der Markierung zuzufügen, selbst wenn das Produkt ohne zwischengehendes Gefriertrocknen angewendet werden soll.
Zu den am meisten bevorzugten Liganden zählen die Diphosphonate, und von diesen sind Methylendiphosphonat (MDP) und Hydroxyäthylendiphosphonat (HEDP) bevorzugt, aber auch irgendwelche Diphosphonate die in der USA Patentschrift Nr. 4 032 625 und in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2 424 296 beschrieben sind können angewandt werden.
Von den Phosphaten sind die Pyrophosphate (vorzugsweise Natriumpyrophosphat) bevorzugt. Doch können auch Orthophosphat, das lineare Polyphosphat und organische Phosphate wie zum Beispiel Inosithexaphosphat ebenso angewandt werden.
Unter den Aminocarboxylaten, welche angewandt werden können, sind Äthylendiamintetra-essigsäure-(EDTA)-salze und Diäthylentriaminpenta-essigsäure-(DTPA)-salze bevorzugt.
Obwohl Polyhydroxycarboxylate und Polycarboxylate als schwache Liganden dienen können, sind sie nicht so geeignet wie die oben erwähnten.
Stabilisierende Liganden, welche angewandt werden können, werden nur durch die Fähigkeit das reduzierende Metall ausreichend gegen Hydrolyse zu stabilisieren oder aufgrund toxikologischer Überlegungen eingeschränkt.
Das am meisten bevorzugte Albumin für die Anwendung beim Menschen ist Humanserumalbumin, obwohl auch Albumine von anderen Arten für diagnostische Anwendungen für die jeweilige Spezies herangezogen werden können.
Obwohl das Zinn(II)-ion (Sn+ +) bevorzugt ist als Reduktionsmetall können auch andere, wie zum Beispiel das Eisen(II)ion (Fe+ +) und das einwertige Kupferion (Cu+) ebenso angewandt werden, jedoch ohne dass ähnlich gute Resultate erzielt werden. Alle diese reduzierenden Metalle können in mindestens zwei kationischen Redoxzuständen existieren, von denen die niedrigere geladene Valenzform für die Reduktion des Pertechnetates im anschliessenden Markierungsschritt verwendet wird.
Um die Mikroaggregation auszuführen wird eine Lösung einer Mischung des Albumins, des Liganden und des reduzierenden Metalls schnell auf eine Temperatur zwischen 70 und 100"C, und vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen 80 und 100"C, und insbesondere bevorzugt zwischen 85 und 99 C erhitzt. Optimale Resultate werden erhalten mit Temperaturen zwischen 90 und 99"C. Höhere Temperaturen können ebenso angewandt werden wenn gewährleistet ist, dass der Druck ausreichend erhöht wird um ein wesentliches Kochen der Reaktionsmasse zu verhindern. Die Erhitzungszeit kann zwischen Sekunden und Stunden liegen, abhängig von der Temperatur und der Art der Erhitzung.
Beispielsweise Erhitzen durch Mikrowellenenergie oder durch Hochfrequenzheizung oder durch Induktionsheizung erfordert nur Sekunden, während Erhitzen durch Eintauchen in kochendes Wasser oder durch Überleiten über Heizwicklungen Minuten erfordert. Die maximale Erhitzungszeit wird festgelegt durch die Tatsache, dass fortdauerndes Heizen nach Bildung der Mikroaggregate (pAA) die Teilchengrösse des HSA-reduzierenden Metallkomplexes über 5 pm erhöhen kann und/oder die Produktion von löslichen Zersetzungsprodukten bewirken kann. Ebenso scheint Kochen zur Erhöhung der Teilchengrösse zu führen. Die minimale Erhitzungszeit und Temperatur werden von der Zeit und der Temperatur bestimmt, welche notwendig ist um eine ausreichende Aggregation zu erhalten und um eine Mikroteilchengrössenverteilung zu erreichen, wie sie bereits oben angegeben wurde.
Die maximale Erhitzungszeit und Temperatur werden durch die Zeit und Temperatur bestimmt, nach welcher zu viele Teilchen grösser als 5 zm werden, oder nach der Zersetzung eintritt. Unter Benützung dieser Richtlinien können optimale Heiztemperaturen und Zeiten leicht durch routinemässige Testverfahren an irgendwelchen gegebenen Zusammensetzungen für irgendeine gegebene Art der Erhitzung bestimmt werden, wodurch man die erwünschte Teilchengrössenverteilung erhält. Ausgezeichnete Resultate sind erhalten worden mit Heizzeiten von 3 bis 10 Minuten bei Heiztemperaturen von 90 bis 99"C wenn das Heizen in einem heissen Wasserbad ausgeführt wurde, wobei annehmbare Resultate erhalten wurden, wenn man Heizzeiten von 2 bis 5 Minuten anwandte unter Anwendung eines derartigen Bades und der genannten Temperaturen.
Man nimmt an, dass das Albumin während dieses Erhitzungsschrittes denaturiert wird, d.h. dass die Denaturierung gleichzeitig mit der Mikroaggregierung auftritt.
Die Mikroaggregation durch Erhitzen wird bei einem pH Wert ausgeführt, der ausreichend entfernt ist vom isoelektrischen Punkt des Albumins (bei welchem die Ladung der Moleküle 0 oder nahezu 0 ist), um die oben erwähnte Teilchengrössenverteilung zu erhalten. In dieser Hinsicht besteht handelsübliches HSA aus einer Mischung von Albuminen mit einer Verteilung von isoelektrischen Punkten. Dementsprechend können die isoelektrischen Punkte der Mischung von Ansatz zu Ansatz variieren. Es sind Werte im Bereich von pH 4,5 bis 5,5 berichtet worden. Die Gegenwart von geladenen Verbindungen, welche dazu neigen sich mit dem Albumin zu asoziieren können jedoch den scheinbaren isoelektrischen Punkt deutlich verschieben.
Man nimmt an, dass sie diesen Effekt bewirken indem sie entweder ihre eigene Ladung dem Albumin verleihen oder gewisse positiv oder negativ geladene Gruppen dieses Proteins neutralisieren.
Je näher der pH-Wert zum isoelektrischen Punkt liegt desto grösser sind die Aggregatteilchen. Dementsprechend tritt beim pH-Wert des isoelektrischen Punktes Makroaggregation oder unkontrollierte Agglomeration auf. Wenn der pH-Wert vom isoelektrischen pH entfernt wird, und zwar in Richtung der sauren Seite wie auch in Richtung der alkalischen Seite, werden die Teilchen kleiner und kleiner. Der optimale pH-Wert bei der vorliegenden Erfindung variiert gemäss dem zusätzlichen Liganden, welcher angewandt wird.
Es hat sich herausgestellt, dass die erwünschte Teilchengrössenverteilung der Mikro aggregate erreicht werden kann in einem pH-Bereich, welcher wiederum von dem jeweils angewandten zusätzlichen Liganden abhängt, und wobei der erwünschte Ligand derjenige ist, welcher die erwünschte Teilchengrösse über den weitesten pH-Bereich ergibt, und dementsprechend die am wenigsten empfindlichen und am leichtesten reproduzierbaren Systeme ergibt. Es hat sich ebenso herausgestellt, dass ansteigende Ionenstärke, d.h. beispielsweise durch Zugabe eines neutralen Salzes wie zum Beispiel Kochsalz (NaCI) während der Aggregation, den pH-Wert verschiebt bei welchem die erwünschte Teilchengrössenverteilung erhalten wird, und zwar weiter weg vom isoelektrischen Punkt.
Vorzugsweise sind neben dem zusätzlichen Liganden und dem reduzierenden Salz die einzigen anderen Materialien, welche die Ionenstärke der noch nicht aggregierten Massenlösung (Mischung welche der Aggregation unterworfen wird) bewirken, die Säure, beispielsweise HCI, oder die Base, beispielsweise NaOH, verwendet werden um den pH einzustellen. Es können jedoch auch noch andere Materialien anwesend sein, welche die Ionenstärke beeinflussen.
Obwohl die erwünschten Teilchengrössenverteilungen in einem pH-Bereich auf der sauren Seite in einer Entfernung vom pH-Wert des isoelektrischen Punktes, wie auch auf der alkalischen Seite, erreicht werden können, ist der letztere Fall bevorzugt, weil die Mikroaggregation auf der sauren Seite andere Schwierigkeiten bietet.
Auf der sauren Seite des pH-Bereiches im Verhältnis zum isoelektrischen Punkt kann der pH-Bereich von 3,5 bis 4,5 reichen, und auf der alkalischen Seite relativ zum isoelektrischen Punkt kann der pH-Bereich im Bereich von etwa 5,4 bis 9,5 liegen, und vorzugsweise zwischen 5,5 und 7,0 und insbesonderes bevorzugt zwischen 5,6 und 6,5 abhängig von dem zusätzlichen Liganden der angewandt wurde, dem isoelektrischen Punkt des speziellen Albumins das angewandt wird, und der Konzentration der Komponenten. Wenn jedoch der scheinbare isoelektrische Punkt durch die Gegenwart einer geladenen Verbindung, wie oben gesagt, auf Werte unterhalb 4,5 vermindert worden ist kann der optimale pH-Bereich bis herab zu 4,5 sein.
Unter Bedingungen die mit MDP untersucht wurden, wurden erfolgreiche Resultate erhalten in einem pH-Bereich von 5,4 bis 6,6 und vorzugsweise in einem pH-Bereich von 5,6 bis 6,5, und optimal reproduzierbare Resultate wurden in einem pH Bereich von 5,7 bis 6,35 erhalten. Unter Bedingungen die mit Pyrophosphat untersucht wurden, wurden optimale Resultate in einem pH-Bereich von 5,9 bis 6,1 erhalten.
Der optimale pH-Bereich für irgend einen speziellen Liganden und in irgendeiner speziellen Konzentration kann leicht und routinemässig durch Aggregation bei verschiedenen pH-Werten, die vom isoelektrischen Punkt entfernt liegen, bestimmt werden bis die erwünschte Teilchengrössenverteilung erreicht wird.
Das reduzierende Metall, beispielsweise Zinn(II)-chlorid, kann der Albumin- und Ligandlösung in Form eines Feststoffes oder in Form einer Lösung zugefügt werden.
Die maximale Menge an reduzierendem Metall ist diejenige, oberhalb welcher Niederschlagsbildung vor Aggregation des Albumins auftritt. Die minimale Menge ist diejenige die notwendig ist, um Tc-99m in ausreichendem Masse zu reduzieren und an das aggregierte Albumin zu binden, um klinisch akzeptable RES-Aufnahmen zu erreichen. Diese Mengen können leicht für spezielle Zumischungen bestimmt werden, indem man routinemässige Experimente ausführt.
Sehr kleine Mengen Reduktionsmetall sind wirksam für die entsprechende Reduktion und Bindung des Tc-99m an das aggregierte Albumin, d.h. weniger als ein Molverhältnis von 8:1 von Zinn(II) zu Albumin, aber weil es leicht oxydiert wird können Zusammensetzungen, welche die minimal erforderliche Menge enthalten ihre Wirksamkeit während einer gewissen Zeitspanne nach Lagerung, Manipulation oder Verwendung verlieren. Dementsprechend wird ein Überschuss im Vergleich zur minimal notwendigen Menge zur Bindung des Tc-99m angewandt. Wenn der Anteil des reduzierenden Metalls erhöht wird, so erscheint ein Punkt für irgendeine Kombination an Ausgangsmaterialien, bei welchem die Bindungswirksamkeit für das Tc-99m an das Albumin nicht weiter ansteigt, und zwar entweder sofort oder als Funktion der Zeit bis zu 24 Stunden oder mehr nach Markierung.
Berücksichtigt man die obigen Erwägungen, so kann das Molekulargewichtsverhältnis von reduzierendem Metall, insbesonders So++, zu Albumin in einem sehr grossen Bereich variieren, d.h. beispielsweise von 8 : 1 bis 80 1, und vorzugsweise von 30 1 bis 50:1. Es ist bevorzugt, dass das Molekulargewichtsverhältnis von Sn+ + zu Albumin 80:1 nicht übersteigt.
Ausgezeichnete Resultate wurden mit Molverhältnissen von Sn+ + zu Albumin von etwa 30 zu 1 bis 50 zu 1 erhalten.
Die minimale Menge des zusätzlichen Liganden die notwendig ist, ist diejenige welche ausreicht um die Bildung von irgendwelchen wesentlichen Mengen unlöslicher Hydroxide oder Oxidhydrate des reduzierenden Metalls für eine gegebenen Zusammensetzung durch Bindung des reduzierenden Metalls zu verhindern. Die Maximalmenge ist diejenige, über welcher es zu einer wesentlichen Konkurrenz zwischen dem Albumin und dem zusätzlichen Liganden um das Tc-99m kommt, wenn Mikroaggregate mit dem Pertechnetat vermischt werden.
Derartige Liganden, wenn sie im Überschuss gegenüber dem Mass das notwendig ist um das reduzierende Material zu stabilisieren vorhanden sind, insbesondere diejenigen mit hoher Affinität für Technetium, können mit dem Tc-99m reagieren, wodurch Komplexe gebildet werden, welche eine hohe Affinität zu Knochen, Nieren oder anderen nicht erwünschten Geweben zeigen, wodurch die erwünschte Aufnahme auf Kosten der RES-Aufnahme erhöht wird, und wodurch eine Verminderung der Wirksamkeit der Mikroaggregate als RES-Darstellungsmittel bewirkt wird. Dementsprechend soll die Menge des Liganden keinen wesentlichen Überschuss darstellen gegenüber derjenigen Menge welche erforderlich ist um das reduzierende Material zu stabiliseren.
Die minimalen und maximalen Mengen des Liganden können leicht durch routinemässige Testung auf unlösliche Hydroxide vor der Aggregierung bestimmt werden, und durch Beobachtung der Wirkung auf die Aufnahme durch Knochen, Nieren, Urinabscheidung und andere, nicht erwünschte Verteilungen des aggregierten Produktes. Darüber hinaus ist bei steigender Konzentration des Liganden der pH-Bereich enger, in welchem die erwünschten Teilchengrössenverteilungen bei der Aggregation erreicht werden. Dementsprechend ist es für optimale Resultate erwünscht, etwas mehr als die minimal notwendie Menge an Ligand zu verwenden die notwendig ist um das reduzierende Metall vor der Aggregation in Lösung zu halten.
Die Konzentration an zusätzlichem Ligand und die maximale und minimale Menge davon hängt ebenso von der Art des Liganden ab, der angewandt wird, da einige Liganden, wie zum Beispiel MDP, eine grössere Bindungsfähigkeit (höhere Stabilitätskonstante) und eine geringere ionische Stärke aufweisen als andere. Ein Ligand welcher den weitesten pH-Bereich, in dem die erwünschte Teilchengrössenverteilung erreicht wird, gewährleistet ist der am meisten zu bevorzugende. Die Diphosphate, und insbesondere MDP und HEDP, fallen in diese Kategorie.
Die maximalen und minimalen Mengen an Ligand hängen ebenso vom jeweiligen pH-Wert ab, bei welchem die Aggregation ausgeführt wird. Die optimale Menge an zusätzlichem Ligand ist zu klein um einen deutlichen Puffereffekt zu bewirken, oder um das Verhältnis zwischen Zielaktivität zu Nicht-Zielaktivität zu verändern, obwohl der Ligand ein derartiger sein kann, von dem bekannt ist, dass er Nicht-Zielgewebe aufsucht. Es ist interessant festzustellen, dass die Zugabe eines Liganden von dem bekannt ist, dass er Nicht-Zielgewebe sucht, das Ziel/ Nichtziel-Verhältnis erhöht.
Da es der Komplex-bildende Anteil des Liganden ist, welcher das reduzierende Metall bindet, wird die Konzentration des Liganden am besten als Molekulargewichtsverhältnis einer derartigen Funktion zum reduzierenden Metallion, beispielsweise So++, angegeben. Dieses Verhältnis hängt stark von der Auswahl des Liganden ab. Für einen Liganden wie zum Beispiel Methylendiphosphonat, welcher eine ziemlich hohe Stabilitätskonstante aufweist, ist ein derartiges Verhältnis vorzugsweise zwischen 0,6: 1 und 1,2: 1, und für einen Liganden wie zum Beispiel Glucoheptonat, welches eine ziemlich niedrige Stabilitätskonstante aufweist, ein etwa 2'/2faches dieses Verhältnisses bevorzugt.
Unter Verwendung von MDP und Zinn(II)-chlorid und einem pH-Bereich von 5,4 bis 6,6 werden erfolgreiche Resultate erhalten mit einem Gewichtsverhältnis von Ligand zu SnCl2 2H2O von 0,5 : 1 bis 1:1. Wenn der pH-Wert über diesen Bereich erhöht wird, dann kann die Konzentration von MDP erhöht werden um die gleiche biologische Verteilung zu erhalten.
Es geht aus dem obigen klar hervor, dass ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Auswahl und der Konzentration eines Liganden und dem optimalen pH-Bereich für das Erhalten von Teilchen der geeigneten Grössenbereiche bei der Aggregation besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Aggregation in Gegenwart eines wasserlöslichen pharmakologisch und toxikologisch annehmbaren oberflächenaktiven Mittels der gleichen Art, welche auch vorzugsweise in die Stabilisierlösung eingebracht wird, zugeführt. Obwohl gute Resultate ohne Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels während der Aggregation erhalten wurden, ist es bevorzugt dieses Mittel als zusätzlichen Sicherheitsfaktor anzuwenden, da man annimmt dass dessen Anwendung die Reproduzierbarkeit und Stabilität der Aggregate bezüglich der Teilchengrösse erhöht.
Eine Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln ist für die Verwendung beim Aggregationsschritt und in der Stabilisierlösung geeignet. Vorzugsweise sind die oberflächenaktiven Materialien nicht-ionische oberflächenaktive Materialien und bei Zimmertemperatur Feststoffe. Die geeigneten oberflächenaktiven Materialien sind diejenigen, welche nicht-toxisch gegenüber den Blutkomponenten oder Geweben sind, und welche vorzugsweise eine Hydrophil/Lipophil-Balance (HLB) von etwa 14 bis etwa 40, und vorzugsweise von etwa 27 bis 30,5 aufweisen.
Wenn das oberflächenaktive Mittel im Aggregationsschritt angewandt wird, werden üblicherweise nur sehr kleine Mengen angewandt. Vorzugsweise ist das oberflächenaktive Mittel in der noch nicht aggregierten Masse, wenn es überhaupt verwendet wird, in einer Menge von etwa 0,1% bis etwa 10% des Albumins in derartigen noch nicht aggregierten Massen vorhanden, und insbesondere bevorzugt in einer Menge von 2 - 8 Gew.-%.
Das oberflächenaktive Mittel, das in der Stabilisierlösung gelöst ist wie das bereits erwähnt wurde, erleichtert die schnelle Dispersion (Wiederherstellung der Dispersion) der gefriergetrockneten Albumin-reduzierenden-Aggregate in der Pertechnetatlösung wenn die letztere Lösung zugesetzt wird um an den Patienten verabreicht zu werden. Die Menge an oberflächenaktivem Mittel, welche in der Stabilisierlösung angewandt wird, ist üblicherweise grösser als die Menge die beim Aggregationsschritt angewandt wird.
Vorzugsweise ist das oberflächenaktive Mittel in der Stabilisierlösung in einer Menge von etwa 0,2 bis 20%, und vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10% der lyophilisierten Zusammensetzung (auf Feststoffbasis) anwesend.
Geeignete oberflächenaktive Mittel für die Verwendung während der Aggregation und in der Stabilisierlösung sind Polysorbat 80, U.S.P., höhermolekulargewichtige Polyäthylenglycole wie zum Beispiel Carbowaxe von der Union Carbide, und Molekularkombinationen von Polyoxyäthylen und Polyoxypropylen (Äthylenoxyd-Propylenoxyd-Block-Copolymerisate) wie beispielsweise die Pluronics von der BASF Wyandotte.
Siehe dazu auch das Werk Detergents and Emulsifiers von McCutcheon, nordamerikanische Ausgabe (1973) auf den Seiten 213-217, wo viele handelsüblich erhältlichen oberflächenaktive Mittel mit HLB-Zahlen zwischen 14 und 40 aufgeführt sind. Am meisten bevorzugt sind die Pluronics, und davon insbesonders Pluronic-F-68, welches ein Molekulargewicht von etwa 8350 und einen HLB-Wert von 29,0 aufweist und bei Zimmertemperatur fest ist.
Das Volumenverhältnis von nicht aggregierter Albumin Stabilsatorlösung (enthaltend oberflächenaktive Mittel und Pufferstoffe wenn sie angewandt werden) zum aggregierten Humanserumalbumin (aggregierte Masse) kann in einem weiten Bereich variieren. Ausgezeichnete Resultate wurden mit Verhältnissen von 1:1 bis 1: 3 erhalten, wobei ein Verhältnis von I 2 bevorzugt ist.
Bezogen auf die endgültige lyophilisierte Feststoffzusammensetzung liegt das Verhältnis von löslichem Albumin zu aggregiertem Albumin beispielsweise im Bereich von etwa 3 1 bis 20 1, und insbesondere im Bereich von 5 1 bis 15 1.
Die Pufferverbindung wird der aggregierten Masse entweder als Teil der Stabilisierlösung oder, wenn eine solche Lösung nicht angewandt wird, als solche zugsetzt, um den pH-Wert in einem solchen Bereich aufrecht zu erhalten, der ausreichend weit vom isoelektrischen Punkt entfernt ist, um die Zusammensetzung dahingehend zu stabilisieren, dass kein Wachstum der Partikel beim Vermischen durch Lyophilisierung oder nach der Markierung eintritt. Ein geeigneter pH-Bereich ist dabei zwischen 7 und 9, und vorzugsweise bei 8 + 0,5, aufgrund der weiter oben genannten Gründe. Irgendeine pharmakologisch und toxikologisch annehmbare verträgliche Puffersubstanz, welche nicht wesentlich mit dem Tc-99m in Konkurrenz tritt, kann angewandt werden.
Geeignete Puffer sind Mischungen aus Säuren und Salzen von schwachen Säuren, wie zum Beispiel die geeigneten Natriumsalze der Orthophosphorsäure.
In manchen Fällen kann es erwünscht sein, der Masse vor der Aggregierung einen Elektrolyten zuzusetzen, wie zum Beispiel lösliches Alkali- oder Erdalkalimetallsalz, wie beispielsweise Natriumchlorid, um die lonenstärke einzustellen.
Die maximale Menge von Tc-99m (Pertechnetat), die zu den Albuminaggregaten relativ zur Menge der denaturierten und aggregierten HSA zugesetzt wird, wird durch die Tatsache gegeben, dass jeder wesentliche Überschuss über die Menge hinaus die an die Mikroaggregate gebunden wird keinen vorteilhaften Effekt aufweist, und es sollte dieser Überschuss vermieden werden aus Gründen die nichts mit der vorliegenden Erfindung zu tun haben, nämlich aufgrund dessen, dass die Menge an radioaktivem Material die in den Körper injiziert werden soll auf dem benötigten Minimum gehalten werden soll. Es kann jedoch ein leichter Überschuss angewandt werden, relativ zu der Menge die an die Mikroaggregate gebunden wird. Aufgrund von Primatenuntersuchungen können bis zu 10% freies Pertechnetat voraussichtlicherweise die klinische Verwendbarkeit nicht nachteilig beeinflussen.
Die minimale Menge wird durch die Menge bestimmt, welche notwendig ist um klinisch annehmbare Darstellungen zu ergeben. Das Molekulargewichtsverhältnis von Tc-99m zu aggregiertem HSA (bezogen auf das Molekulargewicht des HSA vor der Aggregation) kann 0,25 oder mehr betragen.
Die radioaktive Dosierung der Tc-99m-markierten erfindungsgemässen Mikroaggregate kann im Bereich von 0,01 bis 50 mCi (Millicurie) pro Patient liegen und liegt vorteilhafterweise im Bereich von 1 bis 8 mCi.
Vorzugsweise ist das Volumen der Pertechnetatlösung, welche zur schlussendlichen Masse als solche oder nach Gefriertrocknung zugegeben wird, im Bereich von 1 bis 10 vorzugsweise 1 bis 8 ml, enthaltend 1 bis 300 oder mehr, und vorzugsweise 5 bis 50 mCi pro Milligramm denaturiertes Albumin. Die Pertechnetatlösung ist üblicherweise das Eluat aus einem üblichen Tc-99m Generator, aber es muss nicht der Fall sein.
Eine bessere Bindung des reduzierenden Metalls an das HSA und homogenere Mikroaggregate werden erreicht mit einer geringeren Oxydation des reduzierenden Metalls durch Mischen des reduzierenden Metalls und zusätzlichem Liganden mit dem HSA vor der Aggregierung, wodurch man eine verbesserte RES-Darstellung erhält. Es wird angenommen, dass ein intimerer Kontakt zwischen dem HSA und dem reduzierenden Metall erreicht wird weil das HSA sich während der Erhitzung öffnet und die neu exponierten Bindungsstellen mit dem reduzierenden Metall reagieren, und zwar vor und während der Aggregierung, und das reduzierende Metall wird ein inniger Teil der Mikroaggregatpartikel.
In jedem Fall hat sich herausgestellt, wie das bereits festgestellt wurde, dass bessere Resultate erhalten werden wenn das HSA in Gegenwart des reduzierenden Metalls aggregiert wird.
Jedoch stellt die Gegenwart des reduzierenden Metalls während der Aggregation Probleme, welche nicht auftreten wenn das Humanserumalbumin ohne der Gegenwart des reduzierenden Metalls aggregiert wird, und welche überwunden werden durch die Gegenwart eines Liganden während der Aggregation, durch Einregelung des pH-Wertes und die Erhitzungsbedingungen während der Aggregation und durch Aufrechterhaltung anaerober Bedingungen während des ganzen Verfahrens.
Ein derartiges Problem ist das Erreichen einer erwünschten Teilchengrössenverteilung, ein anderes besteht in der Bindung der erforderlichen Menge an reduzierendem Metall an das denaturierte Albumin, und ein weiteres Problem besteht in der Verhinderung der Bildung von unlöslichen Hydroxyden oder Oxidhydraten des reduzierenden Metalls.
Das Wasser oder andere pharmazeutisch akzeptable Träger, die angewandt werden, um die verschiedenen Lösungen herzustellen, und in welchen die Mikroaggregation auftritt sind vorzugsweise pyrogenfreies destilliertes Wasser, welches behandelt wurde um den darin enthaltenen Sauerstoffgehalt zu vermindern.
Ebenso werden vorzugsweise alle Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens unter anaeroben Bedingungen ausgeführt, d.h. in Abwesenheit von Sauerstoff, wie zum Beispiel in einer Stickstoffatmosphäre.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die Mischung der Stabilisatorlösung und der denaturierten HSA-reduzierenden Metall-Mikroaggregate die den Liganden enthalten, wenn einer angewandt wird, in üblicher Weise gefriergetrocknet, und zwar in sterilen pyrogenfreien Behältern oder Ampullen welche verschlossen werden, und in Form eines Anwendersatzes vertrieben werden, welche am Anwendungsort verwendet werden können, indem man eine vorgeschriebene Menge radioaktives Pertechnetat der Ampulle zusetzt.
Bezüglich der Technik zur Bestimmung der Radioaktivitätsverteilung im Mikroaggregat in Abhängigkeit der Teilchengrösse besteht eine geeignete Technik darin, welche angewandt wurde um Aliquote von Tc-99m-markierten Mikroaggregaten zu verdünnen, die durch Filter die in Serie angeordnet sind hindurchtreten sollen, indem man zu den markierten Mikroaggregaten, d.h. dem Produkt das durch Zugabe der Pertechnetatlösung zu den lyophilisierten Aggregaten erhalten wird, eine Verdünnungsmenge an Stabilisatorlösung in einem Volumenverhältnis von 9 Teilen verdünnter Stabilsatorlösung zu 1 Teil markierten Aggregaten zusetzt. Dieses Verhältnis kann in einem weiten Bereich variieren, solange das schliesslich verdünnte All- quot nicht in ungeeigneter Weise die Poren der Filtermembranen verstopft.
Die Stabilisatorlösung wird verdünnt, indem man eine ausreichende Menge Kochsalzlösung zusetzt, um sie auf die in etwa gleiche Feststoffkonzentration zu verdünnen wie das markierte Produkt. Die Teilchengrössenverteilungen die hier angegeben sind wurden nach dieser Technik erhalten. Es können jedoch auch andere Techniken angewandt werden.
Obwohl die Stabilisatorlösung nicht erforderlich ist, wenn die aggregierte Masse direkt ohne Gefriertrocknung (in solchen Fällen kann der Puffer als solcher zugesetzt werden) verwendet wird ist es jedoch bevorzugt die Stabilisierlösung mit dem Puffer in jedem Falle zuzusetzen um die Teilchengrösse bei Zugabe der Pertechnetatlösung zu stabilisieren.
Das erfindungsgemäSSE Verfahren kann als ansatzweises Verfahren, als halbkontinuierliches Verfahren oder als kontinuierliches Verfahren ausgeführt werden, indem man ein relativ grosses Verhältnis von Heizfläche zu Volumen anwendet.
Vorzugsweise wird die voraggregierte Masse durch eine Sterilfiltermembran, beispielsweise eine 0,22 zm Sterilisiermembran, filtriert bevor die Aggregation ausgeführt wird, und die Stabilisatorlösung wird durch eine Sterilisierfilter filtriert bevor man sie der aggregierten Masse zusetzt/.
Ebenso wird die endgültige Masse (die Mischung der aggregierten Masse und der Stabilisatorlösung) durch ein Filter einer Porenweite von 3 pm filtriert, um Teilchen zu entfernen die eine Teilchengrösse von mehr als 3 ,am aufweisen, und sodann füllt man in Ampullen ein und lyophilisiert.
Die erfindungsgemässe aggregierte Masse weist eine milchige bis trübe Erscheinungsform auf, entsprechend den Bedingungen die im Aggregierungsschritt angewandt wurden. Bei niedrigeren pH-Werten innerhalb des annehmbaren pH-Bereiches kann die Masse opaque werden. Wenn der pH-Wert erhöht wird, und zwar in Richtung der Mitte des pH-Bereiches wird die Masse eher leicht milchig mit leicht durchscheinendem Aussehen, und wenn der pH-Wert weiterhin im gegebenen Bereich ansteigt, wird die Masse trübe.
Die Erfindung sei nun anhand einiger bevorzugten Ausführungsformen, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, näher erläutert.
Beispiel 1
Zu 90 ml Wasser mit niedrigem Sauerstoffgehalt werden unter Rühren und anaeroben Bedingungen die folgenden Materialien zugefügt: 0,6 ml Humanserumalbumin, 25% (25 g/100 ml) Salz-arm, U.S.P., wobei das HSA 0,15 g wiegt, 3 ml Natriummethylen-diphosphonat-(MDP)-lösung (0,5 g Methylendiphosphonsäure gelöst in 100 ml 0,5-normaler Natriumhydroxydlösung), 11,15 ml 0,05-normaler Hydroxydlösung für die pH Einstellung, 0,5 ml Zinn(II)-chlondlösung [4,2 g Zinn(II)chlorid-dihydrat + 1,5 ml 12n Chlorwasserstoffsäure verdünnt auf 100 ml mit Wasser niedrigen Sauerstoffgehaltesj, und 0,6 ml einer lprozentigen wässrigen Lösung von Pluronic F-68, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel aus einem Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymeren. Der pH-Wert der Lösung ist 6,1.
Aliquote dieser Lösung werden anaerob durch eine Sterilisiermembran von 0,22 ym Porengrösse filtriert, und man erhitzt während 3,5 Minuten in einem Wasserbad mit etwa 99"C Temperatur, wodurch man eine milchige Suspension der Mikroaggregate von HSA und Sn+ + erhält.
Zu etwa 50 ml sauerstoffarmem Wasser werden unter anaeroben Bedingungen 5,7 g Dinatriumorthophosphatheptahydrat (Puffer), 12 ml 25prozentiges HSA und 0,33 g Pluronic f-68 zugefügt. Nach Lösen der Feststoffe wird die Stabilisatorlösung auf 100 ml mit sauerstoffarmem Wasser verdünnt und durch ein Sterilisierfilter unter anaeroben Bedingungen filtriert.
3,3 ml der obigen sterilen Stabilisierlösung werden unter anaeroben Bedingungen mit 6,7 ml der sterilen milchigen Suspension an Mikroaggregaten vermischt. 1 ml Aliquote dieser Formulierungen, welche einen pH-Wert von 8 aufwiesen, wurden unter aseptischen Bedingungen in sterile pyrogenfreie Serumampullen von 10 ml Fassungsvermögen eingefüllt. Die Ampullen werden üblicherweise unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet (lyophylisiert) um das Wasser zu entfernen.
So erhält man feste Mikroaggregate des Komplexes (chemisch oder physikalisch) von denaturiertem HSA und So+ + . Jede Ampulle enthielt 1 mg mikroaggregierte Teilchen von komplexiertem, denaturiertem und aggregiertem HSA, 10 mg nicht aggregiertes HSA, 0,1 mg SnCl2, 0,1 mg MDP, 10 mg Phosphatpuffer (berechnet als Dinatriumorthophosphat) und 1,14 mg Pluronic F-68 oberflächenaktives Mittel.
Die Ampullen werden verschlossen und gelagert bis sie zur Verwendung gelangen, und sodann wurde das enthaltene Zinn (II)-mikroaggregierte Albumin mit Tc-99m markiert.
Um die Tc-99m-markierten Aggregaten herzustellen wurden 5 ml frische radioaktive Natriumpertechnetatlösung (etwa 100 mCi obwohl auch eine wirksame Markierung mit weniger als 1 mCi bis mehr als 300 mCi möglich ist) aus einer sterilen pyrogenfreien Eluatlösung aus einem sterilen NEN Tc-99m Generator entnommen, welches in Form einer 0,9prozentigen Kochsalzlösung vorlag, und diese Lösung wurde unter aseptischen Bedingungen der jeweiligen Ampulle zugefügt. Die Ampulle wird sodann geschüttelt um die löslichen Anteile zu lösen, und die Mikroaggregatteilchen in der Kochsalzlösung zu dispergieren, wodurch man das gefriergetrocknete Produkt in seiner ursprünglichen Form erhält und die Mikroaggregate markiert.
Bei allen erwähnten Schritten werden aseptische Verfahrensbedingungen und sterile pyrogenfreie Materialien und Behälter angewandt.
Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchen grösse der Mikroaggregate wie sie bei einer derartigen Herstellung bestimmt wurde:
Teilchengrösse Prozent vom Total r 5 ILm 0,5 3-5 ILm 1,5 0,2- 3 pm 71,1 < 0,2,am 26,9 1-5 mCi dieser Dispersion von Tc-99m markierten Zinn(II) Mikroaggregaten wurden intravenös in erwachsene Mäuse eingespritzt.
15 Minuten nach der intravenösen Injektion wurden die Mäuse getötet und die verschiedenen Organe (Leber, Milz usw.) mittels üblicher Gammazähltechniken gemessen, um die Aufnahme eines jeden Organes bezüglich Tc-99m zu bestimmen.
Biologische Verteilung in Mäusen 15 Minuten nach intravenöse Injektion:
Organ Prozentsatz der injizierten
Dosis pro Organ
Leber 87,8
Milz 2,6
Lungen 0,5
Skelett (einschl. Knochenmark) 5,8
Nieren 1,0
Magen-Darm-Trakt 0,6
Rest 1,6
Aktivitäten von 1-5 mCi, die in ähnlicher Weise hergestellt wurden, wurden intravenös in Primaten (Paviane) eingespritzt.
Die Leber-Milz-Darstellung wurde in üblicher Weise ausgeführt, und zwar innerhalb der ersten 30 Minuten nach Einspritzung, indem man eine Gamma-Szintillationskamera (Picker Dyna Camera II) verwendete. Es wurden gleichzeitige scharfe und klare Darstellungen der Leber und der Milz erhalten, wobei nur ein niedriger Untergrund auftrat. Die Aufnahme in der Lunge und in weichen Geweben war minimal. Ausgezeichnete Bilder des Knochenmarkes können ebenso erhalten werden, indem man geeignete längere Expositionen anwendet als dies für Leber und Milz der Fall ist. Diese Darstellungen waren gleich gut wie diejenigen welche mit Schwefelkolloid RES-Darstellungsmittel erhalten werden, und sie sind klinisch geeignet für genaue diagnostische Anwendungen.
Obwohl die biologische Verteilung der Radioaktivität bei Mäusen dazu herangezogen werden kann um die Verteilung bei Primaten sowie die selektive Aufnahme durch das RES als Ganzes (Leber, Milz und Knochenmark) vorauszusagen, und die unterschiedliche Aufnahme durch das RES als Ganzes und die Aufnahme durch andere Organe darzustellen ergibt sich keine Correlation zwischen den Leber-Milz Aufnahmeverhältnissen von Primaten, und dementsprechend auch keine gegenüber der Qualität der Milzdarstellung einzeln oder simultan mit der Leberdarstellung bei Primaten. Siehe dazu Int. J. of Applied Radiation and Isotopes 1977, Band 28, Seiten 123-130. Um dementsprechend dieses Verhältnis und die Darstellungsqualität bei Menschen vorherzusagen ist es notwendig das RES von Primaten darzustellen, wie beispielsweise von Affen (Rhesusaffen) oder Pavianen.
Die oben genannte biologische Verteilung bei Mäusen und die radioaktive bildliche Darstellung des RES bei Primaten zeigt, dass die erfindungsgemässen radioaktiv markierten Zinn(II) mikroaggregierten Albuminpräparationen dieses Beispieles ausgezeichnete RES-Darstellungsmittel sind, welche eine ausgezeichnete gleichzeitige Milz-Leber-Darstellung erlauben.
Im wesentlichen die gleichen Resultate wurden erhalten, wenn der Gefriertrocknungsschritt ausgelassen wurde. Ebenso wurden gute Resultate erhalten, wenn das Zinn(II) mikroaggregierte Albumin direkt angewandt wird, ohne dass man gefriertrocknet und ohne dass man die stabilisierende gepufferte HSA Pluron-F-68-Lösung zusetzte, jedoch eine ausreichende Menge Puffer zusetzte, um den gleichen pH-Wert zu erreichen. Wenn jedoch die Mikroaggregate gefriergetrocknet werden, ohne eine derartige Stabilisierlösung zuzusetzen ist es schwierig sie bei Zugabe der Pertechnetatlösung wieder zu dispergieren. Ob nun die Mikroaggregate in Abwesenheit einer Stabilisierung die durch einen Puffer gewährleistet wird gefriergetrocknet werden oder nicht, kann die Teilchengrösse in einer Pertechnetatlösung in physiologischer Kochsalzlösung in unkontrollierter Weise ansteigen.
In allen folgenden Beispielen wurden alle Mischungs- und Filtrations- und Erhitzungs-schritte unter anaeroben Bedingungen ausgeführt, wie dies auch in diesem Beispiel der Fall war, und jedes 1 ml Aliquot der Dispersion in den sterilen pyrogenfreien Ampullen von 10 ml Fassungsvolumen wurde den gleichen Arbeitsschritten wie in Beispiel 1 unterworfen, d.h. das Aliquot kann gefriergetrocknet und markiert werden, oder es kann markiert werden ohne dass man Gefriertrocknung anwendet, und das markierte Aliquot wurde bezüglich der Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse wie oben beschrieben analysiert. Die biologische Verteilung in Mäusen und die Radioaktivitätsdarstellung bei Affen wurde, wenn diese Tests ausgeführt wurden, in jedem Beispiel gleich ausgeführt wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
Beispiel 2
Zu 45 ml eines Wassers mit niedrigem Sauerstoffgehalt wurden unter Mischen die folgenden Materialien zugefügt: 0,3 ml 25prozentige Humanserumalbuminlösung (75 mg HSA), 0,25 ml Zinn(II)-chloridlösung (wie in Beispiel 1), 0,3 ml lprozentige Pluron-F-68-Lösung, 11,2 mg Diäthylentriaminpentaessigsäure und 1,65 ml 0,1 n-Natriumhydroxydlösung. Der pH-Wert der Lösung war 6,54. Aliquote dieser Lösung wurden durch eine Sterilisiermembran einer Porengrösse von 0,22 y filtriert, und man erhitzte während 31/2 Minuten auf etwa 990C, wodurch man eine leicht milchige Suspension von Mikroaggregaten des denaturierten HSA und von Sn+ + erhielt.
3,3 ml einer Stabilisierlösung, die die gleiche Zusammensetzung aufwies wie in Beispiel 1, wurde unter anaeroben Bedingungen mit 6,7 ml der milchigen Suspension vermischt. Aliquote eines Volumens von 1 ml dieser Formulierung, welche einen pH-Wert von 8 aufwies, wurden in sterile pyrogenfreie Serumampullen mit 10 ml Fassungsvolumen wie in Beispiel 1 eingefüllt.
Die Testdaten einer derartigen Herstellung, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 verarbeitet und markiert wurde, zeigten die folgenden Werte: Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse: Teilchen grösse Prozent vom Total - 5 ym 1,1 3-5ym 1,1
0,2 - 3 itm 68,4 < 0,2 llm 29,5
Beispiel 3 zu 45 ml eines Wassers niedrigen Sauerstoffgehaltes werden unter Rühren die folgenden Materialien zugefügt:
0,3 ml Iprozentige Pluron-68-Lösung, 0,3 ml 25prozentiges Humanserumalbumin (75 mg HSA), 0,25 ml Zinn(II)-chloridlösung [4,2 g Zinn(II)-chlorid + 3 ml 12 normale Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes]. 16,7 ml dieser Lösung wurden mit 1 ml einer Iprozentigen wässrigen Lösung von Natriumpyrophosphat (10,2 mg Na4P207 l0H2O) und 0,55 ml einer 0,025 normalen
Natriumhydroxydlösung vermischt. Der pH-Wert dieser Lösung war 5,85. Aliquote dieser Lösung wurden durch eine Sterilisier membran von 0,22 zm Porengrösse filtriert, und man erhitzte während 31/2 Minuten in kochendem Wasser, wodurch man eine milchige Suspension von Mikroaggregaten des denaturierten
HSA erhielt.
Zu etwa 50 ml Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes wurden 5,7 g Na2HPO4 7H2O, 12 ml 25prozentiges Humanse rumalbumin und 0,33 g Pluron-F-68 zugefügt. Nach Auflösen der Feststoffe wurde diese Stabiliserlösung auf 100 ml mit Was ser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes verdünnt, und man fil trierte durch ein Sterilisierfilter.
3,3 ml der oben erwähnten Stabilisierlösung werden unter anaeroben Bedingungen mit 6,7 ml der milchigen Suspension vermischt. 1 ml Aliquote dieser Formulierung, welche einen pH-Wert von 8 aufwies, wurden in Serumampullen von 10 ml
Volumen eingefüllt.
Die Testdaten einer derartigen Herstellung, die wie in Beispiel 1 beschrieben verarbeitet und markiert wurde, waren die folgenden: Aklivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchen grösse:
Teilchengrösse Prozent vom Total 54m 1,0 3-5Ssm 1,0
0,2 - 3 ym 69,0 0,2 clm 29,0
Beispiel 4
Zu 290 ml eines Wassers niedrigen Sauerstoffgehaltes wurden unter Rühren die folgenden Materialien zugefügt:
1 ml einer wässrigen Lösung, welche 0,2 g Pluron-F-68 pro 5 ml enthielt, 4 ml 25prozentiges Humanserumalbumin (1 g HSA), 3 ml Zinn(II)-chloridlösung [4,64 g Zinn(II)-chloriddihydrat + 2 ml 12 normaler Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes], 0,66 g Na2HPO4 - 7H2O in 15 ml eines Wassers niedrigen Sauerstoff- gehaltes und 4,04 ml einer 4 molaren Natriumchloridlösung.
Der pH-Wert der Lösung war 6,5. Nach anaerober Filtration durch eine Sterilisiermembran von 0,22 zm Porengrösse wird das Material nach und nach und kontinuierlich durch zwei Wärmetauscher hindurchgeleitet. Dadurch wird eine halbkontinuierliche Methode für die Aggregation zur Verfügung gestellt, welche vollkontinuierlich gemacht werden kann, indem man einen eingeregelten und kontinuierlichen Fluss von Bestandteilmaterialien in eine Mischkammer einführt, und indem man einen kontinuierlichen Fluss aus dieser Mischkammer durch den Filter und die Wärmetauscher herstellt, wobei das aus den Wärmetauschern austretende Material kontinuierlich unter eingeregeltem Fluss in eine Mischkammer eingeführt wird, in welche die Stabilisierlösung kontinuierlich und in eingeregelter Menge zugeführt wird, und wo eine Mischung zwischen diesen Materialien stattfindet,
wobei die so erhaltene Mischung kontinuierlich durch ein Filter mit 3 ,am Porengrösse hindurchgeführt wird, und in Ampullen, bzw. Serumfläschchen eingefüllt wird, welche kontinuierlich in einen Gefriertrockner eingeführt werden können. Der erste Wärmetauscher wird mittels eines fluiden Mediums bei etwa 99"C gehalten, und der zweite wird mittels eines fluiden Mediums auf eine normale Zimmertemperatur gekühlt, und aus diesem werden die Aggregat-Produkte unter anaeroben Bedingungen gesammelt. Die durchschnittliche Verweilzeit der gesamten Masse in jedem Wärmetauscher reicht von etwa 3 bis etwa 8 Minuten, und man erhält eine milchige Suspension von Mikroaggregaten des Zinn(II) denaturierten Humanserumalbumins.
Zu 10 ml Phosphatlösung (9,5 g Na2HPO4 - 7H20 pro 100 ml) werden 2 ml 25prozentiges Humanserumalbumin (0,5 g HSA), 6,25 ml Pluron-F-68-Lösung (4,0 g pro 100 ml), und Wasser zugesetzt, wodurch man ein Totalvolumen von 35 ml Stabilisierlösung erhält. Nach gründlicher Mischung, Entfernung von Sauerstoff und Sterilfiltration werden 15 ml der milchigen Suspension zugefügt, und anschliessend wird nochmals gründlich durchgemischt.
1 ml Aliquote dieser Formulierung, welche einen pH-Wert von 8 aufwiesen, wurden in Serumfläschchen, bzw. Ampullen mit einem Fassungsvermögen von 10 ml eingefüllt. Die Testdaten derartiger Präparationen, welche wie in Beispiel 1 beschrieben markiert wurden, sind die folgenden: Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse: Teilchen grösse Prozent vom Total 2 3gam 7 1-3 Lcm 16
0,2-1 ym 57 < 0,2ym 18 Biologische Verteilung in Mäusen 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung:
Organ Prozent der injizierten
Dosis pro Organ
Leber 89,3
Milz 1,1
Lungen 1,0
Knochengerüst 7,7
Nieren 0,5
Magen-Darm-Trakt 0,2
Rest 0,2
Beispiel 5
Zu 45 ml eines sauerstoffarmen Wassers werden unter Rühren folgende Materialien zugesetzt:
0,3 ml 25prozentiges Humanserumalbumin (75 mg HSA), 0,25 ml Zinn(II)-chloridlösung [4,2 g Zinn(II)-chloriddihydrat und 3 ml 12 normale Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 mit Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes], 0,3 ml lprozentige Pluron F-68-Lösung, und 3,7 ml lprozentige Natriumpyrophosphatlösung (hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben). Der pH-Wert ist 5,71. Aliquote dieser noch nicht aggregierten Lösungsmasse werden durch eine Sterilisiermembran von 0,22 pm Porengrösse filtriert, und man unterwirft einer ausreichenden Erhitzung durch Mikrowellen, beispielsweise während 20 Sekunden, wodurch man eine milchige Suspension von Mikroaggregaten des Zinn(II)-denaturierten Humanserumalbumins erhält.
Diese milchige Suspension wird mit einer HSA-Natriumphosphat-Pluron-F-68-Stabilisierlösung formuliert, wodurch man eine Formulierung mit pH 8 erhält, und diese wird in Se rurnflschchen, bzw. Ampullen eingefüllt und mit 7 ml 99mTc- Natriumpertechnetat wie in Beispiel 3 markiert.
Es werden die folgenden Resultate mit einem derartig hergestellten Material erhalten: Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchen grösse:
Teilchengrösse Prozent vom Total 5ym 2,1 3 - 5 pm 3,1
0,2 - 3 ,am 84,0
0,2 zum 10,8 Biologische Verteilung in Mäusen 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:
Organ Prozent der injizierten
Dosis pro Organ
Leber 85,9
Milz 4,3
Lungen 0,5
Knochengerüst 5,3
Nieren 1,0
Magen-Darm-Takt 0,7
Rest 2,3
Beispiele 6 und 7
Zu 417 ml eines Wassers niedrigen Sauerstoffgehaltes werden unter Rühren die folgenden Materialien zugefügt: 16,3 ml (0,75 g) gereinigtes Humanserumalbumin (von Lipidmaterial durch Ansäuern und durch Behandlung mit Aktivkohle befreit, wie dies in der U.S.
Patentschrift Nr ; (Serial Nr.
783 633) beschrieben ist, unter anschliessender Ultrafiltration, wodurch man eine Albuminkonzentration von 4,6% erhält), 2,5 ml Zinn(ll)-chloridlösung [4,2 g Zinn(II)-chlorid-dihydrat + 3 ml 12-normale Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes], und 3 ml Iprozentige Pluron-F-68-Lösung. Die so erhaltene Lösung wird gründlich mit 25,6 ml einer Iprozentigen wässrigen Lösung von Natriumpyrophosphat (hergestellt wie in Beispiel 3) vermischt, sowie mit 34,2 ml 0,025-normaler Natriumhydroxydlösung. 150 ml der so erhaltenen Lösung werden durch eine Sterilisiermembran von 0,22 pm Porengrösse filtriert. Dieses filtrierte Ausgangsmaterial das noch nicht aggregiert ist, wies einen pH-Wert von 5,62 auf, und wird für die Anwendung in Beispiel 6 aufbewahrt.
Eine weitere Menge von 3,4 ml 0,025-normaler Natriumhydroxydlösung wird zur verbleibenden Lösung zugegeben, während man weiter rührt. Der pH-Wert ist 6,11. Die Filtration wird wie oben ausgeführt. Dieses Ausgangsmaterial welches noch nicht aggregiert ist wird für Beispiel 7 aufbewahrt.
Aliquote der beiden noch nicht aggregierten Ausgangsmaterialien werden während 3,5 Minuten in einem heissen Wasserbad mit einer Temperatur von 99"C erwärmt, um die Mikroaggregate herzustellen.
Erscheinungsform Beispiel 6 Beispiel 7
Milchig X
Trübe X
Man formuliert mit Stabilisierlösung (der pH-Wert der stabilisierten Formulierung ist 8), füllt in Ampullen ein und markiert mit 5 ml 99mTc-Natriumpertechnetatlösung, wie dies alles in Beispiel 3 beschrieben ist, und man erhält die folgenden Resultate: Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse:
Prozent vom Total
Teilchengrösse Beispiel 6 Beispiel 7 2 5,um 1,9 0,7 3-5 llm 2,8 1,3
1-3 ym 32,7 1,3 0,2 - 1 ,am 50,5 4,6 < 0,2 pm 12,2 92,1 Biologische Verteilung in Mäusen 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:
: No der injzierten Dosis pro Organ
Organ Beispiel 6 Beispiel 7
Leber 86,0 88,3
Milz 3,3 2,2
Lungen 0,8 0,6
Knochengerüst 6,2 7,3
Nieren 1,0 0,7
Magen-Darm-Trakt 1,0 0,3
Rest 1,7 0,6 Szintigraphische Darstellung bei Affen:
Qualität der Darstellung
Organ Beispiel 6 Beispiel 7
Leber Gut Gut
Milz Gut Mässig
Knochenmark Gut Gut
Die Verschlechterung der Darstellungsqualität der Milz infolge der scharfen Reduktion der Teilchengrösse, welche durch Erhöhung des pH-Wertes in Beispiel 7 erreicht wurde, ist aus dem Vergleich der Beispiele 6 und 7 bezüglich der Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse ersichtlich (was sich ebenso in der Erscheinungsform der aggregierten Materialien zeigt), und aufgrund der Bilddarstellungsqualität bei gesunden Primaten ersichtlich.
Beispiel 8
Zu 45 ml eines Wassers niedrigen Sauerstoffgehaltes werden unter Rühren die folgenden Materialien zugefügt: 0,3 ml 25prozentiges Humanserumalbumin (75 mg HSA), 1,5 ml Hydroxyäthylendiphosphonat-(HEDP)-lösung (eine wässrige Lösung welche 0,21 g HEDP in 30 ml enthält), 0,25 ml Zinn (II)-chloridlösung [4,2 g Zinn(lI)-chloriddihydrat + 3 ml 6,15-normale Chlorwasserstoffsäure, verdünnt auf 100 ml mit Wasser eines niedrigen Sauerstoffgehaltes], 0,3 ml 1prozentige Pluron-F-68-Lösung und 5,42 ml 0,05-normale Natriumhydro xydlösung. Der pH-Wert der Lösung war 5,90.
Aliquote dieser Ausgangsmateriallösung vor der Aggregierung werden durch eine Sterilisiermembran mit 0,22 jtm Porengrösse filtriert, und man erhitzt während 31/2 Minuten in einem 99"C heissen Wasserbad, um eine milchige Suspension der Mikroaggregate herzustellen.
Formulierung mit Stabilisierlösung (der pH-Wert der Formulierung ist 8) und Einfüllen in Serumampullen, bzw. Fläschchen, und Markieren mit 5 ml 99"Tc-Natriumpertechnetat, wobei alle Operationen gemäss Beispiel 3 ausgeführt werden, ergab die folgenden Resultate: Aktivitätsverteilung in Abhängigkeit der Teilchengrösse: Teilchen grösse Prozent vom Total L 3 m 8,9 1-3ym 2,1
0,2-1 m 61,2 < 0,2 Zm 27,8 Biologische Verteilung in Mäusen 15 Minuten nach intravenöser Verabreichung:
:
Prozent der injizierten
Organ Dosis pro Organ
Leber 92,8
Milz 2,6
Lungen 0,4
Knochengerüst 5,1
Nieren 0,5
Magen-Darm-Trakt 0,5
Rest 2,3
Das erfindungsgemässe lyophilisierte Zinn(II)-mikroaggregierte Albumin zeigte eine sehr hohe Lagerlebenszeit von mindestens einem Jahr bei üblichen Zimmertemperaturen (wenn man das Material vor Licht geschützt aufbewahrt). Das Material ist ebenso mindestens während 24 Stunden stabil, nachdem man es radioaktiv markiert hat, wenn man das Material unter Kühlung aufbewahrt zum Schutz des Patienten, weil es keine Konservierungsmittel enthält, obwohl es bevorzugt ist, das Präparat innerhalb von 8 Stunden nach der Markierung zu verwenden.
99mTc-markierte biologisch abbaubare Zinn(II)-Makroaggregate (Teilchengrösse grösser als 5 m) von Humanserumalbumin, das bei oder in der Nähe des isoelektrischen Punktes des Humanserumalbumins makroaggregiert wurde, wobei man Teilchen erhielt welche 0 oder nahezu 0 Ladung aufwiesen (dies wurde erreicht indem man die Aggregierung beim isoelektrischen pH-Wert von etwa 4,8-5,5 ausführte und eine relativ hohe lonenkonzentration anwandte), wurden bereits bisher handelsüblicherweise für die bildliche Darstellung der Lungen unter Ausnützung der Radioaktivität (der Szintigraphie) verwendet.
Diese Materialien sind ebenso in der Patentliteratur beschrieben. Siehe dazu beispielsweise die U.S. Patentschriften Nr.
3 987 157; Nr. 3 872 226 und Nr. 3 863 004. Jedoch sind derartige Mittel nicht geeignet als Darstellungsmittel für das RES, da diese grösseren Teilchen aus dem Blutstrom durch die Lungen entfernt werden bevor sie die Leber, die Milz und das Knochenmark erreichen. Siehe dazu auch die US-Patentschrift Nr.
4 024 233 und United States Pharmacopia XIX, Seite 488.
Eine RES-Abtast-Materialzusammenstellung von Zinn enthaltenden Tc-99m-markierten Minimikrokügelchen (durchschnittlicher Durchmesser von 1 m und 98 Gew.-% mit einem
Durchmesser von weniger als 3 zm) an Humanserumalbumin, welches bei einem pH-Wert von 2,4 durch Anwendung eines
Glycin-Chlorwasserstoffsäure-Puffers, der in einer Konzentra tion von 3 Mol vorliegt, gehalten wird, wird im Journal of Nuc lear Medicine, Band 16, Nr. 6, 1975, Seite 543, geoffenbart. Es wird angenommen, dass diese Minimikrokügelchen aus einer flüssigen Humanserumalbuminlösung in einem Ölbad ausgefällt werden. Es ist nicht bekannt zu welchem Zeitpunkt das Zinn zugegeben wird. Siehe dazu ebenso die U.S. Patentschrift Nr.
3 3 937 668, und Int. J. of App. Rad. and Isotopes, 1970, Band
21, Seiten 155-167.
Es wurde ebenso in der Literatur vorgeschlagen die radio jodierten und 99mTc-markierten Makroaggregate von Humanse rumalbumin auf Teilchen mit Mikrogrösse zu zerkleinern, in dem man Ultraschallzerkleinerung anwendet. (J.N.M. Band 13,
1972, Seiten 260-65; J.N.M. Abstract, Band 12, Nr. 6, 1971,
Seite 373; J.N.M. Abstract, Band 10, Nr. 6, Seiten 453-4; Int.
J. of Applied Radiation and Isotopes, 1975, Band 26, Seiten
31-32). In diesen Literaturzitaten wird jedoch nirgends die An wesenheit eines reduzierenden Metalls während der Aggregie rung oder ein Ligand für dieses Metall erwähnt, und derartige
Produkte erfordern einen Zerkleinerungsschritt.
Ebenso wird im Journal of Nuclear Medicine (J.N.M.),
Band 12, Nr. 6, in einer Veröffentlichung beginnend auf der ;Seite 372 und endend auf der Seite 373 von Tc-99m und 131J- markierten Mikroaggregaten von Albumin berichtet, aber es wird keinerlei Erwähnung von der Anwesenheit irgendeines reduzierenden Metalls und eines Liganden dafür gemacht, und es wird nicht erläutert wie die Mikroaggregate hergestellt wer den.
Im J.N.M., Band 10, Nr. 6, 1969, Seite 454, wird ein Ver fahren zur Markierung von Makro- und Mikroaggregaten von
Serumalbumin beschrieben, indem man Eisen(III)-ionen und
Ascorbinsäure anwendet, wobei jedoch nicht geoffenbart wird, wie die Mikroaggregate gebildet werden und wobei weder ein reduzierenden Metall noch ein Ligand dafür erwähnt wird.
Im J.N.M., Band 9, Nr. 9, 1968, Seiten 482-485, wird ein
Verfahren zur Herstellung von Mikroaggregaten von Humanse rumalbumin beschrieben, und eine anschliessende Markierung mit Radiojod. Es wird dabei kein reduzierendes Metall und kein Ligand dafür erwähnt.
Im J.N.M., Band 11, Nr. 6, 1970, Seite 387, wird ein Ver fahren zur Herstellung von Tc-99m-markierten Mikroaggrega ten von Albumin beschrieben, welche Teilchengrössen von etwa 0,5 , < m aufweisen, und wobei die Mikroaggregate augenschein lich aus Tc-99m-markiertem, unaggregiertem Albumin herge stellt werden [das unaggregierte Albumin wurde mit Tc-99m markiert, indem man Eisen(III)-chlorid, Ascorbinsäure und
Acetatpuffer anwandte], und es wird keinerlei Erwähnung von der Anwesenheit eines reduzierenden Metalls und eines Ligan den dafür gemacht.
Im J.N.M., Band 12, Nr. 6, 1971, Seiten 467-468, wird eine kolloidale Zinn(II)-hydroxyd-suspension, die mit Tc-99m mar kiert ist, beschrieben, die zur Darstellung der Leber verwendet wird, es wird jedoch keinerlei Erwähnung von Humanserumal bumin oder einem stabilisierenden Liganden in der dort be schriebenen Formulierung gemacht.
Im J.N.M., Band 11, Nr. 10, Seiten 580-585, 1970, wird die
Mikroaggregierung von HSA beschrieben, und die anschliessen de Markierung mit Technetium das zuerst mit Eisen(III)-chlorid und Ascorbinsäure reduziert wurde. Es findet sich keinerlei Er wähnung der Anwesenheit eines reduzierenden Metalls oder ei nes Liganden dafür während der Aggregierung.
In den folgenden Literaturzitaten werden jodierte Humanse rumalbuminaggregate beschrieben: Br. J. Exp. Path, Band 38,
Seiten 35-48;
Report of Scientific Exhibit mit dem Titel Kolloidale Radio albuminaggregate für das Organ-Scanning vom 10. jährlichen Treffen der nuklearmedizinischen Gesellschaft in Montreal, Kanada, vom 26. - 29. Juni 1963; J.N.M., Band 5, Seiten 259-275, 1964; J. Lab. & Clin. Med., Band 51, Nr. 2, Seiten 230-239, 1958; Dynamische klinische Studien mit Radioisotopen , USAEC Abteilung für technische Informationen, Seiten 285-317 vom Juni 1964; Invest. Radiol. Band 1, 1966, Seiten 295-300; Der Bericht von G. V.
Taplan et al, mit dem Titel Herstellung von kolloidalen Suspensionen von Humanserumalbumin J131 für die Ermittlung des Leberblutflusses und der Funktion des Reticulo-endothelial-Systems beim Menschen , UCLA Report Nr. 481 Biologie und Medizin, vom 23. Juni 1961 der Universität von Kalifornien der medizinischen Abteilung Los Angeles.
In der U.S. Patentschrift Nr. 4 054 645 wird die Verwendung von Zinn(II)-fluorid-reduktionsmittel zusammen mit einer Anzahl verschiedener Ziel suchenden Liganden beschrieben, wovon einer Albumin ist, aber es wird nichts über eine Mikroaggregierung des Albumins in Gegenwart eines Zinn(II)-salzes und eines zusätzlichen nicht Ziel suchenden Liganden geschrieben.
In der U.S. Patentschrift Nr. 4 057 615 wird die Anwendung eines reduzierenden Komplexmittels zusammen mit verschiedenen Ziel suchenden Excipienten (ein unglücklich gewählter Ausdruck für die Ziel suchenden Liganden) beschrieben, wobei die Bindungskonstante des reduzierenden Anions für das Technetium geringer ist als diejenige des Excipienten. Es wird nichts über eine Mikroaggregierung in Gegenwart eines reduzierenden Metalls und eines nicht Ziel suchenden Liganden geschrieben.
Obwohl manche der oben genannten Literaturstellen sich auf Tc-99m-markierte Mikroaggregate von Albumin als Darstellungsmittel für radioaktive Abbildung (Szintigraphie) beziehen, ist kein derartiges Mittel gegenwärtig auf dem Markt für die Darstellung des RES, und kolloidaler Schwefel ist noch immer das hauptsächliche Mittel zur RES-Darstellung auf dem Markt, obwohl es seine bekannten Nachteile aufweist, und obwohl Tc-99m-markierte Makroaggregate hauptsächlich bedeutend wurden bei der Darstellung der Lunge.
The present invention relates to a composition
for labeling with Tc-99m to produce an optical representation, using radioactivity.
Furthermore, the present invention relates to a method for producing such compositions and furthermore means for the representation of an optical image, using radioactivity, which contain corresponding compositions labeled with Tc-99m.
Furthermore, the present invention relates to a method for producing such an agent, in which the corresponding composition according to the invention is marked with Tc-99m.
Compositions according to the invention, as soon as they are labeled with Tc-99m, are agents for radioactive imaging of the reticulo-endothelial system (RES) of vertebrates, in particular primates. They are used in particular for radioactive imaging of the liver, spleen and bone marrow.
Such means are sometimes referred to as radioactive RES imaging agents.
In the past, the common commercial RES imaging agent was a radio-colloid (particle size of 0.001-0.5 μm) of gold, which was stabilized with gelatin and which was removed from the RES after injection into the bloodstream and accumulated in it, whereby a latent radioactive image was obtained which could then be converted into a visible image using suitable instruments.
This imaging agent was later replaced by 99mTc-labeled sulfur colloid stabilized with gelatin, with a majority of this material having a particle size of less than 0.1-1 am, and which is still the most widely used radioactive RES Notational means, although it has disadvantages, such as (a) the requirement for a relatively large number of components, (b) the requirement for cooking and neutralization for marking by the user at the application site, and (c) the property that the material is not biodegradable.
Most sulfur colloid RES imaging agents on the market result in crisp, clear, simultaneous imaging of the liver and spleen.
A 99mTc-labeled tin (II) hydroxide colloid was also sold as a RES imaging agent, but it showed the disadvantage that it is difficult to prevent the growth of the colloidal particles after the labeling without the user adding stabilizers to the site, which in addition leads to the fact that they are not satisfactory for the RES representation. d. H. that they are not stable.
Another RES imaging agent that has been marketed in small quantities is a 99mTc-labeled tin (II) phytate complex, which is believed to be converted to an insoluble colloid by calcium in the bloodstream, from which it is then processed by the RES Will get removed. With this imaging medium, however, it was difficult to achieve clinically acceptable clear, sharp images of the spleen at the same time as the normal healthy liver. Accordingly, the use of this agent has not been very widespread.
The aim of the present invention was to provide a new, highly stable, biodegradable RES imaging agent for labeling with Tc-99m. This agent is said to be easily markable with Tc-99m at the application site by mixing it with a material supplying Tc-99m, for example a Tc-99m pertechnetate solution, without any additional work steps.
Furthermore, the product in a marked form is said to give clinically acceptable, clear, sharp images of both the liver and the spleen at the same time.
Surprisingly, it was found that the desired goals can be achieved by a composition that contains micro-aggregates of albumin and a reducing metal.
The present invention therefore relates to a composition for labeling with Tc-99m for producing an optical representation using radioactivity, which is characterized in that it contains microaggregates of albumin and a reducing metal.
The composition according to the invention preferably additionally contains a stabilizing ligand for the reducing metal. This ligand is preferably selected from the group consisting of phosphonates, phosphates, aminocarboxylates, polyhydroxycarboxylates and polycarboxylates.
A preferred such ligand is a diphosphonate, preferably a methylene diphosphonate, hydroxyethylene diphosphonate or amino ether hand diphosphonate.
The reducing metal contained in the compositions according to the invention is preferably a divalent tin, tin (II) chloride, tin (II) iodide, tin (II) fluoride or tin (II) bromide being particularly preferred.
In the compositions according to the invention, at least 90% of the microaggregates mentioned should expediently have a particle size of not more than 5 m.
It is particularly preferred if at least 40% of the said microaggregates have a particle size between 0.2 and 3 µm. Furthermore, it is particularly preferred if no more than 50% of the microaggregates mentioned have a particle size of less than 0.2 μm.
Human albumin is preferably used as albumin in the compositions according to the invention. A particularly preferred composition according to the invention contains a human serum albumin as the albumin, divalent tin as the reducing metal and it is further stabilized with undenatured human serum albumin and a buffer.
Another object of the present invention is a method for producing the compositions according to the invention, which is characterized in that an albumin is micro-aggregated in the presence of a reducing metal.
Furthermore, the present invention relates to a means for displaying an optical image using radioactivity, which is characterized in that it contains microaggregates of albumin and a reducing metal according to the invention, these microaggregates being marked with Tc-99m.
Another object of the present invention is a method for producing this agent, which is characterized in that a composition according to the invention is marked with Tc-99m.
According to a particularly preferred embodiment of this method, a composition kept closed in a sterile, pyrogen-free ampoule in a dry form is marked by labeling it with Tc-99m immediately before use, by mixing it with a radioactive pertechnetate solution after opening the ampoule.
In the preparation of the agent according to the invention, the albumin is preferably micro-aggregated under anaerobic conditions. It is particularly preferred to micro-aggregate human serum albumin, ie human serum albumin (HSA), in the presence of a reducing metal in ionic, physical or chemical complex form (hereinafter simply referred to as reducing metal). This gives a product which contains microaggregated colloidal particles, the albumin and the reducing metal, and which can be labeled directly with Tc-99m by mixing a radioactive pertechnetate solution.
However, it is also possible to freeze-dry this product and it can then be sealed and stored in a sterile pyrogen-free ampoule, then labeled with Tc-99m at the point of use when required, for example by labeling it with a radioactive pertechnetate solution . In the following, the Tc-99m used for marking is also referred to as 99 "'Tc.
In the preparation of the agents according to the invention, the microaggregation is advantageously carried out in the presence of an additional ligand, preferably in a water-soluble form, in order to stabilize the reducing metal against precipitation before the aggregation. Preferred ligands are the diphosphonates and preferably methylene diphosphonate, hydroxyethylene diphosphonate and amino ether hand diphosphonate; Diphosphates such as polyphosphates, for example pyrophosphates; Diaminocarboxylates such as diethylenetriaminepentaacetate salts; Polyhydroxycarboxylates such as glucoheptonate; and polycarboxylates such as the salts of carboxymethyl cellulose. So far, the diphosphonates have been found to be the most preferred.
However, other known physiologically and toxicologically compatible ligands are also suitable for the respective reducing metal. It has been found that the anion of certain reducing metal salts, such as tin (II) fluoride, itself has a sufficiently high stability constant to exclude the need for an additional ligand. In such cases, the fluoride anion itself acts as a stabilizing ligand for the tin (II) ion.
In general, the radioactivity distribution over the particle size of the microaggregated colloidal particles is as follows: At least 90 to 95 μm, and preferably at least 980 μm, the radioactivity adheres to particles which have a particle size of no more than 5 μm. For a good presentation of the spleen at the same time as an illustration of the liver, no more than 40 to 60%, and preferably no more than 40 to 50%, and particularly preferably no more than 10 to 40%, of the radioactivity should adhere to particles which have a particle size of less have less than 0.1, and preferably less than 0.2 ym.
It is particularly preferred for a good simultaneous presentation of the spleen and liver that at least 40 to 60%, and particularly preferably more than 500% (the main part) of the activity adheres to particles which are between 0.2 and 5, and in particular between 0.2 and are 3 cm tall.
Good simultaneous representations of the spleen and liver were achieved when between 60 and 1000 appeared in the activity of particles which had a particle size of 0.2 to 3 μm when it was ensured that more than 90 to 98% of the activity in particles was present, that were not larger than 5 ym. Good images of the liver with poorer splenic presentation were obtained when only 5 to 20% of the activity was present on microparticles with a particle size of 0.2 to 5 cm, if it was ensured that more than 90 to 98% of the particles were not larger than 5 µm and the remainder of the activity was mainly bound to particles having a particle size of less than 0.2 nm.
The radioactivity distribution over the particle size is determined by passing a known aliquot of a dilute suspension of the 99nTc-labeled microaggregated particles through a series of polycarbonate filter membranes [e.g. membranes sold under the name NUCLEPORE by Nuclepore Corporation, and in NUCLEPORE filter containers according to Manufacturer's instructions are built in and connected in series, resulting in a sequence of decreasing pore size (sometimes referred to as serial filtration technique) j
and then the radioactivity of the filtered particles in each filter housing and in the final filtrate is determined by conventional measuring methods and the respective amount of activity is divided by the total radioactivity and multiplied by 100 to obtain the percentage. The aliquot is diluted sufficiently to prevent the pores of the filters from being blocked or to keep them to a minimum, which would reduce their effective size and, accordingly, give incorrect measurement results.
The preferred technique for diluting the aliquot is described below. All particle sizes given here have been determined using this technique.
Although good liver imaging is achieved when all particles appear to have a particle size of less than 0.2 pm, the simultaneous imaging of the spleen is generally poor.
Accordingly, it is preferred to obtain a particle size distribution in which as many particles as possible fall in a size range between 0.1 or 0.2 and 5 μm and preferably between 0.2 and 3 pm.
Good simultaneous spleen and liver imaging results, which are obtained with the following particle size distribution, are explained in more detail: not more than 4 to 10% larger than 5 pm, not more than 15% larger than 3 pm, at least 20% above 1 μm (mostly 1 to 3 ym), at least 80 to 90% over 0.2 ym and preferably at least 40 to 50% between 0.4 and 3.0 ym, with no more than 5 to 10% and preferably no more than 5 to 8% mobile components (relatively low molecular weight soluble fractions) due to thin layer chromatography with saline as the eluent.
From less than 15 minutes to more than 60 minutes after injection, excellent visualization of both the spleen and the liver is achieved with an insignificant, undesirable distribution with optimal absorption by the cell tissue. The distribution in the bone marrow, and especially in the spine and in the pelvic area, can be represented by means of longer exposure times, which are optimal for the liver and spleen, as is the case with colloidal sulfur RES imaging agents.
A solution of the albumin and reducing metal, preferably with an additional ligand in the solution, is heated at a controlled pH and the temperature is selected so that the microaggregates form.
The above-mentioned particle size distribution is primarily achieved by precisely regulating the concentrations of the components, the pH and the heating conditions, as will be explained in more detail below.
The reducing metal is bound to the albumin (it is believed that a physical or chemical complex is formed) which enhances the selective binding effectiveness of the Tc-99m to the denatured microaggregated albumin when the microaggregated albumin particles are subsequently labeled, resulting in improved uptake through the RES and a clear representation of the RES.
The function of the additional ligand is to increase the amount of reducing metal which can be stabilized against hydrolysis (formation of insoluble hydroxides or hydrated oxides of the reducing metal) prior to microaggregation. During the denaturation of the albumin, which is done by heat, it is believed that conformational changes in the albumine provide reactive groups that increase the affinity of the albumine for the reducing metal and, accordingly, significantly larger amounts of the reducing metal are bound to and within the microaggregates than this would be achieved in the absence of the additional ligand or compared to the reaction of the reducing metal with the albumin after microaggregation.
In any case, the additional ligand contributes significantly to the excellent visualization of the RES using radioactivity. However, as mentioned earlier, if the anion of the water-soluble reducing metal salt has a sufficiently high stability constant to stabilize the reducing agent against hydrolysis, as is the case with the fluoride, the need for an additional ligand is eliminated. In such cases, the anion is effectively a stabilizing ligand for the reducing metal.
In cases where the micro-aggregates (uAA) are to be freeze-dried for storage before they are used, they are preferably mixed with a stabilizing solution prior to freeze-drying, namely of soluble undenatured (unaggregated) albumin (HSA) around the dispersion (recovery the dispersion) of the solids of the freeze-dried particles in the pertechnetate solution if the latter is added to mark the microaggregates with Tc-99m in order to make them ready for use. In a preferred embodiment, the stabilizer solution also contains a non-ionic surfactant (preferably Pluronic F-68) to further aid in the dispersion of the solid freeze-dried particles in the pertechnetate solution.
Buffers, such as sodium phosphate, can also be added (preferably together with unaggregated human serum albumin and surfactant as part of the stabilizing solution) to adjust a pH that is sufficiently far from the isoelectric point of the particles to counter the redispersed formulation Protect particle growth when the pertechnetate solution is then added to the freeze-dried particles to disperse the 99mTc-labeled albumin-Sn + + microaggregates in saline or pharmaceutically and pharmacologically acceptable carrier material to inject them into the patient.
Accordingly, it is advantageous to add such a buffered stabilizer solution in connection with the labeling, even if the product is to be used without intermediate freeze-drying.
The most preferred ligands include the diphosphonates, and of these, methylene diphosphonate (MDP) and hydroxyethylene diphosphonate (HEDP) are preferred, but also any diphosphonates described in U.S. Patent No. 4 032 625 and in German Offenlegungsschrift No. 2,424,296 can be used.
Of the phosphates, the pyrophosphates (preferably sodium pyrophosphate) are preferred. However, orthophosphate, linear polyphosphate and organic phosphates such as inositol hexaphosphate can also be used.
Among the aminocarboxylates that can be used, ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) salts and diethylene triamine penta acetic acid (DTPA) salts are preferred.
Although polyhydroxycarboxylates and polycarboxylates can serve as weak ligands, they are not as suitable as those mentioned above.
Stabilizing ligands that can be used are limited only by the ability to sufficiently stabilize the reducing metal against hydrolysis or are restricted due to toxicological considerations.
The most preferred albumin for use in humans is human serum albumin, although albumins of other types can also be used for diagnostic applications for the particular species.
Although the tin (II) ion (Sn + +) is preferred as the reducing metal, others such as the iron (II) ion (Fe + +) and the monovalent copper ion (Cu +) can also be used, but without similarly good results be achieved. All of these reducing metals can exist in at least two cationic redox states, of which the lower charged valence form is used for the reduction of the pertechnetate in the subsequent labeling step.
To carry out the microaggregation, a solution of a mixture of the albumin, the ligand and the reducing metal is rapidly heated to a temperature between 70 and 100 ° C., and preferably to a temperature between 80 and 100 ° C., and particularly preferably between 85 and 99 ° C. . Optimal results are obtained with temperatures between 90 and 99 "C. Higher temperatures can also be used if it is ensured that the pressure is increased sufficiently to prevent the reaction mass from boiling substantially. The heating time can range from seconds to hours, depending on the temperature and the type of heating.
For example, heating by microwave energy or by high frequency heating or by induction heating takes only seconds, while heating by immersion in boiling water or by passing over heating coils takes minutes. The maximum heating time is determined by the fact that continuous heating after the formation of the microaggregates (pAA) can increase the particle size of the HSA-reducing metal complex by more than 5 pm and / or can cause the production of soluble decomposition products. Cooking also seems to increase the particle size. The minimum heating time and temperature are determined by the time and temperature necessary to obtain sufficient aggregation and to achieve a microparticle size distribution as stated above.
The maximum heating time and temperature are determined by the time and temperature after which too many particles become larger than 5 cm, or after decomposition occurs. Using these guidelines, optimal heating temperatures and times can easily be determined by routine test procedures on any given compositions for any given type of heating, thereby obtaining the desired particle size distribution. Excellent results have been obtained with heating times of 3 to 10 minutes at heating temperatures of 90 to 99 ° C when heating is carried out in a hot water bath, and acceptable results are obtained when heating times of 2 to 5 minutes are applied using such a bath and the temperatures mentioned.
The albumin is believed to be denatured during this heating step, i. H. that the denaturation occurs simultaneously with the micro-aggregation.
The microaggregation by heating is carried out at a pH sufficiently distant from the isoelectric point of the albumin (at which the charge of the molecules is 0 or almost 0) to obtain the particle size distribution mentioned above. In this regard, commercial HSA consists of a mixture of albumins with a distribution of isoelectric points. Accordingly, the isoelectric points of the mixture can vary from batch to batch. Values in the range of pH 4.5 to 5.5 have been reported. However, the presence of charged compounds that tend to associate with the albumin can significantly shift the apparent isoelectric point.
They are believed to produce this effect either by imparting their own charge to the albumin or by neutralizing certain positively or negatively charged groups of this protein.
The closer the pH is to the isoelectric point, the larger the aggregate particles. Accordingly, macro-aggregation or uncontrolled agglomeration occurs at the pH of the isoelectric point. When the pH is removed from the isoelectric pH, both towards the acidic side and towards the alkaline side, the particles become smaller and smaller. The optimal pH in the present invention varies according to the additional ligand that is used.
It has been found that the desired particle size distribution of the micro aggregates can be achieved in a pH range, which in turn depends on the additional ligand used, and the desired ligand is the one which gives the desired particle size over the broadest pH range , and, accordingly, results in the least sensitive and most reproducible systems. It has also been found that increasing ionic strength, i. H. for example by adding a neutral salt such as table salt (NaCl) during the aggregation, which shifts the pH at which the desired particle size distribution is obtained, further away from the isoelectric point.
In addition to the additional ligand and the reducing salt, the only other materials which bring about the ionic strength of the not yet aggregated bulk solution (mixture which is subjected to the aggregation), the acid, for example HCl, or the base, for example NaOH, are preferably used around the adjust pH. However, other materials that influence the ionic strength can also be present.
Although the desired particle size distributions can be achieved in a pH range on the acidic side at a distance from the pH of the isoelectric point as well as on the alkaline side, the latter case is preferred because microaggregation on the acidic side has other difficulties offers.
On the acid side of the pH range relative to the isoelectric point, the pH range can range from 3.5 to 4.5, and on the alkaline side relative to the isoelectric point the pH range can range from about 5.4 to 9.5, and preferably between 5.5 and 7.0 and particularly preferably between 5.6 and 6.5 depending on the additional ligand used, the isoelectric point of the particular albumin used and the concentration of the components . However, if the apparent isoelectric point has been reduced to values below 4.5 by the presence of a charged compound, as stated above, the optimal pH range can be as low as 4.5.
Under conditions examined with MDP, successful results were obtained in a pH range of 5.4 to 6.6 and preferably in a pH range of 5.6 to 6.5, and optimally reproducible results were in a pH range obtained from 5.7 to 6.35. Under conditions studied with pyrophosphate, optimal results were obtained in a pH range from 5.9 to 6.1.
The optimum pH range for any particular ligand and at any particular concentration can be easily and routinely determined by aggregation at various pH values that are distant from the isoelectric point until the desired particle size distribution is achieved.
The reducing metal, for example tin (II) chloride, can be added to the albumin and ligand solution in the form of a solid or in the form of a solution.
The maximum amount of reducing metal is that above which precipitation occurs before the albumin is aggregated. The minimum amount is that necessary to reduce Tc-99m sufficiently and bind to the aggregated albumin to achieve clinically acceptable RES uptake. These amounts can easily be determined for special admixtures by performing routine experiments.
Very small amounts of reducing metal are effective for the corresponding reduction and binding of the Tc-99m to the aggregated albumin, i.e. H. less than an 8: 1 molar ratio of tin (II) to albumin, but because it is easily oxidized, compositions containing the minimum amount required may lose their effectiveness for a period of time after storage, manipulation or use. Accordingly, an excess is used compared to the minimum amount required to bind the Tc-99m. As the proportion of reducing metal is increased, a point will appear for any combination of starting materials where the binding effectiveness of the Tc-99m to the albumin will not increase either immediately or as a function of time up to 24 hours or more after marking.
Taking into account the above considerations, the molecular weight ratio of reducing metal, in particular So ++, to albumin can vary within a very wide range, i. H. for example from 8: 1 to 80 1, and preferably from 30 1 to 50: 1. It is preferred that the molecular weight ratio of Sn ++ to albumin not exceed 80: 1.
Excellent results have been obtained with Sn ++ to albumin molar ratios of about 30 to 1 to 50 to 1.
The minimum amount of additional ligand that is necessary is that sufficient to prevent the formation of any substantial amounts of insoluble hydroxides or oxide hydrates of the reducing metal for a given composition by binding the reducing metal. The maximum amount is that above which there is substantial competition between the albumin and the additional ligand for the Tc-99m when microaggregates are mixed with the pertechnetate.
Such ligands, if present in excess of the amount necessary to stabilize the reducing material, especially those with high affinity for technetium, can react with the Tc-99m, forming complexes which have a high affinity for bone, Show kidneys or other undesirable tissues, thereby increasing the desired uptake at the expense of RES uptake, and causing the effectiveness of the microaggregates as RES imaging agents to decrease. Accordingly, the amount of ligand should not constitute a substantial excess over the amount required to stabilize the reducing material.
The minimum and maximum amounts of ligand can easily be determined by routine testing for insoluble hydroxides prior to aggregation, and by observing the effect on uptake by bones, kidneys, urine output and other undesirable distributions of the aggregated product. In addition, with increasing ligand concentration, the pH range in which the desired particle size distributions are achieved during aggregation is narrower. Accordingly, for optimal results, it is desirable to use slightly more than the minimal amount of ligand necessary to keep the reducing metal in solution before aggregation.
The concentration of additional ligand and the maximum and minimum amount thereof also depends on the type of ligand used, as some ligands, such as MDP, have greater binding ability (higher stability constant) and lower ionic strength than others. A ligand which ensures the broadest pH range in which the desired particle size distribution is achieved is the most preferred. The diphosphates, and in particular MDP and HEDP, fall into this category.
The maximum and minimum amounts of ligand also depend on the particular pH at which the aggregation is carried out. The optimal amount of additional ligand is too small to cause a significant buffering effect or to change the ratio of target activity to non-target activity, although the ligand may be one known to seek non-target tissue. It is interesting to note that the addition of a ligand known to seek non-target tissue increases the target / non-target ratio.
Since it is the complex-forming portion of the ligand that binds the reducing metal, the concentration of the ligand is best expressed as the molecular weight ratio of such a function to the reducing metal ion, e.g. So ++. This ratio strongly depends on the choice of the ligand. For a ligand such as methylene diphosphonate which has a rather high stability constant, such a ratio is preferably between 0.6: 1 and 1.2: 1, and for a ligand such as glucoheptonate which has a rather low stability constant about 2 '/ 2 times this ratio is preferred.
Using MDP and stannous chloride and a pH range of 5.4 to 6.6, successful results are obtained with a weight ratio of ligand to SnCl2 2H2O of 0.5: 1 to 1: 1. If the pH is increased beyond this range, the concentration of MDP can be increased to obtain the same biodistribution.
It is clear from the above that there is a functional relationship between the selection and concentration of a ligand and the optimal pH range for obtaining particles of the appropriate size ranges in the aggregation.
In a preferred embodiment of the present invention, the aggregation is carried out in the presence of a water-soluble pharmacologically and toxicologically acceptable surface-active agent of the same type, which is also preferably introduced into the stabilizing solution. Although good results were obtained without the presence of a surfactant during the aggregation, it is preferred to use this agent as an additional safety factor, since it is believed that its use increases the reproducibility and stability of the aggregates with regard to the particle size.
A variety of surfactants are suitable for use in the aggregation step and in the stabilizing solution. Preferably, the surface active materials are non-ionic surface active materials and solids at room temperature. The suitable surfactant materials are those which are non-toxic to the blood components or tissues and which preferably have a hydrophile / lipophile balance (HLB) from about 14 to about 40, and preferably from about 27 to 30.5.
When the surfactant is used in the aggregation step, only very small amounts are usually used. Preferably, the surfactant is present in the unaggregated mass, if used at all, in an amount from about 0.1% to about 10% of the albumin in such unaggregated masses, and more preferably in an amount of 2- 8 wt. -%.
The surfactant dissolved in the stabilizing solution as mentioned above facilitates the rapid dispersion (restoration of the dispersion) of the freeze-dried albumin reducing aggregates in the pertechnetate solution when the latter solution is added to be administered to the patient. The amount of surfactant used in the stabilizing solution is usually greater than the amount used in the aggregation step.
Preferably, the surfactant is present in the stabilizing solution in an amount of about 0.2 to 20%, and preferably in an amount of 1 to 10%, of the lyophilized composition (on a solid basis).
Suitable surfactants for use during aggregation and in the stabilizing solution are Polysorbate 80, U. S. P. , higher molecular weight polyethylene glycols such as Carbowaxe from Union Carbide, and molecular combinations of polyoxyethylene and polyoxypropylene (ethylene oxide-propylene oxide block copolymers) such as Pluronics from BASF Wyandotte.
See also McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1973), pages 213-217, where many commercially available surfactants with HLB numbers between 14 and 40 are listed. Most preferred are the Pluronics, and especially Pluronic-F-68, which has a molecular weight of approximately 8350 and an HLB of 29.0 and is solid at room temperature.
The volume ratio of non-aggregated albumin stabilizer solution (containing surface active agents and buffering agents if they are used) to the aggregated human serum albumin (aggregated mass) can vary within a wide range. Excellent results have been obtained with ratios of 1: 1 to 1: 3, with a ratio of I 2 being preferred.
Based on the final lyophilized solid composition, the ratio of soluble albumin to aggregated albumin is, for example, in the range from about 3 1 to 20 1, and in particular in the range from 5 1 to 15 1.
The buffer compound is added to the aggregated mass either as part of the stabilizing solution or, if such a solution is not used, as such, in order to maintain the pH in a range sufficiently far from the isoelectric point to the composition to stabilize in such a way that the particles do not grow when mixed by lyophilization or after labeling. A suitable pH range is between 7 and 9, and preferably at 8 + 0.5, due to the reasons mentioned above. Any pharmacologically and toxicologically acceptable tolerable buffering agent that does not substantially compete with the Tc-99m can be used.
Suitable buffers are mixtures of acids and salts of weak acids, such as the suitable sodium salts of orthophosphoric acid.
In some cases it may be desirable to add an electrolyte to the mass prior to aggregation, such as soluble alkali or alkaline earth metal salts, such as sodium chloride, to adjust the ionic strength.
The maximum amount of Tc-99m (pertechnetate) added to the albumin aggregates relative to the amount of denatured and aggregated HSA is given by the fact that any substantial excess beyond the amount bound to the microaggregates has no beneficial effect , and this excess should be avoided for reasons unrelated to the present invention, namely that the amount of radioactive material to be injected into the body should be kept to the minimum required. However, a slight excess can be used relative to the amount bound to the microaggregates. Based on primate studies, up to 10% free pertechnetate is unlikely to adversely affect clinical utility.
The minimum amount is determined by the amount necessary to produce clinically acceptable representations. The molecular weight ratio of Tc-99m to aggregated HSA (based on the molecular weight of the HSA before aggregation) can be 0.25 or more.
The radioactive dosage of the Tc-99m-labeled microaggregates according to the invention can be in the range from 0.01 to 50 mCi (millicuria) per patient and is advantageously in the range from 1 to 8 mCi.
The volume of the pertechnetate solution which is added to the final mass as such or after freeze-drying is preferably in the range from 1 to 10, preferably 1 to 8 ml, containing 1 to 300 or more, and preferably 5 to 50 mCi per milligram of denatured albumin. The pertechnetate solution is usually the eluate from a common Tc-99m generator, but it does not have to be the case.
Better binding of the reducing metal to the HSA and more homogeneous microaggregates are achieved with less oxidation of the reducing metal by mixing the reducing metal and additional ligand with the HSA before aggregation, which results in an improved RES display. It is believed that more intimate contact between the HSA and the reducing metal is achieved because the HSA opens during heating and the newly exposed binding sites react with the reducing metal before and during aggregation, and the reducing metal becomes one intimate part of the micro-aggregate particles.
In any case, as has already been found, it has been found that better results are obtained when the HSA is aggregated in the presence of the reducing metal.
However, the presence of the reducing metal during the aggregation presents problems that do not occur when the human serum albumin is aggregated without the presence of the reducing metal, and that are overcome by the presence of a ligand during the aggregation, pH adjustment, and heating conditions during aggregation and by maintaining anaerobic conditions throughout the process.
One such problem is achieving a desired particle size distribution, another is binding the required amount of reducing metal to the denatured albumin, and another problem is preventing the formation of insoluble hydroxides or oxide hydrates of the reducing metal.
The water or other pharmaceutically acceptable carrier used to prepare the various solutions and in which the microaggregation occurs is preferably pyrogen-free distilled water which has been treated to reduce the oxygen content therein.
Likewise, preferably all steps of the method according to the invention are carried out under anaerobic conditions, i. H. in the absence of oxygen, such as in a nitrogen atmosphere.
In the preferred embodiment, the mixture of the stabilizer solution and the denatured HSA-reducing metal microaggregates which contain the ligand, if one is used, are freeze-dried in a conventional manner, in sterile pyrogen-free containers or ampoules which are sealed, and in the form of a user substitute which can be used at the application site by adding a prescribed amount of radioactive pertechnetate to the ampoule.
With regard to the technique for determining the radioactivity distribution in the micro-aggregate depending on the particle size, a suitable technique has been used to dilute aliquots of Tc-99m-labeled micro-aggregates which are to pass through filters arranged in series by going to the labeled ones Microaggregates, d. H. Add a dilution amount of stabilizer solution in a volume ratio of 9 parts of diluted stabilizer solution to 1 part of labeled aggregates to the product obtained by adding the pertechnetate solution to the lyophilized aggregates. This ratio can vary within a wide range as long as the finally diluted all-quot does not unsuitably clog the pores of the filter membranes.
The stabilizer solution is diluted by adding a sufficient amount of saline to dilute it to approximately the same solids concentration as the labeled product. The particle size distributions given here were obtained using this technique. However, other techniques can also be used.
Although the stabilizer solution is not required if the aggregated mass is used directly without freeze-drying (in such cases the buffer can be added as such), it is preferred to add the stabilizing solution with the buffer in any case in order to stabilize the particle size when adding the pertechnetate solution .
The process according to the invention can be carried out as a batch process, as a semi-continuous process or as a continuous process by using a relatively large ratio of heating surface to volume.
Preferably, the pre-aggregated mass is filtered through a sterile filter membrane, for example a 0.22 cm sterilizing membrane, before the aggregation is carried out, and the stabilizer solution is filtered through a sterilizing filter before it is added to the aggregated mass.
The final mass (the mixture of the aggregated mass and the stabilizer solution) is also filtered through a filter with a pore size of 3 μm in order to remove particles having a particle size of more than 3 μm, and then it is filled into ampoules and lyophilized.
The aggregated mass according to the invention has a milky to cloudy appearance, in accordance with the conditions used in the aggregation step. At lower pH values within the acceptable pH range, the mass can become opaque. If the pH is increased towards the middle of the pH range, the mass tends to be slightly milky with a slightly translucent appearance, and if the pH continues to increase in the given range, the mass will become cloudy.
The invention will now be explained in more detail with reference to some preferred embodiments, which are described in the following examples.
example 1
The following materials are added to 90 ml of water with low oxygen content with stirring and under anaerobic conditions: 0.6 ml of human serum albumin, 25% (25 g / 100 ml) low in salt, U. S. P. , the HSA weighing 0.15 g, 3 ml of sodium methylene diphosphonate (MDP) solution (0.5 g of methylene diphosphonic acid dissolved in 100 ml of 0.5 normal sodium hydroxide solution), 11.15 ml of 0.05 normal hydroxide solution for pH adjustment, 0.5 ml of tin (II) chloride solution [4.2 g of tin (II) chloride dihydrate + 1.5 ml of 12N hydrochloric acid diluted to 100 ml with water of low oxygen contentj, and 0.6 ml of a 1% aqueous solution Solution of Pluronic F-68, a non-ionic surfactant made from an ethylene oxide-propylene oxide block copolymer. The pH of the solution is 6.1.
Aliquots of this solution are filtered anaerobically through a sterilizing membrane with a pore size of 0.22 μm and the mixture is heated for 3.5 minutes in a water bath at a temperature of about 99 ° C., giving a milky suspension of the microaggregates of HSA and Sn ++.
5.7 g of disodium orthophosphate heptahydrate (buffer), 12 ml of 25 percent HSA and 0.33 g of Pluronic f-68 are added to about 50 ml of oxygen-poor water under anaerobic conditions. After the solids have been dissolved, the stabilizer solution is diluted to 100 ml with oxygen-poor water and filtered through a sterilizing filter under anaerobic conditions.
3.3 ml of the above sterile stabilizing solution are mixed under anaerobic conditions with 6.7 ml of the sterile milky suspension of microaggregates. 1 ml aliquots of these formulations, which had a pH of 8, were filled under aseptic conditions into sterile pyrogen-free serum ampoules of 10 ml capacity. The ampoules are usually freeze-dried (lyophilized) under aseptic conditions to remove the water.
In this way, solid microaggregates of the complex (chemically or physically) are obtained from denatured HSA and So + +. Each vial contained 1 mg microaggregated particles of complexed, denatured and aggregated HSA, 10 mg non-aggregated HSA, 0.1 mg SnCl2, 0.1 mg MDP, 10 mg phosphate buffer (calculated as disodium orthophosphate) and 1.14 mg Pluronic F-68 surfactant.
The ampoules are sealed and stored until used, and then the tin (II) micro-aggregated albumin contained is labeled with Tc-99m.
In order to produce the Tc-99m-labeled aggregates, 5 ml of fresh radioactive sodium pertechnetate solution (about 100 mCi although effective labeling with less than 1 mCi to more than 300 mCi is possible) were made from a sterile pyrogen-free eluate solution from a sterile NEN Tc-99m generator removed, which was in the form of a 0.9 percent saline solution, and this solution was added to the respective ampoule under aseptic conditions. The ampoule is then shaken to dissolve the soluble fractions and to disperse the micro-aggregate particles in the saline, thereby obtaining the freeze-dried product in its original form and labeling the micro-aggregates.
Aseptic process conditions and sterile pyrogen-free materials and containers are used in all of the steps mentioned.
Activity distribution depending on the particle size of the microaggregates as determined in such a production:
Particle size Percent of the total r 5 ILm 0.5 3-5 ILm 1.5 0.2-3 pm 71.1 <0.2, at 26.9 1-5 mCi of this dispersion of Tc-99m labeled tin (II) microaggregates were injected intravenously into adult mice.
Fifteen minutes after the intravenous injection, the mice were sacrificed and the various organs (liver, spleen, etc.) measured using standard gamma counting techniques to determine the uptake of each organ for Tc-99m.
Biological distribution in mice 15 minutes after intravenous injection:
Organ percentage of injected
Dose per organ
Liver 87.8
Spleen 2.6
Lungs 0.5
Skeleton (including bone marrow) 5.8
Kidneys 1.0
Gastrointestinal tract 0.6
Rest 1.6
Activities of 1-5 mCi that were prepared in a similar manner were injected intravenously into primates (baboons).
Liver-spleen imaging was performed in the usual manner, within the first 30 minutes after injection, using a gamma scintillation camera (Picker Dyna Camera II). Sharp and clear images of the liver and spleen were obtained simultaneously, with only a low background. The uptake in the lungs and in soft tissues was minimal. Excellent bone marrow images can also be obtained using appropriate longer exposures than are the liver and spleen. These representations have been as good as those obtained with sulfur colloid RES imaging agents and are clinically useful for accurate diagnostic applications.
Although the biological distribution of radioactivity in mice can be used to predict the distribution in primates as well as the selective uptake by the RES as a whole (liver, spleen and bone marrow), and the different uptake by the RES as a whole and the uptake by other organs there is no correlation between the liver-spleen uptake ratios of primates and, accordingly, none compared to the quality of the spleen presentation individually or simultaneously with the liver presentation in primates. See int. J. of Applied Radiation and Isotopes 1977, Volume 28, pages 123-130. Accordingly, in order to predict this ratio and the quality of display in humans, it is necessary to display the RES of primates, such as monkeys (rhesus monkeys) or baboons.
The above-mentioned biological distribution in mice and the radioactive imaging of the RES in primates shows that the radioactively labeled tin (II) microaggregated albumin preparations according to the invention of this example are excellent RES imaging agents which allow an excellent simultaneous spleen-liver imaging.
Essentially the same results were obtained when the freeze-drying step was omitted. Good results have also been obtained when the tin (II) micro-aggregated albumin is used directly without freeze-drying and without adding the stabilizing buffered HSA Pluron-F-68 solution, but adding a sufficient amount of buffer to the same pH Value to achieve. However, if the microaggregates are freeze-dried without adding such a stabilizing solution, it is difficult to redisperse them when the pertechnetate solution is added. Whether the microaggregates are freeze-dried in the absence of a stabilization which is ensured by a buffer or not, the particle size in a pertechnetate solution in physiological saline solution can increase in an uncontrolled manner.
In all of the following examples, all of the mixing and filtration and heating steps were carried out under anaerobic conditions, as was the case in this example, and each 1 ml aliquot of the dispersion in the sterile pyrogen-free ampoules of 10 ml capacity became the same steps subjected as in Example 1, ie the aliquot can be freeze-dried and labeled, or it can be labeled without freeze-drying, and the labeled aliquot was analyzed for activity distribution depending on particle size as described above. The biodistribution in mice and the radioactivity display in monkeys, when these tests were carried out, were carried out in the same way in each example as described in example 1.
Example 2
To 45 ml of low oxygen water, the following materials were added with mixing: 0.3 ml of 25 percent human serum albumin solution (75 mg HSA), 0.25 ml of tin (II) chloride solution (as in Example 1), 0.3 ml of 1 percent Pluron-F-68 solution, 11.2 mg diethylenetriaminepentaacetic acid and 1.65 ml 0.1N sodium hydroxide solution. The pH of the solution was 6.54. Aliquots of this solution were filtered through a sterilization membrane with a pore size of 0.22 y and heated to about 990C for 31/2 minutes to give a slightly milky suspension of denatured HSA and Sn ++ microaggregates.
3.3 ml of a stabilizing solution, which had the same composition as in Example 1, was mixed under anaerobic conditions with 6.7 ml of the milky suspension. Aliquots of a volume of 1 ml of this formulation, which had a pH of 8, were filled into sterile, pyrogen-free serum ampoules with a volume of 10 ml as in Example 1.
The test data of such a production, which was processed and marked in the same way as in Example 1, showed the following values: Activity distribution as a function of the particle size: Particle size percent of the total - 5 μm 1.1 3-5 μm 1.1
0.2 - 3 itm 68.4 <0.2 llm 29.5
Example 3 The following materials are added to 45 ml of water with a low oxygen content, with stirring:
0.3 ml of I percent Pluron 68 solution, 0.3 ml of 25 percent human serum albumin (75 mg HSA), 0.25 ml of tin (II) chloride solution [4.2 g of tin (II) chloride + 3 ml of 12 normal hydrochloric acid , diluted to 100 ml with water of low oxygen content]. 16.7 ml of this solution was mixed with 1 ml of an 1% aqueous solution of sodium pyrophosphate (10.2 mg Na4P207 l0H2O) and 0.55 ml of a 0.025 normal
Sodium hydroxide solution mixed. The pH of this solution was 5.85. Aliquots of this solution were filtered through a 0.22 cm pore size sterilizing membrane and heated in boiling water for 31/2 minutes, resulting in a milky suspension of denatured microaggregates
HSA received.
To about 50 ml of water with a low oxygen content, 5.7 g of Na2HPO4 7H2O, 12 ml of 25 percent human serum albumin and 0.33 g of Pluron-F-68 were added. After dissolving the solids, this stabilizer solution was diluted to 100 ml with low oxygen water and filtered through a sterilizing filter.
3.3 ml of the above-mentioned stabilizing solution are mixed under anaerobic conditions with 6.7 ml of the milky suspension. 1 ml aliquots of this formulation, which had a pH of 8, were in serum ampoules of 10 ml
Volume filled.
The test data of such a production, which was processed and labeled as described in Example 1, were the following: Activity distribution as a function of the particle size:
Particle size percent of the total 54m 1.0 3-5Ssm 1.0
0.2-3 ym 69.0 0.2 clm 29.0
Example 4
The following materials were added to 290 ml of water with a low oxygen content with stirring:
1 ml of an aqueous solution containing 0.2 g Pluron-F-68 per 5 ml, 4 ml 25% human serum albumin (1 g HSA), 3 ml tin (II) chloride solution [4.64 g tin (II) chloride dihydrate + 2 ml of 12 normal hydrochloric acid, diluted to 100 ml with water with a low oxygen content], 0.66 g Na2HPO4 - 7H2O in 15 ml of a water with low oxygen content and 4.04 ml of a 4 molar sodium chloride solution.
The pH of the solution was 6.5. After anaerobic filtration through a sterilization membrane with a pore size of 0.22 cm, the material is gradually and continuously passed through two heat exchangers. This provides a semi-continuous aggregation method which can be made fully continuous by introducing a regulated and continuous flow of constituent materials into a mixing chamber and by producing a continuous flow from this mixing chamber through the filter and heat exchangers, where the material emerging from the heat exchangers is continuously introduced under controlled flow into a mixing chamber into which the stabilizing solution is fed continuously and in a controlled amount, and where a mixture between these materials takes place,
the mixture thus obtained is continuously passed through a filter with 3, pore size, and filled into ampoules or serum vials, which can be continuously introduced into a freeze dryer. The first heat exchanger is maintained at about 99 ° C by means of a fluid medium, and the second is cooled to a normal room temperature by means of a fluid medium, and from this the aggregate products are collected under anaerobic conditions. The average residence time of the total mass in each Heat exchangers range from about 3 to about 8 minutes, and a milky suspension of microaggregates of tin (II) denatured human serum albumin is obtained.
To 10 ml phosphate solution (9.5 g Na2HPO4 - 7H20 per 100 ml) add 2 ml 25% human serum albumin (0.5 g HSA), 6.25 ml Pluron-F-68 solution (4.0 g per 100 ml), and water are added to give a total volume of 35 ml of stabilizing solution. After thorough mixing, removal of oxygen and sterile filtration, 15 ml of the milky suspension are added, and the mixture is then thoroughly mixed again.
1 ml aliquots of this formulation, which had a pH of 8, were filled into serum vials or ampoules with a capacity of 10 ml. The test data of such preparations, which were marked as described in Example 1, are the following: Activity distribution depending on the particle size: Particle size percent of the total 2 3 gam 7 1-3 Lcm 16
0.2-1 ym 57 <0.2ym 18 Biological distribution in mice 15 minutes after intravenous administration:
Organ percent of injected
Dose per organ
Liver 89.3
Spleen 1.1
Lungs 1.0
Bone structure 7.7
Kidneys 0.5
Gastrointestinal tract 0.2
Rest 0.2
Example 5
The following materials are added to 45 ml of oxygen-poor water with stirring:
0.3 ml of 25 percent human serum albumin (75 mg HSA), 0.25 ml of tin (II) chloride solution [4.2 g of tin (II) chloride dihydrate and 3 ml of 12 normal hydrochloric acid, diluted to 100 with water with a low oxygen content], 0.3 ml of 1% Pluron F-68 solution, and 3.7 ml of 1% sodium pyrophosphate solution (prepared as described in Example 3). The pH is 5.71. Aliquots of this not yet aggregated solution mass are filtered through a sterilization membrane with a pore size of 0.22 μm and subjected to sufficient heating by microwaves, for example for 20 seconds, whereby a milky suspension of micro-aggregates of the stannous (II) -denatured human serum albumin is obtained.
This milky suspension is formulated with an HSA sodium phosphate pluron F-68 stabilizing solution, whereby a formulation with pH 8 is obtained, and this is filled into serum vials or ampoules and with 7 ml of 99mTc sodium pertechnetate as in Example 3 marked.
The following results are obtained with a material produced in this way: Activity distribution depending on the particle size:
Particle size percent of the total 5ym 2.1 3 - 5 pm 3.1
0.2 - 3, on 84.0
0.2 to 10.8 Biodistribution in mice 15 minutes after intravenous administration:
Organ percent of injected
Dose per organ
Liver 85.9
Spleen 4,3
Lungs 0.5
Bone structure 5.3
Kidneys 1.0
Gastrointestinal cycle 0.7
Rest 2.3
Examples 6 and 7
The following materials are added to 417 ml of low oxygen water with stirring: 16.3 ml (0.75 g) of purified human serum albumin (freed from lipid material by acidification and treatment with activated carbon, as described in U.S. Pat.
Patent Specification No; (Serial no.
783 633), followed by ultrafiltration, which gives an albumin concentration of 4.6%), 2.5 ml of tin (II) chloride solution [4.2 g of tin (II) chloride dihydrate + 3 ml of 12- normal hydrochloric acid, diluted to 100 ml with water of low oxygen content] and 3 ml of 1% Pluron-F-68 solution. The solution thus obtained is mixed thoroughly with 25.6 ml of an 1% aqueous solution of sodium pyrophosphate (prepared as in Example 3) and with 34.2 ml of 0.025 normal sodium hydroxide solution. 150 ml of the solution thus obtained are filtered through a sterilization membrane with a pore size of 0.22 μm. This filtered starting material, which has not yet aggregated, had a pH of 5.62 and is kept for use in Example 6.
Another 3.4 ml of 0.025 normal sodium hydroxide solution is added to the remaining solution while stirring continues. The pH is 6.11. The filtration is carried out as above. This starting material, which has not yet been aggregated, is kept for example 7.
Aliquots of the two as yet unaggregated starting materials are heated for 3.5 minutes in a hot water bath at a temperature of 99 ° C. in order to produce the microaggregates.
Appearance Example 6 Example 7
Milky X
Hazy X
It is formulated with stabilizing solution (the pH of the stabilized formulation is 8), filled into ampoules and labeled with 5 ml of 99mTc sodium pertechnetate solution, as described in Example 3, and the following results are obtained: Activity distribution depending on the particle size :
Percent of the total
Particle size Example 6 Example 7 2 5, around 1.9 0.7 3-5 llm 2.8 1.3
1-3 ym 32.7 1.3 0.2-1, on 50.5 4.6 <0.2 pm 12.2 92.1 Biological distribution in mice 15 minutes after intravenous administration:
: No of the injected dose per organ
Organ Example 6 Example 7
Liver 86.0 88.3
Spleen 3.3 2.2
Lungs 0.8 0.6
Bone structure 6.2 7.3
Kidneys 1.0 0.7
Gastrointestinal tract 1.0 0.3
Rest 1.7 0.6 Scintigraphic representation in monkeys:
Quality of presentation
Organ Example 6 Example 7
Liver good good
Spleen good moderate
Bone marrow good good
The deterioration in the quality of the representation of the spleen due to the sharp reduction in the particle size, which was achieved by increasing the pH in Example 7, can be seen from the comparison of Examples 6 and 7 with regard to the activity distribution as a function of the particle size (which is also evident in the manifestation of the aggregated materials) and due to the image quality in healthy primates.
Example 8
The following materials are added to 45 ml of water with low oxygen content with stirring: 0.3 ml of 25 percent human serum albumin (75 mg HSA), 1.5 ml of hydroxyethylene diphosphonate (HEDP) solution (an aqueous solution containing 0.21 g of HEDP in 30 ml contains), 0.25 ml of tin (II) chloride solution [4.2 g of tin (II) chloride dihydrate + 3 ml of 6.15 normal hydrochloric acid, diluted to 100 ml with water with a low oxygen content], 0.3 ml 1 percent Pluron F-68 solution and 5.42 ml 0.05 normal sodium hydroxide solution. The pH of the solution was 5.90.
Aliquots of this starting material solution before aggregation are filtered through a sterilizing membrane with a pore size of 0.22 μm and the mixture is heated in a 99 ° C. water bath for 31/2 minutes in order to produce a milky suspension of the microaggregates.
Formulation with stabilizing solution (the pH of the formulation is 8) and filling into serum ampoules or vials, and labeling with 5 ml of 99 "Tc sodium pertechnetate, all operations being carried out according to Example 3, gave the following results: Activity distribution dependent the particle size: particle size percent of the total L 3 m 8.9 1-3ym 2.1
0.2-1 m 61.2 <0.2 cm 27.8 Biological distribution in mice 15 minutes after intravenous administration:
:
Percent of injected
Organ dose per organ
Liver 92.8
Spleen 2.6
Lungs 0.4
Bone structure 5.1
Kidneys 0.5
Gastrointestinal tract 0.5
Rest 2.3
The lyophilized tin (II) micro-aggregated albumin according to the invention showed a very long storage life of at least one year at normal room temperatures (if the material is kept protected from light). The material is also stable for at least 24 hours after radiolabelling it, keeping the material under refrigeration to protect the patient because it contains no preservatives, although it is preferred to close the preparation within 8 hours of labeling use.
99mTc-labeled biodegradable tin (II) macro-aggregates (particle size larger than 5 m) of human serum albumin that was macro-aggregated at or near the isoelectric point of human serum albumin to give particles that had 0 or almost 0 charge (this was achieved by carrying out the aggregation at the isoelectric pH value of about 4.8-5.5 and using a relatively high ion concentration), commercial use has previously been used for imaging the lungs using radioactivity (scintigraphy).
These materials are also described in the patent literature. See, for example, U.S. Patent No.
3,987,157; No. 3 872 226 and No. 3 863 004. However, such agents are not suitable as imaging agents for RES, since these larger particles are removed from the blood stream through the lungs before they reach the liver, spleen and bone marrow. See also US Pat. No.
4,024,233 and United States Pharmacopia XIX, page 488.
A RES scan material assortment of tin-containing Tc-99m labeled mini microspheres (average diameter of 1m and 98 wt% with a
Diameter of less than 3 cm) of human serum albumin, which at a pH of 2.4 by using a
Glycine-hydrochloric acid buffer, which is present in a concentration of 3 mol, is disclosed in the Journal of Nuclear Medicine, Volume 16, No. 6, 1975, page 543. These miniature microspheres are believed to be precipitated from a liquid human serum albumin solution in an oil bath. It is not known when the tin was added. See also U.S. Patent specification No.
3 3 937 668, and Int. J. of App. Rad. And Isotopes, 1970, volume
21, pages 155-167.
It has also been proposed in the literature to comminute the radio-iodinated and 99mTc-labeled macro-aggregates from Humanse rumalbumin to micro-sized particles by using ultrasonic comminution. (J.N.M. volume 13,
1972, pages 260-65; J.N.M. Abstract, Volume 12, No. 6, 1971,
Page 373; J.N.M. Abstract, Volume 10, No. 6, pages 453-4; Int.
J. of Applied Radiation and Isotopes, 1975, volume 26, pages
31-32). However, these references do not mention the presence of a reducing metal during aggregation or a ligand for that metal, and such
Products require a shredding step.
Likewise, in the Journal of Nuclear Medicine (J.N.M.),
Volume 12, No. 6, in a publication beginning on page 372 and ending on page 373 of Tc-99m and 131J-labeled microaggregates of albumin, but no mention is made of the presence of any reducing metal and a ligand therefor made, and it is not explained how the micro-aggregates who made the.
In J.N.M., Volume 10, No. 6, 1969, page 454, a method is used to mark macro and micro aggregates
Serum albumin is described by using iron (III) ions and
Ascorbic acid applies, but it is not disclosed how the microaggregates are formed, and neither a reducing metal nor a ligand for it is mentioned.
In J.N.M., Volume 9, No. 9, 1968, pages 482-485, a
Process for the production of micro-aggregates of Humanse rumalbumin described, and a subsequent labeling with radio iodine. No reducing metal and no ligand for it is mentioned.
In J.N.M., Volume 11, No. 6, 1970, page 387, a process is described for the production of Tc-99m-labeled microaggregates of albumin, which have particle sizes of about 0.5, <m, and the microaggregates are apparently produced from Tc-99m-labeled, unaggregated albumin [the unaggregated albumin was labeled with Tc-99m by using ferric chloride, ascorbic acid and
Acetate buffer], and no mention is made of the presence of a reducing metal and a ligand therefor.
In JNM, Volume 12, No. 6, 1971, pages 467-468, a colloidal tin (II) hydroxide suspension, which is labeled with Tc-99m, is described, which is used to represent the liver, it becomes however, no mention of human serum bumin or a stabilizing ligand in the formulation described there.
In J.N.M., Volume 11, No. 10, pages 580-585, 1970, the
Microaggregation of HSA described, and the subsequent labeling with technetium, which was first reduced with ferric chloride and ascorbic acid. There is no mention of the presence of a reducing metal or a ligand therefor during the aggregation.
Iodized human serum albumin aggregates are described in the following citations: Br. J. Exp. Path, Volume 38,
Pages 35-48;
Report of Scientific Exhibit entitled Colloidal Radio Albumin Aggregates for Organ Scanning from the 10th Annual Meeting of the Nuclear Medicine Society in Montreal, Canada, June 26-29, 1963; J.N.M., Vol. 5, pp. 259-275, 1964; J. Lab. & Clin. Med., Vol. 51, No. 2, pages 230-239, 1958; Dynamic radioisotope clinical trials, USAEC Technical Information Department, pages 285-317, June 1964; Invest. Radiol. Volume 1, 1966, pages 295-300; G. V.'s report
Taplan et al, entitled Making Colloidal Suspensions of Human Serum Albumin J131 for the Determination of Liver Blood Flow and Function of the Reticulo-Endothelial System in Humans, UCLA Report No. 481 Biology and Medicine, June 23, 1961 of the University of California medical department Los Angeles.
In the U.S. U.S. Patent No. 4,054,645 describes the use of stannous fluoride reducing agent along with a number of different targeting ligands, one of which is albumin, but nothing is said about microaggregating the albumin in the presence of stannous. salt and an additional non-targeting ligand.
In the U.S. Patent Specification No. 4,057,615 describes the use of a reducing complex agent together with various targeting excipients (an unfortunate term for the targeting ligand), the binding constant of the reducing anion for the technetium being lower than that of the excipient. Nothing is written about microaggregation in the presence of a reducing metal and a non-targeting ligand.
Although some of the above references refer to Tc-99m labeled microaggregates of albumin as a radioactive imaging agent (scintigraphy), no such agent is currently on the market for RES imaging, and colloidal sulfur is still the primary agent RES imaging on the market, although it has its known disadvantages, and although Tc-99m-labeled macro-aggregates have become mainly important in the imaging of the lungs.