CH652599A5

CH652599A5 - Verfahren zur herstellung physiologisch abbaubarer kolloidaler, human-serumalbumin enthaltender produkte und ihre verwendung.

Info

Publication number: CH652599A5
Application number: CH5560/81A
Authority: CH
Inventors: Han-Lie Dr Chia; Siegfried Woltmann
Original assignee: Solco Basel Ag
Priority date: 1981-08-28
Filing date: 1981-08-28
Publication date: 1985-11-29
Also published as: IT1156495B; GB2108967A; JPH0375534B2; BE894233A; NL8203360A; FI822941L; JPS5846028A; FI77374B; GB2108967B; FR2512031A1; US4410507A; FI822941A0; CA1187789A; FR2512031B1; IT8268049A0; FI77374C

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines mit Technetium-99m markierbaren, physiologisch abbaubaren, kolloidalen, Human-Serumalbumin enthaltenden Produktes in Form von Mikroaggregaten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung von Human-Serumalbumin mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel und einer wässri-gen sauren Lösung eines Zinn(II)-salzes vermischt, den pH-Wert der Reaktionsmischung durch Zugabe einer Pufferlösung auf einen konstanten, vorgewählten pH-Wert von 3,5 bis 8,0 einstellt und die Mischung auf konstanter Temperatur im Bereich von 45 bis 100"C, durch die Einwirkung von Mikrowellen oder unter Rühren, bis zur vollständigen Hydrolyse des Zinn(II)-salzes und gleichzeitiger Denaturierung des Human-Serumalbumins erhitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als wässrige saure Lösung eines Zinn(II)-salzes eine wässrige Lösung von Zinn(II)-chlorid in Salzsäure verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltene kolloidale Lösung gefriertrocknet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man der kolloidalen Lösung vor der Gefriertrocknung Dextrose und Inositolhexaphosphorsäureester-Natriumsalz, z.B. Natriumphytat, zusetzt.

5. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2 hergestelltes, zur Markierung mit Technetium-99m bereites kolloidales Produkt.

6. Gefriergetrocknetes Produkt nach Anspruch 5, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3 oder 4.

7. Verwendung des kolloidalen Produktes gemäss Anspruch 5 zur Herstellung eines kolloidalen radioaktiven Präparates für szintigraphische Untersuchungen des reticuloen-dothelialen Systems oder des lymphatischen Systems, dadurch gekennzeichnet, dass man besagtes Produkt mit einer "mTc-Pertechnetatlösung behandelt.

8. Verwendung nach Anspruch 7 des gefriergetrockneten Produktes gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,

dass man besagtes Produkt mit einer 99mTc-Pertechnetatlö-sung behandelt.

Radioaktiv markierte kolloidale Partikeln sind in der Nuklearmedizin für szintigraphische Untersuchungen bereits eingesetzt worden, insbesondere für die Perfusions-Lungen-szintigraphie sowie für Untersuchungen des reticuloendothe-lialen Systems. Als Radionuklid wird meistens Technetium-99m wegen seiner besonders günstigen radiologischen und physikalischen Eigenschaften (Ty2-Zerfall = 6,05 Stunden, Gammastrahlenenergie 140 keV) verwendet.

Als Träger oder Matrix des Radionuklides sind verschiedene Teilchenmaterialien vorgeschlagen oder verwendet worden, unter anderem Proteine, wie menschliches Serumalbumin und Hämoglobin [G. V. Taplin et al., J. Nucl. Med. 5 (1964), 259]. Die Anwendung von Human-Serumalbumin (HSA) als kolloidales Material ist in vielfacher Hinsicht von Vorteil, weil HSA-Kolloide bzw. Partikeln für den Menschen gut verträglich sind und ihre Metabolisierbarkeit sowohl durch histologische Untersuchungen an Lungengewebe als auch durch Radioaktivitätsmessungen eindeutig nachgewiesen wurde.

Um Produkte von reproduzierbarer Partikelgrösse zu erhalten, sind verschiedene Herstellungsverfahren vorgeschlagen worden, z. B. die HSA-Koagulation in Anwesenheit von Zinn(II)salz in physiologischer Kochsalzlösung (GB-PS 1 389 809), die Denaturierung von Human-Protein durch Hitzebehandlung beim isoelektrischen Punkt von HSA

(pH = 4,9) und anschliessende Ausfallung durch verdünnte Salzsäure (GB-PS 1 409 176). die Anwendung von HSA nach Vorreinigung durch Dialyse (DE-AS 2 536 008), die spezifische Anwendung von Zinn(II)tartrat als Reduktions-s mittel (DE-OS 2 654 298). das Mischen von metallischen Ionen in Gelatine-HSA-Lösung (US-PS Re 29 066) oder die Anwendung von Pufferlösungen (US-PS 4 024 233). Mit all diesen Verfahren wurden allerdings hauptsächlich grössere HSA-Partikeln mit einer Verteilung der Partikelgrösse von io 10 bis 100 (im erhalten; sie werden für die Perfusions-Lungen-szintigraphie angewendet.

Bei der Herstellung kleiner kolloidaler HSA-Teilchen hingegen treten Komplikationen durch die schwer zu steuernde Aggregatsbildung auf. Wegen deren Wichtigkeit 15 als radiodiagnostisches Mittel für die Untersuchung des reti-culoendothialen und des lymphatischen Systems wird deshalb die Herstellung kleiner HSA-Teilchen mit definierten Partikelgrössen weiterhin angestrebt.

Unter anderem wurde über die Anwendung von entfette-20 tem Human-Serumalbumin als Ausgangsmaterial berichtet (DE-OS 2 814 038). Daraus wurden HSA-Kolloide der Teil-chengrösse 0,1-5 um, vorwiegend für die Leber- und Milzdarstellung, bzw. von 15-50 pm für die Lungenszintigraphie erhalten. Durch Zerkleinerung von denaturierten HSA-Sn-25 Makroaggregaten (10-100 um) mittels Ultraschall ist die Herstellung von HSA-Kolloiden der Teilchengrösse 0,1-3,0 pm für die szintigraphische Darstellung von reticuloendothe-iischen Systemen bekannt (US-PS 4 187 285). Alle diese Verfahren bedürfen offensichtlich zusätzlicher aufwendiger Auf-30 trennungsvorgänge.

In der DE-OS 2 909 355 wurde ein Verfahren zur Herstellung von HSA-Mikroaggregaten der Partikelgrösse vorwiegend im Bereich 0,2-5 (im vorgeschlagen. Darin wird die Mikroaggregation einer Mischung aus Human-Serumalbu-35 min und Zinn(II)salz durch Hitze-Denaturierung, vor allem in Anwesenheit eines für Zinnionen stabilisierenden Liganden, bewerkstelligt. Der vor der Mikroaggregation zugesetzte Ligand trägt wesentlich dazu bei, dass eine gute radioaktive Darstellung des reticuloendothelialen Systems ermöglicht 40 wird. Als stabilisierende Liganden wurden beispielsweise Natrium-methylendiphosphonat (MDP), Diäthylentriamin-pentaessigsäure (DTPA), Hydroxyäthyldisphosphonat (HEDP), Natriumpyrophosphat sowie Dinatriumhydrogen-phosphat verwendet. Nach diesem Verfahren wurden HSA-45 Mikroaggregate mit verhältnismässig breiter Teilchengrös-senverteilung erhalten: ca. 40 bis 70% im Bereich 0,2-3 (im und ca. 10 bis 30% im Bereich unterhalb 0,2 |im.

Die nach diesem Verfahren erhaltenen kolloidalen Präparate eignen sich lediglich zur szintigraphischen Darstel-50 lung morphologischer Schäden des reticuloendothelialen Systems, vor allem der Leber und der Milz (gleichzeitige Leber-Milzdarstellung), jedoch sind sie für die szintigraphische Knochenmarkdarstellung nur bedingt anwendbar. Eine bessere Knochenmark-Darstellung wird bekanntlich mit kolloi-55 dalen Präparaten kleinerer Partikelgrösse (vorwiegend unterhalb 0,2 (im) erhalten.

Ferner weisen diese Präparate eine breite und schwankende Teilchengrössenverteilung auf und eignen sich deshalb nicht für die Untersuchungen des dynamischen Zustandes 60 oder der dynamischen Vorgänge des RE-Systems.

Schliesslich sind sie nicht für die szintigraphische Darstellung des lymphatischen Systems anwendbar, wofür bekanntlich kolloidale Präparate kleinerer Teilchengrösse notwendig sind. Dazu wird zur Zeit meistens das 99mTc-Anti-65 monschwefelkolloid verwendet, welches eine Teilchengrösse von 0,002-0,015 um aufweist, biologisch aber schlecht meta-bolisierbar ist [G.N.Ege et al.. Brit. J.Radiol. 52 (1979),

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Aus den erwähnten Gründen fehlt zur Zeit nach wie vor offensichtlich ein radioaktives kolloidales Präparat,

1. welches nicht nur für die morphologische Darstellung, sondern vor allem auch für funktionsszintigraphische Untersuchungen des RE-Systems geeignet ist;

2. welches eine gute Knochenmark-Darstellung ermöglicht, und

3. welches für die szintigraphische Darstellung des lymphatischen Systems bessere Eigenschaften besitzt als die zur Zeit zugänglichen 99mTc-Antimonschwefel-Kolloide bzw. 99mTc-Schwefelkolloide.

Für eine quantitative Funktionsprüfung des RE-Systems wird ein kolloidales Produkt mit folgenden Eigenschaften gefordert (I. Zolle et al., Radioaktive Isotopen in Klinik und Forschung, Gasteiner Symposium 1972, Bd. 10, Seite 446):

1. kleinere Teilchen mit genau definierter, einheitlicher bzw. engerer Teilchengrössenverteilung,

2. gute Reproduzierbarkeit von der einen zur anderen Herstellung

3. gute Markierungsstabilität und

4. gute Verträglichkeit und Metabolisierbarkeit im Menschen.

Für die szintigraphische Darstellung der RE-Zelle des Knochenmarks wird ein kolloidales Produkt gewünscht, welches ausser den obenerwähnten Eigenschaften zusätzlich eine Partikelgrösse im Bereich unterhalb 0,2 |im aufweist. Bekanntlich besteht ein Zusammenhang zwischen Partikelgrösse und Anreicherungsgrad der Kolloide im Knochenmark. Die bessere Anreicherung im Knochenmark wird eher mit kleineren Partikeln erzielt [H.L. Atkins et al., J. of Reti-culoendothelial Soc. 8 (1970) 1976] und deren Teilchengrösse wird im allgemeinen im Bereich von 0,03-0,2 (im als ideal angenommen.

Ein ideales kolloidales Präparat für die szintigraphische Darstellung des lymphatischen Systems soll folgende Eigenschaften aufweisen [G.N. Ege et al, Brit. J. Radiol. 52 (1979), 124]:

1. homogene und möglichst eng definierte Partikelgrössen-verteilung; es wird angenommen, dass die optimale Teilchengrösse im Bereich von 0,002-0,03 (im liegen soll;

2. beständiges Präparat; ein Agglomerationsprozess soll nicht stattfinden;

3. gute Reproduzierbarkeit von der einen zur anderen Herstellung;

4. gute Markierbarkeit mit dem Radionuklid, welches günstige physikalische und radiologische Eigenschaften haben soll;

5. gute Verträglichkeit und Metabolisierbarkeit im Menschen.

6. das Präparat soll eine möglichst kleine Restaktivität an der Injektionsstelle nach subkutaner Applikation aufweisen.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von mit Technetium-99m markierbaren, kolloidales Human-Serumalbumin enthaltenden Produkten in Form von Mikroag-gregaten gefunden, welche die obenerwähnten Eigenschaften aufweisen und sich daher nach der Markierung mit Techne-tium-99m zu morphologischen sowie funktionsszintigraphi-schen Untersuchungen insbesondere des RE-Systems (der Leber, der Milz und des Knochenmarks) und zur Darstellung des lymphatischen Systems vorzüglich eignen.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren kann man

1. kolloidale Produkte kleinerer Teilchengrösse herstellen, deren Teilchengrössenbereich je nach Anwendungszweck gezielt gesteuert werden kann,

2. die Teilchengrössenverteilung der daraus gewonnenen kolloidalen Produkte besonders eng und definiert halten,

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3. reproduzierbare Produkte mit definierter Teilchengrössenverteilung von der einen zur anderen Herstellung produzieren,

4. kolloidale Produkte gezielt mit enger und definierter Par-tikelgrössenverteilung je nach Verwendungszweck im Bereich unterhalb 3,0 |xm herstellen, wie beispielsweise von 0,2-3,0 um von 0,03-0,2 (im und unterhalb 0,03 um,

5. mit dem gleichen Herstellungsprinzip mindestens zwei neue kolloidale Präparate herstellen, nämlich Präparate für die szintigraphische Leber-Milzdarstellung, für funktionsszintigraphische Untersuchungen des RE-Systems, für die szintigraphischen Untersuchungen des Knochenmarks bzw. des lymphatischen Systems.

Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf dem Befund, dass die Teilchengrösse sowie die Teilchengrössenverteilung des entstehenden kolloidalen Produktes unter konstant gehaltenen Konzentrationen der Komponenten einzig vom pH-Wert der Mischung vor der Mikroaggregation abhängig ist. Die Komponenten sind Human-Serumalbumin, Zinn(II)ionen und nichtionogene oberflächenaktive Mittel in einer Pufferlösung. Es zeigte sich, dass der Teilchengrössenbereich des entstehenden kolloidalen Produktes durch pH-Einstellung vor der Mikroaggregation genau gesteuert werden kann. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Teilchengrössenverteilung des daraus entstehenden kolloidalen Produktes eng definiert und reproduzierbar ist. Dafür ist kein zusätzlicher Ligand vor der Mikroaggregation notwendig.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist in Anspruch 1 definiert. Das erhaltene Produkt kann als kolloidale Lösung oder in lyophilisierter Form vorliegen.

Die Erhitzung mittels Mikrowellenofen bietet den Vorteil, dass die vollständige Hydrolyse bei gleichzeitiger Denaturierung des Albumins aufgrund der regelmässigen Wärmezufuhr homogen verläuft.

Im folgenden wird die Erfindung ausführlich im einzelnen beschrieben.

Als menschliches Serumalbumin kann jedes beliebige Handelsprodukt ohne besondere Reinigung oder Vorbehandlung und namentlich ohne vorherige Entfettung oder Reinigung durch Dialyse, Ultrafiltration oder Säulenchromatographie verwendet werden. Es wird davon eine wässrige Lösung hergestellt, deren Konzentration zweckmässig 0,05 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 0,2 bis 2,5 mg/ml beträgt.

Für die gewünschtenfalls an die Herstellung anschliessende Gefriertrocknung des kolloidalen Produktes hat es sich als vorteilhaft erwiesen, der erhaltenen Lösung einen pharmakologisch inerten Füllstoff sowie einen als Stabilisator wirkenden Stoff zuzusetzen. Infolge dieser Zusätze führt die Gefriertrocknung zu einem qualitativ besseren Lyophylisat.

Dadurch lässt sich das Produkt bei der Markierung mit 99mTc-Natriumpertechnetat in physiologischer Kochsalzlösung leichter lösen und es bleibt als beständiges Kolloid bei physiologischem pH-Wert erhalten. Für diese Zusätze eignet sich insbesondere eine wässrige Lösung von 0,05 bis 40 mg Dextrose und 0,01 bis 5 mg Inositolhexaphosphat-Natrium-salz (Natriumphytat) per ml, vorzugsweisè von 10 bis 20 mg Dextrose und 0,1 bis 0,5 mg Natriumphytat per ml.

Selbstverständlich können, ausser den obengenannten Stoffen, andere als Füllstoff bzw. Stabilisator wirkende Substanzen verwendet werden, beispielsweise Kohlehydratabkömmlinge (Mannit, Fructose, Lactose, Inositol, Sorbit), Glycin, Kochsalz, Human-Serumalbumin, anorganische Phosphate, Sulfate, Carbonate, Monocarbonsäuren, Phos-phonate usw. Ausführliche Abhandlungen hierüber sind den folgenden Monographien zu entnehmen: H. Sucker, P.

Fuchs, P. Speiser, Herausgeber: Pharmazeutische Technologie, Seite 321-332, 620-628, Georg Thieme Verlag, Stuttgart

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1978; P. H. List, L. Hörhammer, Herausgeber: Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Bd. 7, Seite 297-302,4. Ausgabe, Springer-Verlag, Berlin 1971.

Gegebenenfalls lässt sich die Verbesserung der Löslichkeit des lyophilisierten Produktes auch dadurch erzielen,

dass das Material vor der Lyophilisation unter konstanter Temperatur zwischen 35 und 75 C während 1 bis 3 Stunden gehalten wird. Dadurch werden die bereits gebildeten Kolloidalteilchen mit reduzierender Wirkung ebenfalls stabilisiert und deren gute Löslichkeit bzw. Resuspendierbarkeit bleibt erhalten.

Als oberflächenaktives Mittel verwendet man wasserlösliche, nichtionogene atoxische und für die parenterale Darreichung gut verträgliche Stoffe. Diese Stoffe werden je nach Verwendungszweck bekanntlich als Solubilisator, Netzmittel, Emulgator, Tenside, Detergentien oder Lösungsvermitt-ler bezeichnet. Demgemäss kann man unter anderen folgende Stoffe verwenden: Tween 80, Carbowax bzw. Polyäthy-lenglykole Typ 600,1500,4000, Poly-N-vinyl pyrrolidon Typ 20,40, Plasdone Typ C-15, Polysacchariden-Abkömm-linge wie Dextran, Protein-Abkömmlinge wie Gelatine, Pro-pylenoxy-Äthylenoxyd-Blockpolymere (Pluriol-PE oder Plu-ronics Typ F-38, F-88, F-98, F-108, Cremophore Typ EL, RH-40 und RH-60 sowie Tergitele). Ausführliche Beispiele dieser Stoffklassen sind der folgenden Monographie zu entnehmen: H.P. Fiedler, H.v. Czetsch-Lindenwald: Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Editio Cantor KG, Aulendorf i. Württemberg 1971.

Die Konzentration der wässrigen Lösung an oberflächenaktivem Mittel soll im allgemeinen das 1- bis 20-fache der Konzentration an HSA betragen: vorzugsweise werden 0,2 bis 40 mg/ml Pluronic F-88 eingesetzt.

Die Anwendung von Pufferlösungen zur strikten Einhaltung des vorgesehenen pH-Wertes der Mischung vor der Mikroaggregation erweist sich als vorteilhaft. Unter anderen sind als Puffer verwendbar: Natriumbicarbonat/Natrium-carbonat, Borax/Natronlauge, Dihydrogenphosphat (z.B. NaH2P04)/Monohydrogenphosphat (z.B. Na2HP04)/ Phosphat (z.B. Na3P04), Kaliumbiphthalat/Natronlauge, Natriumacetat, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Puffer), 2-[4-(2-Hydroxyäthyl)piperazin-1 -yl]-äthansulfon-säure/Natronlauge (HEPES-Puffer) usw. In Frage kommende Puffersysteme sind in folgenden Monographien zusammengestellt worden: H.M. Rauen, Herausgeber: Biochemisches Taschenbuch 2. Auflage, Bd. 2, Seite 90-104, Springer Verlag, Berlin 1964; N.E. Good, G.D. Winget, W. Winter, T.N. Conolly, S. Izawa und R.M.M. Singh, Biochemistry 5, 467 (1966); H. Eagle, Science 174, 500 (1971).

Der Einfachheit halber kann die wässrige Lösung, welche aus Human-Serumalbumin, einem nichtionogenen oberflächenaktiven Mittel und einem Zinn(II)salz in Salzsäure besteht, zuerst mit der Pufferlösung vermischt und anschliessend der vorgesehene pH-Wert mit Natronlauge bzw. Salzsäure genau eingestellt werden.

Das Zinn(II)salz kann beispielsweise SnCl2 ■ 2H2 O, ein anderes Zinn(II)-halogenid oder Zinn(II)-tartrat sein.

Der pH-Wert der Mischung vor der Mikroaggregation wird je nach der gewünschten Teilchengrösse zwischen 3,0 und 8,0 eingestellt. Wird die Pufferlösung nicht sofort mit der wässrigen Lösung von Human-Serumalbumin, nichtio-nogenem oberflächenaktivem Mittel und Zinn(II)ionen in Salzsäure vermischt, so lässt sich die vorgesehene pH-Einstellung mittels einer wässrigen Lösung von Pufferreagenz und alkalischem Reagenz, z. B. Natronlauge, Kalilauge, Ammoniakwasser bzw. organischer Base, bewerkstelligen. Es bildet sich dabei in jedem Fall eine Puffermischung, welche den gewünschten, konstanten pH-Wert vor der Mikroaggregation aufrechterhält. Von der Pufferlösung wird mit Vorteil soviel hergestellt bzw. zugegeben, dass ihre Konzentrationin der Lösung 0,05 bis 50 mg/ml beträgt.

Für die Herstellung kolloidaler Produkte der Teilchengrösse 0,2—3,0 |im wird die pH-Einstellung im Bereich 5,8-6,8, für die Partikelgrösse 0,03-0,2 |im hingegen in pH-Bereichen 3,0-5,0 bzw. 6,8-8,0 bevorzugt. Diese pH-Werte gelten vor allem, wenn die Konzentration an Human-Serumalbumin 1,0-3,0 mg/ml an oberflächenaktivem Mittel 1,0-40 mg/ml und an Zinn(II)-salz 0,1-0,8 mg Sncl2 • 2H2 O/ml beträgt. Im pH-Bereich von 6,0-6,8 lässt sich ein kolloidales Präparat der Partikelgrösse 0,03-0,2 (im bzw. im Bereich von 6,8-7,5 ein kolloidales Präparat der Partikelgrösse unterhalb 0,03 p.m herstellen, wenn die Konzentration an Human-Serumalbumin 0,2-1,2 mg/ml, an Zinn(II)-salz 0,05-0,4 mg SnCl2 • 2H20/ml und an oberflächenaktivem Mittel 1,0-40 mg/ml beträgt.

Die Hydrolyse der in der Reaktionsmischung befindlichen Zinn(II)ionen beginnt bereits während der Einstellung des vorgesehen pH-Wertes durch die Pufferlösung, wobei die vollständige Hydrolyse gleichzeitig mit dem vollständigen Mikroaggregationsvorgang durch Erhitzen der Lösung stattfindet. Bekanntlich erfolgt die Hydrolyse der Sn(II)ionen stufenweise. Sehr wahrscheinlich bewirkt die Hitze-Behandlung der Lösung nicht nur die vollständige Mikroaggregation des Serumalbumins, sondern auch die Dehydratation von Zinnhydroxiden zu schwerlöslichen Produkten, welche mit koaguliertem Serumalbumin vereinigt als kolloidale Partikeln vorliegen.

Die Wärmebehandlung erfolgt mit Vorteil mittels eines Mikrowellenofens oder durch Erhitzen bei konstanter Temperatur unter Rühren. Wichtig dabei ist, dass der gewählte pH-Wert für konstant gehaltene Konzentrationsverhältnisse der Reaktionskomponenten strikte eingehalten wird. Im allgemeinen wird die Lösung auf einer bestimmten Temperatur von 45-100 °C gehalten. Die Dauer des Mikroaggregations-prozesses hängt bekanntlich von der gewählten Temperatur sowie des Volumens ab; sie kann zwischen 2 Minuten und 2 Stunden variieren, im allgemeinen hält sie sich in einem Intervall von 5-45 Minuten. Kürzere Mikroaggregationsdauer wird durch Wärmebehandlung mittels Mikrowellenofens bei 100-250 °C (50 Sekunden bis 30 Minuten) erreicht. Es zeigte sich ferner, dass die Mikroaggregation der herzustellenden Produkte auch durch das Umwälzen der Lösung in einem kontinuierlichen, schlangenartigen Rohr als Reaktionsgefäss im Heizbad bewerkstelligt werden kann. Die Einhaltung des Durchflusses wird durch eine am Reaktionskreislauf angeschlossene Förderpumpe gewährleistet, wobei die Temperatur des Heizbades vorteilhafterweise zwischen 70-90 °C gehalten wird.

Anschliessend kann das entstandene kolloidale Produkt direkt für die Tc99m-Markierung verwendet oder gefriergetrocknet und in dieser Form bis zum Zeitpunkt der Markierung mit 99mTc-Natriumpertechnetat aufbewahrt werden.

Um die Wiederauflösung des lyophilisierten Produktes vor der Markierung zu erleichtern, erweist sich als vorteilhaft, dem Produkt vor der Lyophilisation als Füllstoff und Stabilisator wirkende Substanzen zuzusetzen. Dafür wird eine Mischung aus Dextrose und Natriumphytat (Inositolhe-xaphosphat-Natriumsalz) bevorzugt, da die hervorragenden Eigenschaften der pharmakologisch annehmbaren Dextrose und auch die Vorteile der hohen spezifischen Ladung von Natriumphytat (6 negative Ladungen per Molekül) bekannt sind. Dadurch werden die bereits gebildeten Kolloidalteilchen mit reduzierender Wirkung besser stabilisiert und deren gute Löslichkeit bzw. Resuspendierbarkeit bleibt erhalten.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, dass man als nichtionogenes oberflä5

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chenaktives Mittel Pluronic F-88 oder Chromophor-EL, als Puffer Dinatriumhydrogenphosphat oder Tris(hydroxy-methyl)-aminomethan (Trispuffer) oder 2-[(4-(2-Hydroxy-äthyl)-piperazin-l-yl]-äthansulfonsäure/Natronlauge (HEPES-Puffer) und als Füllstoff bzw. Stabilisator Dextrose und Natriumphytat verwendet, wobei die Mikroaggregation durch Mikrowellenofen bewerkstelligt wird.

Aus dem erfindungsgemäss hergestellten Produkt (als kolloidale Lösung oder in lyophilisierter Form) lässt sich eine entsprechende kolloidale radioaktive Lösung für szintigraphische Untersuchungen leicht herstellen, indem man das Produkt mit einer "mTc-Pertechnetat-Lösung, vorzugsweise einer Na99mTc04-Lösung, versetzt.

Dass es sich bei dem vorliegenden kolloidalen Produkt nicht lediglich um eine Mischung aus getrennt befindlichem Human-Serumalbumin, Zinn(II)salz und anderen Komponenten handelt, welche sich als solche getrennt mit Techne-tium-99m markieren lassen, geht deutlich aus den vorliegenden Analysendaten (Tabellen 1 und 2) hervor.

Eine ohne Mikroaggregation bereitgestellte Mischung (Produkt Nr. 4) verhält sich sowohl in der Teilchengrössenverteilung als auch in der biologischen Verteilung nach der 99raTc-Markierung anders als die erfindungsgemäss erhältlichen Produkte (Produkte Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3). Die Mischung (Produkt Nr. 4) verhält sich wie ein wasserlöslicher HSA-Reagenssatz für Blutvolumendarstellung (Produkt Nr. 5, Handelspräparat). Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird hingegen tatsächlich ein kolloidales Produkt (Produkte Nr. 1 bis 3) gewonnen. Der Unterschied zwischen den erfindungsgemäss erhältlichen Produkten Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 besteht darin, dass das Produkt Nr. 1 gezielt mit einer Teilchengrösse von 0,2-3,0 um, das Produkt Nr. 2 mit einer Teilchengrösse von 0,03-0,2 (am und das Produkt Nr. 3 mit der Teilchengrösse unterhalb 0,03 (im hergestellt wurden. Die Bestimmung der Teilchengrössenverteilung erfolgt mittels Mikrofiltration durch Nucleopore-Filter, deren kleinste Porengrössen bis 0,03 jxm erhältlich sind. Dass das erfindungsgemäss erhältliche Produkt Nr. 3 (Teilchengrösse unterhalb 0,03 (im) tatsächlich in kolloidaler Form vorliegt, ist aus dessen biologischer Verteilung (Tabelle 2) ersichtlich. Nach intravenöser Injektion wird ein Kolloid durch Phagozytose im RE-System gespeichert. Übersichtshalber werden die Daten der handelsüblichen Reagenssätze (HSA- bzw. Sb-S-Kolloide) sowie zum Vergleich jene der 99mTc-Pertechne-tat-Lösung aufgeführt.

Für die Bestimmung der Teilchengrösse wird das99m TC-markierte Produkt durch Mikrofilter definierter Poren-grösse (Nucleopore-Filter) geleitet. Die Aktivität der Lösung vor und nach der Filtration wird in Gammazähler gemessen und die Teilchengrössenverteilung aufgrund der gemessenen Aktivitätsverteilung ermittelt.

Für die Biodistribution wird das 99mTc-markierte Produkt intravenös in die Schwanzvene verabreicht. 30 Minuten nach Verabreichung werden die Tiere unter Äther-Narkose getötet, seziert und die Aktivität in den einzelnen Organen im Gammazähler gemessen.

In Tabelle 3 sind die Biodaten an Ratten, 2 Stunden nach subkutaner Injektion in die rechte Fussferse des Hinterbeins, aufgeführt. Die erfindungsgemäss erhältlichen Präparate Nr. 8 bis 11 eigenen sich deutlich unter anderem für die Darstellung des lymphatischen Systems.

Die Markierungsausbeute der Produkte liegt nach ra-diochromatographischer Untersuchung immer über 95%. Zur Bestimmung der Markierungsausbeute werden die 99mTc-markierten Präparate radiochromatographiert und das Radiochromatogramm mit einem Dünnschicht-Scanner ausgewertet. Die Abwesenheit von nicht gebundenem 99mTc-Pertechnetat lässt sich unter anderem mit dem in Tabelle 4 aufgeführten Prüfsystem bestimmen.

Zur Herstellung kolloidaler Präparate für die parenterale 5 Verabreichung ist es notwendig, dass die zu verwendenden Reagenzien, Lösungen sowie Gebrauchsgegenstände steril und pyrogenfrei sind und alle Vorbereitungen und Verfah-rensmassnahmen unter Stickstoffatmosphäre und aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Die Prüfung auf io Keimfreiheit wird nach US-Pharmacopeia XIX, auf Abwesenheit von pyrogenen Stoffen nach European Pharmaco-poeia durchgeführt.

Beispiel 1

Pufferlösung: 1,0 mg NaHC03 + 0,5 mg NaOH/ml Wasser i5 In einem verschlossenen 100-ml-Reaktionsgefass werden 250 mg Human-Serumalbumin (entspricht 1,25 ml 20%iger HSA-Lösung) und 250 mg Dextrose in 70 bis 75 ml Wasser vorgelegt. Nach Zugabe von 2,5 ml 0,8%iger SnCU-Lösung in 0,1 n HCl wird die Mischung mit der Pufferlösung auf pH 20 6,37 eingestellt (Verbrauch 14,0 ml). Die schwach opalisierende Mischung wird mit Wasser auf ein Volumen von 90 ml verdünnt und während 3 Minuten bei 80 °C erhitzt. Die milchige Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und während 60 Minuten auf 60 °C wieder erwärmt. Vor dèr 25 Lyophilisation werden 10 ml Lösung aus löslichem HSA und Na2HP04 (entspricht jeweils 100 mg HSA bzw. Na2HP04 per 1 ml) zugesetzt und die erhaltene Lösung wird in Ampullen von 1 ml Inhalt lyophilisiert.

1 Ampulle enthält:

30 2,5 mg HSA in Kolloidform 0,2 mg SnCl2 • 2H20 2,5 mg Dextrose

10,0 mg lösliches HSA als Füllstoff 10,0 mg Na2HP04 als Stabilisator 35 NaHC03/Na0H als Puffer vor der Mikroaggregation. Die Biodaten des 99mTc-markierten Produktes werden in Tabelle 5 aufgeführt.

Beispiel 2

Pufferlösung: l,0mgNaHCO3 + 0,5 mg NaOH/ml Wasser 40 Man verfährt wie in Beispiel 1; pH-Einstellung auf 6,98. 1 Ampulle enthält:

0,5 mg HSA in Kolloidform 0,2 mg SnCl2 • 2H20 2,0 mg Cremophor RH-40 45 10,0 mg lösliches HSA als Füllstoff 10,0 mg Na2HP04 als Stabilisator NaHC03/Na0H als Puffer vor der Mikroaggregation Biodaten, siehe Tabelle 5.

so Beispiel 3

Pufferlösung: 1,0 mg Dinatriumtetraborat + 0,5 mg NaOH/ml Wasser Je 250 mg Human-Serumalbumin und Polyvinylpyrroli-don (KW 29-32) werden in 50 ml Wasser vorgelegt. 2,5 ml 55 0,8%ige Lösung von SnCl2 • 2H20 in 0,1 n-Salzsäure werden zugesetzt. Der pH-Wert der schwach opalisierenden Lösung wird mit der Pufferlösung auf 6,5 (Verbrauch 15 ml) eingestellt. Nach Wasserzugabe bis auf ein Volumen von 95 ml wird die Lösung während 3 Minuten bei 80 °C erhitzt. 6o Die weitere Behandlung geschieht wie im Beispiel 1. 1 Ampulle enthält:

2,5 mg HSA in Kolloidform 0,2 mg SnCl2 + 2H20 2,0 mg Polyvinylpyrrolidon 65 10,0 mg lösliches HSA als Füllstoff 10,0 mg Na2HP04 als Stabilisator Borax NaOH als Puffer vor der Mikroaggregation Biodaten, siehe Tabelle 5.

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6

Beispiel 4

Pufferlösung: 119,2 mg 2-[4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-1 -yl]-äthansulfonsäure (HEPES) + 20 mg Natronlauge/ml H20 In einem verschlossenen 100-ml-Gefass werden 250 mg HSA und Cremophor-EL in 50 bis 60 ml Wasser gelöst. 2,5 ml 0,8%ige Lösung von SnCl2 • 2H20 in 0,1 n-HCl werden zugesetzt. Durch Zugabe der Pufferlösung wird der pH-Wert auf 6,4 eingestellt. Die schwach opalisierende Lösung wird während 60 Sekunden in einem Mikrowellenofen (Ausgangsleistung 1500 Watt) erhitzt. Der milchigen Lösung werden 1,5 g Dextrose und 250 mg wasserfreies Natriumphytat zugesetzt. Die kolloidale Lösung wird in Ampullen von 1 ml Inhalt lyophilisiert.

Biodaten, siehe Tabelle 5.

Beispiel 5 Pufferlösung: Na2HP04/Na0H

In einem verschlossenen 100-ml-Reaktionsgefäss werden nacheinander gelöst: 250 mg HSA und Pluronic F-88, 2,5 ml l,6%iges SnCl2 • 2H20 in 0,1 n-HCl und 50 mg Na2HPÖ4 in 50 bis 60 ml Wasser. Durch Zugabe von 0,025 n-NaOH wird der pH auf 6,4 eingestellt. Die schwach opalisierende Mischung wird wie in Beispiel 4 weiter aufgearbeitet und lyophilisiert.

Biodaten, siehe Tabelle 5.

Beispiel 6

Pufferlösung: 1,0 mg Dinatriumtetraborat + 0,5 mg NaOH ml Wasser In einem verschlossenen 100-ml-Reaktionsgefäss werden s 50 mg HSA, 200 mg Pluronic F-68 und 20,0 mg SnCl2 • 2H20 in 0.1 n-HCl in 50 bis 60 ml Wasser vermischt. Der pH der Mischung wird mit der Pufferlösung auf 6,9 eingestellt, anschliessend wird mit Wasser auf 100 ml verdünnt. Die schwach opalisierende Mischung wird wie im Beispiel 4 io mittels Mikrowellenofens erhitzt. Die kolloidale Lösung wird mit 99mTc-Pertechnetat markiert.

Biodaten, siehe Tabelle 5.

Beispiel 7

15 Pufferlösung: 5,0 mg Na2HP04 und 1,0 mg NaOH/ml Wasser

Man verfährt wie in Beispiel 6; pH-Einstellung auf 6,8. 1 Ampulle enthält:

0,5 mg HSA in Kolloidform 20 0,2 mg SnCl2 • 2H20 2,0 mg Cremophor EL 15,0 mg Dextrosè

0,25 mg wasserfreies Natriumphytat Na2HP04/Na0H als Puffer vor der Mikroaggregation 25 Biodaten, siehe Tabelle 5.

Tabelle 1

Mikrofiltration der 99mTc-markierten Produkte durch Nucleopore-Filter %-Verteilung der Teilchengrösse

Prod. Nr. 1

2

3

4

5

6

7

zum Vergleich

Kolloid nach Verfahren

Mischung nach Verfahren,

aber vor der Mikroaggregation lösliches HSA-Reagenssatz vom Handel

HSA-Kolloid vom Handel

Sb-S-Kolloid vom Handel

99mTc04~ vom Generator

>5 pm: 7,0%

>3 pm: 0%

5 bis 3 pm: 21,0%

3 bis 0,2 (im: 96,7%

>0,2 pm: 0%

1 bis 0,1 (im: 4,5%

3 bis 0,2 pm: 0%

> 0,2 pm: 0%

3 bis 0,2 pm: 68,0%

>0,2pm: 0,7%

> 0,2 pm: 2%

<0,2 pm: 3,3%

0,2 bis 0,03 pm: 100%

0,1 bis 0,03 pm: 3,5%

<0,03 (im: 92,5%

<0,2 pm: 100%

<0,2 pm: 98%

< 0,2 pm: 3,5%

<0,2 pm: 99,3%

<0,2 pm: 98%

Tabelle 2

Biodistribution der "mTc-markierten Präparate (30 Min. nach i.v.-Verabreichung) % applizierte Dosis, Mittelwert von 3 Tieren

Prod. Nr. 1

Herstellung Kolloid nach Verfahren

Kolloid nach Verfahren

Teilchengrösse (hauptsächlich im Bereich)

0,2-3,0 um 0,03-0,02 |im

Kolloid nach Verfahren kleiner als 0,03 (im

Mischung nach Verfahren,

aber vor der Mikroaggregation kleiner als 0,2 um lösliches HSA- HSA-Kolloid Reagenssatz vom Handel vom Handel kleiner als 0,2 |im breite Ver-teiluns (s. Tab. 1) 0,2-3.0 (im

Sb-S-Kolloid vom Handel kleiner als 0.2 (im zum Vergleich

99mTc04~ vom Generator kleiner als 0,2 um

7

652 599

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Biodistribution der 99mTc-markierten Präparate (30 Min. nach i.v.-Verabreichung) % applizierte Dosis, Mittelwert von 3 Tieren

Prod. Nr.

1

2

3

4

5

6

7

zum Vergleich

Biodaten

Ratten

Mäuse

Ratten

Mäuse

Blut

0,37

0,59

2,63

14,86

28,5

1,06

13,3

8,0

Lunge

0,19

0,18

0,27

0,78

2,1

6,15

1,9

1,2

Leber

81,48

78,78

80,04

29,87

15,7

78,78

66,5

6,8

Milz

2,20

1,45

1,76

0,55

0,5

1,58

1,2

0,3

Nieren

0,69

5,33 '

1,63

10,52

4,9

0,98

1,3

1,2

Magen +

Darmtr.

0,20

1,74

1,30

3,39

7,7

2,12

2,7

39,5

Knochen u.

Knochen

•

mark

6,07

8,89

10,10

14,64

27,9

2,66

9,1

5,0

Muskel

0,62

2,59

1,54

8,24

0,1

1,32

0,1

0,0

Harn

0,49

3,00

2,26

13,09

12,4

2,23

4,9

11,4

Tabelle 3

Biodistribution an Ratten 2 Stunden nach subkutaner Verabreichung % applizierte Dosis, Mittelwert von 2 Tieren

Prod. Nr.

8

9

10

11

5

7

12

zum Vergleich

Herkunft nach nach nach nach im Handel im Handel im Handel

99mTc04-

Verfahren

Generator

Anmerkung

HSA-Kolloid

HSA-Kolloid lösliches

Sb-S-Kolloid-

Schwefel-

freies

Sn-Reduk-

HSA-Sn-

für lymphati

Kolloid

99mTc-Per-

tionsmittel tionsmittel tionsmittel tionsmittel

Reagens-

sches System für lymphati technetat

Cremophor

Pluronic

Cremophor

Pluronic satz für

sches System

NaHC03/

Borax/NaOH-

Na2HP04/

Blutvolumen

NaOH-Puffer

Puffer

NaOH-Puffer

Injektions

stelle

47,7

56,46

56,58

51,20

63,91

52,66

71,95

3,40

(rechte

Fussferse)

Ln. popli-

teus.

- rechts

12,0

13,39

14,46

17,15

1,57

7,88

6,12

0,03

- links

0,006

0,007

0,005

0,002

0,001

0,002

0,0

0,01

Ln-ingui-

nalis

- rechts

0,02

0,006

0,003

0,026

0,005

0,0

0,01

- links

0,01

0,003

0,006

0,003

0,026

0,005

0,0

0,01

Ln-iliacus

ext.

- rechts

2,12

1,00

6,51

6,22

1,11

5,86

2,31

0,01

- links

0,10

0,002

0,003

0,02

0,04

0,002

0,0

0,00

Ln. renalis

rechts+

links

0,006

0,001

0,004

0,002

0,14

0,002

0,0

0,01

Blut

7,41

1,09

2,82

1,20

5,98

3,45

1,35

8,65

Leber

2,74

0,35

2,28

1,22

1,78

2,93

2,26

3,48

Milz

0,08

0,01

0,09

0,04

0,23

0,38

0,03

0,10

Nieren

4,20

1,88

3,42

1,71

3,79

0,99

0,92

1,52

652 599

Tabelle 4

Radiochromatographische Prüfsysteme für 99mTc-Kolloide

Rf-Werte Merck-SG Fertigplatte Whatman-ET31

0,9%ige Kochsalzlösung Aceton freies

Pertechnetat 1,0 1,0 gebundenes

Radionuklid 0,0 0,0

Tabelle 5

Zusammenstellung der Patentbeispiele Biodaten 30 Min. nach i.v.-Verabreichung Mittelwert von 3 Tieren

Beispiel Nr. 1

Kolloid HSA Reduktions- SnCl2'2H20 mittel Netzmittel

Puffer

Dextrose

NaHC03 + NaOH

HSA

Cremophor RH-40

Na2HP04 + NaOH

HSA

SnCl2-2H2<

Polyvinyl-pyrrolidon

Na-Tetra- HEPES + borat+NaOH NaOH

HSA

SnCl2-2H20

Cremophor EL

HSA

Pluronic F-88

Na2HP04 + NaOH

HSA

SnCl2 • 2H20

Pluronic F-68

Na-Tetra-borat+NaOH NaOH

HSA

SnCl2-2H20

Cremophor EL

Na2HP04

HSA

SnCl2-2H20

Pluronic F-68

Citronensäu-re + NaOH

pH vor dem 6,4 6,1 6,5 6,4 6,4 6,9 6,8 5,9

Erhitzen

Füllstoff lösliches HSA lösl. HSA lösl. HSA Dextrose Dextrose - Dextrose lösliches HSA

Stabilisator Na2HP04 Na2HP04 Na2HP04 Na-Phytat Na-Phytat - Na-Phytat Na2HP04

% Appi.

Dosis

(Maus)

Blut

2,78

3,10

3,41

1,61

1,18

1,10

1,82

4,36

Lunge

0,36

0,54

0,32

0,37

0,94

0,17

0,73

0,52

Leber

67,35

76,45

74,84

80,81

77,72

82,21

72,17

Milz

0,78

0,67

0,63

1,32

1,36

1,27

1,19

Nieren

6,04

1,83

3,00

0,96

0,62

0,61

1,56

1,91

Magen+

Darmtr.

3,62

2,27

3,65

1,07

1,12

1,29

0,85

2,34

Knochen-

und

Knochen

mark

5,65

4,80

6,02

4,81

3,18

7,90

?

5,00

Muskel

1,63

1,15

1,72

1,24

0,96

0,78

1,98

0,90

Harn

4,44

2,38

2,16

0,33

1,50

?

2,00

Beispiel 8

Pufferlösung: 5,0 mg Citronensäure-monohydrat + 1,0 mg Natronlauge/ml Wasser Man verfährt wie in Beispiel 6; pH-Einstellung auf 5,9. 1 Ampulle enthält:

0,5 mg HSA in Kolloidform 0,2 mg SnCl2 ■ 2H,0

so 2,0 mg Pluronic F-68

10,0 mg HSA als Füllstoff 10,0 mg Na2HP04 als Stabilisator Citronensäure + NaOH als Puffer vor der Mikroaggregation

55 Biodaten: siehe Tabelle 5.

60

s