MXPA97002523A - Agentes liposomicos - Google Patents

Abstract

En la presente invención se proporciona un agente liposómico que comprende liposomas que tienen unido a la membrana de los mismos un ion metálico, quelado, diagnósticamente o terapéuticamente efectivo, el agente quelante que se enlazan al ion metálico tiene una porción de quelante macrocíclico que tiene unida a un sóloátomo del anillo, de la misma, una porción de asociación a la membrana, lipofílica.

Description

AGENTES LIPOSOMICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevos agentes liposóp.icos, en particular a agentes que se pueden administrar parent eral ent e , que tienen grupos quelantes macroc icl icos , enlazados a la memorar.a, que transportan iones metálicos útiles diagnósticamente o terapéuticamente. Esos agentes liposópticos se pueden usar en terapia o como agentes mejoradores del contraste en modalidades para la formación de imágenes de diagnóstico, tales como la MRI, e s c int i ga f i a , rayos X y CT.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de agentes de diagnóstico en procedimientos de formación de imágenes médicas, está bien establecido. En MRI, los agentes de contraste genera J.mente derivan su agente mejorador del contraste, de la inclusión de un material que exhibe comportamiento paramagné t ico , ferrimctgnét ico , fer romagnét ico o REF: 24400 superparamagnét ico , por ejemplo un ion metálico paramagné t i co , quelado (tal como el Gd o Dy) o una nanopart icul a de óxido de hierro. Estos materiales afectan los tiempos de relajación característicos de los núcleos para la formación de imágenes, en las regiones del cuerpo dentro de las cuales se distribuyen, causando un incremento o disminución en la intensidad de la señal de MR.

En los rayos X y en CT, los agentes de contraste derivan su efecto de su capacidad para alterar las características de transmisión de rayos X de las regiones del cuerpo dentro de las cuales se distribuyen, y como resultado se ha propuesto el uso de iones metálicos pesados, quelados, que tienen mayores secciones transversales para rayos X, como agentes de contraste para rayos X. En escint igraf ia, el agente para la formación de imágenes es un radionúcl ido, por ejemplo un ion metálico radioactivo, quelado, generalmente un emisor de rayos gamma. Para terapia, también es bien conocido el uso de especies metálicas queladas, ya sea radionúclidos o metales que por si mismos tienen un efecto terapéutico, tales como el vanadio para la terapia de la diabetes. Aunque en medicina se han utilizado, durante mucho tiempo, quelatos metálicos diagnósticamente y terapéuticamente, aún existe la necesidad de agentes en base a quelatos metálicos con perfiles de t iodis t r ibución y de bioel iminación, mejorados . En la administración parenteral, los quelatos simples, metálicos de bajo peso molecuLar, solubles en agua, tales como los agentes de contraste para MRI, GdDTPA y GdDTPA-BMA, se distribuyen a través del fluido extracslular (ECF, por sus siglas en inglés) sin alguna especificidad para algún sitio en particular y se excretan rápidamente a través de los ri?ones mediante la filtración glomerular. Se han propuesto otros agentes que, debido a su naturaleza lipofilica o de forma de partículas, son sustraídos rápidamente de la sangre por el sistema re t iculoendo t el ial (RES, por sus siglas en inglés) o por los hepatocitos del higado, y de esta forma son adecuados como agentes hepatooiliares . Una aproximación para el desarrollo de un agente para el remanso sanguíneo, es decir un agente que permanezca dentro del espacio vascular durante un periodo prolongado suficiente para expandir o prolongar el tiempo disponible para la formación de imágenes, ha sido usar macromoléculas de pol i quel atos , solubles en agua, con pesos moleculares por encima del umbral del riñon. Otra aproximación en el esfuerzo para desarrollar agentes específicos para sitios, ha sido acoplar quelatos, por ejemplo monoquelato s , ol igoquelatos o po 1 i que 1 ato s , a una molécula dirigida al sitio, usualmente una macromo lécula . De esta forma, se han acoplado, por ejemplo, quelatos de gadolinio, a albúmina y a inmunoglobul inas . Sin embargo existen varias desventajas en esta aproximación. Se requiere un gran número de iones quelados metálicos por macroe truc tura . En donde un gran número de quelatos se acoplan a una molécula dirigida al sitio, su especificidad al sitio se puede reducir. Al controlar los procesos de separación para dar niveles de carga de metales, reproducibles , es difícil obtener productos homogéneos y alta especificidad al blanco u objetivo, y esos procesos son costosos. Las rutas de excreción y metabólicas para esos agentes son complejas y no están bien entendidas. El estudio científico y la documentación requerida para rastrear todos los metabolitos potenciales producidos por la eliminación en el RES, seria extensa. De esta forma, no es sorprendente que, hasta la fecha, en las pruebas clínicas no haya agentes de contraste en base a gadolinio macromolecular. Dado que ' las partículas inyectadas son captadas rápidamente por el RES, también ha sido sugerido ampliamente el uso de agentes de contraste, liposómicos. El término liposomas, se usa en la presente para referirse a partículas que tienen una o más membranas encapsul antes , formadas por moléculas anfifilicas (tales como por ejemplo lipidos) y en particular partículas que tienen una membrana de dos partículas y un núcleo acuoso encerrado, que son portadores versátiles para el suministro o entrega especifica al sitio, de los agentes terapéuticos y de diagnóstico. Estos se pueden usar en órganos específicos que se eligen selectivamente como blanco, tales como el hígado, bazo, riñon, sistema linfático, y médula de los huesos, o pueden ser retenidos en la vasculatura. La composición y tamaño de los agentes liposónicos se pueden seleccionar para controlar su bio istribución y, dado que se puede utilizar como e .. volumen de las moléculas formadoras de la membrana, fosfolipidos naturales, su transformación por metabolismo y la eliminación de los metabolitos puede poseer mucho menores problemas que en el caso de los reactivos macrom leculares . Los agentes liposómicos generalmente caen dentro de dos categorías: una primera en donde el liposoma se usa para atrapar un agente terapéutico o de diagnóstico usado, dentro de la cavida acuosa central; y una segunda categoría en donde la entidad deseada se encuentra atada a la membrana liposómica como resultado de incluir un grupo "de anclaje" hidrofóbico, el cual se incorpora en la membrana. Se han sugerido ambas formas en relación a los agentes para la formación de imágenes. La presente invención concierne a agentes liposómicos en los cuales, porciones de quelatos metálicos se encuentran atadas a la membrana liposómica . Los quelatos atados a la membrana, previamente sugeridos, han involucrado, en general, grupos quelantes lineales, tales como el DTPA, en donde una o dos de las funciones quelantes se han derivado para unirse a grupos de anclaje lipofilicos. Los ejemplos incluyen la dipalmi toil fos fat idi le tanolamina (PE) : DTPA-quelantes anhídridos de Karlik et al. (ver Mag. Res. Med. 19_: 56-66 (1991)), las DTPA-dies tear i lamidas de Hnato ich et al. (ver J. Nucí. Med. 22_: 810-814 (1981)), los esteres de DTPA-es tear ilo de Tilcock et al. (ver Mag. Res. Med. _7_: 44-51 (1992)) y los diferentes grupos lipofilicos dobles que transportan quelantes, de Unger et al. (ver la WO- 92 / 21017 ) . Además de los quelantes lineales que transportan grupos de anclaje, lipofilicos, Unger (supra) también sugirió el uso de quelantes macroc í cl icos N4 que transportan grupos lipofilicos en dos nitrógenos opuestos del anillo. La ruta sintética descrita para preparar los quelatos anclados, dobles, da por resultado una mezcla de productos que no es la 1,7-diamida reportada. Una ruta sintética para el isómero 1 , 7-di -substituido seria mucho más complicada. Por ejemplo, el método descrito por Dumont (Tetrahedron Lett. 35 (22), 3707) . Además, la eficacia quelante se perjudica severamente. Dado que los liposomas se eliminan del cuerpo mediante el RES por lo cual se exponen al medio o ambiente ácido gue se encuentra dentro de las células del hígado, son necesarios complejos altamente estables para evitar la retención, a largo plazo, del gadolinio. En la presente se ha encontrado que la eliminación del metal se optimiza mediante el uso de las porciones del quelante macroc:. cl i co , unidas a la membrana, que tienen un grupo de anclaje lipofílico unido solamente a un átomo del anillo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se ha descubierto que la utilización y la eliminación de metales se optimiza mediante el uso de porciones de quelante macroc:. cl ico , unidas a la membrana, que tengan un grupo de anclaje lipofilico, unido solamente a un átomo del anillo, el quelante macrociclico y los grupos de anclaje se encuentran preferentemente anclados unos con otros, en forma ventajosa via un enlace biodegradable, después de la formación del liposoma .

Vista desde otro aspecto, la invención proporciona por lo tanto un agente liposómico que comprende liposomas que tienen unido a una membrana de los mismos un ion metálico efectivo diagnósticamente o terapéuticamente, quelado, el agente quelante que enlaza el ion metálico tiene una porción quelante macrociclica que tiene unida a un sólo átomo del anillo, de la misma, una porción de asociación de la membrana lipofilica. Como un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende un compuesto formador de la membrana del liposoma y un compuesto mejorador del contraste, en donde el úl:imo comprende una porción de quelante macroc.Lclico que tiene unida a un sólo átomo del anillo, de la misma, una porción de asociación a la membrana lipofilica, a partir de las cuales se pueden producir las composiciones liposómicas. La invención es particularmente importante porque proporciona composiciones liposómicas con una eliminación mejorada del componente mejorador del contraste, del hígado. Eventualmente los liposonas son reconocidos por el RES, son captad s hacia las células por la fagocitosis y son depositadas todas en el hígado. Los mecanismos por los cuales los quelatos son eliminados del hígado no están bien comprendidos. Los materiales hidro fóbicos , insolubles en agua, tales como el GdTPA-SA, permanecen en el hígado indef i idamente . La mayoría de los complejos solubl s en agua tienen una vida media de eliminación del hígado, de 6 a 8 días. En la presente se ha encontrado, sin embargo, que la incorporación de ciertas porciones en la estructura del agente de contraste, acelera la eliminación en el hígado. Por ejemplo, los quelat s de gadolinio con anillo de fenilo tienen una eliminación mejorada en el hígado, respecto a los complejos alifáticos simples. Una mejora adicional en la eliminación se puede logar por la presencia de uno o más grupos ionizables (tal como carboxilato o sulfonato) en un anillo de fenilo. El grupo mejorador de la eliminación se puede incorporar en la estructura del agente de contraste, en la forma de un grupo de anclaje, un grupo enlazante o como un producto de biodegradación de un grupo de anclaje o de enlaz amiento. La porción de quelato macrocí cl ico , en el compuesto de mejoramiento del contraste, es preferentemente hidrofílica y esta opcionalmente cargada electrostáticamente cuando se encuentra in s i tu en los liposomas. Como resultado, la porciór quelato se encontrará ubicada fuera de la capa o de las capas de lípido de la membrana 1 iposórr.ica . Aunque la invención permite que el quelatc se encuentre fuera de la membrana liposóp.ica o dentro del volumen acuoso del núcleo 1 iposóp.ico , se prefiere especialmente que la porciór quelato esté ubicada en forma pre f ere ncial , predominante o substancialmente, en forma total, en el exterior de los liposomas. Este es particularmente el caso en donde se pretenc.e que la especie quelada funcione como un agente de contraste Ti - MR, positivo. Visita desde un aspecto adicional, la adición proporciona un proceso para la preparación de un agente de contraste liposómico, de conformidad con la invención, en donde el proceso comprende uno de los siguientes pasos (a) transformar una composición que comprende un medio portador acuoso, y un compuesto formador de membrana liposómica y un compuesto quelante macroc ícl ico , opcione lmente metalizado, que tiene un grupo de asociación a la membrana hidrofóbica, unido a un átomo del anillo del macrociclo, en una composición liposómica y si se requiere después, metalizar el compuesto quelante, y (b) acoplar un compuesto quelante macrocí c 1 i co , opcionalmente metalizado, a un compuesto de anclaje que tenga una porción hidrofóbica incorporada en una membraia liposómica de un liposoma, y si se requiere metalizar después el grupo quelante. La formación de los liposomas y la metalización del quelante se puede efectuar a través de medios convencionales que se discuten posteriormente y el acoplamiento del quelante: ancla se puede efectuar también a través de reacciones de acoplamiento convencionales que usan quelantes y compuestos de anclaje, adecua amente funcionalizados, y si se desea activados, opcionalmente en forma conjunta con un agente de enlazamiento bifuncional. Las composiciones de agentes de contraste, liposó icos, de la invención, se pueden usar en procedimientos para la formación de imágenes de diagnósticos y por lo tanto, la invención también proporciona, en un aspecto adicional, un método para cfenerar una imagen mejorada de un cuerpo humano o no humano, preferentemente de un mamífero, el cual involucra la administración parenteral a ese cuerpo, en particular la administración a la vasculatura sistémica, de un agente de contraste y la generación de u a imagen de al menos una parte de ese cuerpo, y la mejora comprerde administrar como ese agente, un agente liposón.ico de conformidad con la invención. Visita desde un aspecto aún adicional, la invención también proporciona el uso de un quelant.e macrocíclico o de un quelato o sal del mismo, para la fabricación de un agente de contraste liposómico, de conformidad con la invención, para el uso de la formación de imágen s para diagnóstico. Dado que está bien establecido que se pueden producir liposomas bio tolerabl es , y dado que los agentes de contraste liposómicos, in vivo , de conformidad con la invención, biodegradar ían , simplemente a los componentes de los liposomas (la membrana y la especie formadora del núcleo) y la especie mejoradora del contraste o los metabolitos de la misma, el diseño de agentes liposómicos con metabolitos fácilmente caracterizados cuya biodi s tr ibución y bioel iminación se pueda también investigar fácilmente, es más simple y más directo que el diseño de un agente acromolecular. El agente quelante en el agente liposómico de la invención es así una especie bifuncional, que tiene una porción quelante y una porción de anclaje a la membrana, unida a la misma vía un enlace o una porción enlazante. En forma ventaj sa, la porción enlazante incorporara un enlace biodegradable de tal forma que moléculas de quelato con bajo peso molecular se puedan libera:: de los liposomas, ya sea antes o después de que ocurra la degradación del liposoma, para facilitar su bioeliminación. Para este propósito se pre::iere especialmente que la porción quelato, opcionalmente en forma conjunta con su residuo posdegradación de la porción enlazante, sea soluble en agua. Esos compuestos de anclaje-enlazante biodegradable- quelantes macrocíclicos, sus sales y complejos de quelato, son por sí mismos novedosos y forman un aspecto adicional de la invención. En forma preferentemente particular, la invención enlazante surgirá, al menos en parte, de la reacción para acoplar un quelante macroc.Lclico a una molécula de anclaje, lipofílica. Así, aunque el anclaje lipofílico-quelato macrocíclico se puede preparar antes de que se efectúe la formación de los liposomas, se prefiere especialme te que esos compuestos se preparen in si tu mediante el acoplamiento de un quelante macrocíclico, o en forma más especial un quelante lacrocícl i co metalizado, a una molécula que ya esté incorporada a la membrana liposómica. Asi, una clase especialmente preferida de moléculas quelantes son aquellas de la fórmula generad. I An - L- Ch (R I) en dor.de An es un grupo de asociación a la membrana, hidrofóbico, L es una porción enlazante, unida a un átomo del anillo de Ch y que se puede separar en un enlace biodegradable, y Ch es una porción de quelante macrocíclico que opcionalmente lleva. uno o más grupos R hidrof Micos o dirigidos a un sitio (es decir, n es 0 o un número entero positivo) . En una modalidad alternativa, el agente quelante es un compuesto anfifílico tal como se descrioe en la PCT /GB95/ 00833 (de la cual una copia del texto se presenta con la presente invención y los contenidos de la cual se incorpora en la presente como referencia), es decir, un compuesto de la fórmula II (R) „ChL' -Ar- ( AH ) q ( II ) en donde (R)„Ch es una porción de quelante macrocíclico, hidrofílico, como se definió anteriormente, L' es una porción de enlazante de alquileno de 2 a 25 átomos de carbono, opcion lmente oxo-subs t i tuida , unida a un átomo del anillo de Ch y en la cual al menos una porción CH2 está reemplazada por un grupo oxa, aza c tia, en la que esta opcionalmente interrampida por un grupo biodegradable M, Ar es un anillo de arilo opcionalmente substituido por, o que tiene fusionado al mismo, un anillo de arilo adicional, q es un número entero positivo, preferentemente 1 o 2, y cada AH es un grupo ácido prótico, por ejemplo carbono, azufre u oxácido fosforoso. La porción quelante Ch(R)n es convenientemente un grupo de la fórmula (XN(CHR?)«)p en donde p es 3, 4, 5 o 6 preferentemente 4; cada m es 2, 3 o 4, preferentemente 2; cada Bi es un átomo de hidrógeno, un grupo hidrofílico, o un grupo dirigido al sitio; y cada X es un grupo Ri o un grupo de coordinación metálico, que tiene, sin embargo, un carbonc o nitrógeno unido al grupo Rx, proporcionando un enlace a la porción de enlazan iento . Los. ejemplos de grupos de coordinación preferidos incluyen los grupos alquilo lineal de 1 a 3 átomos de carbono, substituidos por grupos carboxilo, fosfonato o sulfonato, y opcionalmente substituidos en forma adicional por uno o más grupos Ri . Particularmente preferidos son los grupos carboximet i lo y fos fonome t i lo . Los ejemplos de grupos hidrofílicos preferidos incluyen los grupos alquilo hidroxilado y/o alcoxilado, por ejemplo los grupos hidroxime t i lo , 2 -hidroxie t i lo , 3-hidroxipropilo, 2,3-dihidroxi-propilo, y 2 -hidroxi etoxi etilo. En las porciones quelantes y de enlazamiento , a las que se hace referencia en la presente, al menos que se indique de otro forma, las porciones alquilo y alquileno, tienen preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono. Asi, las porciones quelantes preferidas incluyen grupos de la fórmula (en donde cada m es 2, 3 o 4, preferentemente 2; cada R2 es hidrógeno o un grupo alquilo substi:uido por al menos un grupo hidroxi, alcoxi, amino, oxo, carboxilo, ácido sulfónico, bromoacilo, i sot ioci anato o un grupo dirigido al sitio, y substituido opcionalmente por, o que incorpora un, anillo homocíclico o heterocí cl ico , satura o o insaturado; y cada Z es un grupo C02H, P03H, C0N(R2)2 o R2, al menos 2 y preferentemente todos los 3, son los grupos COOH o P03H; y un grupo R2 que es un enlace que se encuentra en la porción enlazante) . Los grupos quelantes especialmente preferidos incluyen los residuos de D03A y de DOTA, por e j empl o R,ZCH | LCHUjZ «ßZCH | ,CHR,Z / | ^ SCHH,Z — CHZ | | CHR,Z Z (en donde cada Z es COOH o P03H, preferentemente COOH y cada R2 es hidrógeno o un grupo hidrofílico, por ejemplo un grupo monohi roxialquí lico o pol ihidroxialquí 1 ico ) . En forma particularmente preferente los residuos de quelantes son residuos de D03A simples, de la fórmula y monoamidas de D03A tales como las que se describen en la WO 95/24225 en la PCT/GB95/00833. El grupo "de anclaje" hidrofóbico, usado para atar la porción quelante a la membrana liposómica puede ser cualquier grupo hidrofóbico que pueda servir para esta función. Generalmente comprenderá una o más, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 pero preferentemente 1 o 2, cadenas lipofílicas, o grupos monocíclicos o pol icícl icos , saturados o insaturados, en donde los últimos están opcionalmente substituidos por grupos alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, ramificados o lineales, opcionalmente insaturados, átomos de flúor o grupos carbono, azufre o de oxácido fosforoso, o esteres o amidas de los mismos, por ejemplo esteres alquílicos de 1 a 20 átomos de carbono o alquilamidas en las que los grupos alquilo están opcionalmente insaturados o fluorados. Los grupos de anclaje, de una sola cadena, en los agentes quelantes de la fórirula II anterior deben ser plegados, cuando se encuentran in s i tu en el liposoma, para presentar los grupos (R)nCh y Ar(AH)q, sobre la superficie de la membrana y en donde el enlazante L', plegado, actúa como el ancla de asociación a la membrana . Los ejemplos de grupos cíclicos adecuados incluyen el fenilo, difenilo, naftilo, grupos heteroarilo que contienen 0, N o S, de 5 a 7 miembr s, grupos esteroidales, etc. Ejemplos de grupos lineales hidrofóbicos, adecuados, incluyen los grupos de 12 a 18 átomos de carbono, saturados, insaturados o fluorados, por ejemplo los grupos alquilo per fluorados . De la literatura se conocen muchos grupos de anclaje, adecuados. Ver por ejemplo Kinski en Biochim Biophys Acta 769 : 543 (1984), Kung en Biochi Biophys Acta 862 : 435 (1986), Gregoriades en Biochem Soc. Trans. 1_7_: 128 (1989), Wessig en Biochim Biophys Acta 1003 : 54 (1989), Dancy en J. Immunol 122 : 638 (1979), Carroll en J. Med. Chem 29: 1821 (1986), Unger en WO92/21017 y Herlóf en W092/21384. Ejemplos preferidos de fosfolipidos que pueden ser usados como grupos de anclaje, en esta forma, se incluyen las amidas del ácido a, ojal cano -dicarboxí 1 ico de fos fat idi le taño laminas (PE) por ejemplo, dioleoil-PE, dipalmi toi 1- PE u otros PE portadores de cadenas de ácidos grasos (tales como el N- succini 1 -PE , N- glut ami 1 - PE y N-dodeceni 1-PE ) y amidas del colesterol. En una modalidad preferida de la invención, el grupo de anclaje se acopla a la porción quelato después de que se ha efectuado la formación del liposoma. Para este propósito, se usan compuestos de anclaje que se incorporan en la membrana del liposoma dejando un grupo funcional (para la unión directa o indirecta del quelato) en el exterior de la membrana. Esos compuestos incluyen convenientemente una porción separadora o espaciadora, que en forma especial y conveniente es de naturalez-a anfifí-.ica, entre el grupo de anclaje y el grupo de unión al quelato. Ejemplos de esos compuestos incluyen los compuestos de las fórmulas II a la V posteriores R3 -•(C)„-Xl(CH2)r(Xa)ß - Y - Zi I (II) o Ar' O - Y - zx (III) (en donde cada R3 es, en forma independiente, un grupo alquilo de 12 a 18 átomos de carbono, saturado, insaturado o perfluorado; w e s 0 o 1 ; cada XL es, en forma independiente, un enlace, un átomo de oxígeno o azufre, o un grupo NH; r es 0, 1, 2, o 3; s e s 0 o 1 ; X2 es un enlace, un átomo de oxígeno o azufre, o un grupo NH o -0P03H-; Y es un grupo (CH2)t, (CH2CH20)t/ (CH2)t Xi-Ar ' -Xi (CHa) t o (NHCH2C0)t; cada t es un número entero de 0 a 12; cada Ar' es un grupo fenilo, difenilo, naftilo, o heteroarilo que contiene O, N o S de 5 a 7 miembros, substituido opcionalmente por los grupos COOH, S03H, P03H, P02H o C00R3; Zi es un grupo C02H, NH2, COO- succinimida , aleimida, tiol, COCH2R4, Ar' NCS, Ar ' N3, Ar ' NCO o CHO; y R4 es an grupo OTs o OMs, I, Br o Cl) . El grupo de enlazamiento en los conjugados de ancla: quelato puede ser cualquier grupo que sirva para conectar el grupo (o grupos) de anclaje hidrofóbico, que se entierra (n) en la membrana del liposoma, con el grupo quelato que esta fuera de la membrana. Dependiendo del modo de fabricación del liposoma que lleva el quelato, el grupo enlazante puede o no contener grupos que sean el resultado de la conjugación del compuesto de anclaje: compuesto quelato; sin embargo este será generalmente el caso. En forma similar, estos pueden incluir o no, aunque preferentemente lo harán, secciones hidrofílicas, o en forma más preferente anfifílicas, que servirán para separar el grupo quelato de la superficie de la membrana. Además el grupo de enl az amiento incluirá preferentemente una función biodegradable que se puede separar para liberar moléculas de quelato (el término molécula, tal como se usa en la presente, incluye una especie cargada o una especie no cargada) para facilitar su bioeliminación o, quizá en el caso de la terapia, para facilitar la liberación del metal terapéutico en el sitio de interés. LOÍS ejemplos de funciones biodegradables adecuadas incluyen los enlaces éster, carbamato, doble éster y disulfuro. Los dobles enlaces éster, es decir enlaces de la fórmula -O-CO-0-CH2-0-C0-0- de la cual uno o ambos oxígenos terminales se pueden omitir y en la que el grupo metileno se puede substituir, son particularmente adecuados como enlaces biodegradables. De esta forma, la porción de enlazamiento , comprende convenientemente una cadena de alquileno de 2 a 20 átomos de carbono, lineal o ramificada, terminada o interrumpida, opcionalmente, por átomos de N, O, S y P, o por anillos homocíclicos o he t erocí cl icos , saturados o insaturados, y substituidos opcionalmente por átomos de oxígeno o flúor, o por los grupos hidroxi, amina, alcoxi, imino, alquilo o arilo, y los grupos alcoxi, imino, alquilo o arilo se encuentran opcionalmente substituidos por los grupos hidroxi, amina o alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono . En donde los grupos de enlazamiento estén unidos a heteroátomos del anillo, del grupo de anclaje o de las porciones quelato, el átomo terminal del enlazante será generalmente carbono. Para macrociclos N4Ci2, similares al D03A y DOTA, la unión es preferentemente vía, un nitrógeno del anillo, por ejemplo vía el residuo de un grupo N-carbox imetilo o de un grupo NH del anillo, aunque en forma menos preferente, la unión puede ser en un carbón del anillo, por ejemplo, usando quelatos C-ar al qui 1- subs t i tuidos tales como aquéllos propuestos por Meares et al. (ver Bioconjugate Chem. 3_: 563 (1992)) para la reacción de acoplamiento de ancla: quelato. La molécula del quelato, para esas reacciones de acoplamiento transporta o lleva preferentemente una cadena lateral reactiva (preferentemente unida a un nitrógeno del anillo) que tre.nsporta o lleva un grupo reactivo tal como un grupo carboxilo, tiol, NCS o amina. La cadena en la cual se lleva éste es convenientemente un grupo alquileno de 1 a 20 átomos de carbono opcionó.lment e interrumpido por un grupo arilo o por átomos de N, O o S, y opcionalmente substit.uido por oxo, alquilo o flúor, por ejemplo -C0NHCH2CH2NH2, o C0NHCH2CH2NHC0 ( CH2 ) 3COOH . Los grupos tales como éstos pueden formarse facilitante en un DOTA o D03A N- carbox imet i lo o en un sitio -NH- . Para los agentes quelantes de la fórmula II anterior, los ejemplos de estructuras L' de enlazamiento, preferidas, incluyen (CH2)d0 en donde d es un número de 1 a 15, en donde Ar es bicíclico y de 6 a 15 en donde Ar es monocíclico, y los grupos Ar (AH)q preferidos incluyen el 4-carboxi feni lo y el 3 , 5-bi s-carboxi feni lo . Los agentes quelantes, particularmente preferidos, de la fórmula II incluyen los siguientes Nombre (R)nCh L' Ar(AH)q D03A DOBA DO3A (CH2)10 0* 4-carboxifenilo D03A DOIA DO3A (CH2)?o 0* 3, 5biscarboxifenilo DO3A DOmBA D03A (CH2)?o 0* 3-carboxifenilo - D03A OOBA DO3A (CH2)ß 0* 4-carboxifenilo DO3A HOBA D03A (CH2)6 0* 4-carboxi fenilo DO3A DOoBA DO3A (CH2)10 0* 2-carboxi fenilo oxigeno unido a Ar La selección de los metales que se van a quelar por la porción quelante, dependerá por supuesto del uso final deseado de los agentes liposómicos de la invención, pero serán generalmente de un metal paramagnét ico , pesado o radioactivo, sólo o en agupamientos poliatómicos.

Los agentes liposómicos incluirán generalmente, además de las moléculas de ancla : quelato , compuestos formadores de la membrana del liposoma, es decir lípidos, y en particular fos fo 1 ípidos , así como los materiales que forman el núcleo del liposoma y su entorno externo, generalmente, en cada caso, un medio acuoso . Los liposomas, en sí, son vesículas esféricas que tienen una capa de lípido que rodea un espacio central. La presente invención concierne particularmente a liposomas unilamelares y muí t i lamelares que tienen respectivamente una sola capa doble del lipido o múltiples capas dobles de lipido rodeando un núcleo acuoso. Los liposomas forman espontáneamente, al dispersarse los lípidos, particularmente fos fol ípidos , en medios acuosos y la estructura liposómica de los agentes de la invención se puede producir mediante técnicas convencionales. A esas técnicas convencionales se hace referencia en la O92/21017 (Unger) y en Papahadj opolus en Ann Rep. Med. Chem. 1_4_: 250-260 (1979) e incluye la evaporación inversa, la congelación-descongelación, la diálisis con detergentes, la homogenei zación, la sonicación o aplicación de energía sónica, la microemul s i f icación y la formación espontánea mediante la hidratación de una película de lípido, deshidratada. Los liposomas muí ti lame lares se pueden usar de conformidad con la invención o se pueden convertir en liposomas con una lamelaridad inferior, o en liposomas uní 1 amelares , mediante métodos conocidos. Los liposomas unilamelares también se pueden preparar directamente. Las preparaciones de liposomas típicamente son de tamaño heterogéneo y los liposomas se que usan de conformidad con la invención se pueden dimensionar hasta el diámetro deseado, mediante técnicas conocidas, por ejemplo extrusión, congelación-descongelación, fragmentación mecánica, homogenei zación y aplicación de energía sónica. Los liposomas usados de conformidad con la invención son, de forma ventajosa, de 20 a 5,000 nm de diámetro, unilamelares o muí t i lamel ares . Los liposomas se pueden liofilizar para incrementar la vida en anaquel y los liposomas liofilizados se pueden reconstituir mediante la agitación vigorosa con amortiguador acuoso, antes de su uso. Las formulaciones pueden incluir agentes que sirvan para estabilizar el material liposómico para el procedimiento de 1 io f i 1 i zación . Los liposomas más pequeños que 200 nm se pueden esterilizar después de la formulación, mediante la filtración a través de un filtro de 0.2 µm . Los lipidos usados como las moléculas formadoras de la membrana liposómica son típicamente fosfolipidos o fosfolípidos hidrogenados tales como las fos fat idi 1 col inas (lecitinas) (PC), las fos fat idi let anol aminas (PE), las 1 isoleci tinas , las 1 i sofo s fat idiletanolaminas , las fos fat idi 1 ser inas (PS), los fosf at idilgliceroles (PG), el fos fat idi linosi tol (Pl), las es f ingomiel inas , la cardio lipina, los ácidos fosfatídicos (PA), los ácidos gasos, los gangl iósidos , los glucol ípidos , los gl icol ipidos , los monogl icéridos , diglicéridos o t riglicéridos , las ceramidas o los cerebrósidos, naturales o sintéticos, por ejemplo los compuestos formadores de la membrana liposómica tales como los que se describen el la WO-92/,21017. Los lípidos formadores de la membrana también pueden comprender lípidos polimerizables, por ejemplo lípidos de metacrilato, lípidos de tiol y de disulfuro, lípidos de dienoato, lípidos de estirilo y lípidos diace t i lanicos , como lo describe Johnston en Liposome Technology Vol. I, Gegoriades Ed., páginas 123-129 (1983) y Singh en Phosphol ipid Handbook, Cevc Ed., Dekker, páginas 233-29L (1993) y las referencias que se encuentran en los mismos. El uso de lípidos polimerizables en la formación de liposomas, proporciona una ruta para incrementar la estabilidad de los líposomas. La membrana liposómica también puede tener esferoides y otros compuestos, incorporados en la misma, por ejemplo para afectar la biodi str ibución del liposoma. Los esteroides adecuados incluyen por ejemplo el colesterol, los derivados del colesterol, el colestano, el ácido cólico, y los ácidos biliares, pero particularmente el colesterol. La inclusión de esteroides sirve para modificar la fluidez de la membrana liposómica y esta afecta la biodis t ribución . Así, los lípidos con temperaturas de transición mayores conducen a vidas medias en la sangre, más largas, y la inclusión del colesterol da por resultado una capa doble menos permeable y más rígida. Con la adición del colesterol se observa una disminución en la captación por el RES. Se pueden incorporar modificadores de la biodi s r ibución, mediante el uso de un derivado de fosfolipido que tenga una función colgante, modificadora de la biodi str ibución , mediante el uso de un agente modificador de la biodi str ibución que tenga una porción "de anclaje" hidrofóbica que se asocie a la membrana liposónica o mediante el acoplamiento de un modificador de la biodi s tr ibución a una molécula de anclaje (tal como las que se discutieron anteriormente con relación a la atadura del quelato) presente en la membrana liposómica. Los modificadores de la biodi s tribución , particularmente preferidos, incluyen los compuestos, especialmente los polímeros anfifi lieos, que sirven para reducir el enlazamiento de proteínas, in vivo, al liposoma, y prolongar así la vida media de los liposomas con la sangre. En este aspecto son efectivos los polímeros de pol i alqui lenoxi , tales como el pol iet i lengl icol (PEG) y gangl ios idos , tales como e 1 Gm.? . La incorporación de 1 a 10 %, con relación al peso del material formador de la membrana del liposona, de derivados de PEG-PE, extiende así, en forma significativa, la vida media en la sangre . Los liposmas preparados a partir de fosfolipidos perfluorados (ver Santaella, PEBS Letter 336 : 481-484 (1993) y Angew, Chem. Int. De. Eng. 3_0: 567-568 (1991)) pueden extender o prolongar también las vidas medias en la sangre.

El envió dirigido, activo, hacia órganos o tejidos, específicos, se puede logar mediante la incorporación de lípidos con anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos, unidos a los mismos, que sean específicos para los antígenos asociados con el tumor, lecitinas o pépt idos . La biodi s tribuci ón de los liposomas también es significativamente dependiente de la carga de la superficie y los liposmas de conformidad con la invención pueden incluir, en forma deseable, de 1 a 10 %, con relación al peso del material formador de la membrana de los liposomas, de fosfolipidos cargados negativamente, tales como por ejemplo fosfatidilserina, fos f at i dilgl iceroles , ácidos fosfatídicos y fosfatidilinositol . Como se discutió anteriormente, los metales queladcs se pueden atar a los liposomas en varias formas, por ejemplo: (i) mediante la metalización de grupos quelantes atados o unidos a la superficie de liposomas preformados; (ii) mediante el acoplamiento de porciones quelatc a moléculas de anclaje en liposomas preformados ; (iii) mediante la formación de liposomas usando una mezcla de lípidos que incluya moléculas de quel ato : ancla . Todos los tres métodos representan aspectos de la presente invención. Estos procesos simplifican el procedimiento para preparar agentes de enlazamiento a la membrana, evitando la síntesis y purificación de quelatos hidrofóbicos (implícitos en el proceso iii ) ) y evitando el débil enlazamiento no deseado (fácilmente inversible in vivo ) del metal al liposoma que esta asociado con el proceso (i) . Cono se mencionó, los liposomas de la invenc ón se producen preferentemente mediante el acoplamiento de moléculas de quelato, metalizadas, a moléculas de anclaje, en liposomas preparados previamente. En esta forma el que Lato se enlaza solamente al exterior de la membrana del liposoma. Los liposomas que se forman con quelatos derivados tienen el complejo unido t.anto en el interior como en el exterior de la membrana. La permeabilidad al agua, de la membrana, o la velocidad de difusión del agua en masa, a través de la membrana, determinará las caract rísticas de relajación de los iones paramacfné t i eos internos. Con liposomas herméticos, estables, las características de relajación del gadolinio, dentro del liposoma, pueden ser muy bajas. De esta forma, cuando los grupos quelato están atados solamente al exterior del liposoma, se optimiza la eficiencia del uso del metal, es decir los liposomas tienen altas características de relajación, por ion metálico.

Tener los quelatos enlazados solamente al exterior de los liposomas es también una ventaja para los radionúcl idos de enlazamiento, especialmente los emisores de rayos a, dado que la membrana del liposoma no tiene que ser penetrada por los rayos a. De esta forma, los liposomas se pueden preparar a través de un método convencional a partir de una mezcla de fosfolípidos que incluya el compuesto de anclaje, un compuesto que tenga una porción de anclaje, hidrofóbica, atada a un grupo funcional reactivo que proporcione un punto de unión para la porción quelato. Luego los liposomas se pueden dimensionar al diámetro requerido, a través del método conocido. El grupo funcional reactivo se acopla después a un grupo funcional compatible, sobre el quelato, y el agente de bajo peso molecular, sin reaccionar, se puede eliminar fácilmente, por ejemplo mediante cro at ogaf í a con permeación en gel, diálisis o ultra filtración. El compuesto ' de anclaje comprende convenientemente de 5 a 50 %, en relación al peso total de los compuestos formadores de la membrana del liposoma, preferentemente de 10 a 30 % . La eficiencia de acoplamiento, del quelato a los grupos reactivos externamente dirigidos, puede ser tan alta como por ejemplo de aproximadamente 90 % . Los grupos reactivos que están sobre el compuesto de anclaje pueden ser simplemente aminas primarias sobre un lipido de la membrana del liposoma, que se pueden hacer reaccionar con un grupo carboxilo no coordinante, de una molécula de quelato. En general, los métodos más conocidos de acoplamiento de quelatos a macromoléculas, tales como las proteínas, se pueden usar para la unión de quelatos a liposomas. La química de superficies estará sin embargo limitada por la estabilidad de liposomas y por lo tanto puede ser deseable la inspección del pH y de la osmolalidad de la mezcla de reacción. Unos cuantos ejemplos de estrategias de acoplamiento se ilustran posteriormente en forma esquemática : Como una alternativa para acoplar quelatos a grupos de anclaje, en el liposoma, los grupos de anclaje se pueden acoplar al quelato antes de la formación del liposoma. El quelante se metaliza en solución acuosa y luego el quelato se acopla a la molécula de anclaje a través de métodos convencionales usando un solvente mezclado. Luego se forma el liposoma usando una mezcla de lipidos que incluye las moléculas de quelato:grupo de anclaje. Esto evita dificultades con el enlazamiento no específico de iones metálicos a liposomas, el cual puede ocurrir cuando los quelatos se metalizan in s i t u sobre la superficie del liposoma, así como problemas de solubilidad asociados con quelantes insolubles en agua, metalizantes, antes de la formación del liposoma. Los iones metálicos también sirven como grupos protectores durante la formación del liposoma para grupos quelantes po tenc ialmente activos. Para producir las composiciones para medios de contraste, de la invención, los liposomas se formulan en un medio portador liquido, fisiológicamente tolerable, por ejemplo una soluci n acuosa que pueda incluir uno o más aditivos, tales como agentes modificadores del pH, agentes quelantes, antioxidantes, agentes modificadores de la tonicidad, cr iopro t ec tor es , agentes de contraste adicionales, etc. Ejemplos de ingedientes adecuados para ajusta:: el pH, incluyen los ácidos, bases y amortiguadores-, fisiológicamente tolerables, tales como el ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorhídrico, ácido málico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, o ácido tartárico, el amoniaco, carbonato de amonio, die t anol amina , di i sopiopanolamina, hidróxido de potasio, bicarbonato de sodio, borato de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, trolamina, fosfato de amonio, ácido bórico, ácido cítrico, ácido láctico, metafosfato de potasio, fosfato monobásico de potasio, acetato de sodio, bifosfato de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio, Tris, y N-me t i lglucamina . Ej mplos de agentes quelantes, adecuados, incluyen el EDTA, DTPA, DTPA-BMA y sales y complejos de los mismos, especialmente las sales de calcio, sodio o meglumina, por ejemplo el edetato disódico, ácido edético, y EDTA calcico.

Ejemplos de antioxidantes, adecuados, incluyen el ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, cisteina, mono t iogl i cero 1 , hidroxiani sol butilado, hidroxi tolueno butilado, ácido hipo fos fórico , galato de propilo, bisulfato de sodio, sulfoxilato formaldehído de sodio, metabi ulfato de sodio, tiosulfato de sodio, dióxido de azufre, o tocoferol. Ejemplos de agentes para la tonicidad, idecua os, incluyen el cloruro de sodio, glucosa, sucrosa, manitol, sorbitol y dextrosa. Estos agentes se usan preferentemente para hacer a la formulación isotónica o cercanamente isotónica con la sangre . Ejemplos de agentes antimicrobianos, adecuados, incluyen el cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, clorobutanol, metacresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propil y timerosal. Ejemplos de agentes crioprotectores, adecuados, que auxilian en los procesos de liofili zación y reconstitución, incluyen el cloruro de sodio, sorbitol, manitol, glucosa y poliet lenglicol.

El portador líquido puede contener, como se mencionó, un agente de contraste secundario. Esto daría por resultado que el segundo agente quede atrapado en el volumen acuoso interno del liposona. Los agentes en el volumen acuoso exterior se pueden remover o no. Esto puede hacerse para preparar un medio de contraste dual [por ejemplo como se describe en la WO 89/09625] .

Por ejemplo, un agente para la suscept abi 1 idad T2*, tal como un complejo de disprosio, soluble, tal como el DyDTPA-BMA podría ser atrapado dentro de un liposoma con un agente para las características de relajación de Ti, por ejemplo un complejo de gadolinio, CC? el GdD03A que se encuentre unido al exterior de la membrana. Los agentes secundarios incluyen por ejemplo agentes para la formación de imágenes con la luz, por MRI, rayos X, y escint igra fieos , solubles en agua . Otros ejemplos de agentes de contraste, adicionales, que pueden ser encerrados dentro de los liposomas incluyen agrupamientos de metales pesados y sus compiejos de quelatos, como se describió por ejemplo en la WO91/14460 y en la W092/l''215. Esos liposomas pueden ser usados por ejemplo como agentes de contraste para rayos X especialmente los agrupamient os (Ct)2L3 (en donde Ct es un agupamiento metálico, por ejemplo un agrupamiento de W3 o W4 y L es un ligando) . El metal quelado, en los agentes de contraste liposómicos, de la invención, se seleccionará para proporcionar contraste en la modalidad de formación de imágenes, de elección. Para la formación de imágenes por MRI y magne tomé trica , este involucrará generalmente la quelación de centros modificadores del tiempo de relajación es decir, Ti, o tales como iones metálicos paramagnéticos , y iones de agrupamientos poliatómicos. Para la formación de imágenes por rayos X y por CT, la especie metálica quelada será generalmente iones metálicos de alto número atómico (y de aqui de una alta sección transversal para los rayos X) con números atómicos de 37 o superiores, o iones de agrupamientos poliatómicos. Para la formación de imágenes con luz, la porción de quelato metálico será un cromóforo o cloróforo que tenga un pico de absorción o de emisión característico. Para SPECT, PET y escint r igaf i a , se quela un radio emisor de iones metálicos, apropiado. De esta forma en el campo de la MRI, la invención cubre en particular agentes de contraste liposómicos que incorporan múltiples complejos de especies mejoradoras del contraste que están unidos a la capa doble de la membrana liposómica. La especie mejoradora del contraste puede ser cualquier ion ' metalálico magnético, agrupamiento de iones metálicos, o un microc ris t al . Este incluye en particular iones y iones en agrupamientos , con los números atómicos de 21 a 29, 42, 44, o de 57 a 71. Los agentes para MRI, positivos, pueden incluir típicamente los iones metálicos Eu (III), Gd (III), Dy (III), Ho (III), Cr (III) Fe (III), o Mn (II) . Agentes de contraste, negativos, incluyen típicamente los iones Tb (III), Sm (III) y especialmente Dy (III) • La unión de los radioisótopos a los liposomas es ú il para la formación de imágenes, escintr igáf ica, o como agentes terapéuticos. Se prefieren particularmente los siguientes radioisótopos: ""Te, 51Cr, 201T1, ß7Ga, 68Ga, ulIn, 168 Yb, L40 La, 90 , 8ßY, 153Sm, 156Ho, 165Dy, 64Cu, 97Ru, 103'R,u, 1J 8ß6oR, e, 1lß88s,Re, 2Z0Ü3Í,Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 21 Bi. La elección del ion metálico estará determinada en base a la aplicación terapéutica o de diagnóstico, deseada. Para los rayos X, los iones de metal pesado, no radioactivo, estarán generalmente quelados. Esta invención incluye el uso de iones metálicos con números atómicos mayores que 37 y, en particular iones metálicos con números atómicos mayores que 50. Particularmente preferidos son los acrupamientos nucleares como los que se describen en la WO91/14460. Para el uso como agentes para la formación de imágenes por la luz, los agentes de contraste de la invención incluirán preferentemente una porciór. para absorbancia o fluorescencia que tenga una absorbancia o emisión cercana al infrarrojo (IR) (670-1,300 nm), preferentemente desplazado hacia el rojo, hacia 1,300 nm . El coeficiente de extinción deberá ser tan grande como sea posible, preferentemente mayor que, o igual que, 105 cm"1M"1. Pa a que los agentes de contraste liposómicos, de la invención, sean ecogénicos, es decir, capaces de funcionar como agentes de contraste para ultrasonido, se prefiere que tengan una estructura dilamelar u oligolamelar con una separación entre las lámelas. Los lípidos que contienen una atadura con un grupo ionizable (tal como carboxilato) deberán tener una distancia relativamente grande entre las capas dobles, concéntricas, de fosfolípido. Esto deberá incrementar la reflexión acústica de los liposomas. Esta invención incluye incorporación de derivados de lípidos para este propósito. Alternativamente, podrían usarse líquidos per fluorados , como componentes de los liposomas. Así como incrementar el tiempo de resonancia en la sangre, de los liposomas, usar líquidos per fluorados , puede aumentar o mejorar las propiedades acústicas de los liposomas. Como se discutió anteriormente, los posibles grupos de anclaje hidrofóbicos, es decir la porción de asociación a la membrana en la especie mejora ora del contraste, pueden incluir fos fol ipidos , cadenas alquilicas largas o moléculas que contengan múltiples cadenas alquil.Leas largas que incluyan esteres y amidas de ácidos gasos, esteroides, grupos aromáticos y poliaromáticos. El grupo de anclaje se puede diseñar para mejorar la eliminación de la porción mejoradora del contraste (por ejemplo el complejo de qu lato) una vez depositada en el hígado. La eliminación se puede controlar equilibrando la naturaleza hidrofóbica e hidrofílica de toda la molécula, por ejemplo incluyendo grupos potencialmente ionizables tales como los ácidos carboxí 1 icos , fosfónico, o sulfónico, en la porción mejoradora del contraste. En esta forma podria ser posible asemejar la estructura de compuestos biológicamente relevantes que se excretan rápidamente del hígado. Alternativamente, el grupo de anclaje hidrofóbico podria contener un grupo polimerizable, permitiendo la formación de un liposoma más estable mediante la polimerización del grupo de anclaje hidrofóbico con el lipido en masa, de la vesícula. El enlace o la unión entre la porción mejoradora del contraste y la porción de asociación a la membrana, en las especies mejoradoras del contraste, pueden ser relativamente inertes a la biodegradación (tales como un grupo alquilo, arilo, o éter) o pueden ser hidrolizables , por ejemplo que incluyan un grupo carboxílico o de éster carbónico, disulfuro, acetal, cetal, tioéster, carbamato, amida, lactama, tiourea, urea. la porción de enlazamiento puede incluir un espaciador o separador para actuar como una atadura, tal como una cadena de alquilo saturado o insaturado y/o estructuras de anillos tales como grupos aliciclicos, aromáticos, pol iaromáticos , y he t erocí cl icos . La longitud y flexibilidad del separador se puede alterar para optimizar la eficiencia del acoplamiento y las características de relajación del agente. El enlazante puede ser hidrofóbico de tal forma que se entierre o introduzca en la capa doble del lipido, o hidrofílico, de tal forma que se extienda hacia los medios acuosos. El grupo de enlazamiento puede así jugar un importante papel para controlar las rutas metabólicas y de eliminación de la porción mejoradora del contraste. La composición y tamaño del liposoma se puede seleccionar de tal forma que controle la biodis r ibución del agente. Por ejemplo, los liposomas con carga superficial positiva o negativa se pueden preparar mediante la incorporación del lipido con grupos de encabezamiento, polares, cargados. Cuando se administran intravenosamente, la carga superficial afecta la biodi s tr ibución de los agentes [ver Paphadj opolous , en Biochim. Biophys. Acta 1103 : 185-197 (1992)] - los liposomas cargados negativamente son captados en forma más rápida por el RES que los liposomas cargados positivamente o que los liposomas neutros, mientras que los liposomas cargados positi amente y negativamente se acumulan en los pulmones en un gado mayor que los liposomas. Adicionalmente, el diámetro de los liposomas afecta su biodis t ribución y su farmacociné t ica . Los liposomas pequeños tienen tiempos de circulación mayores que los liposomas grandes. La captación de las células de Kupffer es más rápida con liposomas grandes, mientras que los hepatocitos captan pequeños liposomas con una velocicad mayor. Después de la inyección se atrapar en los pulmones liposomas muy grandes (> 100 µm) . La hidrofilicidad de la membrana del lipido tambiér afecta el tiempo de circulación de los liposomas. La conjugación de polimeros hidrofílicos o anfifílicos tales como el pol iet i lengl icol , a la superficie de la membrana, incrementa el tiempo de circulación hasta en 8,000 %, reduciendo la velocidad de la fagocitosis por los macrófagos. El envío dirigido, activo, con liposomas se puede llevar a cabo mediante la unión de ligandos, carbohidratos, antígenos, proteínas, aminoácidos, ol i gopépt idos , enzimas, hormonas, anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos, a la superficie exterior de los liposomas. Al reconocer sitios del receptor, los liposomas se enlazan a las células blanco u objetivo [ver Jones, Adv. Drug Deliv. 13_: 215-250 (1994), US-A-4603044, J. Med. Chem., 2_9: 1821-1826 (1986), Ann. N.Y. Acad. Sci., 698 : 427-43 (1993), Liposones Technology, Gregoriadis, de. Vol. II, (1983), y referencias que se encuentran en los mismos! . Esta invención también se proporciona para la unión de agentes de envió dirigido a múltiples sitios, a la superficie exterior del liposona, preferentemente porciones de peso molecular relativamente bajo tales como un péptido o fragmentos de anticuerpos. Lo agentes de contraste de la invención se pueden administrar a pacientes, para la formación de ipágenes, en cantidades suficientes para producir el contraste deseado con la técnica de formación de imágenes, particular. En general, las dosificaciones de 0.001 a 5.0 mmoles del ion metálico para la formación de imágenes, quelado, por kilogamo de peso corporal del paciente, son efectivos para logar mejoras adecuadas en el contraste. Para la mayoría de las aplicaciones en MRI las dosificaciones preferidas del ion metáli o para la formación de imágenes se encontrarán en el intervalo desde 0.001 hasta 1.2, por ejemplo desde 0.01 hasta 0.5 mmoles/kg de peso corporal, mientras que para aplicaciones en rayos X, desde 0.5 hasta 1.5 mmoles/kg son generatmente efectivas para logar la atenuación de lo rayos X. Las dosificaciones preferidas para la mayoría de las aplicaciones en rayos X son desde 0.8 hasta 1.2 mmoles del lantánido o metal oesado/kg de peso corporal Para aplicaciones en rayos X, para prolongar el rango de energía de fotones durante el cual los a entes de contraste de la invención son óptimamente efectivos, se pueden usar dos o más metalep quelados como mezclas de homopo 1 iquelatos o como un het eropol iquela to Los agentes liposómicos de la invención proporcionarán varias mejoras sobre la técnica anterior . La velocidad del intercambio metálico es muy importante para la formación de imágenes en el remanso sanguíneo en donde los tiempos de residencia en la sangre son mucho mayores que para los agentes ECF y para la formación de imágen s del hígado en donde el quelato se captará intracelul ármente y estará expuesto al ambiente ácido de los lisosomas. El uso, de confor idad con la invención, de grupos quelantes macroc ícl icos es importante debido a que se incrementa la estabilidad del complejo. Además las porciones quelato, tales como el D03A-Gd (III), pueden ser neutras o de carga seleccionada y esta puede ser una ventaja para controlar la biodis ribución, dado que la carga superficial del lioosoma determina su destino in vivo. Con la unión de quelatos preme t al i zados , a liposomas preformados, de conformidad con la manera preferida de fabricación de los liposomas de la invención, el quelato no unido o enlazado se puede remover fácilmente del liposoma y se puede reciclar, y dado que el ion metálico ya esta unido al quelato éste previene el enlazamiento no específico de iones metálicos al liposoma o a los agentes de envío dirigido, con ug dos . El agente de contraste de la invención permitís particularmente la eliminación efectiva del metal quelado. La técnica anterior no ha satisfecho este requisito. La eliminación de quelatos radioactivos en ratones para agentes unidos a membrana y encapsulados , ha sido estudiada. El ejemplo 13 de la presente tiene una mejor vida media de eliminación que el complejo GdD03A encapsulado (3.2 vs . 6 días) . Un aspecto adicional de esta invención es que usar un enlace biodegradable da por resultado un mecanismo para la liberación a través del tiempo de especies queladas. Esto es especialmente útil para agentes terapéuticos, es decir, agentes en donde el metal quelado tiene una función terapéutica. Esos agentes terapéuticos más que de diagnóstico o de contraste también forman parte de la invención. Todas las publicaciones a las cuales se hace referencia en la presente se incorporan en la misma como referencia.

Ahora se describirá la invención, en forma adicional, con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes: En los Ejemplos, las concentraciones de gadolinio se determinaron mediante la digestión de muestras liposómicas, seguido del análisis por ICP. Las concentraciones de lípidos se determinaron mediante la digestión de la muestra seguido de la determinación espectro fot orné tri ca de la concentración de fosfatos usando molibdato. Los liposomas se extruyeron usando un extrusor Lipex con dos capas de membrana de policarbonato Poretics, apropiadas. La distribución de tamaños de los liposomas se determinó mediante dispersión de luz láser usando un Zetasizer Malvern 4. Los fosfolipidos usados se obtuvieron de lípidos de Avanti Polar. Se almacenaron en un congelador bajo argón. El colesterol se obtuvo de Aldrich y el hemisuccina to de colesterol de Sigma. El clorhidrato de l-(3-Dimet i laminopropil ) - 3-et i lcarbodi imida (EDAC, por sus siglas en inglés) se obtuvo de Aldrich y se almacenó en un congelador. El PE-glut ar ildipalmi tilo se preparó con el método de Torchilin [ver Phospholipid Handbook, Marcel De ker,. Inc., G. Cevc, de., chater 8], el 6-( coles ter i 1 ) -7-oxaheptan-l-ol se prepara mediante el método de Caroll [ver J. Med. Chem., 2_9_, 1821, 1986], y el colesterol-O-tosilato se preparó mediante el método de Koswer [ver JACS, 7_8_, 4347-4355 (1956)] .

Ej emplo 1_ 1, 4, 7-1ri-terbutoxicarbonilmetil-10-metoxicarbo-nil-me il-1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano Se prepara una pasta liquida de bromhidrato de 1, 4, 7-Tri-terbutoxicarbonilmetil-l, 4, 7, 10-tetraa;:aciclododecano (25.0 g, 42 mmoles) en ace t oni. t r i lo , y se trata con TMG (70 mL) . Se adiciona bromoacetato de metilo (6.5 g, 42 mmoles) en una porción, y la mezcla se somete a reflujo durante 3 horas. Después de agitar a tempera.tura ambiente durante 18 horas adicionales , el solvente y el TMG en exceso se remueven mediante evaporación giratoria. El residuo se disuelve en CHC13, se lava con agua, y se seca (Na2SÜ4) . La evaporación del solvente produce' el producto del titulo como un aceite pálido (23 g, 95 %) . RMN 1R (CDC13) 1.4 (s, 27 H), 2.8 (s, 16 H) , 3.2 (s, 6H), 3.4 (s,2H), 3.6 (s, 3 H) .

E j emplo 2_ 1, 4, 7-T i-terbutoxicarbonilmetil-10- (N- ( 2-aminoetil) -amido-metil-1, 4, 7, 10-tetraazaciclo-dodecar o El éster metílico del Ejemplo 1 (23.0 g, 40 mmoles) se disuelve en metanol (500 mL ) y se trata con etilendiamina (200 mL) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 días. El solvente y la etilendiamina en exceso se eliminan median:e evaporación giratoria, y el residuo se disuel e en cloroformo, se lava con agua, y se seca (Na2S04) . El solvente se evapora para producir el producto del título como un aceite viscoso (18 g, 75 %) . RMN H (CDC13) delta 1.4 (s, 27 H), 2.5-3.0 (m, 20 H), 3.3 (m, 8 H), 6.0 ( s . amplio , 1 H) .

E j empl o 3_ 1, 4.7-Tri (carboximetíl) -10- (N- (2-aminoetil) amido-metil-1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan [AE-D03A] Se desprotege el éster del Ejemplo 2 (10.0 g, 16 mmoles) mediante la reacción con TFA (200 mL) a temperatura ambiente, durante 3 horas. Después de la eliminación del TFA, el residuo se disuelve en NaOH 1 M y se carga a una columna de intercambio iónico [AG 1 X 8 (OH-), 200 L] . La columna se lava con agua y el producto se eluye con HOAc 1.5 M. La concentración de las fracciones que contienen el producto del titulo producen 7.0 g (93 %) como un sólido de color blanco. RMN H (D20) delta 2.9-3.6 (mult. amplio) Análisis Calculado para Ci8H34N6?7 HOAc:C, 47.14; H, 8.11; N, 16.49. Encontrado: C, 47.40; H, 7.98; N, 16.48.

Ej emplo 4_ 1, 4, 7-Tri (carboximetil) -10- (N- (2-aminoetil) amido-metil) -1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano Gadolinio (III) [GdAE-D03A] Se disuelve el Ejemplo del compuesto 3 (1.0 g, 2.38 mmoles) en agua (37 mL) . El pH se ajusta a 5 mediante la adición de NaOH 1 M. Se adiciona acetato de Gadolinio (III) en pequeñas porciones hasta que se presenta un ligero exceso de metal (mediante aanaranj adodo de xilenol) . Durante la adición el pH se mantiene en un intervalo de 5 a 6. La mezcla de reacción se agita durante toda la noche. Se adiciona el ligando (50 mg) y se continúa la agitación hasta que se obtiene una prueba negativa al anaranjado de xilenol. El agua se elimina bajo vacio. El residuo se somete a cromatogafía en una columna Sephadex G-10 para eliminar las sales inorgánicas. Las fracciones se analizan mediante MS ( FAB ) : MH+ = 602.

E j emplo 5_ 1, 4, 7-Tri (carboximetil) -10- (N- (2-aminoetil) amido-metil) -1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan-N-hemisuccinamida S e calienta el compuesto del Ejemplo 3 (6.1 g, 13.6 mmoles) en piridina (20 mL) hasta que se completa la disolución. Se adiciona anhídrido succínico (1.5 g, 15 mmoles) y la mezcla se calienta durante 1 hora. La solución se enfría y se adiciona acetona para precipitar el producto. El sól.Ldo de color blanco se lava completamente con ac tona y se seca bajo vacío para producir 5.0 g ele 1 producto del titulo (67 %) .

Ej emplo 6_ 1, 4, 7-Tri (carboximetil) -10- (N- (2-aminoetil) amido-metil) -1, , 7, 10-tetraazaciclododecan-N-hemisuccinamida Gadolinio (III) (A' Se disuelve el compuesto del Ejemplo 5 (1.9 g, 3 mmoles) en agua (30 mL) . El pH se ajusta con NaOH 1 M hasta 5.0. Se adiciona, gota a gota, cloruro de Gadolinio (III) (aprox. 1.4/10 mL) en agua, hasta que permanece un ligero exceso del metal por varias horas. Se adiciona gadolinio adicional (50 mg) y la mezcla de reacción se agita hasta que se obtiene una prueba negativa de anaranjado de xilenol. El agua se evapora y el residuo se lava varias veces con etanol. El producto del título se purifica mediante HPLC preparativa, de fase inversa ( C?8) con 2 % de metanol en agua como la fase móvil. (B) El compuesto del titulo se prepara" también mediante un procedimiento alternativo: El compuesto del Ejemplo 3 (240 mg, 0.4 mmoles) en DMSO (10 mL) se calienta a 80° hasta que finaliza la disolución. Se adiciona anhídrido succínico (40 mg, 0.4 mmoles) y la mezcla se calienta durante: 6 horas. Después de enfriar a temperatura ambient.e se adiciona acetona para precipitar el producto del título. El polvo de color blanco se lava con acetona y se seca bajo vacío. MS ( FAB ) : MH+ 683.2, MNa+ 705.1.

E j emplo 7 13-Colesteril-3, 6, 9, 12-tetraoxa-dodecan-l-ol Se disuelven, tosilato de colesterol (2.0 g, 3.7 mmoles) y t e t rae t i lengl ico 1 (6.42 mL, 37 mmoles) en dioxano (100 mL) se calientan a 70°C durante 6 horas. El solvente se evapora y el residuo se disuelve en tolueno y se lava completamente con agua. La capa orgánica se seca ( Na2S04) , y se concentra hasta un aceite. El" material crudo se purifica mediante cromatogafía sobre una columna corta, de sílice, con elución con gadiente de 0 a 20 % de metanol en cloroformo para producir 1.0 g (49 %) del producto del título como un aceite pálido.

E j empl 8_ Ácido 13-Colesteril-3, 6, 9, 12-tetraoxa-dodecan-l oico El compuesto del Ejemplo 7 (0.5 g) en acetona (20 mí.) se oxida mediante la adición, gota a gota, de reactivo de Jones hasta que se presenta un ligero exceso. La mezcla de reacción se trata con isopropanol y se filtra a través de un tapón de sí-ice. El producto del título crudo se purifica mediante TLC y RMN.

E j emplo 9_ GdD03a-estearilamida El compuesto del Ejemplo 3 (100 mg, 1.6 mmoles! se disuelve en DMSO (10 mL ) y se trata con cloruro de estearilo (51 mg, 1.6 mmoles) . La mezcla de reacción se calienta a 60° durante 2 horas, y se agita durante la noche a temperatura ambiente. Se adiciona agua (50 mL) y el producto se extrae en cloroformo (3 X 100 mL) . Los extraeros se secan, se concentran para producir el producto del título como un sólido de color blanco. MS ( FAB ) 868.5 MH+ .

Ejemplo 10 Carbamato de GdAE-D03A colesterilo El compuesto del Ejemplo 3 (300 mg, 0.8 mmolesi se disuelve en DMSO (20 mL ) y se trata con cloroformiato de colesterol (225 mg, 0.5 mmolesi . La mezcla de reacción se calienta a 80°C durant 5 horas. Se deja reposar la mezcla a temper.atura ambiente hasta que se depositan cristaLes incoloros. MS ( FAB ) : MH+ 1014.5, MNa* 1036.5.

E j emplo 11 LaD03A--succinil-PE Se disuelve LaD03A- Succinamida (130 mg, 0.2 mmoles; en DMSO (3 mL) . Se adiciona di ci clohexi lcarbodi imida (39 mg, 0.2 mmoles) seguido por N-hidroxisuccinimida (22 mg, 0.2 mmoles; . La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora, y se adiciona PE (130 mg, 0.2 mmoles) en cloroformo (20 m ) . Después de 6 horas, la mezcla de reacci n se filtra, se lava con agua, se seca, y se evapora para producir el producto del titulo. TLC (65 CHCl3/25 MeOH/4 H20/1 ácido fórmico) Rf = 0.2. MS (FAB) : MH+ 1400.7, Mna+ 1422.7.

E j emplo 12 GdAE-DC3A-glutaril-PE Se trata PE-glutarilo de huevo (100 mg, 0.11 mmoles) en cloroformo (5 mL) con N-hidroxi succinamida (25 mg, 0.21 mmoles) y diciclc hexilcarbodi i ida (50 mg, 20.25 mmoles). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante toda la noche y se filtra para remover' la urea. Se adicionan el compuesto del Ejemplo 4 (100 mg, 0.16 mmoles) en metanol (1 mL ) y 1 mL de trie ti lamina . La reacción se agita a temperatura ambiente durante 6 horas, y se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en cloroformo (10 mL) y se coloca en un saco para diálisis. La reacción se somete a diálisis contra amortiguador de acetato de sodio (1 L, 50 M, pH 5.5, 12 horas), amortiguador Tris (1 L, pH 8, 50 mM , 5 oras), y agua desionizada (1 L, 5 horas) . Una pequeña cantidad del precipitado que se había formado en la capa del cloroformo se disuelve mediante la adición de metanol. La solución se seca (Na2S04) y se evapora para producir e^ producro del titulo como un sólido ceroso de color blanco (150 mg, 89 %) . TLC (65 CHCl3/25 MeOH/4 H20/1 ácido fórmico) Rf = 0.2. MS (FAB) : MNa+ 1459.

Ej emplo 13 Una mezcla de PC de huevo (52 µmoles) y PE-glutarilo de huevo (48 µmoles) en cloroformo, se evaporan hasta una película delgada, bajo vacio. La mezcla de lípidos se disuelve en éter dietílico (3 mL) y se trata con 23 mL de amortiguador (MES 25 mM, NaCl 100 mM) . Se forma una emulsión mediante sonicación o aplicación de energía sónica, de la mezcla. El éter se evapora para formar un gel. El gel se rompe mediante agitación con formación de vórtices y evaporación del so]. vente residual. Se adiciona 1 mL adicional de amcrtiguador y se continúa la evaporación hasta que todas las trazas del solvente se eliminan. Los liposomas se tratan con GdAE-D03A (140 mg) y EDA (130 mg) durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación rápida. Los reactivos sin reaccionar se eliminan haciendo pasar el producto a través de una columna Sephadex G-75 (2.54 x 20.32 cm ( 1 x 8 plg)) . Los liposomas se extruyen tres veces a través de dos membranas de 100 nm . El análisis de la mezcla final produce [Gd] = 1.14 mM, [P] = 5.04 mM . En base a la relación P/Gd, se deriva 47.1 % del PE-glutarilo. Características de relajación (agua, MHz) rx = + 2 (mMs) -i E j emplo 14 Se usa el mismo procedimiento para la síntesis del Ejemplo 13. Se usan PC de huevo ( 2 Ó" µmoles) y PE-succinilo de dioleilo (17 µmoles) . El aná..isis de la mezcla final da [Gd] = 0.56 mM, [ P ] = 3.8 mM . En base a la relación de P/Gd, se deriva 30 % del PE-g lutar i lo . Las características de relajación (agua, 20 MHz) rx = 18 + 2 (mMs)"1.

E j empl 15 Se usa el mismo procedimiento para la síntesis descrita del Ejemplo 13. Se usan PC de huevo (10 µmoles) y PE-dodecanoi lo de dioleilo (8 µmoles) . Los liposomas se extruyen (3 x 200 nm, 3 x 50 nm) . El análisis de la mezcla final da [Gd] = 0.66 nM, [P] = 3.49 nM. En base a la relación P/Gd, se deriva 43 % del PE-glut ar i lo . Características de relajación (agua, 20 MHz) rL = 17 +_ 2 (mMs ) _1.

E j emplo 16 Se usa el mismo método para preparar el Ejemplo 13, par una mezcla de PC de huevo (56 µmoles; y PE de huevo (53 µmoles) . Los liposomas se tratan con ECAC (100 mg) y GdAE-D03A-succinamida (80 mg) durante toda la noche a temperatura ambiente, con agitación rápida. Después de la eliminación del reactivo que no ha reaccionado, los liposomas se extruyen (3 x 200 nm y 3 x 250 nm) . El análisis de la mezcla final da [Gd] = 0.39 mM, [P] = 5.87 mM . En base a la relación P/Gd, se deriva 14 % del PE-glut ar i lo . Características de relajación (agua, 20 MHz) rx = 27 + 2 (mMs) _1.

Ejemplo 17 Se preparan liposomas a partir de PC de huevo (13 µmoles) y hemi succina to de colesterol (16 µmoles) mediante el mismo método usado para preparar el Ejemplo 13. Los liposomas se tratan con EDAC (25 mg) y GdAE-D03A (25 mg) . Después de la eliminación de los reactivos que no han reacci nado, los liposomas se extruyen ( 3 x 200 nm y 3 x 50 nm) . El análisis de la mezcla final da [Gd] = 0.26 mM, [P] = 2.93 mM . En base a la relación P/Gd, se deriva 7.2 % del PE-glut ar i lo . Características de relajación ( agua, 20 MHz) Ejemplo 18 Se preparan liposomas a partir de PC de huevo (80 µmoles) y 6- ( col es t er i 1 ) - 7 -oxahept an- l-ol (80 µmoles) mediante el método descrito para la preparación del Ejemplo 13. Los liposomas se tratan con EDAC (70 mg) y GdAE-D03A (40 mg) . Después de la eliminación de los agentes que no han reaccionado, los liposomas se extruyen ( 3 x 200 nm y 3 x 50 nm) . El análisis de la mezcla final da [Gd] = 0.39 mM, [P] = 3.34 mM . En base a la relación P/Gd, se deriva 11% del PE-glut ar i lo . Caract rísticas de relajación (agua, 20 MHz) ri = 19 +_ 2 (mMs) _1.

E j emplo 19 Se preparan liposomas a partir de PE de huevo (68 µ cles), PE-glutarilo de huevo (55 µmoles) y Brain PS (6 µmoles) mediante el método descrito para la preparación del Ejemplo 13. Los liposomas se tratan con GdAE-D03A (40 mg) y EDAC (75 mg) . Después de la eliminación de los reactivos que no han reaccionado, los liposomas se extruyen ( 3 x 200 nm y 3 x 100 nm) . El análisis de la mezcla final da [Gd] = 0.51 mM, [P] = 4.15 mM . En base a la relación P/Gd, se deriva 29 % del PE-glutari. lo. Características de relajación (agua, 20 MHz) rx = 18 +_ 2 (mMs)"1.

Ej emplo 20 Se preparan liposomas mediante el método descrito para la síntesis del Ejemplo 13, a partir de hemisebacato de colesterol (130 µmoles) y PC de huevo (130 µmoles) . Los liposomas se tratan con GdAE-D03A (120 mg) y EDAC (120 mg) . Los reactivos sin reaccionar se eliminan mediante cromatcgafía con gel y los liposomas se extruyen.

E j e pl o 21 Se adiciona el compuesto del Ejemplo 10 (71 mg, 6 µmoles) a dioleilo PC (15 mg, 20 µmoles) en cloroformo. El solvente se evapora bajo vacío. El residuo se disuelve en éter (1 mL) . Se adiciona agua (1 mL) y la mezcla, se somete a la aplicac; ion de energía sónica hasta que se forma una emulsión. El éter se evapora lentamente bajo" vacío. Se forma un gel espeso. Se adiciona agua adicional ( 1 mL) y el gel se somete a la agitación con vórtices hasta que el gel se colapsa o se rompe para formar vesículas. El producto se extruye (3 x 200 nm, 3 x 50 nm) .

Ej emplo 22 Se disuelven en cloroformo (3 mL) , el compuesto del Ejemplo 12 (25 mg, 17,4 µmoles) y PC de huevo (13.7, 18 µmoles) . La solución se evapora a sequedad bajo vacío. El residuo se disuelve en éter (3 mL) y se filtra. Se adiciona amortiguador MES (3 mL) y la mezcla se somete a energía sónica hasta que se forma una emulsión. El éter se elimina mediante evaporación bajo vacío con agitación con vórtices, ocasional.

E j emp lo 23 Se disuelven, el compuesto del Ejemplo 9 (50 µmoles) y PC de huevo (150 µmoles) hidrogenado, en una mezcla de cloroformo (10 mL) y metanol (2 mL) . EL solvente se evapora a 75°C. La película delgada residual se hidrata en amortiguador MES" a 75°C mediante agitación. Después de congelar y descongelar cuatro veces, los liposomas se extruyen (3 x 100 nm) a 75°C.

Ejemplo 24 Fármac cinética Se inserta un catéter en la vena yugular de una rata, días antes al estudio. Se retira una mezcla de sangre de 300 µL y se coloca en un tubo tarado que contiene heparina, antes de la inyecci.ón de la muestra. El compuesto de prueba se inyecta en el tiempo cero. Se toman muestras de sangre (300 µL) a intervalos durante un periodo de 24 horas. A los 7 días el animal se sacrifica, y se remueven los ríñones, el hígado y el bazo. La sangre y las muestras de órganos se digieren con ácido nítrico y peróxido de hidrógeno y se analizan respecto a la concentración de gadolinio (µg/g) mediante ICP.

Producto Retención en el Órgano del Ej emplo Dosis t? 2 a los 7 días µg Gd/Kg min . Hígado Bazo Riñe % % I 13 831 98 9.9 1.3 0.7 13 1190 111 7.4 0.6 0.6 19 1764 69 24.0 11.8 0.5 20 1310 58 34.8 8.9 0.8 E j emp l o 2 5 Biodis iribución Se marca ( 2 -aminoe t i 1 ) -D03A con 1x5o3"',Gd. El quelato se acopla a PC/ Glutaril liposomas de huevo (lOOnm), en relación 1:1 como en el Ejemplo 13. Los liposomas r adiomarcados se inyectan en las venas de la cola de ratones. Se usan tres ratones para cada tiempo. Se cuentan muestras de sangre y, bazo, riñon y piel, a 1 d, 3 d, y 7 d. Se calcula la dosis inyectada porcentual, retenida en cada órgano, la cual se presenta posteriormente. La vida media de eliminación para el hígado es de 3.2 d.

Retención del Órgano (% de la dosis inyectada ) 1 día 3 días 7 días Sangre 0.60 0.54 0.51 Hígado 18.22 9.91 4.88 Bazo 0.86 0.79 0.69 Riñon 1.03 0.74 0.64 Piel 1.68 1.19 0.80 Ejempl 26 Síntesis de GdDOTA-DOBA ( i ) Síntesis de p- ( 10-bromodeci loxi ) benzoato de metilo Se agita a reflujo, durante 20 horas, una mezcla de 1 , 10-dibromodecano (18.01 mmoles), p-hidrox ibenzoato (9.12 g, 60 mmoles) y K2C03 (8.28 g, 60 mmoles) en acetona (90 mL) . El sólido de color blanco se separa por filtración y se lava con acetona. El filtrado y los lavados se combinan y se concentran para dar un sólido de color blanco del cual se aisla el producto deseado mediante cromatografía en columna sobre gel de silice usando un gadiente de solventes de hexano /cloroformo, para la elución (10.8 g, 48.4 %) . RMN XH (CDC13, delta) : 7.95 (d), 6.88(d), 3.98 (t), 3.85 (s), 3.39 (t), 1.52 (m), 1.42 ( ) y 1.29 (m) . FABMS : 371 (MH+) . ( i i ) Síntesis de p- ( 10-N- ft al imidodeci loxi ) -benzoato de metilo Se agita, a 60°C, durante 14 horas, bajo nitrógeno, una mezcla de p-(10-bromodeciloxi ) benzoato de metilo (10.44g, 28.12 mmolesi y ftalimida de potasio (5.47 g, 29.53 mmolesl en DMF anhidra (175 mL) . El solvente se elimina bajo vacio y el residuo se disuelve en CHCI3 y se lava (4 x 15 mL) . Los lavados acuosos se combinan y se vuelven a extraer una vez con CHCI3 (100 mL) . Las capas orgánicas combinadas se secan con MgS04 y la solución se concentra para producir el producto crudo el cual se purifica mediante cromatogafia sobre gel de silice usando un gadiente de solventes de hexano/ cloro formo , para ..a elución (11.8g, 96 %) . RMN XH (CDD13, delta) : 7.95 (d), 7.81 (m), 7.68 (m), 6.86 (d), 3.97 (t), 3.85 (s), 3.64 (t), 1.76 (m), 1.65 (m), 1.54 (m) , 1.42 (m), 1.29 (m), FABMS : 438 (MH+) . (iii) Síntesis de p- ( 10-amondeciloxi ) benzoato de met i lo Se disuelve p- ( 10-N- ftal imidode-ciloxi ) benzoato de metilo (8.52 g, 19.48 mmoles) en metanol (75 mL) a 65°C. Se adiciona monohidrato de hidrazina (1 mL, 20.62 mmoles) y la solución se somete a reflujo bajo nitrógeno, durante 22 horas. La solución se enfría hasta temperatura ambiente y el precipitado se filtra. La solución se concentra y el residuo se combina con el precipitado y se trata con cloroformo (500 mL) . La solución se lava con agua y los lavados se vuelven a extraer con cloroformo (2 x 100 mL) .

La capa orgánica combinada se seca sobre MgS04 y se concentra para producir el producto (5.62 g, 97%) . RMN 1R (CDC13, delta) : 7.95 (d), 6.88 (d), 3.97 (-:), 3.86 (s), 2.64 (t), 1.78 (m), 1.53 (m), 1.43 (m), 1.28 (m) . 1 v Síntesis de p- (10-cloroacetamido-decilo i) benzoato de metilo Se disuelven, el producto crudo de (iii) anterior (5.62 g, 18.84 mmoles) y trietilamina (2.6 mL, 18.7 mmoles), en cloroformo (90 mL) y se enfría en un baño de hielo. Se adiciona, gota a gota, con agitación, una solución de cloruro de cloroacetilo (1.5 mL) en cloroformo (40 mL) después de finalizar la adición, la solución se agita en el baño de hielo durante 15 minutos y se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante 20 horas. La solución se lava con agua (4 x 80 niL ) . El secado (MgS04) y la concentración, producen el producto (6.71 g, 93 %) el cual se usa sin purificación adicional. RMN XH (CDC13 delta) : 7.95 (d), 6.87 (d), 6.54 (s. amplio), 4.01 (d), 3.96 (t), 3.86 (s), 3.28 (cuarteto), 1.76 m) 1.55 m) 1.45 (m; 1.29 (m) RMN 13.

(CDC13, delta) : 130.71, 130.66, 121.52, 113.23, 75.37, 67.33, 50.95, 41.85, 39.04, 28.56, 28.53, 28.47, 28.43, 28.33, 28.25, 25.94, 25.11. ( v ) Síntesis de acetato de 10- (p-metoxicarboni 1-feniloxidecilcarbamoilmetil) -1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan-1, 4, 7-tri-t-butilo Se disuelven, éster de DO 3A- tr i- t-but í 1 ico (9.31 g, 15.63 mmoles) y trietilamina, en DMF (90 mL) y se adiciona la cloroacet amida del inciso (iv) anterior (6.0 g, 15.63 mmoles), a la solución, la cual se calienta a 60°C bajo nitrógeno, durante 19 horas. El solvente se remueve bajo vacio y el residuo se recoge en cloroformo (200 mL) . La solución se lava con agua (3 x 100 mL), se seca sobre MgS04 y se concentra para producir el producto crudo (10.97 g) como un aceite . (D03A = 1, 4 , 7-Triscarboximetil-l , 4 , 7 , 10-te traa aciclododecano ) .

E j emplos 27-31 Usando el siguiente esquema de reacción, se preparan los análogos del D03A-D0BA (el compuesto del E j emplo 26 ) Ntatar Metanol o DMF R" -(CB ?)«Rll + t Gel de Sílice 1 (en donde R11 es halógeno, por ejemplo Br; X11 es CH2 u ; y d es un número entero positivo) . La síntesis de los compuestos de los Ejemplos 27 al 31 es directa y reproducible en todos los casos .

Ejemplo No. -L'Ar (AH)q Nombre Abreviado 27 m-carboxi fenoxi- ( CH2 ) 10 D03A-D0mBA Ejemplo No. -L ?r (AH) g Nombre Abreviado 28 o-carboxi f enoxi- ( CH2) ?o D03A-DoBA 29 3,5-bis carboxi fenoxi - D03A-DOIA (CH2) ?o 30 p-carboxifenoxi- (CH2) 6 D03A-HOBA 31 p-carboxifenoxi- (CH2) 8 D03A-OOBA E j emplo 32 Liposomas que tienen Gd D03A-DOBA enlazado a la membrana Se preparan liposomas del tamaño de 110 nm usando 90 moles % de fos t a t idi Ico 1 ina de huevo y moles % de Gd D03A-DOBA en 175 mM de glucosa, 100 mM de sucrosa media de una osmolalidad total de 282 mOs Características de relajación Ti : 17 mM^s"1 Concentración de Gd: 7.87 mM Concentración de lípidos: 65.9 mM Vida media en la sangre (ratas) seguido de la inyección intravenosa a razón de 0.03 mmoles/kg: 20-90 minutos Retención en tejidos (como un porcentaje de la dosis inyectada) : Tie tipo Hígado Riñon Bazo t? 53.22 1.87 0.74 1 h 27.95 0.34 0.91 3 h 7.31 0.26 0.85 1 d 4.27 0.34 1.60 7 d 1.85 0.36 0.61 Los liposomas cargados con quelatos de gadolinio, de los quelantes de los Ejemplos del 27 al 31, se preparan en forma análoga.

Ejemplo 33 Agente de contraste dual Se preparan liposomas de tamaño de 200 nm usando Gd D03A-DOBA, como un quelato de asociación a la membrana, fos fat idi Icol ina de huevo como un lipido formador de membrana y una solución acuosa glucosa/ sucrosa como en el Ejemplo 32. Se incorpora, Dy DTPA-BMA, disuelto, dentro de los liposomas con una relación de Dy/Gd, de 2, para producir un agente de contraste dual. Características de relajación Ti = 14.6 mMf"-l Características de relajación T2* = 16.6 mM -1 ,-1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un agente liposómico, caracterizado porque comprende liposomas que tienen enlazado o unido, a una membrana de los mismos, un ion metálico, quelado, el agente quelante que enlaza al ion metálico tiene una porción de quelante macrocíclico que tiene unida a un solo átomo del anillo, de la misma, una porción de asociación a la membrana, lipofílica.

2. Un agente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente quelanie es de la fórmula I An-L-Ch (R) (I) en donde An es un grupo de asociación a la membrana, hidrofóbico, L es una porción enlazante unida a un átomo del anillo de Ch y que se puede separac en un enlace biodegradable, Ch es una porción de quelante macrocíclico, que transporta o lleva opcionalmente uno o más grupos R hidrofílicos o dirigidos al sitio, y n es cero o un número entero positivo.

3. Un agente de conformidad con la rei vinc.icación 2, caracterizado porque en el agente quelante An comprende un grupo colesterilo o fosfa t idilo .

4. Un agente de conformidad con la rei vinc.icación 1, caracterizado porque el agente quelante es un compuesto anfifílico de fórmula II (HA) qAr-L -Ch (R) II) en donde Ch(R)„ es como se definió en la reivinc.icación 2, L' es una porción enlazante de alquileno de 2 a 25 átomos de carbono, opcionalmente oxo-subs ti tuida, unida a un átomo del anillo de Ch y en el que al menos una porción CH2 está reemplazada por un grupo oxo, aza o tia y que está opcionalmente interrumpida por un grupo K biodegradable, Ar es un anillo arilo opcionalmente substituido por, o que tiene fusionado al mismo, un anillo arilo adicional, q es un número entero positivo y cada AH es un grupo ácido prótico.

5. Un agente de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque en el agente quelante de fórmula II q es 1 o 2, Ar es fenilo y L' es un grupo alquilenoxi de 6 a 15 átomos de carbono, unido con oxígeno a Ar.

6. Un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque el agente quelante Ch(R)n es un grupo de la fórmula XN (CHR?)B)p en donde p es 3, 4, 5, o 6, cada m es 2 , 3 o 4 , cada Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidrofllico, o un grupo dirigido al sitio, y cada X es un grupo Ri o un grupo de coordinación, metálico, que tiene, sin embargo, un grupo Ri unido a carbono o nitrógeno, que proporciona un enlace a la porción enlazante.

Un agente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente quelan e Ch(R)n es un residuo de D03A o DOTA.

8. Un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, caracterizado porque el agente quelante se selecciona de: carbamato de AE-DO 3A-coles t er i lo , DO 3A- succini 1-PE, D03A-glutaril-PE, D03A-DOBA, D03A-DOmBA, D03A-D OBA, D03A-DOIA, D03A-HOBA, D03A-OOBA Y AE-D03A-dodecenil-PE.

9. Un agente de conformidad con cualquiera de las eivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizado porque los liposomas comprenden un material formador de membrana, de fosfolipidos o de fosfolípidos hidrogenados.

10. Un agente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado porque el ion metálico es un ion de metal para agnético.

11. Un agente de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones de la 1 a la 10, caract rizado porque comprende un quelato adicional de un ion metálico diagnósticamente o terapéuticamente, efectivo.

12. Un agente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el quelato adicional está colocado en el núcleo del 1 iposo na .

13. Un agente de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque contiene un quelato de gadolinio, del agente quelante, y un quelato de disprosio, hidrofílico, soluble en agua, oomo el quelato adicional.

14. Un agente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el quelat adicional es un quelato de un agrupamiento de metal pesado.

15. Una composición caracterizada porque comprende un compuesto formador de membrana del liposoma y un compuesto mejorador del contraste, en donde el último comprende una porción de quelanze macrocíclico que tiene unida a un sólo átomo del anillo, de la misma, una porción de asociación a la membrana, lipofílica, a partir de la cual se pueden producir composiciones 1 iposómi cas .

16. Un proceso para la preparación de un agente liposómico, de conformidad con la descripción de la reivindicación 1, caracterizado po que comprende uno de los pasos siguientes: (a) transformar una composición que comprende un medio portador acuoso, un compuesto formador de membrana liposómica y un compuesto quelante, macrocicl ico , opcionalmente metalizado, que tiene un grupo de asociación a la membrana, hidrofóbico, unido en un átomo del anillo del macrociclo, en una composición liposómica y si se requiere metalizar después el compuesto quelante; y (b) acoplar un compuesto quelante, macrocíclico, opcionalmente metalizado, a un compuesto de anclaje que tenga una porción hidrofóbica incorporada dentro de una membrana liposómica de un liposoma, y si se requiere metalizar después el compuesto quelante.

17. El uso de un quelante macrocíclico o de un quelato o sal del mismo, para la fabricación de un agente de contraste, liposómico, como se describe en la reivindicación 1, para la formación de imágenes para diagnóstico.

18. En un método para generar una imagen mejorada de un cuerpo humano o no humano, el cual comprende administrar al cuerpo, parenteralmente , una cantidad efectiva para contraste, de un agente de contraste, y generar una imagen de al menos piarte del cuerpo, la mejora caracterizada porque comprende administrar como el agente, un agente liposómico de conformidad con la reivindicación 1.