MXPA96004079A - Ensayo homogeneo de sondas genicas con un receptor dirigido contra el marcador - Google Patents

Ensayo homogeneo de sondas genicas con un receptor dirigido contra el marcador

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MXPA96004079A MXPA/A/1996/004079A MX9604079A MXPA96004079A MX PA96004079 A MXPA96004079 A MX PA96004079A MX 9604079 A MX9604079 A MX 9604079A MX PA96004079 A MXPA96004079 A MX PA96004079A
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La invención se refiere a un ensayo homogéneo de sondas génicas que se basa en modificar la señal de la sonda génica no hibridada, mediante un receptor dirigido contra el marcador.

Description

ENSAYO HOMOGÉNEO DE SONDAS GENICAS CON UN RECEPTOR DIRIGIDO CONTRA EL MARCADOR. La invención se refiere a un ensayo homogéneo de sondas génicas que se basa en modificar la señal de la sonda génica no hibpdada, mediante un receptor dirigido contra el marcador. Los ensayos de sondas génicas estén ya descritos en la bibliografía en diferentes formas de realización. Las formas de realización más frecuentemente empleadas son el ''hybrídízation protection assay" ("ensayo de protección de la hibridación") (Clin. Chem. 35/8, 1989, 1588-1594), la técnica de las "Kissing Probes" ("Sondas de acopiamiento transitorio") (Nachr. Chem. Tech. Lab. 37/7, 1989, 598) y el principio de ''Energy Transfer" ("Transferencia de Energía"). En la Fig. 1 se reproduce un principio muy general de un ensayo de sondas génicas según el estado actual de la técnica: en la primera etapa se hibridan entre sí la secuencia diana y la sonda génica marcada, de la que, en el caso de una homología suficiente de las dos secuencias, resultan construcciones de doble cadena. Sin embargo, por regla general, quedan también sobrantes porciones de cadena sencilla y no hibpdadas de la sonda génica. En la segunda etapa se lleva a cabo una hidrólisis selectiva, que está caracterizada porque, debido a las condiciones elegidas, se ataca esencialmente el marcador de la sonda génica de cadena sencilla, mientras que el marcador de la construcción de doble cadena está ampliamente protegido de un ataque hidrófilo. Por consiguiente, después, en la tercera etapa, se mide esencialmente la señal producida por el marcador unido en ia construcción de doble cadena . Un inconveniente del procedimiento anterior consiste en que, a pesar del trabamiento con el reactivo de selección (etapa 2), queda un resto de sonda génica de cadena sencilla con el marcador intacto, lo que falsea la medida. Por consiguiente, la presente invención se basa en la misión de proporcionar un procedimiento para la determinación de una secuencia de. ácidos nucleicos (un "ensayo de sonda génica"), en el que la sonda génica marcada no hibrida-da contribuye a una formación de la señal indeseada en medida menor que en el procedimiento según el estado actual de la técnica. La mejora pretendida debe hacer posible en especial una realización mejorada y homogénea del ensayo. La realización homogénea del ensayo está caracterizada fundamentalmente por la ausencia de una etapa de separación física entre la hibridación de los ácidos nucleicos y la verificación de la señal. Según el estado actual de la técnica, en un procedi-miento de este tipo hay que contar con una influencia perturbadora especialmente fuerte por parte de la sonda génica marcada no hibridada. Sorprendentemente, el problema se resolvió porque en el procedimiento según la invención se emplea un receptor que se puede fijar en el marcador y, como consecuencia de la fijación, la señal atribuible al marcador cambia de manera detectable, por ejemplo se debilita. En consecuencia, por el procedimiento según la invención descrito a continuación, es posible reducir de manera significativa la influencia pertur-badora debida a la sonda génica marcada no hibridada y, con ello, mejorar de manera decisiva la sensibilidad y especificidad del sistema de ensayo. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de una secuencia de ácidos nucleicos (= secuencia diana), en el que una muestra que eventualmente contiene la secuencia diana se pone en contacto con una sonda génica apropiada para la determinación de esta secuencia diana, de tal manera que la secuencia diana y la sonda géníca se hibpdan entre si, caracterizado porque, además, (a) se añade un receptor que se fija al marcador de una fracción de la sonda génica, eventualmente en exceso, no hibridada a la secuencia diana, con lo que se modifica cualitativa y/o cuantitativamente la señal atribuible al marcador, y (b) la señal atribuible al marcador se detecta cualitativa o cuantitativamente con un procedimiento apropiado para ello. La presente invención se refiere, además, a un procedimiento en el que, en una etapa adicional, el marcador de una sonda génica no hibridada, eventualmente en exceso, se inactiva parcialmente por incubación con un reactivo de selección. Una forma preferida de realización de la presente invención está caracterizada porque primero se realiza la incubación con el reactivo de selección y, a continuación, se lleva a cabo la adición del receptor. Además, se prefiere un procedimiento en el que el receptor es un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo modificado quimicamen-te o un fragmento de anticuerpo modificado químicamente, siempre que, después de la modificación química, se conserve en medida suficiente la capacidad de fijación del antigeno. Procedimientos según la invención adicionalmente preferidos están caracterizados porque el marcador es un grupo capaz de proporcionar fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, bioluminiscenciao electroluminiscencia. En una forma de realización especialmente preferida de la presente invención el marcador es un éster de acridi-nio, una acridinioacilsulfonamida, un luminol, un isoluminol o un derivado del mismo, un dioxetano, una luciferina, un éster de ácido oxálico o una amida de ácido oxálico. Asimismo, es preferido un procedimiento en el que el marcador es una enzima. Marcador: Como marcador son apropiados todos los grupos capaces de proporcionar fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, bioluminiscencia o electroluminiscencia que, debido a su estructura química, pueden interactuar con una doble cadena de un ácido nucleico, por ejemplo por intercalación en la doble cadena, de manera que se dificulta la fijación de un receptor dirigido contra este grupo, en comparación con la fijación al grupo correspondiente fijado de cadena sencilla. Son especialmente apropiados los grupos éster de acridinio y acridinioacilsulfonamida, que se intercalan en un ácido nucleico de doble cadena. También es apropiado un luminol, un isoluminol o un derivado del mismo, un dioxetano, una luciferina, un éster de ácido oxálico o una amida de ácido oxálico. Los compuestos luminiscentes encuentran ya múltiples aplicaciones. Se emplean como indicadores en in unoensa-yos enzi áticos, in unoensayos de luminiscencia (véase .P. Collins, "Alternative Immunoassays" , editorial John iley & Sons Ltd., Chichester, 1985) y bioensayos (ensayos que se basan no en interacciones antígeno-anticuerpo, sino en afinidades de fijación entre moléculas que no se atribuyen al sistema inmune), pero también en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos (véase J.A. Matthews et al. "Analytical Biochemistry", 151, 205-289, 1985). Además, se emplean compuestos quimioluminiscentes en el "análisis de inyección de flujo" en detectores "posteriores a la columna" en la cromatografía de líquidos, en la investigación hidrodinámica, así como para la fabricación de fuentes luminosas artificiales. Los derivados de acridina son apropiados, además, en procedimientos de ensayo para el análisis de alimentos y del medio ambiente. El empleo de marcadores de acridinio en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos se menciona en el documento EP-A-0 273 115 y se describe en los documentos EP-A--0 212 951, EP-A-0 281 390, EP-A-0 310 312 y EP-A-0 313 219 y en el documento WO 89/02896. En el documento EF-A-0 407816 se describen derivados de nucleótidos con la base uracilo que, a su vez, está marcada con un compuesto quimioluminis-cente a través de un espaciador. En el documento EP-A 602 524 se describen sondas génicas marcadas luminiscentemente, con propiedades ventajosas frente a las del estado actual de la técnica, así como, entre otros, un ensayo homogéneo de sonda génica según el principio de "ensayo de protección de la hibridación", que se basa en las propiedades ventajosas de las sondas génicas dadas a conocer. Anticuerpo anti-marcador Los anticuerpos dirigidos contra el marcador se pueden preparar fundamentalmente de manera convencional, por ejemplo por inmunización de un animal de ensayo con el marcador y selección subsiguiente de anticuerpos modificadores de la señal apropiados. Son adecuados tanto los anticuerpos policlonales como también los monoclonales, siendo preferidos los anticuerpos monoclonales (AMC) . Algunos anticuerpos dirigidos contra el marcador luminógeno de acridinio poseen la propiedad de reducir la intensidad de la señal del marcador por fijación del mismo (efecto de debilitación). Así por ejemplo, en una sola tanda de ensayo, entre 10 AMC's de ratón dirigidos contra un marcador luminógeno de acridinioacilsulfonamida, que no se habían seleccionado previamente en cuanto a posibles propiedades debilitadoras de la señal, se encontró un AMC que poseía las deseadas propiedades deb litadoras de la señal. Un ejemplo de un anticuerpo muy bien apropiado es el anticuerpo monoclonal de ratón segregado de la línea de células BW 90-614-8-04, que fue depositado en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschero-der Weg IB, D-38124 Braunschweig con el número de entrada DSM ACC 2184. Este AMC está dirigido contra la acridinioacilsul-fsnamida mostrada en la Fig. 2. Preparación de las sondas génicas: La preparación de sondas génicas adecuadas se puede realizar con métodos conocidos en principio por el experto en la materia. En un gran número de publicaciones se trata detalladamente de sondas génicas, por ejemplo en: S.L. Beaucage y R.P. Iyer: "The Functionalization of Oligonucleo-tides Via Phosphoramidite Derivati es" ; Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993) y J. Goodchild: "Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of Their Synthesis and Properties"; Bioconjugate Chemistry 1, 165-187 (1990).
La estructura de una sonda génica apropiada está representada, a título de ejemplo, en la Fig. 3. Naturalmente la secuencia de bases mostrada puede ser reemplazada por cualquier otra secuencia apropiada. Asimismo otros marcadores conocidos por cualquier experto en la materia se pueden unir por procedimientos conocidos por cualquier experto en la materia con el ácido nucleico que se va a utilizar como sonda génica. El ensayo de sonda génica: Generalmente, el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo en base a todos los procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica. De manera especialmente ventajosa, la tecnología de sondas génicas según la invención se puede utilizar en ensayos homogéneos. En virtud de la fuerte debilitación de la señal por un AMC anti-marcador, se pueden desarrollar, con una estabilidad comparativamente buena, ensayos homogéneos de sonda génica esencialmente más sensibles que los que son conocidos en el estado actual de la técnica. Los ensayos homogéneos de sondas génicas según la invención destacan, además, por una sencilla manipulación y una fácil capacidad de automatización. Una variante preferida del procedimiento según la invención está representada esquemáticamente en la Fig. 4: en la primera etapa, se hibridan entre sí la secuencia diana y la sonda génica marcada, de lo que resultan, en caso de homología suficiente de las dos secuencias, construcciones de doble cadena. Además, por regla general, quedan sobrantes porciones de cadena sencilla y no hibridadas de la sonda génica. En la segunda etapa se emplea un receptor, por ejemplo un anticuerpo, que se puede fijar en el marcador de la sonda génica de cadena sencilla y que, como consecuencia de la fijación, modifica, por ejemplo debilita, de manera detectable la señal atribuible al marcador. Después, en la tercera etapa, casi exclusivamente se mide la señal provocada por el marcador fijado en la construcción de doble cadena, puesto que el marcador de la sonda génica hibridada no puede ser fijado por el receptor o puede ser fijado peor que el marcador de la sonda génica no hibridada. Frente a los procedimientos conocidos, este procedimiento tiene la ventaja de que aún menos sondas génicas de cadena sencilla proporcio-nan una contribución (indeseada) a la señal de medida. El procedimiento anterior puede ser todavía mejorado realizando, después de la primera etapa de hibridación, una hidrólisis selectiva de la sonda génica de cadena sencilla por tratamiento con un reactivo de selección y, sólo después de ello, empleando seguidamente un receptor dirigido contra el marcador, como se representa anteriormente. Entonces, la medición subsiguiente, a causa de la doble eliminación procedente del marcador de la sonda génica de cadena sencilla, prácticamente ya no resulta falseada por el marcador no fijado (véase la Fig. 5). Otra variante de realización preferida se basa en el "ensayo de protección de la hibridación" (véase anteriormente) y, según la invención, está caracterizada porque el marcador de las porciones de cadena sencilla y no hibridadas de la sonda génica se modifica, por ejemplo se debilita de manera detectable en una etapa adicional, por adición de un receptor que puede fijarse al marcador de la sonda génica de cadena sencilla, de manera que estas sondas génicas no fijadas no pueden dar lugar a ningún falseamiento de la señal medida. En el procedimiento según la invención se prefieren como receptor anticuerpos monoclonales o policlonales, debilitadores de la señal y dirigidos contra el marcador, como ya se ha descrito con anterioridad. Los siguientes ejemplos deben explicar adicionalmente la presente invención, pero sin limitarla de ninguna manera. Ejemplo 1: Preparación de un anticuerpo monoclonal contra un marcador luminógeno de acridinioacilsulfonamida Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se inyectaron a ratones BALB-c, por vía subcutánea o intraperi-toneal , 10 µg de conjugado de acridinioacilsulfonamida-BSA, emulsionado en coadyuvante de Freund completo. El conjugado de acridinioacilsulfonamida-BSA se puede preparar por reacción de fluorosulfonato o trifluoroacetato de la amida del ácido N-(4-metoxifenil )-N-[4-(2-succinimidiloxicarbonil-et.il )bencenosulfonil]-10-metilacridinio-9-carboxílico (Fig. 2) con BSA, por procedimientos conocidos por el experto en la materia. A ello siguieron de 4 a 5 inmunizaciones adicionales sin coadyuvante cada cuatro semanas. Los últimos cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron inyecciones intravenosas de renovación (10 µg por día). Para la preparación de hibridomas, los animales inmunizados se sacrificaron mediante luxación cervical. Se retiró asépticamente el bazo y se deshilaclió para obtener una suspensión aislada de células del bazo en medio Eagle modificado según Dulbecco (MEMD) exento de suero. Las células se reunieron mediante centrifugación (5 min; 1.800 rpm) y se lavaron una vez en MEMD. El número total de células se determinó por recuento con hemocitómetro y utilización de la técnica de exclusión de azul de tripano. Las células de mieloma de ratón (SP2/0) se lavaron dos veces en MEMD exento de suero, se reunieron mediante centrifugación (10 min, 1.000 rpm) y se contaron como se describió con anterioridad. Aproximadamente 10° células de bazo se mezclaron con 2 x 10' células de mieloma SP2/0 del ratón. Después de centrifugar durante 10 minutos a 1.000 rpm, se retiró el material sobrenadante y se añadió 1 mi de polietilenglicol (PEG 4000, de la entidad Merck, al 50 %) al recipiente con el sedimento. Después, se volvió a suspender el sedimento mediante agitación ligera y se incubó a 37°C durante 1 minuto. Se añadieron gota a gota y con agitación ligera 10 mi de MEMD exento de suero y la mezcla se incubó durante 2 a 4 minutos. A continuación, las células fusionadas se centrifugaron durante 10 minutos a 1.000 rpm. El sedimento de células obtenido se suspendió en MEMD que contenía 20 % de suero de ternero fetal (STF) y HAT (hipoxantina 0,1 µM; aminopterina 0,4 µM; timidina 16 µM) y se extendió sobre placas de cultivo (Nunc) con 24 cavidades, con una concentración de aproximadamente 5 x 10 - 10° células por cavidad. Después de 2 a 3 semanas, las colonias de células individuales se retiraron de las distintas cavidades y se cultivaron en cavidades de una nueva placa de cultivo. Los materiales sobrenadantes del cultivo se examinaron en cuanto a anticuerpos específicos de antigeno mediante la técnica EIA. Cada cavidad de una placa de microtitulación recubierta con acridinioacilsulfonamida-BSA (3 µg/ml) se llenó con 100 µl del material sobrenadante y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 100 µl de un conjugado de peroxidasa--anti-ratón (POD) procedente de conejo, durante una hora más a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de incubación con el sustrato, el desarrollo de coloración se midió a 492 nm con un procesador Behring-ELISA (BEP). Se seleccionaron loe hibridomas que producen anticuerpos con una especificidad antigénica adecuada, y se clonaron con empleo de un manipulador monocelular. Para la preparación de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales, los clones se multiplicaron mediante cultivo en masa. La purificación subsiguiente de los distintos anticuerpos monoclonales se llevó a cabo mediante cromatografía de proteína A. Ejemplo 2: preparación de una sonda génica (Fig. 3) La síntesis del oligonucleótido está descrita en el documento EP-A 0 602 524, pág. 49, Ejemplo 14b). El acoplamiento con la acridinioacilsulfonamida se realizó por procedimientos conocidos que, por ejemplo, están descritos en las solicitudes de patente europea antes mencionadas. Ejemplo 3: ensayo homogéneo de sonda génica para la detección en E. coli sin AMC anti-marcador 50 µl de patrón (de Flash-Track®-Test de la entidad Gen Probé. Lote 11276/11278 para patrón positivo/negativo) se pipetean en tubitos de poliestireno. Se añaden 50 µl de la sonda génica segur la Fig. 3 (2,5 x 10° RLU, tampón Tris 1 M, pH 7) y se hibridan a 60 °C durante 15 minutos. A continuación, se añaden 300 µl de un reactivo de selección (tetra-borato 0,2 M, pH 8), se sacude 2 veces durante 3 segundos y se incuba de nuevo a 60 °C durante 15 minutos. Después de ello, se dejan enfriar los tubitos durante 5 minutos. La medición se realiza por adición de, en cada caso, 300 µl de reactivo de análisis 1 (HN03 0,1 M, 0,5 % de H202) y reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M) en un medidor de luminosidad (AutoCliniLumat® de la entidad Berthold) . El tiempo de medición asciende a 1 s/muestra. Se detecta una diferenciación clara de la señal entre el patrón positivo y el negativo (véase la Tabla). Ejemplo 4: ensayo homogéneo de sonda génica para la detección en E. coli con AMC anti-marcador 50 µl de patrón (de Flash-Track®-Test de la entidad Gen Probé, Lote 11276/11278 para patrón positivo/negativo) se pipetean en tubitos de poliestireno. Se añaden 50 µl de la sonda génica según la Fig. 3 (2,5 x 10° RLU, tampón Tris 1 M, pH 7) y se hibridan a 60 °C durante 15 minutos. A continuación, se añaden 300 µl de un reactivo de selección (tetra-bsrato 0,2 M, pH 81, se sacude 2 veces durante 3 segundos y se incuba de nuevo a 60 "C durante 15 minutos. Después de ello, se dejan enfriar los tubitos durante 5 minutos. A continuación, 50 µl de solución de AMC anti- -marcador (10 µg/ml de tampón Tris, pH 7,4, 1 M, Tritón X-100 al 0,1 %) se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. La medición se realiza por adición, en cada caso, de 300 µl de reactivo de análisis 1 (HNO3 0,1 M, 0,5 % de H2O2) y reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M) en un medidor de luminosidad (AutoCliniLumat® de la entidad Berthold) . El tiempo de medición asciende a 1 s/muestra. En comparación con el "ensayo de protección de la hibridación" original (Ejemplo 3), por la adición del AMC anti-marcador se mejora claramente la diferenciación de la señal entre patrón positivo y negativo (véase la Tabla). Se logra una diferenciación de la señal que, de lo contrario, sólo es posible en una forma heterogénea de realización con partículas magnéticas como fase sólida (véase el documento EP-A-0 602 524, páginas 50 a 51, Ejemplo 17). Ejemplo 5: ensayo homogéneo de sonda génica para la detección en E. coli con AMC no específico (experimento testigo) 50 µl de patrón (de Flash-Track®-Test de la entidad Gen Probé, Lote 11276/11278 para patrón positivo/negativo) se pipetean en tubitos de poliestireno. Se añaden 50 µl de la sonda génica según la Fig. 3 (2,5 x 10° RLU, tampón Tris 1 M, pH 7) y se hibridan a 60 °C durante 15 minutos. A continuación, se añaden 300 µl de un reactivo de selección (tetra-borato 0,2 M, pH 8), se sacude 2 veces durante 3 segundos y se incuba de nuevo a 60 °C durante 15 minutos. Después de ello, se dejan enfriar los tubitos durante 5 minutos. A continuación, 50 µl de solución de anti-AMC-TSH (1 µg de AMC-TSH de la entidad Medix, n° Ch:SPHY052/ml de tampón Tris, pH 7,4, 1 M, Tritón X-100 al 0,1 %) se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. La medición se realiza por adición, en cada caso, de 300 µl de reactivo de análisis 1 (HNO3 0,1 M, 0,5 % de H202) y reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M) en un medidor de luminosidad (AutoCliniLumat® de la entidad Berthold) . El tiempo de medición asciende a 1 s/muestra. La diferenciación de la señal entre patrón positivo y negativo corresponde - como era de esperar - al Ejemplo 3 (véase la Tabla) . Tabla (RLU = unidades de luz relativas)

Claims (2)

  1. Reivindicaciones la.- Procedimiento para la determinación de una secuencia diana, en el que una muestra que eventualmente contiene la secuencia diana se pone en contacto con una sonda génica apropiada para la determinación de esta secuencia diana, de manera que la secuencia diana y la sonda génica se hibridan entre sí, caracterizado porque, además, (a) se añade un receptor que se fija al marcador de una fracción de la sonda génica, eventualmente en exceso, no hibridada a la secuencia diana, con lo que se modifica cualitativa y/o cuantitativamente la señal atribuible al marcador, y (b) la señal atribuible al marcador se detecta cualitativa o cuantitativamente con un procedimiento apropiado para ello. 2a.- Procedimiento según la reivindicación la, caracterizado porque, en una etapa adicional, el marcador de una sonda génica no hibridada, eventualmente en exceso, se inactiva parcialmente por incubación con un reactivo de selección. 3a.- Procedimiento según la reivindicación 2a, caracterizado porque primero se realiza la incubación con el reactivo de selección y, a continuación, la adición del receptor. 4a.- Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el receptor es un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo modificado químicamente o un fragmento de anticuerpo modificado químicamente, siempre que, después de la modificación química, se conserve en medida suficiente la capacidad de fijación de antígeno. 5a.- Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el marcador es un grupo capaz de proporcionar fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, bioluminiscencia o electroluminiscencia. 6a.- Procedimiento según la reivindicación 5a , caracterizado porque el marcador es un éster de acridinio, una acridinioacilsulfonamida, un luminol.. un isoluminol o un derivado del mismo, un dioxetano, una luciferina, un éster de ácido oxálico o una amida de ácido oxálico. 7a.- Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 13 a 48, caracterizado porque el marcador es una enzima.
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