JPH1023890A - ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体及びそのモノクロナール抗体を作るハイブリドーマ - Google Patents
ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体及びそのモノクロナール抗体を作るハイブリドーマInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸プローブや蛋白質プローブを検出するの
に有用なポリクロナール抗体を提供する。 【解決手段】 ハプテンスルホフェニル化合物に対し特
異的な結合親和性を有するポリクロナール抗体、モノク
ロナール抗体及び抗体；並びに、該モノクロナール抗体
を作るハイブリドーマ。
に有用なポリクロナール抗体を提供する。 【解決手段】 ハプテンスルホフェニル化合物に対し特
異的な結合親和性を有するポリクロナール抗体、モノク
ロナール抗体及び抗体；並びに、該モノクロナール抗体
を作るハイブリドーマ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な核酸プロー
ブ（探査子）及び蛋白質プローブを検出するのに有用な
新規なポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体に関
し、また、前記モノクロナール抗体を作る新規なハイブ
リドーマに関する。
ブ（探査子）及び蛋白質プローブを検出するのに有用な
新規なポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体に関
し、また、前記モノクロナール抗体を作る新規なハイブ
リドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】核酸プ
ローブは、また、ハイブリッド形成プローブとも呼ば
れ、特異的なポリヌクレオチド配列の検出を可能とす
る。蛋白質プローブは、蛋白質プローブと特異的な通常
は非共有結合をし得る核酸、炭水化物、ステロイド及び
蛋白質のような各種化合物の検出を可能にする。蛋白質
プローブが標識した抗体であるなら、対応する抗原の検
出が可能である。核酸プローブは、特異的なポリヌクレ
オチド配列を検出するために用いることができ、多くの
遺伝障害及び遺伝病、例えばのう胞性繊維症、筋ジスト
ロフィー、後天性免疫不全症候群（エイズ）、肝炎、単
純ヘルペス、エプスタインバー及び各種のウイルス感染
例としてシトメガロウイルス及びアデノウイルスにより
起こされるウイルス感染の診断と治療を補助できる。核
酸プローブは、また、移植片拒絶の原因となる抗原を暗
号としている遺伝子を明らかにできる。癌遺伝子試験学
（cancer oncogeny testing medicine) 及び法医学に有
用な遺伝情報が得られる。
ローブは、また、ハイブリッド形成プローブとも呼ば
れ、特異的なポリヌクレオチド配列の検出を可能とす
る。蛋白質プローブは、蛋白質プローブと特異的な通常
は非共有結合をし得る核酸、炭水化物、ステロイド及び
蛋白質のような各種化合物の検出を可能にする。蛋白質
プローブが標識した抗体であるなら、対応する抗原の検
出が可能である。核酸プローブは、特異的なポリヌクレ
オチド配列を検出するために用いることができ、多くの
遺伝障害及び遺伝病、例えばのう胞性繊維症、筋ジスト
ロフィー、後天性免疫不全症候群（エイズ）、肝炎、単
純ヘルペス、エプスタインバー及び各種のウイルス感染
例としてシトメガロウイルス及びアデノウイルスにより
起こされるウイルス感染の診断と治療を補助できる。核
酸プローブは、また、移植片拒絶の原因となる抗原を暗
号としている遺伝子を明らかにできる。癌遺伝子試験学
（cancer oncogeny testing medicine) 及び法医学に有
用な遺伝情報が得られる。
【０００３】ハイブリッド形成プローブまたは蛋白質プ
ローブは、修飾反応または付着反応（attaching reacti
on）で検出可能な標識で蛋白質またはポリヌクレオチド
を標識することにより作ることができる。典型的には、
標識はポタヌクレオチドまたは蛋白質に付着させられる
前に結合部分（binding moiety）に結合される。結合部
分は標識をポリヌクレオチドまたは蛋白質に付着させる
ように働く反応基を有している。結合部分に結合した標
識は、タグ化合物（tag compound）と呼ばれる。ハイブ
リッド形成プローブは、特異的な結合検定で捕獲（capt
ure)ポリヌクレオチドと呼ばれるもうひとつのポリヌク
レオチドと、接触させられ一緒に温置させられて２つの
ポリヌクレオチドがハイブリッド形成したかどうか決定
できる。捕獲ポリヌクレオチドの配列または領域と実質
的に相補的な少なくとも１つの配列または領域を有する
プローブポリヌクレオチドと呼ばれるポリヌクレオチド
を含むようにハイブリッド形成プローブが選択される
と、２つのポリヌクレオチドのハイブリッド形成が起こ
る。蛋白質プローブも、特異的な結合反応で特異的な結
合相手と接触させ、一緒に温置させることができる。特
異的な結合は、通常強力であるが、可逆的であり、そし
て結合対のメンバーの間またはその中での共有結合の形
成または切断には通常至らない。結合対は、抗原／抗体
及びレセプター／レセプター結合分子結合対を含むこと
ができる。
ローブは、修飾反応または付着反応（attaching reacti
on）で検出可能な標識で蛋白質またはポリヌクレオチド
を標識することにより作ることができる。典型的には、
標識はポタヌクレオチドまたは蛋白質に付着させられる
前に結合部分（binding moiety）に結合される。結合部
分は標識をポリヌクレオチドまたは蛋白質に付着させる
ように働く反応基を有している。結合部分に結合した標
識は、タグ化合物（tag compound）と呼ばれる。ハイブ
リッド形成プローブは、特異的な結合検定で捕獲（capt
ure)ポリヌクレオチドと呼ばれるもうひとつのポリヌク
レオチドと、接触させられ一緒に温置させられて２つの
ポリヌクレオチドがハイブリッド形成したかどうか決定
できる。捕獲ポリヌクレオチドの配列または領域と実質
的に相補的な少なくとも１つの配列または領域を有する
プローブポリヌクレオチドと呼ばれるポリヌクレオチド
を含むようにハイブリッド形成プローブが選択される
と、２つのポリヌクレオチドのハイブリッド形成が起こ
る。蛋白質プローブも、特異的な結合反応で特異的な結
合相手と接触させ、一緒に温置させることができる。特
異的な結合は、通常強力であるが、可逆的であり、そし
て結合対のメンバーの間またはその中での共有結合の形
成または切断には通常至らない。結合対は、抗原／抗体
及びレセプター／レセプター結合分子結合対を含むこと
ができる。
【０００４】水素（3 Ｈ）、燐（32Ｐ）または沃素（
125 Ｉ）のような元素の放射性同位体は、通常用いられ
る標識である。放射性標識を用いる検定は、しばしば連
邦、州及び地方の規定を一緒に含むことを必要とする特
別な廃棄処理手続き、高価な機器及び大規模な安全対策
を必要とする。放射性標識の不安定性はまた高い利用コ
ストにもつながる。加えて、長い照射時間でも、3 Ｈ及
び125 Ｉのオートラジオグラフィーでは限られた分解能
が得られる。さらに、32Ｐ同位体は、危険な同位体であ
る。したがって、核酸及び蛋白質プローブのための非放
射性標識の必要がある。典型的な非放射性間接標識付け
方法論では、ハプテンがプローブポリヌクレオチドに付
着させられて間接的な標識として働く。別法として、バ
プテンは蛋白質に付着させられることにより間接標識と
して働くことができる。ハイブリッド形成に引き続き、
ハプテン標識したプローブポリヌクレオチドは、抗ハプ
テン（anti-hapten)抗体と、またはハプテンに対する同
様の特異的な結合相手と接触させられる。抗ハプテン抗
体は、検出可能な部分例えば酵素、化学発光化合物また
は蛍光化合物で標識することができる。別法として、抗
ハプテン抗体に対する第２の抗体が検出可能な部分を有
していてもよい。間接標識付けスキームに用いるのに適
する非放射性標識を見つけ出す難点は、そのような標識
がハプテン性であること、すなわち、担体と結合した時
に免疫応答を誘発し得ることを要件とすることである。
ハプテン標識はまた、その対応する抗体に結合できなく
てはならない。ハプテン標識は、また、ハイブリッド形
成反応を干渉しない程十分小さく、かつ抗ハプテン抗体
により「確かめられる」（to be seen）程度に十分に大
きいことが必要である。
125 Ｉ）のような元素の放射性同位体は、通常用いられ
る標識である。放射性標識を用いる検定は、しばしば連
邦、州及び地方の規定を一緒に含むことを必要とする特
別な廃棄処理手続き、高価な機器及び大規模な安全対策
を必要とする。放射性標識の不安定性はまた高い利用コ
ストにもつながる。加えて、長い照射時間でも、3 Ｈ及
び125 Ｉのオートラジオグラフィーでは限られた分解能
が得られる。さらに、32Ｐ同位体は、危険な同位体であ
る。したがって、核酸及び蛋白質プローブのための非放
射性標識の必要がある。典型的な非放射性間接標識付け
方法論では、ハプテンがプローブポリヌクレオチドに付
着させられて間接的な標識として働く。別法として、バ
プテンは蛋白質に付着させられることにより間接標識と
して働くことができる。ハイブリッド形成に引き続き、
ハプテン標識したプローブポリヌクレオチドは、抗ハプ
テン（anti-hapten)抗体と、またはハプテンに対する同
様の特異的な結合相手と接触させられる。抗ハプテン抗
体は、検出可能な部分例えば酵素、化学発光化合物また
は蛍光化合物で標識することができる。別法として、抗
ハプテン抗体に対する第２の抗体が検出可能な部分を有
していてもよい。間接標識付けスキームに用いるのに適
する非放射性標識を見つけ出す難点は、そのような標識
がハプテン性であること、すなわち、担体と結合した時
に免疫応答を誘発し得ることを要件とすることである。
ハプテン標識はまた、その対応する抗体に結合できなく
てはならない。ハプテン標識は、また、ハイブリッド形
成反応を干渉しない程十分小さく、かつ抗ハプテン抗体
により「確かめられる」（to be seen）程度に十分に大
きいことが必要である。
【０００５】ビオチンとその誘導体が非放射性プローブ
標識として用いられた。ハイブリッド形成したビオチニ
ル化プローブは、ビオチン標識をアビジンまたは抗ビオ
チン抗体と接触させることにより典型的に検出される。
ビオチン標識は、ヌクレオチドに付着するかまたはヌク
レオチドを修飾することのできるヒドラジドのような反
応基に通常接合（conjugate)される。従来技術のビオチ
ンラベルには、フォトビオチン（PHOTOBIOTIN TM）（Ｎ
−〔４−アジド−２−ニトロフェニル〕−Ｎ′−〔Ｎ−
ｄ−ビオチニル−３−アミノプロピル〕−Ｎ′−メチル
−３−プロパンジアミン）、ビオチンスクシンイミドエ
ステル（ビオチン−ＮＨＳ）、及びビオチンヒドラジド
がある。フォトビオチンは、約１５分でプローブポリヌ
クレオチドを修飾できるが、非常に高価である。フォト
ビオチンは、不安定であり極度に光に鋭敏であるため修
飾反応の制御を難しくするさらなる欠点を有している。
ビオチンヒドラジド及びビオチンスクシンイミドエステ
ルはフォトビオチン程高価ではないが、両方とも、より
長い修飾反応時間を要する。ビオチンスクシンイミドエ
ステルによる修飾は、２段階の手順であるのに対し、ビ
オチンヒドラジドは、修飾反応の完結に２４時間から約
２日半を必要とする。費用、安定性及び修飾反応時間の
考慮に加えて、ビオチン標識には、「粘着性（stickine
ss）」、すなわち凝集の問題がある。粘着性とは、ビオ
チニル化抗体及び／または核酸プローブが中性（帯電し
てない）ビオチンに接合した通常は帯電したポリヌクレ
オチドの表面特性の変化により凝集する状態を指す。凝
集の問題は、標識したプローブの準備に用いた標識付け
接合体に関係なく全てのビオチン標識にある。凝集は、
修飾反応中に低い反応性と下がった溶解性をもたらす。
標識として用いられた。ハイブリッド形成したビオチニ
ル化プローブは、ビオチン標識をアビジンまたは抗ビオ
チン抗体と接触させることにより典型的に検出される。
ビオチン標識は、ヌクレオチドに付着するかまたはヌク
レオチドを修飾することのできるヒドラジドのような反
応基に通常接合（conjugate)される。従来技術のビオチ
ンラベルには、フォトビオチン（PHOTOBIOTIN TM）（Ｎ
−〔４−アジド−２−ニトロフェニル〕−Ｎ′−〔Ｎ−
ｄ−ビオチニル−３−アミノプロピル〕−Ｎ′−メチル
−３−プロパンジアミン）、ビオチンスクシンイミドエ
ステル（ビオチン−ＮＨＳ）、及びビオチンヒドラジド
がある。フォトビオチンは、約１５分でプローブポリヌ
クレオチドを修飾できるが、非常に高価である。フォト
ビオチンは、不安定であり極度に光に鋭敏であるため修
飾反応の制御を難しくするさらなる欠点を有している。
ビオチンヒドラジド及びビオチンスクシンイミドエステ
ルはフォトビオチン程高価ではないが、両方とも、より
長い修飾反応時間を要する。ビオチンスクシンイミドエ
ステルによる修飾は、２段階の手順であるのに対し、ビ
オチンヒドラジドは、修飾反応の完結に２４時間から約
２日半を必要とする。費用、安定性及び修飾反応時間の
考慮に加えて、ビオチン標識には、「粘着性（stickine
ss）」、すなわち凝集の問題がある。粘着性とは、ビオ
チニル化抗体及び／または核酸プローブが中性（帯電し
てない）ビオチンに接合した通常は帯電したポリヌクレ
オチドの表面特性の変化により凝集する状態を指す。凝
集の問題は、標識したプローブの準備に用いた標識付け
接合体に関係なく全てのビオチン標識にある。凝集は、
修飾反応中に低い反応性と下がった溶解性をもたらす。
【０００６】ビオチン以外の非放射性標識は、これらの
問題を処理する目的でプローブへの組入れに探索されて
きた。非放射性標識は代わりの核酸及び蛋白質プローブ
標識として有用でもある。ビオチンの別の標識がビオチ
ニル化プローブと関連させて用いられると、単一段階で
サンドイッチ検定が行うことができる。２つの非放射性
非ビオチンハプテン性標識が、最近ある成功を収めた。
１つは、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフル
オレン（ＡＡＦ）とその７−ヨード−誘導体（ＡＡＩ
Ｆ）である。ＡＡＦ及びＡＡＩＦはグアニン残基を修飾
する。もう１つは、メトキシアミン（ｏ−メチルヒドロ
キシルアミン、メトキシルアミン、α−メチルヒドロキ
シルアミン及びヒドロキシルアミンメチルエーテルとも
呼ばれる）である。メトキシアミン標識したプローブを
用いた商業的なキットが、シグマ化学社、セントルイ
ス、ミズリー（Sigma Chemical Company, St.Louis, Mi
ssouri ）（スルホプローブ（SulfoPROBETW））、ＦＭ
Ｃバイオプロダクト、ロックランド、メリーランド（FM
C BioProducts, Rockland, Maryland)（ケミプローブ
（CHEMIPROBETM））及びオーゲニックス社（Orgenics,
Ltd.）（イスラエル）（ケミプローブ（CHEMIPROB
ETM））から入手できる。これらの２つの標識は、どれ
もビオチン標識に関連する問題を完全には克服しない。
ＡＡＦは、不安定である。メトキシアミンは、より安定
であるが、あまり可溶性ではなく、標識付けプロセス中
での低い反応性をもたらし、またビオチン標識で典型的
に起る「粘着性」の問題の効果的緩和が少なくなる。Ａ
ＡＦ及びメトキシアミンは、ともに発癌性であり、した
がってかなり注意して用いられなければならない。従っ
て、必要とされるのは（１）ハプテン性で、（２）安定
で、（３）反応性であり（標識付けの容易さに対し）、
（４）可溶性であり（標識付けの容易さに対してと「粘
着性」の問題を緩和することに対して）、（５）非発癌
性であり、（６）非放射性であり、そして（７）高価で
ない核酸プローブ及び蛋白質プローブのための標識であ
る。
問題を処理する目的でプローブへの組入れに探索されて
きた。非放射性標識は代わりの核酸及び蛋白質プローブ
標識として有用でもある。ビオチンの別の標識がビオチ
ニル化プローブと関連させて用いられると、単一段階で
サンドイッチ検定が行うことができる。２つの非放射性
非ビオチンハプテン性標識が、最近ある成功を収めた。
１つは、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフル
オレン（ＡＡＦ）とその７−ヨード−誘導体（ＡＡＩ
Ｆ）である。ＡＡＦ及びＡＡＩＦはグアニン残基を修飾
する。もう１つは、メトキシアミン（ｏ−メチルヒドロ
キシルアミン、メトキシルアミン、α−メチルヒドロキ
シルアミン及びヒドロキシルアミンメチルエーテルとも
呼ばれる）である。メトキシアミン標識したプローブを
用いた商業的なキットが、シグマ化学社、セントルイ
ス、ミズリー（Sigma Chemical Company, St.Louis, Mi
ssouri ）（スルホプローブ（SulfoPROBETW））、ＦＭ
Ｃバイオプロダクト、ロックランド、メリーランド（FM
C BioProducts, Rockland, Maryland)（ケミプローブ
（CHEMIPROBETM））及びオーゲニックス社（Orgenics,
Ltd.）（イスラエル）（ケミプローブ（CHEMIPROB
ETM））から入手できる。これらの２つの標識は、どれ
もビオチン標識に関連する問題を完全には克服しない。
ＡＡＦは、不安定である。メトキシアミンは、より安定
であるが、あまり可溶性ではなく、標識付けプロセス中
での低い反応性をもたらし、またビオチン標識で典型的
に起る「粘着性」の問題の効果的緩和が少なくなる。Ａ
ＡＦ及びメトキシアミンは、ともに発癌性であり、した
がってかなり注意して用いられなければならない。従っ
て、必要とされるのは（１）ハプテン性で、（２）安定
で、（３）反応性であり（標識付けの容易さに対し）、
（４）可溶性であり（標識付けの容易さに対してと「粘
着性」の問題を緩和することに対して）、（５）非発癌
性であり、（６）非放射性であり、そして（７）高価で
ない核酸プローブ及び蛋白質プローブのための標識であ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】要約 本発明は、これらの要求を満足する標識を検出するため
のモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、及びその
他の抗体（例えば組換えＤＮＡ技術で作られた抗体）を
提供する。また本発明は、前記モノクロナール抗体を作
るハイブリドーマ、及び前記抗体をコード化するポリヌ
クレオチド配列を提供する。前記標識はポリヌクレオチ
ドに付着させられてハイブリッド形成プローブを作るこ
とができる。ハイブリッド形成プローブは捕獲ポリヌク
レオチドとハイブリッド形成することができる。標識
は、また、蛋白質プローブに付着させられて蛋白質プロ
ーブを作ることができる。蛋白質プローブは、さまざま
な種類の特異的な結合相手に結合することができる。
のモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、及びその
他の抗体（例えば組換えＤＮＡ技術で作られた抗体）を
提供する。また本発明は、前記モノクロナール抗体を作
るハイブリドーマ、及び前記抗体をコード化するポリヌ
クレオチド配列を提供する。前記標識はポリヌクレオチ
ドに付着させられてハイブリッド形成プローブを作るこ
とができる。ハイブリッド形成プローブは捕獲ポリヌク
レオチドとハイブリッド形成することができる。標識
は、また、蛋白質プローブに付着させられて蛋白質プロ
ーブを作ることができる。蛋白質プローブは、さまざま
な種類の特異的な結合相手に結合することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】定義 本発明の理解を便するために、以下に定義を示す。定義
が本分野の意味で多様となる範囲で、以下の定義は、標
準（control)である。用語「プローブ」は、ハイブリッ
ド形成プローブまたは蛋白質プローブを意味している。
「ハイブリッド形成プローブ」は、帯電したハプテン標
識に付着したポリヌクレオチドを意味する。帯電ハプテ
ン標識は、結合部分によりポリヌクレオチドに付着され
る。結合部分に接合したラベルは、「タグ」化合物を形
成する。用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」と同じ
意味で用いられ、すべてのオリゴヌクレオチドを含む。
「プローブポリヌクレオチド」は、「ハイブリッド形成
プローブ」のポリヌクレオチドであり、一本鎖のポリヌ
クレオチドフラグメントまたは鎖を意味する。プローブ
ポリヌクレオチドの構造は、既知でるかまたは未知であ
ってよい。プローブポリヌクレオチドは、一本鎖のＤＮ
ＡまたはＲＮＡのどちらであってもよい。
が本分野の意味で多様となる範囲で、以下の定義は、標
準（control)である。用語「プローブ」は、ハイブリッ
ド形成プローブまたは蛋白質プローブを意味している。
「ハイブリッド形成プローブ」は、帯電したハプテン標
識に付着したポリヌクレオチドを意味する。帯電ハプテ
ン標識は、結合部分によりポリヌクレオチドに付着され
る。結合部分に接合したラベルは、「タグ」化合物を形
成する。用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」と同じ
意味で用いられ、すべてのオリゴヌクレオチドを含む。
「プローブポリヌクレオチド」は、「ハイブリッド形成
プローブ」のポリヌクレオチドであり、一本鎖のポリヌ
クレオチドフラグメントまたは鎖を意味する。プローブ
ポリヌクレオチドの構造は、既知でるかまたは未知であ
ってよい。プローブポリヌクレオチドは、一本鎖のＤＮ
ＡまたはＲＮＡのどちらであってもよい。
【０００９】用語「捕獲」ポリヌクレオチドは、プロー
ブポリヌクレオチドがハイブリッド形成し得るポリヌク
レオチドを意味する。用語「標的」ポリヌクレオチド
は、試験試料からのまたは試験試料中のポリヌクレオチ
ドを意味する。標的ポリヌクレオチドは「未知」のポリ
ヌクレオチドである。用語「対照」ポリヌクレオチドは
「既知」のポリヌクレオチドを意味する。既知のポリヌ
クレオチドは既知の生物体からのポリヌクレオチドまた
は構造が少なくとも一部特徴付けられているポリヌクレ
オチドを意味する。標的ポリヌクレオチドまたは対照ポ
リヌクレオチドは帯電ハプテン標識に付着させることに
よりプローブポリヌクレオチドとして用いることができ
る。「蛋白質プローブ」は帯電ハプテン標識に付着した
蛋白質を含んでなる。帯電ハプテン標識は結合部分によ
り蛋白質へ付着される。「プローブ蛋白質」は、蛋白質
プローブの特異的な結合蛋白質である。プロープ蛋白質
の構造は、既知であっても未知であってもよい。用語
「捕獲分子」はプローブ蛋白質と特異的に結合すること
のできる分子である。
ブポリヌクレオチドがハイブリッド形成し得るポリヌク
レオチドを意味する。用語「標的」ポリヌクレオチド
は、試験試料からのまたは試験試料中のポリヌクレオチ
ドを意味する。標的ポリヌクレオチドは「未知」のポリ
ヌクレオチドである。用語「対照」ポリヌクレオチドは
「既知」のポリヌクレオチドを意味する。既知のポリヌ
クレオチドは既知の生物体からのポリヌクレオチドまた
は構造が少なくとも一部特徴付けられているポリヌクレ
オチドを意味する。標的ポリヌクレオチドまたは対照ポ
リヌクレオチドは帯電ハプテン標識に付着させることに
よりプローブポリヌクレオチドとして用いることができ
る。「蛋白質プローブ」は帯電ハプテン標識に付着した
蛋白質を含んでなる。帯電ハプテン標識は結合部分によ
り蛋白質へ付着される。「プローブ蛋白質」は、蛋白質
プローブの特異的な結合蛋白質である。プロープ蛋白質
の構造は、既知であっても未知であってもよい。用語
「捕獲分子」はプローブ蛋白質と特異的に結合すること
のできる分子である。
【００１０】ハイブリッド形成プローブ ハイブリッド形成プローブは少なくとも３つの部分を有
する。この３つの部分はプローブポリヌクレオチド、帯
電ハプテン標識及び結合部分である。プローブポリヌク
レオチドは、捕獲ポリヌクレオチドの少なくとも１つの
配列または領域と実質的に相補的な少なくとも１つの配
列または領域を有する。プローブポリヌクレオチド及び
捕獲ポリヌクレオチドは、したがって、互いにハイブリ
ッド形成することができる。プローブポリヌクレオチド
は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは、少
なくとも１つのシトシン塩基を有している。シトシン塩
基は、付着反応または修飾反応で好ましい結合部分によ
りアミノ交換される。帯電ハプテン標識は、標識と帯電
ハプテン標識に特異的な抗体との間の免疫反応により検
出される。好ましくは、帯電ハプテン標識は、実効陰電
荷がもたらす増加した溶解性のような利点のため実効陰
電荷を有している。当業者により容易に認識されるよう
に、さらには、正に帯電したハプテン標識の抗体の検出
は、困難である。好ましくは、ハプテン標識は、負に帯
電した置換フェニル基であり、より好ましくは、カルボ
キシレート置換またはスルホネート置換（すなわちＳＯ
3 置換）フェニル基である。結合部分は、帯電ハプテン
標識をプローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質
に付着させるように働く。求核基を含む結合部分は修飾
抵抗性ポリヌクレオチドに対し反応性である。結合部分
はヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒド
ラゾン、オキシム、カルバジド、カルバゾン、第一アミ
ン、第二アミン、第三アミン、アミド及びそれらの誘導
体からなる群から選択することができる。好ましい結合
部分は、ヒドラジンである。ヒドラジンは、シトシン塩
基とよく反応し、ヒドラジン含有結合部分は、ポリヌク
レオチドのシトシン塩基を修飾するのに用いられる。
する。この３つの部分はプローブポリヌクレオチド、帯
電ハプテン標識及び結合部分である。プローブポリヌク
レオチドは、捕獲ポリヌクレオチドの少なくとも１つの
配列または領域と実質的に相補的な少なくとも１つの配
列または領域を有する。プローブポリヌクレオチド及び
捕獲ポリヌクレオチドは、したがって、互いにハイブリ
ッド形成することができる。プローブポリヌクレオチド
は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは、少
なくとも１つのシトシン塩基を有している。シトシン塩
基は、付着反応または修飾反応で好ましい結合部分によ
りアミノ交換される。帯電ハプテン標識は、標識と帯電
ハプテン標識に特異的な抗体との間の免疫反応により検
出される。好ましくは、帯電ハプテン標識は、実効陰電
荷がもたらす増加した溶解性のような利点のため実効陰
電荷を有している。当業者により容易に認識されるよう
に、さらには、正に帯電したハプテン標識の抗体の検出
は、困難である。好ましくは、ハプテン標識は、負に帯
電した置換フェニル基であり、より好ましくは、カルボ
キシレート置換またはスルホネート置換（すなわちＳＯ
3 置換）フェニル基である。結合部分は、帯電ハプテン
標識をプローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質
に付着させるように働く。求核基を含む結合部分は修飾
抵抗性ポリヌクレオチドに対し反応性である。結合部分
はヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒド
ラゾン、オキシム、カルバジド、カルバゾン、第一アミ
ン、第二アミン、第三アミン、アミド及びそれらの誘導
体からなる群から選択することができる。好ましい結合
部分は、ヒドラジンである。ヒドラジンは、シトシン塩
基とよく反応し、ヒドラジン含有結合部分は、ポリヌク
レオチドのシトシン塩基を修飾するのに用いられる。
【００１１】ハイブリッド形成プローブ及び蛋白質は、
また、「スペーサー」成分を有していてもよい。スペー
サー成分は結合部分と帯電ハプテン標識との間に位置さ
せられ、帯電ハプテン標識をプローブポリヌクレオチド
から、あるいは蛋白質プローブの場合プローブ蛋白質か
ら、間隙をおいて分離するように働く。分離は、帯電ハ
プテン標識と標識に特異的な抗体との間の免疫反応中に
おけるプローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質
による立体障害を減ずるのを助ける。スペーサー化合物
は、プローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質か
らの、帯電ハプテン標識の所望の分離をさせるのに十分
な大きさである。好ましいハイブリッド形成プローブ
は、一本鎖の核酸のシトシン塩基の４−位にそのヒドラ
ジン末端を介して共有結合した４−ヒドラジノベンゼン
スルフォネートアニオン化合物である。この核酸プロー
ブは、温和な条件下で形成させることができ、その使用
は、ピコグラム量の捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能
とする。ハイブリッド形成プローブまたは蛋白質プロー
ブは、１つまたはそれ以上の追加の標識例えばビオチン
標識を有することができる。追加の標識は、追加の検出
可能な部位を与えることができ、したがって、ノイズま
たはバックグラウンド信号を減らすのを助ける。
また、「スペーサー」成分を有していてもよい。スペー
サー成分は結合部分と帯電ハプテン標識との間に位置さ
せられ、帯電ハプテン標識をプローブポリヌクレオチド
から、あるいは蛋白質プローブの場合プローブ蛋白質か
ら、間隙をおいて分離するように働く。分離は、帯電ハ
プテン標識と標識に特異的な抗体との間の免疫反応中に
おけるプローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質
による立体障害を減ずるのを助ける。スペーサー化合物
は、プローブポリヌクレオチドまたはプローブ蛋白質か
らの、帯電ハプテン標識の所望の分離をさせるのに十分
な大きさである。好ましいハイブリッド形成プローブ
は、一本鎖の核酸のシトシン塩基の４−位にそのヒドラ
ジン末端を介して共有結合した４−ヒドラジノベンゼン
スルフォネートアニオン化合物である。この核酸プロー
ブは、温和な条件下で形成させることができ、その使用
は、ピコグラム量の捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能
とする。ハイブリッド形成プローブまたは蛋白質プロー
ブは、１つまたはそれ以上の追加の標識例えばビオチン
標識を有することができる。追加の標識は、追加の検出
可能な部位を与えることができ、したがって、ノイズま
たはバックグラウンド信号を減らすのを助ける。
【００１２】ハイブリッド形成プローブを製造する方法
は、プローブポリヌクレオチドを選択すること、結合部
分に接合した帯電ハプテン標識を選択すること、結合部
分を付着反応でプローブポリヌクレオチドに付着させて
ハイブリッド形成プローブを作ること、及び付着反応を
停止化合物で停止させることを含んでなる。捕獲ポリヌ
クレオチドを検出する方法は、ハイブリッド形成プロー
ブと捕獲ポリヌクレオチドとを混合すること、混合物を
温置して捕獲ポリヌクレオチドとハイブリッド形成プロ
ーブとの間にハイブリッド形成反応を起こさせること、
ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形成され
てないプローブから分離すること及びハイブリッド形成
したプローブまたはハイブリッド形成していないプロー
ブを検出することを含んでなる。検出手段は、ハイブリ
ッド形成プローブの帯電したハプテン標識に特異的な抗
体を用いる免疫検出手段であってよい。
は、プローブポリヌクレオチドを選択すること、結合部
分に接合した帯電ハプテン標識を選択すること、結合部
分を付着反応でプローブポリヌクレオチドに付着させて
ハイブリッド形成プローブを作ること、及び付着反応を
停止化合物で停止させることを含んでなる。捕獲ポリヌ
クレオチドを検出する方法は、ハイブリッド形成プロー
ブと捕獲ポリヌクレオチドとを混合すること、混合物を
温置して捕獲ポリヌクレオチドとハイブリッド形成プロ
ーブとの間にハイブリッド形成反応を起こさせること、
ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形成され
てないプローブから分離すること及びハイブリッド形成
したプローブまたはハイブリッド形成していないプロー
ブを検出することを含んでなる。検出手段は、ハイブリ
ッド形成プローブの帯電したハプテン標識に特異的な抗
体を用いる免疫検出手段であってよい。
【００１３】抗体及びハイブリドーマ 本発明は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体及
びハイブリドーマを提供する。ポリクロナール抗体及び
モノクロナール抗体は、好ましいハプテン性スルホニル
標識に対して特異的な結合親和性を有する。抗体はＩｇ
Ｇイソタイプ抗体であってよい。ハイブリドーマは好ま
しいハプテン性スルホフェニル化合物に対して特異的な
親和性を有するモノクロナール抗体を作ることができ
る。ハイブリドーマは、スルホフェニル抗原により免疫
されたマウス脾臓細胞のハイブリッドであるか、または
マウス骨髄腫細胞のハイブリッドであってよい。
びハイブリドーマを提供する。ポリクロナール抗体及び
モノクロナール抗体は、好ましいハプテン性スルホニル
標識に対して特異的な結合親和性を有する。抗体はＩｇ
Ｇイソタイプ抗体であってよい。ハイブリドーマは好ま
しいハプテン性スルホフェニル化合物に対して特異的な
親和性を有するモノクロナール抗体を作ることができ
る。ハイブリドーマは、スルホフェニル抗原により免疫
されたマウス脾臓細胞のハイブリッドであるか、または
マウス骨髄腫細胞のハイブリッドであってよい。
【００１４】蛋白質プローブ 蛋白質プローブは、少なくとも３つの部分を有してい
る。この３つの部分は、プローブ蛋白質、帯電ハプテン
標識及び結合部分である。プローブ蛋白質は捕獲分子と
の特異的親和性結合反応をすることができる。帯電ハプ
テン標識は、帯電ハプテン標識と標識に特異的な抗体と
の間の免疫反応により検出される。結合部分は帯電ハプ
テン標識をプローブ蛋白質に付着させる。
る。この３つの部分は、プローブ蛋白質、帯電ハプテン
標識及び結合部分である。プローブ蛋白質は捕獲分子と
の特異的親和性結合反応をすることができる。帯電ハプ
テン標識は、帯電ハプテン標識と標識に特異的な抗体と
の間の免疫反応により検出される。結合部分は帯電ハプ
テン標識をプローブ蛋白質に付着させる。
【００１５】キット ハイブリッド形成プローブを作り、帯電ハプテン標識を
検出するキットは、帯電ハプテン標識、結合部分、プロ
ーブポリヌクレオチドへの結合部分の付着反応を触媒す
る手段及び帯電ハプテン標識に特異的な抗体を含んでい
る。蛋白質プローブを作り、捕獲分子を検出するキット
は、帯電ハプテン標識、結合部分、プローブ蛋白質への
結合部分の付着反応を触媒する手段及び帯電ハプテン標
識に特異的な抗体を含んでいる。本発明の抗体などが特
異的な結合親和性を有する標識は、結合部分に接合され
た時に、可溶性であり、安定であり、よく反応し、ハプ
テン性であり、非放射性であり、そして高価でない、蛋
白質プローブラベル及び核酸標識のための従来技術の要
求を満足する。これらの特徴は、温和な条件下で一本鎖
のポリヌクレオチドまたは蛋白質に迅速に付着し、少量
の捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子の検出を可能とす
る標識結合部分接合体（タグ化合物）をもたらす。本発
明のこれらの特徴及び他の特徴、態様及び利点は以下の
説明、添付の請求の範囲及び添付の図面からより良く理
解されよう。
検出するキットは、帯電ハプテン標識、結合部分、プロ
ーブポリヌクレオチドへの結合部分の付着反応を触媒す
る手段及び帯電ハプテン標識に特異的な抗体を含んでい
る。蛋白質プローブを作り、捕獲分子を検出するキット
は、帯電ハプテン標識、結合部分、プローブ蛋白質への
結合部分の付着反応を触媒する手段及び帯電ハプテン標
識に特異的な抗体を含んでいる。本発明の抗体などが特
異的な結合親和性を有する標識は、結合部分に接合され
た時に、可溶性であり、安定であり、よく反応し、ハプ
テン性であり、非放射性であり、そして高価でない、蛋
白質プローブラベル及び核酸標識のための従来技術の要
求を満足する。これらの特徴は、温和な条件下で一本鎖
のポリヌクレオチドまたは蛋白質に迅速に付着し、少量
の捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子の検出を可能とす
る標識結合部分接合体（タグ化合物）をもたらす。本発
明のこれらの特徴及び他の特徴、態様及び利点は以下の
説明、添付の請求の範囲及び添付の図面からより良く理
解されよう。
【００１６】説明 本発明は、ある種の化合物がポリヌクレオチドを標識付
けするための優れた非放射性ハプテン性標識として働き
得ることの知見に基づく。標識したポリヌクレオチドは
核酸プローブとして用いられる。ハイブリッド形成プロ
ーブとも呼ばれる核酸プローブは、特異的ポリヌクレオ
チド配列を検出するのに用いられる。各種の試験試料中
の特異的ポリヌクレオチド配列が、検出できる。試験試
料は、例えば、組織標本、血清、血漿、尿、唾液、脳脊
髄液、羊水及び他の生理的流体を含む。加えて本発明の
非放射性ハプテン性標識は、蛋白質プローブとして用い
る蛋白質を標識するために用いることができる。
けするための優れた非放射性ハプテン性標識として働き
得ることの知見に基づく。標識したポリヌクレオチドは
核酸プローブとして用いられる。ハイブリッド形成プロ
ーブとも呼ばれる核酸プローブは、特異的ポリヌクレオ
チド配列を検出するのに用いられる。各種の試験試料中
の特異的ポリヌクレオチド配列が、検出できる。試験試
料は、例えば、組織標本、血清、血漿、尿、唾液、脳脊
髄液、羊水及び他の生理的流体を含む。加えて本発明の
非放射性ハプテン性標識は、蛋白質プローブとして用い
る蛋白質を標識するために用いることができる。
【００１７】ハイブリッド形成プローブ ハイブリッド形成プローブは、プローブポリヌクレオチ
ド、帯電ハプテン標識及び結合部分を含んでなる。プロ
ーブポリヌクレオチドは、捕獲ポリヌクレオチドの少な
くとも１つのポリヌクレオチド配列に実質的に相補的な
少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するので、２つ
のポリヌクレオチドを一緒にハイブリッド形成させるこ
とができる。帯電ハプテン標識は、標識と標識に特異的
な抗体との間の免疫反応により検出される。結合部分
は、帯電ハプテン標識をプローブポリヌクレオチドに付
着させる働きをする。プローブポリヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは、一本鎖の
核酸である。標識がプローブポリヌクレオチドに付着さ
れる付着反応は二本鎖の核酸ではより困難である。
ド、帯電ハプテン標識及び結合部分を含んでなる。プロ
ーブポリヌクレオチドは、捕獲ポリヌクレオチドの少な
くとも１つのポリヌクレオチド配列に実質的に相補的な
少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するので、２つ
のポリヌクレオチドを一緒にハイブリッド形成させるこ
とができる。帯電ハプテン標識は、標識と標識に特異的
な抗体との間の免疫反応により検出される。結合部分
は、帯電ハプテン標識をプローブポリヌクレオチドに付
着させる働きをする。プローブポリヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは、一本鎖の
核酸である。標識がプローブポリヌクレオチドに付着さ
れる付着反応は二本鎖の核酸ではより困難である。
【００１８】好ましい標識は、中性ｐＨで帯電してい
て、水溶液中で可溶性であり、ハプテン性である。帯電
は、速い修飾反応を得るのを助けるのに望ましい水性の
溶解性を補助する。好ましいハプテン標識は、負に帯電
している。負の帯電は、中性のまたは正に帯電した標識
で遭遇する「粘着性」または凝集の問題を減ずるのを助
けることがわかった。好ましい標識は、室温で通常は安
定で商業的に入手できるハプテン性の陰イオンスルホフ
ェニル化合物である。結合部分は、標識を、プローブポ
リヌクレオチドまたは蛋白質プローブのプローブ蛋白質
のどちらかに付着させるように働く。好ましくは、結合
部分は求核性の結合部分を含んでなり、その理由は、い
くつかの求核性結合部分は付着反応で核酸を修飾できる
からである。結合部分として用いるのに適する各種の窒
素性求核性化合物が容易に入手できる。結合部分はヒド
ロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾ
ン、オキシム、カルバジド、カルバゾン、第一アミン、
第二アミン、第三アミン、アミド及びそれらの誘導体か
らなる群から選択できる。これらの化合物は、その「求
核性」の強さにおいて多様である。好ましい窒素性求核
性結合部分はヒドラジンであり、その理由は、ヒドラジ
ンの修飾抵抗性ポリヌクレオチドとの反応性にある。
て、水溶液中で可溶性であり、ハプテン性である。帯電
は、速い修飾反応を得るのを助けるのに望ましい水性の
溶解性を補助する。好ましいハプテン標識は、負に帯電
している。負の帯電は、中性のまたは正に帯電した標識
で遭遇する「粘着性」または凝集の問題を減ずるのを助
けることがわかった。好ましい標識は、室温で通常は安
定で商業的に入手できるハプテン性の陰イオンスルホフ
ェニル化合物である。結合部分は、標識を、プローブポ
リヌクレオチドまたは蛋白質プローブのプローブ蛋白質
のどちらかに付着させるように働く。好ましくは、結合
部分は求核性の結合部分を含んでなり、その理由は、い
くつかの求核性結合部分は付着反応で核酸を修飾できる
からである。結合部分として用いるのに適する各種の窒
素性求核性化合物が容易に入手できる。結合部分はヒド
ロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾ
ン、オキシム、カルバジド、カルバゾン、第一アミン、
第二アミン、第三アミン、アミド及びそれらの誘導体か
らなる群から選択できる。これらの化合物は、その「求
核性」の強さにおいて多様である。好ましい窒素性求核
性結合部分はヒドラジンであり、その理由は、ヒドラジ
ンの修飾抵抗性ポリヌクレオチドとの反応性にある。
【００１９】結合部分に共有結合した帯電ハプテン標識
はタグ化合物を形成する。好ましくは、帯電ハプテン標
識及び結合部分は、タグ化合物の両端にあってその相互
作用を防ぎ、帯電ハプテン標識の免疫検出反応の間の立
体障害を減ずる。タグ化合物の結合部分と標識との間に
は、任意の「スペーサー」化合物があってもよい。スペ
ーサーは、帯電ハプテン標識と結合標識との間に位置で
きるほとんどのいずれの化合物であってもよい。スペー
サー化合物は、プローブポリヌクレオチドへの標識の付
着の後にプローブポリヌクレオチドから標識を離すよう
に働く。適当なスペーサーの例は、約２−約１５の炭素
原子の直鎖である。プローブポリヌクレオチドから標識
を分離させることにより、スペーサー化合物は標識の免
疫検出の間プローブポリヌクレオチドによる立体障害の
減少を助ける。ヒドラジン結合部分に接合した適当な帯
電ハプテン標識の例は、以下に示す： １．４−ヒドラジノ安息香酸アニオン
はタグ化合物を形成する。好ましくは、帯電ハプテン標
識及び結合部分は、タグ化合物の両端にあってその相互
作用を防ぎ、帯電ハプテン標識の免疫検出反応の間の立
体障害を減ずる。タグ化合物の結合部分と標識との間に
は、任意の「スペーサー」化合物があってもよい。スペ
ーサーは、帯電ハプテン標識と結合標識との間に位置で
きるほとんどのいずれの化合物であってもよい。スペー
サー化合物は、プローブポリヌクレオチドへの標識の付
着の後にプローブポリヌクレオチドから標識を離すよう
に働く。適当なスペーサーの例は、約２−約１５の炭素
原子の直鎖である。プローブポリヌクレオチドから標識
を分離させることにより、スペーサー化合物は標識の免
疫検出の間プローブポリヌクレオチドによる立体障害の
減少を助ける。ヒドラジン結合部分に接合した適当な帯
電ハプテン標識の例は、以下に示す： １．４−ヒドラジノ安息香酸アニオン
【００２０】
【化１】
【００２１】２．４−（ヒドラジノスロニル）安息香酸
アニオン
アニオン
【００２２】
【化２】
【００２３】３．スルホフェニルヒドラジンアニオン- ＳＯ3 −φ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ2 （ここで、φはフェニル基であり、Ｘはスペーサー化合
物である。） 結合部分に接合した好ましい帯電ハプテン標識は、スル
ホフェニルヒドラジン化合物である。好ましいスルホフ
ェニルヒドラジン化合物は、末端ヒドラジン結合部分に
共有結合したハプテン性の陰イオンスルホフェニル標識
を含んでなる。非常に好ましいスルホフェニルヒドラジ
ン化合物は「ＳＰＨ」と呼ばれる４−ヒドラジノベンゼ
ンスルホネートアニオンである。ＳＰＨは、次の構造を
有している：
物である。） 結合部分に接合した好ましい帯電ハプテン標識は、スル
ホフェニルヒドラジン化合物である。好ましいスルホフ
ェニルヒドラジン化合物は、末端ヒドラジン結合部分に
共有結合したハプテン性の陰イオンスルホフェニル標識
を含んでなる。非常に好ましいスルホフェニルヒドラジ
ン化合物は「ＳＰＨ」と呼ばれる４−ヒドラジノベンゼ
ンスルホネートアニオンである。ＳＰＨは、次の構造を
有している：
【００２４】
【化３】
【００２５】ＳＰＨの使用は多くの利点を有する。ＳＰ
Ｈは、ハプテン性であり、高価でなく、安定であり、修
飾抵抗ポリヌクレオチド及びある種の蛋白質と良く反応
し、商業的に入手可能であり、非発癌性と確信され、非
放射性であり、そして高い水溶解性を有している。加え
て、ＳＰＨは、室温で長期間保存できる。シトシン塩基
とのＳＰＨのヒドラジン末端の反応性は、付着反応また
は修飾反応でシトシン塩基含有ポリヌクレオチドをＳＰ
Ｈで標識することを約３０分未満で可能とする。標識と
してＳＰＨを用いるもう１つの利点は、ＳＰＨによる修
飾に先立つプローブポリヌクレオチドの必要な精製がほ
んの最小限で良いことである。ＳＰＨ−シトシン修飾反
応の特異性のために、最小限の精製が十分である。シト
シンに対するＳＰＨの顕著な反応特異性は、脂肪酸、炭
水化物及び他の化合物の非特異性標識付けを減ずる。典
型的には、スピンカラム（spin column ）で５分間で十
分な精製を与える。ＳＰＨの使用のもう１つの利点は、
ＳＰＨが１モル未満（すなわち、約５０ｍＭ）から数モ
ルのモル濃度（すなわち、約８Ｍ）で室温で水溶液中で
可溶性であることである。大きな水溶解度は、アニオン
スルホフェニルラベル成分の存在によると考えられる。
高い水溶解度は、ビオチニル化プローブで起こることが
知られている際立った凝集（すなわち「粘着性」）の問
題を伴わずに高水準のポリヌクレオチド修飾を可能にす
る。
Ｈは、ハプテン性であり、高価でなく、安定であり、修
飾抵抗ポリヌクレオチド及びある種の蛋白質と良く反応
し、商業的に入手可能であり、非発癌性と確信され、非
放射性であり、そして高い水溶解性を有している。加え
て、ＳＰＨは、室温で長期間保存できる。シトシン塩基
とのＳＰＨのヒドラジン末端の反応性は、付着反応また
は修飾反応でシトシン塩基含有ポリヌクレオチドをＳＰ
Ｈで標識することを約３０分未満で可能とする。標識と
してＳＰＨを用いるもう１つの利点は、ＳＰＨによる修
飾に先立つプローブポリヌクレオチドの必要な精製がほ
んの最小限で良いことである。ＳＰＨ−シトシン修飾反
応の特異性のために、最小限の精製が十分である。シト
シンに対するＳＰＨの顕著な反応特異性は、脂肪酸、炭
水化物及び他の化合物の非特異性標識付けを減ずる。典
型的には、スピンカラム（spin column ）で５分間で十
分な精製を与える。ＳＰＨの使用のもう１つの利点は、
ＳＰＨが１モル未満（すなわち、約５０ｍＭ）から数モ
ルのモル濃度（すなわち、約８Ｍ）で室温で水溶液中で
可溶性であることである。大きな水溶解度は、アニオン
スルホフェニルラベル成分の存在によると考えられる。
高い水溶解度は、ビオチニル化プローブで起こることが
知られている際立った凝集（すなわち「粘着性」）の問
題を伴わずに高水準のポリヌクレオチド修飾を可能にす
る。
【００２６】ハイブリッド形成プローブを作る方法 捕獲ポリヌクレオチドによりハイブリッド形成できるハ
イブリッド形成プローブを作る方法は、先ず、プローブ
ポリヌクレオチド、帯電ハプテン標識、さらに結合部分
を選択することを含んでなる。好ましくは、選択された
帯電ハプテン標識及び結合部分はタグ化合物として相互
に共有結合される。次の段階は付着反応または修飾反応
でタグ化合物の結合部分をプローブポリヌクレオチドに
付着させてから、停止化合物で付着反応を停止させるこ
とである。付着反応は、結合部分に接合した帯電ハプテ
ン標識の溶液にプローブポリヌクレオチドの溶液を加え
ることにより適当な容器中で行うことができる。典型的
には、付着反応は、好ましくは、約３０分後またはそれ
以内で、停止化合物により停止される。３０分またはそ
れ以内の付着反応は、標識が免疫検出手段により容易に
検出されるように、十分な数の帯電ハプテン標識をプロ
ーブポリヌクレオチドに付着することを可能にする。付
着反応を約３０分よりも長く続けることは、帯電ハプテ
ン標識による非特異的標識付けの過剰量をもたらしかね
ない。非特異的標識付けは検出手段を適用するに当た
り、「ノイズ」または信号干渉として表われる。ノイズ
は、捕獲ポリヌクレオチドの検出をより難しいものとす
る。加えて、付着反応を約３０分を越えて続けること
は、ハイブリッド形成反応中、塩基対合（base pairin
g）を干渉しかねない。塩基対合は、プローブポリヌク
レオチドに付着できる過度に多数の帯電ハプテン標識に
よって干渉される。最適には、付着反応は亜硫酸塩また
は重亜硫酸塩の触媒作用によるものである。この塩は重
亜硫酸ナトリウムの水溶液であってよい。図２に示す結
果は重亜硫酸ナトリウムが付着反応触媒として重硫酸ア
ンモニウムより優れていることを示す。
イブリッド形成プローブを作る方法は、先ず、プローブ
ポリヌクレオチド、帯電ハプテン標識、さらに結合部分
を選択することを含んでなる。好ましくは、選択された
帯電ハプテン標識及び結合部分はタグ化合物として相互
に共有結合される。次の段階は付着反応または修飾反応
でタグ化合物の結合部分をプローブポリヌクレオチドに
付着させてから、停止化合物で付着反応を停止させるこ
とである。付着反応は、結合部分に接合した帯電ハプテ
ン標識の溶液にプローブポリヌクレオチドの溶液を加え
ることにより適当な容器中で行うことができる。典型的
には、付着反応は、好ましくは、約３０分後またはそれ
以内で、停止化合物により停止される。３０分またはそ
れ以内の付着反応は、標識が免疫検出手段により容易に
検出されるように、十分な数の帯電ハプテン標識をプロ
ーブポリヌクレオチドに付着することを可能にする。付
着反応を約３０分よりも長く続けることは、帯電ハプテ
ン標識による非特異的標識付けの過剰量をもたらしかね
ない。非特異的標識付けは検出手段を適用するに当た
り、「ノイズ」または信号干渉として表われる。ノイズ
は、捕獲ポリヌクレオチドの検出をより難しいものとす
る。加えて、付着反応を約３０分を越えて続けること
は、ハイブリッド形成反応中、塩基対合（base pairin
g）を干渉しかねない。塩基対合は、プローブポリヌク
レオチドに付着できる過度に多数の帯電ハプテン標識に
よって干渉される。最適には、付着反応は亜硫酸塩また
は重亜硫酸塩の触媒作用によるものである。この塩は重
亜硫酸ナトリウムの水溶液であってよい。図２に示す結
果は重亜硫酸ナトリウムが付着反応触媒として重硫酸ア
ンモニウムより優れていることを示す。
【００２７】付着反応は、プローブポリヌクレオチドの
多数のさまざまな可能な付着部位のいずれかに結合部分
を付着させることにより進めることができる。結合部分
は、プローブポリヌクレオチドの末端ホスフェート基、
例えば末端５′ホスフェートに付着され得る。そのよう
な付着を行う方法は、ビー・シー・エフ・チュ（B. C.
F. Chu) らにより「保護されていないポリヌクレオチド
の誘導（Derivatization of Unprotected Polynucleoti
des)」核酸研究（Nucleic Acids Research）、１１（１
８）、６５１３−６５２９、（１９８３）に記載されて
いるが、そのような付着を達成する当業者に公知のいず
れの方法も用いることができる。別法として、結合部分
を、ＲＮＡ分子の３′末端に付着させてもよい。この種
の付着を達成する方法は、エフ・ハンスケ（F. Hanssk
e）らにより「パーオデート酸化及びヒドラジドによる
後続反応によるｔＲＮＡの３′末端の修飾（Modificati
on of the 3' Termination of tRNA by Perodate Oxida
tion and Subsequent Reaction with Hydrazides）、酵
素学での方法（Methods in Enzymology)、５９（１
０）、１７２−１８１、（１９７９）に記載されている
が、そのような付着を達成する当業者に公知のいずれの
方法も用いられる。各種の停止化合物が用いられる。例
えば、停止化合物は、反応溶液のｐＨを上げることによ
り付着反応を停止させることができる。トリス（Tris）
緩衝溶液を、ｐＨ上昇停止化合物として用いてもよい。
通常、ｐＨは少なくともｐＨ約７に上げて付着反応を停
止させる。
多数のさまざまな可能な付着部位のいずれかに結合部分
を付着させることにより進めることができる。結合部分
は、プローブポリヌクレオチドの末端ホスフェート基、
例えば末端５′ホスフェートに付着され得る。そのよう
な付着を行う方法は、ビー・シー・エフ・チュ（B. C.
F. Chu) らにより「保護されていないポリヌクレオチド
の誘導（Derivatization of Unprotected Polynucleoti
des)」核酸研究（Nucleic Acids Research）、１１（１
８）、６５１３−６５２９、（１９８３）に記載されて
いるが、そのような付着を達成する当業者に公知のいず
れの方法も用いることができる。別法として、結合部分
を、ＲＮＡ分子の３′末端に付着させてもよい。この種
の付着を達成する方法は、エフ・ハンスケ（F. Hanssk
e）らにより「パーオデート酸化及びヒドラジドによる
後続反応によるｔＲＮＡの３′末端の修飾（Modificati
on of the 3' Termination of tRNA by Perodate Oxida
tion and Subsequent Reaction with Hydrazides）、酵
素学での方法（Methods in Enzymology)、５９（１
０）、１７２−１８１、（１９７９）に記載されている
が、そのような付着を達成する当業者に公知のいずれの
方法も用いられる。各種の停止化合物が用いられる。例
えば、停止化合物は、反応溶液のｐＨを上げることによ
り付着反応を停止させることができる。トリス（Tris）
緩衝溶液を、ｐＨ上昇停止化合物として用いてもよい。
通常、ｐＨは少なくともｐＨ約７に上げて付着反応を停
止させる。
【００２８】別法として、停止化合物は、タグ化合物の
結合部分と反応して結合部分をブロックし付着反応が更
に進むのを防いで付着反応を停止させるブロッキング剤
でも良い。ブロッキング剤は求電子化合物、例えばアル
デヒドまたは無水物であってよい。適当な化合物には、
シンナムアルデヒド、コハク酸、サリチル酸及びＮ−ヒ
ドロキシコハク酸アミンエステルの無水物がある。これ
らの化合物は結合部分を迅速にブロックするので適当で
ある。最も好ましいブロッキング剤は、コハク酸無水物
である。求電子ブロッキング剤の使用の利点は、付着反
応を行う前にブロープポリヌクレオチドの精製を必要と
しないことである。プローブポリヌクレオチドの精製を
必要としないのは、求電子化合物が、結合部分に対して
高い反応特異性を有するからである。例えば、コハク酸
無水物は、多くの他の化合物を除外してしまうほどにヒ
ドラジン結合部分を特異的にブロックする。したがっ
て、精製段階で炭水化物、蛋白質などを除く必要が実質
的に排除される。
結合部分と反応して結合部分をブロックし付着反応が更
に進むのを防いで付着反応を停止させるブロッキング剤
でも良い。ブロッキング剤は求電子化合物、例えばアル
デヒドまたは無水物であってよい。適当な化合物には、
シンナムアルデヒド、コハク酸、サリチル酸及びＮ−ヒ
ドロキシコハク酸アミンエステルの無水物がある。これ
らの化合物は結合部分を迅速にブロックするので適当で
ある。最も好ましいブロッキング剤は、コハク酸無水物
である。求電子ブロッキング剤の使用の利点は、付着反
応を行う前にブロープポリヌクレオチドの精製を必要と
しないことである。プローブポリヌクレオチドの精製を
必要としないのは、求電子化合物が、結合部分に対して
高い反応特異性を有するからである。例えば、コハク酸
無水物は、多くの他の化合物を除外してしまうほどにヒ
ドラジン結合部分を特異的にブロックする。したがっ
て、精製段階で炭水化物、蛋白質などを除く必要が実質
的に排除される。
【００２９】図１は亜硫酸塩の触媒作用による付着反応
でのシトシン塩基によるＳＰＨに対する仮定の付着反応
化学を示す。図１では、Ａは、プローブポリヌクレオチ
ドＲのシトシン塩基を示し、Ｂは、６−炭素位に付着し
たスルホネート基を有するシトシン塩基であり、ＣはＳ
ＰＨタグ化合物であり、Ｄ及びＥは、Ｂの平衡種（equi
librium species)であり、そして、Ｆ及びＧは、付着反
応から生じるポリヌクレオチドプローブ平衡生成物を示
す。図１により示されるように、ＳＰＨが、付着反応
で、シトシン塩基をアミノ転移または修飾すると、ヒド
ラジン結合部分がシトシン塩基の４−炭素アミンをアミ
ノ転移または置換することによりシトシンの４−炭素位
に共有結合する。ポリヌクレオチドプローブ反応生成物
は１つより多い負の電荷を有し得る。よって、シトシン
塩基の４−位でのスルホフェニルの負に帯電したスルホ
ンに加えて、溶液の平衡条件に依存して、種Ｆにより示
されるように、シトシン塩基の６−位に負に帯電したス
ルホン基があってもよい。
でのシトシン塩基によるＳＰＨに対する仮定の付着反応
化学を示す。図１では、Ａは、プローブポリヌクレオチ
ドＲのシトシン塩基を示し、Ｂは、６−炭素位に付着し
たスルホネート基を有するシトシン塩基であり、ＣはＳ
ＰＨタグ化合物であり、Ｄ及びＥは、Ｂの平衡種（equi
librium species)であり、そして、Ｆ及びＧは、付着反
応から生じるポリヌクレオチドプローブ平衡生成物を示
す。図１により示されるように、ＳＰＨが、付着反応
で、シトシン塩基をアミノ転移または修飾すると、ヒド
ラジン結合部分がシトシン塩基の４−炭素アミンをアミ
ノ転移または置換することによりシトシンの４−炭素位
に共有結合する。ポリヌクレオチドプローブ反応生成物
は１つより多い負の電荷を有し得る。よって、シトシン
塩基の４−位でのスルホフェニルの負に帯電したスルホ
ンに加えて、溶液の平衡条件に依存して、種Ｆにより示
されるように、シトシン塩基の６−位に負に帯電したス
ルホン基があってもよい。
【００３０】スルホフェニルヒドラジンによる付着反応
は、約３０分未満で完結できる。図２に示すように、僅
か３分間で、シトシン塩基へ多数の検出可能なＳＰＨタ
グ化合物を付着させることができる。約１０分間の付着
反応が好ましく、その理由は、大きなノイズ及び塩基対
合の問題を伴わずにスルホフェニル標識の迅速検出に対
し十分なスルホニル標識の付着を可能とするからであ
る。ＳＰＨによる付着反応は、ＳＰＨの反応性と溶解度
のため迅速に完了できる。ＳＰＨ付着反応の速度は、反
応溶液温度を少なくとも約４０℃好ましくは約９０℃ま
で上昇させることにより上げることができる。最も好ま
しくは、約８０℃の付着反応溶液温度である。加えて、
より高い温度は核酸が二本鎖の領域を形成するのを防ぐ
のを助ける。好ましくは、付着反応はＳＰＨ付着反応が
一本鎖の核酸に特異的であるため一本鎖のプローブポリ
ヌクレオチドにより起こるものである。
は、約３０分未満で完結できる。図２に示すように、僅
か３分間で、シトシン塩基へ多数の検出可能なＳＰＨタ
グ化合物を付着させることができる。約１０分間の付着
反応が好ましく、その理由は、大きなノイズ及び塩基対
合の問題を伴わずにスルホフェニル標識の迅速検出に対
し十分なスルホニル標識の付着を可能とするからであ
る。ＳＰＨによる付着反応は、ＳＰＨの反応性と溶解度
のため迅速に完了できる。ＳＰＨ付着反応の速度は、反
応溶液温度を少なくとも約４０℃好ましくは約９０℃ま
で上昇させることにより上げることができる。最も好ま
しくは、約８０℃の付着反応溶液温度である。加えて、
より高い温度は核酸が二本鎖の領域を形成するのを防ぐ
のを助ける。好ましくは、付着反応はＳＰＨ付着反応が
一本鎖の核酸に特異的であるため一本鎖のプローブポリ
ヌクレオチドにより起こるものである。
【００３１】図３は、発色試薬との反応の後、ニトロセ
ルロースフィルター上の一本鎖のＭ１３・ＤＮＡのＳＰ
Ｈ修飾への温度の影響の研究の結果を示す。付着反応
は、６つの異なる温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃、８０℃及び９０℃）で行った。亜硫酸アンモニウム
溶液の低い反応速度のために、更に１００倍のＤＮＡ
が、この反応に対するアガロースゲルに負荷された（亜
硫酸アンモニウムでは５ｎｇのＮＤＡに対し重亜硫酸ナ
トリウムでは５０ｐｇのＤＮＡ）。両方の付着反応は、
１５分間行ってから、ｐＨ８．５のトリス１．０Ｍの９
容量を含んでなる停止溶液を加えて停止させた。次に、
酵素の比色法による検出を行った。図３は、温度の上昇
に伴う標識付け反応の積極攻勢の一貫した増加を示し、
約８０℃が最適ＳＰＨ修飾反応温度といえる。図４に示
すように、ｐＨも、修飾反応の速度と効率に関係する。
図４は、発色試薬による反応の後、ニトロセルロースフ
ィルター上の一本鎖のＭ１３・ＤＮＡの重亜硫酸ナトリ
ウムの触媒作用によるＳＰＨ修飾へのｐＨの影響の研究
の結果を示す。付着反応は、図に示す１１の異なるｐＨ
値で行った。５０ピコグラムのＤＮＡを、アガロースゲ
ルに充填（loading)することによりこの量のＤＮＡを各
付着反応に用いた。付着反応は８０℃で１５分間行って
から停止化合物を加えた。図４からの明白な結果によれ
ば、付着反応のｐＨは好ましくは約３−約６、より好ま
しくは約４−約５、最も好ましくは約４．５である。
ルロースフィルター上の一本鎖のＭ１３・ＤＮＡのＳＰ
Ｈ修飾への温度の影響の研究の結果を示す。付着反応
は、６つの異なる温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃、８０℃及び９０℃）で行った。亜硫酸アンモニウム
溶液の低い反応速度のために、更に１００倍のＤＮＡ
が、この反応に対するアガロースゲルに負荷された（亜
硫酸アンモニウムでは５ｎｇのＮＤＡに対し重亜硫酸ナ
トリウムでは５０ｐｇのＤＮＡ）。両方の付着反応は、
１５分間行ってから、ｐＨ８．５のトリス１．０Ｍの９
容量を含んでなる停止溶液を加えて停止させた。次に、
酵素の比色法による検出を行った。図３は、温度の上昇
に伴う標識付け反応の積極攻勢の一貫した増加を示し、
約８０℃が最適ＳＰＨ修飾反応温度といえる。図４に示
すように、ｐＨも、修飾反応の速度と効率に関係する。
図４は、発色試薬による反応の後、ニトロセルロースフ
ィルター上の一本鎖のＭ１３・ＤＮＡの重亜硫酸ナトリ
ウムの触媒作用によるＳＰＨ修飾へのｐＨの影響の研究
の結果を示す。付着反応は、図に示す１１の異なるｐＨ
値で行った。５０ピコグラムのＤＮＡを、アガロースゲ
ルに充填（loading)することによりこの量のＤＮＡを各
付着反応に用いた。付着反応は８０℃で１５分間行って
から停止化合物を加えた。図４からの明白な結果によれ
ば、付着反応のｐＨは好ましくは約３−約６、より好ま
しくは約４−約５、最も好ましくは約４．５である。
【００３２】プローブを用いる分析方法 ハイブリッド形成プローブを用いる分析方法は、ハイブ
リッド形成プローブと捕獲ポリヌクレオチドとを混合す
ること、この混合物を温置して２つのポリヌクレオチド
の間でハイブリッド形成反応を起こさせること、ハイブ
リッド形成してないプローブからハイブリッド形成した
プローブを分離すること、及びハイブリッド形成したプ
ローブまたはハイブリッド形成してないプローブの標識
を検出することを含んでなる。捕獲ポリヌクレオチド
が、二本鎖であるなら、混合段階前に、変性して一本鎖
の捕獲ポリヌクレオチドを得る。ハイブリッド形成反応
は、相補的な一本鎖のポリヌクレオチドの間で起こる。
ハイブリッド形成反応は、捕獲ポリヌクレオチドが溶液
中にある場合に起るが、別法として、捕獲ポリヌクレオ
チドをハイブリッド形成反応を行う前に、ナイロン、ニ
トロセルロース、ポリスチレンのような支持体または同
様な支持体材料に直接または間接的に付着させてもよ
い。典型的には、標識してない捕獲ポリヌクレオチドだ
けを、支持体に直接付着させる。なぜなら支持体に直接
付着したポリヌクレオチドの帯電ハプテン標識は検出試
薬にとって「見える（visible)」ことができないからで
ある。標識を「検出すること」は、帯電ハプテン標識の
存在を測定することを意味するか、または溶液中の帯電
ハプテン標識の濃度を、最初に存在した帯電ハプテン標
識の濃度の測定値として決定することである。用語「検
出すること」は、また、ハイブリッド形成したプローブ
の帯電ハプテン標識及び／またはハイブリッド形成して
ないプローブの帯電ハプテン標識を検出することを指
す。標識の検出は、１種または２種の抗体を用いる免疫
系により行われる。単一抗体系では、第１の抗体は検出
可能な部分に接合されている。２抗体検出系では、第２
の抗体が、通常は、検出可能な部分に接合されている。
検出可能な部分が帯電ハプテン標識の存在の検出を可能
にする。
リッド形成プローブと捕獲ポリヌクレオチドとを混合す
ること、この混合物を温置して２つのポリヌクレオチド
の間でハイブリッド形成反応を起こさせること、ハイブ
リッド形成してないプローブからハイブリッド形成した
プローブを分離すること、及びハイブリッド形成したプ
ローブまたはハイブリッド形成してないプローブの標識
を検出することを含んでなる。捕獲ポリヌクレオチド
が、二本鎖であるなら、混合段階前に、変性して一本鎖
の捕獲ポリヌクレオチドを得る。ハイブリッド形成反応
は、相補的な一本鎖のポリヌクレオチドの間で起こる。
ハイブリッド形成反応は、捕獲ポリヌクレオチドが溶液
中にある場合に起るが、別法として、捕獲ポリヌクレオ
チドをハイブリッド形成反応を行う前に、ナイロン、ニ
トロセルロース、ポリスチレンのような支持体または同
様な支持体材料に直接または間接的に付着させてもよ
い。典型的には、標識してない捕獲ポリヌクレオチドだ
けを、支持体に直接付着させる。なぜなら支持体に直接
付着したポリヌクレオチドの帯電ハプテン標識は検出試
薬にとって「見える（visible)」ことができないからで
ある。標識を「検出すること」は、帯電ハプテン標識の
存在を測定することを意味するか、または溶液中の帯電
ハプテン標識の濃度を、最初に存在した帯電ハプテン標
識の濃度の測定値として決定することである。用語「検
出すること」は、また、ハイブリッド形成したプローブ
の帯電ハプテン標識及び／またはハイブリッド形成して
ないプローブの帯電ハプテン標識を検出することを指
す。標識の検出は、１種または２種の抗体を用いる免疫
系により行われる。単一抗体系では、第１の抗体は検出
可能な部分に接合されている。２抗体検出系では、第２
の抗体が、通常は、検出可能な部分に接合されている。
検出可能な部分が帯電ハプテン標識の存在の検出を可能
にする。
【００３３】検出可能な部分には、酵素、酵素基質、発
蛍光団、発色団、化学発光団、及び／または１つまたは
それ異常のハプテン性標識または非ハプテン性標識が含
まれる。検出可能な部分には、酵素基質及びビオチン標
識が含まれる。第１の抗体または第２の抗体またはその
両者を１つまたはそれ以上の標識、例えばビオチンに接
合させることは、ほとんどバックグランドノイズなしで
少量の捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能とする。免疫
検出では、帯電ハプテン標識が標識に特異的な抗体と反
応する。検出方法は、例えば、光学的免疫検定法、放射
線免疫検定法または酵素免疫検定法であってよい。酵素
免疫検定検出反応が、それが１抗体検出系または２抗体
検出系へ適応し得るから、好ましい。分析方法には、プ
ローブポリヌクレオチドの非特異的な結合からくるノイ
ズの減少を補助するため１つまたはそれ以上の「ブロッ
キング」段階が含まれてもよい。第１のブロッキング段
階は、ブロッキング手段による捕獲ポリヌクレオチド上
の及び支持体上の非特異的結合部位をブロックするハイ
ブリッド形成反応の前に行われる。ブロッキング手段
は、プレハイブリッド形成ブロッキングポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
蛍光団、発色団、化学発光団、及び／または１つまたは
それ異常のハプテン性標識または非ハプテン性標識が含
まれる。検出可能な部分には、酵素基質及びビオチン標
識が含まれる。第１の抗体または第２の抗体またはその
両者を１つまたはそれ以上の標識、例えばビオチンに接
合させることは、ほとんどバックグランドノイズなしで
少量の捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能とする。免疫
検出では、帯電ハプテン標識が標識に特異的な抗体と反
応する。検出方法は、例えば、光学的免疫検定法、放射
線免疫検定法または酵素免疫検定法であってよい。酵素
免疫検定検出反応が、それが１抗体検出系または２抗体
検出系へ適応し得るから、好ましい。分析方法には、プ
ローブポリヌクレオチドの非特異的な結合からくるノイ
ズの減少を補助するため１つまたはそれ以上の「ブロッ
キング」段階が含まれてもよい。第１のブロッキング段
階は、ブロッキング手段による捕獲ポリヌクレオチド上
の及び支持体上の非特異的結合部位をブロックするハイ
ブリッド形成反応の前に行われる。ブロッキング手段
は、プレハイブリッド形成ブロッキングポリヌクレオチ
ドを含んでなる。
【００３４】第２のブロッキング段階は、ハイブリッド
形成反応の後でかつ第２のブロッキング手段による捕獲
ポリヌクレオチドの検出の前に行ってよい。第２のブロ
ッキング手段は、捕獲ポリヌクレオチドのような支持体
固定化合物及び温置段階の間に支持体に付着される炭水
化物及び脂肪酸のような他の化合物上の及び支持体上の
非特異的な結合部位をブロックする。第２のブロッキン
グ手段はポストハイブリッド形成ブロッキングポリヌク
レオチドを含んでなる。標識としてのスルホフェニルの
使用は、大きい利点をもたらす。標識がスルホフェニル
である時、１ピコグラム未満の捕獲ポリヌクレオチドを
検出することが可能である。加えて、捕獲ポリヌクレオ
チドは、数時間で検出できる。更に、スルホフェニル標
識の非放射性は、本質的に安全な手順をもたらし、廃棄
の問題のないこと、さらに放射性標識の廃棄に伴う危険
と費用の因子のないことにつながる。
形成反応の後でかつ第２のブロッキング手段による捕獲
ポリヌクレオチドの検出の前に行ってよい。第２のブロ
ッキング手段は、捕獲ポリヌクレオチドのような支持体
固定化合物及び温置段階の間に支持体に付着される炭水
化物及び脂肪酸のような他の化合物上の及び支持体上の
非特異的な結合部位をブロックする。第２のブロッキン
グ手段はポストハイブリッド形成ブロッキングポリヌク
レオチドを含んでなる。標識としてのスルホフェニルの
使用は、大きい利点をもたらす。標識がスルホフェニル
である時、１ピコグラム未満の捕獲ポリヌクレオチドを
検出することが可能である。加えて、捕獲ポリヌクレオ
チドは、数時間で検出できる。更に、スルホフェニル標
識の非放射性は、本質的に安全な手順をもたらし、廃棄
の問題のないこと、さらに放射性標識の廃棄に伴う危険
と費用の因子のないことにつながる。
【００３５】帯電ハプテン標識に対する抗体 帯電ハプテン標識を検出するため、標識に対する抗体が
用いられる。抗体は帯電ハプテン標識に対するポリクロ
ナール、モノクロナール及び組換えＤＮＡで作られた抗
体であってよい。好ましい抗体は、ＩｇＧ抗体である。
ポリクロナール抗体は、ヤギ、ウサギまたはマウスのよ
うな動物を、担体に接合したハプテン性スルホフェニル
化合物を含んでなる抗原により免疫してハプテンに対す
る抗体を生じさせることにより作られる。次にポリクロ
ナール抗体を親和性精製により動物の体液の試料から取
り出すことができる。ウサギポリクロナール抗体が好ま
しく、その理由は帯電スルホフェニル標識に対してヤギ
またはマウスポリクロナール抗体よりも高い親和性を示
すからである。抗原は、ＳＰＩＴＣ−ＢＳＡであっても
よい。この抗原は、高分子量の担体であるウシ血清アル
ブミンに接合した４−スルホフェニルイソチオシアネー
ト化合物を含んでなる。好ましくは、免疫化は２段階で
起こる。第１の段階では、メチル化されてない蛋白質担
体に接合された帯電ハプテン標識を動物に注入する。第
２段階では、ブースター注入を、メチル化ＢＳＡのよう
なメチル化担体に接合した帯電ハプテン標識で行う。こ
の２段階免疫化法は、スルホフェニル標識のような帯電
ハプテン標識に対する高い親和性をもたらす。モノクロ
ナール抗体は、ジー・コラー（G. Kohler)及びシー・ミ
ルステイン（C. Milstein)により「あらかじめ定められ
た特異性の融合細胞分泌抗体の連続培養（Continuous C
ultures ofFused Cells Secreting Antibody of Pre-De
fined Specificity）」、ネーチャー（Nature）２５
６、４９５（１９７５）に教示されるハイブリドーマ法
により作ることができる。この方法は、担体に接合した
帯電ハプテン標識を含む抗体で動物を免疫化すること含
む。この動物は、マウスのようなほ乳動物でよい。好ま
しくは、免疫化は、２段階の非メチル化／メチル化担体
手順により行われる。２段階免疫化手順により作られた
モノクロナール抗体は、スルホフェニル標識に対して最
も高い親和性を示した。
用いられる。抗体は帯電ハプテン標識に対するポリクロ
ナール、モノクロナール及び組換えＤＮＡで作られた抗
体であってよい。好ましい抗体は、ＩｇＧ抗体である。
ポリクロナール抗体は、ヤギ、ウサギまたはマウスのよ
うな動物を、担体に接合したハプテン性スルホフェニル
化合物を含んでなる抗原により免疫してハプテンに対す
る抗体を生じさせることにより作られる。次にポリクロ
ナール抗体を親和性精製により動物の体液の試料から取
り出すことができる。ウサギポリクロナール抗体が好ま
しく、その理由は帯電スルホフェニル標識に対してヤギ
またはマウスポリクロナール抗体よりも高い親和性を示
すからである。抗原は、ＳＰＩＴＣ−ＢＳＡであっても
よい。この抗原は、高分子量の担体であるウシ血清アル
ブミンに接合した４−スルホフェニルイソチオシアネー
ト化合物を含んでなる。好ましくは、免疫化は２段階で
起こる。第１の段階では、メチル化されてない蛋白質担
体に接合された帯電ハプテン標識を動物に注入する。第
２段階では、ブースター注入を、メチル化ＢＳＡのよう
なメチル化担体に接合した帯電ハプテン標識で行う。こ
の２段階免疫化法は、スルホフェニル標識のような帯電
ハプテン標識に対する高い親和性をもたらす。モノクロ
ナール抗体は、ジー・コラー（G. Kohler)及びシー・ミ
ルステイン（C. Milstein)により「あらかじめ定められ
た特異性の融合細胞分泌抗体の連続培養（Continuous C
ultures ofFused Cells Secreting Antibody of Pre-De
fined Specificity）」、ネーチャー（Nature）２５
６、４９５（１９７５）に教示されるハイブリドーマ法
により作ることができる。この方法は、担体に接合した
帯電ハプテン標識を含む抗体で動物を免疫化すること含
む。この動物は、マウスのようなほ乳動物でよい。好ま
しくは、免疫化は、２段階の非メチル化／メチル化担体
手順により行われる。２段階免疫化手順により作られた
モノクロナール抗体は、スルホフェニル標識に対して最
も高い親和性を示した。
【００３６】ハイブリドーマ法は、免疫化した動物から
のひ臓細胞を骨髄腫細胞と融合させること、生じたハイ
ブリドーマ細胞を選択的な媒体中で培養すること、所望
の抗体の存在を試験すること及び所望の抗体を生ずるハ
イブリドーマをクローン化することを含んでなる。ハイ
ブリドーマは、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウスから
誘導したマウス骨髄腫細胞系６５３．１とスルホフェニ
ル抗原免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスひ臓細胞とのハイブリ
ッドであってよい。好ましいハイブリドーマ細胞系は、
出願人によりＳＰＩＴＣ・ＡＳ１１、ＳＰＩＴＣ・ＡＳ
１３、ＡＰＩＴＣ・ＡＳ１４及びＳＰＩＴＣ・ＡＳ１５
と確認されている。これらの細胞系は、特許手続きの目
的のための微生物の寄託物の国際承認についてのブタペ
スト条約の規定の下に、１９８９年１０月２５日に２０
８５２メリーランド州、ロックビル、１２３０１パーク
ローン・ドライブ（12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852)のザ・アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（the American Type Culture Collec
tion）（ＡＴＣＣ）に寄託された。ＡＴＣＣは、これら
の４つのハイブリドーマ細胞系を、それぞれＡＴＣＣ寄
託番号ＨＢ１０２８０、ＨＢ１０２８１、ＨＢ１０２８
２及びＨＢ１０２８３と指定した。これらのハイブリド
ーマ培養物（hydridoma culture)は１９８９年１１月３
日ＡＴＣＣにより試験され、すべて生育培養物であると
決定された。
のひ臓細胞を骨髄腫細胞と融合させること、生じたハイ
ブリドーマ細胞を選択的な媒体中で培養すること、所望
の抗体の存在を試験すること及び所望の抗体を生ずるハ
イブリドーマをクローン化することを含んでなる。ハイ
ブリドーマは、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウスから
誘導したマウス骨髄腫細胞系６５３．１とスルホフェニ
ル抗原免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスひ臓細胞とのハイブリ
ッドであってよい。好ましいハイブリドーマ細胞系は、
出願人によりＳＰＩＴＣ・ＡＳ１１、ＳＰＩＴＣ・ＡＳ
１３、ＡＰＩＴＣ・ＡＳ１４及びＳＰＩＴＣ・ＡＳ１５
と確認されている。これらの細胞系は、特許手続きの目
的のための微生物の寄託物の国際承認についてのブタペ
スト条約の規定の下に、１９８９年１０月２５日に２０
８５２メリーランド州、ロックビル、１２３０１パーク
ローン・ドライブ（12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852)のザ・アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（the American Type Culture Collec
tion）（ＡＴＣＣ）に寄託された。ＡＴＣＣは、これら
の４つのハイブリドーマ細胞系を、それぞれＡＴＣＣ寄
託番号ＨＢ１０２８０、ＨＢ１０２８１、ＨＢ１０２８
２及びＨＢ１０２８３と指定した。これらのハイブリド
ーマ培養物（hydridoma culture)は１９８９年１１月３
日ＡＴＣＣにより試験され、すべて生育培養物であると
決定された。
【００３７】典型的には、分析を目的とした十分な量の
モノクロナール抗体を得るには、動物例えばマウスに培
養したハイブリドーマの溶液を注入する。マウスにより
作られて得られる腹水液は、モノクロナール抗体を含ん
でいる。モノクロナール抗体は次に慣用の方法により取
り出すことができる。帯電ハプテン標識に対する抗体
も、公知の組換え遺伝子技術により作ることができる。
例えば、遺伝子またはスルホフェニルハプテンに対して
免疫された細胞の遺伝子の適当な部分が除かれ、適当な
宿主細胞に挿入される。宿主細胞は、次に、帯電ハプテ
ン標識に対する抗体を作る。帯電ハプテン標識に対する
抗体を暗号化する組換えＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列を通
常はともなう蛋白質を暗号化するＤＮＡからの分離で免
疫化細胞から除去することができる。別法として、組換
えＤＮＡ配列は、宿主細胞でのＤＮＡの発現を助ける配
列を制御するように操作可能に連鎖した免疫化細胞から
取り出される。
モノクロナール抗体を得るには、動物例えばマウスに培
養したハイブリドーマの溶液を注入する。マウスにより
作られて得られる腹水液は、モノクロナール抗体を含ん
でいる。モノクロナール抗体は次に慣用の方法により取
り出すことができる。帯電ハプテン標識に対する抗体
も、公知の組換え遺伝子技術により作ることができる。
例えば、遺伝子またはスルホフェニルハプテンに対して
免疫された細胞の遺伝子の適当な部分が除かれ、適当な
宿主細胞に挿入される。宿主細胞は、次に、帯電ハプテ
ン標識に対する抗体を作る。帯電ハプテン標識に対する
抗体を暗号化する組換えＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列を通
常はともなう蛋白質を暗号化するＤＮＡからの分離で免
疫化細胞から除去することができる。別法として、組換
えＤＮＡ配列は、宿主細胞でのＤＮＡの発現を助ける配
列を制御するように操作可能に連鎖した免疫化細胞から
取り出される。
【００３８】ハイブリッド形成プローブキット ハイブリット形成プローブを作り、捕獲ポリヌクレオチ
ドを検出するキットは、帯電ハプテン標識、結合部分、
付着反応を触媒する手段、停止化合物、帯電ハプテン標
識に特異的な第１の抗体、第２の抗体、プレハイブリッ
ド形成反応ブロッキングポリヌクレオチド、ポストハイ
ブリッド形成反応ブロッキングポリヌクレオチド及び１
つまたはそれ以上の対照ポリヌクレオチドを含んでいて
よい。第２の抗体がキットに存在すると、それは、検出
可能な部分に接合されている。対照（コントロール）ポ
リヌクレオチドは、ＳＰＨ標識したハイブリッド形成プ
ローブを用いて受け取った信号を較正することにより捕
獲ポリヌクレオチドの検出を助ける。典型的には、正の
対照と負の対照が用いられる。正の対照は、帯電ハプテ
ン標識で標識したポリヌクレオチドを含んでなる。負の
対照は、標識してないポリヌクレオチドである。
ドを検出するキットは、帯電ハプテン標識、結合部分、
付着反応を触媒する手段、停止化合物、帯電ハプテン標
識に特異的な第１の抗体、第２の抗体、プレハイブリッ
ド形成反応ブロッキングポリヌクレオチド、ポストハイ
ブリッド形成反応ブロッキングポリヌクレオチド及び１
つまたはそれ以上の対照ポリヌクレオチドを含んでいて
よい。第２の抗体がキットに存在すると、それは、検出
可能な部分に接合されている。対照（コントロール）ポ
リヌクレオチドは、ＳＰＨ標識したハイブリッド形成プ
ローブを用いて受け取った信号を較正することにより捕
獲ポリヌクレオチドの検出を助ける。典型的には、正の
対照と負の対照が用いられる。正の対照は、帯電ハプテ
ン標識で標識したポリヌクレオチドを含んでなる。負の
対照は、標識してないポリヌクレオチドである。
【００３９】ハイブリッド形成プローブを作るキットは
帯電ハプテン標識、結合部分及び付着反応の触媒作用を
する手段を含んでいてよい。帯電ハプテン標識及び結合
部分は、タグ化合物として一緒に共有結合していてもよ
い。タグ化合物はスルホフェニルヒドラジン化合物であ
ってよい。触媒作用をする手段は、重亜硫酸塩を含んで
なるものであってよい。ハイブリッド形成プローブを作
るキットは、また、停止化合物例えばｐＨ上昇緩衝剤ま
たは求電子性化合物の水溶液を含んでいてよい。捕獲ポ
リヌクレオチドを検出するキットは、帯電ハプテン標識
及び帯電ハプテン標識に特異的な抗体を含んでなるもの
であってよい。帯電ハプテン標識はスルホフェニル標識
であってよく、この場合、抗体はアンチスルホフェニル
抗体である。検出キットは、また、結合部分及び触媒作
用をする手段とを含んでいてよい。
帯電ハプテン標識、結合部分及び付着反応の触媒作用を
する手段を含んでいてよい。帯電ハプテン標識及び結合
部分は、タグ化合物として一緒に共有結合していてもよ
い。タグ化合物はスルホフェニルヒドラジン化合物であ
ってよい。触媒作用をする手段は、重亜硫酸塩を含んで
なるものであってよい。ハイブリッド形成プローブを作
るキットは、また、停止化合物例えばｐＨ上昇緩衝剤ま
たは求電子性化合物の水溶液を含んでいてよい。捕獲ポ
リヌクレオチドを検出するキットは、帯電ハプテン標識
及び帯電ハプテン標識に特異的な抗体を含んでなるもの
であってよい。帯電ハプテン標識はスルホフェニル標識
であってよく、この場合、抗体はアンチスルホフェニル
抗体である。検出キットは、また、結合部分及び触媒作
用をする手段とを含んでいてよい。
【００４０】捕獲ポリヌクレオチドを検出するキット
は、また、プレハイブリッド形成反応ブロッキングポリ
ヌクレオチド、ポストハイブリッド形成反応ブロッキン
グポリヌクレオチド及び１つまたはそれ以上の対照ポリ
ヌクレオチドを含んでいてよい。捕獲ポリヌクレオチド
を検出するキットは、また、任意に第２の抗体を含んで
いてもよい。検出可能な部分は、蛍光性の分子、例えば
蛍光イソチオシアネートまたは高電子密度の化合物接合
体例えばコロイド金またはフェリチンであり得る。別法
として、検出可能な部分は、酵素に対する基質例えばア
ルカリ性ホスファターゼ、ホースラデッシュペルオキシ
ダーゼまたはガラクトシダーゼであり得る。検出可能な
部分は、色素形成手段、化学発光手段または蛍光手段に
よって検出される。検出可能な部分は、発色試薬との例
えばＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）及びＢＣＩ
Ｐ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート）との反応で見えるようになる化合物であってよ
い。検出するための手段は、発色試薬を含んでいてよ
い。
は、また、プレハイブリッド形成反応ブロッキングポリ
ヌクレオチド、ポストハイブリッド形成反応ブロッキン
グポリヌクレオチド及び１つまたはそれ以上の対照ポリ
ヌクレオチドを含んでいてよい。捕獲ポリヌクレオチド
を検出するキットは、また、任意に第２の抗体を含んで
いてもよい。検出可能な部分は、蛍光性の分子、例えば
蛍光イソチオシアネートまたは高電子密度の化合物接合
体例えばコロイド金またはフェリチンであり得る。別法
として、検出可能な部分は、酵素に対する基質例えばア
ルカリ性ホスファターゼ、ホースラデッシュペルオキシ
ダーゼまたはガラクトシダーゼであり得る。検出可能な
部分は、色素形成手段、化学発光手段または蛍光手段に
よって検出される。検出可能な部分は、発色試薬との例
えばＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）及びＢＣＩ
Ｐ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート）との反応で見えるようになる化合物であってよ
い。検出するための手段は、発色試薬を含んでいてよ
い。
【００４１】蛋白質プローブ 捕獲分子と特異的な親和反応をし得る蛋白質プローブ
は、プローブ蛋白質、帯電ハプテン標識及び結合部分を
含んでなる。ハイブリッド形成プローブについて上記し
たのと同じ帯電ハプテン標識が、蛋白質プローブに対し
ても用いられる。蛋白質プローブの好ましいスルホフェ
ニル標識は、例１２及び図９により示されるようにアン
チスルホフェニル抗体により認識することができる。結
合部分は、プローブ蛋白質を帯電ハプテン標識に付着さ
せる。結合部分は、スクシンイミド、マレイミド、ハロ
ゲン、ジドラジン、第１、第２及び第３アミン、アミド
及びそれらの誘導体からなる群から選択される。プロー
ブ蛋白質は捕獲分子と特異的な親和反応ができるもので
ある。特異的な親和反応は、通常、非共有結合を含み、
そして典型的な抗原−抗体相互作用の親和性に匹敵する
親和性を有する。典型的なプローブ蛋白質／捕獲分子対
は、抗原／抗体、蛋白質レセプター／ホルモン及び酵素
／酵素阻害剤を含む。蛋白質プローブは、現在入手でき
る非放射性の蛋白質プローブの代用を与える。蛋白質プ
ローブは各種の捕獲分子の検出を補助するために使用さ
れる。捕獲分子は、例えば、抗体、抗原、ホルモン、ス
テロイド、炭水化物、酵素阻害剤、酵素エフェクター、
各種の酵素基質類似体及び核酸である。
は、プローブ蛋白質、帯電ハプテン標識及び結合部分を
含んでなる。ハイブリッド形成プローブについて上記し
たのと同じ帯電ハプテン標識が、蛋白質プローブに対し
ても用いられる。蛋白質プローブの好ましいスルホフェ
ニル標識は、例１２及び図９により示されるようにアン
チスルホフェニル抗体により認識することができる。結
合部分は、プローブ蛋白質を帯電ハプテン標識に付着さ
せる。結合部分は、スクシンイミド、マレイミド、ハロ
ゲン、ジドラジン、第１、第２及び第３アミン、アミド
及びそれらの誘導体からなる群から選択される。プロー
ブ蛋白質は捕獲分子と特異的な親和反応ができるもので
ある。特異的な親和反応は、通常、非共有結合を含み、
そして典型的な抗原−抗体相互作用の親和性に匹敵する
親和性を有する。典型的なプローブ蛋白質／捕獲分子対
は、抗原／抗体、蛋白質レセプター／ホルモン及び酵素
／酵素阻害剤を含む。蛋白質プローブは、現在入手でき
る非放射性の蛋白質プローブの代用を与える。蛋白質プ
ローブは各種の捕獲分子の検出を補助するために使用さ
れる。捕獲分子は、例えば、抗体、抗原、ホルモン、ス
テロイド、炭水化物、酵素阻害剤、酵素エフェクター、
各種の酵素基質類似体及び核酸である。
【００４２】蛋白質プローブの作製方法 蛋白質プローブの作製方法は、帯電ハプテン標識、結合
部分、及びプローブ蛋白質を選択することを含んでな
る。好ましくは、帯電ハプテン標識及び結合部分は相互
に標識化合物と共有結合するものである。標識化合物の
結合部分は付着反応においてプローブ蛋白質に付着す
る。付着反応はプローブ蛋白質の溶液をタグ化合物の溶
液へ添加することにより適切な容器中で行うことができ
る。付着反応は停止化合物を用い停止される。説明的蛋
白質プローブは付着反応においてスルホフェニルイソチ
オシアン酸（ＳＰＩＴＣ）標識化合物をプローブ蛋白質
と結合させることにより作ることができる。蛋白質また
は蛋白質の炭化水素部分へビオチン標識を付着させる公
知の反応の多くが、帯電ハプテン標識を付着するのに用
いることができる。つまり、例えば、ニトロヒドロスク
シンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳエステル、マレ
イミド、活性ハロゲン、ヒドラジン及びヒドラジド反応
スキームを用い得る。
部分、及びプローブ蛋白質を選択することを含んでな
る。好ましくは、帯電ハプテン標識及び結合部分は相互
に標識化合物と共有結合するものである。標識化合物の
結合部分は付着反応においてプローブ蛋白質に付着す
る。付着反応はプローブ蛋白質の溶液をタグ化合物の溶
液へ添加することにより適切な容器中で行うことができ
る。付着反応は停止化合物を用い停止される。説明的蛋
白質プローブは付着反応においてスルホフェニルイソチ
オシアン酸（ＳＰＩＴＣ）標識化合物をプローブ蛋白質
と結合させることにより作ることができる。蛋白質また
は蛋白質の炭化水素部分へビオチン標識を付着させる公
知の反応の多くが、帯電ハプテン標識を付着するのに用
いることができる。つまり、例えば、ニトロヒドロスク
シンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳエステル、マレ
イミド、活性ハロゲン、ヒドラジン及びヒドラジド反応
スキームを用い得る。
【００４３】捕獲分子の検出方法 捕獲分子の検出方法は蛋白質プローブと捕獲ポリヌクレ
オチドの混合、混合物の温置、捕獲分子と結合した蛋白
質プローブの捕獲分子と結合していない蛋白質プローブ
からの分離、及び捕獲分子の検出を含んでなる。捕獲分
子は免疫検出法による結合または非結合蛋白質プローブ
のどちらかの帯電ハプテン標識の検出により検出され
る。免疫検出において、帯電ハプテン標識はその帯電ハ
プテン標識に特異的な抗体と反応する。
オチドの混合、混合物の温置、捕獲分子と結合した蛋白
質プローブの捕獲分子と結合していない蛋白質プローブ
からの分離、及び捕獲分子の検出を含んでなる。捕獲分
子は免疫検出法による結合または非結合蛋白質プローブ
のどちらかの帯電ハプテン標識の検出により検出され
る。免疫検出において、帯電ハプテン標識はその帯電ハ
プテン標識に特異的な抗体と反応する。
【００４４】蛋白質プローブキット 蛋白質プローブ作製用及び捕獲分子検出用のキットは、
帯電ハプテン標識、結合部分、付着反応に触媒作用する
手段、帯電ハプテン標識に特異的な第一の抗体、検出さ
れる部分に接合した第二の抗体、及び検出される部分を
検出する手段を含んでなる。蛋白質プローブを作るため
のキットは帯電ハプテン標識、結合部分及び付着反応の
触媒作用をする手段を含んでなる。捕獲分子検出用のキ
ットは帯電ハプテン標識及びその帯電ハプテン標識に特
異的な抗体を含んでなる。検出用キットはまた第一の抗
−帯電ハプテン標識抗体、第一の抗体に対する第二の抗
体、検出される部分に接合した第二の抗体、及び検出さ
れる部分を検出する手段を含んでなる。
帯電ハプテン標識、結合部分、付着反応に触媒作用する
手段、帯電ハプテン標識に特異的な第一の抗体、検出さ
れる部分に接合した第二の抗体、及び検出される部分を
検出する手段を含んでなる。蛋白質プローブを作るため
のキットは帯電ハプテン標識、結合部分及び付着反応の
触媒作用をする手段を含んでなる。捕獲分子検出用のキ
ットは帯電ハプテン標識及びその帯電ハプテン標識に特
異的な抗体を含んでなる。検出用キットはまた第一の抗
−帯電ハプテン標識抗体、第一の抗体に対する第二の抗
体、検出される部分に接合した第二の抗体、及び検出さ
れる部分を検出する手段を含んでなる。
【００４５】
【実施例】以下の例は本発明の種々の特徴及び態様の説
明として述べるものであり、請求する発明の範囲を制限
するものではない。なお、以下の例中２、３、７及び１
３は本発明の実施例であり、例１、４〜６、及び８〜１
２は参考例である。例１ （付着反応の亜硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム
触媒の比較）亜硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム
（亜硫酸水素ナトリウム）をＳＰＨとＭ１３・ＤＮＡと
の付着反応の触媒に使用した。１０ｍｇ／ｍｌのＳＰ
Ｈ、１ｍｇ／ｍｌのハイドロキノン及び２．０Ｍの（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ3 を含有する溶液（Ａ）をｐＨ４．５に調
整した。１０ｍｇ／ｍｌのＳＰＨ、１ｍｇ／ｍｌのハイ
ドロキノン及び２．０ＭのＮａ2 Ｓ2 Ｏ3 を含有する溶
液（Ｂ）をｐＨ４．５に調整した。２つの溶液を８０℃
に加熱し、一本鎖Ｍ１３ＤＮＡをプローブポリヌクレオ
チドとして１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した。６
つの時点（３，６，１０，１５，２０，及び３０分）の
それぞれで試料を抜き取り、停止化合物としての９倍容
量の１．０トリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）の添加により付
着反応を停止させた。これらの試料は、電機泳動用アガ
ロースゲル上に各時点のＤＮＡが直接５ｎｇ及び５０ｐ
ｇの量で装填できるようにさらに希釈した。試料は、約
２時間電気泳動処理し、ニトロセルロース上にブロット
（吸い取り）させた。そのブロットは、真空下８０℃で
２時間ベーキングし、その後ウサギ親和性−精製抗スル
ホフェニル抗体による検出までに検出した。（この抗体
製造法については例２及び３参照。） この研究の結果は図２に示す。短い展開時間（発色展開
剤ＢＣＩＰ及びＮＢＴによる１０分間）にもかかわら
ず、重亜硫酸ナトリウム処理試料はわずか３分間の付着
反応後に５０ｐｇの標識したＤＮＡの検出ができた。し
たがって、スルホフェニル標識したハイブリッド形成プ
ローブを作るのに３分間の付着反応で十分である。亜硫
酸アンモニウム溶液は５ｎｇの標識したＤＮＡがわずか
に検出できる塗まつを示した。重亜硫酸ナトリウム溶液
は８０℃で３０分後でさえもわずかの分解しか示さなか
ったが、亜硫酸アンモニウム試料でやっと検出できるＤ
ＮＡは実質的に分解していた。それゆえ、付着反応触媒
として重亜硫酸ナトリウムを使用することが明らかに有
利であることが示される。
明として述べるものであり、請求する発明の範囲を制限
するものではない。なお、以下の例中２、３、７及び１
３は本発明の実施例であり、例１、４〜６、及び８〜１
２は参考例である。例１ （付着反応の亜硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム
触媒の比較）亜硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム
（亜硫酸水素ナトリウム）をＳＰＨとＭ１３・ＤＮＡと
の付着反応の触媒に使用した。１０ｍｇ／ｍｌのＳＰ
Ｈ、１ｍｇ／ｍｌのハイドロキノン及び２．０Ｍの（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ3 を含有する溶液（Ａ）をｐＨ４．５に調
整した。１０ｍｇ／ｍｌのＳＰＨ、１ｍｇ／ｍｌのハイ
ドロキノン及び２．０ＭのＮａ2 Ｓ2 Ｏ3 を含有する溶
液（Ｂ）をｐＨ４．５に調整した。２つの溶液を８０℃
に加熱し、一本鎖Ｍ１３ＤＮＡをプローブポリヌクレオ
チドとして１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した。６
つの時点（３，６，１０，１５，２０，及び３０分）の
それぞれで試料を抜き取り、停止化合物としての９倍容
量の１．０トリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）の添加により付
着反応を停止させた。これらの試料は、電機泳動用アガ
ロースゲル上に各時点のＤＮＡが直接５ｎｇ及び５０ｐ
ｇの量で装填できるようにさらに希釈した。試料は、約
２時間電気泳動処理し、ニトロセルロース上にブロット
（吸い取り）させた。そのブロットは、真空下８０℃で
２時間ベーキングし、その後ウサギ親和性−精製抗スル
ホフェニル抗体による検出までに検出した。（この抗体
製造法については例２及び３参照。） この研究の結果は図２に示す。短い展開時間（発色展開
剤ＢＣＩＰ及びＮＢＴによる１０分間）にもかかわら
ず、重亜硫酸ナトリウム処理試料はわずか３分間の付着
反応後に５０ｐｇの標識したＤＮＡの検出ができた。し
たがって、スルホフェニル標識したハイブリッド形成プ
ローブを作るのに３分間の付着反応で十分である。亜硫
酸アンモニウム溶液は５ｎｇの標識したＤＮＡがわずか
に検出できる塗まつを示した。重亜硫酸ナトリウム溶液
は８０℃で３０分後でさえもわずかの分解しか示さなか
ったが、亜硫酸アンモニウム試料でやっと検出できるＤ
ＮＡは実質的に分解していた。それゆえ、付着反応触媒
として重亜硫酸ナトリウムを使用することが明らかに有
利であることが示される。
【００４６】例２ （ＳＰＨに対するポリクロナール抗体の調製）ＳＰＨに
対する抗体を作るためにウシ血清アルブミンに接合した
スルホフェニルイソチオシアン酸（ＳＰＩＴＣ−ＢＳ
Ａ）抗体を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中２５ｍｇ／ｍｌのウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するｐＨ８．７の１
０ｍｌ溶液に２５０ｍｇの４−スルホフェニルイソチオ
シアン酸（ＳＰＩＴＣ）を添加することによって調製し
た。この溶液はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対する
透析を行うまで揺り台上で３７℃４時間温置した。アポ
フェリチンもまた代りのハプテン担体として用いた。ア
ポフェリチンに接合したスルホフェニルイソチオシアン
酸（ＳＰＩＴＣ−Ａｐｏ）抗体をＳＰＩＴＣ−ＢＳＡ抗
体を作るのに用いたのと同じ方法で調製した。この抗体
は例１２のＥＬＩＳＡ検定に用いた。ＰＢＳ中濃度１０
０μｇ／ｍｌのＳＰＩＴＣ−ＢＳＡを５０％完全、５０
％不完全フロイドアジュバントを含有する当容量のアジ
ュバント溶液と混合した。１／２ミリリットルの接種液
をウサギの２本の足それぞれへ筋肉内に投与した。また
１／１０ミリリットルの接種液をウサギの１０本の脊椎
部へ皮内に投与した。それぞれのウサギはこれにより１
００μｇのスルホフェニル抗体の第一注射液で注射され
た。それぞれのウサギは数カ月間月１回５０μｇのスル
ホフェニル抗体の追加注射をうけた。
対する抗体を作るためにウシ血清アルブミンに接合した
スルホフェニルイソチオシアン酸（ＳＰＩＴＣ−ＢＳ
Ａ）抗体を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中２５ｍｇ／ｍｌのウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するｐＨ８．７の１
０ｍｌ溶液に２５０ｍｇの４−スルホフェニルイソチオ
シアン酸（ＳＰＩＴＣ）を添加することによって調製し
た。この溶液はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対する
透析を行うまで揺り台上で３７℃４時間温置した。アポ
フェリチンもまた代りのハプテン担体として用いた。ア
ポフェリチンに接合したスルホフェニルイソチオシアン
酸（ＳＰＩＴＣ−Ａｐｏ）抗体をＳＰＩＴＣ−ＢＳＡ抗
体を作るのに用いたのと同じ方法で調製した。この抗体
は例１２のＥＬＩＳＡ検定に用いた。ＰＢＳ中濃度１０
０μｇ／ｍｌのＳＰＩＴＣ−ＢＳＡを５０％完全、５０
％不完全フロイドアジュバントを含有する当容量のアジ
ュバント溶液と混合した。１／２ミリリットルの接種液
をウサギの２本の足それぞれへ筋肉内に投与した。また
１／１０ミリリットルの接種液をウサギの１０本の脊椎
部へ皮内に投与した。それぞれのウサギはこれにより１
００μｇのスルホフェニル抗体の第一注射液で注射され
た。それぞれのウサギは数カ月間月１回５０μｇのスル
ホフェニル抗体の追加注射をうけた。
【００４７】例３ （ＳＰＨに対するポリクロナール抗体の精製）例２の方
法により生起したウサギの抗スルホフェニルポリクロナ
ール抗体を親和性精製した。親和性ゲルに結合したＳＰ
Ｈは１００ｍｇのＳＰＨをｐＨ７．５の０．１ＭのＭＯ
ＰＳ３０ｍｌ中に最初に溶解することにより調製した。
次いでそのＳＰＨ溶液に１０ミリリットルの末洗浄Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ・Ａｆｆｉ−ゲル１０を添加した。得られた
スラリーを約２時間室温に放置して反応させた。反応ス
ラリーを、ベックマン（Beckman)ＴＪ−６遠心器中１５
００ＲＰＭで遠心分離した。上澄みを除去し、残ったゲ
ルのペレットを蒸留水で徹底的に洗い、次にＰＢＳで洗
った。その親和性ゲルへのＳＰＨ結合物５ミリリットル
を例２の方法で得られた２００ｍｌの取りまとめたウサ
ギの抗−ＳＰＨ抗血清とともに４℃で４時間温置した。
親和性ゲルに結合したＳＰＨに結合したウサギの抗スル
ホフェニル抗体からなる得られたスラリーは小型のＢｉ
ｏ−Ｒａｄエコノカラム（Econo-column）上に装填し、
４℃で１００ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次いで、ハプテ
ン置換クロマトグラフィーをＳＰＨ親和ゲルに結合した
ウサギの抗スルホフェニルポリクロナール抗体を除去す
るのに使用した。ハプテン置換基はＳＰＨのスクシニル
化誘導体であった。ＳＰＨのスクシニル化誘導体は１０
ｇのＳＰＨを２５ｍｌの１０ＸＰＢＳ及び約２００ｍｌ
の蒸留水を含有する溶液中の１０ｇの無水コハク酸と室
温で１時間温置することにより調製した。温置後３０ｍ
ｌの１．０ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し
た。この溶液をさらに３７℃で２時間温置した。し最終
的容積を２５０ｍｌになるよう調整して１ＸＰＢＳ、１
２０ｍＭのトリスＨＣｌ及び２００ｍＭのＳＰＨスクシ
ン酸塩の溶液を得た。この置換混合液の１０ミリリット
ルを親和性ゲルスラリーに結合したＳＰＨに結合したウ
サギの抗スルホフェニル抗体とともに４℃で６０分間温
置し、その後４℃で３日間ＰＢＳに対して透析した。こ
の方法が精製されたポリクロナール抗スルホフェニル抗
体を提供した。
法により生起したウサギの抗スルホフェニルポリクロナ
ール抗体を親和性精製した。親和性ゲルに結合したＳＰ
Ｈは１００ｍｇのＳＰＨをｐＨ７．５の０．１ＭのＭＯ
ＰＳ３０ｍｌ中に最初に溶解することにより調製した。
次いでそのＳＰＨ溶液に１０ミリリットルの末洗浄Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ・Ａｆｆｉ−ゲル１０を添加した。得られた
スラリーを約２時間室温に放置して反応させた。反応ス
ラリーを、ベックマン（Beckman)ＴＪ−６遠心器中１５
００ＲＰＭで遠心分離した。上澄みを除去し、残ったゲ
ルのペレットを蒸留水で徹底的に洗い、次にＰＢＳで洗
った。その親和性ゲルへのＳＰＨ結合物５ミリリットル
を例２の方法で得られた２００ｍｌの取りまとめたウサ
ギの抗−ＳＰＨ抗血清とともに４℃で４時間温置した。
親和性ゲルに結合したＳＰＨに結合したウサギの抗スル
ホフェニル抗体からなる得られたスラリーは小型のＢｉ
ｏ−Ｒａｄエコノカラム（Econo-column）上に装填し、
４℃で１００ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次いで、ハプテ
ン置換クロマトグラフィーをＳＰＨ親和ゲルに結合した
ウサギの抗スルホフェニルポリクロナール抗体を除去す
るのに使用した。ハプテン置換基はＳＰＨのスクシニル
化誘導体であった。ＳＰＨのスクシニル化誘導体は１０
ｇのＳＰＨを２５ｍｌの１０ＸＰＢＳ及び約２００ｍｌ
の蒸留水を含有する溶液中の１０ｇの無水コハク酸と室
温で１時間温置することにより調製した。温置後３０ｍ
ｌの１．０ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し
た。この溶液をさらに３７℃で２時間温置した。し最終
的容積を２５０ｍｌになるよう調整して１ＸＰＢＳ、１
２０ｍＭのトリスＨＣｌ及び２００ｍＭのＳＰＨスクシ
ン酸塩の溶液を得た。この置換混合液の１０ミリリット
ルを親和性ゲルスラリーに結合したＳＰＨに結合したウ
サギの抗スルホフェニル抗体とともに４℃で６０分間温
置し、その後４℃で３日間ＰＢＳに対して透析した。こ
の方法が精製されたポリクロナール抗スルホフェニル抗
体を提供した。
【００４８】例４ （ハイブリッド形成プローブの調製）シトシン塩基含有
核酸へスルホフェニルヒドラジンを付着反応によって付
着させることにより、ハイブリッド形成プローブを作っ
た。スルホフェニルヒドラジンは標識用混合物中で用い
た。 標識用混合物調製に使用した試薬類は次の通りであっ
た：ＳＰＨ乾燥「結晶」（スルホフェニルヒドラジン、
フェニルヒドラジン−４−スルホン酸・半水和物、フル
カ（Fulka)から＃−７８７２０−粉体として入手、純度
９９％） 重亜硫酸ナトリウム（メタ重亜硫酸ナトリウム、シグマ
（Sigma)＃Ｓ−９０００） ハイドロキノン溶液（１００ｍｇ／ｍｌエタノール溶
液、−２０℃で貯蔵）１．０Ｍクエン酸ナトリウム溶液
（ｐＨ５．２）
核酸へスルホフェニルヒドラジンを付着反応によって付
着させることにより、ハイブリッド形成プローブを作っ
た。スルホフェニルヒドラジンは標識用混合物中で用い
た。 標識用混合物調製に使用した試薬類は次の通りであっ
た：ＳＰＨ乾燥「結晶」（スルホフェニルヒドラジン、
フェニルヒドラジン−４−スルホン酸・半水和物、フル
カ（Fulka)から＃−７８７２０−粉体として入手、純度
９９％） 重亜硫酸ナトリウム（メタ重亜硫酸ナトリウム、シグマ
（Sigma)＃Ｓ−９０００） ハイドロキノン溶液（１００ｍｇ／ｍｌエタノール溶
液、−２０℃で貯蔵）１．０Ｍクエン酸ナトリウム溶液
（ｐＨ５．２）
【００４９】標識用混合物は、４．２ｍｌの蒸留水に
０．９５０５ｇのメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2 Ｓ2
Ｏ5 ）を溶解して、調製した。この重亜硫酸塩溶液へ４
０ｍｇのフェニルヒドラジン−４−スルホン酸半水和物
を添加した後、５００ｍｌの１．０Ｍクエン酸ナトリウ
ム溶液、ｐＨ５．２、を添加した。この溶液をすべての
試薬が溶解するまで湯浴中で６５℃に加熱した。次いで
５０マイクロリットルのハイドロキノン１００ｍｇ／ｍ
ｌエタノール溶液を添加した。付着反応を行うために、
１０μｌの二本鎖ｐＵＣ・ＳＬＯプラスミド（トリスま
たは水中）をまず水中で約５〜１０分間煮沸することに
より変性した。変性でプローブポリヌクレオチドとして
用いる一本鎖ｐＵＣ・ＳＬＯプラスミドＤＮＡが得られ
た。次いで９０マイクロリットル（９部）の標識用混合
物を１０μｌ（１部）の変性ＤＮＡ溶液へ迅速に添加し
た。この混合物を８０℃で１０分間温置した。付着反応
を停止溶液としての５０μｌ（反応当初のＤＮＡ量１０
μｌに対し５部）の３．０Ｍトリス（ｐＨ８．５）の添
加により停止させた。ハイブリッド形成プローブ、標識
用混合物、及びプローブヌクレオチドの混合物は未反応
のハプテン及び触媒を取り除くため透析することもでき
るし、捕獲ポリヌクレオチドによるハイブリッド形成反
応に直接使用することもできる。
０．９５０５ｇのメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2 Ｓ2
Ｏ5 ）を溶解して、調製した。この重亜硫酸塩溶液へ４
０ｍｇのフェニルヒドラジン−４−スルホン酸半水和物
を添加した後、５００ｍｌの１．０Ｍクエン酸ナトリウ
ム溶液、ｐＨ５．２、を添加した。この溶液をすべての
試薬が溶解するまで湯浴中で６５℃に加熱した。次いで
５０マイクロリットルのハイドロキノン１００ｍｇ／ｍ
ｌエタノール溶液を添加した。付着反応を行うために、
１０μｌの二本鎖ｐＵＣ・ＳＬＯプラスミド（トリスま
たは水中）をまず水中で約５〜１０分間煮沸することに
より変性した。変性でプローブポリヌクレオチドとして
用いる一本鎖ｐＵＣ・ＳＬＯプラスミドＤＮＡが得られ
た。次いで９０マイクロリットル（９部）の標識用混合
物を１０μｌ（１部）の変性ＤＮＡ溶液へ迅速に添加し
た。この混合物を８０℃で１０分間温置した。付着反応
を停止溶液としての５０μｌ（反応当初のＤＮＡ量１０
μｌに対し５部）の３．０Ｍトリス（ｐＨ８．５）の添
加により停止させた。ハイブリッド形成プローブ、標識
用混合物、及びプローブヌクレオチドの混合物は未反応
のハプテン及び触媒を取り除くため透析することもでき
るし、捕獲ポリヌクレオチドによるハイブリッド形成反
応に直接使用することもできる。
【００５０】例５ （ハイブリッド形成反応）例４のスルホフェニル標識し
たサケ精液ハイブリッド形成プローブと変性ｐＵＣ・Ｓ
ＬＯプロラミドＤＮＡからなる捕獲ポリヌクレオチドと
の間のハイブリッド形成反応を次に行った。変性ｐＵＣ
・ＳＬＯ・ＤＮＡをニトロセルロース支持体上にブロッ
トした。予備ハイブリッド形成反応遮断段階はｐＵＣ・
ＳＬＯ・ＤＮＡ及びニトロセルロース支持体に５ＸＳＳ
ＰＥ，５０％ホルムアミド、５Ｘデンハーズ（Denhardt
s)、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡ（フェノー
ル抽出し、音波処理）及び０．１％ＳＤＳを含んでなる
標準予備ハイブリッド形成混合物を用いて行った。予備
ハイブリッド形成遮断段階は３７℃で少なくとも１時間
かけて行った。スルホフェニル標識したｐＵＣ・ＳＬＯ
・ＤＮＡハイブリッド形成プローブと捕獲ＤＮＡとして
の支持体固定ｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡのハイブリッド形
成は５ＸＳＳＰＥ、５０％脱イオン処理ホルムアミド、
５Ｘデンハーズ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液Ｄ
ＮＡ中で開始した。ハイブリッド形成は、振とう定温器
中３７℃で行った。濃度５０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍ
ｌのハイブリッド形成プローブを用いた。操作が大容量
のハイブリッド形成プローブの方が容易であったから、
約０．２ｍｌ／ｃｍ2 などの大容量のハイブリッド形成
プローブを使用した。
たサケ精液ハイブリッド形成プローブと変性ｐＵＣ・Ｓ
ＬＯプロラミドＤＮＡからなる捕獲ポリヌクレオチドと
の間のハイブリッド形成反応を次に行った。変性ｐＵＣ
・ＳＬＯ・ＤＮＡをニトロセルロース支持体上にブロッ
トした。予備ハイブリッド形成反応遮断段階はｐＵＣ・
ＳＬＯ・ＤＮＡ及びニトロセルロース支持体に５ＸＳＳ
ＰＥ，５０％ホルムアミド、５Ｘデンハーズ（Denhardt
s)、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡ（フェノー
ル抽出し、音波処理）及び０．１％ＳＤＳを含んでなる
標準予備ハイブリッド形成混合物を用いて行った。予備
ハイブリッド形成遮断段階は３７℃で少なくとも１時間
かけて行った。スルホフェニル標識したｐＵＣ・ＳＬＯ
・ＤＮＡハイブリッド形成プローブと捕獲ＤＮＡとして
の支持体固定ｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡのハイブリッド形
成は５ＸＳＳＰＥ、５０％脱イオン処理ホルムアミド、
５Ｘデンハーズ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液Ｄ
ＮＡ中で開始した。ハイブリッド形成は、振とう定温器
中３７℃で行った。濃度５０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍ
ｌのハイブリッド形成プローブを用いた。操作が大容量
のハイブリッド形成プローブの方が容易であったから、
約０．２ｍｌ／ｃｍ2 などの大容量のハイブリッド形成
プローブを使用した。
【００５１】例６ （ハイブリッド化ｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡの検出）ハイ
ブリッド化プローブを酵素基材比色沈殿反応において、
例３のウサギ抗スルホフェニルポリクロナール抗体を用
いて検出した。例５で得られたニトロセルロース支持体
上のブロットを６５℃の０．１ＸＳＳＰＥの３回の１０
分間変化によるストリンジェンシー（stringency）洗浄
で洗浄した。ストリンジェンシー洗浄は非ハイブリッド
化ポリヌクレオチドからハイブリッド化ポリヌクレオチ
ドを分離した。次にニトロセルロース支持体上に残存す
るブロットを、その洗浄ブロットを１Ｘ洗浄緩衝液中に
入れ、振とう定温器中２３℃または３７℃で３０分間温
置することによるハイブリッド形成後処理反応遮断段階
で処理して、支持体上及び化合物上の非特異結合サイト
を遮断した。１Ｘ洗浄緩衝液は１００ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＮのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．５％のＮＰ４０、０．１％の硫酸デキストラ
ン、及び５００μｇ／ｍｌのフェノール抽出全（安価）
酵母ＤＮＡを含んでなるものであった。次にブロット
を、例３から得られた親和性精製したウサギの抗スルホ
フェニル抗体を用い、１Ｘ洗浄緩衝液中０．１μｇ／ｍ
ｌの濃度で温置した。温置は３７℃で約４５分間行っ
た。次に、未結合のウサギの抗スルホフェニル抗体を
１．０Ｘ洗浄緩衝液中２回の短時間洗浄ですすぎ落し
た。その後ブロットは約５分間かけてアルカリ塩洗浄緩
衝液で洗浄した。アルカリ塩洗浄緩衝液は１．０ＭのＮ
ａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ１０）、及び５
０ｍＭのＭｇＣｌ2 を含んでなるものであった。アルカ
リ塩洗浄緩衝液を３７℃で１．０Ｘ洗浄緩衝液での２回
の短時間洗浄を用いてブロットをすすぎ出した。
ブリッド化プローブを酵素基材比色沈殿反応において、
例３のウサギ抗スルホフェニルポリクロナール抗体を用
いて検出した。例５で得られたニトロセルロース支持体
上のブロットを６５℃の０．１ＸＳＳＰＥの３回の１０
分間変化によるストリンジェンシー（stringency）洗浄
で洗浄した。ストリンジェンシー洗浄は非ハイブリッド
化ポリヌクレオチドからハイブリッド化ポリヌクレオチ
ドを分離した。次にニトロセルロース支持体上に残存す
るブロットを、その洗浄ブロットを１Ｘ洗浄緩衝液中に
入れ、振とう定温器中２３℃または３７℃で３０分間温
置することによるハイブリッド形成後処理反応遮断段階
で処理して、支持体上及び化合物上の非特異結合サイト
を遮断した。１Ｘ洗浄緩衝液は１００ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＮのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．５％のＮＰ４０、０．１％の硫酸デキストラ
ン、及び５００μｇ／ｍｌのフェノール抽出全（安価）
酵母ＤＮＡを含んでなるものであった。次にブロット
を、例３から得られた親和性精製したウサギの抗スルホ
フェニル抗体を用い、１Ｘ洗浄緩衝液中０．１μｇ／ｍ
ｌの濃度で温置した。温置は３７℃で約４５分間行っ
た。次に、未結合のウサギの抗スルホフェニル抗体を
１．０Ｘ洗浄緩衝液中２回の短時間洗浄ですすぎ落し
た。その後ブロットは約５分間かけてアルカリ塩洗浄緩
衝液で洗浄した。アルカリ塩洗浄緩衝液は１．０ＭのＮ
ａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ１０）、及び５
０ｍＭのＭｇＣｌ2 を含んでなるものであった。アルカ
リ塩洗浄緩衝液を３７℃で１．０Ｘ洗浄緩衝液での２回
の短時間洗浄を用いてブロットをすすぎ出した。
【００５２】次に、１．０Ｘ洗浄緩衝液中の第二の抗
体、市販のヤギの抗ウサギアルカリホスファターゼの
１：２０００希釈液をブロットに添加した後、３７℃で
約４５分間温置した。その後ブロットを３７℃で１．０
Ｘ洗浄緩衝液を用いすすいだ。さらに約１０分間のすす
ぎをアルカリホスファターゼ緩衝液を用いて行った。ア
ルカリホスファターゼ緩衝液は１００ｍＭのトリスｐＨ
９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び５０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 を含んでなるものであった。次に、クラビーバッグ
(CLAVIE bag)（ベルアートプロダクツ(Bel Art Product
s)）に検出溶液を添加した後３６℃で約２時間温置し
た。温置は必要な発色強度を得るよう約３０分から約１
２時間の間で行うことができる。使用した検出溶液は１
０μｌのニトロブルーテトラゾリウム（５０％ＤＭＦ中
１００ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍ
ｌ）、及び３ｍｌのアルカリホスファターゼ緩衝液を含
んでなるものであった。検出反応を蒸留水及びトリスＨ
Ｃｌによるすすぎにより停止させた後、気乾し、ブロッ
トの写真をとった。着色ブロットの存在は補足ｐＵＣ・
ＳＬＯ・ＤＮＡにハイブリッド化されたスルホフェニル
標識したｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡハイブリッド形成プロ
ーブの存在を示した。これによりｐＵＣ・ＳＬＯ捕獲Ｄ
ＮＡの検出がなされた。
体、市販のヤギの抗ウサギアルカリホスファターゼの
１：２０００希釈液をブロットに添加した後、３７℃で
約４５分間温置した。その後ブロットを３７℃で１．０
Ｘ洗浄緩衝液を用いすすいだ。さらに約１０分間のすす
ぎをアルカリホスファターゼ緩衝液を用いて行った。ア
ルカリホスファターゼ緩衝液は１００ｍＭのトリスｐＨ
９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び５０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 を含んでなるものであった。次に、クラビーバッグ
(CLAVIE bag)（ベルアートプロダクツ(Bel Art Product
s)）に検出溶液を添加した後３６℃で約２時間温置し
た。温置は必要な発色強度を得るよう約３０分から約１
２時間の間で行うことができる。使用した検出溶液は１
０μｌのニトロブルーテトラゾリウム（５０％ＤＭＦ中
１００ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍ
ｌ）、及び３ｍｌのアルカリホスファターゼ緩衝液を含
んでなるものであった。検出反応を蒸留水及びトリスＨ
Ｃｌによるすすぎにより停止させた後、気乾し、ブロッ
トの写真をとった。着色ブロットの存在は補足ｐＵＣ・
ＳＬＯ・ＤＮＡにハイブリッド化されたスルホフェニル
標識したｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡハイブリッド形成プロ
ーブの存在を示した。これによりｐＵＣ・ＳＬＯ捕獲Ｄ
ＮＡの検出がなされた。
【００５３】例７ （ハイブリードーマの調製）スルホフェニル標識に特異
的親和性を持つモノクロナール抗体を作ることができる
ハイブリドーマを調製した。使用した材料は次の通りで
ある。使用した骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３骨髄腫細胞系統、カーネーら、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー(Kearney et al., J. Immunol.) １２３：１
５４８（１９７９）により開発された非分泌性マウス骨
髄腫系統から誘導した。使用したひ臓細胞は、下記の方
法により免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから採取した。増
殖培地は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン(Hycllon
e)）及び２ｍＭの１−グルタミン（イルビン・サイエン
ティフィック(Irvine Scientific) ）で補強したＤＭＥ
低グルコース（イルビン・サイエンティフィック）であ
った。再用した培地は、３日間６５３．１細胞を培養
し、遠心分離し、濾過して細胞を取り除いた増殖培地で
あった。チャットメディア(CHAT Media)は５０％の増殖
培地と５０％の１００単位／ｍｌのペニシリン−ストレ
プトマイシン溶液（イルビン・サイエンティフィッ
ク）、４×１０-7Ｍのアミノプテリン（シグマ(Sigma)
）、１×１０-4Ｍのヒポキサンチン（ＭＡ・バイオプ
ロダクツ(MA Bioproducts)）、１．６×１０-5Ｍのチミ
ジン（ＭＡ・バイオプロダクツ）、及び１０単位／ｍｌ
のインシュリン（エリ・リリー(Eli Lily)）で慣らした
培地であった。慣らした培地は５０％増殖培地−５０％
再用培地及び２．５×１０-5Ｍのｂ−メルカプトエタノ
ール（シグマ(Sigma) ）であった。分子量約１３００と
１６００の間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（シ
グマ）を用いた。注射媒体は、１００単位／ｍｌのペニ
シリン−ストレプトマイシン溶液を有するＤＭＥ低グル
コースであった。１／２ミリリットルのプリスタン(Pri
stane)（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン、アルドリッヒ(Aldrich) から入手）を各Ｂａｌｂ／
ｃマウスにハイブリドーマ注射２週間前に腹腔内に注射
した。ハイブリドーマはコーラーとミルステイン、ネイ
チュア(Kohler and Milstein, Nature) ２５６：４９５
（１９７５）により開発された方法を用いて作製した。
免疫処理したマウスのひ臓を頸部転移後無菌的に取り出
し、組織フルイ中で単細胞が得られるまで磨砕した。洗
浄後、細胞をひ臓対骨髄腫細胞２：１の中の洗浄した６
５３．１骨髄腫細胞と混合し、その後ペレット化した。
上澄みを除去し、ＰＥＧを１分間かけてゆっくり添加し
た。ＰＢＳを添加して全容量を２２ｍｌとした後、ＰＥ
Ｇ添加後８分にペレット化した。ペレットを２００ｍｌ
のチャット培地中に懸濁し、その懸濁液０．２ｍｌを１
０個の９６−ウエル微量滴定器プレートの各ウエルに添
加した。ウエルにはポスト融合日数６または７に新鮮な
チャットを供給した。
的親和性を持つモノクロナール抗体を作ることができる
ハイブリドーマを調製した。使用した材料は次の通りで
ある。使用した骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３骨髄腫細胞系統、カーネーら、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー(Kearney et al., J. Immunol.) １２３：１
５４８（１９７９）により開発された非分泌性マウス骨
髄腫系統から誘導した。使用したひ臓細胞は、下記の方
法により免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから採取した。増
殖培地は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン(Hycllon
e)）及び２ｍＭの１−グルタミン（イルビン・サイエン
ティフィック(Irvine Scientific) ）で補強したＤＭＥ
低グルコース（イルビン・サイエンティフィック）であ
った。再用した培地は、３日間６５３．１細胞を培養
し、遠心分離し、濾過して細胞を取り除いた増殖培地で
あった。チャットメディア(CHAT Media)は５０％の増殖
培地と５０％の１００単位／ｍｌのペニシリン−ストレ
プトマイシン溶液（イルビン・サイエンティフィッ
ク）、４×１０-7Ｍのアミノプテリン（シグマ(Sigma)
）、１×１０-4Ｍのヒポキサンチン（ＭＡ・バイオプ
ロダクツ(MA Bioproducts)）、１．６×１０-5Ｍのチミ
ジン（ＭＡ・バイオプロダクツ）、及び１０単位／ｍｌ
のインシュリン（エリ・リリー(Eli Lily)）で慣らした
培地であった。慣らした培地は５０％増殖培地−５０％
再用培地及び２．５×１０-5Ｍのｂ−メルカプトエタノ
ール（シグマ(Sigma) ）であった。分子量約１３００と
１６００の間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（シ
グマ）を用いた。注射媒体は、１００単位／ｍｌのペニ
シリン−ストレプトマイシン溶液を有するＤＭＥ低グル
コースであった。１／２ミリリットルのプリスタン(Pri
stane)（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン、アルドリッヒ(Aldrich) から入手）を各Ｂａｌｂ／
ｃマウスにハイブリドーマ注射２週間前に腹腔内に注射
した。ハイブリドーマはコーラーとミルステイン、ネイ
チュア(Kohler and Milstein, Nature) ２５６：４９５
（１９７５）により開発された方法を用いて作製した。
免疫処理したマウスのひ臓を頸部転移後無菌的に取り出
し、組織フルイ中で単細胞が得られるまで磨砕した。洗
浄後、細胞をひ臓対骨髄腫細胞２：１の中の洗浄した６
５３．１骨髄腫細胞と混合し、その後ペレット化した。
上澄みを除去し、ＰＥＧを１分間かけてゆっくり添加し
た。ＰＢＳを添加して全容量を２２ｍｌとした後、ＰＥ
Ｇ添加後８分にペレット化した。ペレットを２００ｍｌ
のチャット培地中に懸濁し、その懸濁液０．２ｍｌを１
０個の９６−ウエル微量滴定器プレートの各ウエルに添
加した。ウエルにはポスト融合日数６または７に新鮮な
チャットを供給した。
【００５４】ウエルの増殖についての試験は日数１０で
開始し、その後３〜４日続けた。光学的濃度の読みが負
の対照(negative control)よりも大きいウエルをそれに
続く日に再試験した。試験の第２日に読みが負の対照よ
りも大きいままであればそのコロニーは陽性とみなしク
ローン化した。クローン化は、２個の９６−ウエルプレ
ート中のならし培地中の希釈を制限すること、１個は１
ウエル当り２細胞、１個は１ウエル当り１細胞とするこ
と、により行った。クローン化１週間後単一コロニーの
ウエルを酵素免疫測定（ＥＩＡ）により試験した。ウエ
ル全部が陽性であれば、その系統は純粋であると考え、
安定のため第２回の再クローン化した。ウエル全部が１
００％陽性ではない場合は陽性のウエルを第２回のクロ
ーン化に使用した。プレートはクローン化後７日に再度
試験した。この操作は試験したクローンのすべてが１０
０％陽性になるまで繰り返した。その細胞を増殖培地中
に延ばして注射媒質中に入れプリスタン(Pristane)始動
したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔中へマウス１匹当り約３
×１０6 細胞になる濃度で注射した。注射の前に、培養
した細胞からの上澄みをオーチタロニー(Ouchterlony)
ゲル拡散法、アクタ・パス・ミクロバイオロジ・スカン
ジ(Acta Path Microbiol Scand) ２６：５０７（１９４
９）によるイソタイプ化に使用した。ハイプリドーマ細
胞を注射後約１０日のマウスから腹水液を取り出した。
次に、その腹水液をＥＩＡで滴定し、ＩｇＧイソタイプ
含有量をベックマンＩＣＳ速度比濁計(BeckmanICS rate
nephelometer) を用い測定した。ＳＰＩＴＣ・ＡＳ１
１のマウスは次のようにして免疫した。フロインド(Fre
und)の完全アジュバント（ＦＣＡ）中の５０マイクログ
ラムのＳＰＩＣＴ−ＢＳＡを腹腔内注射し、１０週間
後、１５０μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射
した後、フロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）
中のＢＡＳを腹腔内注射した。１カ月後、１５０μｇの
メチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射した後、ＦＩＣＡ
中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月後、２０μｇのメ
チル化ＳＰＨ−ＤＮＡ／メチルを腹腔内注射した。最終
的に、融合の日食塩水中のＢＳＡを静脈内に投与した。
開始し、その後３〜４日続けた。光学的濃度の読みが負
の対照(negative control)よりも大きいウエルをそれに
続く日に再試験した。試験の第２日に読みが負の対照よ
りも大きいままであればそのコロニーは陽性とみなしク
ローン化した。クローン化は、２個の９６−ウエルプレ
ート中のならし培地中の希釈を制限すること、１個は１
ウエル当り２細胞、１個は１ウエル当り１細胞とするこ
と、により行った。クローン化１週間後単一コロニーの
ウエルを酵素免疫測定（ＥＩＡ）により試験した。ウエ
ル全部が陽性であれば、その系統は純粋であると考え、
安定のため第２回の再クローン化した。ウエル全部が１
００％陽性ではない場合は陽性のウエルを第２回のクロ
ーン化に使用した。プレートはクローン化後７日に再度
試験した。この操作は試験したクローンのすべてが１０
０％陽性になるまで繰り返した。その細胞を増殖培地中
に延ばして注射媒質中に入れプリスタン(Pristane)始動
したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔中へマウス１匹当り約３
×１０6 細胞になる濃度で注射した。注射の前に、培養
した細胞からの上澄みをオーチタロニー(Ouchterlony)
ゲル拡散法、アクタ・パス・ミクロバイオロジ・スカン
ジ(Acta Path Microbiol Scand) ２６：５０７（１９４
９）によるイソタイプ化に使用した。ハイプリドーマ細
胞を注射後約１０日のマウスから腹水液を取り出した。
次に、その腹水液をＥＩＡで滴定し、ＩｇＧイソタイプ
含有量をベックマンＩＣＳ速度比濁計(BeckmanICS rate
nephelometer) を用い測定した。ＳＰＩＴＣ・ＡＳ１
１のマウスは次のようにして免疫した。フロインド(Fre
und)の完全アジュバント（ＦＣＡ）中の５０マイクログ
ラムのＳＰＩＣＴ−ＢＳＡを腹腔内注射し、１０週間
後、１５０μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射
した後、フロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）
中のＢＡＳを腹腔内注射した。１カ月後、１５０μｇの
メチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射した後、ＦＩＣＡ
中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月後、２０μｇのメ
チル化ＳＰＨ−ＤＮＡ／メチルを腹腔内注射した。最終
的に、融合の日食塩水中のＢＳＡを静脈内に投与した。
【００５５】ＳＰＩＴＣ・ＡＳ１３、ＳＰＩＴＣ・ＡＳ
１４及びＳＰＩＴＣ・ＡＳ１５のマスウは次のようにし
て免疫した。フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）
中の５０マイクログラムのＳＰＩＴＣ−ＢＳＡを腹腔内
注射し、１０週間後１００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮ
Ａを腹腔内注射した後、フロインドの不完全アジュバン
ト（ＦＩＣＡ）中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月
後、１００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射
した後、ＦＩＣＡ中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月
後、２０μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡ／メチルを腹腔
内注射した後、食塩水中のＢＳＡを腹腔内注射した。３
週間後、２００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを注射し
た。最終的に融合前の３日間食塩水中のＢＳＡを静脈内
に投与した。
１４及びＳＰＩＴＣ・ＡＳ１５のマスウは次のようにし
て免疫した。フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）
中の５０マイクログラムのＳＰＩＴＣ−ＢＳＡを腹腔内
注射し、１０週間後１００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮ
Ａを腹腔内注射した後、フロインドの不完全アジュバン
ト（ＦＩＣＡ）中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月
後、１００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを腹腔内注射
した後、ＦＩＣＡ中のＢＳＡを腹腔内注射した。１カ月
後、２０μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡ／メチルを腹腔
内注射した後、食塩水中のＢＳＡを腹腔内注射した。３
週間後、２００μｇのメチル化ＳＰＨ−ＤＮＡを注射し
た。最終的に融合前の３日間食塩水中のＢＳＡを静脈内
に投与した。
【００５６】メチル化ＳＰＨ−ＤＮＡ抗原は次のように
して調製した。子ウシの胸線ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
を次の操作によりＳＰＨで標識付けした：（ａ）１０ｍ
ｌの子ウシの胸線ＤＮＡを１５分間１００℃加熱により
変性し；（ｂ）９０ｍｌの例６の標識用混合物を８０℃
で２０分間温置し、ＰＢＳに対し透析した。次にスルホ
フェニル標識したＤＮＡをバイオケミストリー(Biochem
istry)２２，３４５３−３４６０（１９８３）に記載の
ジョンストンら(Johnston et al.) の操作に従ってメチ
ル化ＢＳＡと結合させた。この方法によって調製したハ
イブリドーマはスルホフェニル標識に対し特異の親和性
をもつモノクロナール抗体を作ることができるものであ
った。
して調製した。子ウシの胸線ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
を次の操作によりＳＰＨで標識付けした：（ａ）１０ｍ
ｌの子ウシの胸線ＤＮＡを１５分間１００℃加熱により
変性し；（ｂ）９０ｍｌの例６の標識用混合物を８０℃
で２０分間温置し、ＰＢＳに対し透析した。次にスルホ
フェニル標識したＤＮＡをバイオケミストリー(Biochem
istry)２２，３４５３−３４６０（１９８３）に記載の
ジョンストンら(Johnston et al.) の操作に従ってメチ
ル化ＢＳＡと結合させた。この方法によって調製したハ
イブリドーマはスルホフェニル標識に対し特異の親和性
をもつモノクロナール抗体を作ることができるものであ
った。
【００５７】例８ （１ピコグラム以下の捕獲ポリヌクレオチドの検出）非
常に少量の捕獲ポリヌクレオチドの検出が、図５に示す
ように、ハイブリッド形成プローブを使用することによ
って可能である。図５は子ウシの胸線ＤＮＡ標的ポリヌ
クレオチドに対するスルホフェニル変性ｐＵＣ・ＳＬＯ
プラスミドハイブリッド形成プローブのハイブリッド形
成終点ないし感度を示す。ニトロセルロースストリップ
(strip) の上列に、ストリップ上に示すように左から右
へ（ａ）濃度１μｇ、３３３ｎｇ、１１１ｎｇ、３７ｎ
ｇ、１２ｎｇ、４ｎｇ、１３ｎｇ、４５７ｐｇ、１５２
ｐｇ、５０．８ｐｇ、１６．９ｐｇ及び５．６ｐｇの子
ウシの胸線ＤＮＡ捕獲ポリヌクレオチド、及び（ｂ）濃
度４０ｎｇから０．２２ｐｇまでの標識しないｐＵＣ・
ＳＬＯプラスミドＤＮＡプローブポリヌクレオチドを含
有する１２個の１μｌコントロールスポットを点づけし
た。また、ニトロセルロースストリップの下列に子ウシ
の胸線ＤＮＡ捕獲（標的）ポリヌクレオチドにハイブリ
ッド化されたハイブリッド形成プローブを含有する１２
個のスポットをつけた。
常に少量の捕獲ポリヌクレオチドの検出が、図５に示す
ように、ハイブリッド形成プローブを使用することによ
って可能である。図５は子ウシの胸線ＤＮＡ標的ポリヌ
クレオチドに対するスルホフェニル変性ｐＵＣ・ＳＬＯ
プラスミドハイブリッド形成プローブのハイブリッド形
成終点ないし感度を示す。ニトロセルロースストリップ
(strip) の上列に、ストリップ上に示すように左から右
へ（ａ）濃度１μｇ、３３３ｎｇ、１１１ｎｇ、３７ｎ
ｇ、１２ｎｇ、４ｎｇ、１３ｎｇ、４５７ｐｇ、１５２
ｐｇ、５０．８ｐｇ、１６．９ｐｇ及び５．６ｐｇの子
ウシの胸線ＤＮＡ捕獲ポリヌクレオチド、及び（ｂ）濃
度４０ｎｇから０．２２ｐｇまでの標識しないｐＵＣ・
ＳＬＯプラスミドＤＮＡプローブポリヌクレオチドを含
有する１２個の１μｌコントロールスポットを点づけし
た。また、ニトロセルロースストリップの下列に子ウシ
の胸線ＤＮＡ捕獲（標的）ポリヌクレオチドにハイブリ
ッド化されたハイブリッド形成プローブを含有する１２
個のスポットをつけた。
【００５８】ハイブリッド形成プローブは次のようにし
て調製した。１０マイクロリットルのｐＵＣ・ＳＬＯプ
ラスミドＤＮＡを１０分間煮沸してプローブポリヌクレ
オチドとして用いるための３マイクログラムの一本鎖ｐ
ＵＣ・ＳＬＯを含有する溶液を得た。９０マイクロリッ
トルのＳＰＨ標識用混合物をプローブポリヌクレオチド
溶液に添加した。付着反応を、求電子性停止化合物とし
て４０μｌの２．０Ｍ無水コハク酸（１００％ジメチル
ホルミド中）の添加により停止させるまで８０℃で１０
分間行った。付着反応停止溶液（標識用混合物及びＳＰ
Ｈ標識したハイブリッド形成プローブ含有）の全部を次
にハイブリッド形成緩衝剤溶液へ添加した。ハイブリッ
ド形成緩衝剤溶液は５ＸＳＳＰＥ、５０％ホルムアミ
ド、５Ｘデンハーズ、及び１００μｇ／ｍｌの子ウシの
胸線ＤＮＡ捕獲ポリヌクレオチドを含んでなっていた。
混合物は上記した１２の捕獲ないし標的ポリヌクレオチ
ド濃度でニトロセルロースストリップの下列にスポット
付けするまで３７℃で１晩温置した。洗浄及び検出段階
は例６に示したように、第１ないし１次の抗スルホフェ
ニル抗体として蛋白質親和性精製したＡＳ１４モノクロ
ナール抗体を用いて行った。酵素的検出は室温で２時間
放置して進行させた。図５に示すように、使用したスル
ホフェニル標識したハイブリッド形成プローブは０．２
２ｐｇの捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能にした。
て調製した。１０マイクロリットルのｐＵＣ・ＳＬＯプ
ラスミドＤＮＡを１０分間煮沸してプローブポリヌクレ
オチドとして用いるための３マイクログラムの一本鎖ｐ
ＵＣ・ＳＬＯを含有する溶液を得た。９０マイクロリッ
トルのＳＰＨ標識用混合物をプローブポリヌクレオチド
溶液に添加した。付着反応を、求電子性停止化合物とし
て４０μｌの２．０Ｍ無水コハク酸（１００％ジメチル
ホルミド中）の添加により停止させるまで８０℃で１０
分間行った。付着反応停止溶液（標識用混合物及びＳＰ
Ｈ標識したハイブリッド形成プローブ含有）の全部を次
にハイブリッド形成緩衝剤溶液へ添加した。ハイブリッ
ド形成緩衝剤溶液は５ＸＳＳＰＥ、５０％ホルムアミ
ド、５Ｘデンハーズ、及び１００μｇ／ｍｌの子ウシの
胸線ＤＮＡ捕獲ポリヌクレオチドを含んでなっていた。
混合物は上記した１２の捕獲ないし標的ポリヌクレオチ
ド濃度でニトロセルロースストリップの下列にスポット
付けするまで３７℃で１晩温置した。洗浄及び検出段階
は例６に示したように、第１ないし１次の抗スルホフェ
ニル抗体として蛋白質親和性精製したＡＳ１４モノクロ
ナール抗体を用いて行った。酵素的検出は室温で２時間
放置して進行させた。図５に示すように、使用したスル
ホフェニル標識したハイブリッド形成プローブは０．２
２ｐｇの捕獲ポリヌクレオチドの検出を可能にした。
【００５９】例９ （レジオネラ・ニューモフィラＤＮＡの検出）スルホフ
ェニル標識したハイブリッド形成プローブを全変性細菌
ＤＮＡに直接標識することによりレジオネラ・ニューモ
フィラ(Legionella Pneumophila)捕獲ポリヌクレオチド
の検出に使用した。全ＤＮＡは、６種の異ったレジオネ
ラ種；Ｌ．ニューモフィラ、Ｌ．スピリテンシス(L. sp
iritensis)、Ｌ．フィーレイ(L. feeleii)、Ｌ．ゴルマ
ニイ(L. gormani)、Ｌ．クリスラ(L. crythra)、及び
Ｌ．アニサ(L. anisa)から誘導した。これら６種の異っ
たタイプのレジオネラＤＮＡを変性し、図６に示すよう
に、５枚のニトロセルロースストリップ上に上記の順で
１から６まで番号付けした一列にスポット当たり２０ｎ
ｇの濃度でスポット付けした。このように６種の異った
支持体固定一本鎖レジオネラＤＮＡは６種の捕獲可能な
ポリヌクレオチドとして作用した。次に異った５濃度
（１０００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、及び
０．１ｎｇ）のレジオネラ・ニューモフィラＤＮＡを次
のようにしてＳＰＨで標識した。５種の指示量のレジオ
ネラ・ニューモフィラＤＮＡ（１０００ｎｇ、１００ｎ
ｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、及び０．１ｎｇ）を含有する１
０μｌの水を１０分間煮沸してＤＮＡを変性した。次に
９０マイクロリットルのＳＰＨ標識用混合物を添加し、
各混合液に停止化合物として４０μｌの２．０Ｍ無水コ
ハク酸を添加するまで５つの混合液を８０℃で１０分間
温置した。各混合物（標識用混合物とスルホフェニル標
識したハイブリッド形成プローブ）を次に前記の垂直に
１から５の番号付けされたニトロセルロースストリップ
に添加した。ハイブリッド形成反応は一晩中行った。ハ
イブリッド形成及び検出の方法は既に例５及び６で述べ
た。高ストリンジェンシー洗浄（０．１ＸＳＳＰＥ、６
５℃）を例６に示した検出の前に行った。酵素的検出を
室温で２．０時間続けた。結果は図６に示す。図６によ
って示されるように、スルホフェニル標識したレジオネ
ラ・ニューモフィラハイブリッド形成プローブは相補的
レジオネラ・ニューモフィラ捕獲ポリペプチドと特異に
ハイブリッド形成した。それゆえレジオネラ・ニューモ
フィラＤＮＡの検出は達成された。
ェニル標識したハイブリッド形成プローブを全変性細菌
ＤＮＡに直接標識することによりレジオネラ・ニューモ
フィラ(Legionella Pneumophila)捕獲ポリヌクレオチド
の検出に使用した。全ＤＮＡは、６種の異ったレジオネ
ラ種；Ｌ．ニューモフィラ、Ｌ．スピリテンシス(L. sp
iritensis)、Ｌ．フィーレイ(L. feeleii)、Ｌ．ゴルマ
ニイ(L. gormani)、Ｌ．クリスラ(L. crythra)、及び
Ｌ．アニサ(L. anisa)から誘導した。これら６種の異っ
たタイプのレジオネラＤＮＡを変性し、図６に示すよう
に、５枚のニトロセルロースストリップ上に上記の順で
１から６まで番号付けした一列にスポット当たり２０ｎ
ｇの濃度でスポット付けした。このように６種の異った
支持体固定一本鎖レジオネラＤＮＡは６種の捕獲可能な
ポリヌクレオチドとして作用した。次に異った５濃度
（１０００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、及び
０．１ｎｇ）のレジオネラ・ニューモフィラＤＮＡを次
のようにしてＳＰＨで標識した。５種の指示量のレジオ
ネラ・ニューモフィラＤＮＡ（１０００ｎｇ、１００ｎ
ｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、及び０．１ｎｇ）を含有する１
０μｌの水を１０分間煮沸してＤＮＡを変性した。次に
９０マイクロリットルのＳＰＨ標識用混合物を添加し、
各混合液に停止化合物として４０μｌの２．０Ｍ無水コ
ハク酸を添加するまで５つの混合液を８０℃で１０分間
温置した。各混合物（標識用混合物とスルホフェニル標
識したハイブリッド形成プローブ）を次に前記の垂直に
１から５の番号付けされたニトロセルロースストリップ
に添加した。ハイブリッド形成反応は一晩中行った。ハ
イブリッド形成及び検出の方法は既に例５及び６で述べ
た。高ストリンジェンシー洗浄（０．１ＸＳＳＰＥ、６
５℃）を例６に示した検出の前に行った。酵素的検出を
室温で２．０時間続けた。結果は図６に示す。図６によ
って示されるように、スルホフェニル標識したレジオネ
ラ・ニューモフィラハイブリッド形成プローブは相補的
レジオネラ・ニューモフィラ捕獲ポリペプチドと特異に
ハイブリッド形成した。それゆえレジオネラ・ニューモ
フィラＤＮＡの検出は達成された。
【００６０】例１０ （モノクロナール抗体のハイブリッド形成プローブのス
ルホフェニル標識に対する親和性）本発明の９種の異っ
たハイブリドーマ細胞系統によって作られたマウスのモ
ノクロナール抗スルホフェニル抗体のスルホフェニル標
識に対する親和性の比較を行った。スルホフェニル標識
したｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡを１６．６ｎｇ、５．４６
ｎｇ、１．８２ｎｇ、０．６０ｎｇ、２０２ｐｇ、６
７．５ｐｇ、２２．５ｐｇ、７．５ｐｇ、２．５ｐｇ、
０．８ｐｇ、及び０．２７ｐｇの濃度で直接ニトロセル
ロース支持体ストリップ上にスポット付けした。標識し
たＤＮＡは例４によって調製された標識用混合物から直
接スポット付けしたから、若干の遊離のＳＰＨがニトロ
セルロースに付着し、それが、例えばＡＳ１６ストリッ
プのように、目立った着色外側リングとして検出され
た。スルホフェニルで標識したＤＮＡの検出は例６に記
載した二元抗体検出法を用いることによって行った。ス
ルホフェニル標識への親和性、したがって、感度は図７
によって示されるようにＡＳ１１、ＡＳ１３、ＡＳ１
４、及びＡＳ１５ハイブリドーマ細胞系列から誘導され
たマウスのモノクロナール抗体で最大であった。これら
マウスのモノクロナール抗体の４試料はまたブロットか
ら外側のリングが存在しないことによって明らかなよう
に遊離のＳＰＨに対し低い親和性を示した。ＡＳ１１、
ＡＳ１３、ＡＳ１４、及びＡＳ１５ハイブリドーマ細胞
系列はＡＴＣＣで析出した。
ルホフェニル標識に対する親和性）本発明の９種の異っ
たハイブリドーマ細胞系統によって作られたマウスのモ
ノクロナール抗スルホフェニル抗体のスルホフェニル標
識に対する親和性の比較を行った。スルホフェニル標識
したｐＵＣ・ＳＬＯ・ＤＮＡを１６．６ｎｇ、５．４６
ｎｇ、１．８２ｎｇ、０．６０ｎｇ、２０２ｐｇ、６
７．５ｐｇ、２２．５ｐｇ、７．５ｐｇ、２．５ｐｇ、
０．８ｐｇ、及び０．２７ｐｇの濃度で直接ニトロセル
ロース支持体ストリップ上にスポット付けした。標識し
たＤＮＡは例４によって調製された標識用混合物から直
接スポット付けしたから、若干の遊離のＳＰＨがニトロ
セルロースに付着し、それが、例えばＡＳ１６ストリッ
プのように、目立った着色外側リングとして検出され
た。スルホフェニルで標識したＤＮＡの検出は例６に記
載した二元抗体検出法を用いることによって行った。ス
ルホフェニル標識への親和性、したがって、感度は図７
によって示されるようにＡＳ１１、ＡＳ１３、ＡＳ１
４、及びＡＳ１５ハイブリドーマ細胞系列から誘導され
たマウスのモノクロナール抗体で最大であった。これら
マウスのモノクロナール抗体の４試料はまたブロットか
ら外側のリングが存在しないことによって明らかなよう
に遊離のＳＰＨに対し低い親和性を示した。ＡＳ１１、
ＡＳ１３、ＡＳ１４、及びＡＳ１５ハイブリドーマ細胞
系列はＡＴＣＣで析出した。
【００６１】例１１ （生体内原位置の捕獲ポリヌクレオチドの検出）ＨＰＶ
・６・ＤＮＡの生体内原位置(In Situ) の検出がスルホ
フェニル標識したハイブリッド形成プローブを使うこと
によって達成された。これはヒトの頸部生体組織検査標
本中のＨＰＶ・６誘発障害の検出を可能にした。ハイブ
リッド形成プローブは次のようにして調製した。ＨＰＶ
・６・ＤＮＡをＣｓＣｌ精製して１ｍｇ／ｍｌ濃度の二
本鎖ＨＰＶ・６・ＤＮＡを得た。５００マイクロリット
ルのＨＰＶ・６・ＤＮＡを次にマイクロチッププローブ
でヒート−システムズソニケーター(Heat-Systems Soni
cator)を用いて超音波処理した。超音波処理は約１．５
の設定で１０％出力で１分間続けた。超音波処理に続い
てＤＮＡを５分間湯浴中で煮沸することにより変性し
た。変性したＨＰＶ・６・ＤＮＡを次に付着反応によっ
てＳＰＨで標識した。付着反応に続いて、スルホフェニ
ル標識した一本鎖ＨＰＶ・６・ＤＮＡをＴ．Ｅ．（１０
ｍｌトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に
対して徹底的に透析した。ヒトの頸部生体組織検査組織
試料中のＨＰＶ・６・ＤＮＡを２ＸＳＳＣ及び５０％ホ
ルムアミドの７０℃での塗布により生体内原位置で変性
した。ハイブリッド形成反応を４ＸＳＳＣ及び４０％ホ
ルムアミド中、４２℃で１２時間行った。スルホフェニ
ル修飾プローブを５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。一次
抗体は、例５の親和性精製されたウサギの抗スルホフェ
ニル抗体（２．３μｇ／ｍｌ）であった。二次抗体はア
ルカリホスファターゼ接合ヤギの抗ウサギ抗体（ケミコ
ン(Chemicon)１：２０００）であった。ハイブリッド形
成プローブを検定するのに用いた酸素基準比色沈殿反応
の結果は図８に示す。暗い円形部分はＨＰＶ・６捕獲Ｄ
ＮＡとハイブリッド形成したスルホフェニル標識したＨ
ＰＶ・６・ＤＮＡハイブリッド形成ブローブの部位であ
る。このようにスルホフェニル標識ハイブリッド形成プ
ローブは組織標本中の補足的ＨＰＶ・６捕獲ＤＮＡの生
体内原位置検定を可能にした。
・６・ＤＮＡの生体内原位置(In Situ) の検出がスルホ
フェニル標識したハイブリッド形成プローブを使うこと
によって達成された。これはヒトの頸部生体組織検査標
本中のＨＰＶ・６誘発障害の検出を可能にした。ハイブ
リッド形成プローブは次のようにして調製した。ＨＰＶ
・６・ＤＮＡをＣｓＣｌ精製して１ｍｇ／ｍｌ濃度の二
本鎖ＨＰＶ・６・ＤＮＡを得た。５００マイクロリット
ルのＨＰＶ・６・ＤＮＡを次にマイクロチッププローブ
でヒート−システムズソニケーター(Heat-Systems Soni
cator)を用いて超音波処理した。超音波処理は約１．５
の設定で１０％出力で１分間続けた。超音波処理に続い
てＤＮＡを５分間湯浴中で煮沸することにより変性し
た。変性したＨＰＶ・６・ＤＮＡを次に付着反応によっ
てＳＰＨで標識した。付着反応に続いて、スルホフェニ
ル標識した一本鎖ＨＰＶ・６・ＤＮＡをＴ．Ｅ．（１０
ｍｌトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に
対して徹底的に透析した。ヒトの頸部生体組織検査組織
試料中のＨＰＶ・６・ＤＮＡを２ＸＳＳＣ及び５０％ホ
ルムアミドの７０℃での塗布により生体内原位置で変性
した。ハイブリッド形成反応を４ＸＳＳＣ及び４０％ホ
ルムアミド中、４２℃で１２時間行った。スルホフェニ
ル修飾プローブを５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。一次
抗体は、例５の親和性精製されたウサギの抗スルホフェ
ニル抗体（２．３μｇ／ｍｌ）であった。二次抗体はア
ルカリホスファターゼ接合ヤギの抗ウサギ抗体（ケミコ
ン(Chemicon)１：２０００）であった。ハイブリッド形
成プローブを検定するのに用いた酸素基準比色沈殿反応
の結果は図８に示す。暗い円形部分はＨＰＶ・６捕獲Ｄ
ＮＡとハイブリッド形成したスルホフェニル標識したＨ
ＰＶ・６・ＤＮＡハイブリッド形成ブローブの部位であ
る。このようにスルホフェニル標識ハイブリッド形成プ
ローブは組織標本中の補足的ＨＰＶ・６捕獲ＤＮＡの生
体内原位置検定を可能にした。
【００６２】例１２ （蛋白質プローブのスルホフェニル標識の検出）モノク
ロナール抗体による蛋白質プローブのスルホフェニル標
識の検出を基準ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫溶媒検定）(e
nzyme-linked immunosorbent assay) ）微量滴定検定を
用いて測定した。ＥＬＩＳＡ検定はモノクロナール抗体
の蛋白質プローブのスルホフェニル標識との免疫反応の
検出を可能にした。ＥＬＩＳＡ検定は本質的にサンドイ
ッチ免疫検定であり、第１の抗体は本発明のモノクロナ
ール抗体であり、第２の抗体は市販の接合抗体である。
標準ＥＬＩＳＡ検定を実施するのに用いた試験類には次
のものが含まれる： ａ．例２の方法により調製した濃度１μｇ／ｍｌ（１：
１２，０００）のＳＰＩＴＣ−アポフェリチン抗体（Ｓ
ＰＩＴＣ＝Ａｐｏ）、 ｂ．炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ９．６塗布緩衝剤、 ｃ．４組のそれぞれＡＳ１１、ＡＳ１３、ＡＳ１４、及
びＡＳ１５をマウスに注射して得られたモノクロナール
抗体を含有する腹水液、４つのモノクロナール抗体溶液
は別々の微量滴定器プレートとともに用い、プレート上
で希釈＃１（１：１００）から希釈＃２４（１：８３
８，８６０，８００）まで順次希釈（Ｘ２）した。 ｄ．使用したコントロールは希釈率１：１００で用いた
正常なマウス腹水（ＮＡＳ）であった、用いた培地及び
正のコントロールは腹水(Ascites) ＃６（１：１００）
であった。 ｅ．使用した第２の抗体はアルカリフォスファターゼに
接合したウサギの抗マウス抗体（シグマから＃５７Ｆ−
８８２４として市販）であり、希釈率１：１２，０００
で使用した。 ｆ．アルカリフォスファターゼ基質は、フォスファター
ゼ基質、ｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ１０４−
０）及びジエタノールアミン緩衝剤から調製した。 ｇ．リンブロ／タイターテック(Linbro/Titertek) 微量
滴定器プレート（カタログ番号＃７６−３８１−０４）
を使用した。
ロナール抗体による蛋白質プローブのスルホフェニル標
識の検出を基準ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫溶媒検定）(e
nzyme-linked immunosorbent assay) ）微量滴定検定を
用いて測定した。ＥＬＩＳＡ検定はモノクロナール抗体
の蛋白質プローブのスルホフェニル標識との免疫反応の
検出を可能にした。ＥＬＩＳＡ検定は本質的にサンドイ
ッチ免疫検定であり、第１の抗体は本発明のモノクロナ
ール抗体であり、第２の抗体は市販の接合抗体である。
標準ＥＬＩＳＡ検定を実施するのに用いた試験類には次
のものが含まれる： ａ．例２の方法により調製した濃度１μｇ／ｍｌ（１：
１２，０００）のＳＰＩＴＣ−アポフェリチン抗体（Ｓ
ＰＩＴＣ＝Ａｐｏ）、 ｂ．炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ９．６塗布緩衝剤、 ｃ．４組のそれぞれＡＳ１１、ＡＳ１３、ＡＳ１４、及
びＡＳ１５をマウスに注射して得られたモノクロナール
抗体を含有する腹水液、４つのモノクロナール抗体溶液
は別々の微量滴定器プレートとともに用い、プレート上
で希釈＃１（１：１００）から希釈＃２４（１：８３
８，８６０，８００）まで順次希釈（Ｘ２）した。 ｄ．使用したコントロールは希釈率１：１００で用いた
正常なマウス腹水（ＮＡＳ）であった、用いた培地及び
正のコントロールは腹水(Ascites) ＃６（１：１００）
であった。 ｅ．使用した第２の抗体はアルカリフォスファターゼに
接合したウサギの抗マウス抗体（シグマから＃５７Ｆ−
８８２４として市販）であり、希釈率１：１２，０００
で使用した。 ｆ．アルカリフォスファターゼ基質は、フォスファター
ゼ基質、ｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ１０４−
０）及びジエタノールアミン緩衝剤から調製した。 ｇ．リンブロ／タイターテック(Linbro/Titertek) 微量
滴定器プレート（カタログ番号＃７６−３８１−０４）
を使用した。
【００６３】検定は、抗体（ＳＰＩＴＣ−Ａｐｏ）の冷
コーチング緩衝液での予め決められた希釈率の希釈液を
調製すること及びそれを氷上で保持することにより行っ
た。約２００μｌの抗体希釈液をマルチチャンネルピペ
ットを用いプレートウエル中へ分配した。４つのモノク
ロナール抗体液試料を順次希釈して別々のプレートのウ
エルへ添加した。次にプレートは約３７℃で約２時間温
置した。第２の抗体をウエルへ添加した。さらに温置
し、洗浄した後希釈した基質（ジエタノールアミン緩衝
液中１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。次いで約３７℃で約３
０分間温置した。結果は４０５ｎｍにセットしたタイタ
ーテック(Titertek)分光光度計で読み取った。ＥＬＩＳ
Ａ検定の結果は図９にグラフで示した。腹水液を含む４
つのモノクロナール抗体液のそれぞれの３回滴定値を図
９に示すデータを得るのに用いた。正常なマウス腹水血
清（ＮＡＳ）基線値よりも大きい吸光度（ＡＢＳ）はモ
ノクロナール抗体の蛋白質プローブのスルホフェニル標
識への結合を意味している。ＡＳ１３モノクロナール抗
体は用いたすべての希釈率において蛋白質プローブのス
ルホフェニル標識に対し最も高い親和性を示した。
コーチング緩衝液での予め決められた希釈率の希釈液を
調製すること及びそれを氷上で保持することにより行っ
た。約２００μｌの抗体希釈液をマルチチャンネルピペ
ットを用いプレートウエル中へ分配した。４つのモノク
ロナール抗体液試料を順次希釈して別々のプレートのウ
エルへ添加した。次にプレートは約３７℃で約２時間温
置した。第２の抗体をウエルへ添加した。さらに温置
し、洗浄した後希釈した基質（ジエタノールアミン緩衝
液中１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。次いで約３７℃で約３
０分間温置した。結果は４０５ｎｍにセットしたタイタ
ーテック(Titertek)分光光度計で読み取った。ＥＬＩＳ
Ａ検定の結果は図９にグラフで示した。腹水液を含む４
つのモノクロナール抗体液のそれぞれの３回滴定値を図
９に示すデータを得るのに用いた。正常なマウス腹水血
清（ＮＡＳ）基線値よりも大きい吸光度（ＡＢＳ）はモ
ノクロナール抗体の蛋白質プローブのスルホフェニル標
識への結合を意味している。ＡＳ１３モノクロナール抗
体は用いたすべての希釈率において蛋白質プローブのス
ルホフェニル標識に対し最も高い親和性を示した。
【００６４】例１３ （捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子の検出に用いる複
合物の調製方法）この例はスルホフェニル抗体複合物調
製の３方法を示す。複合物は酵素、酵素基質及び／また
はハプテン標識または非ハプテン標識など各種検出可能
な部分を含むことができる。複合物は捕獲ポリヌクレオ
チド及び捕獲分子がスルホフェニル標識したプローブと
反応した後少量の捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子を
検出するのに用いることができる。そのうえ、複合物の
使用は捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子をバックグラ
ウンドのノイズが少ない、より迅速な検出を可能にす
る。
合物の調製方法）この例はスルホフェニル抗体複合物調
製の３方法を示す。複合物は酵素、酵素基質及び／また
はハプテン標識または非ハプテン標識など各種検出可能
な部分を含むことができる。複合物は捕獲ポリヌクレオ
チド及び捕獲分子がスルホフェニル標識したプローブと
反応した後少量の捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子を
検出するのに用いることができる。そのうえ、複合物の
使用は捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子をバックグラ
ウンドのノイズが少ない、より迅速な検出を可能にす
る。
【００６５】方法Ａ（酵素接合した抗スルホフェニル抗
体の調製） これはアルカリホスファターゼに直接接合した一次抗ス
ルホフェニル抗体を含んでなる複合体の調製方法であ
る。ホースラディッシュペオキシダーゼなどの他の酵素
もまた用いることができる。その複合体は、抗体、研究
室マニュアル、第９章、第３４６−３４７頁（「グルタ
ールアルデヒド・カップリング」）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー(Antibodies, A Labolat
ory Manual, capter 9, pages 346-347(“ Glutaraldeh
yde Coupling”），Cold Spring Harbor Laboratory)
（１９８８）にイー・ハーローら(E. Harlow et at.)が
開示した方法を修正した次のようなカップリング操作を
用い作ることができる： ａ．１０ｍｇの精製した抗スルホフェニル抗体を５ｍｇ
のアルカリホスファターゼと混合して１ｍｌの抗体と酵
素の混合物を得る。 ｂ．その混合物を０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）を４回取り替えて透析する。 ｃ．酵素・抗体混合物を小容量を容易かつ有効にかきま
ぜできる容器に移す。０．０５ｍｌのグルタールアルデ
ヒド１％溶液をゆっくり加える。 ｄ．５分後スターラーのスイッチを切り、室温で約３時
間放置する。０．１ｍｌの１．０Ｍエタノールアミン
（ｐＨ７）を加える。 ｅ．さらに２時間後４℃でＰＢＳを３回取り替えて一晩
中透析する。 ｆ．混合物を４０，０００ｇで２００分間遠心する。 ｇ．上澄みを４℃で５０％グリセロール、１ｍＭ・Ｍｇ
Ｃｌ2 、１ｍＭ・ＺｎＣｌ2 、０．０２％アジ化ナトリ
ウムの存在下で貯蔵する。その上澄みは、アルカリホス
ファターゼに接合した抗スルホフェニル抗体を含んでい
る。この複合体は、核酸プローブまたは蛋白質プローブ
のスルホフェニル標識を検出するのに用いることができ
る。酵素がスルホフェニル標識の部位に直接配置してい
るから改良されたより少量のスルホフェニル標識の検出
が可能となる。
体の調製） これはアルカリホスファターゼに直接接合した一次抗ス
ルホフェニル抗体を含んでなる複合体の調製方法であ
る。ホースラディッシュペオキシダーゼなどの他の酵素
もまた用いることができる。その複合体は、抗体、研究
室マニュアル、第９章、第３４６−３４７頁（「グルタ
ールアルデヒド・カップリング」）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー(Antibodies, A Labolat
ory Manual, capter 9, pages 346-347(“ Glutaraldeh
yde Coupling”），Cold Spring Harbor Laboratory)
（１９８８）にイー・ハーローら(E. Harlow et at.)が
開示した方法を修正した次のようなカップリング操作を
用い作ることができる： ａ．１０ｍｇの精製した抗スルホフェニル抗体を５ｍｇ
のアルカリホスファターゼと混合して１ｍｌの抗体と酵
素の混合物を得る。 ｂ．その混合物を０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）を４回取り替えて透析する。 ｃ．酵素・抗体混合物を小容量を容易かつ有効にかきま
ぜできる容器に移す。０．０５ｍｌのグルタールアルデ
ヒド１％溶液をゆっくり加える。 ｄ．５分後スターラーのスイッチを切り、室温で約３時
間放置する。０．１ｍｌの１．０Ｍエタノールアミン
（ｐＨ７）を加える。 ｅ．さらに２時間後４℃でＰＢＳを３回取り替えて一晩
中透析する。 ｆ．混合物を４０，０００ｇで２００分間遠心する。 ｇ．上澄みを４℃で５０％グリセロール、１ｍＭ・Ｍｇ
Ｃｌ2 、１ｍＭ・ＺｎＣｌ2 、０．０２％アジ化ナトリ
ウムの存在下で貯蔵する。その上澄みは、アルカリホス
ファターゼに接合した抗スルホフェニル抗体を含んでい
る。この複合体は、核酸プローブまたは蛋白質プローブ
のスルホフェニル標識を検出するのに用いることができ
る。酵素がスルホフェニル標識の部位に直接配置してい
るから改良されたより少量のスルホフェニル標識の検出
が可能となる。
【００６６】方法Ｂ（標識した抗スルホフェニル抗体の
調製） これはビオチン標識に接合した抗スルホフェニル抗体を
含んでなる複合体の調製方法である。蛍光及び化学発光
標識などの他の標識もまた使用できる。その複合体は次
のよにして調製することができる。 ａ．ジメチルスルホキシド中に１０ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド−Ｘ−ビオチンの溶液を調製す
る。 ｂ．約ｐＨ８．０で重炭酸ナトリウム緩衝液中約１〜３
ｍｇ／ｍｌの抗スルホフェニル抗体溶液を調製する。す
べての反応性アミンを透析除去する。 ｃ．抗スルホフェニル抗体にビオチンエステルを抗体約
１ミリグラム当りビオチン−ＮＨＳエステル約１０〜２
５０μｇの割合で添加する。ＮＨＳ−エステルは４℃で
かきまぜながら加えるべきである。 ｄ．４℃で最小３時間温置する。 ｅ．抗体・ビオチン混合物をリン酸塩緩衝食塩水に対し
透析する。この方法により調製されたビオチンで標識し
た抗スルホフェニル抗体はストレプタビジン(streptavi
din)−アルカリホスファターゼ、抗ビオチン−アルカリ
ホスファターゼまたは他の酵素接合体などのようにビオ
チンに対し特異な親和性を有する化合物を用い検出する
ことができる。この方法は標識した一次抗体の使用がビ
オチン標識などのより検出しやすい標識をスルホフェニ
ル標識の近傍に配置するようにするから改善されたスル
ホフェニル標識の検出を可能にする。
調製） これはビオチン標識に接合した抗スルホフェニル抗体を
含んでなる複合体の調製方法である。蛍光及び化学発光
標識などの他の標識もまた使用できる。その複合体は次
のよにして調製することができる。 ａ．ジメチルスルホキシド中に１０ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド−Ｘ−ビオチンの溶液を調製す
る。 ｂ．約ｐＨ８．０で重炭酸ナトリウム緩衝液中約１〜３
ｍｇ／ｍｌの抗スルホフェニル抗体溶液を調製する。す
べての反応性アミンを透析除去する。 ｃ．抗スルホフェニル抗体にビオチンエステルを抗体約
１ミリグラム当りビオチン−ＮＨＳエステル約１０〜２
５０μｇの割合で添加する。ＮＨＳ−エステルは４℃で
かきまぜながら加えるべきである。 ｄ．４℃で最小３時間温置する。 ｅ．抗体・ビオチン混合物をリン酸塩緩衝食塩水に対し
透析する。この方法により調製されたビオチンで標識し
た抗スルホフェニル抗体はストレプタビジン(streptavi
din)−アルカリホスファターゼ、抗ビオチン−アルカリ
ホスファターゼまたは他の酵素接合体などのようにビオ
チンに対し特異な親和性を有する化合物を用い検出する
ことができる。この方法は標識した一次抗体の使用がビ
オチン標識などのより検出しやすい標識をスルホフェニ
ル標識の近傍に配置するようにするから改善されたスル
ホフェニル標識の検出を可能にする。
【００６７】方法Ｃ（スルホフェニル標識した酵素の調
製） これは抗スルホフェニル抗体−スルホフェニル標識した
アルカリホスファターゼ複合体を含んでなる複合体を調
製する方法である。その複合体は「組織抗原を局在させ
るための免疫グロブリン−酵素架橋法」ジャーナル・ヒ
ストケミカリー・シトケミカリー (“An Immunoglobuli
n-Enzyme Bridge Method for Localizing Tissue Antig
ens,”J. Histchem. Cytochem.) １７：５６３−５６９
にティー・イー・メイソンら(T.E. Mason et al.) が開
示した方法を修正した次のような操作を用い作ることが
できる： ａ．アルカリホスファターゼを１００ｍＭ炭酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ９．０に対し透析する。アルカリホスファ
ターゼは約２ｍｇ／ｍｌにすることができる。 ｂ．新たに調製したイソチオシアン酸スルホフェニルを
濃度約２ｍｇ／ｍｌで水に溶解する。 ｃ．各アルカリホスファターゼ１ｍｌ当り５〜１００μ
ｌのイソチオシアン酸スルホフェニル溶液を添加する。 ｄ．混合溶液を４℃で一晩中温置放置する。 ｅ．５０％グリセロール、１ｍＭ・ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ
・ＺｎＣｌ2 、０．０２％アジ化ナトリウムに対して透
析して、スルホフェニル標識したアルカリホスファター
ゼ精製物を得る。 ｆ．スルホフェニル標識したアルカリホスファターゼ精
製物を抗スルホフェニル抗体と混合する。これにより抗
スルホフェニル抗体−スルホフェニル標識したアルカリ
ホスファターゼを含んでなる複合体が形成される。
製） これは抗スルホフェニル抗体−スルホフェニル標識した
アルカリホスファターゼ複合体を含んでなる複合体を調
製する方法である。その複合体は「組織抗原を局在させ
るための免疫グロブリン−酵素架橋法」ジャーナル・ヒ
ストケミカリー・シトケミカリー (“An Immunoglobuli
n-Enzyme Bridge Method for Localizing Tissue Antig
ens,”J. Histchem. Cytochem.) １７：５６３−５６９
にティー・イー・メイソンら(T.E. Mason et al.) が開
示した方法を修正した次のような操作を用い作ることが
できる： ａ．アルカリホスファターゼを１００ｍＭ炭酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ９．０に対し透析する。アルカリホスファ
ターゼは約２ｍｇ／ｍｌにすることができる。 ｂ．新たに調製したイソチオシアン酸スルホフェニルを
濃度約２ｍｇ／ｍｌで水に溶解する。 ｃ．各アルカリホスファターゼ１ｍｌ当り５〜１００μ
ｌのイソチオシアン酸スルホフェニル溶液を添加する。 ｄ．混合溶液を４℃で一晩中温置放置する。 ｅ．５０％グリセロール、１ｍＭ・ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ
・ＺｎＣｌ2 、０．０２％アジ化ナトリウムに対して透
析して、スルホフェニル標識したアルカリホスファター
ゼ精製物を得る。 ｆ．スルホフェニル標識したアルカリホスファターゼ精
製物を抗スルホフェニル抗体と混合する。これにより抗
スルホフェニル抗体−スルホフェニル標識したアルカリ
ホスファターゼを含んでなる複合体が形成される。
【００６８】この複合体は、既にスルホフェニル標識し
たプローブと反応している捕獲ポリヌクレオチドまたは
捕獲分子の改善された検出に用いることができる。その
複合体の使用はアルカリホスファターゼの多くの分子を
捕獲ポリヌクレオチドまたは捕獲分子の近傍に配置する
ことができるようにするから改善された検出が可能とな
る。この例はそれぞれスルホフェニル標識した各酸プロ
ーブまたはスルホフェニル標識した蛋白質プローブと反
応してしまった捕獲ポリヌクレオチドまたは捕獲分子を
検出するのに用いることができる各種の複合体及び方法
を説明するものである。上記とは違っているがこの技術
分野で公知の酵素類、酵素接合体類、ハプテン類、及び
非ハプテン標識類が使用可能であり、それはこの例の範
囲内にある。
たプローブと反応している捕獲ポリヌクレオチドまたは
捕獲分子の改善された検出に用いることができる。その
複合体の使用はアルカリホスファターゼの多くの分子を
捕獲ポリヌクレオチドまたは捕獲分子の近傍に配置する
ことができるようにするから改善された検出が可能とな
る。この例はそれぞれスルホフェニル標識した各酸プロ
ーブまたはスルホフェニル標識した蛋白質プローブと反
応してしまった捕獲ポリヌクレオチドまたは捕獲分子を
検出するのに用いることができる各種の複合体及び方法
を説明するものである。上記とは違っているがこの技術
分野で公知の酵素類、酵素接合体類、ハプテン類、及び
非ハプテン標識類が使用可能であり、それはこの例の範
囲内にある。
【００６９】前記核酸プローブと蛋白質プローブは下記
を含む多くの利点を有している： １．核酸及び蛋白質はともに帯電ハプテン標識で標識す
ることができる。 ２．帯電ハプテン標識はプローブ上でビオチンヒドラジ
ドやホトビオチン(PHOTOBIOTINTM) などの他の標識と連
結して使用することができる。 ３．核酸は１０分以内で標識することができる。 ４．核酸は標識する前に何等精製する必要がない。 ５．好ましい帯電ハプテンは非特異標識が少なくそのた
め低バックグラウンド信号を示す。 ６．捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子は非放射性免疫
的検出手段により検出することができる。 ７．捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子はまた免疫放射
性検出方法を用いても検出することができる。 ８．非放射性免疫的検出手段は免疫放射性検出方法より
も簡単で早い。 ９．帯電ハプテンは安価で安定である。 １０．帯電ハプテン標識及び非放射性検出方法の使用に
よりピコグラム以下の捕獲ポリヌクレオチドの検出が可
能である。 １１．帯電ハプテン標識は非放射性でありしたがって使
用するのに安全である。 １２．ビオチン標識の時使用されるような複雑で時間の
かかる蛋白質保護段階を必要としない。 １３．非放射性検出手段を使用した場合、試薬類及び反
応生成物類の廃棄は簡単で金がかからない。 本発明をその或る好ましい態様に関してかなり詳細に説
明したが、本発明の技術範囲内で他の態様が可能であ
る。例えば、広範囲の各種帯電ハプテン化合物をハイブ
リッド形成形成プローブ用及び蛋白質プローブ用標識と
して使用することができる。帯電ハプテンは芳香族また
はスルホン化化合物に限定されない。それゆえ、広範囲
の各種抗体の共存も可能である。したがって、別記の特
許請求の範囲の精神及び範囲はここに含まれる好ましい
態様の説明に限定されるものではない。
を含む多くの利点を有している： １．核酸及び蛋白質はともに帯電ハプテン標識で標識す
ることができる。 ２．帯電ハプテン標識はプローブ上でビオチンヒドラジ
ドやホトビオチン(PHOTOBIOTINTM) などの他の標識と連
結して使用することができる。 ３．核酸は１０分以内で標識することができる。 ４．核酸は標識する前に何等精製する必要がない。 ５．好ましい帯電ハプテンは非特異標識が少なくそのた
め低バックグラウンド信号を示す。 ６．捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子は非放射性免疫
的検出手段により検出することができる。 ７．捕獲ポリヌクレオチド及び捕獲分子はまた免疫放射
性検出方法を用いても検出することができる。 ８．非放射性免疫的検出手段は免疫放射性検出方法より
も簡単で早い。 ９．帯電ハプテンは安価で安定である。 １０．帯電ハプテン標識及び非放射性検出方法の使用に
よりピコグラム以下の捕獲ポリヌクレオチドの検出が可
能である。 １１．帯電ハプテン標識は非放射性でありしたがって使
用するのに安全である。 １２．ビオチン標識の時使用されるような複雑で時間の
かかる蛋白質保護段階を必要としない。 １３．非放射性検出手段を使用した場合、試薬類及び反
応生成物類の廃棄は簡単で金がかからない。 本発明をその或る好ましい態様に関してかなり詳細に説
明したが、本発明の技術範囲内で他の態様が可能であ
る。例えば、広範囲の各種帯電ハプテン化合物をハイブ
リッド形成形成プローブ用及び蛋白質プローブ用標識と
して使用することができる。帯電ハプテンは芳香族また
はスルホン化化合物に限定されない。それゆえ、広範囲
の各種抗体の共存も可能である。したがって、別記の特
許請求の範囲の精神及び範囲はここに含まれる好ましい
態様の説明に限定されるものではない。
【００７０】
【発明の効果】本発明のポリクロナール抗体、モノクロ
ナール抗体、抗体は、好ましいハプテン性スルホニル標
識を特異的に結合することができ、抗原の検出に好適に
用いられる。
ナール抗体、抗体は、好ましいハプテン性スルホニル標
識を特異的に結合することができ、抗原の検出に好適に
用いられる。
【図１】シトシン塩基へのスルホフェニルヒドラジンの
亜硫酸塩触媒された付着反応を示すスキームである。
亜硫酸塩触媒された付着反応を示すスキームである。
【図２】３分と３０分との間の時間に対するｐＨ４．５
でのスルホフェニルヒドラジンによるＤＮＡ修飾の亜硫
酸アンモニウム及び重亜硫酸ナトリウムの比較調査の結
果を示す。
でのスルホフェニルヒドラジンによるＤＮＡ修飾の亜硫
酸アンモニウム及び重亜硫酸ナトリウムの比較調査の結
果を示す。
【図３】４０℃と５０℃との間の６つの温度でのスルホ
フェニルヒドラジンによるＤＮＡ修飾の亜硫酸アンモニ
ウム及び重亜硫酸ナトリウムの比較研究の結果を示す。
フェニルヒドラジンによるＤＮＡ修飾の亜硫酸アンモニ
ウム及び重亜硫酸ナトリウムの比較研究の結果を示す。
【図４】８０℃でのスルホフェニルヒドラジンによるＤ
ＮＡの修飾へのｐＨを変えた影響の結果を示す。
ＮＡの修飾へのｐＨを変えた影響の結果を示す。
【図５】ＳＰＨ標識したハイブリッド形成プローブの感
度の結果を示す。
度の結果を示す。
【図６】ＳＰＨ標識したハイブリッド形成標識プローブ
を用いたレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pne
umophila）の検出の結果を示す。
を用いたレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pne
umophila）の検出の結果を示す。
【図７】ハイブリッド形成プローブのハプテン性スルホ
フェニル標識に対する９つの異なるハイブリドーマ細胞
系からのモノクロナール抗体の親和性の比較研究の結果
を示す。
フェニル標識に対する９つの異なるハイブリドーマ細胞
系からのモノクロナール抗体の親和性の比較研究の結果
を示す。
【図８】スルホフェニル標識した核酸プローブを用いた
ヒト頚部生体組織標本中のＨＰＶ・６・ＤＮＡのその場
での検出の結果を示す。
ヒト頚部生体組織標本中のＨＰＶ・６・ＤＮＡのその場
での検出の結果を示す。
【図９】蛋白質のスルホフェニル標識に対するマウスの
モノクロナール抗体の特異的親和性を示すグラフであ
る。
モノクロナール抗体の特異的親和性を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ 33/566 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ 33/577 39/395 Ｊ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 39/395 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】 ハプテンスルホフェニル化合物に対し特
異的な結合親和性を有するポリクロナール抗体。 - 【請求項２】 ハプテンスルホフェニル化合物に対し特
異的な結合親和性を有するモノクロナール抗体。 - 【請求項３】 ハプテンスルホフェニル化合物に対し特
異的な結合親和性を有するモノクロナール抗体を作るこ
とができるハイブリドーマ。 - 【請求項４】 ハイブリドーマがスルホフェニル担持接
合体及び動物の骨髄腫細胞で免疫された動物からのひ臓
細胞のハイブリッドである請求項３記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項５】 動物が両例ともマウスであり、ハイブリ
ドーマがＡＴＣＣ識別ＨＢ１０２８０である請求項４記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 動物が両例ともマウスであり、ハイブリ
ドーマがＡＴＣＣ識別ＨＢ１０２８１である請求項４記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項７】 動物が両例ともマウスであり、ハイブリ
ドーマがＡＴＣＣ識別ＨＢ１０２８２である請求項４記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項８】 動物が両例ともマウスであり、ハイブリ
ドーマがＡＴＣＣ識別ＨＢ１０２８３である請求項４記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】 ハプテンスルホフェニル化合物に対する
抗体をコード化するポリヌクレオチド配列。 - 【請求項１０】 実質的に精製された形のハプテンスル
ホフェニル化合物の抗体。 - 【請求項１１】 抗体がＩｇＧイソタイプを有するもの
である請求項１０記載の抗体。
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