JPS6281564A - 核酸を加溶媒分解ナイロン支持体上に固定化する方法及び該方法により固定化された核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明はＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸を固体支持体上
に固定化する方法に関する。固定化された核酸は相補性
の一重鎖ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成により
、特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定するための
プローブ（ｐｒｏｂｅ）として特に使用される。核酸の
ハイブリッド形成は、中でも人間及び動物薬、農業及び
食品科学の分野における分析方法として有用である。特
に、該方法はバクテリア及びビールスのような病原因子
の検知及び同定を行い、抗生物質耐性について微生物を
選別（スクリーニング）し、また悪性細胞を検出するの
に用いられる。

ハイブリッド形成試験では、通常、試料中に存在する核
酸又はプローブ核酸のどちらか一方を固定化する。かか
る固相技術においては、最終的には、固定相上に形成さ
れた。プローブと相補性の試料ポリヌクレオチド間のハ
イブリッドの検出が行なわれる。これらの方法において
、核酸の固定化のために従来最も一般的に用いられてき
たマトリックスは微細孔性のニトロセルロース膜である
。より近年になって、微細孔性ナイロン膜は、ニトロセ
ルロースよりも良好な機械的強度を有するため、普及す
るようになった。第４級アンモニウムイオンのような陽
イオン性基をナイロン膜に導入してその湿潤性の改良を
行った製造業者もいる。核酸の固定化に用いられる全て
の公知のニトロセルロース膜及びナイロン膜は、それら
の表面上に・ポリヌクレオチドを吸着せしめるために高
濃度の塩（ｔｌｉｇｈ　５ａｌｔ）を必要とし、また吸
着したＤＮＡ又はＲＮＡを永久的に固定するために約８
０℃のベーキングを必要とする。

固体マトリックス上に形成された固定化ハリブリッドの
検出は、通常、該ハイブリッドと特異的に結合する検知
可能な蛋白質試薬を加えることにより行われる。通常、
かかる蛋白質試薬は、プローブ核酸上のりガント部分又
はハイブリッド自体の独特な構造と結合するという点で
特異的な抗体又は他の結合性蛋白質から成る。前者の例
としては、ビオチン基又はハプテン基を有するプローブ
核酸のアビジン又は抗ハブテン抗体との結合による検出
がある。後者の例としてはＤＮＡ−ＲＮＡ若しくはＲＮ
Ａ−ＲＮＡ二重鎖体（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）又は挿入若し
くは抗原的に変性された二重鎖体に対して選択性を有す
る抗体の使用がある。特異的結合性蛋白質試薬は検知可
能な成分、通常は酵素で標識化される。

酵素標識された又は検知可能な蛋白質試薬を用いて、従
来公知の固体マトリックス上の／％イブリッド形成を測
定する際の問題はかかる試薬の非特異的吸着である。こ
の非特異的結合により、全試験操作の感度が制限される
。したがって、効果的かつ安定な固定化を得るために高
濃度の塩やベーキングを必要としないより良好な、核酸
を固定化するための固体マトリックスが必要とされてい
る。さらに、かかる新規なマトリックスは、特にハイブ
リッド形成試験において、また特に得られたハイブリッ
ドを標識蛋白質試薬を用いて検出する場合に必要とされ
る。また、ハイブリッド形成操作には、通常、数段階の
インキュベーション及び洗浄工程が要求されるため、公
知の微細孔性膜は、脆弱で取扱いが困難であるために迅
速処理には向かない、固体状のより剛性の支持体材料に
よってこれらの問題は解決される。

［発明の概要］ 部分的に加溶媒分解されたアミド基を有するナイロンか
ら成る固体支持体又はマトリックス上に効果的かつ安定
に固定化され得ることが今や見出された。加溶媒分解は
、ナイロンのモノマ一単位間のアミド架橋を通常はプロ
トン性溶媒のような溶媒で処理することにより開裂せし
める方法である。その結果、２種の異るフラグメントが
形成され、これらは、それぞれ、末端に修飾若しくは未
修飾のカルボキシル基及びアミノ基を有する。加溶媒分
解方法は、形成される末端官能基が未修飾のカルボキシ
ル基及びアミンである加水分解、又は形成される末端基
がアルキルエステルのようなエステル及びアミンである
アルコリシスを伴うことができる。ナイロン支持体の加
溶媒分解は、無水条件下にトリアルキルオキソニウム塩
のようなアルキル化剤を用いて処理し１次いで水を加え
ることにより行うのが好ましい、核酸と部分的に加溶媒
分解せしめられたナイロン支持体との相互作用の性質の
正確なところは知られていないが、静電気的かつ、恐ら
くはその他の非共有結合的力が主に関係していると考え
られる。

本発明の核酸固定化方法は幾つかの利点によって特徴づ
けられる。核酸の、変性されたナイロン表面への吸着を
達成するために高濃度の塩を存在せしめる必要がない、
さらに、吸着された核酸のベーキングを行って固体支持
体に安定に固定化せしめる必要もない。酵素標識複合体
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のような蛋白質系試薬を用い
て支持体上に形成されたハイブリッドの検出を行う際の
特別な利点は、この変性ナイロン表面がかかる試薬に対
して極めて低い非特異的結合性を示すことによってより
高感度の検出限界が達成されることである。

［好ましい実施態様の説明］ 特定の核酸の固定化形成に必要であるか、又は好ましい
ナイロン支持体中の加溶媒分解の程度は、通常、日常的
な試験によって測定される。加溶媒分解の結果、ナイロ
ンポリマー中のモノマ一単位を架橋しているアミド基が
開裂する。したがって、加溶媒分解は、全体としてのナ
イロン支持体の構造的一体性を破壊したり、大きく弱め
てしまわない程度に制御する０例えば、ナイロン支持体
をビーズの形で用いた場合、通常は、直径４．７６ｍｍ
のビーズ表面上に露出される。利用可能なアミド基の２
０〜５００ナノモルが加溶媒分解されることが予測され
る０表面が平滑であると仮定すると、これにより１平方
ｃｍ当り３０〜７００ナノモルの加溶媒分解性基が得ら
れる。かかる直径が４．７６ｓ＋ｍのビーズ上に露出さ
れたアミド基め約１５０ナノモルの加溶媒分解が、核酸
を固定化するのに特に有用であることが判明している。

実質的にいかなる手段を用いてナイロンアミド基を加溶
媒分解して１本発明の有用な固定用支持体を形成しても
よいものと思われる０通常、加溶媒分解法には、ナイロ
ン支持体の塩酸、硫酸、スルホン酸又はトリクロロ酢酸
のような酸との接触を伴うか又は無水条件下に、適切な
活性剤を用いたアミド基の活性化を行った後に水の添加
を伴う通常の酸加水分解が含まれる。活性化剤はアミド
を０−アルキル化してイミデートを形成する働きをする
。イミデートは、水で処理すると加水分解してアミノカ
ルボアルコキシ置換ナイロンを形成する。加水分解を伴
うアルキル化反応の結果は。

全体的にはアルコリシス、すなわちアルコールの添加に
よる開裂と等しい結果をもたらす、有用なアルキル化剤
には硫酸ジアルキル、アルキルトリフレート、アルキル
ジフェニルスルホニウム塩、過塩素酸アルキル及び特に
、低級アルキル塩のようなトリアルキルオキソニウム塩
、好ましくはトリメチルオキソニウム塩及びトリエチル
オキソニウム塩が挙げられる。塩の対アニオンは、通常
、ヘキサクロロアンチモン酸塩、ヘキサフルオロリン酸
塩及びテトラフルオロ硼酸塩から選ばれるが、最後に挙
げたテトラフルオロ硼酸塩が好ましい。

ナイロン支持体の加溶媒分解に特に有用な一般的方法は
、まず、支持体をトリアルキルオキソニウム塩１例えば
テトラフルオロ硼酸トリメチルオキソニウムの非水溶媒
、例えば塩化メチレン、四塩化炭素又はジエチルエーテ
ル溶液で処理する。

インキュベーションを、好ましくは撹拌しながら約１３
４〜約５時間行うが、約３時間位が最適である。反応温
度は広範に変化させることができ、主に任意に決定され
る。室温における処理が通常用いられる。活性化せしめ
た支持体を非水溶液から除去し、次いで場合により一連
の非水溶媒による洗浄を行い、更に水、好ましくは、塩
濃度的０．１ｍＭ以上及びｐ）ｌ約７〜約１０を有する
。硼酸塩、リン酸塩及び炭酸基のような、低求核性の低
イオン力緩衝液と接触せしめてアミド結合の酸又は塩基
触媒加水分解を防ぐ、加溶媒分解は約３０分〜−晩行な
う、好ましくは、加溶媒分解された支持体を１次に水又
は緩衝液中で１日〜１週間もの長時間にわたって洗浄す
る。最終生成物は水若しくは緩衝剤の存在下又は乾燥状
態で保存することができる。

上記の好ましい可溶媒介解法は、主に末端にエステル基
又はアミ７基をそれぞれ有する開裂したフラグメントを
与えるものと理解され、したがってかかる方法にはアル
コール部分の添加による総体的アルコリシスが伴うもの
と理解される。少量、又はある場合には大量の付加的生
成物は単なる加水分解の結果書られるカルボキシルとア
ミンのフラグメントである。これらの最終生成物は全て
本発明の核酸の固定化方法において有用であると考えら
れる。

ナイロン支持体は、通常、α、ω−アミノカルボン酸モ
ノマーから成るものばかりでなく、ジアミンとジカルボ
ン酸モノマーとの縮合物をはじめとするポリアミドから
成るものとする。活性化操作は、モノマ一単位の長さに
かかわらず、どのようなポリアミドにも適用することが
できる。芳香族、アルキル又はアルケニル骨格はすべて
アミンカルボアルコキシ（ａｍｉｎｏｃａｒｂａｌｋｏ
ｒｙ）−置換ナイロンを与える。同様に、骨格及びアミ
ド基は広範に置換され得るが、もしある種の官能基、例
えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、フェノール基及
びアミンが存在する場合には、これらはアルキル化反応
中に修飾される。これは、最終的に加溶媒分解されたナ
イロンが、実質的に核酸を吸着する働きをする限り許容
される。

支持体の配座及び一般的組成は、その表面上に加溶媒分
解されて及び核酸と相互作用する、露出されたナイロン
アミド基を有する限り、核酸の固定化への適用に際して
は所望により変化させることができる。支持体はビーズ
、細片、マイクロタイターウェル（ｓｉｃｒｏｔｉｔｅ
ｒ　ｗｅｌｔｇ）　、試験管、微細孔性膜等の形態であ
ってよい、ビーズは、その操作性の良さ及び高い表面積
率から特に有利であることが判明している。直径１ｐＭ
〜約１ｃｍの範囲のナイロンビーズが特に用いられる。

均質又は不均質なナイロンで形成された支持体を用いる
ことができ、また非ナイロン芯又は基材上にナイロンを
被覆して用いてもよい。

本発明の加溶媒分解されたナイロン支持体は、一般に、
所望の数の塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの訓導
体又は変性体をはじめとする核酸の固定化に用いること
ができる。ゲノム及びプラスミド核酸並びにそれらの制
限フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドは本発明に
より固定化することができる。

通常、所望の核酸又は核酸の母集団は、支持体を該核酸
の緩衝液又は分散液中でインキュベートすることにより
加溶媒分解ナイロン支持体上に固定化される。緩衝液は
イオン強度が低く１通常、塩濃度的０．５Ｍ以下及びｐ
Ｈ約４〜約１０、好ましくは約７を有するものが好まし
い。有用な緩衝液は、リンｍ塩、炭酸塩、トリス等を含
み、ヌクレアーゼ阻害剤１例えばエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム又はアラリン
トリカルポン酸（ａｕｒｉｎ　ｔｒｉｃａｒｂｏｘ７ｈ
ｉ　ａｃｉｄ）を含有する。インキュベーションを約１
〜４時間行って結合部位を飽和せしめる。より短いイン
キュベーション時間を用いて飽和状態に満たない量の核
酸を吸着せしめてもよい、インキュベーション温度は、
好ましくは、２０〜６０℃テするが１例えば５０℃とい
ったや覧高温を用いるのが好ましい、固定化が完了した
ら、次に支持体をこの目的のため周知のサケ精子ＤＮＡ
のような非特異的な核酸溶液中でインキュベートして、
満たされていない核酸結合部位を飽和せしめるのが好ま
しい。

固定化核酸は、アフィニティーリガンドとして一重鎖又
は二重鎖核酸を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー及び精製方法において使用することができ、特に、生
体液のような試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検
知するハイブリッド形成試験に適用される。一般に、本
発明の核＃１固定化手段は、固相ポリヌクレオチドの使
用又は形成を伴ういかなるハイブリッド形成方法におい
ても用いることができる。

通常のハイブリッド形成試験においては、試料の核酸又
はプローブとしての核酸のどちらかが、相補性を測定す
る目的で他の一方と接触せしめられる場合に固定化され
る。プローブは、対象とされる配列に対して実質的に相
補性の少くともｌの一重鎖の塩基配列を有する。本発明
の固定化方法は、通常、より長いインキュベーション時
間を用いてこの素子を製造又は調製することができ、し
かも、実際の試験に必要な時間が増えることがないので
、該試験を行うための固定化プローブを提供するのによ
り有用である。

試料中の対象となる配列の存在を示す、ハイブリッドの
形成は種々の方法で検知される。当業界公知のように試
料の核酸及び固定化されていないプローブのうちの一方
を放射性同位元素、蛍光体、化学発光体、酵素又は特異
的に結合可能なリガンドのような検知可能なマーカーで
標識することができる。したがって、ナイロン支持体と
結び付くようになる。かかる標識の量はハイブリッド形
成の程度と直接関係する。また、対象とされる配列の第
１の部分が、固定化された第１のプローブとハリブリッ
ドを形成し、対象とされる配列の、相互に排他的な第２
の部分と標識化された又は他の方法により検知可能な第
２のプローブとのハイブリッド形成により検知が行なわ
れる２重ハイブリッド形成方法も公知である。

プローブを標識化する特に際立った方法は、詩学的変性
により、プローブの分子中に、特定の結合性物質のため
の結合部位を、包含せしめることである。ヌクレオチド
配列中に存在する結合部位の例は、プローブがプロモー
ター蛋白質（例えばバクテリオファージプロモーター及
びＲＮＡポリメラーゼ）と結合可能なプロモーター配列
［例えばラクトースプロモーター及びトリプトファンプ
ロモーター（ｔｒｐ−ｐｒａｏ＋ｏｔｅｒ）　］’から
成るか、又はリプレッサー蛋白質（例えばラクトースリ
プレッサー）と結合可能なオペレーター配列（例えばラ
クトースオペレーター）から成るか、あるいはまた特定
の抗体と結合可能な抗原性ヌクレオチド若しくは配列（
例えば５−ブロモ若しくは５−ヨードデオキシウリジン
及びＺ−ＤＮＡ）から成るような部位である（英国特許
明細書第２．１２５，９６４号参照）。プローブの化学
的変性により導入された結合部位は特に有用であり１通
常、特定の結合対の片方をプローブ核酸と結合せしめる
ことが伴う。結合対は、ビオチン／アビジン　ハブテン
あり　ｋ＊百１ｈｆｒ沫　害★ｌし輸／レクチン、酵素
／阻害剤等の有用な結合対から選ばれる。結合対が蛋白
質性要素と非蛋白質性要素とから成る場合、蛋白質性要
素はプローブのハイブリッド形成の変性条件下では不安
定になるため、非蛋白質性要素をプローブと結合せしめ
るのが好ましい。好ましいシステムにはプローブと、ビ
オチン又はハブテンのようなリガンドとを結合させ、こ
れらに対してそれぞれ標識アビジン又は抗ハプテン抗体
を用いることが含まれる。

有用なりガントＩ！：４識プローブの製造は公知である
（例えば欧州特許公告公報筒６３．８７９号及び第９７
，３７３号、ＰＣＴ公報第８３−００２．２８６号参照
。

本発明に特に有用なハイブリッド形成の形式は、固定化
ポリヌクレオチドプローブの使用及び得られたハイブリ
ッドを標識化された若しくはその他の方々によって検知
可能なハイブリッド結合性試薬、通常は該ハイブリッド
に対する選択性を有する抗体のような特異的結合性蛋白
質との結合によって測定することが伴うものである。一
重鎖核酸類及び他の種類の二重鎖体と比較して特定の二
重鎖体に対して選択性を有する抗体には、ＤＮＡ　−Ｒ
ＮＡ、ＲＮＡ・ＲＮＡに対する抗体及び限られた範囲内
のＤＮＡ−ＤＮＡに対する抗体並びに挿入二重鎖体（ｉ
ｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ　ｄｕｐｌｅｘｅｓ）に対する
抗体がある。

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対して特異性を有する抗
体は、単独重合体又はペテロ重合体ポリヌクレオチド二
重鎖体から成る免疫原（抗原）によって刺激される。有
用な単独重合体二重鎖体のうち、特に好ましいものはポ
リ（ｒＡ）・ポリ（ｄＴ）である［キタガワ（Ｋｉｔａ
ｇａｗａ）及びストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ）　、　Ｍ
ｏ１．　Ｌｍｍｕｎｏｌ　、土」。

４１３（１９８２）］。しかしながら、通常、ペテロ重
合体二重鎮体が好んで用いられφ×１７４ピリオン（ｖ
ｉｒｉｏｎ）　Ｄ　Ｎ　ＡのＲＮＡポリメラーゼによる
転写をはじめとする種々の方々によって製造される［ナ
カザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）　　、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
　。

±９，２８３５　（１９８１）］。選ばれたＤＮＡ・Ｒ
ＮＡ二重鎖体はメチル化蛋白質によって吸着されるか又
は他の方法により通常の抗原性担体材料、例えば牛血清
アルブミンと結合せしめて所望の宿主である動物に注射
する〔ストーラ−（Ｓｔｏｌｌｅｒ）　、　Ｍｅｔｈ、
　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　、ヱｊ、７０（１９８０）参照］
。

ＲＮＡφＲＮＡ二重鎖体に対する抗体は中でもレオウィ
ルス又は砂糖きびが感染するフィージー病ウィルスのよ
うなウィルス類からの二重鎖ＲＮＡに対して惹起される
。またホモポリマーの二重鎖体、例えば、中でもポリ（
ｒ　Ｉ）・ポリ（ｒＣ）又はポリ（ｒＡ）　・ポリ（ｒ
Ｕ）が上記のような免疫感作に用いられる。

ＤＮＡ　−ＤＮＡ二重鎖体に対して選択性を有するモノ
クローナル抗体が欧州特許公開筒１３５．１３９号に報
告されている。

挿入二重鎖体に対する抗体は、通常、カチオン性蛋白質
又は蛋白質誘導体（例えばメチル化牛血清アルブミン）
とアニオン性の挿入核酸複合体とのイオン複合体から成
る免疫原に対して惹起され有結合せしめてもよい。

上記の抗ハイブリッド抗体は、通常、上記のような検知
可能な基で標識され１本発明の支持体上に形成されたハ
イブリッドを容易に測定することが可能となる。また、
抗体試薬は、それ自体の抗原性のような本来の性質に基
いて検出される。標識化抗（抗体試薬）又は蛋白質Ａは
、−次抗体試薬と結合してその検知が可能となる。

本発明を下記の実施例により説明するが、これによって
本発明は、何ら制限されるものではない。

［実施例１］ 大腸菌２３ｓ　　リポソームＲＮＡに対して相補性の配
列を有する一重鎖ＤＮＡプローブを加溶媒分解ナイロン
ビーズ上に吸着せしめた。このプローブと大腸菌２３ｓ
　　ＲＮＡとのハイブリッドを形成し、これをＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドに対する抗体で検知した。

ナイロンビーズ　ロ゛ シカゴのプレシジョン・プラスティック・ポール・カン
パ＝−（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１
ｌ　Ｇｏ、）カら入手］５００個を、テトラフルオロ硼
酸トリメチルオキソニウム７５０　ｒａｇを含む無水塩
化メチレン５００ｍ１中で３時間激しく攪拌した。ビー
ズを直ちに塩化メチレン各１００．ｌで３度洗浄し、ｐ
）１９．５のＯ，１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液２００ｍＪ
に加えた。ビーズを上記緩衝液と共に１．７５時間攪拌
し、次いで水を５〜７回（１回分１ｆＬ）交換しながら
６日間水洗した。最後にビーズを風乾した。

スルホン酸トリニトロベンゼン（ＴＮＢＳ）との反応に
よりビーズの第１アミンを調べた。ビーズ１個を、その
表面上のアミンと反応してビーズを黄橙色に着色するＴ
ＮＢＳｌ、１７ミリモルを含むｐＨ９，３の０．１ＭＮ
ａ２Ｂ４０７緩衝液０．８５−と共に室温にて３時間振
とうした０次に３０ｍＭグリシン１５０ト見を加えて過
剰のＴＮＢＳと３０分間反応させた。反応混合物のアリ
コート４０ＩＬ９．を亜硫酸ナトリウム１．５５℃Ｍを
含むｐＨ７、０の０．１Ｍ硫酸ナトリウム緩衝液０．９
６４中に加えて希釈すると、４１４ｎｍにお也する吸収
が記録された。この反応に用いた全ＴＮＢＳを、ビーズ
を用いない以外は上記のように製造した対照を用いて測
定した。

種々の量のグリシン（Ｏ〜０．８ミリモル）を上記Ｎａ
２Ｂ、Ｏ，緩衝液中でＴＮＢｓ　　１．６ミリモルと３
０分間反応させて検量線を作成した。これらの反応混合
物のアリコー）４０ｇＭをリン酸塩／亜硝酸塩０．９６
ｗＪ中に加えて希釈し吸収を記録した。ビーズを用いず
に測定した全ＴＮＢＳとビーズと反応後の過剰のＴＮＢ
　Ｓの量との差がビーズ上の７ミノ基のモル数である。

加溶媒分解したナイロンビーズはビーズ１個当りアミン
１３０ナノモルを含んでいた。

２３ｓ　　ＲＮＡ　　ため　ＤＮＡプローブ２３ｓ　　
ＲＮＡをコードする、大腸菌のｒｒｎＤオペロンからｃ
７）ＥｃｏＲＩ／ＢｇＪＩ　　ＩＩフラグメントをＭ　
１３　ｍ　ｐ　９ベクターにクローニングし、ピリオン
ＤＮＡを製造した［ジンクスーロバートソン（Ｊｉｎｋ
ｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）等、鉦胞坦旦旦、３３，８６
５　（１９８３）］、ＤＮＡ調製物の夾雑物であるＲＮ
Ａは、ＤＮＡを０．３ＭＮａＯＨ中、３７℃で４時間イ
ンキュベートすることにより消失せしめた。３０％酢酸
を加えてアルカリを中和し、冷エタノールを用いた沈澱
によってＤＮＡを回収した。

１笠人立羞°・　　　ナイロンビーズ　への　　し加溶
媒分解せしめたナイロンビーズ１４個を、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１ミリモル及び上記ＤＮＡプロ
ーブ２８ｇ１　（２８ＪＬｇ）を含むｐＨ７，４のリン
酸ナトリウム緩衝液２．０ａＪと合わせた。この混合物
を５０℃で１４時間振とうしてからサケ精子Ｄ　ＮＡ　
（４、２５ｍｇ／ｄ）１４１　ＪＬＱを加え、更に振と
うを５０℃で４時間続けた。（サケ精子ＤＮＡは、ＤＮ
Ａプローブについて上述したように０．３Ｍ　　ＮａＯ
Ｈで１６アミド４０％と下記の成分： サケ精子Ｄ　ＮＡ　　　　　　　０　、２ｔｎｇ／ｍ！
ポリビニルピロリドン　　　Ｌｍｇ／ｍ１７フイコール
（Ｆ　＋　ｃ　ｏ　Ｉ　ｌ　）　　　　１　ｍｇ　／、
、ｔ（ファルマシア） 牛血清アルブミン　　　　　１ｍｇ／ＪＮａＣ１１，８
Ｍ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液　　０．１Ｍ ドデシル硫酸ナトリウム　　ｌａｇ／。

（ＳＤＳ） を含む水溶液６０％から成るハイブリッド形成反応溶液
２．０ｄ中に入れた。ビーズを５５℃で１７時間インキ
ュベートし、ＳＤＳを０．１％含ｔ／ｌＸ５ＳＰＥ　（
ｌＸｓｓＰＥｌｆＮａｃＪＬｏ、１８モル及びＥＤＴＡ
Ｉミリモルを含むＰＨ７，７の１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液である）毎回２ｆａｌで２度洗浄した。

ＤＮＡ　−ＲＮＡに、　るモノクローナル４　の挺造 ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドの１製造 ｒのバイブｏ　−、ｗ＋−＋　　／ｋｙ　ｌ　７　ＡＩ
＋＋ｎ　↓ｚａＤＮＡの大腸菌からのＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼによる転写によって製造される。この操
作法はナカザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）によりＢｉｏｃｈ
ｅｍ　、±９．２８３５　（１９８０）に記載されてい
る。

メチル化チログロブリンの製造 牛チログロブリン［米国、ミズリー州、セントルイスの
シグマ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅａ＋１ｃａｌ　
Ｃａ、）製］１００ｍｇを無水メタノール１０−及び２
．５Ｍ　　ＨＣＪ）のメタノール溶液４００ｐ−１と合
わせた。混合物をロータリーミキサーで室温にて５日間
反応させた。沈澱物を遠心分離により採取してメタノー
ルで２度、更にエタノールで２度洗浄した０次いで該沈
澱物を減圧下で一晩乾燥した。

マウスの免疫感作 ＥＤＴＡ　　１ミリモルを含むＰＩ（７、４の２０ｍＷ
）リス−塩化水素緩衝液２５０ＩＬＪｌ中（７）ＤＮＡ
φＲＮＡハイブリッド１５０ｐｇをメチル化チログロブ
リン１５０＃Ｌｇの水２５０ｇＭ溶液と合わせた。沈澱
物が形成され、これにトリス緩衝液２．５４を加えた。

混合物全体を等量のフロインドアジュバントで乳化した
。各々のＢＡＬＢ／ｃマウスに上記懸濁液０．５−を免
疫注射した。３週間後及びそれ以後は１週間ごとに追加
免疫注射を行った。第１回目の追加免疫注射を行ってか
ら１週間目から開始して以後２週間ごとに血液を採取し
た。

血清中の抗体価を酵素標識免疫吸着試験法によって測定
した。イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）　ＩＩ　［米国、バ
ージニア州、アレクサンドリアのタイナテック社（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｋ）製］マイクロタイターウェルのそれぞれ
に５ｇｇ／−溶液５０ル見を入れることによりＤＮＡ　
＠ＲＮＡを塗布した。このＤＮＡ−ＲＮＡを、ＮａＣＪ
ｌ’　Ｏ，１５モルを含むＰＨ６，８の０　、０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム緩衝液中に加えた。この溶液を室温
で２時間放置してから、ウェルを牛血清アルブミン５ｎ
＋ｇ／−及びトウ４−７　（Ｔｗｅｅｎ）　２０洗浄剤
０．５％（Ｖ／Ｖ）を含むＰＨ７，４の０．０２Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。適当に希釈した抗血清
をウェルに加えて固定化ＤＮＡ−ＲＮＡと該抗体とを結
合せしめた０次に結合した抗体を周知の操作により、酵
素標識抗マウスＩｇＧを用いて検出した。ＤＮＡ・ＲＮ
Ａに対して高い血清力価を有するが、一重鎖ＤＮＡに対
しては低い力価を有するマウスの牌臓細胞とミエローマ
細胞とを融合してハイブリドーマを製造した［スチュア
ート　（Ｓｔｕａｒｔ）等量Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

陽、７８．３７５１　（１９８１）；ガルフレ（Ｇａｌ
ｆｒｅ）及びミルスタイン（Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）の１
已」工ｉｎ　　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　、７３　、１　（１
９８１）　］　ａ例えば、この細胞系は、米国、マリー
ランド州、ロックビルのアメリカン拳タイプｅカルチャ
ー・コレクシ、　７　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＨ
Ｂ　　８７３０として寄託されている。

クローニングしたハイブリドーマはマウスの腹腔内で増
殖せしめ更なる用途のための適当量の抗クロマトグラフ
ィーにより腹水から単離した。

２３ｓ　　ＲＮＡ　　ハイブリ・ド１ 種々の量の大腸菌　２３ｓ　　ＲＮＡを含むハイブリッ
ド形成反応溶液１５０　ＩＬｌ中で一連のハイブリッド
形成反応を行った。固定化ＤＮＡプローブを有するビー
ズ１個を各反応に用い、上記混合物を５５℃で２１時間
インキュベートした。次にビーズをＳＯＳ　　０．１％
を含むｌＸ５ＳＰＥ０．５ｍｌ中ですすぎ、この溶液０
．５ｄ中、５５℃で３′０分インキュベートした。ビー
ズをもう一度すすぎ、形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドの量をイムノアッセイにより測定した。

上記ビーズをそれぞれ、ＮａＣｆＬ　　Ｏ，１５モル、
牛血清アルブミン０．５％（Ｗ／Ｖ）、トウ４−７２０
　０．５％（ｖ／ｖ）及びＥＤＴＡ１ミリモルを含むＰ
Ｈ７、４’の０．０２Ｍ　　リン酸ナトリウム（ＰＢＳ
／ＢＳＡ／）ウィーン／ＥＤＴＡ）５０ｇ文中、室温で
３０分振とうした。次にＰＢＳ／ＢＳＡ／トウィーン／
ＥＤＴＡ出＋Ｌ＃ｎ１ＪＡ、Ｄ％ｒａ　／ｌ　、、ｔｖ
／−ｚ）Ｉｌ’ＬＡ、＋１１を加え、更に振どうを３０
分継続した。上記ビーズを、トウイー７０．５％（ｖ／
ｖ）、ＢＳＡＯ，５％（Ｗ／Ｖ）及びＭｇＣＪ１２１．
０ミリモルを含むｐｉ（７，４の５０＋ｗＮリン酸ナト
リウム緩衝液（リン酸塩／トウィーン／　Ｂ　Ｓ　Ａ　
／　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２　）で２度（毎回０　、５−）す
すいだ。

ビーズをそれぞれ、リン酸塩／トウィーン／Ｂ　Ｓ　Ａ
／Ｍｇ　０文２中で５００倍に希釈したβ−ガラクトシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ［米国、イリノイ州、シカゴ
のアマジャム社（Ａｍｅｒｓｈａ厘）製］１５０　ｇｌ
と共に１時間振とうした。上記ビーズを、ＮａＣ１Ｏ，
５モルを含むリン酸塩／トウィーン／ＢＳＡ／ＭｇＣ立
２０．５−中で５分間づつ２度洗浄した。

各ビーズを、ＭｇＣｌ２５ミリモル含むｐＨ７，４の５
０ｍＭリン酸ナトリウム中の０．８ｄ７−β−ガラクト
シル−３−［３−ジメチルアミノブロビル力ルポキシア
ミド］クマリン［ウオーナ（Ｗｏｒａｈ）等のクリニカ
ル・ケミストリー（ＣＩ　ｉｎ。

Ｃｈｅｗ、）、２７，６７３　（１９８１）］　２５０
＃Ｌ１中、２５℃で３０分インキュベートすることによ
り、結合β−ガラクトシダーゼ標識を測定した。

次いでリン酸塩緩衝液１．５４を加え、励起に４０５ｎ
ＩＩ＋及び発光に４５０ｎｍを用いて蛍光を記録した。

３０　　　　　　　　　　１！４０ 酵素活性は、ハイブリッド形成反応溶液中の２３ｓ　　
ＲＮＡの増加に伴って上昇し、これは加水分解ナイロン
ビーズに固定化された試料ＲＮＡとプローブＤＮＡとの
ハイブリッドの存在を示すものである。

２３ｓ　　ＲＮＡを用いずにハイブリッド形成反応混合
物に加えたビーズは、β−ガラクトシダーゼ標識抗マウ
スＩ［Ｇ　　Ｏ，１５％と非特異的に結合した。

ニトロセルロース微細孔性膜及びβ−ガラクトシダーゼ
標識化結合性蛋白質を用いた同様の実験では０．３〜２
．０％の非特異的結合が得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸を、アミド基が部分的に加溶媒分解されたナイ
   ロンから成る固体支持体と接触せしめる工程からなるこ
   とを特徴とする核酸固定化方法。 ２、ナイロンを無水条件下にアルキル化剤によって処理
   した後に水と接触せしめる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３、活性化剤がトリアルキルオキソニウム塩である特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４、固定化すべき核酸が所定の塩基配列を有し、該核酸
   をナイロン支持体と結合せしめた後に、該支持体に非特
   異的核酸を接触せしめて該支持体上の、残余の核酸結合
   部位を飽和せしめる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ６、核酸がＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ７、核酸がＲＮＡである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ８、アミド基が部分的に加溶媒分解されたナイロンから
   成る固体支持体と結合した核酸から成ることを特徴とす
   る固定化核酸。 ９、核酸が、非共有結合により固体支持体と結合せしめ
   られた特許請求の範囲第８項記載の固定化核酸。 １０、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲
   第８項記載の固定化核酸。 １１、核酸がＤＮＡである特許請求の範囲第８項記載の
   固定化核酸。 １２、核酸がＲＮＡである特許請求の範囲第８項記載の
   固定化核酸。 １３、（ａ）試料を、測定すべき配列に対して実質的に
   相補性の、少くとも１の一重鎖塩基配列を有する固定化
   ポリヌクレオチドプローブと接触せしめる工程；及び （ｂ）得られたハイブリッドを、ハイブリッドと結合す
   る標識化結合性試薬と接触せしめることにより測定する
   工程から成り、固定化プローブを、アミド基が部分的に
   加溶媒分解されたナイロンから成る固体支持体と結合せ
   しめてあることを特徴とする、試料中の特定のポリヌク
   レオチド配列を測定する方法。 １４、プローブが非共有結合により固体支持体と結合さ
   れている特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、固体支持体がビーズの形状である特許請求の範囲
   第１３項記載の方法。 １６、プローブがＤＮＡから成る特許請求の範囲第１３
   項記載の方法。 １７、プローブがＲＮＡから成る特許請求の範囲第１３
   項記載の方法。 １８、得られたハイブリッドがポリヌクレオチドプロー
   ブとは抗原的に異り、標識試薬が、一重鎖核酸に対する
   よりもハイブリッド二重鎖体に対して選択性を有する抗
   体試薬から成る特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １９、抗体試薬が抗ＤＮＡ・ＲＮＡ性又は抗ＲＮＡ・Ｒ
   ＮＡ性である特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、プローブが、標識化結合性試薬と選択的に結合せ
   しめられている、特定の結合性リガンドで標識されてい
   る特許請求の範囲第１３項記載の方法。 ２１、リガンドがビオチン又はハプテンであり、結合試
   薬がそれぞれアビジン又は抗ハプテン抗体である特許請
   求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、結合試薬が酵素で標識されている特許請求の範囲
   第１３項記載の方法、