DE69128127T2

DE69128127T2 - NUKLEINSÄUREPROBEN mit über Hydrazin-Bindungen verbundenen negativ geladenen Haptenen

Info

Publication number: DE69128127T2
Application number: DE69128127T
Authority: DE
Inventors: Craig Adams
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1990-06-20
Filing date: 1991-06-05
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2011-06-06
Also published as: JPH05500001U; ES2110445T3; EP0487718A1; JPH0884600A; WO1991019729A1; CA2059559A1; JP2686729B2; ATE160017T1; DK0487718T3; DE69128127D1; JPH1023890A; US5552541A; EP0487718B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleinsäureproben.
Das Journal of Immunology veröffentliche im August 1981 (Vol. 127, Nr. 2; Seiten 523-528; Levy, R.B., Shearer, G.M., Richardson, J.C. und Henkart, P.A.) ein Dokument mit dem Titel "Cellmediated lympholytic responses against autologous cells modified withhaptenic sulfhydryl reagents". In diesem Dokument wird die Herstellung von Anti-Hapten-Antikörpern beschrieben, wobei das Hapten primär mit einer Zellenoberfläche-Protein-Sulfhydryl (-SH)-Gruppe verbunden ist, anstelle der typischeren Bindung an eine freie Amino-Gruppe. Das Hapten-System kann Trinitrobenzensulfonat einschließen. Die Verwendung von Sulfhydryl- Gruppen als Ziel ergibt eine spezifischere Probe, die ein genaueres Studium der Immunantwort ermöglicht.
In der EP-A-0 251 527 sind haptenylierte Reagenzien und Immun- Assays beschrieben. Diese Reagenzien sind wasserlösliche Avidin-Derivate, die ein kovalent gebundenes aromatisches Hapten aufweisen, das mit einer quartären Ammonium-Gruppe oder einer Arsenat-Gruppe oder einer Nitro-Gruppe oder einer Stickstoff- Ring-Gruppe substituiert ist. Materialsätze, die diese Verbindungen und Antikörper enthalten, die sich auf bestimmte Weise mit dem Hapten verbinden, sind dort auch beschrieben.
Die US-A-4 490 473 betrifft ein Sandwich- bzw. Mehrschicht- Immun-Assay zur Antikörper-Erfassung, wobei substituierte quartäre Ammonium-Phenyl-/Antikörper-Reagenzien verwendet werden, die mit einem Antikörper konjugiert sind, der zur Erfassung markiert ist und gegen ein Antigen gezüchtet wurde, das aus einem substituierten quartären Ammonium-Phenyl-Reagenz besteht, das durch eine Amino-Verbindung mit einem Antikörper Nukleinsäureproben, die auch als Hybridisierungsproben bezeichnet werden, ermöglichen die Erfassung von bestimmten Polynukleidsequenzen.
Nukleinsäureproben können zur Erfassung bestimmter Polynukleotid-Sequenzen verwendet werden und die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von genetischen Störungen und Erkrankungen unterstützen, wie zum Beispiel zystische Fibrose, muskuläre Dystrophie, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Hepätitis, Herpes Simplex, Epstein-Barr und verschiedenen viralen Infektionen, wie zum Beispiel die, die durch das Zytomegalievirus und Adenovirus verursacht werden.
Nukleinsäureproben können auch Gene enthüllen, die Antigene kodieren, die für die Transplantat-Abstoßung verantwortlich sind. Es können genetische Informationen erhalten werden, die zur Krebs-Oncogenie-Untersuchung und bei der Gerichtsmedizin verwendet werden können.
Die Hybridisierungs-Probe kann erzeugt werden, indem ein Polynukleotid mit einer erfaßbaren Markierung in einer Modifikations- oder Anbindungsreaktion markiert wird. Typischerweise wird die Markierung mit einem Bindungsanteil verbunden, bevor sie an dem Polynukleotid befestigt wird. Der Bindungsanteil weist eine reaktive Gruppe auf, die dazu dient, die Markierung an dem Polynukleotid oder dem Protein zu befestigen. Die mit dem Bindungsanteil verbundene Markierung wird als Markierungsverbindung bezeichnet.
Die Hybridisierungsprobe kann mit einem anderen Polynukleotid, das als Eingangs-Polynukleotid bezeichnet wird, in Verbindung gebracht und inkubiert werden, um festzustellen, ob die beiden Polynukleotide miteinander hybridisieren. Wenn die Hybridisierungsprobe derart ausgewählt wurde, daß sie ein Polynukleotid einschließt, das als das Proben-Polynukleotid bezeichnet wird, und wenigstens eine Sequenz oder einen Bereich aufweist, der im wesentlichen komplementär zu einer Sequenz oder zu einem Bereich des Einfang-Polynukleotids ist, so tritt die Hybridisierung der beiden Polynukleotide ein.
Radioaktive Isotope von Atomen, wie zum Beispielwasserstoff (³H), Phosphor (³²P), oder Jod (¹²&sup5;I) sind gewöhnlich verwendete Markierungen. Assays, die radioaktive Markierungen verwenden, erfordern umfangreiche Sicherheitsvorkehrungen, teure Geräte und spezielle Abfallentsorgungsverfahren, bei denen häufig Kombinationen aus Bundes-, Landes- und Kommunal- Vorschriften beachtet werden müssen. Die Instabilität von radioaktiven Markierungen ergibt weiterhin hohe Verwendungskosten. Zusätzlich ist, auch mit langen Belichtungszeiten, nur eine eingeschränkte Auflösung beider ³H- und ¹²&sup5;I-Autoradiographie verfügbar. Weiterhin ist das ³²-P-Isotop ein gefährliches Isotop. Somit sind nicht-radioaktive Markierungen für Nuklein-Säure und Protein-Proben wünschenswert.
Bei typischen nicht-radioaktiven, indirekten Markierungsmethoden wird ein Hapten an einem Proben-Polynukleotid befestigt, um als indirekte Markierung zu dienen. Alternativ kann das Hapten als indirekte Markierung dienen, indem es an einem Protein befestigt wird. Nach der Hybridisierung kann das hapten-markierte Proben-Polynukleotid mit einem Anti-Hapten-Antikörper in Verbindung gebracht werden, oder mit einem ähnlichen bestimmten Bindungspartner für das Hapten. Der Anti-Hapten-Antikörper kann mit einem erfaßbaren Anteil markiert werden, wie zum Beispiel einem Enzym, einer Chemilumineszenz-Verbindung oder einer Fluoreszenz-Verbindung. Alternativ kann ein zweiter Antikörper zu dem Anti-Hapten-Äntikörper den erfaßbaren Anteil aufweisen.
Eine Schwierigkeit beim Auffinden von nicht-radioaktiven Markierungen, die zur Verwendung in indirekten Markierungsschemas geeignet sind, besteht darin, daß es erforderlich ist, daß derartige Markierungen haptenisch sind, d.h. dazu in der Lage sind, eine Immun-Antwort hervorzurufen, wenn sie an einen Träger gebunden werden. Die Hapten-Markierung muß auch dazu in der Lage sein, sich an ihren entsprechenden Antikörper zu binden. Die Hapten-Markierung muß auch klein genug sein, um die Hybridisierungs-Reaktion nicht zu beeinflussen, sie muß jedoch groß genug sein, um von dem Anti-Hapten-Antikörper "gesehen" zu werden.
Biotin und seine Derivate wurden als nicht-radioaktive Probenmarkierungen verwendet. Die hybridisierte biotilisierte Probe wird typischerweise erfaßt, indem die Biotin-Markierung mit Avidin oder einem Anti-Biotin-Antikörper in Verbindung gebracht wird. Die Biotin-Markierung ist gewöhnlich an eine reaktiven Gruppe konjugiert ist, wie zum Beispiel einem Hydrazid, das dazu in der Lage ist, sich an ein Nukleotid zu binden oder dieses zu modifizieren. Die bekannten Biotin-Markierungen schließen PHOTOBIOTIN (N-[4-Azido-2-Nitrophenyl]-N'- [N-d-Biotinyl-3-Aminopropyl]-N'-Methyl-3-Propandiamin)-, Biotin-Succinimid-Ester (Biotin-NHS)- und Biotin-Hydrazid ein.
PHOTOBIOTIN kann ein Proben-Polynukleotid in ungefähr 15 Minuten modifizieren, ist jedoch sehr teuer. PHOTOBIOTIN weist den zusätzlichen Nachteil auf, unstabil und extrem lichtempfindlich zu sein, wodurch die Modifikationsreakti-on schwierig zu steuern ist. Biotin-Hydrazid und Biotin-Succinimid-Ester sind nicht so teuer wie PHOTOBIOTIN , erfordern jedoch beide eine sehr viel längere Modifikations-Reaktionszeit. Die Modifikation mit Biotin-Succinimid-Ester ist eine Zweischritt-Prozedur, während das Biotin-Hydrazid vierundzwanzig Stunden bis zu ungefähr zweieinhalb Tage benötigt, um die Modifikations-Reaktion abzuschließen.
Zusätzlich zur Berücksichtigung der Kosten, Stabilität und Modifikations-Reaktions-Zeit, tritt bei Biotin-Markierungen ein "Klebrigkeits"- oder Aggregationsproblem auf. Die Klebrigkeit betrifft die Situation, in der die biotinisierten Antikörper und/oder Nukleinsäure-Proben aufgrund der Änderung der Oberflächeneigenschaften von normal geladenen, an neutrales (ungeladenes) Biotin konjugierte Polynukleotide aggregieren. Das Aggregationsproblem tritt bei allen Biotinmarkierungen auf, unabhängig von der Markierungs-Konjugierung, die bei der Herstellung der markierten Probe verwendet wurde. Die Aggregation ergibt eine verringerte Löslichkeit und eine niedrigere Reaktivität während der Modifikations-Reaktion.
Es wurde nach anderen nicht-radioaktiven Markierungen als Biotin zum Einbringen in die Proben gesucht, um diese Probleme zu beseitigen. Die nicht-radioaktive Markierung kann auch als eine alternative Nukleinsäure- und Protein-Proben-Markierung geeignet sein. Wenn andere als Biotin-Markierungen im Zusammenhang mit biotinisierten Proben verwendet werden, können Sandwich-Assäys in einem einzigen Schritt erzielt werden.
Zwei nicht-radioaktive, nicht-biotin-haptenische Markierungen wurden vor kurzem mit einigem Erfolg entdeckt. Eines ist N- Acetoxy-N-2-Acetylaminofluoren (AAF) und seine 7-Iodo-Derivate (AAIF). AAF und AAIF modifizieren Guanin-Rückstände. Eine andere ist Methoxyamin (das auch als o-Methyl-Hydroxylamin, Methoxylamin, α-Methylhydroxylamin und Hydroxylaminmethyläther) bezeichnet wird). Kommerzielle Materialsätze, die Methoxyamin-markierte Proben verwenden, können von der Sigma Chemical Company, St. Loüis, Missouri (SULFOPROBE ), der FMC Bioproducts, Rockland, Maryland (CHEMIPROBE ) und der Orgenics, Ltd., Israel (CHEMIPROBE ) bezogen werden.
Keine dieser beiden.Markierungen beseitigt die mit Biotin- Markierungen verbundenen Probleme vollständig. AAF ist unstabil. Methoxyamin ist stabiler, aber es ist nicht sehr löslich, was eine niedrigere Reaktivität während des Markierungsprozesses und eine weniger wirksame Linderung des "Klebrigkeits"-Problems ergibt, das typischerweise bei Biotin-Markierungen auftritt. Sowohl AAF als auch Methoxyamin sind karzinogen und müssen deshalb mit besonderer Vorsicht verwendet werden.
Demnach wird eine Markierung für Nukleinsäureproben benötigt, die: (1) haptenisch; (2) stabil; (3) reaktiv-(zur einfachen Markierung); (4) löslich (sowohl zur einfachen Markierung als auch zur Linderung des "Klebrigkeits"-Problems); (5) nicht- karzinogen; (6) nicht-radioaktiv; und (7) nicht teuer ist.

Zusammenfassung

Eine Markierung nach der vorliegenden Erfindung erfüllt diese Anforderungen. Die Markierung kann an ein Polynukleotid gebunden werden, um eine Hybridisierungsprobe zu erzeugen. Die Hybridisierungsprobe ist zur Hybridisierung mit einem Einfang Polynukleotid geeignet.

Definitionen

Die folgenden Definitionen dienen dazu, die vorliegende Erfindung leichter zu verstehen. Bis zu dem Ausmaß, in dem sich die Definitionen von den fachlichen Bedeutungen unterscheiden, müssen die nachfolgenden Definitionen überprüft werden.
Der Ausdruck "Probe" bedeutet eine Hybridisierungsprobe.
"Hybridisierungsprobe" bedeutet ein an eine geladene Hapten- Markierung gebundenes Polynukleotid. Die geladene Hapten- Markierung wird durch einen Bindungsanteil an dem Polynukleotid befestigt. Eine mit einem Bindungsanteil verbundene Markierung bildet eine "Markierungs"-Verbindung.
Der Ausdruck "Polynukleotid" wird austauschbar mit dem Ausdruck "Nukleinsäure" verwendet und schließt alle oligonukleotide ein.
-Däs "Proben-Polynukleötid" ist das Polynukleotid von der "Hybridisierungsprobe" und bezieht sich auf einen einsträngigen Polynukleotid-Anteil oder -Strang. Die Struktur von einem Proben-Polynukleotid kann bekannt oder unbekannt sein. Das Proben-Polynuklectid kann entweder einsträngiges DNA oder RNA sein.
Der Ausdruck "Einfang"-Polynukleotid bedeutet ein Polynukleotid, mit dem das P-roben-Polynukleotid hybridisieren kann.
Der Ausdruck "Ziel"-Polynukleotid bedeutet ein Polynukleotid von oder in einer Test-Probe. Ein Ziel-Polynukleotid ist ein "unbekanntes" Polynukleotid.
Der Ausdruck "Referenz"-Polynukleotid bedeutet ein "bekanntes" Polynukleotid. Ein bekanntes Polynukleotid bedeutet ein Polynukleotid von einem bekannten Organismus oder ein Polynukleotid dessen Struktur zumindest teilweise charakterisiert wurde.
Das Ziel-Polynukleotid oder das Referenz-Polynukleotid kann als das Proben-Polynukleotid verwendet werden, indem es an die geladene Hapten-Markierung gebunden wird.

Hybridisierungs-Proben

Eine Hybridisierungsprobe, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, weist wenigstens drei Teile auf. Die drei Teile sind: ein Proben-Polynukleotid, eine geladene Hapten-Markierung und ein Bindungsanteil.
Das Proben-Polynukleotid weist wenigstens eine Sequenz oder einen Bereich auf, der im wesentlichen komplementär zu wenigstens einer Sequenz oder einem Bereich von einem Einfang-Polynukleotid ist. Das Probenpolynukleotid und das Einfangpolynukleotid sind deshalb dazu geeignet sich gegenseitig zu hybridisieren. Das Probenpolynukleotid kann entweder DNA oder RNA sein und weist vorzugsweise zumindest eine Cytosinbase auf. Die Cytosinbase kanndurch die bevorzugten Bindungsanteile nach der Erfindung in einer Anbindungs- oder Modifikationsreaktion transaminiert werden.
Die geladene Hapten-Markierung ist dazu geeignet, durch eine immunologische Reaktion zwischen der Markierung und einem bezüglich der geladenen Hapten-Markierung spezifischen Antikörper erfaßt zu werden. Die geladene Hapten-Markierung trägt eine negative Netto-Ladung aufgrund der Vorteile, wie zum Beispiel einer verbesserten Löslichkeit, die eine negative Netto-Ladung mit sich bringt. Weiterhin kann die Erfassung von positiv geladenen Hapten-Markierungen schwierig sein, wie dies leicht vom Fachmann nachvollzogen werden kann.
Der Bindungsanteil dient dazu, die geladene Hapten-Markie rung an das Probenpolynukleotid oder an das Probenprotein zu binden.
Ein Bindungsanteil, der eine nukleophile Gruppe enthält, kann mit modifikations-resistenten Polynukleotiden reaktive sein. Der Bindungsanteil kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Hydroxylaminen, Hydrazinen, Hydraziden, Hydrazonen, Oximen, Carbaziden, Carbazonen, primären Ammen, sekundären Aminen, tertiären Aminen, Amiden und deren Derivaten besteht. Der bevorzugte Bindungsanteil ist ein Hydrazin. Hydrazine sind mit Cytosinbasen reaktiv und ein hydrazin-enthaltender Bindungsanteil kann zur Modifikation der cytosinbase eines Polynukleotids verwendet werden.
Die Hybridisierungsprobe kann auch einen "Abstands"-Bestandteil aufweisen. Der Abstands-Bestandteil ist zwischen dem Bindungsanteil und der geladenen Hapten-Markierung angeordnet und dient dazu, die geladene Haptenmarkierung räumlich von dem Probenpolynukleotid zu trennen. Die Trennung kann dazu beitragen, die sterische Störung durch das Probenpolynukleotid während einer immunologischen Reaktion zwischen der geladenen Hapten-Markierung und einem für die Markierung spezifischen Antikörper zu verringern.
Der Abstands-Bestandteil weist eine ausreichende Größe auf, um die erwünschte Trennung der geladenen Hapten-Markierung von dem Probenpolynukleotid zu bewirken.
Eine bevorzugte Hybridisierungsprobe ist eine 4-Phenylhydrazinsulfonatanionen-Verbindung, die durch ihr Hydrazinende kovalent an die 4-Position von einer Cytosinbase einer einsträngigen Nukleinsäure gebunden ist. Diese Nukleinsäureprobe kann unter schonenden Bedingungen hergestellt werden und ihre Verwendung ermöglicht die Erfassung von Picogram- Mengen des Einfang-Polynukleotids.
Die Hybridisierungsprobe kann eine oder mehrere zusätzliche Markierungen aufweisen, wie beispielsweise eine Biotinmarkierung. Eine zusätzliche Markierung kann eine zusätzliche erfaßbare Stelle ergeben und somit dazu beitragen, Rauschen oder Störsignale zu verringern.
Ein anderer Grundgedanke der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Hybridisierungsprobe. Das Verfahren umf aßt die Auswahl des Probenpolynukleotids, die Auswahl der geladenen Haptenmarkierung, die an den Bindungsanteil gebunden ist, die Anbindung des Bindungsanteils an das Probenpolynukleotid in einer Anbindungsreaktion, um somit die Hybridisierungsprobe zu ergeben, und das Anhalten der Anbindungsreaktion mit einer Änhalteverbindung.
Ein Verfahren zur Erfassung des Einfang-Polynukleotids umfaßt das Mischen der Hybridisierungsprobe und des Einfang-Polynukleotids, die Inkubation der Mischung, um den Ablauf der Hybridisierungsreaktion zwischen dem Einfang-Polynukleotid und der Hybridisierungsprobe zu ermöglichen, die Trennung der hybridisierten von der nicht-hybridisierten Probe, und die Erfassung der hybridisierten oder der nicht-hybridisierten Probe. Die Erfassungs-Einrichtungen können immunologische Erfassungseinrichtungen sein, die einen Antikörper verwenden, der bezüglich der geladenen Hapten-Markierung der Hybridisierungsprobe spezifisch ist.

Materialsätze

Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfaßt auch verschiedene Bausätze. Ein Materialsatz zur Herstellung der Hybridisierungsprobe und zur Erfassung der geladenen Haptenmarkierung schließt die geladene Haptenmarkierung, den Bindungsanteil, Einrichtungen zur Katalysierung der Anbindungsreaktion des Bindungsanteils an das Probenpolynukleotid, und den für die geladene Haptenmarkierung spezifischen Antikörper ein.
Die vorliegenden Erfindung befriedigt das bisherige Bedürfnis nach einer Nukleinsäuremarkierung, die, wenn sie an den Bindungsanteil gebunden ist, löslich, stabil, reaktiv, haptenisch, nicht-radioaktiv und nicht teuer ist. Diese Eigenschaften ergeben eine Markierungs-Bindungsanteil-Konjugierung (Markierungsverbindung), die sich unter schonenden Bedingungen schnell an ein einsträngiges Polynukleotid bindet und die die Erfassung von kleinen Mengen des Einfang-Polynukleotids ermöglicht.

Zeichnungen

Diese und andere Merkmale, Grundgedanken und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die nachfolgende Beschreibung, die zugehörigen Ansprüche und die beiliegenden Zeichnüngen leichter verständlich, in denen:
Fig. 1 eine sulfit-katalysierte Anbindungsreaktion von Sulfophenylhydrazin an eine Cytosinbase zeigt.
Fig. 2 die Ergebnisse von Vergleichsstudien der Ammoniumsulfit- und Natriumbisulfit-Katalyse der DNA-Modifizierung durch Sulfophenylhydrazin bei einem pH-Wert von 4,5 für Zeiten zwischen 3 Minuten und 30 Minuten darstellt.
Fig. 3 die Ergebnisse von Vergleichsstudien der Ammoniumsulfit- und Natriumbisulfit-Katalyse der DNA-Modifizierung durch Sulfophenylhydrazin bei sechs Temperaturen zwischen 40ºC und 90ºC darstellt.
Fig. 4 die Ergebnisse der Auswirkung der pH-Wert-Änderung auf die Modizifizierung von DNA durch Sulfophenylhydrazin bei 80ºC darstellt.
Fig. 5 die Ergebnisse der Empfindlichkeit einer SPHmarkierten Hybridisierungsprobe darstellt.
Fig. 6 die Ergebnisse der Erfassung von Legionellapneumophila bei Verwendung einer SPH-markierten Hybridisierungsprobe darstellt.
Fig. 7 die Ergebnisse von Vergleichsstudien der Affinitäten von den monoklonalen Antikörpern von neun verschiedenen -Hybridomzellenlinien für eine haptenische Sulfophenyl-Markierung einer Hybridisierungsprobe darstellt.
Fig. 8 die Ergebnisse der in-situ Erfassung von HPV 6 DNA in einer menschlichen Zervikalgewebe-Biopsie-Probe bei Verwendung einer sulfophenyl-markierten Nukleinsäureprobe darstellt.

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß bestimmte Verbindungen als hervorragende nicht-radioaktive haptenische Markierungen zur Markierung von Polynukleotiden dienen können. Die markierten Polynukleotide können als Nukleinsäureproben verwendet werden. Nukleinsäureproben oder Hybridisierungsproben, wie diese auch genannt werden, können zur Erfassung bestimmter Polynukleotid-Sequenzen verwendet werden. Es können bestimmte Polynukleotid-Sequenzen in einer Vielzahl von Versuchsproben erfaßt werden. Versuchsproben schließen zum Beispiel Gewebeproben, Serum, Plasma, Urin, Speichel, zerebrospinale, amniotische und verschiedene andere physiologische Flüssigkeiten ein.

Hybridisierungs-Proben

Eine Hybridisierungsprobe weist nach der vorliegenden Erfindung ein Probenpolynukleotid, eine geladene Hapten-Markierung und einen Bindungsanteil auf. Das Probenpolynukleotid weist wenigstens eine Nukleotid-Sequenz auf, die im wesentlichen komplementär zü wenigstens einer Polynukleotid-Sequenz von einem Einfang-Polynukleotid ist, wodurch ermöglicht wird, daß die beiden Polynukleotide miteinander hybridisieren. Die geladene Hapten- Markierung ist dazu geeignet, durch eine immunologische Reaktion zwischen der Markierung und einem für die Markierung spezifischen Antikörper erfaßt zu werden. Der Bindungsanteil dient dazu, die geladene Haptenmarkierung an das Probenpolynukleotid zu binden.
Das Probenpolynukleotid kann DNA oder RNA sein und ist vorzugsweise eine einstrangige Nukleinsäure. Die Anbindungsreaktion, durch die die Markierung an das Probenpolynukleotid gebunden wird, ist bei einer zweistrangigen Nukleinsäure schwieriger.
Bevorzugte Markierungen sind bei neutralem pH-Wert geladen, löslich in einer wäßrigen Lösung, und haptenisch. Eine Ladung unterstützt die Wasserlöslichkeit, die erwünscht ist, um dazu beizutragen, eine schnelle Modifikationsreaktion zu erhalten. Die bevorzugten Haptenmarkierungen sind negativ geladen. Es hat sich gezeigt; daß eine negative Ladung dazu beiträgt, das "Klebrigkeits"- oder Aggregations-Problem zu verringern, das bei neutralen oder positiv geladenen Markierungen auftritt. Eine bevorzugte Markierung ist eine haptenische, anionische Sulfophenyl-Verbindung, die im Handel erhältlich und im wesentlichen stabil bei Raumtemperatur ist.
Der Bindungsanteil dient dazu, die Markierung an das Probenpolynukleotid zu binden Vorzugsweise weist der Bindungsanteil einen nukleophilen Bindungsanteil auf, weil einige nukleophile Bindungsanteile Nukleinsauren in einer Anbindungsreaktion modifizieren können. Eine Vielzahl von stickstoffhaltigen, nukleophilen Verbindungen, die zur Verwendung als Bindungsanteile geeignet sind, sind problemlos erhältlich.
Ein Bindungsanteil kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxylaminen, Hydrazinen, Hydraziden, Hydrazonen, Oximen, Carbaziden, Carbazonen, primären Ammen, sekundären Aminen, tertiären Aminen, Amiden und Derivaten davon besteht. Diese Verbindungen unterscheiden sich in der Stärke ihrer "Nukleophilität". Die Erfindung verwendet, aufgrund der Reaktivität von Hydrazinen mit modifikations-resistenten Polynukleotiden, ein Hydrazin.
Die geladene Hapten-Markierung, die kovalent an den Bindungsanteil gebunden ist, bildet eine Markierungsverbindung. Vorzugsweise befinden sich die geladene Haptenmarkierung und der Bindungsanteil an gegenüberliegenden Enden der Markierungsverbindung, um ihre Wechselwirkung zu verhindern und die sterische Behinderung während einer immunologischen Erfassungsreaktion der geladenen Haptenmarkierung zu verringern.
Zwischen der Markierung und dem Bindungsanteil der Markierungsverbindung kann sich optional eine "Abstands"-Verbindung befinden. Die Abstandsverbindung kann fast jede Verbindung sein, die zwischen der geladenen Haptenmarkierung und dem Bindungsanteil angeordnet werden kann. Die Abstandsverbindung dient zur Trennung der Markierung von dem Probenpolynukleotid, nachdem die Markierung an das Probenpolynukleotid gebunden wurde. Ein Beispiel einer geeigneten Abstandsverbindung ist eine lineare Kette aus von ungefähr zwei bis zu ungefähr fünfzehn Kohlenstoffatomen. Durch die Trennung der Markierung von dem Probenpolynukleotid kann die Abstandsverbindung dazu beitragen, die sterische Behinderung durch das Probenpolynukleotid während einer immunologischen Erfassung der Markierung zu verringern.
Beispiele für geeignete geladene Hapten-Markierungen, die an Hydrazin-Bindungsanteile gebunden sind, sind:
1. 4-Hydrazinobenzoesäure-Anion;
2. 4-(Hydrazinosulfonyl)-benzoesäure-Anion;
3. Sulfophenylhydrazin-Anion;
&supmin;SO&sub3;-Φ-X-NH-NH&sub2;
dabei ist Φ eine Phenyl-Gruppe und X ist eine Abstandsverbindung.
Eine bevorzugte geladene Haptenmarkierung, die an einen Bindungsanteil gebunden ist, ist eine Sulfophenylhydrazin-Verbindung. Eine bevorzugte Sulfophenylhydrazin-Verbindung weist eine haptenische, anionische Sulfophenyl-Markierung auf, die kovalent an einen terminalen Hydrazin-Bindungsanteil gebunden ist. Eine stark bevorzugte Sulfophenylhydrazin-Verbindung ist ein 4-Hydrazinobenzensulfonat-Anion, das als "SPH" bezeichnet wird. SPH hat die folgende Struktur:
Die Verwendung von SPH hat viele Vorteile. SPH ist haptenisch, nicht teuer, stabil, reaktiv mit bestimmten Proteinen und modifikations-resistenten Polynukleotiden, kommerziell erhältlich, angenommenerweise nicht-karzinogen, nicht radioaktiv und weist eine hohe Wasserlöslichkeit auf. Weiterhin kann SPH für lange Zeitabschnitte bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Reaktivität des Hydrazin-Endes von SPH mit Cytosin- Basen ermöglicht die Markierung eines Cytosin-Base enthaltenden Polynukleotids mit SPH in einer Anbindungs- oder Modifikations Reaktion in weniger als ungefähr 30 Minuten.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von SPH als die Markierung besteht darin, daß nur eine minimale Reinigung des Probenpolynukleotids vor der Modifikation mit SPH erforderlich ist. Eine minimale Reinigung ist aufgrund der Spezifizität der SPH- Cytosin-Modifikationsreaktion ausreichend. Die spezielle Reaktions-Spezifität von SPH für Cytosin reduziert die nicht- spezifische Markierung von Fettsäuren, Kohlehydraten und anderen Verbindungen. Typischerweise ergeben 5 Minuten auf einer Rotationssäule eine ausreichende Reinigung.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von SPH besteht darin, daß SPH in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur in geringeren als einmolaren Konzentrationen (d.h. ungefähr 50 mM) bis hin zu multimolaren Konzentrationen (d.h. ungefähr 8 M) löslich ist. Es wird vermutet, daß die hohe Wasserlöslichkeit durch die Gegenwart der anionischen Sulfophenyl-Markierungs- Verbindung Verursacht wird. Die hohe Wasserlöslichkeit ermöglicht eine Polynukleotid-Modifizierung auf hohem Niveau, ohne nennenswerte Aggregations-(d.h. "Klebrigkeits"-)Probleme, von denen bekannt ist, daß sie bei biotinisierten Proben auftreten.

Verfahren zur Herstellung der Hybridisierungs-Probe

Ein Verfahren zur Herstellung der Hybridisierungsprobe, geeignet zur Hybridisierung mit dem Einfang-Polynukleotid, umfaßt zuerst die Auswahl des Probenpolynukleotids, der geladenen Haptenmarkierung und des Bindungsanteils. Vorzugsweise sind die ausgewählte geladene Haptenmarkierung und der Bindungsanteil miteinander kovalent als eine Markierungsverbindung gebunden. Der nächste Schritt ist die Anbindung des Bindungsanteils der Markierungsverbindung an das Probenpolynukleotid in einer Anbindungs- oder Modifizierungsreaktion, gefolgt vom Anhalten der Anbindungsreaktion mit einer Anhalteverbindung.
Die Anbindungsreaktion kann in einem geeigneten Behälter durch das Hinzufügen einer Lösung aus dem Probenpolynukleotid zu einer Lösung aus der geladenen Haptenmarkierung erfglgen, die an den Bindungsanteil gebunden ist. Typischerweise wird die Anbindungsreaktion durch die Anhalteverbindung angehalten, vorzugsweise nach ungefähr 30 Minuten oder weniger. Eine Anbindungsreaktion von 30 Minuten oder weniger ermöglicht eine Anbindung einer ausreichenden Anzahl der geladenen Haptenmarkierungen an das Probenpolynukleotid, so daß die Markierungen einfach durch immunologische Erfassungseinrichtungen erfaßt werden können. Die Fortsetzung der Anbindungsreaktion für mehr als ungefähr 30 Minuten kann eine übermäßige Menge von nicht-spezifischen Markierungen durch die geladene Haptenmarkierung ergeben. Nicht-spezifische Markierungen erscheinen als "Rauschen" oder Signal-Interferenz bei der Anwendung der Erfassungseinrichtungen. Rauschen kann die Erfassung des Einfang-Polynukleotids erschweren.
Zusätzlich kann die Fortsetzung der Anbindungsreaktion für mehr als ungefähr 30 Minuten die Basen-Paar-Bildung während der Hybridisierungs-Reaktion beeinflussen. Die Basen-Paar- Bildung kann durch eine übermäßig große Anzahl von geladenen Haptenmarkierungen beeinflußt werden, die sich an das Probenpolynukleotid binden können.
Idealerweise wird die Anbindungsreaktion durch ein Sulfit- oder Bisulfit-Salz katalysiert. Das Salz kann eine wäßrige Lösung von einem Natriumbisulfit sein. Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Natriumbisulfit Ammoniumsulfit als der Anbindungsreaktions-Katalysator vorzuziehen ist.
Die Anbindungsreaktion kann durch die Anbindung des Bindungsanteils an irgendeinen von einer Anzahl verschiedener möglicher Anbindungsstellen des Probenpolynukleotids erfolgen. Der Bindungsanteil kann an eine terminale Phosphat-Gruppe des Proben polynukleotids gebunden werden; beispielsweise als ein terminales 5' Phosphat. Ein Verfahren zur Erzielung- einer derartigen Anbindung ist von B.C.F. Chu et al. in "Derivatization of Unprotected Polynucleotides", Nucleic Acids Research, 11(18), 6513-6529, (1983) beschrieben, obwohl irgendein dem Fachmann bekanntes Verfahren zur Erzielung einer derartigen Anbindung verwendet werden kann.
Alternativ kann der Bindungsanteil an ein 3' Ende bzw. Terminus eines RNA-Moleküls gebunden werden. Ein Verfahren zur Erzielung dieser Art von Anbindung ist von F. Hansske et al. in "Modification of the 3' Terminus of tRNA by Periodate Oxidation and Subsequent Reaction with Hydrazides", Methods in Enzymology, 59(10), 172-181, (1979) beschrieben, obwohl irgendein dem Fachmann bekanntes Verfahren zur Erzielung einer derartigen Anbindung verwendet werden kann.
Es kann eine Vielzahl von Anhalteverbindungen verwendet werden. Beispielsweise kann die Anhalteverbindung die Anbindungsreäktion durch das Anheben des pH-Werts der Reaktionslösung anhalten. Eine Tris-Pufferlösung kann als die den pH-Wert anhebende Anhalteverbindung verwendet werden. Allgemein wird der pH-Wert bis zu einem pH-Wert von wenigstens ungefähr 7 angehoben, um die Anbindungsreaktion anzuhalten.
Alternativ kann die Anhalteverbindung ein Blockiermittel sein, daß die Anbindungsreaktion anhält, indem es mit dem Bindungsanteil der Markierungsverbindung reagiert, um den Bindungsanteil zu blockieren und eine weitere Anbindungsreaktion zu verhindern. Das Blockiermittel kann eine elektrophile Verbindung sein, wie zum Beispiel ein Aldehyd oder ein Anhydrid. Geeignete Verbindungen schließen Zimtaldehyd, Bernstein-, Salicylsäure und N-Hydroxysuccinaminester-Anhydride ein. Diese Verbindungen sind geeignet, weil sie den Bindungsanteil schnell blockieren können. Ein am meisten bevorzugtes Blockierungsmittel ist Succin-Anhydrid.
Ein Vorteil der Verwendung eines elektrophilen Blockiermittels ist, daß keine Reinigung des Probenpolynukleotids erforderlich ist, bevor die Anbindungsreaktion durchgeführt wird. Es ist keine Reinigung des Probenpolynukleotids erforderlich, weil die elektrophile Verbindung eine hohe Reaktionsspezifizität für den Bindungsanteil hat. Beispielsweise blockiert Succin- Anhydrid, zum Ausschluß von vielen anderen Verbindungen, genau den Hydrazin-Bindungsanteil. Somit wird die Notwendigkeit Kohlenhydrate, Proteine, etc. in einem Reinigungsschritt zu entfernen, im wesentlichen beseitigt.
Fig. 1 zeigt die Chemie einer postulierten Anbindungsreaktion für SPH mit der Cytosinbase in einer sulfit-katalysierten Anwendung sreaktion. In Fig. 1: A zeigt die Cytosinbase des Probenpolynukleotids R; B ist die Cytosinbase mit einer Sulfonatgruppe, die an die Sechs-Kohlenstoff-Position gebunden ist; C ist die SPH-Markierungsverbindung; D und E sind Gleichgewichtsarten von B; und F und G zeigen Polynukleotid-Proben-Gleichgewichts-Produkte, die durch die Anbindungsreaktion erhalten wurden.
Wenn, wie in dies in Fig. 1 dargestellt ist, SPH eine Cytosinbase in einer Anbindungsreaktion transaminiert oder modifiziert, bindet sich der Hydrazin-Bindungsanteil kovalent an die Vier- Kohlenstoff-Position von Cytosin, indem er das Vier-Kohlenstoff-Amin der Cytosinbase ersetzt oder transaminiert. Die Polynukleotidproben-Reaktionsprodukte können mehr als eine negative Ladung tragen. Somit kann sich, zusätzlich zu dem negativ geladenen Sulfon auf dem Sulfophenyl an der 4-Position der Cytosinbase und in Abhängigkeit von den Gleichgewichtsbedingungen der Lösung, auch eine negativ geladene Sulfongruppe an der 6-Position der Cytosinbase befinden, wie dies durch die Spezies F dargestellt ist.
Die Anbindungsreaktion mit Sulfophenyl-Hydrazin kann in weniger als ungefähr 30 Minuten abgeschlossen werden. Bereits ein so kurzer Zeitabschnitt wie drei Minuten ermöglicht, daß eine Anzahl von erfaßbaren SPH-Markierungsverbindungen an die Cytosin-Basen gebunden werden, wie dies in Fig. 2 dargestellt ist.
Es wird eine Anbindungsreaktion von ungefähr 10 Minuten bevorzugt, da diese die Anbindung von genügend Sulfophenylmarkierungen zur schnellen Erfassung der Sulfophenylmarkierung ohne wesentliches Rauschen und ohne Basen-Paarungs-Probleme ermöglicht.
Die Anbindungsreaktion mit SPH kann aufgrund der Löslichkeit und Reaktivität von SPH schnell abgeschlossen werden. Die Rate einer SPH-Anbindungsreaktion kann erhöht werden, indem die Reaktions-Lösungs-Temperatur auf bis zu wenigstens ungefähr 40ºC und vorzugsweise bis zu ungefähr 90ºC erhöht wird. Am meisten wird eine Anbindungsreaktion-Lösungstemperatur von ungefähr 80ºC bevorzugt. Zusätzlich kann eine höhere Temperatur dazu beitragen, daß verhindert wird, daß Nukleinsäuren zweistrangige Bereiche bilden. Vorzugsweise wird die Anbindungsreaktion mit einsträngigen Probenpolynukleotiden durchgeführt, weil die SPH-Anbindungsreaktion für einsträngige Nucleinsäuren spezifisch ist.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Studie der Temperaturauswirkungen auf die SPH-Modifizierung von einsträngigen M13 DNA auf ein Nitrozellulose-Filter nach der Reaktion mit Farb- Entwicklungs-Reagenzien. Die Anbindungsreaktion wurde bei den sechs verschiedenen Temperaturen durchgeführt (40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC und 90ºC); Aufgrund der verringerten Reaktionsrate der Ammoniumsulfitlösung wurde 100-fach mehr DNA für diese Reaktion auf das Agarosegel geladen ( 5 ng DNA für Ammoniumsulfit gegenüber 50 pg DNA für Natriumbisulfit). Beide Anbindungsreaktionen wurden für 15 Minuten durchgeführt, bevor sie durch das Hinzufügen einer Anhaltelösung angehalten wurden, die 9 Volumen bzw. Einheiten von 1,0 M Tris pH-Wert 8,5 umfaßte. Anschließend wurde eine enzymatische Erfassung auf Farbmessungs-Basis durchgeführt. Fig. 3 zeigt einen gleichmäßigen Anstieg in der Agressivität der Markierungsreaktion bei steigender Temperatur, wobei eine Temperatur von ungefähr 80ºC eine optimale SPH-Modifizierungs-Reaktions-Temperatur zu sein scheint.
Wie dies in Fig. 4 dargestellt ist, kann der pH-Wert ebenfalls die Rate und den Wirkungsgrad der Modifizierungsreaktion beeinträchtigen. Figur 4 zeigt die Ergebnisse einer Studie der pH-Wert-Auswirkungen auf die natriumbisulfit-katalysierte SPH-Modifizierung von einsträngigen M13 DNA auf einem Nitrozellulosefilter nach der Reaktion mit Farb-Entwicklungsreagenzien. Die Anbindungsreaktion wurde bei den in der Figur dargestellten 11 verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Bei jeder Anbindungsreaktion wurden 50 Picogramm von der DNA verwendet, indem diese Menge von DNA auf das Agarosegel geladen wurde Die Anbindungsreaktion wurde bei 80ºC für 15 Minuten durchgeführt, bevor die Anhalteverbindung hinzugefügt wurde. Entsprechend den aus Fig. 4 zu erkennenden Ergebnissen, beträgt der pH-Wert der Anbindungsreaktion vorzugsweise ungefähr 3 bis ungefähr 6, bevorzugter ungefähr 4 bis ungefähr 5, und am meisten bevorzugt beträgt der pH-Wert ungefähr 4,5.

Die Probe verwendende analytische Methoden

Ein die Hybridisierungsprobe verwendendes analytisches Verfahren umfaßt das Mischen der Hybridisierungsprobe und eines Einfang-Polynukleotids, die Inkubation der Mischung, um den Ablauf der Hybridisierungsreaktion zwischen den beiden Polynukleotiden zu ermöglichen, die Trennung der hybridisierten Probe von der nicht-hybridisierten Probe, und die Erfassung der Markierung von entweder der hybridisierten oder der nicht- hybridisierten Probe. Wenn das Einfang-Polynukleotid doppelsträngig ist, wird es vor dem Misch-Schritt denaturiert, um einsträngiges Einfang-Polynukleotid zu erhalten. Die Hybridisierungsreaktion findet zwischen komplementären einsträngigen Polynukleotiden statt. Die Hybridisierungsreaktion kann stattfinden, wenn das Einfang-Polynukleotid in einer Lösung ist, oder, alternativ, das Einfang-Polynukleotid kann direkt oder indirekt an einen Träger gebunden werden, wie zum Beispiel Nylon, Nitrozellulose, Polystyrol oder ein ähnliches Trägermaterial, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Typischerweise wird nur unmarkiertes Einfang- Polynukleotid direkt an einen Träger gebunden, weil die geladene Haptenmarkierung von einem direkt an einen Träger gebundenen Polynukleotid für die Erfassungsreagenzien nicht "sichtbar" wäre.
"Erfassung" der Markierung bedeutet, daß entweder das Vorhandensein von der geladenen Haptenmarkierung festgestellt wird, oder daß die Konzentration von der geladenen Haptenmarkierung in Lösung als eine Messung der Konzentration der ursprünglich vorhandenen geladenen Haptenmarkierung bestimmt wird. Der Ausdruck "Erfassung" betrifft auch die Erfassung von entweder der geladenen Haptenmarkierung der hybridisierten Probe und/oder der geladenen Haptenmarkierung der nicht-hybridisierten Probe.
Die Erfassung der Markierung-kann mit einem immunologischen System durchgeführt werden, das einen oder zwei Antikörper verwendet. In einem Einzel-Antikörper-System wird der erste Antikörper an einen erfaßbaren Anteil konjugiert. In einem Zwei-Antikörper-Erfassungssystem wird der zweite Antikörper gewöhnlich an den erfaßbaren Anteil konjugiert. Der erfaßbare Anteil ermöglicht die Erfassung der vorhandenen geladenen Haptenmarkierung.
Der erfaßbare Anteil kann ein Enzym, Enzymsubstrat, Fluorophor, Chromophor, Chemilumiphor und/oder eine oder mehrere haptenische oder nicht-haptenische Markierungen einschließen. Somit kann der erfaßbare Anteil ein Enzymsubstrat und eine Biotin- Markierung aufweisen. Die Konjugierung von entweder dem ersten Antikörper, dem zweiten Antikörper oder beiden an eine oder an mehrere Markierungen, wie zum Beispiel Biotin, kann schnell die Erfassung von kleinen Mengen von Einfang-Polynukleotid mit geringem Hintergrundrauschen ermöglichen. Bei einer immunologischen Erfassung reagiert die geladene Haptenmarkierung mit einem für die Markierung spezifischen Antikörper. Die Erfassungsmethode kann beispielsweise ein optischer Immun-Assay, ein Radio-Immun-Assay oder ein Enzym-Immuno-Assay sein. Eine Enzym-Immun-Assay-Reaktion wird aufgrund ihrer Anpaßbarkeit an ein Ein- oder Zwei-Antikörper-Erfassungssystem als Erfassungsreaktion bevorzugt.
Die analytische Methode kann einen oder mehrere "Blockierungs"- Schritte einschließen, um zur Verringerung des Rauschens beizutragen, das sich durch die nicht-spezifischen Bindungen des Probenpolynukleotids ergibt. Ein erster Blockierungsschritt kann vor der Hybridisierungsreaktion ausgeführt werden, um die nicht-spezifischen Bindungsstellen auf dem Träger und auf dem Einfang-Polynukleotid mit einer Blockierungseinrichtung zu blockieren. Die Blockierungseinrichtung umfaßt ein Prehybridisierungs-Blockierungs-Polynukleotid.
Ein zweiter Blockierungsschritt kann nach der Hybridisierungsreaktion, jedoch vor der Erfassung des Einfang-Polynukleotids, mit einer zweiten Blockierungseinrichtung ausgeführt werden. Die zweite Blockierungseinrichtung blockiert nicht-spezifische Bindungsstellen auf dem Träger und auf träger-befestigten Verbindungen, wie zum Beispiel dem Einfang-Polynukleotid und anderen Verbindungen, wie zum Beispiel Fettsäuren und Kohlenhydrate, die während des Inkubationsschrittes an den Träger gebunden wurden. Die zweite Blockierungseinrichtung umfaßt ein Pösthybridisierungs-Blockierungs-Polynukleotid.
Die Verwendung von Sulfophenyl als die Markierung ergibt wesentliche Vorteile. Wenn die Markierung ein Sulfophenyl ist, ist es möglich, weniger als ein Picogramm von Einfang-Polynukleotid zu erfassen. Zusätzlich kann das Einfang-Polynukleotid innerhalb von Stunden erfaßt werden. Weiterhin ergibt die Nicht-Radioaktivität der Sulfophenylmarkierung das damit verbundene sicherere Verfahren, den Wegfall eines Entsorgungsproblems und den Wegfall der Risiko- und Kostenfaktoren, die mit der Entsorgung von radioaktiven Markierungen zusammenhängen.

Antikörper zu der geladenen Haptenmarkierung

Um die geladene Haptenmarkierung erfassen zu können, werden Antikörper zu der Markierung verwendet. Die Antikörper können polyklonale, monoklonale und durch DNA-Rekombination erzeugte Antikörper zu der geladenen Haptenmarkierung sein. Die bevorzugten Antikörper sind IGG-Antikörper.
Polyklonale Antikörper können erzeugt werden, indem ein Tier, beispielsweise eine Ziege, ein Kaninchen bzw. Hase oder eine Maus mit einem Antigen immunisiert werden, das eine haptenische Sulfophenylverbindung umfaßt, die an einen Träger konjugiert ist, um einen Antikörper zu dem Hapten zu erzeugen. Der polyklonale Antikörper kann anschließend aus einer Probe von der Tierkörper-Flüssigkeit durch Affinitätsreinigung entnommen werden. Kaninchen-Polyklonal-Antikörper werden bevorzugt, weil sie eine höhere Affinität als die Ziegen- oder Maus-Polyklonal- Antikörper für die geladene Sulphophenylmarkierung aufweisen.
Das Antigen kann SPITC-BSA sein. Dieses Antigen umfaßt eine -4-Sulfophenylisothiozyanat-Verbindung, die an Bovin-Serum-Albumin konjugiert ist, einem Träger mit hohem Molekulargewicht. Vorzugsweise erfolgt die Immunisierung in zwei Stufen. In der ersten Stufe wird dem Tier die geladene Haptenmarkierung injiziert, die an einem nicht-methylierten Proteinträger konjugiert ist. In der zweiten Stufe wird eine Booster-Injektion mit der geladenen Haptenmarkierung durchgeführt, die an einem methylierten Träger konjugiert ist, wie zum Beispiel methyliertem BSA. Diese Zweistufen-Immunisations-Methode ergibt Antikörper mit einer hohen Affinität für die geladene Haptenmarkierung, wie zum Beispiel die 5 ulfophenylmarkierung.
Monoklonale Antikörper können durch die Hybridoma-Methode hergestellt werden, die von G. Kohler und C. Milstein in "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Pre- Defined Specificity", Nature 256, 495 (1975) beschrieben wurde. Das Verfahren umfaßt die Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen, das die geladene Haptenmarkierung umfaßt, die an einem Träger konjugiert ist. Das Tier kann ein Säugetier sein, wie zum Beispiel eine Maus. Vorzugsweise wird die Immunisierung mit dem Zwei-Stufen-nicht-methylierter/methylierter-Träger- Verfahren durchgeführt. Durch das Zwei-Stufen-Immunisationsverfahren hergestellte monoklonale Antikörper zeigen die höchste Affinität für die Sulfophenylmarkierung.
Die Hybridoma-Methode umfaßt das Fusionieren von Milzzellen des immunisierten Tieres mit Myeloma-Zellen, die Kultivierung der erhaltenen Hybridoma-Zellen in einem selektiven Medium, den Nachweis für das Vorhandensein des gewünschten Antikörpers, und das Klonen- der die gewünschten Antikörper erzeugenden Hybridomas.
Die Hybridomas können Hybride von einer. Maus-Myeloma-Zell-Linie 653.1 sein, die aus P3X63-Ag8.653 Mäuse- und Sulfophenyl-Antigen immunisiertem Balb/c Mäusemilzzellen erhalten wurde. Bevorzugte Hybridoma-Zell-Linien sind durch die Anmelderin als SPITC AS11, SPITC AS13, SPITC-AS14 und SPITC AS15 identifiziert. Diese Zell- Linien wurden am 25. Oktober 1989 bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 nach den Bestimmungen des Budapester Übereinkommens über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentangelegenheiten hinterlegt. Die ATCC hat diesen vier Hybridoma-Zell-Linien die ATCC-Hinterlegungs Nummern HB 10280, HB 10281, HB 10282 bzw. HB 10283 zugewiesen. Diese Hybridoma-Kulturen wurden am 3. November 1989 durch die ATCC überprüft und die Lebensfähigkeit von allen Kulturen wurde bestätigt.
Um ausreichende Mengen von Monoklonal-Antikörpern für Assayzwecke zu erhalten, wird typischerweise einem Tier, wie zum Beispiel einer Maus eine Lösung von den kultivierten Hybridomas injiziert. Die sich ergebende, von den Mäusen hergestellte, Ascit-Flüssigkeit enthält die Monoklonal-Antikörper. Die Monoklonal-Antikörper können dann durch konventionelle Verfahren entfernt werden.
Antikörper zu der geladenen Haptenmarkierung können auch durch bekannte genetische Rekombinations-Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann das Gen oder der relevante Teil des Gens einer Zelle, die gegen das Sulfophenylhapten immunisiert wurde, entnommen und in eine geeignete Wirtszelle eingefügt werden. Die Wirtszelle kann dann die Antikörper gegen die geladene Haptenmarkierung erzeugen.
Die rekombinierte, für den Antikörper zu der geladenen Haptenmarkierung kodierte DNA-Sequenz, kann von der immunisierten Zelle entfernt werden, isoliert von der DNA-Kodierung für Proteine, die normalerweise zu einer DNA-Sequenz gehören. Alternativ kann die rekombinierte DNA-Sequenz von der immunisierten Zelle entfernt werden, beweglich an eine Kontrollsequenz gebunden, die zur Expression der DNA in der Wirtszelle beiträgt.

Hybridisierungs-Proben-Materialsätze

Verschiedene Materialsätze fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Ein Mäterialsatz für sowohl die Herstellung der Hybridisierungsprobe als auch für die Erfassung des Einfang- Polynukleotids kann die geladene Haptenmarkierung, den Bindungsanteil, Einrichtungen zur Katalysierung der Anbindungsreaktion, eine Anhalte-Verbindung, den ersten, für die geladene Haptenmarkierung spezifischen Antikörper, den zweiten Antikörper, das Prehybridisierungs-Reaktions-Blockierungs- Polynukleotid, das Posthybridisierungs-Reaktions-Blockierungs- Polynukleotid sowie ein oder mehrere Kontroll-Polynukleotide enthalten. Wenn der zweite Antikörper zu dem Bausatz gehört ist dieser an dem erfaßbaren Anteil konjugiert.
Die Kontroll-Polynukleotide tragen zur Erfassung des Einfang- Polynukleotids bei, indem sie das Signal kalibrieren, das bei der Verwendung der SPH-markierten Hybridisierungsprobe nach der vorliegenden Erfindung empfangen wird. Typischerweise wird eine positive und eine negative Kontrolle verwendet. Die positive Kontrolle umfaßt ein Polynukleotid, das mit der geladenen Haptenmarkierung markiert ist. Die negative Kontrolle ist ein unmarkiertes Polynukleotid.
Ein Materialsatz zur Herstellung der Hybridisierungsprobe kann die geladene Haptenmarkierung, den Bindungsanteil und Einrichtungen zur Katalysierung der Anbindungsreaktion umfassen.
Die geladene Haptenmarkierung und der Bindungsanteil können kovalent miteinander als eine Markierungsverbindung gebunden sein. Die Markierungsverbindung kann eine Sulfophenylhydrazin- Verbindung sein. Die Einrichtungen zur Katalysierung können ein Bisulfitsalz umfassen.
Der Materialsatz zur Herstellung der Hybridisierungsprobe kann auch eine Anhalteverbindung enthalten, wie zum Beispiel eine wäßrige Lösung von entweder einem pH-Wert anhebenden Puffer oder einer elektrophilen Verbindung.
Ein Materialsatz zur Erfassung des Einfang-Polynukleotids kann eine geladene Haptenmarkierung und einen zu der geladenen Haptenmarkierung spezifischen Antikörper umfassen. Die geladene Haptenmarkierung kann die Sulfophenylmarkierung sein, wobei der Antikörper in diesem Fall der Antisulfophenyl-Antikörper sein kann. Der Bausatz zur Erfassung kann auch den Bindungsanteil und Einrichtungen zur Katalysierung umfassen.
Der Materialsatz zur Erfassung des Einfang-Polynukleotids kann auch das Prehybridisierungs-Reaktions-Blockierungs-Polynukleotid, das Posthybridisierungs-Reaktions-Blockierungs-Polynukleotid und ein oder mehrere Kontroll-Polynukleotide umfassen. Der Materialsatz zur Erfassung des Einfang-Polynukleotids kann optional auch den zweiten Antikörper umfassen.
Der erfaßbare Anteil kann ein fluoreszierendes Molekül, wie zum Beispiel Fluorescein-Isothiocyanat, oder eine elektronendichte konjugierte Verbindung, wie zum Beispiel Kolloidgold oder Ferritin, sein. Alternativ kann der erfaßbare Anteil ein Substrat für ein Enzym sein, wie zum Beispiel Alkalin-Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder eine Galactosidase. Der erfaßbare Anteil kann durch chromogene, chemilumineszente oder fluoreszente Einrichtungen erfaßt werden. Der erfaßbare Anteil kann eine Verbindung sein, die bei Reaktion mit einem Farb- Entwicklungs-Reagenz sichtbar wird, zum Beispiel mit NBT (Nitro-Blau-Tetrazolium) und BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- Phosphat). Der Bausatz zur Erfassung kann Farbentwicklungsreagenzien einschließen.

Beispiel 1

(Vergleich von Ammonium-Sulfit- und Natrium-Bisulfit- Katalysierung der Anbindungsreaktion)

Ammoniumsulfiüund Natriumbisulfit wurden zur Katalysierung der Anbindungsreaktion von SPH zu M13 DNA verwendet. Es wurden zwei Lösungen hergestellt. Lösung (A) enthielt 10 mg/ml von SPH, 1 mg/ml Hydroquinon und 2,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub3;, eingestellt auf einen pH-Wert von 4,5. Die Lösung (B) enthielt 10 mg/ml SPH, 1 mg/ml Hydroquinon und 2,0 M Na&sub2;S&sub2;O&sub5;, eingestellt auf einen pH-Wert von 4,5. Die beiden Lösungen wurden auf 80ºC erhitzt, bevor einsträngiges M13 DNA bis zu einer Konzentration von 1 µg/ml als das Proben-Polynukleotid hinzugefügt wurde. Zu jedem der sechs Zeitpunkte (3, 6, 10, 15, 20 und 30 Minuten) wurden Proben entnommen und die Anbindungsreaktion wurde durch das Hinzufügen von 9 Volumen von 1,0 Tris HCl (pH 8,5) als die Anhalteverbindung angehalten. Diese Proben wurden weiter-verdünnt, damit 5 ng und 50 pg von DNA zu jedem Zeitpunkt zur Elektrophorese direkt auf ein Agarosegel geladen werden konnte. Die Elektrophorese der Proben wurde für ungefähr zwei Stunden durchgeführt, bevor sie zur Flüssigkeitsabgabe auf Nitrozellulose angeordnet wurden. Die Kleckse wurden für zwei Stunden bei 80ºC in Vakuum gebacken und dann vor der Erfassung mit affinitäts-gereinigten Kaninchen-Antisulfophenyl- Antikörpern erfaßt. (Siehe Beispiele 2 und 3 für das Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper.)
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 2 dargestellt. Trotz der kurzen Entwicklungszeit (10 Min. mit den Farbentwicklungsreagenzien BCIP and NBT) ermöglichten die natriumbisulfitbehandelten Proben die Erfassung von den 50 pg der markierten DNA nach einer nur drei-minütigen Anbindungsreaktion. Eine dreiminütige Anbindungsreaktion ist deshalb ausreichend, um eine sulfophenyl-markierte Hybridisierungsprobe herzustellen. Die Ammonium-Sulfit-Lösung zeigte einen deutlich erfaßbaren Abstrich mit 5 ng der markierten DNA. Die Natrium-Bisulfit-Lösung zeigte auch nach 30 Minuten bei 80ºC nur einen leichten Zerfall, während das einzige erfaßbare DNA in der Ammonium-Sulfit-Probe im wesentlichen zerfallen war. Es ist deshalb ein klarer Vorteil darin zu sehen, Natrium-Bisulfit als den Anbindungsreaktionskatalysator zu verwenden.

Beispiel 2

(Herstellung von Polyklonal-Antikörpern zu SPH)

Um Antikörper zu SPH herzustellen, wurde ein Sulfophenylisothiocyanat, konjugiert an Bovin-Serum-Albumin (SPITC-BSA), Antigen hergestellt, in dem 250 mg 4-Sulfophenylisothiocyanat (SPITC) zu einer 10 ml Lösung hinzugefügt wurde, die 25 mg/ml Bovin-Serum-Albumin (BSA) in 50 mM HEPES, pH 8,7, enthielt. Diese Lösung wurde vor der Dialyse gegen phosphat-gepuffertes Salm (PBS) bei 37ºC für 4 Stunden mit einem Schüttelapparat geschüttelt.
Auch Apoferritin wurde als ein alternativer Hapten-Träger verwendet. Ein an Apoferritin konjugiertes Sulfophenylisothiocyanat (SPITC-Apo) Antigen wurde durch dasselbe Verfahren hergestellt, das zur Herstellung eines SPITC-BSA Antigens verwendet wurde. Dieses Antigen wurde in dem ELISA-Assay von Beispiel 12 verwendet.
SPITC-BSA wurde bei einer Konzentration von 100 µg/ml in PBS mit einem gleichen Volumen einer Adjuvant-Lösung gemischt, die 50 % vollständiges und 50 % unvollständiges Freund'sches Adjuvant enthielt. Ein halber Milliliter der Impfsäule wurde an jedem der beiden Beine eines Kaninchens intramuskulär appliziert. Ein Zehntel Milliliter der Impfsäule wurde auch intradermal an jeder der zehn Dorsalstellen des Kaninchens appliziert. Jedes Kaninchen wurde dadurch mit einer ersten Injektion von 1.00 µm des Sulfophenyl-Antigens injiziert. Jedes Kaninchen erhielt einmal im Monat für mehrere Monate eine Booster-Injektion von 50 µg des Sulfophenyl-Antigens.

Beispiel 3

(Reinigung des Polyklonal-Antikörpers zu SPH)

Der bei dem Verfahren nach Beispiel 2 gezüchtete Kaninchen- Antisulfophenyl-Polyklonal-Antikörper wurde affinitäts-gereinigt. An Affinitätsgel gebundenes SPH wurde hergestellt, indem zuerst 100 mg von SPH in 30 ml von 0,1 M MOPS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst wurden. Dann wurden 10 Milliliter ungewaschenes Bio-Rad Affi-Gel zu der SPH-Lösung hinzugefügt. Der erhaltene Schlamm konnte bei Raumtemperatur für zwei Stunden reagieren. Der reagierte Schlamm wurde bei 1500 U/min. in einer Beckman TJ-6 Zentrifuge zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde entfernt und das verbleibende Gel-Pellet wurde ausgiebig mit destilliertem Wasser und dann mit PBS gewaschen.
Fünf Milliliter des an das Affinitätsgel gebundenen SPH wurden dann bei 4ºC für vier Stunden inkubiert, mit 200 ml gepooltem Kaninchen Anti-SPH-Antiserum, das durch das Verfahren nach Beispiel 2 erhalten wurde. Der erhaltene Schlamm, bestehend aus dem Kaninchen-Antisulfophenyl-Antikörper, gebunden an SPH, gebunden an das Affinitätsgel, wurde auf eine kleine Bio-Rad Econo-Column aufgetragen und mit 100 ml PBS bei 4ºC gewaschen.
Dann wurde die Hapten-Verschiebungs-Chromatographie verwendet, um den an die SPH-Affi-Gel 10 Säule gebundenen Kaninchen- Antisulfophenyl-Polyklonal-Antikörper zu entfernen. Die haptenische Verschiebungsgruppe war ein succinyliertes Derivat von SPH. Das succinylierte Derivat von SPH wurde hergestellt, indem 10 gm SPH mit 10 gm Succin-Anhydrid bei Raumtemperatur für eine Stünde in einer Lösung inkubiert wurde, die 25 ml 10X PBS und ungefähr 200 ml destilliertes Wasser enthielt. Nach der Inkubation wurden 30 ml 1,0 M Tris HCl (pH 7,5) hinzugefügt. Diese Lösung wurde für zwei Stunden bei 37ºC weiter inkubiert. Das Endvolumen wurde auf 250 ml eingestellt, um eine Lösung aus 1X FBS, 120 mM Tris HCl und 200 mM von dem SPH-Succinat zu erhalten. Zehn Milliliter von dieser Verschiebungsmischung wurden für 60 Minuten bei 4ºC mit dem Kaninchen- Antisulfophenyl-Äntikörper inkubiert, der an das SPH gebunden war, das an den Affinitätsgelschlamm gebunden war, und anschließend wurde gegen PBS für drei Tage bei 4ºC dialysiert. Dieses Verfahren ergibt einen gereinigten Polyklonal-Antisulfophenyl-Antikörper.

Beispiel 4

(Herstellung der Hybridisierungs-Probe)

Eine Hybridisierungsprobe wurde hergestellt, indem Sulfophenylhydrazin in einer Anbindungsreaktion an eine Cytosin-Base enthaltende Nukleinsäure gebunden wurde. Das Sulfophenylhydrazin wurde in einer Markierungsmischung verwendet. Die zur Herstellung der Markierungsmischung verwendeten Reagenzien waren:
SPH Trocken-"Kristalle" (Sulfophenylhydrazin, Phenylhydrazin-4-Sulfon-Säure-Hemihydrat, von der Fluka als #78720- Powder erhältlich, 99 % Reinheit);
Natriumbisulfit (Natrium-Metabisulfit, Sigma # S-9000);
Hydroquinon-Lösung (100 mg/ml in Äthanol, aufbewahrt bei -20ºC); und
1,0 M Natriumcitrat-Lösung (pH 5,2).
Die Markierungsmischung wurde hergestellt, indem 0,9505 g von dem Natrium-Metabisulfit (Na&sub2;S&sub2;O&sub5;) in 4,2 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Zu dieser Bisulfit-Lösung wurden 40 mg von dem Phenylhydrazin-4-Sulfon Säure-Hemihydrat hinzugefügt, gefolgt von dem Hinzufügen von 500 ml von der 1,0 M Natriumcitrat-Lösung, pH 5,2. Diese Lösung wurde in einem Wasserbad mit 65ºC erhitzt, bis alle der Reagenzien in Lösung waren. Fünfzig Mikroliter von der 100 mg/ml Lösung aus Hydroquinon in Äthanol wurden dann zugefügt.
Um die Anbindungsreaktion durchzuführen, wurden zuerst 10 µl von doppelsträngiger pUC SLO Plasmid DNA (in Tris oder Wasser) denaturiert, indem sie für ungefähr 5 bis 10 Minuten in Wasser gekocht wurde. Die Denaturierung ergab einsträngiges pUC SLO Plasmid DNA, das als das Proben-Polynukleotid verwendet wurde. Neunzig Mikroliter (9 Teile) von der Markierungsmischung wurden dann schnell zu 10 µl (1 Teil) von der denaturierten DNA-Lösung hinzugefügt. Diese Mischung wurde bei 80ºC für 10 Minuten inkubiert. Die Anbindungsreaktion wurde durch das Hinzufügen von 50 µl (5 Teile bezogen auf ein DNA-Anfangsvolumen von 10 µl) von 3,0 M Tris (pH 8,5) als die Anhaltelösung angehalten. Die Mischung aus Hybridisierungsprobe, Markierungsmischung und Proben-Polynukleotid kann dialysiert werden, um nicht-reagierte Hapten- und Katalysator-Bestandteile zu entfernen, oder sie kann direkt in einer Hybridisierungsreaktion mit einem Einfang- Polynukleotid verwendet werden.

Beispiel 5

(Hybridisierungs-Reaktion)

Anschließend wurde eine Hybridisierungsreaktion zwischen der sulfophenyl-markierten Lachssperma-Hybridisierungsprobe nach Beispiel 4 und einem Einfang-Polynukleotid durchgeführt, das aus denaturiertem pUC SLO Plasmid DNA bestand; Das denaturierte pUC SLO Plasmid DNA wurde zur Flüssigkeitsabgabe auf einen Nitrozellulose-Träger aufgetragen. Ein Prehybridisierungs Reaktions-Blockierungsschritt wurde an der pUC SLO DNA und an dem Nitrozellulose-Träger durchgeführt, wobei eine Standard- Prehybridisierungsmischung verwendet wurde, die 5X SSPE, 50 % Formamid, 5X Denhardts, 100 µg/ml denaturiertes Lachssperma-DNA; (phenol-extrahiert und beschallt) und 0,1 % SDS enthält. Der Prehybridisierungs-Blockierungschritt wurde bei 37ºC für wenigstens eine Stunde durchgeführt.
Die Hybridisierung der sulfophenyl-markierten pUC SLO DNA Hybridisierungsprobe und des träger-fixierten pUC SLO DNA als die Einfang-DNA wurde in 5X SSPE, 50 % entionisiertem Formamid, 5X Denhardts und 100 µg/ml denaturierter-Lachssperma- DNA ausgeführt. Die Hybridisierung wurde bei 37ºC in einem Schüttelinkubator durchgeführt. Es können Hybridisierungsprobenkonzentrationen zwischen 50 ng/ml bis 1 µg/ml verwendet werden. Es wurden große Volumen der Hybridisierungsprobe verwendet, wie zum Beispiel ungefähr 0,2 ml/cm², weil es einfacher war mit großen Hybridisierungsproben-Volumen zu arbeiten.

Beispiel 6

(Erfassung von hybridisierte pUC SLO DNA)

Die hybridisierte Probe wurde unter Verwendung des Kaninchen- Antisulfophenyl-Polyklonal-Antikörpers aus Beispiel 3 in einer kolorimetrischen Fällungsreaktion auf Enzymbasis erfaßt. Die aus Beispiel 5 erhaltenen Kleckse auf Nitrozellulose-Trägern wurden in einer Stringency-(Exaktheit der Paarung)-Wäsche mit drei 10-minutigen Wechseln eines 0,1X SSPE Puffers bei 65ºC gewaschen. Die Stringency-Wäsche trennte die hybridisierten von den nicht-hybridisierten Polynukleotiden.
Die auf dem Nitrozellulose-Trägern verbliebenen Klekse wurden mit einem Posthybridisierungs-Reaktions-Blockierungsschritt behandelt, um nicht-spezifische Bindungsstellen auf dem Träger und auf den Verbindungen zu blockieren, die während des Hybridisierungsschrittes an dem Träger gebunden wurden, indem die gewaschenen Klekse in einem 1X Waschpuffer für 30 Minuten bei 23ºC oder 37ºC in einem Schüttelinkubator inkubiert wurden. Der 1X Waschpuffer umfaßte 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 % NP 40, 0,1 % Dextran-Sulfat und 500 µg/ml Phenol extrahierte Gesamt-(Billig-) Hefe-RNA.
Die Kleckse wurden dann mit dem affinitäts-gereinigten Kaninchen-Antisulfophenyl-Antikörper, der aus Beispiel 3 erhalten wurde, bei einer Konzentration von 0,1 µg/ml in dem 1x Wasch- Puffer inkubiert. Die Inkubation wurde bei 37ºC für ungefähr 45 Minuten durchgeführt. Die nicht-gebundenen Kaninchen- Antisulfophenyl-Antikörper wurden dann mit einer zweimaligen kurzen Wäsche in dem 1.0X Wasch-Puffer weggespült. Die Klekse wurden dann für ungefähr 5 Minuten mit einem Alkalisalz-Wasch- Puffer gewaschen. Der Alkalisalz-Wasch-Puffer umfaßte 1,0 M NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 10) und 50 mM MgCl&sub2;.
Der Alkalisalz-Wasch-Puffer wurde dann von den Kleksen abgespült, wobei einige kurze Wäschen mit dem 1,0X Wasch-Puffer bei 37ºC verwendet wurden.
Der zweite Antikörper, eine 1:2000 Verdünnung des im Handel erhältlichen Ziegen-Anti-Kaninchen-Alkali-Phosphatase-Konjugats, in 1,0X Wasch-Puffer wurde den Kleksen dann hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für ungefähr 45 Minuten. Die Klekse wurden dann mit dem 1,0X Wasch-Puffer bei 37ºC gespült.
Dann wurde eine weitere Spülung für ungefähr 10 Minuten mit einem Alkali-Phosphatase-Puffer bei 37ºC durchgeführt. Der Alkali-Phosphatase-Puffer umfaßte 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl&sub2;.
Eine Erfassungslösung wurde dann zu einem CLAVIE-bag (der Bel Art Products) hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation bei 36ºC für ungefähr 2 Stunden. Die Inkubation kann für zwischen ungefähr 30 Minuten und ungefähr 12 Stunden durchgeführt werden, um die gewünschte Farbintensität zu erhalten. Die verwendete Erfassungslösung bestand aus 10 µl Nitro Blue Tetrazohum (100 mg/ml in 50 % DMF), 10 µl von 5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphat (50 mg/ml in DMF) und 3 ml des Alkali-Phosphatase- Puffers. Die Erfassungsreaktion wurde durch Spülen mit destilliertem Wasser und Tris HCl angehalten, gefolgt von einer Luft-Trocknung und dem Photographieren der Kleckse. Das Vorhandensein der farbigen Klekse zeigte das Vorhandensein von der sulphophenyl-markierten pUC SLO DNA Hybridisierungsprobe, die zu dem komplementären pUC SLO DNA hybridisiert war. Damit war die Erfassung von der pUC SLO Einfang-DNA erreicht.

Beispiel 7

(Herstellung von Hybridomas)

Es wurden Hybridomas hergestellt, die zur Erzeugung von Monoklonal-Antikörpern mit einer spezifischen Affinität für eine Sulfophenyl-Markierung geeignet sind. Es wurden die folgenden Materialien verwendet. Die verwendeten Myeloma-Zellen wurden von der P3x63-Ag8.653 Myelomazell-Linie erhalten, einer nicht-sekretierenden Maus-Myeloma-Linie, die von Kearney et al. entwickelt wurde, J. Immunol, 123:1548 (1979). Die verwendeten Milzzellen wurden Balb/c Mäusen entnommen, die durch das unten beschriebene Verfahren immunisiert waren. Das Wachstumsmedium war DME Niedrig-Glukose (Irvine Scientific), dem 10 % Kalbsfötusserum (Hydon) und 2 mM 1-Glutamin (Irvine Scientific) zugesetzt waren. Das verwendete Medium war ein Wachstumsmedium von einer Drei-Tage-Kultur aus 653.1 Zellen, zentrifugiert und filtriert um Zellen zu entfernen. Das CHAT-Medium war zu 50 % Wachstumsmedium und zu 50 % konditioniertes Medium mit 100 Einheiten/ml Penizillin-Streptomycin-Lösung (Irvine Scientific), 4 X 10&supmin;&sup7; M Aminopterin (Sigma), 1 X 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin (MA Bioproducts), 1,6 X 10&supmin;&sup5; M Thymidin (MA Bioproducts), und 10 Einheiten/ml Insulin (Eli Lily). Das konditionierte Medium war zu 50 % Wachstumsmedium - zu 50 % gebrauchtes Medium und 2,5 X 10&supmin;&sup5; M b-Mercaptoäthanol (Sigma). Es wurdepolyäthylen-Glykol (PEG) mit einem Molekulargewicht zwischen ungefähr 1300 und 1600 (Sigma) verwendet. Das Injektionsmedium war DME Niedrig-Glukose mit 100 Einheiten/ml Penizillin-Streptomycin-Lösung. Ein halber Milliliter Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, erhältlich von Aldrich) wurde zwei Wochen vor der Hybridoma-Injektion intraperitonal in jede Balb/c Maus injiziert.
Die Hybridomas wurden mit dem von Kohler und Milstein entwickelten Verfahren hergestellt, NATURE 256:495 (1975). Die Milz der immunisierten Maus wurde nach Halswirbelbruch aseptisch entfernt und in einem Gewebesieb zerkleinert, bis eine Einzellen- Suspension erhalten wurde. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit den gewaschenen 653.1 Myelomazellen in einem 2:1 Verhältnis von Milz zu Myelomazellen gemischt und dann pelletiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde entfernt und das PEG langsam über eine Minute hinzugefügt. PBS wurde hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 22 ml zu bringen und die Zellen wurden dann für 8 Min. nach dem Beginn der PEG-Zugabe pelletiert. Das Pellet wurde in 200 ml CHAT-Medium resuspensiert und 0,2 ml der Suspension wurden jeder Mulde von zehn 96-Mulden-Mikrotiter- Platten hinzugefügt. Die Mulden wurden am sechsten oder siebten Postfusions-Tag mit frischem CHAT versorgt.
Die Überprüfung der Mulden auf Wachstum begann am 10. Tag und wurde für die nächsten 3 - 4 Tage fortgesetzt. Mulden mit einem größeren optischen Dichte-Meßwert als die negative Kontrolle wurden am folgenden Tag erneut getestet. Wenn der Meßwert am zweiten Überprüfungstag größer als der der negativen Kontrolle blieb, wurde die Kolonie als positiv betrachtet und geklont. Das Klonen wurde durch Verringerung der Verdünnung im Konditionierungsmedium innerhalb zwei 96-Ausnehmungs-Platten durchgeführt, eine mit 5 Zellen/Ausnehmung und eine mit 1 Zelle/Ausnehmung. Eine Woche nach dem Klonen wurden Einzelkolonie- Mulden durch Enzym-Immun-Assay (EIA) überprüft. Wenn alle Mulden positiv waren, wurde die Linie als rein betrachtet und zur Stabilitat ein zweites Mal wieder geklont. Wenn nicht alle Mulden als 100 % positiv getestet wurden, wurde eine positive Mulde für das zweite Klonen verwendet. Die Platten wurden 7 Tage nach dem Klonen erneut getestet. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis alle Klone 100 % positiv getestet waren. Die Zellen wurden dann in Wachstumsmedium ausgebreitet und in einem Injektionsmedium in die Peritonal-Ausnehmung von pristanvorbehandelten Balb/c-Mäusen injiziert, mit einer Konzentration von ungefähr 3 X 10&sup6; Hybridomazellen pro Maus.
Vor der Injektion wurde der Flüssigkeitsüberstand von den kultivierten Zellen zur Isotypisierung durch das Ouchterlony- Gel-Diffusions-Verfahren verwendet, Acta Path Microbiol Scand 26:507 (1949). Ungefähr 10 Tage nachdem den Mäusen die Hybridoma-Zellen injiziert wurden, wurde die Ascit-Flüssigkeit von den Mäusen geerntet. Die Ascit-Flüssigkeit wurde dann durch EIA getitert und der IgG-Isotyp-Gehalt wurde mit einem Beckman- ICS-Raten-Nephelometer gemessen.
Die SPITC AS11 Mäuse wurden wie folgt immunisiert. Fünfzig Mikrogramm von SPITC-BSA in vollständigem Freund'schen-Adjuvant (FCA) wurden intraperitonal injiziert, gefolgt von einer 10 Wochen späteren Intraperitonal-Injektion mit 150 µg methylierter SPH-DNA, gefolgt von Intraperitonal-Injektion von BSA in unvollständigem Freund'schen-Adjuvant (FICA). Einen Monat später wurden 150 µg von methylisierter SPH-DNA intraperitonal injiziert, gefolgt von einer intraperitonalen Injektion von BSA in FICA. Einen Monat später wurden 20 µg methyliertes SPH-DNA/Methyl intraperitonal injiziert. Schließlich wurde am Tag der Fusion BSA in Salin intravenös appliziert.
Die SPITC AS13, SPITC AS14 und SPITC AS15 Mäuse wurden wie folgt immunisiert. Fünfzig Mikrogramm von SPITC-BSA in vollständigem Freund'schen Adjuvant (FCA) wurden intraperitonal injiziert, gefolgt von einer 10 Wochen späteren intraperitonalen Injektion mit 100 µg methylierter SPH-DNA, gefolgt von intraperitonaler Injektion von BSA in unvollständigem Freund'schen-Adjuvant (FICA). Einen Monat später wurden 100 pg methylisierte-SPH-DNA intraperitonal injiziert, gefolgt von intraperitonaler Injektion von BSA in FICA. Einen Monat später wurden 20 µg methyhsiertes SPH-DNA/Methyl intraperitonal injiziert, gefolgt von intravenöser Injektion von BSA in Salin. Drei Wochen später wurden 20 µg methylisierte SPH-DNA injiziert. Schließlich würde drei Tage vor der Fusion BSA in Salm intravenös appliziert.
Das methylisierte SPH-DNA-Antigen wurde wie folgt hergestellt. Kalb-Thymus-DNA (10 mg/ml) wurde mit SPH durch das folgende Verfahren markiert: (a) 10 ml von Kalb-Thymus-DNA wurden durch Hitze denaturiert, bei 100ºC für 15 Minuten; (b) 90 ml der SPH- Markierungsmischung aus Beispiel 6 wurden dazu gemischt und die Mischung wurde vor der Dialyse gegen PBS bei 80ºC für 20 Min. inkubiert. Die sulfophenyl-markierte DNA wurde dann mit methylisiertem BSA kombiniert, wobei dem Verfahren gefolgt wurde, das von Johnston et al. in Biochemistry 22, 3453-3460 (1983) beschrieben wurde.
Die durch dieses Verfahren hergestellten Hybridomas waren zur Erzeugung von Monoklonal-Antikörpern mit einer für die Sulfophenyl-Markierung spezifischen Affinität geeignet.

Beispiel 8

(Erfassung von weniger als einem Picogramm des Einfang-Polynukleotids)

Die Erfassung einer sehr kleinen Menge des-Einfang-Polynukleotids ist durch die Verwendung der Hybridisierungsprobe nach der vorliegenden Erfindung möglich, wie dies in Fig. 5 dargestellt ist. Fig. 5 zeigt die Endpunkt-Hybridisierung oder Empfindlichkeit von einer sulfophenyl-modifizierten pUC SLO Plasmid Hybridisierungsprobe für Kalb-Thymus-DNA-Ziel-Polynukleotid.
Ein Nitrozellulgse-Streifen wurde an der oberen Reihe des Streifens mit zwölf 2 µl Kontrollkleksen betupft, die von links nach rechts enthielten (a) das Kalb-Thymus-DNA-Einfang-Polynukleotid mit Konzentrationen von 1 µg, 333 ng, 111 ng, 37 ng, 12 ng, 4 ng, 13 ng, 457 pg, 152 pg, 50,8 pg, 16,9 pg und 5,6 pg und (b) das nicht-markierte pUC SLO Plasmid-DNA-Probenpolynukleotid mit Konzentrationen von 40 ng bis herab zu 0,22 pg, wie dies auf dem Streifen gezeigt ist. Der Nitrozellulosestreifen wurde auch auf der unteren Reihe mit zwölf Kleksen betupft, die die Hybridisierungsprobe enthielten, die zu dem Kalb-Thymus-DNA-Einfang-(Ziel-)Polynukleotid hybridisiert waren.
Die Hybridisierungsprobe wurde wie folgt hergestellt. Zehn Mikroliter der pUC SLO Plasmid-DNA wurden für 10 Minuten gekocht, um eine Lösung zu erhalten, die 3 Mikrogramm des einsträngigen pUC SLO für die Verwendung als das Probenpolynukleotid enthielt. Neunzig Mikroliter von der SPH-Markierungsmischung wurden zu der Lösung aus dem Probenpolynukleotid hinzugefügt. Die Anbindungsreaktion wurde für 10 Minuten bei 80ºC durchgeführt, bevor sie durch das Hinzufügen von 40 µl 2,0 M Succin-Anhydrid (in 100 % Dimethylformid) als die elektrophile Anhalteverbindung angehalten wurde. Die gesamte angehaltene Anbindungsreaktions-Lösung (einschließlich der Markierungsmischung und der SPH-markierten Hybridisierungsprobe) wurde dann zu einer Hybridisierungs-Puffer-Lösung hinzugefügt. Die Hybridisierungs-Puffer-Lösung umfaßte 5X SSPE, 50 % Formamid, SX Denhardts und 100 µg/ml von dem Kalb-Thymus- DNA-Einfang-Polynukleotid. Die Mischung wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert, bevor sie auf die untere Reihe des Nitrozellulosestreifens bei den markierten zwölf Einfang- oder Ziel-Polynukleotid-Konzentrationen aufgetupft wurde. Die Wasch- und Erfassungs-Schritte wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, wobei der affinitäts-gereinigte Protein AS14 Monoklonal-Antikörper als der erste oder primäre Antisulfophenyl-Antikörper verwendet wurde. Es wurde die Durchführung einer enzymatischen Erfassung für 2 Stunden bei Raumtemperatur ermöglicht.
Wie dies in Fig. 5 gezeigt ist, ermöglichte die gemäß der Erfindung verwendete sulfophenyl-markierte Hybridisierungsprobe die Erfassung von 0,22 pg von dem Einfang-Polynukleotid.

Beispiel 9

(Erfassung der Legionella-Pneumophila-DNA)

Es wurde eine sulfophenyl-markierte Hybridisierungsprobe zur Erfassung von Legionella-Pneumophila Einfang-Polynukleotid durch direkte Markierung der gesamten, denaturierten Bakterien-DNA verwendet. Die gesamte DNA wurde von sechs verschiedenen Legionellen-Spezies erhalten: L. Pneumophila, L. Spiritensis, L. Feeleii, L. Gormani, L. Crythra und L. Anisa. Diese sechs verschiedenen Typen von Legionellen-DNA wurden denaturiert und in einer von 1 bis 6 durchnumerierten Reihe in der oben angegebenen Reihenfolge auf fünf Nitrozellulose-Streifen mit Konzentrationen von 20 ng/Kleks aufgetupft, wie dies in Fig. 6 dargestellt ist. Die sechs verschiedenen trägerbefestigten, einsträngigen Legionellen-DNAs dienten somit als sechs verschiedene mögliche Einfang-Polynukleotide.
Fünf verschiedene Konzentrationen (1000 ng, 100 ng, 10 ng, 1 ng und 0,1 ng) von Legionella-Pneumophila-DNA wurden dann wie folgt mit SPH markiert. Fünf Proben von 10 µl Wasser, das die angegebene Menge der Legionella-Pneumophila-DNA enthielt (1000 ng, 100 ng, 10 ng, 1 ng oder 0,1 ng) wurde für zehn Minuten gekocht, um die DNA zu denaturieren Dann wurden neunzig Mikroliter von der SPH-Markierungsmischung hinzugefügt und die fünf Mischungen wurden bei 80ºC für 10 Minuten inkubiert, bevor 40 µl von 2,0 M Succin-Anhydrid als die Anhalteverbindung zu jeder Mischung hinzugefügt wurde. Dann wurde jede Mischung (die Markierungsmischung und die sulfophenyl-markierte Hybridisierungsprobe) zu den genannten Nitrozellulose-Streifen hinzugefügt, von 1 bis 5 vertikal durchnumeriert.
Die Hybridisierungsreaktion wurde über Nacht durchgeführt. Die Hybridisierungs- und Erfassungsmethode entsprachen der vorstehend in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen. Eine ? Hoch-Stringency-Wäsche ? (0,1X SSPE bei 65ºC) wurde vor der in Beispiel 6 beschriebenen Erfassung durchgeführt. Eine Enzymatische Erfassung wurde für 2,0 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Wie dies in Fig. 6 dargestellt ist, hybridisierte die sulfophenyl-markierte Legionella-Pneumophila-Hybridisierungsprobe spezifisch mit dem komplementären Legionella-Pneumophila einfang-Polynukleotid. Die Erfassung, von Legionella-Pneumophila-DNA war somit erreicht.

Beispiel 10

(Affinität von Monoklonal-Antikörpern für die Sulfophenyl-Markierung von einer Hybridisierungsprobe)

Es wurde ein Vergleich der Affinität von dem Maus-Monoklonal- Antisulfophenyl-Antikörpern durchgeführt, die durch neun verschiedene Hybridoma-Zell-Linien nach der Erfindung für die Sulfophenyl-Markierung hergestellt wurden.
Sulfophenyl-markiertes pUC SLO DNA wurde direkt auf Nitrozellulose-Trägerstreifen aufgetragen, mit Konzentrationen vqn 16,4 ng, 5,46 ng, 1,82 ng, 0,60 ng, 202 pg, 67,5 pg, 22,5 pg, 7,5 pg, 2,5 pg, 0,8 pg und 0,27 pg. Weil die markierte DNA direkt von der Markierungsmischung aufgetupft wurde, die nach Beispiel 4 hergestellt wurde, band sich etwas freies SPH an die Nitrozellulose und wurde als farbige äußere Ringe erfaßt, beispielsweise deutlich auf dem AS16-Streifen zu erkennen. Die, Erfassung von der sulfophenyl-markierten DNA wurde mit dem Doppel-Antikörper-Erfassungs-Verfahren durch geführt, das in Beispiel 6 beschrieben wurde.
Die Affinität und somit die Empfindlichkeit für die Sulfophenyl- Markierung war am größten für die Maus-Monoklonal-Antikörper, die von den AS11, AS13, AS14 und AS15 Hybridoma-Zell-Linien erhalten wurden, wie dies in Fig. 7 dargestellt ist. Diese vier Proben von Maus-Monoklonal-Antikörpern zeigten auch eine niedrige Affinität für das freie SPH, was durch das Fehlen der äußeren Ringe der Klekse nachgewiesen ist. Die AS11, AS13, AS14 und AS15 Hybridoma-Zell-Linien wurden beim ATCC hinterlegt.

Beispiel 11

(Erfassung des Einfang-Polynukleotids, in situ)

Die in situ Erfassung von HPV 6 DNA wurde durch die Verwendung einer sulfophenyl-markierten Hybridisierungsprobe nach der vorliegenden Erfindung erreicht. Dies ermöglichte die Erfassung von einer durch HPV 6 verursachten krankhaften Veränderung in einer menschlichen Cervical-Biopsy-Probe.
Die Hybridisierungsprobe wurde wie folgt hergestellt. HPV 6 DNA wurde CsCl-gereinigt, um eine 1 mg/ml Konzentration von doppelsträngiger HPV 6 DNA zu erhalten. Fünfhundert Mikroliter von der HPV 6 DNA wurden dann beschallt, wobei ein Heat- Systems-Sonicator mit einer Mikrospitzen-Probe verwendet wurde. Die Beschaltung wurde für eine Minute mit einem 10 %-igen Ausgangssignal bei einer Einstellung von ungefähr 1,5 fortgesetzt. Nach der Beschallung wurde die DNA denaturiert, indem sie für fünf Minuten im Wasserbad gekocht wurde. Die denaturierte HPV 6 DNA wurde dann durch die Anbindungsreaktion mit SPH markiert. Nach der Anbindungsreaktion wurde die sulfophenylmarkierte, einsträngige HPV 6 DNA gründlich gegen T.E. dialysiert (10 mM Tris HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA).
HPV 6 DNA in der menschlichen Cervical-Biopsy-Gewebeprobe wurde in situ denaturiert, indem 2X SSC und 50 % Formamid bei 70ºC. angewendet wurden. Die Hybridisierungs-Reaktion wurde für 12 Stunden bei 42ºC in 4X SSC und 49 % Formamid durchgeführt. Die sulfophenyl-modifizierte Probe wurde mit einer Konzentration von 5 µg/ml verwendet. Der primäre Antikörper war der affinitäts-gereinigte Kaninchen-Antisulfophenyl-Antikörper (2,3 µg/ml) von Beispiel 5. Der zweite Antikörper war der alkali-phosphatase-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Chemicon 1:2000).
Die Ergebnisse der kolorimetrischen Prazipitationsreaktion auf Enzymbasis, die zur Erfassung der hybridisierten Probe verwendet wurde, sind in Fig. 8 dargestellt. Die dunklen kreisförmigen Bereiche sind Stellen von sulfophenyl-markierter HPV 6 DNA Hybridisierungsprobe, hybridisiert zu HPV 6 Einfang- DNA. Somit ermöglichte die Sulfophenyl-Markierungs-Hybridisierungsprobe die in situ Erfassung von komplementärer HPV 6 Einfang-DNA in der Gewebeprobe.

Beispiel 12

(Verfahren zur Herstellung von Komplexen, die zur Erfassung von Einfang-Polynukleotid verwendbar sind)

Dieses Beispiel zeigt drei Verfahren zur Herstellung von Antisulfophenyl-Antikörper-Komplexen. Die Komplexe können eine Vielzahl von erfaßbaren Anteilen einschließen, wie zum Beispiel ein Enzym; Enzym-Substrat und/oder ein haptenische oder nicht- haptenische Markierung. Die Komplexe können verwendet werden, nachdem Einfang-Polynukleotid mit einer sulfophenyl-markierten Probe reagiert hat, um kleinere Mengen von Einfang-Polynukleotid zu erfassen. Weiterhin kann die Verwendung der Komplexe eine schnellere Erfassung von Einfang-Polynukleotid mit geringerem Hintergrundrauschen vermöglichen.

Verfahren A (Herstellung von enzym-konjugiertem Antisulfophenyl-Antikörper)

Dies ist ein Verfahren zur Herstellung von einem Komplex, der einen primären Antisulfophenyl-Antikörper aufweist, der direkt an Alkali-Phosphatase konjugiert ist. Es können auch andere Enzyme verwendet werden, wie zum Bei, spiel Meerrettich-Peroxidase.
Der Komplex kann durch Verwendung eines Kopplungsverfahrens, das modifiziert wurde, nachdem es von E. Harlow et al. in Antibodies, A Laboratory Manual, Kapitel 9, Seiten 346-347 ("Glutaraldehyde Coupling"), Cold Spring Harbor Laboratory (1988) beschrieben wurde, wie folgt hergestellt werden:
a. Mische 10 mg gereinigte Antisulfophenyl-Antikörper mit 5 mg Alkali-Phosphatase, um eine 1 ml Mischung aus Antikörpern und Enzymen zu erhalten.
b. Dialysiere die Mischung gegen vier Änderungen von 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8).
c. Überführe die Enzym-Antikörper-Mischung in einen Behälter, der ein einfaches und wirksames Rühren des kleinen Volumens ermöglicht. Füge langsam 0,05 ml von einer 1 %-Lösung von Glutaraldehyd zu.
d. Schalte den Rührer nach fünf Minuten aus und ermögliche ein Setzen bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Füge 0,1 ml von 1,0 M Äthanolamin (pH 7) hinzu.
e. Nach 2 weiteren Stunden, dialysiere über Nacht bei 4ºC gegen drei Änderungen von PBS.
f. Rotiere die Mischung bei 40.000 g für 200 Min.
g. Bewahre den Flüssigkeitsüberstand bei 4ºC in Gegenwart von 50 % Glyzerol, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM ZnCl&sub2; und 0,02 % Na Azid auf.
Der Flüssigkeitsüberstand enthält an Alkali-Phosphatase konjugierte Antisulfophenyl-Antikörper. Dieser Komplex kann zur Erfassung der Sulfophenyl-Markierung-von einer Nukleinsäure Probe verwendet werden. Es kann eine verbesserte Erfassung von kleineren Mengen der Sulfophenyl-Markierung möglich sein, weil das Enzym direkt zum Sulfophenyl-Markierungs-Ort zugeführt wird.

Verfahren B (Herstellung von markiertem Antisulfophenyl-Antikörper)

Dies ist ein Verfahren zur Herstellung von einem Komplex, der einen Antisulfophenyl-Antikörper umfaßt, der an einer Biotin- Markierung konjugiert ist. Andere Markierungen, wie zum Beispiel fluoreszierende und chemilumineszente Markierungen, könnten ebenfalls verwendet werden. Der Komplex kann wie folgt hergestellt werden:
a. Stelle eine Lösung aus N-Hydroxysuccinimid-X-Biotin bei 10 mg/ml in Dimethyl-Sulfoxid her.
b. Stelle eine Antisulfophenyl-Antikörper-Lösung von ungefähr 1-3 mg/ml in einem Natrium-Bicarbonat-Puffer bei ungefähr pH 8,0 her. Dialysiere alle reaktiven Amine weg.
c. Füge den Biotin-Ester zu dem Antisulfophenyl-Antikörper mit einem Verhältnis von ungefähr 10-250 µg von Biotin-NHS-Ester pro Milligramm Antikörper hinzu. Der NHS-Ester sollte unter, Rühren bei 4ºC hinzugefügt werden.
d. Inkubiere bei 4ºC für mindestens 3 Stunden.
e. Dialysiere die Antikörper-Biotin-Mischung gegen phosphat-gepuffertes Salin.
Die biotin-markierten Antisulfophenyl-Antikörper, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, können durch die Verwendung von Verbindungen erfaßt werden, die eine für Biotin spezifische Affinität aufweisen, wie zum Beispiel Streptavidin-Alkalin- Phosphatase, Anti-Biotin-Alkalin-Phosphatase oder andere Enzym- Konjugierungen. Dieses Verfahren kann die verbesserte Erfassung von Sulfophenyl-Markierungen ermöglichen, weil die Verwendung eines markierten, primären Antikörpers ermöglicht, daß mehr erfaßbare Markierungen, wie zum Beispiel Biotin-Markierungen, in die Nähe der Sulfophenyl-Markierung gebracht werden.

Verfahren C (Herstellung von sulfophenyl-markierten Enzymen)

Dies ist ein Verfahren zur Herstellung von einem Komplex, der einen Antisulfophenyl-Antikörper umfaßt - sulfophenyl- markierter Alkali-Phosphatase-Komplex.
Der Komplex kann durch ein, das bezüglich dem von T.E. Masen et al. in "An Immunoglobulin-Enzyme Bridge Method for Localizing Tissue Antigens", J. Histochem. Cytochem. 17:563-569 beschriebenen modifizierten Verfahren wie folgt hergestellt werden:
a. Dialysiere die Alkali-Phosphatase gegen 100 mM Natrium-Carbonat-Puffer, pH 9,0. Die Konzentration von der Alkali-Phosphatase kann ungefähr 2 mg/ml betragen.
b. Löse frisch hergestelltes Sulfophenyl-Isothiocyanat in Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 1 mg/ml.
c. Füge zwischen 5 und 100 µl von der Sulfophenyl- Isothiocyanat-Lösung zu jedem ml der Alkali- Phosphatase hinzu.
d. Ermögliche die Inkubation der gemischten Lösung über Nacht bei 4ºC.
e. Dialysiere gegen 50 % Glyzerol, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM ZnCl&sub2;, 0,02 % Na Azid, um gereinigte sulfophenyl-markierte Alkali-Phosphatase zu erhalten.
f. Mische die gereinigte sulfophenyl-markierte Alkali-Phosphatase mit Antisulfophenyl-Antikörpern.
Ein Antisulfophenyl-Antikörper aufweisender Komplex - sulfophenyl-markierte Alkali-Phosphatase wird dadurch gebildet.
Dieser Komplex kann zur verbesserten Erfassung von einem Einfang-Polynukleotid verwendet werden, das bereits mit einer sulfophenyl-markierten Probe reagiert hat. Eine verbesserte Erfassung ist möglich, weil die Verwendung von dem Komplex ermöglicht, daß viele Moleküle der Alkali-Phosphatase in die Nähe von dem Einfang-Polynukleotid oder Einfang-Molekül gebracht werden.
Dieses Beispiel dient nur zur Veranschaulichung der Vielzahl von Komplexen und Verfahren, die zur Erfassung eines Einfang- Polynukleotids verwendet werden können, das mit einer sulfophenyl-markierten Nukleinsäure-Probe reagiert hat. Enzyme, Enzym-Konjugierungen, Haptene und nicht-haptenische Verbindungen, die sich von den beschriebenen unterscheiden, jedoch dem Fachmann bekannt sind, können innerhalb des Schutzbereiches dieses Beispiels verwendet werden.
Nukleinsäure-Proben nach der vorliegenden Erfindung weisen viele Vorteile auf, die die folgenden einschließen:
1. Nukleinsäuren können mit den geladenen Hapten- Markierungen markiert werden.
2. Die geladenen Hapten-Markierungen können in Verbindung mit anderen Markierungen, wie zum Beispiel Biotin- Hydrazid und PHOTOBIOTIN an den Proben angewendet werden.
3. Nukleinsäuren können in zehn oder weniger-Minuten markiert werden.
4. Eine Reinigung der Nukleinsäure ist nicht erforderlich bevor die Nukleinsäure markiert wird.
5. Die bevorzugte geladene Hapten-Markierung zeigt nur geringe nicht-spezifische Markierungen, was ein niedriges Störsignal ergibt.
6. Das Einfang-Polynukleotid und das Einfang-Molekül können durch eine nicht-radioaktive, immunologische Erfassungs- Einrichtung erfaßt werden.
7. Das Einfang-Polynukleotid und das Einfang-Molekül können auch durch die Verwendung einer immunoradioaktiven Erfassungs-Methode erfaßt werden.
8. Die nicht-radioaktiven, immunologischen Erfassungs- Einrichtungen sind einfacher und schneller als immunoradioaktive Erfassungs-Methoden.
9. Die geladenen Hapten-Markierungen sind nicht teuer und stabil.
10. Die Erfassung von weniger als einem Picogramm von Einfang-Polynukleotid ist durch die Verwendung der geladenen Hapten-Markierung und einem nicht-radioaktiven Erfassungs- Verfahren möglich.
11. Die geladene Haptenmarkierung ist nicht-radioaktiv und deshalb sicher zu verwenden.
12. Kein komplex- und zeitaufwendiger Protein-Blockierungsschritt, wie er bei Biotin-Markierungen verwendet wird, ist erforderlich.
13. Die Entsorgung der Reagenzien und Reaktionsprodukte ist einfach-und nicht teuer, wenn nicht-radioaktive Erfassungs- Einrichtungen verwendet werden.,

Claims

1. Nicht-radioaktive, haptenische Probe zur Erfassung eines Einfang-Polynukleotids, mit:

(a) einem Probenpolynukleotid, wobei das Probenpolynukleotid eine Polynukleotid-Sequenz aufweist, die im wesentlichen komplementär zu einer Polynukleotid-Sequenz von dem Einfang- Polynukleotid ist;

(b) wenigstens einer nicht-radioaktiven, geladenen Hapten- Markierung, die ausgewählt ist aus Benzoesäureanion, 4-(Sulfonyl)-Benzoesäureanion und Sulfophenylanion; und

(c) einem Hydrazin-Bindungsanteil, der das geladene Hapten an die N-4-Position von einer Cytosinbase von einem Nukleotid bindet, das auf dem Proben-Polynukleotid angeordnet ist, wobei die Erfassung von dem Einfang-Polynukleotid auf einer immunologischen Reaktion zwischen der nicht-radioaktiven, geladenen Haptenmarkierung und einem für die Markierung spezifischen Antikörper basiert.

2. Probe nach Anspruch 1, die weiterhin eine Abstandsverbindung zwischen dem Bindungsanteil und der geladenen Haptenmarkierung zur Trennung der geladenen Haptenmarkierung von den Probenpolynukleotid aufweist, wobei die Abstandsverbindung eine ausreichende Größe aufweist, um die sterische Störung durch das Probenpolynukleotid wesentlich zu verringern, wenn die geladene Haptenmarkierung mit einer immunologischen Reaktion erfaßt wird.

3. Probe nach Anspruch 1, bei der das Probenpolynukleotid einsträngige RNA umfaßt.

4. Probe nach Anspruch 3, bei der der Bindungsanteil an einen-3'-Terminus von der einsträngigen RNA gebunden ist.

5. Probe nach Anspruch 1, bei der die Haptenmarkierung ünd der Bindungsanteil gemeinsam eine Sulfophenylhydrazin- Verbindung umfassen.

6. Hybridisierungs-Probe, die zum Hybridisieren mit einem Einfang-Polynukleotid geeignet ist, wobei die Hybridisierungs-Probe ein 4-Hydrazinobenzensulfonat-Anion umfaßt, das durch seinen Hydrazin-Terminus kovalent an die 4-Position von einer Cytosinbase von einem einsträngigen DNA- oder RNA-Polynukleotid gebunden ist.

7. Verfahren zur Herstellung einer Hybridisierungs-Probe, die zum Hybridisieren mit einem Einfang-Polynukleotid geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Auswahl eines Probenpolynukleotids, wobei das Probenpolynukleotid eine Polynukleotid-Sequenz aufweist, die im wesentlichen komplementär zu einer Polynukleotid-Sequenz von dem Einfang-Polynukleotid ist;

(b) Auswahl von wenigstens einer nicht-radioaktiven, geladenen Haptenmarkierung, die an einen Hydrazin-Bindungsanteil gebunden ist, wobei die geladene Haptenmarkierung ausgewählt ist aus Benzoesäureanion, 4-(Sulfonyl)-Benzoesäureanion und Sulfophenylanion; und

(c) Binden des Hydrazin-Bindungsanteils an die N-4-Position von einer Cytosinbase von einem Nukleotid, das auf dem Probenpolynukleotid angeordnet ist, in einer Anbindungsreaktion.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Anbindungsreaktion mit einem Bisulfitsalz katalysiert ist.

9. Verfahren zur Erfassung eines Einfang-Polynukleotids, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) das Mischen einer Hybridisierungsprobe und des Einfang- Polynukleotids, wobei die Hybridisierungsprobe umfaßt:

(i) ein Probenpolynukleotid, das eine Polynukleotid- Sequenz aufweist, die im wesentlichen komplementär zu einer Polynukleotid-Sequenz von dem Einfang-Polynukleotid ist;

(ii) wenigstens eine nicht-radioaktive, geladene Haptenmarkierung, die ausgewählt ist aus Benzoesäureanion, 4-(Sulfonyl)-Benzoesäureanion und Sulfophenylanion, wobei die geladene Haptenmarkierung dazu geeignet ist, in einer immunologischen Reaktion zwischen der geladenen Haptenmarkierung und einem zu der geladenen Haptenmarkierung spezifischen Antikörper erfaßt zu wetden; und

(iii) einem Hydrazin-Bindungsanteil, der das geladene Hapten an das Probenpolynukleotid bindet;

(b) Inkubation der Mischung für einen Zeit abschnitt, der ausreichend ist, um das Stattfinden der Hybridisierungsreaktion zwischen dem Einfang-Polynukleotid und der Hybridisierungsprobe zu ermöglichen, um dadurch eine hybridisierte Probe zu bilden;

(c) Trennung der hybridisierten Probe von der nicht- hybridisierten Probe; und

(d) Erfassung des Einfang-Polynukleotids durch Erfassung der geladenen Haptenmarkierung der hybridisierten Probe oder der geladenen Haptenmarkierung der nicht-hybridisierten Probe durch eine immunologische Erfassungseinrichtung, wobei die geladene Haptenmarkierung mit dem für die geladene Haptenmarkierung spezifischen Antikörper reagiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Einfang-Polynukleotid doppelstrangig ist, und das Verfahren zusätzliche Schritte vor dem Schritt der Mischung der Hybridisierungsprobe und des Einfang-Polynukleotids aufweist, wobei die zusätzlichen Schritte umfassen:

(a) Denaturierung des Einfang-Polynukleotids; und

(b) Binden des denaturierten Einfang-Polynukleotids an einen Träger durch Hinzufügen einer Lösung, die das Einfang- Polynukleotid enthält, zu dem Träger

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Antikörper ein Antisulfophenyl-Antikörper ist, der zu einem erfaßbaren Anteil konjugiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der erfaßbare Anteil ein Enzym oder ein Enzymsubstrat umfaßt.

13. Verfähren nach Anspruch 11, bei dem der erfaßbare Anteil eine haptenische oder eine nicht-haptenische Markierung umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Markierung eine Biotinmarkierung ist und der Schritt der Erfassung die folgenden Schritte umfaßt:

(a) in Kontakt bringen der Markierung mit dem Antisulfophenyl-Antikörper; und

(b) in Kontakt bringen des Antisulfophenyl-Antikörpers mit einer Verbindung, die dazu geeignet ist einer spezifischen Affinitätsreaktion mit der Biotinmarkierung unterworfen zu werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Schritt der Erfassung die folgenden Schritte umfaßt:

(a) in Kontakt bringen der geladenen Haptenmarkierung mit einem ersten Antisulfophenyl-Antikörper; und

(b) in Kontakt bringen des ersten Antikörpers mit einem zweiten Antikörper gegen den ersten Antikörper, wobei der zweite Antikörper zu einem erfaßbaren Anteil konjugiert ist.

16. Materialsatz zur Herstellung einer Hybridisierungs- Probe, mit:

(a) wenigstens einer nicht-radioaktiven, geladenen Haptenmarkierung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Benzoesäureanion, 4-(Sulfonyl)-Benzoesäureanion und Sulfophenylanion besteht;

(b) einem Hydrazin-Bindungsanteil zur Bindung des geladenen Haptens an die N-4-Position von einer Cytosinbase von einem Nukleotid, das auf dem Probenpolynukleotid angeordnet ist; und

(c) Einrichtungen zur Katalysierung einer Anbindungsreaktion, wobei der Hydrazin-Bindungsanteil, der die geladene Haptenmarkierung trägt, an das Probenpolynukleotid gebunden wird.

17. Materialsatz nach Anspruch 16, bei dem die Einrichtungen zur Katälysierung ein, Bisulfitsalz umfassen.

18. Materialsatz nach Anspruch 16, der weiterhin eine Anhalteverbindung zum Anhalten, der Anbindungsreaktion umfaßt.

19. Materialsatz nach Anspruch 16, bei dem die an den Bindungsanteil gebundene geladene Haptenmarkierung eine Sulfophenylhydrazin-Verbinudng umfaßt.

20. Materialsatz zur Erfassung eines Einfang-Polynukleotids, mit:

(b) einem zu der geladenen Haptenmarkierung spezifischen 10, Antikörper; und

(c) einem Hydrazin-Bindungsanteil zur Bindung des geladenen Haptens- an die N-4-Position von einer Cytosinbase von einem Nukleotid, das auf einen Probenpolynukleotid angeordnet ist.

21. Materialsatz nach Anspruch 20, der weiterhin Einrichtungen zum Katalysieren der Anbindungsreaktion umfaßt, wobei der Hydrazin-Bindungsanteil, der die geladene Haptenmarkierung trägt, an das Probenpolynukleotid gebunden wird.