JPS60185798A - ウイルス粒子中のｄｎａ又はｒｎａの抽出方法、該方法に基づく検定法及び該方法で使用するキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １、発明の分野 本発明は、ウィルス粒子からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出す
る方法及びウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの検定法に係る。

ここで１検定（−ＩＩａｙ　）Ｊ　なる語は、ＤＮＡ又
はＲＮＡの定性的検出及び定量的又は手足（４的ｄ（す
定の意である。本発明の方法は、患者が特定種のウィル
スに感染しているか否かを決定し、感染している場合に
はこの感染の程度を測定するべく患者からの試料を検定
するのに特に使用され得る。

従来、ウィルス粒子は遠心外”ｒｌｔにより患者の血清
から抽出している。ウィルスＤ　Ｎ　Ａは沈降物から抽
出される。しかし乍ら、沈降物Ｚヒは多縦の夾雑血清蛋
白質が含まれている。該蛋白質は、プロテアーゼを添加
し、フェノール中に、　ｙＪｉ白、ｐ（加水分１實生成
１匁（主にポ白′伐）を抽出することにより除去しｌよ
ければならない。この男含、多１１１のプロテアーゼが
必’Ａ’２−（：あり％　ＩＶ’ｂＷのフェノールを取
扱うのでフェノール・＼の抽出は危険’ｃ　１’ｒう。

一方、蛋白霞は而め℃十分に除去する必′戻がある。蛋
白質が十分ＩＯ除去されないと、・ノイルスＤＮＡはそ
の後の検定Ｉ２１）ｉ譬Ｃニトロセルロースフィルター
ζご付腐しｌよい。

こうし又抽出したＤＮＡ試料は、次にＩ、Ｖ、Ｄ。

Ｗｅｌｌｅｒ　ａｔ　ａｌｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ
、１２７３−Ｉｆ）（１９１３２）　Ｉこ１．己市’ｔ
’））ｉ１’とｌこより１勾定され得る。即ぢ、試料１
）　Ｎ　Ａをニトロセルロースフィルターディスク上に
（：（き、アルカリ変性させ、中和させ、ニトロセルロ
ースディスク上に固定する。

こうして得られた同定化ｓ　ｓ−Ｄ　Ｎ　Ａを放ａｄ能
標識プローブＤＮＡとハイブリダイズさせ、次いでディ
スクの放射活性を測定する。

この方法の間；但点は、患者血？Ｕ中のウィルスＤ　Ｎ
　Ａ　ヲニトロセルロースディスクにｆ」着させるため
に蛋白質から遊（碓させなければならないという点にあ
る。従って、この方法を使用すも場合、蛋白質をフェノ
ールで除去する必要プ＋ｉある。

発明の要約 ここに到り、ウィルスの表面抗原の不浴化単−特異性抗
体、奸才しくはモノクローナル抗体を使用することによ
りウィルス粒子を沈降させることができ、遠心分離によ
り得られるウィルス−レット中に存在し得る不要な夾雑
血清蛋白質を除去することなく、この沈降物から液相中
にウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを抽出できることが発見さ
れた。

この場合、少情の所定の試薬、例えばプロテアーゼ？ｉ
ｌ−砲加し、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを夾雑ウィルス
、Ｈ白′Ｉ（、即ちウィルスＤＮＡ又はＲＮＡζこ１１
ｆ）３イＣ会台（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　Ｌｌてい
る蛋白質から遊離させるたけで十分である。次いで、１
本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを形成後、該ＤＮＡ又はＲＮＡ
をハイプリグイゼーション条件下−Ｃ１尚当な相補的Ｄ
ＮＡで４表（プローブ）することｊごより検定可ｆＩヒ
であり、この検定法の場合、抽出物中に多少蛋白ν（が
バまれていてもイ〕害ではない。この抽出方法は従来使
用していた大１１ｔのプロテアーゼを必要としないので
ＩＪ？Ｉ価であり、加えてフェノールを使用しないので
フェノール取扱に伴う安全上のあらゆる開祖が排除され
るという点で極めて有利である。

Ｑｉ−Ｑ！ｊＪ’＜−性抗体とインキュは一部すること
により付８本からウィルス粒子を沈降させる段階声、ウ
ィルスＤＮＡ又はＲＮＡに密接に会合し℃いるあらゆる
蛋白質からウィルス粒子のウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを
遊ｔ’ｉＩさぜるべくウィルス粒子のキャプシドを開く
段階と、ウィルスＤＮＡ又はＲＮ　Ａ　：ｒ、３゜液相
中に抽出する段階と、液相を固］（Ｊから分雛する段階
とを含んでいるとして定義することができる。

更に、ＤＮＡ又はＲＮＡ試料の異なる６１１賊ζこ対し
て２種類のハイブリダイゼーシヨンを実施することによ
り、１本鎖ＤＮＡ又はＩｔＮＡ、１り１１えばウィルス
Ｄ　Ｎ　Ａ又はＲＮＡを効率的かつより正確に検定でき
ることが発見された。Ｉ　、ＶＪ）　、Ｗｅ　ｌ　ｌ　
ｅ　ｒｅｔ　ａｌ　、止揚ｌＬよる従来の方法の場合Ｗ
氏ｒト・）をフィルターに固定化させ、可溶性の標識プ
ローブＤＮＡを１史用後、未結合物質を除去し、該物質
の標識量をｔｌｉｌｔ定している。本発明の新規方法で
は、同相に付着させたウィルスＤＮＡの一部（フラグメ
ントＡ）とハイブリダイズさせることＺこよりつイル、
２．ＤＮＡ又はＲＮ　Ａ　／’、５試料から除去する。

これと同１ｔ、７ｉし又は別１１＾１１Ｌ１つ・ｆシス
ＤＮＡの別の領域（フラグノン］・Ｂ）から形成された
標識プローブＤ　Ｎ　Ａを、固定化ＩＪ　Ｎ　Ａ　６Ｌ
ハイブリダイズしているか又はするウィルスＤＮＡ又は
Ｉｔ　Ｎ　Ａ試料とハイブリダイズさせる。こうして、
試料が検定すべきウィルスのＤＮＡを含んでいる場合、
該試料は、内当なハイブリダイゼーション条件下で同相
（フラグメントＡ）と標品（プローブ（フラグメントＢ
）との双方（Ｌハイブリダイズする。その結果、不要性
の標識物質が生成される。この物）直をｊｊＪ　ｇ性圏
識プローブ（フラグメントＢ）から分ｉ’ｊＧ　Ｌ、、
不ｉｉ：（１生′吻り１中の標識量を１灸出又はｔｌｌ
Ｊ定するべく適当な試験に課す。

上記２つの発見を組合わせ℃、上記単一特異１生抗体沈
降法ＩＬよりウィルスｌ）　Ｎ　Ａ又はＲＮ　Ａを抽出
し、こうしｃ　（ｊｆられ、た核酸を上記２部ｆｔｋハ
イプリタ゛イセ゛−ジョン険定法′む検定１−ると’Ｉ
Ｉこ有利である。この２つの方法には重要な相互依存性
がある。抽出されたウィルスＤＮＡ又はＲＮＡ試料はウ
ィルス性及び血清蛋白質の双方を含んでいるので、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ試料をイーキング（］司定）ｌこよりニト
ロセルロースに不溶化させる従来方法で検定するのは不
適当である。ＤＮＡ又はＲＮＡは蛋白質の存在下ではニ
トロセルロースに適確に付着しないであろう。蛋白質の
抽出には付加工程が必要であり、フェノールを使用し、
核酸が損失し得るので、可能であればＤＮＡ又はｆｌＪ
Ａ試料をそれ以上処理しないことがより好ましい。２部
位ハイブリダイゼーション検定法では、ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ試料のウィルスから抽出後の付加的処理を省略できる
。更に、検定の特異性が改良される。

血清由来の夾雑ＤＮＡは従来の遠心分離法と同様にウィ
ルス粒子沈降物と共にトラップされ得るが、２種類の異
なるハイブリダイゼーションを使用することにより偽陽
性の現われる可能性は減少する。

好適其体例の説明 好ましい２部位式検定法（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ　ａｓｓａ
ｙｍｅｔｈｏｄ　）は、液体試料中Ｉこ存在する疑いの
あるＤＮＡ又はＲＮＡの検定法として定義でき、ＤＮＡ
又はＲＮＡを１本鎖にするのに有効な条件下ζ（７ｇ料
を置く段階と、固相にあってイｉＷ識されておらず、検
定物件下で１１ｉ１記）峠４〔いのあるｌ）　Ｎ　Ａ又
はＲＮ’Ａの核酸配列のＰＪｒ　１の領域とハイブリダ
イゼーションｆｉＪ’　ｆｉ１２な第１の７１？リヌク
レオチド９と、及び液相にあって（・１；成されており
、従ってプローブとして機能し、かつ検定条件下で前記
疑いのあるＩ）　Ｎ　Ａ又はＲＮ　Ａの核Ｉｈｔ配列の
第１の領域とは別個の第２の領１我と、ハイプリダ・ｆ
ゼーションｕＪ能なｉ’ｌ（２のポリヌクレオチドとＩ
Ｌハイノリダイゼーション条件下′Ｃ試料を１疑融さぜ
る段階と、ｌｉ’＝Ｉ相とｒｌｉ：Ｉｌｌとを分Ｐｊｌ
ｔする段階と、同相中の碑識融を測定する段階とを含ん
でいる。（亥１讐配列のｒｌ（１及び第２の領域は、ハ
イプリダイヒ゛−ジョン１−関して相互に排他的（オー
バーラツプしない）でなければならす、従って、第１の
ポリヌクレオチドま第２の領域とハイブリダイズし得す
、第２のポリヌクレオチド９は第１の領域とハイブリダ
イズし得ない。

同相Ｉこある第１のポリヌクレオチド９は、独特のハイ
ブリダイゼーションを許容しイｉｌる程度１こ起こずの
Ｃ仁必要なヌクレオチドの最小数（一般１こ１４乃至１
７）からハイブリダイゼーション容易度に依存する任意
の限界（例えば５００）までの短い配列長のみを必要と
する。該ポリヌクレオチドは、ニトロセルロースディス
クにば−キングすることＩこより、又は他の不溶化支持
体に化学的に結合させることにより、又は第１のポリヌ
クレオチド９のＤＮＡ上の相補的ＤＮＡ配列に付着する
ように支持体のＤＮＡ配列を選択することにより、不溶
性に（不溶化）できる。第３番目の方法の場合、当然の
ことながら第１のポリヌクレオチド９は、試料ＤＮＡに
付着すべき部位と支持体ＤＮＡに付着すベき部位との２
藺のハ・ｆプリグイゼーション部位を形成するのに十分
長いＤＮＡ配列を１１ｉｉｌえている。

１麦ｊ’ｆ　’１−　’−）１よら、１・勃辷全１本Ｉ
Ｌは３４巾ノ了１のハイブリダイゼーションが甘まれで
いる。このり旧ボの利点は、友持体１こイーキングせず
に、「ディツプスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ　）Ｊ法
を用い孜）とい・う点ｊこある。

ディツプスティック法の１１ｈ合、支持体は１本のＤ　
Ｎ　Ａ　（７）　ｒ　＋ｐｉｔＪをイ■し又おり、この
腕の一端は固１＋−イＡイ１１Ｌ（バーキングｊこよっ
て）＋、：ａ定され、他端は１）　Ｎ　Ａ試料の第１の
１ｉｌＩ域に相捕的なりＮＡ配列を含んでいる。該支持
体を検定する溶液に入れ、ハイブリダイズさせるべくイ
ンキュイードする。

プローブとじ℃使用する俗液状の２１■２のポリヌクレ
オチドはＩ’立＋４されており、一般に＊ｔＳ　＋のポ
リヌクレオチドよりも長い配列を有するが、必ずしもそ
うである必・堤はない。一般ζヒヌクレオチ＋！　５０
乃至２０００個の長さである。第２のポリヌクレオチド
９は、従来方法に従い、放射性同位体例えば５２Ｐで標
識され得る。或いは、１９８３年７月１日に英国ケンブ
リッジで開催された第６０４同生化学学会でＡ、ｎＢ、
Ｍａｌｃｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ。が開示した方法番と従い
、西洋ワザビ啄ルオギシダーゼ酵素を用いて酵素標識す
ることもできる。同学会の要約は刊行されており、関連
する要約の開示は珍考頁料として本明細書中ζこ包含す
るものとする。他の標識を使用することもできる。例え
ば、欧州特許用Ｘ（ＩＦＪ　６３８７９号明ＩｖＩＩＩ
＋￥：ｌコ開示さイ（、たエール大学１）、　Ｃ，Ｗａ
　ｒ　ｄ他によるビオチン松幅哉法を１史川することが
できる。この方法゛Ｃは、ビオチン基をデオキシリボ核
酸に化学的ｒこ結合させ、（特にビオチン−１１−ｄＵ
ＴＰ）ニックトランスレーションによりＤＮＡ中ｌこ導
入する。該ビオチン標識ｄ　ｓ　−Ｄ　Ｎ　Ａから、検
出すべきＤＮＡ配列に相捕的な配列を有する１本鎖ＤＮ
Ａを生成し、生成されたビオチン標識ゾローブＩ）　Ｎ
　Ａをハイブリダイゼーション条件下で、例えばニトロ
セルロースフ・イルター上ζヒ好適に固定された検出す
べきＤ　Ｎ　Ａ自已夕１１と１ｄ角虫させる。ハイブリ
ダイゼーションを検出す句ため（仁、ビオチン／ストレ
プトアビジン（５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　）、ビオチ
ン／アビジン、ビオチン／アビジン又は同（）Ｉの反Ｌ
ＩＺｔを使用する。

この鳴合、例えばＲｋ元物質又はビオチン共役アルカリ
フォスファターゼ等の酵素によりストレプトアビジン等
を標識すａ）。

第１及び第２のボリヌクレ］チ白ま、好ましくは組１’
ｔ％　Ｄ　Ｎ　Ａ技６ｔｊ　ｌこよりウィルスのゲノム
から生成されたフラグメント（図面中、フラグメントＡ
及びＢ）である。１４而は、ｃＨＶｌｌ−ＤＮＡをＢａ
ｍＨｌ　でｒｉ′ｆ素、ｔｊ化して得られるフラグメン
トを示している。ｆ、１１４１％　Ｉ）　Ｎ　Ａの調ｊ
１・話は今１」ては常用の方法である。Ｂ順列１炎ウィ
ルスの嚇合、１クイルスＤＮＡの全長のイン−＋３−１
−を汀むプラスミド全体−ｉ　ｌ；ｊｊ用できることが
認められ゛〔いる。ＵａｍＨｌを期用することＩＬより
、ウィルレスＤＮＡ内ζヒ２１固とプラスミド”ＤＮＡ
内に１閏との３個の１所点で１所片が形成され、従って
、一方のフラグメンｌ−ｒ：ｔＩ）　Ｎ　Ａ　、！￥独
から構成され、他方のフラグメントは−アラスミドＤＮ
Ａを尾部に有するウイＩレスＬ）　Ｎ　Ａからｔ１′９
成されている。

２柚類のポリヌクレオチド４１オ、全体が１本ｆ１１（
ｓｓ）ＤＮＡから構成されイするか又ｌｉ２本釦本分部
分望のハイブリダイゼーションに有効な１本鎖部分とか
ら４７７／成され得る。「１本７ｉ）（ｓｉｎｇｌｅ　
−−５ｔｒａｎｄｅｄ　）Ｊ又は［ハイプリダイ−ビー
ジョン可能（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ　）Ｊなる語は
、関連する配列が８８型で存在するという意であると「
１１１解されるべきであり、本文中、１木鎖７１セリヌ
クレオチド９のＩ＋−６成とは、少なくとも閏Ｉ東配列
の１本＜＋１　、ｌ？リヌクレオチドの′ｌヒ成である
とＩＩ杢１’ｌ’Ｆさ＋したいｂ　ｑ”１えば強アルカ
リ又は情をＩＩμ用して＋１　＋１−１）　Ｎ　Ａから
ｓｓ　ＤＮＡを形成する方法はそれ自体公知である。

一般δこ、各ポリヌクレオチ白こ同一のハイノリグイゼ
ーション条件を欧州すにとができる０直って、好ましく
は２１周の７１ぎりヌクレオチ）パをりで質的？乙同時
（Ｌ１弐（：・）と吸触さ１する。ＪＡず；）−１１ら
、該ポリヌクレオチｌ’を厳密に同時ｌこ、又は一方の
的後に他方という順序で試料ｌこ添加すもことができ？
Ｓ０ 次１ｃ　１ハイノリ、マ゛イ１ビージョン湊の不溶性利
料中のＩ）：ｊ　１１：ｉ＜　Ｊ’　ｔｉ、田・用した
ｉｉ！１．ｉｌにの仲１．．ｌｉｔこ１．１（スじて従
〕１（の抗ＩＩバ／］ノ１．咋ル（Ｌ疫１い１！法とし
−ＣＩＩＣ知の方法に、ｈり測定できる。［＋ｔって１
、標識は不耐性イ（料から１＋ｌｊ　４を１１ｉ１５．
’Ｑ−４ることができ、或いは液相中の１１川定１直か
ら、１ト’ｔしてＪｌ（ＩＩ７１１直とＪ七・トンずに
とができる。

４−ベーＣのウィＪレスはう゛＜＋ｆ＋ｉ　Ｉ丸ハル・
代もっ又いろ。−：’ｊ’、ｌヒ、リベこのつ・ｆルス
は１月くＡ又はＲＮ　Ａを；′弓む侯吉、核を包囲し王
おりかっＩ！ｉｌｌ訳された蛋白゛ｅｔをン（む１−１
″シソｌ−”又は外被をもっている。ある１重のウィル
スは、一般に脂質、蛋白質及び炭水化１１勿からノ又る
キャプン１を辛皮値するエンベロープを１＃ｉｉえてい
る。他のウィルスにはこめエンベロープがなく、印であ
る。エンベロープを有するウィルスは、エンベロープ内
に局在する表面抗凪をもっている。計のウィルスはキャ
プソド辰面に表凹抗Ｊｅｔをもっている。本発明の適用
１が可（（（１なウィルスは、ｉｌｌえばＢ型肝炎、Ｄ
型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、」）、に帯状ヘル
ペス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、単純団ヘルペ
ス、ＥＢウィルス、ポックスウィルス、特にＪＸ′−１
，唐、ワクンニア、７６シレボウイルス、特にアデノウ
ィルス、ノＱ、Ｑボウイルス、ピコルナウィルス、例え
はポリオ、ＦＭＤウィルス及びＡ型肝炎、レオウィルス
、ロタウィルス、ノ？ラミクツウィルス、！１イに麻疹
、ジステンパー及び呼吸ｉ生シンシチウム（ｌｔ　Ｓ　
）ウィルス、オルトミクンウイルス、特にインフルエン
ザウィルス、ラブドウィルス、特に狂犬病ウィルス、ト
ーゲｒンイルス、′１〕にアルボウィルス１１’ｑ、及
びコロナウィルス、−７−ルブルグ及びエトラ（　ｐ＋
Ｉｏｌａ）つ・イルスである。Ｂ型叶ル＞は轟然のこと
なか’＞　＋ｕ１“：ｊＪζ１，１□邑にＩＩ）Ｉ　ｉ
Ａしている。サイトメガロウィルス（ＣへＩＶ）は＋’
ｌｒ　、’Ｊミｊｌ，Ｉの多くの１：１子官に＋ｉ％犬
ｌ，１１化・ＩＩ−￥力え、１・ｉ．：：　ｉ眼中に１
１体から伝染され得る。

本文中、　ｌ−　’Ｉ’−　−　１＃　！’／Ｇ　ｌ生
Ｄｉ．体（　ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔ■）ｏｎ
ｌｙ　）　ｌ　ｉ．’１：る，１１４は、ｅツクローナ
ル抗体及び同一ウィルスのりｆ．ｆる用５１〜ンに：＜
Ｊし．て多重画のＣ１′Ｌ−・侍′己１手多１曲抗１１
・の意である。

本．１１明り力ｆ）６の利点は、ウィルス：ｊ１１１子
を高ＩＪ工：に４択的に沈］・ｒＣをせるために抗体を
使用するという点に基づいている。モノクローナル抗体
（ＭＣＡ）の形成方法は公知であり、多くが市販されて
いる。

１ｔりえば１・φ（州Ｔ．ｉ許出ｊＩ′Ｉ４・＋Ｓ　３
　８　６　４　２号明イｉｌｌ　−＋ｉｌｊ：　（ＮＲ
Ｉ）Ｃ　）「６県肝炎のモノクローナル抗体」を参照さ
れたい。＋”：　Ｉｔ’ｌｌ　１ｊ’ｌ　ｉｌ：１．は
、ｌノミ，’体−抗１．’ｉ’ｒ１．１合体ヲ，ｌ（ｔ
　成スルへ（　Ｍ　Ｃ　Ａ　’，ｉー伺〕．１さＶるの
に適当な点とｆ．ｆる。抗体を例えはそれ自体公知の方
法でアガロースデルに結合することにより予め不溶化さ
せ、ウィルス粒子を支持体に吸着させる。次に、−、Ｉ
！直的に全血イｆ蛋白質を含んでいる低不溶（生物冴を
化１咬的低速ｒ）℃の遠心分）ｆｌＣにより除去する。

ウィルスλＡ′１．子内にはキャプシドの蛋白質が残っ
ている。しかし乍ら、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを遊ｆ
’！ＩＭさせるために該キャプシド蛋白質を抽出する必
要はない。キャプシドは極めて容易に壊して開くことが
でき，Ｉ）ＮＡ又はＲＮＡは、前出の従来方法による全
ｉ（ｎ　ｍ蛋白質の加水分ｉ’＋ｖｌに必要なすより著
しく少）・土の酵素を用いて会合蛋白質から遊＋’ｉｆ
ｆｉさせることがＣきる。

一般に、１′（ぞ素１吏用トよけ従来の必要扉、の５０
チ未満、好ましくは３５チ未満である。このステップに
続き、検定に十分な量が抽出できるようにＩ）　Ｎ　Ａ
又はＲ　Ｎ　Ａは（べめて容易に水ＩＩＩに移る。水相
は不可ｌＩ痒的にある程ｌ茂のキャプシド蛋白質を含ん
でいるが、本発明の２部位式検定法は蛋白質の（Ｔ在に
影ｉｔ、’′）されｌ、ｆいので、この点は間；Ｉ直に
ならない。

本゛＋６明は、全鴻ウィルス、’ｔｌｒにヒト、ヒト以
外の１；すｊ物又は、１′１α物に感染可能なウィルス
に適用できる。試料はウィルス感染の８゛ノ［いりある
患者から得られ、例えは血清又は尿試料でありｉ？Ｊる
。更に試４斗は、１１・１１えば純度を検んする」場合
には、血液銀行のＩａ　７１′ｉ、であってもよい。あ
る商のウィルスは核中にＲＮ　Ａを１ζ゛んでいるが、
ｃ、ＤＮＡ　；ｉ？リヌクレオチドを用いることにより
同保の方法で検定することができる。

本発明は、ｌ）￥定的にはウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの
全検定、即ちτフィルスＤＮＡ及びＲＮＡの抽出と２１
′Ｉｔｓ位ハイブリダイゼーション検定との組合せにお
いて使用するキットに係り、該キットは、（１）　ウィ
ルスの表面抗原の単一１１ヤ異（」ミ、好まし゛　くは
モノクローナル抗体と、 （２）（−１′Ｌ１，１ｉｌ！されておらず、１本（１
１の形！ン↓１にある↓場合、ウィルスＤＮＡ又はＲＮ
Ａの核酸配列の８ｔ１の領域にハイブリダイズ可能な第
１の４ＩＪヌクレオチドと。

（３）標、ｌ）（されており、１本鎖の形態にある場合
、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの核１“疲配列のう１へ１
の領域とは別個の第２の領域にハイブリダイズ可能な第
２のポリヌクレオチドさから構成される。

キットは更に、 （４）単一１時異性抗体を不溶化させるための支持体イ
（米１　、と、 （５）　ＳＳ形の佛１のＨｑ　ＩＪヌクレオチドを不溶
化させるための支持体月料と、 （６）１本鎖の形ｊ、１−―にある場合、１本鎖の形１
測の各月？リヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列
を含み、キットを試１険するための１対照（コントロー
ル）ＪＤＮＡ又はＲＮＡと、 （カ　ウィルスのキャプシドを開き、ウィルスＤＮＡ又
はＲＮＡに密接に会合している蛋白′べから該ウィルス
ＤＮＡ又はＲＮＡを：ｊ！　１ｌｉｌｉさせるための試
薬、４４ｐに酵素さ、のいずれか１１以上をもよみｒ坪
る。

該キットで１史川される。Ｉ￥リヌクレオチド及び対照
１）　Ｎ　Ａ又はＲＮＡけｄｓ　形であり＋’！＋　％
　キット膓入者がｉｎ　５ｉｔｕで１本！ｊ％にできろ
。

液体試料からウィルスＤＮＡ又はＲＮ　Ａを生成する方
法は、そのｒ仝の（・（定千ｆ’ｊ：；きに拘らり゛そ
れ自体新）す、である６考イーｒ）れ、１・Ｃって、不
発Ｑ１．Ｊはこの生成方法自体を包含している。

以下、本゛・Ｉ−門０）’、−７”、　Ｈｌｉ　ｌ’ｌ
　’５’（、ｉｅ　’ｄ　−６′ｊ！、″、イ＋１ｉｌ
ｌ’１ １３Ｊ［り肝ｌ＋、：ウイルス ＋ｌ）　ｌ）　Ｉｌｌ’月１１にτノイルスからのウィ
ルスＤＮＡのｉｉ”Ｉ琵 ＩｌＦ’　ＦＴ　＋３　、ｑ　−１，（’ｒｌ　ｐｇ：
）肝炎ｅＧ而面Ｊｔノ１（（のａ決定基のモノクＤ−ｆ
ルｌ’Ｑ、１・Ｌｌ　ビーズ＋＋ｕ５当たり：＋５　白
質１０ｆ）イ（敲＋’、＋Ｌ）、＝ＣＮ　Ｈｙ　ｒ’ｉ
’ｉ　ｉＪ：化レファロース４Ｂを１吏用し〔１，１，
１，１，１＋＜の而・ｉ□１メハらウィルス１１７ｒを
沈１・予させた。前式己のようζこ（皮接した７ｇツタ
状セファロースビーズ５０７１℃を患者の血清１５０μ
μと混合し、室（晶で２時間インキュベートした。ビー
ズを沈澱させ、上イ〃を除去し、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　−Ｈ（Ｊ　。

ｐＨ８、１５０ｎｔｓ４　ＮａＣ９，、１０ｍＭ　Ｅｌ
）ＴＡ、　０．２％ＳＤＳ及び１　ｍｙ　／　１ｎｌプ
ロナーゼを蟲−（Ｆする混合イｆｋ　１５０μａで直噴
した。誠イト（を３７℃で２時間インキュベートし、ウ
ィルスＤＮＡをａ・１」・上〈１°ずを除去した。

木糞＊十Ａ）の、ＩＩ２°Ａ製 Ｂハ１！肝炎つィルスＤＮＡプラスミ１ン、、Ｄ　Ｈ２
０−ＨＢＶからウィルスＤＮＡを１ｎ製し、ＢａｍＨ１
消化により２部分に切１析した。２個のフラグメントを
分取アガロース電気法！Ｉ′ＩＪＩにより分１７．１Ｎ
　ｔ、た。長い方のフラグメントｔＢ）は下記（３）で
述べるように１吏用した。短い方のフラグメント（ンは
Ｎａ０Ｊｌ処理により１本鎖に形成し、Ｔｒｉｓ　−１
１Ｃ４、ｐｌ！７．０　で中４１１シた１々、ニトロセ
ルロースディスク上に固定化した。これを８０゛Ｃで２
１１３間ベーキングした。

の長い方のフラグメン）（Ｂ１を、放射能標、１．１１
ｉ！ヌクレオヂ１ごを用いて高い比？Ｉ層生がＩＪられ
るまで３２ｐで均一にニックｒ：＋ＩＩ　ＮＲＬ／た。

抽出したウィルスＤＮＡ４０１＋１をアルカリ１０７ｄ
Ｌで５分間究件さ（ｔた侵、１０７Ｊのｉ’ｒｉｓ−ｉ
ｉｃｇ　、　ｐＨ７，０テ中４１１させた。上７尼ＨＢ
　Ｖ　３２ｐ　−ＤＮＡ２０口ｊｉ／ｍｌをハイブリダ
イゼーション混合物に添加した。これを沸１冊水浴中で
３分間加熱した後、氷上で冷却した。ハイブリダイゼー
ション混合物の構成成分の最終濃度が５ＸＳＳＣ（０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ１）
、Ｆｉｃｏｌ、ＢＳＡ、　ＰＶＰ及びＳＤＳ各０、５　
ｍｅ）　／　ｍｅ　、及びホルムアミド５０容ｉ：：’
、　％となるように、該混合物１４０７Ｊを各変ｊ’ｌ
：試月に添加した。試料−プローブ混合物をポリビニル
トレー内の直径１０ｍ１πのウェルに入れ、上記（２）
で調製したニトロセルロースディスクを各ウェルに覇王
した。３７℃で１５時間ハイブリダイズさせた。次にデ
ィスクを洗浄し、シンチレーションカウンターで測定し
た（　Ｉ　、Ｖ、Ｄ、Ｗｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

止揚参照）。

実施例　２ の調製 モノクローナル抗体を中和するサイトメガロウィルス（
Ｌ、Ｐｅｒｅｉｒａ　ｅｔａｌｌｌｎｆｅｃｔ　、Ｉ＋
ｎｎｕｎ３６；９２４−９３２（１９８２））でビーズ
を被覆した以外は、実施例１０段階（１）を反復した。

室温で２時間インキュベート後、ビーズｍｌ当たり蛋Ｆ
ｌ　ｌ′’Ｉ　ｌ　（ｌ　ｒ、ｒソも七曲用して患１・
ｉの尿からウィルスを沈降させた。回出に固定比したウ
ィルスを２゜ｍ＆Ｉ　１ｒｉｓ　ＨＣＪ　ｐｌ！８．０
、１５０　ｍＭ　ＮａＣｆｆ１．１０ｍＭ　ＥＩ］’ｌ
”Ａ、０．２　％　ＳＤＳ及びｌ　Ｑ　／　＋ｒ＋６プ
ロナーゼのｒｉも合液１５０μＵでｉｉ’を化した。３
７℃で２時間インキュベート後、ウィルスＤＮＡを含む
上（Ｉ′１を１・珀去し、プこ。

大ハ゛、　ｉ’？ｔ　ｌ　’Ｊのｔｌ、１．ｌ・ｓ）′
ラスミドでりｌコーン化したウィルス１妃列から〕（・
１当ｆ、（ナイトメガロウイルスＤＮＡフラグメント７
、ｉｇ−Ｊ＋Ｊ択し［Ｊ　、　Ｉ）　、Ｏｒａｍ　ｃｔ
　ａｌ、：Ｊ　、（ｙ　Ｑｌｌ　°　Ｖｌ　ｒ”−−−
雫　１１１　−１２９（１９８２）、］ウィルス抽出′
１；りのプローブに用いた。この大きいウィルスの２ツ
ムは、嬰び旧、Ｂａ＋ｎＨ１，ＩＴｉｎｄｌ　’、’＋
−７（１回の重重・・、ｌ、　；’ｊｌ〜位づともつ′
Ｃいた。１）泊って、）１向ゲノ１１を１ｂｌｌ限エン
ドヌクレアーゼでメ匹Ｊ甲し、数１同のフラグメントを
生成し７た。４１１仏に・１１１回比のない詠２１＋ｔ
Ｊのフラグメントを使用してハイブリダイズさせた。ｔ
１ηに好適な方法としてＯｒａｍ　ｅｔ　ａｌ、の）！
ｉ４示のような唯一のシ１　■制限部位しかもたないフ
ラグメントＨ１２Ｂ２を１吏用した。４．亥フラグメン
トを小さいフラグメント（んと大きいフラグメントｆＢ
ｉとに切１Ｇ？　した。一方（ＡｌをＮａ０Ｉｌで変性
させ、Ｔｒｉｓ　−ＨＣｆｌ　ｐＨ７，０で中和し、ニ
トロセルロースディスク上に固定化した後、８０℃で２
時１１１１ベーキングした。他方のフラグメント（Ｂ）
は、放射能（・′１舗復ヌクレオチドを用いて高い比活
性が＋ｉＪられるまで　５２Ｐでニック？、１１訳した
。

実力色１列　３ Ｄ型肝炎ウィルス（４４−ａｇｅｎｔ　）　の外ｉ’Ｉ
はＢ型肝炎表面抗原と：）４抗原のヌクレオキャプシド
から’ＩＩＷ成されていた。Ｂノ￥１！肝炎表面抗原の
モノクローナル抗（、ｌＲＦ’−ＨＢｓ　−１（ビーズ
ｍｌ当たり市Ｅ（買１０　ｍｙ　）を破痰するか又は昇
面活１うｋ　１ｉｌＪ　（０，３％ＮＰ４０）による固
、イ１」処４ｍｌ！　ｋにポリクローナル１元’Ｊ４−
　ａｇｅｎｔ　（ビーズ罰当たり蛋白４’４１０１）η
）を波４°゛えしたＣＮＢ、ｊ占性化セフ′ｙ゛ロース
４Ｂを用いてウィルス粒子を沈降させた。ｚ　□　ｍ＋
ｖｔ　Ｔｒｉａ−Ｉ（Ｃｆｉ　ｐＨ８，０、１５ｍＭ　
ＮａＣＩＩ、、　１　０　ｒ＋＋ＭＥｌアｒＡ、０．２
％　ＳＤＳ、／ｉびｌ　＋ｈＨ）　／　ｍｌプロナーゼ
の混合ｆｉダ１５０μμでに・Ｉ定化・ウィルスＡ・え
子又はヌクレオキ・ＶゾシＦｉ−消化シ７テＩｔ　Ｎ　
Ａ　６に６！Ｈ；（＝　ｌｌ１１−Ｆ、１１すせた１゛
二、ｉ＋ｑ　ＲＮ　Ａ　、ｌｉｉ　ｉ’ｒ；をＲＮ　Ａ
ゲノムのｃ、　Ｄ　Ｎ　Ａコピーからｊ・またフラグメ
ントでゾｌ」−ブした。

ｃｌ）ＮＡ’：−ヅラスミト　１．ｌ目し３２２に挿入
した。

ｌ’１’Ｉｌｌ’ｉ、’１Ｕたｃ　Ｉｔ　ｔＪ　Ａ　コ
ぎ−ヲしり出し、１ｌｉｌｌ限エンドメクレｙ−（しし
処１ｉｊ　（、てフラグメントを生成し、しｚ椎飼２の
段階（２）及び（３）と同１子に処理した。

Ｂ型肝炎又はサイトメヴロウイルスの場合と異り、ＲＮ
Ａを分ｉ’＋’ｌするアルカリステ゛ノブ処理は省ｌａ
３　したが、それ以外は上記と同一の処理を行った。

ハイブリダイゼーション混合物中に試料を直叫・・′ず
いブこ。

４、ｉ、’：Ｊ　而（’）　ｆｉｃＪ　単７４　＋ｆ＋
！　”ＪＪ図面はＢ型肝炎ウィルス（ｎ　Ｂ　Ｖ　）の
検出に１重用される試−：１５と反応との；・ｔｌ・・
；ｉ説り」図“Ｃある。

第１頁の続き ［株］ｒｎｔ、Ｃｊ４　識別記号　庁内整理番号の発明
者　ジョアオ・ペイドロ　イギリス国、つ・プリド・ヴ
アレン　−・エイ、− テ・モンジャーテ′イノ ０発　明　者　ハワード・クリスタフ　イギリス国、ア
・トーマス　ル・ジエイ、 ロンドン・エヌ・タフ゛リュ働３−５−デイビイルハム
Ｏガーデンズ１１２６ ０ンドン・エヌ・ダブリュ・１１・６・アーオークウッ
ド・ロウド・１０３ ”Ｊ−’ｔｉ−７′、；；′市＋１．Ｉ：（）′ノ１１
（）１１）（和６０イｌ’　／ｌ　Ｉ］４　ｒ（２、発
明の名Ｊｊｌ、　ウｒルス粒子中の１）Ｎ△叉は１で１
刈への抽出ノ”ノ汐い　該１３２人に１．１−づく検定
ン人及び該１３１人　Ｃ・使用りる゛１−ツト ３、抽ｉｌをＪる右 ＝ｌｉ　ｌ’ｌどの関係　１□ｌ　：Ｔ　１．ｉ願人名
　ｆ＋、　ノショノール・リリ−ノ・１゛（ｌ＼ＩＮツ
／ノンＩ・・　１−ボレーｒシ１ン ４　代　叩　人　染工ｊＩ都♀Ｉｉ’＋ｒｉ１名ｌ′ｌ
ｉ宿１１１１１１山目シ’、１１１ｉじル（郵便１ｂ号
ＩＧＯ）電話（（１：ｉ　）　：１．’＋Ａ　ｌｌＧ２
３（１）　１ｆｌｌ　１ｕｌｌ　ｉ’ｆ中、１３２ｊＩ
７ｉ　！ｌｆＩ［ｌニｆ　Ｉｉｌ而）　トｆｉルｆ、ｌ
　ｆｆｉ　’Ｉ　ｒ、ｉｒｌ　ｌと７１ｉｉｌ　する。

〈′））添トド１図面合−別組朱１（：３の）Ｄｊり捕
１１］りる。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）臨床標本中のウィルス粒子からＤＮＡ又はＲＮＡ
   を抽出する方法ｔこおいて、該方法が、ウィルス粒子を
   含む沈降物を形成するべく、標本をウィルス表面抗原の
   不溶化単一特異性抗体とインキュベートすることにより
   標本からウィルス粒子を沈降させる段階と、ウィルスＤ
   ＮＡ又はＲＮＡに密接に会合している蛋白質からウィル
   スＤＮＡ又はＲＮＡを遊離させるべくウィルス粒子のキ
   ャプシｒを開く段階と、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを液
   相ｔこ抽出する段階と、液相を同相から分離する段階と
   を含んでいることを特徴＾する方法。
2. （２）キャプシド°を開き、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡ
   を酵素的に遊離させることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。
3. （３）キャプシドを、従来の抽出方法で標本中の蛋白質
   を加水分解するのに必要な割合より低い割合のプロテア
   ーゼと反応させることを特徴とする特許請求の範囲第２
   項に記載の方法。
4. （４）単一特異性抗体がモノクローナル抗体であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   方法。
5. （５）ウィルスがＢ型肝炎、Ｂ型肝炎又はヘルはスウイ
   ルス科に属していることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項又は第２項に記載の方法。
6. （６）特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記
   載の方法により生成された液体試料中に存在し得るＤＮ
   、Ａ又はＲＮＡの検定方法におい【、該方法が、１本鎖
   のＤＮＡ又はＲＮＡを形成するのに４１効な条件下で試
   料を処理すの、’ｉ４１の領域とハイブリダイゼーショ
   ン可能の核酸配列の第２の領域と検定条件下でハイブリ
   ダイゼーション可能な８ｇ２のポリヌクレオチドとにハ
   イブリダイゼーション条件下で試料を接触させる段階と
   、同相と液相とを分団ｔさせる段階と、同相中の標識肴
   を測定する段階とを含んでいることを特徴とする方法。
7. （７）第１及び第２のポリヌクレオチドに対して同一の
   ハイブリダイゼーション条件を使用し、第１及び第２の
   ポリヌクレオチド９を実質的に同時に試料と接触させる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。
8. （８）　ｍウィルスの表面抗原に対する単一特異性抗体
   と、（２Ｈ本鎖の形態にある場合ウィルスＤＮＡ又はＲ
   ＮＡの核酸配列の第１の領域とハイブリダイゼーション
   可能で標識されていない第１のポリヌクレオチドと、（
   ３００本鎖形態にある場合、第１の領域とは別個であり
   かつハイブリダイゼーションに関して相互にオーツＺ−
   ラップしないウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの核酸配列の第
   ２の領域とハイブリダイゼーション可能で標識されてい
   る第２のポリヌクレオチドと、を含んでいることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の方法で使用するた
   めのキット。
9. （９）　（４）単一特異性抗体を不溶化させるための支
   持材と％（５）１本鎖のｖ；１のポリヌクレオチド１を
   不溶化させるための支持材と、（６）１本鎖の形態ＪＣ
   ある場合、１本鎖の各ポリヌクレオチドとハイブリダイ
   ゼーション可能な配列を含んでおり、キットを試験する
   ための対照ＤＮＡ又はＲＮＡと、（７）ウィルスのキャ
   プシドを開き、ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡ１ｊ−密接に
   会合している蛋白質からウィルスＤＮＡ又はＲＮＡを遊
   離させるための試薬とのいずれか１種以上を更に含んで
   いることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載のキ
   ット。 ０（υ　ウィルスがＢ型１１１炎、Ｄ型１１１炎又はヘ
   ルはス【ウィルスｆ］ｌこ属しているこ吉を特徴とする
   特許請求の範囲第８項又は第９項に記載のキット。 （１υ　試薬（７）が「１１素であることを特徴とする
   特許請求の範囲第９項に記載のキット。 （１２１試薬（７）がプロテアーゼであり、それぞれ１
   つのり３本でのｌ１ｌｉ用に適しておりかつ健来の抽出
   方法で標本中の蛋白ｒｔを加水分）ツγするのに必要な
   鼠より小１．；からｌまるｔｉ’ｊ　（５’ｔ’、をい
   くつか組み合わせた形態であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１１項に記載のキット。 （Ｉ３）単一特異性抗体がモノクローナル抗体であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第８項乃至第１２項のい
   ずれかに記載のキット。