ES2297834T3 - Ensayo homogeneo con sonda genica con un receptor dirigido contra el marcador. - Google Patents
Ensayo homogeneo con sonda genica con un receptor dirigido contra el marcador. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2297834T3 ES2297834T3 ES96113136T ES96113136T ES2297834T3 ES 2297834 T3 ES2297834 T3 ES 2297834T3 ES 96113136 T ES96113136 T ES 96113136T ES 96113136 T ES96113136 T ES 96113136T ES 2297834 T3 ES2297834 T3 ES 2297834T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- marker
- gene probe
- target sequence
- probe
- hybridized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/125—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being enzymatic, i.e. proteins, and non proteins, such as nucleic acid with enzymatic activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
LA INVENCION TRATA DE UN ENSAYO HOMOGENEO DE HIBRIDACION, QUE SE BASA EN QUE LA SEÑAL DE LA SONDA GENICA NO HIBRIDADA VARIA MEDIANTE UN RECEPTOR DIRIGIDO CONTRA EL MARCADOR.
Description
Ensayo homogéneo con sonda génica con un
receptor dirigido contra el marcador.
La invención se refiere a un ensayo homogéneo
con sonda génica, basado en que la señal de la sonda génica no
hibridada se modifica a través de un receptor dirigido contra el
marcador.
Los ensayos con sonda génica han sido descritos
ya en la bibliografía, bajo diversas formas de realización. Formas
de realización utilizadas con frecuencia incluyen el "ensayo de
protección de la hibridación" ("Hybridization protection
assay", Clin. Chem. 35/8, 1989,
1588-1594), la técnica de las "sondas en estrecho
contacto" ("Kissing Probes", Nachr. Chem. Tech.
Lab. 37/7, 1989, 698), y el "principio de transferencia de
energía" ("Energy transfer"). En la Fig. 1 se
representa un principio muy general de un ensayo con sonda génica
según el estado de la técnica: en la primera etapa, se hibridan
entre sí la secuencia diana y la sonda génica marcada, de donde se
obtiene, en presencia de una homología suficiente de ambas
secuencias, construcciones de cadena doble. Adicionalmente, sin
embargo, y por norma general, quedan secciones de una sola cadena de
la sonda génica que no han hibridado. En la segunda etapa, se lleva
a cabo una hidrólisis selectiva, que se distingue porque, sobre la
base de las condiciones elegidas, el marcador de la sonda génica de
una sola cadena resulta atacado de forma esencial, en tanto que el
marcador de la construcción de doble cadena se encuentra protegido
ampliamente contra el ataque hidrófilo. De esta forma, en la tercera
etapa, se mide esencialmente la señal generada por el marcador
unido a la construcción de cadena
doble.
doble.
El inconveniente del procedimiento anterior
radica en que, a pesar del tratamiento con el reactivo de selección
(etapa 2), permanece un resto de la sonda génica de una cadena, que
adultera la medición.
Por consiguiente, la presente invención tiene
como misión poner a disposición un procedimiento para la
determinación de una secuencia de ácidos nucleicos (un "ensayo
con sonda génica"), en el cual la sonda génica marcada que no ha
hibridado contribuye a la formación de una señal no deseada en un
grado menor que en los procedimientos según el estado de la
técnica. La mejora a la que se aspira debe hacer posible, en
especial, una realización homogénea mejorada del ensayo. La
realización homogénea del ensayo se distingue, básicamente, por la
ausencia de una etapa de separación física entre la hibridación del
ácido nucleico y la detección de la señal. De acuerdo con el estado
de la técnica, en procedimientos de este tipo se debe contar con una
influencia distorsionadora especialmente intensa causada por la
sonda génica marcada y no hibridada.
El documento EP 0144913 describe un
procedimiento en el que se utilizan un
"anti-fluorescer antibody" (=
anticuerpo anti-fluorescente) y un
"anti-hybrid antibody" (= anticuerpo
anti-híbrido) para reducir la influencia
distorsionadora de las sondas génicas no hibridadas.
El documento EP 0492570 describe una
modificación química del marcador para reducir la influencia
distorsionadora de las sondas génicas no hibridadas.
De manera sorprendente, la misión se resolvió
por medio del uso en el procedimiento según la invención de un
receptor capaz de fijarse al marcador y, como consecuencia de dicha
unión, de modificar de forma detectable la señal atribuible al
marcador, por ejemplo debilitándola ("quenching" =
extinción). Por lo tanto, por medio del procedimiento descrito a
continuación resulta posible reducir de forma importante la
influencia distorsionadora generada por la sonda génica marcada y
no hibridada y, de este modo, mejorar de manera decisiva la
sensibilidad y especificidad del sistema de ensayo.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento para determinar una secuencia de ácidos
nucleicos (= secuencia diana), en el cual una sonda que contiene
eventualmente la secuencia diana se pone en contacto con una sonda
génica adecuada para la determinación de dicha secuencia diana, de
tal forma que la secuencia diana y la sonda génica hibridan entre
sí, que se caracteriza porque, además
- (a)
- se agrega un receptor que se une al marcador de una fracción que se encuentra, eventualmente, en exceso, de la sonda génica que no se hibrida con la secuencia diana, de manera que se modifica cualitativa y/o cuantitativamente la señal atribuible al marcador, y
- (b)
- la señal atribuible al marcador se detecta cualitativa o cuantitativamente a través de un procedimiento adecuado para ello.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un procedimiento en el que, en una etapa
adicional, el marcador de una sonda génica eventualmente en exceso
y que no se hibrida, resulta parcialmente inactivado por la
incubación con un reactivo de selección.
Una forma de realización preferida de la
presente invención se distingue porque se lleva a cabo, en primer
lugar, la incubación con el reactivo de selección y, a continuación,
la adición del receptor.
Se prefiere, además, un procedimiento en el que
el receptor es un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento
de anticuerpo, un anticuerpo modificado químicamente, o un fragmento
de anticuerpo modificado químicamente, con la condición de que la
capacidad de unión antigénica permanezca conservada en grado
suficiente después de la modificación química.
Otros procedimientos preferidos según la
invención se distinguen porque el marcador es un grupo que tiene
capacidad de fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia,
bioluminiscencia o electroluminiscencia.
En una forma de realización especialmente
preferida de la presente invención, el marcador es un éster de
acridinio, una sulfonamida de acridinio-acilo, un
luminol, un isoluminol, o un derivado de los mismos, un dioxetano,
una luciferina, un éster de ácido oxálico, o una amida de ácido
oxálico.
Igualmente preferido es un procedimiento en el
que el marcador es una enzima.
Resultan adecuados como marcadores todos los
grupos que muestran capacidad de fluorescencia, fosforescencia,
quimioluminiscencia, bioluminiscencia o electroluminiscencia que,
debido a su estructura química, pueden interactuar con una cadena
doble de ácidos nucleicos, por ejemplo, por intercalación en la
cadena doble, de tal forma que se dificulta la unión de un receptor
dirigido contra este grupo, en comparación con la fijación al
correspondiente grupo unido a una cadena sencilla. Especialmente
adecuados son los grupos de ésteres de acridinio y sulfonamidas de
acridinio-acilo que se intercalan en un ácido
nucleico de cadena doble. Resultan apropiados, adicionalmente,
luminol, isoluminol, o un derivado de los mismos, dioxetano,
luciferina, un éster de ácido oxálico, o una amida de ácido
oxálico.
Los compuestos luminiscentes encuentran ya en la
actualidad múltiples aplicaciones. Se les utiliza como indicadores
en inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos luminiscentes (véase
W.P. Collins "Alternative Immunoassays", Editorial John
Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), y bioensayos (ensayos que
no se basan en interacciones antígeno-anticuerpo,
sino en afinidades de fijación entre moléculas, que no son
imputables al sistema inmune), así como también en ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos (véase J.A. Matthews et al.,
"Analytical Biochemistry", 151,
205-209, 1985). Adicionalmente, se emplean
compuestos quimioluminiscentes en el "análisis de inyección de
caudal" ("flow injection analysis"), en detectores
"post-columna" de cromatografía líquida, en la
investigación de fluidos, así como para la fabricación de fuentes
lumínicas artificiales. El uso de derivados de acridinio es
adecuado, además, en procedimientos experimentales de análisis de
alimentos y medio ambiente.
El uso de marcadores de acridinio en ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos se menciona en el documento
EP-A-0 273 115, y aparece descrito
en los documentos EP-A-0 212 951,
EP-A-0 281 390,
EP-A-0 310 312,
EP-A-0 313 219 y WO 89/02896. En el
documento EP-A-0 407 816 se
describen derivados de nucleótidos con base uracilo que, por su
parte, están marcados a través de un espaciador con un compuesto
quimioluminiscente. En el documento
EP-A-602 524 se describen sondas
génicas marcadas con luminiscencia, dotadas de propiedades
ventajosas con respecto al estado de la técnica, así como, entre
otros, un ensayo homogéneo con sondas génicas acorde con el
principio del "ensayo de protección de la hibridación", basado
en las propiedades ventajosas de las sondas génicas que se dan a
conocer.
Los anticuerpos dirigidos contra el marcador se
pueden fabricar, básicamente de manera convencional, por ejemplo
mediante la inmunización de un animal experimental con el marcador y
la subsiguiente selección de anticuerpos adecuados que influyen
sobre las señales. Resultan apropiados tanto anticuerpos
policlonales como monoclonales, siendo preferidos los anticuerpos
monoclonales (MAK, en sus siglas en alemán). Algunos anticuerpos
dirigidos contra marcadores de acridinio luminogénicos poseen la
propiedad de reducir, por la fijación al marcador, la intensidad de
su señal (efecto de extinción). De esta forma, por ejemplo, en un
planteamiento experimental único, se encontró entre 10 MAK de ratón
dirigidos contra un marcador de sulfonamida de
acridinio-acilo luminogénica, que no había sido
seleccionados previamente en relación con sus posibles propiedades
extintoras de señales, un MAK que mostró las propiedades extintoras
de señal deseadas.
Un ejemplo de anticuerpo apropiado es el
anticuerpo monoclonal de ratón secretado por la línea celular BW
90-614-8-04, que ha
sido depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y
Cultivos Celulares GmbH, Mascheroder Weg 1B,
D-38124 Braunschweig, bajo el número de entrada DSM
ACC-2184. Este MAK está dirigido contra la
sulfonamida de acridinio-acilo que se muestra en la
Fig. 2.
La fabricación de sondas génicas adecuadas se
puede llevar a cabo con métodos conocidos en principio por el
experto. En un número elevado de publicaciones, se discuten
expresamente las sondas génicas, por ejemplo en: S.L. Beaucage y
R.P. Iyer: "The Functionalization of Oligonucleotides Via
Phosphoramidite Derivatives", Tetrahedron 49,
1925-1963 (1993), y J. Goodchild: "Conjugates of
Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of Their
Synthesis and Properties", Bioconjugate Chemistry 1,
165-187 (1990).
La estructura de una sonda génica apropiada se
representa, por ejemplo, en la Fig. 3. Evidentemente, la secuencia
de bases que se muestra puede estar sustituida por otra secuencia
adecuada. Igualmente, es posible enlazar otros marcadores conocidos
por los expertos, de acuerdo con procedimientos conocidos por cada
experto, con los ácidos nucleicos utilizados como sonda génica.
En general, el procedimiento según la invención
se puede llevar a cabo sobre la base de todos los procedimientos
conocidos por el estado de la técnica. La tecnología de sondas
génicas según la invención se puede aplicar, de manera
especialmente conveniente, en ensayos homogéneos. Debido a la
intensa extinción de señal causada por un MAK
anti-marcador, es posible desarrollar, bajo una
estabilidad comparativamente apropiada, ensayos homogéneos con
sonda génica esencialmente más sensibles que los conocidos en el
estado de la técnica. Los ensayos homogéneos con sonda génica según
la invención se distinguen, adicionalmente, por una sencilla
manipulación y una fácil capacidad de automatización.
Una variante preferida del procedimiento según
la invención se representa en la Fig. 4: en una primera etapa, se
hibridan entre sí la secuencia diana y la sonda génica marcada, de
donde resultan, en caso de una homología suficiente de ambas
secuencias, construcciones de cadena doble. Adicionalmente, por lo
general, quedan también secciones no hibridadas de la sonda génica,
de una sola cadena. En la segunda etapa, se utiliza un receptor,
por ejemplo un anticuerpo, que es capaz de unirse al marcador de la
sonda génica de una cadena y, como consecuencia de esta fijación,
modifica de manera detectable la señal atribuible al marcador, por
ejemplo debilitándola (extinción). En la tercera etapa, se mide
entonces casi exclusivamente la señal generada por el marcador unido
a la construcción de cadena doble, puesto que el receptor no se une
con el marcador de la sonda génica hibridada o lo hace de forma
menos apropiada que con el marcador de la sonda génica no hibridada.
Este procedimiento presenta la ventaja, frente a otros
procedimientos conocidos, de que el número de sondas génicas de una
sola cadena que contribuyen (de forma no deseada) a la señal de
medición es aún más bajo.
El procedimiento anterior se puede mejorar
llevando a cabo, después de la primera etapa de hibridación, una
hidrólisis de la sonda génica de una sola cadena mediante
tratamiento con un reactivo de selección, y utilizando sólo a
partir de este momento un receptor dirigido contra el marcador, tal
como se ha descrito anteriormente. Gracias a la doble eliminación
previa del marcador de la sonda génica de una cadena, la
subsiguiente medición prácticamente no se ve adulterada por el
marcador que no se ha fijado (véase la Fig. 5).
Una variante de realización preferida adicional
se basa en el "ensayo de protección de la hibridación" (véase
antes) que, de acuerdo con la invención, se distingue porque, en una
etapa posterior, el marcador de las secciones de una sola cadena de
la sonda génica que no han hibridado se modifica de manera
detectable, por ejemplo mediante extinción, a través de la adición
de un receptor capaz de unirse al marcador de la sonda génica de una
sola cadena, de forma que estas sondas génicas no fijadas carecen
de capacidad para adulterar la señal de medición.
En el procedimiento según la invención se
utiliza, preferentemente, como receptor un anticuerpo monoclonal o
policlonal capaz de extinguir la señal, dirigido contra el marcador,
tal como se ha descrito anteriormente.
Los siguientes ejemplos deben explicar la
invención de forma más detallada, pero sin limitarla en modo
alguno.
Ejemplo
1
Para la fabricación de anticuerpos monoclonales,
se inyectaron en ratones BALB-c por vía subcutánea o
intraperitoneal 10 \mug de conjugado de sulfonamida de
acridinio-acilo-BSA, emulsionado en
adyuvante de Freund completo. El conjugado de sulfonamida de
acridinio-acilo-BSA se puede
preparar por reacción de fluorosulfonato o trifluoroacetato de la
amida del ácido
N-(4-metoxifenil)-N-[4-(2-succinimidiloxicarbonil-etil)-benzosulfonil]-10-metil-acridinio-9-carboxílico
(Fig. 2) con BSA, de acuerdo con un procedimiento conocido por el
experto. Se llevaron a cabo 4 ó 5 inmunizaciones adicionales, sin
adyuvante, cada cuatro semanas. Los últimos cuatro días previos a la
fusión, los ratones recibieron inyecciones intravenosas de recuerdo
(10 \mug al día).
Para la preparación de los hibridomas, los
animales inmunizados fueron sacrificados por luxación cervical. El
bazo se extrajo y desintegró de forma aséptica para obtener una
suspensión aislada de células esplénicas en Medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM), exento de suero. Las células se
reunieron por centrifugación (5 min; 1800 rpm) y se lavaron una vez
en DMEM. El número total de células se determinó por recuento con un
hemocitómetro, aplicando la técnica de exclusión de azul tripán.
Las células de mieloma del ratón (SP2/0) se lavaron dos veces en
DMEM exento de suero, se reunieron por centrifugación (10 min, 1000
rpm), y su número se determinó de la forma descrita
anteriormente.
Se mezclaron alrededor de 10^{8} células
esplénicas con 2 x 10^{7} células de mieloma SP2/0 de ratón.
Después de centrifugar durante 10 min a 1000 rpm, se retiró el
sobrenadante y se agregó 1 ml de polietilenglicol (PEG 4000,
Compañía Merck, al 50%) en el recipiente con el granulado. A
continuación, el granulado se resuspendió bajo ligeros golpecitos,
y se incubó durante 1 min a 37ºC.
\newpage
Con la administración de suaves golpes, se
agregaron gota a gota 10 ml de DMEM exento de suero, y la mezcla se
incubó durante 2 a 4 min. Las células fusionadas se centrifugaron,
seguidamente, durante 10 min a 1000 rpm. El granulado celular
obtenido se suspendió en DMEM con suero bovino fetal (SBF) al 20% y
HAT (hipoxantina 0,1 \muM; aminopterina 0,4 \muM; timidina 16
\muM), y se sembró sobre placas de cultivo (Nunc) de 24 pocillos,
con una concentración de aproximadamente 5 x 10^{4} - 10^{6}
células por pocillo. Después de 2 a 3 semanas, se extrajeron
colonias aisladas de células de los distintos pocillos, que se
cultivaron a continuación en pocillos de una nueva placa de
cultivo.
La presencia de anticuerpos específicos para
antígeno en los sobrenadantes de los cultivos se analizó por medio
de la técnica EIA. Cada pocillo de una placa de microtitulación
recubierta con sulfonamida de
acridinio-acilo-BSA (3 \mug/ml)
se rellenó con 100 \mul del sobrenadante, y se incubó a
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se agregaron
100 \mul de un conjugado de peroxidasa (POD)
anti-ratón de conejo, durante una hora adicional a
temperatura ambiente. Después de 30 min de incubación con el
sustrato, se determinó el revelado de color a 492 nm sobre un
procesador Behring-ELISA (BEP). Se seleccionaron los
hibridomas que generaron anticuerpos con una especificidad
antigénica adecuada, y se clonaron utilizando un manipulador de
células aisladas. Para preparar grandes cantidades de anticuerpos
monoclonales, los clones se multiplicaron en cultivos en masa. La
subsiguiente purificación de los anticuerpos monoclonales aislados
se llevó a cabo por medio de cromatografía de proteína A.
Ejemplo
2
La síntesis del oligonucleótido se describe en
el documento EP-A 0 602 524, pág. 49, Ejemplo 14b).
El acoplamiento con la sulfonamida de
acridinio-acilo tuvo lugar según procedimientos
conocidos que aparecen descritos, por ejemplo, en la solicitud de
patente europea anteriormente mencionada.
Ejemplo
3
En tubos de poliestireno se pipetean 50 \mul
de estándar (procedente del ensayo Flash Track® de la Compañía Gen
Probe, Lote 11276/11278 para estándar positivo/negativo). Se agregan
50 \mul de la sonda génica según la Fig. 3 (2,5 x 10^{6} RLU,
tampón Tris 1 M, pH 7), y se hibrida durante 15 min a 60ºC. A
continuación, se agregan 300 \mul de un reactivo de selección
(tetraborato 0,2 M, pH 8), se agita dos veces durante 3 segundos, y
se incuba nuevamente durante 15 min a 60ºC. Seguidamente, los tubos
se dejan enfriar durante 5 min.
La medición se lleva a cabo por la adición de
300 \mul de reactivo de análisis 1 (HNO_{3} 0,1 M,
H_{2}O_{2} al 0,5%) y de reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M),
respectivamente, en un luminómetro (AutoCliniLumat® de la Compañía
Berthold). El tiempo de medición es de 1 seg/sonda.
Se determina una clara diferenciación de señal
entre el estándar positivo y el negativo (véase la tabla).
Ejemplo
4
En tubos de poliestireno se pipetean 50 \mul
de estándar (procedente del ensayo Flash Track® de la Compañía Gen
Probe, Lote 11276/11278 para estándar positivo/negativo). Se agregan
50 \mul de la sonda génica según la Fig. 3 (2,5 x 10^{6} RLU,
tampón Tris 1 M, pH 7), y se hibrida durante 15 min a 60ºC. A
continuación, se agregan 300 \mul de un reactivo de selección
(tetraborato 0,2 M, pH 8), se agita dos veces durante 3 segundos, y
se incuba nuevamente durante 15 min a 60ºC. Seguidamente, los tubos
se dejan enfriar durante 5 min.
A continuación, se incuban durante 1 min a
temperatura ambiente 50 \mul de solución de MAK
anti-marcador (10 \mug/ml de tampón Tris a pH
7,4, Triton X-100 al 0,1%, 1 M).
La medición se lleva a cabo por la adición de
300 \mul de reactivo de análisis 1 (HNO_{3} 0,1 M,
H_{2}O_{2} al 0,5%) y de reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M),
respectivamente, en un luminómetro (AutoCliniLumat® de la Compañía
Berthold). El tiempo de medición es de 1 seg/sonda.
En comparación con el "ensayo de protección de
la hibridación" original (Ejemplo 3), la diferenciación de señal
entre el estándar positivo y el negativo resulta claramente mejorada
por la adición del MAK anti-marcador (véase la
tabla). Se alcanza una diferenciación de señal que, por lo general,
sólo es posible en una forma de realización heterogénea, con
partículas magnéticas como fase sólida (véase el documento
EP-A 0 602 524, pág. 50 a 51, Ejemplo 17).
\newpage
Ejemplo
5
En tubos de poliestireno se pipetean 50 \mul
de estándar (procedente del ensayo Flash Track® de la Compañía Gen
Probe, Lote 11276/11278 para estándar positivo/negativo). Se agregan
50 \mul de la sonda génica según la Fig. 3 (2,5 x 10^{6} RLU,
tampón Tris 1 M, pH 7), y se hibrida durante 15 min a 60ºC. A
continuación, se agregan 300 \mul de un reactivo de selección
(tetraborato 0,2 M, pH 8), se agita dos veces durante 3 segundos y
se incuba nuevamente durante 15 min a 60ºC. Seguidamente, los tubos
se dejan enfriar durante 5 min.
A continuación, se incuban durante 1 min a
temperatura ambiente 50 \mul de solución de MAK
anti-TSH (1 \mug de MAK-TSH de la
Compañía Medix, Nº de catálogo: SPHY052/ml de de tampón Tris a pH
7,4, Triton X-100 al 0,1%, 1 M).
La medición se lleva a cabo por la adición de
300 \mul de reactivo de análisis 1 (HNO_{3} 0,1 M,
H_{2}O_{2} al 0,5%) y de reactivo de análisis 2 (NaOH 0,25 M),
respectivamente, en un luminómetro (AutoCliniLumat® de la Compañía
Berthold).
El tiempo de medición es de 1 seg/sonda.
La diferenciación de señal entre el estándar
positivo y el negativo corresponde, tal como era de esperar, al
Ejemplo 3 (véase la tabla).
Claims (7)
1. Procedimiento para determinar una secuencia
diana, en el que una muestra que contiene, eventualmente, la
secuencia diana se pone en contacto con una sonda génica
adecuadamente marcada para la determinación de esta secuencia
diana, de tal forma que la secuencia diana y la sonda génica marcada
hibridan entre sí, caracterizado porque para reducir la
influencia distorsionadora generada por la sonda génica marcada no
hibridada
- (a)
- se agrega un receptor que se une al marcador de una sección que se encuentra presente, eventualmente, en exceso, de la sonda génica que no ha hibridado con la secuencia diana, a través de lo cual la señal atribuible al marcador se modifica de forma cualitativa y/o cuantitativa, y
- (b)
- la señal atribuible al marcador se detecta cualitativa o cuantitativamente, por medio de un procedimiento apropiado para ello.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque, en una etapa adicional, el marcador de
una sonda génica que se encuentra, eventualmente, en exceso, y que
no ha hibridado, resulta parcialmente inactivada por la incubación
con un reactivo de selección, que produce una hidrólisis selectiva
de la sonda génica de una sola cadena.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque, en primer lugar, se lleva a cabo la
incubación con el reactivo de selección y, a continuación, la
adición del receptor.
4. Procedimiento según una o múltiples de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor
es un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento de
anticuerpo, un anticuerpo modificado químicamente, o un fragmento
de anticuerpo modificado químicamente, con la condición de que la
capacidad de fijación del anticuerpo esté conservada en grado
suficiente después de la modificación química.
5. Procedimiento según una o múltiples de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el marcador
es un grupo con capacidad de fluorescencia, fosforescencia,
quimioluminiscencia, bioluminiscencia, o electroluminiscencia.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el marcador es un éster de acridinio,
una sulfonamida de acridinio-acilo, un luminol, un
isoluminol, o un derivado de los mismos, un dioxetano, un éster de
ácido oxálico, o una amida de ácido oxálico.
7. Procedimiento según una o múltiples de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el marcador es
una enzima.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19534122 | 1995-09-14 | ||
| DE19534122A DE19534122A1 (de) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | Homogener Gensondentest mit einem gegen das Label gerichteten Rezeptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2297834T3 true ES2297834T3 (es) | 2008-05-01 |
Family
ID=7772184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96113136T Expired - Lifetime ES2297834T3 (es) | 1995-09-14 | 1996-08-16 | Ensayo homogeneo con sonda genica con un receptor dirigido contra el marcador. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5858668A (es) |
| EP (1) | EP0763601B1 (es) |
| JP (1) | JP4286334B2 (es) |
| KR (1) | KR970015747A (es) |
| AT (1) | ATE382709T1 (es) |
| AU (1) | AU6560096A (es) |
| CA (1) | CA2185516C (es) |
| DE (2) | DE19534122A1 (es) |
| ES (1) | ES2297834T3 (es) |
| MX (1) | MX9604079A (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19808936A1 (de) * | 1998-03-03 | 1999-09-16 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Photodetektor und seine Verwendung |
| US6723851B2 (en) | 2001-10-31 | 2004-04-20 | Quest Diagnostics Investment Incorporated | Chemiluminescent compounds and use thereof |
| WO2012016936A1 (de) * | 2010-07-31 | 2012-02-09 | Aj Innuscreen Gmbh | Nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen mittels fluoreszenz - quenching |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743535A (en) * | 1984-11-07 | 1988-05-10 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
| EP0144913A3 (en) * | 1983-12-12 | 1986-08-20 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
| JP2509574B2 (ja) * | 1985-08-15 | 1996-06-19 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
| ATE111083T1 (de) * | 1986-10-22 | 1994-09-15 | Abbott Lab | Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze. |
| EP0281390B1 (en) * | 1987-03-02 | 1994-06-22 | Gen-Probe Incorporated | Polycationic supports for nucleic acid purification, separation and hybridization |
| AU630076B2 (en) * | 1987-09-21 | 1992-10-22 | Gen-Probe Incorporated | Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes |
| EP0310312A3 (en) * | 1987-10-02 | 1990-08-16 | M.L. Technology Ventures, L.P. | Non-nucleotide reagents for substituting termini of oligonucleotides |
| PT88665B (pt) * | 1987-10-05 | 1992-12-31 | Ml Tecnology Ventures Lp | Metodo para a marcacao com ester de acridinio e purificacao de sondas nucleotidicas |
| EP0407816A3 (en) * | 1989-07-14 | 1993-01-27 | Abbott Laboratories | Base modified nucleosides |
| EP0492570B1 (en) * | 1990-12-24 | 2001-05-02 | Enzo Diagnostics, Inc. | Method for detecting a target polynucleotide in a sample using a background reducing reagent and composition and kit comprising such a reagent |
| US5830642A (en) * | 1992-04-03 | 1998-11-03 | Amersham Life Science, Inc. | Electrophoresis of nucleic acid fragments |
| EP0602524A1 (de) * | 1992-12-15 | 1994-06-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Chemilumineszenzmarkierte Gensonden und ihre Verwendung in Gensondentesten |
-
1995
- 1995-09-14 DE DE19534122A patent/DE19534122A1/de not_active Ceased
-
1996
- 1996-08-16 DE DE59611456T patent/DE59611456D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-16 ES ES96113136T patent/ES2297834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-16 EP EP96113136A patent/EP0763601B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-16 AT AT96113136T patent/ATE382709T1/de active
- 1996-09-12 AU AU65600/96A patent/AU6560096A/en not_active Abandoned
- 1996-09-13 CA CA002185516A patent/CA2185516C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-13 KR KR1019960039770A patent/KR970015747A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-09-13 MX MX9604079A patent/MX9604079A/es unknown
- 1996-09-16 US US08/712,094 patent/US5858668A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-17 JP JP24524996A patent/JP4286334B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6560096A (en) | 1997-03-20 |
| MX9604079A (es) | 1997-08-30 |
| CA2185516A1 (en) | 1997-03-15 |
| DE59611456D1 (de) | 2008-02-14 |
| EP0763601A2 (de) | 1997-03-19 |
| EP0763601A3 (de) | 2002-01-02 |
| JPH09220100A (ja) | 1997-08-26 |
| US5858668A (en) | 1999-01-12 |
| EP0763601B1 (de) | 2008-01-02 |
| ATE382709T1 (de) | 2008-01-15 |
| CA2185516C (en) | 2008-01-22 |
| JP4286334B2 (ja) | 2009-06-24 |
| KR970015747A (ko) | 1997-04-28 |
| DE19534122A1 (de) | 1997-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3335351B2 (ja) | 推定上のｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白に対するモノクローナル抗体およびその使用方法 | |
| CN100510101C (zh) | 用于检测sars病毒和其它感染性物质的方法和组合物 | |
| KR0173133B1 (ko) | 생체외 증폭을 이용한 폴리뉴클레오티드 검체분석 | |
| KR0171617B1 (ko) | 단백질-핵산 프로브 및 그를 사용하는 면역분석법 | |
| KR870010189A (ko) | HTLV-Ⅲgag/ env 유전자 단백질의 발현 및 정제 | |
| ES2207757T3 (es) | Deteccion de igg especifica para antigenos. | |
| JPH05508219A (ja) | 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ | |
| PT1364057E (pt) | Método de detecção de ligandos | |
| EP0892856A1 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
| WO1997032044A9 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
| US6255060B1 (en) | Method of detecting protein by immuno RNA | |
| CN100480397C (zh) | 用于检测sars病毒的生物芯片 | |
| JPH09504173A (ja) | アデノ関連ウイルスとその早期流産の診断への利用 | |
| ES2297834T3 (es) | Ensayo homogeneo con sonda genica con un receptor dirigido contra el marcador. | |
| JP4097289B2 (ja) | 分析対象物質の検出方法 | |
| US5817469A (en) | Monoclonal antibodies against CK-MB | |
| WO2003040186A1 (en) | Monoclonal antibody against canine distemper virus and method of diagnosis of distemper | |
| RU2733379C1 (ru) | Тест-система для диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций | |
| KR102554337B1 (ko) | 인플루엔자 a h5n1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
| MXPA96004079A (es) | Ensayo homogeneo de sondas genicas con un receptor dirigido contra el marcador | |
| Brus Sjölander et al. | Diagnostic potential of Puumala virus nucleocapsid protein expressed in Drosophila melanogaster cells | |
| EP0599913B1 (en) | Monoclonal antibodies to putative hcv ns5 proteins and methos for using same | |
| RU2726797C1 (ru) | Способ диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций | |
| KR102554330B1 (ko) | 인플루엔자 a h1n1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
| EP0405592A2 (en) | A method for detection of nucleic acid and reagents for their detection |