JPH09220100A - 標識に対するレセプターを用いた等質遺伝子プローブ試験 - Google Patents
標識に対するレセプターを用いた等質遺伝子プローブ試験Info
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- JPH09220100A JPH09220100A JP8245249A JP24524996A JPH09220100A JP H09220100 A JPH09220100 A JP H09220100A JP 8245249 A JP8245249 A JP 8245249A JP 24524996 A JP24524996 A JP 24524996A JP H09220100 A JPH09220100 A JP H09220100A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 標題となる配列を遺伝子プローブとハイブリ
ット形成させて、その配列を決定する方法において、ハ
イブリットを形成しない遺伝子プローブの標識からのシ
グナルを配列決定の障害とならない程度に減少させる方
法の提供。 【解決手段】（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない
遺伝子プローブの場合により余分となる部分の標識と結
合するレセプターを添加し、それにより標識に起因する
シグナルを定性的および／または定量的に変化させ、次
いで（ｂ）目的に適した方法を用いて標識に起因するシ
グナルを定性的または定量的に検出する工程を含んでな
る標的配列の決定方法。
ット形成させて、その配列を決定する方法において、ハ
イブリットを形成しない遺伝子プローブの標識からのシ
グナルを配列決定の障害とならない程度に減少させる方
法の提供。 【解決手段】（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない
遺伝子プローブの場合により余分となる部分の標識と結
合するレセプターを添加し、それにより標識に起因する
シグナルを定性的および／または定量的に変化させ、次
いで（ｂ）目的に適した方法を用いて標識に起因するシ
グナルを定性的または定量的に検出する工程を含んでな
る標的配列の決定方法。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、標識に対するレセプターで非ハイブリッド形
成遺伝子プローブのシグナルを変化させることに基づ
く、等質遺伝子プローブ試験に関する。背景技術 遺伝子プローブアッセイは、様々な態様で文献に既に記
載されている。より多く用いられる態様はハイブリッド
形成保護アッセイ(Clin.Chem.35/8,1989,1588-1594) 、
キッシングプローブ技術(Nachr.Chem.Tech.Lab.37/7,19
89,698) およびエネルギートランスファー原理である。
成遺伝子プローブのシグナルを変化させることに基づ
く、等質遺伝子プローブ試験に関する。背景技術 遺伝子プローブアッセイは、様々な態様で文献に既に記
載されている。より多く用いられる態様はハイブリッド
形成保護アッセイ(Clin.Chem.35/8,1989,1588-1594) 、
キッシングプローブ技術(Nachr.Chem.Tech.Lab.37/7,19
89,698) およびエネルギートランスファー原理である。
【０００２】先行技術による遺伝子プローブアッセイの
極めて一般的な原理は図１で表されている：第一工程に
おいて、標的配列および標識された遺伝子プローブは互
いにハイブリッド形成され、そこから２配列に十分な相
同性があれば二本鎖構造体が得られる。しかしながら、
たいてい、遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖
部分も残る。第二工程では選択的加水分解が行われ、そ
こでは選択された条件のために、本質的に一本鎖遺伝子
プローブの標識が攻撃されて、二本鎖構造体の標識が親
水性攻撃から主として保護される。そして、第三工程で
は、本質的に二本鎖構造体中で結合された標識により生
じるシグナルが測定される。
極めて一般的な原理は図１で表されている：第一工程に
おいて、標的配列および標識された遺伝子プローブは互
いにハイブリッド形成され、そこから２配列に十分な相
同性があれば二本鎖構造体が得られる。しかしながら、
たいてい、遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖
部分も残る。第二工程では選択的加水分解が行われ、そ
こでは選択された条件のために、本質的に一本鎖遺伝子
プローブの標識が攻撃されて、二本鎖構造体の標識が親
水性攻撃から主として保護される。そして、第三工程で
は、本質的に二本鎖構造体中で結合された標識により生
じるシグナルが測定される。
【０００３】上記方法の欠点は、選択試薬との処理（工
程２）にもかかわらず、完全標識を有した一本鎖遺伝子
プローブの残留物が残っていて、それが測定に障害をき
たしてしまうことである。
程２）にもかかわらず、完全標識を有した一本鎖遺伝子
プローブの残留物が残っていて、それが測定に障害をき
たしてしまうことである。
【０００４】
【発明の概要】したがって、本発明は核酸配列の決定方
法（“遺伝子プローブアッセイ”）の提供を目的として
おり、非ハイブリッド形成遺伝子プローブは先行技術に
よる方法よりも小さな程度で望ましくないシグナル形成
に関与しているだけである。特に、目標とした改良で、
改善された均一試験操作を可能にしている。均一試験操
作は、核酸ハイブリッド形成とシグナル検出との物理的
分離工程がないことにより基本的に特徴付けられる。こ
のような方法において、先行技術によれば、非ハイブリ
ッド形成標識遺伝子プローブによる特に深刻な干渉作用
が考慮に入れられねばならない。
法（“遺伝子プローブアッセイ”）の提供を目的として
おり、非ハイブリッド形成遺伝子プローブは先行技術に
よる方法よりも小さな程度で望ましくないシグナル形成
に関与しているだけである。特に、目標とした改良で、
改善された均一試験操作を可能にしている。均一試験操
作は、核酸ハイブリッド形成とシグナル検出との物理的
分離工程がないことにより基本的に特徴付けられる。こ
のような方法において、先行技術によれば、非ハイブリ
ッド形成標識遺伝子プローブによる特に深刻な干渉作用
が考慮に入れられねばならない。
【０００５】その目的は、標識と結合して、結合の結果
として標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減
弱（“消失”）させることができるレセプターを本発明
による方法で用いることにより意外にも達成された。し
たがって、下記本発明による方法によれば、非ハイブリ
ッド形成標識遺伝子プローブによる干渉作用を減少させ
て、それにより試験系の感度および特異性を決定的に改
善することが有意に可能である。
として標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減
弱（“消失”）させることができるレセプターを本発明
による方法で用いることにより意外にも達成された。し
たがって、下記本発明による方法によれば、非ハイブリ
ッド形成標識遺伝子プローブによる干渉作用を減少させ
て、それにより試験系の感度および特異性を決定的に改
善することが有意に可能である。
【０００６】
【発明の具体的説明】このように、本発明は、標的配列
を含有しているであろうサンプルがこの標的配列の決定
に適した遺伝子プローブと接触されて、標的配列および
遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成する方法であ
って、（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない遺伝子
プローブの場合により余分となる部分の標識と結合する
レセプターを添加し、それにより標識に起因するシグナ
ルを定性的および／または定量的に変化させ、次いで
（ｂ）目的に適した方法を用いて標識に起因するシグナ
ルを定性的または定量的に検出する工程を含んでなる核
酸配列（すなわち、標的配列）の決定方法に関する。
を含有しているであろうサンプルがこの標的配列の決定
に適した遺伝子プローブと接触されて、標的配列および
遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成する方法であ
って、（ａ）標的配列とハイブリッド形成しない遺伝子
プローブの場合により余分となる部分の標識と結合する
レセプターを添加し、それにより標識に起因するシグナ
ルを定性的および／または定量的に変化させ、次いで
（ｂ）目的に適した方法を用いて標識に起因するシグナ
ルを定性的または定量的に検出する工程を含んでなる核
酸配列（すなわち、標的配列）の決定方法に関する。
【０００７】本発明は、更に、場合により余分な非ハイ
ブリッド形成遺伝子プローブの標識が選択試薬とのイン
キュベートにより部分的に不活化される追加の工程を含
む方法に関する。
ブリッド形成遺伝子プローブの標識が選択試薬とのイン
キュベートにより部分的に不活化される追加の工程を含
む方法に関する。
【０００８】本発明の好ましい態様では、前記の選択試
薬とのインキュベートが最初に行われ、その後レセプタ
ーの添加が行われる。
薬とのインキュベートが最初に行われ、その後レセプタ
ーの添加が行われる。
【０００９】レセプターがモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、抗体断片、（化学的修飾後に抗原結合能
力が十分な程度に留められているならば）化学的修飾抗
体または化学的修飾抗体断片である方法も更に好まし
い。
ローナル抗体、抗体断片、（化学的修飾後に抗原結合能
力が十分な程度に留められているならば）化学的修飾抗
体または化学的修飾抗体断片である方法も更に好まし
い。
【００１０】更に好ましい本発明による方法では、標識
が蛍光、りん光、化学発光、生物発光または電圧発光の
可能な基からなる。
が蛍光、りん光、化学発光、生物発光または電圧発光の
可能な基からなる。
【００１１】本発明の特に好ましい態様において、標識
はアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスル
ホンアミド、ルミノール、イソルミノールまたはその誘
導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステル
あるいはオキサミドである。
はアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスル
ホンアミド、ルミノール、イソルミノールまたはその誘
導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステル
あるいはオキサミドである。
【００１２】標識が酵素である方法も好ましい。 標識：適切な標識は蛍光、りん光、化学発光、生物発光
または電圧発光の可能なすべての基であり、これらはそ
の化学構造のために、この基に対するレセプターの結合
が対応一本鎖結合基への結合と比較して困難になるよう
に、例えば二本鎖中にはいり込むことで核酸二本鎖と相
互作用することができる。二本鎖核酸中にはいり込んだ
アクリジニウムエステルおよびアクリジニウムアシルス
ルホンアミド基が特に適している。加えて、ルミノー
ル、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、
ルシフェリン、シュウ酸エステルまたはオキサミドも適
切である。
または電圧発光の可能なすべての基であり、これらはそ
の化学構造のために、この基に対するレセプターの結合
が対応一本鎖結合基への結合と比較して困難になるよう
に、例えば二本鎖中にはいり込むことで核酸二本鎖と相
互作用することができる。二本鎖核酸中にはいり込んだ
アクリジニウムエステルおよびアクリジニウムアシルス
ルホンアミド基が特に適している。加えて、ルミノー
ル、イソルミノールまたはその誘導体、ジオキセタン、
ルシフェリン、シュウ酸エステルまたはオキサミドも適
切である。
【００１３】発光化合物は既に様々な用途を有してい
る。それらは酵素イムノアッセイ、発光イムノアッセイ
(cf.W.P.Collins "Alternative Immunoassays",Publish
ers John Wiley & Sons Ltd.,Chichester,1985) および
バイオアッセイ（抗原‐抗体相互作用に基づかずに、免
疫系の一部として考えられない分子間の結合親和性に基
づく試験）、更に核酸ハイブリッド形成アッセイ(cf.J.
A.Matthews et al."Analytical Biochemistry",151,205
-209,1985)もまた指示薬として用いられている。加え
て、化学発光化合物はフローインジェクション分析、液
体クロマトグラフィーのポストカラム検出器、フローサ
ーチおよび人工光源の発生に用いられる。アクリジン誘
導体は更に食品および環境分析の試験方法に適してい
る。
る。それらは酵素イムノアッセイ、発光イムノアッセイ
(cf.W.P.Collins "Alternative Immunoassays",Publish
ers John Wiley & Sons Ltd.,Chichester,1985) および
バイオアッセイ（抗原‐抗体相互作用に基づかずに、免
疫系の一部として考えられない分子間の結合親和性に基
づく試験）、更に核酸ハイブリッド形成アッセイ(cf.J.
A.Matthews et al."Analytical Biochemistry",151,205
-209,1985)もまた指示薬として用いられている。加え
て、化学発光化合物はフローインジェクション分析、液
体クロマトグラフィーのポストカラム検出器、フローサ
ーチおよび人工光源の発生に用いられる。アクリジン誘
導体は更に食品および環境分析の試験方法に適してい
る。
【００１４】核酸ハイブリッド形成アッセイにおけるア
クリジニウム標識の使用は、ＥＰ‐Ａ‐０ ２７３ １
１５と、ＥＰ‐Ａ‐０ ２１２ ９５１、ＥＰ‐Ａ‐０
２８１ ３９０、ＥＰ‐Ａ‐０ ３１０ ３１２、Ｅ
Ｐ‐Ａ‐０ ３１３ ２１９およびＷＯ ８９／０２８
９６に記載されている。ＥＰ‐Ａ‐０ ４０７ ８１６
では塩基ウラシルでのヌクレオチド誘導体について記載
し、その一部ではスペーサーを介して化学発光化合物で
標識されている。ＥＰ‐Ａ‐０ ６０２ ５２４では先
行技術と比較して有利な性質のある発光標識遺伝子プロ
ーブ、特に開示された遺伝子プローブの有利な性質に基
づくハイブリッド保護アッセイ原理による等質遺伝子プ
ローブアッセイについて記載している。 抗標識抗体：標識に対する抗体は、例えば実験動物を標
識で免疫し、その後適切なシグナル対応抗体を選択する
ことにより、常法で基本的に作製することができる。ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の双方が適して
おり、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が好ましい。発光
原性アクリジニウム標識に対する一部の抗体は、標識と
結合することにより、そのシグナル強度を減少させる性
質（消失作用）を有している。このため、例えば、マウ
ス１０匹の単一実験バッチでは、発光原性アクリジニウ
ムアシルスルホンアミド標識に対するＭＡｂがみられる
が、可能なシグナル消失性質に関して予め選択されず、
望ましいシグナル消失性質を有した１つのＭＡｂがみら
れた。
クリジニウム標識の使用は、ＥＰ‐Ａ‐０ ２７３ １
１５と、ＥＰ‐Ａ‐０ ２１２ ９５１、ＥＰ‐Ａ‐０
２８１ ３９０、ＥＰ‐Ａ‐０ ３１０ ３１２、Ｅ
Ｐ‐Ａ‐０ ３１３ ２１９およびＷＯ ８９／０２８
９６に記載されている。ＥＰ‐Ａ‐０ ４０７ ８１６
では塩基ウラシルでのヌクレオチド誘導体について記載
し、その一部ではスペーサーを介して化学発光化合物で
標識されている。ＥＰ‐Ａ‐０ ６０２ ５２４では先
行技術と比較して有利な性質のある発光標識遺伝子プロ
ーブ、特に開示された遺伝子プローブの有利な性質に基
づくハイブリッド保護アッセイ原理による等質遺伝子プ
ローブアッセイについて記載している。 抗標識抗体：標識に対する抗体は、例えば実験動物を標
識で免疫し、その後適切なシグナル対応抗体を選択する
ことにより、常法で基本的に作製することができる。ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の双方が適して
おり、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が好ましい。発光
原性アクリジニウム標識に対する一部の抗体は、標識と
結合することにより、そのシグナル強度を減少させる性
質（消失作用）を有している。このため、例えば、マウ
ス１０匹の単一実験バッチでは、発光原性アクリジニウ
ムアシルスルホンアミド標識に対するＭＡｂがみられる
が、可能なシグナル消失性質に関して予め選択されず、
望ましいシグナル消失性質を有した１つのＭＡｂがみら
れた。
【００１５】高度に適切な抗体の例は細胞系ＢＷ９０‐
６１４‐８‐０４から分泌されるモノクローナルマウス
抗体であり、これはGerman Collection of Microorgani
smsand Cell Cultures GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-381
24 Brunswick に番号ＤＳＭＡＣＣ ２１８４のもと寄
託された。このＭＡｂは図２で示されたアクリジニウム
アシルスルホンアミドに対するものである。 遺伝子プローブの作製：適切な遺伝子プローブの作製
は、当業者に原則として知られている方法を用いて行え
る。遺伝子プローブは比較的多数の公開文献、例えば：
S.L.Beaucage andR.P.Iyer:"The Functionalization of
Oligonucleotides Via PhosphoramiditeDerivatives",
Tetrahedron 49,1925-1963 (1993) およびJ.Goodchil
d:"Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oli
gonucleotides: A Review of TheirSynthesis and Pro
perties",Bioconjugate Chemistry 1,165-187 (1990)
で詳細に開示されている。
６１４‐８‐０４から分泌されるモノクローナルマウス
抗体であり、これはGerman Collection of Microorgani
smsand Cell Cultures GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-381
24 Brunswick に番号ＤＳＭＡＣＣ ２１８４のもと寄
託された。このＭＡｂは図２で示されたアクリジニウム
アシルスルホンアミドに対するものである。 遺伝子プローブの作製：適切な遺伝子プローブの作製
は、当業者に原則として知られている方法を用いて行え
る。遺伝子プローブは比較的多数の公開文献、例えば：
S.L.Beaucage andR.P.Iyer:"The Functionalization of
Oligonucleotides Via PhosphoramiditeDerivatives",
Tetrahedron 49,1925-1963 (1993) およびJ.Goodchil
d:"Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oli
gonucleotides: A Review of TheirSynthesis and Pro
perties",Bioconjugate Chemistry 1,165-187 (1990)
で詳細に開示されている。
【００１６】適切な遺伝子プローブの構造は図３で例示
されている。勿論、示された塩基配列はいずれか他の適
切な配列と置き換えてもよい。当業者に知られる他の標
識も、当業者に知られた方法で遺伝子プローブとして用
いられる核酸に結合させることができる。 遺伝子プローブアッセイ：通常、本発明による方法は先
行技術で知られたすべての方法に基づいて理解すること
ができる。本発明による遺伝子プローブ技術は、均一試
験で有利に用いることができる。抗標識ＭＡｂによる強
いシグナル消失のために、先行技術で知られているより
も実質上高感度の等質遺伝子プローブ試験が、比較的良
好な安定性を有するものとして開発できる。本発明によ
る等質遺伝子プローブアッセイは、簡単な取扱いと容易
な自動性で更に区別される。
されている。勿論、示された塩基配列はいずれか他の適
切な配列と置き換えてもよい。当業者に知られる他の標
識も、当業者に知られた方法で遺伝子プローブとして用
いられる核酸に結合させることができる。 遺伝子プローブアッセイ：通常、本発明による方法は先
行技術で知られたすべての方法に基づいて理解すること
ができる。本発明による遺伝子プローブ技術は、均一試
験で有利に用いることができる。抗標識ＭＡｂによる強
いシグナル消失のために、先行技術で知られているより
も実質上高感度の等質遺伝子プローブ試験が、比較的良
好な安定性を有するものとして開発できる。本発明によ
る等質遺伝子プローブアッセイは、簡単な取扱いと容易
な自動性で更に区別される。
【００１７】本発明による方法の好ましい変法は図４で
概略的に示されている：第一工程において、標的配列お
よび標識遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成さ
れ、そこから二配列に十分な相同性があれば二本鎖構造
体が得られる。ところが、たいてい、遺伝子プローブの
非ハイブリッド形成一本鎖部分も残る。第二工程では、
一本鎖遺伝子プローブの標識と結合して、結合の結果と
して標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減弱
（消失）させることができるレセプター、例えば抗体が
用いられる。第三工程では、二本鎖構造体中で結合され
た標識により生じるシグナルがその後でほぼ排他的に測
定されるが、その理由はハイブリッド形成遺伝子プロー
ブの標識がレセプターと結合できないかまたは非ハイブ
リッド形成遺伝子プローブの標識よりもレセプターとよ
く結合できないからである。公知方法と比較して、この
方法では、一本鎖遺伝子プローブによる測定されるシグ
ナルに対する（望ましくない）関与をより一層小さくで
きるという利点を有している。
概略的に示されている：第一工程において、標的配列お
よび標識遺伝子プローブが互いにハイブリッド形成さ
れ、そこから二配列に十分な相同性があれば二本鎖構造
体が得られる。ところが、たいてい、遺伝子プローブの
非ハイブリッド形成一本鎖部分も残る。第二工程では、
一本鎖遺伝子プローブの標識と結合して、結合の結果と
して標識に起因するシグナルを検出上変化、例えば減弱
（消失）させることができるレセプター、例えば抗体が
用いられる。第三工程では、二本鎖構造体中で結合され
た標識により生じるシグナルがその後でほぼ排他的に測
定されるが、その理由はハイブリッド形成遺伝子プロー
ブの標識がレセプターと結合できないかまたは非ハイブ
リッド形成遺伝子プローブの標識よりもレセプターとよ
く結合できないからである。公知方法と比較して、この
方法では、一本鎖遺伝子プローブによる測定されるシグ
ナルに対する（望ましくない）関与をより一層小さくで
きるという利点を有している。
【００１８】上記方法は、第一ハイブリッド形成工程後
に、上記のように、選択試薬との処理で一本鎖遺伝子プ
ローブの選択的加水分解を行い、その後に標識に対する
レセプターを用いることで、更に改善することができ
る。その後の測定では、一本鎖遺伝子プローブの標識の
事前の二重の排除により、未結合標識により事実上もは
や障害をうけない（図５参照）。
に、上記のように、選択試薬との処理で一本鎖遺伝子プ
ローブの選択的加水分解を行い、その後に標識に対する
レセプターを用いることで、更に改善することができ
る。その後の測定では、一本鎖遺伝子プローブの標識の
事前の二重の排除により、未結合標識により事実上もは
や障害をうけない（図５参照）。
【００１９】更に好ましい変法は、ハイブリッド形成保
護アッセイ（前記参照）に基づいており、本発明によれ
ば、これらの未結合遺伝子プローブが測定されるシグナ
ルの障害を起こさないように、一本鎖遺伝子プローブの
標識と結合できるレセプターの添加により、別な工程で
遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖部分の標識
を検出上変化、例えば消失させることからなる。
護アッセイ（前記参照）に基づいており、本発明によれ
ば、これらの未結合遺伝子プローブが測定されるシグナ
ルの障害を起こさないように、一本鎖遺伝子プローブの
標識と結合できるレセプターの添加により、別な工程で
遺伝子プローブの非ハイブリッド形成一本鎖部分の標識
を検出上変化、例えば消失させることからなる。
【００２０】本発明による方法で用いられるレセプター
は、既に上記されたように、標識に対するシグナル消失
モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが
好ましい。
は、既に上記されたように、標識に対するシグナル消失
モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが
好ましい。
【００２１】
【実施例】下記例は本発明を更に説明するためであり、
それをいずれかに限定するためではない。
それをいずれかに限定するためではない。
【００２２】例１：発光原性アクリジニウムアシルスル
ホンアミド標識に対するモノクローナル抗体の作製 モノクローナル抗体の作製のため、ＢＡＬＢ‐ｃマウス
に、完全Freund'sアジュバントに乳化されたアクリジニ
ウムアシルスルホンアミド‐ＢＳＡ複合体１０μｇを皮
下または腹腔内注射した。アクリジニウムアシルスルホ
ンアミド‐ＢＳＡ複合体は、当業者に知られる方法によ
り、ＢＳＡとのＮ‐（４‐メトキシフェニル）‐Ｎ‐
〔４‐（２‐スクシンイミジルオキシカルボニルエチ
ル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐メチルアクリジニウ
ム‐９‐カルボキサミドフルオロスルホネートまたはト
リフルオロアセテート（図２）の反応により製造でき
る。アジュバントなしに４〜５回の追加免疫を４週間毎
に続けた。融合前の最後の４日間は、マウスに静脈内ブ
ースター注射（１０μｇ／日）を行った。
ホンアミド標識に対するモノクローナル抗体の作製 モノクローナル抗体の作製のため、ＢＡＬＢ‐ｃマウス
に、完全Freund'sアジュバントに乳化されたアクリジニ
ウムアシルスルホンアミド‐ＢＳＡ複合体１０μｇを皮
下または腹腔内注射した。アクリジニウムアシルスルホ
ンアミド‐ＢＳＡ複合体は、当業者に知られる方法によ
り、ＢＳＡとのＮ‐（４‐メトキシフェニル）‐Ｎ‐
〔４‐（２‐スクシンイミジルオキシカルボニルエチ
ル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐メチルアクリジニウ
ム‐９‐カルボキサミドフルオロスルホネートまたはト
リフルオロアセテート（図２）の反応により製造でき
る。アジュバントなしに４〜５回の追加免疫を４週間毎
に続けた。融合前の最後の４日間は、マウスに静脈内ブ
ースター注射（１０μｇ／日）を行った。
【００２３】ハイブリドーマの産生のため、免疫動物を
頸部脱臼により殺した。脾臓を無菌的に摘出し、無血清
Dulbecco's修正Eagle's 培地（ＤＭＥＭ）で脾臓細胞の
個別懸濁物を得るために細断した。細胞を遠心（５分
間；１８００ｒｐｍ）により集め、ＤＭＥＭで１回洗浄
した。全細胞数はTrypan Blue 排除技術を用いて血球計
カウントにより調べた。マウスミエローマ細胞（ＳＰ２
／０）を無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、遠心（１０分
間；１０００ｒｐｍ）により集め、上記のようにカウン
トした。
頸部脱臼により殺した。脾臓を無菌的に摘出し、無血清
Dulbecco's修正Eagle's 培地（ＤＭＥＭ）で脾臓細胞の
個別懸濁物を得るために細断した。細胞を遠心（５分
間；１８００ｒｐｍ）により集め、ＤＭＥＭで１回洗浄
した。全細胞数はTrypan Blue 排除技術を用いて血球計
カウントにより調べた。マウスミエローマ細胞（ＳＰ２
／０）を無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、遠心（１０分
間；１０００ｒｐｍ）により集め、上記のようにカウン
トした。
【００２４】約１０８脾臓細胞をマウスの２×１０７Ｓ
Ｐ２／０ミエローマ細胞と混合した。１０００ｒｐｍで
１０分間の遠心後、上澄を除去し、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ４０００、Merck 、５０％）１ｍｌをペレ
ット含有容器に加えた。次いでペレットをライトタッピ
ング(light tapping) しながら再懸濁し、３７℃で１分
間インキュベートした。
Ｐ２／０ミエローマ細胞と混合した。１０００ｒｐｍで
１０分間の遠心後、上澄を除去し、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ４０００、Merck 、５０％）１ｍｌをペレ
ット含有容器に加えた。次いでペレットをライトタッピ
ング(light tapping) しながら再懸濁し、３７℃で１分
間インキュベートした。
【００２５】無血清ＤＭＥＭ１０ｍｌをライトタッピン
グしながら滴下し、混合液を２〜４分間インキュベート
した、次いで融合された細胞を１０００ｒｐｍで１０分
間遠心した。得られた細胞ペレットを２０％胎児牛血清
（ＦＣＳ）およびＨＡＴ（ヒポキサンチン０．１μＭ、
アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭ）を含有
したＤＭＥＭに懸濁し、約５×１０４〜１０６細胞／ウ
ェルの濃度を用いて２４ウェルの培養プレート（Nunc）
上で培養した。２〜３週間後、個別の細胞コロニーを個
々のウェルから取出し、新たな培養プレートのウェルで
培養した。
グしながら滴下し、混合液を２〜４分間インキュベート
した、次いで融合された細胞を１０００ｒｐｍで１０分
間遠心した。得られた細胞ペレットを２０％胎児牛血清
（ＦＣＳ）およびＨＡＴ（ヒポキサンチン０．１μＭ、
アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭ）を含有
したＤＭＥＭに懸濁し、約５×１０４〜１０６細胞／ウ
ェルの濃度を用いて２４ウェルの培養プレート（Nunc）
上で培養した。２〜３週間後、個別の細胞コロニーを個
々のウェルから取出し、新たな培養プレートのウェルで
培養した。
【００２６】培養上澄をＥＩＡ技術により抗原特異的抗
体について試験した。アクリジニウムアシルスルホンア
ミド‐ＢＳＡ（３μg/ml）でコートされた微量滴定プレ
ートの各ウェルを上澄１００μＬで満たし、室温で１時
間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗マウスペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）複合体１００μＬを室温で更に１
時間かけて加えた。基質と共に３０分間インキュベート
後、４９２ｎｍでの発色をBehring-ELISA プロセッサー
（ＢＥＰ）で読み取った。適切な抗原特異性を有した抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、個別細胞マニピ
ュレーターを用いてクローニングした。多量のモノクロ
ーナル抗体の作製のために、クローンを集団培養で複製
した。その後の個別モノクローナル抗体の精製は、プロ
テインＡクロマトグラフィーにより行った。
体について試験した。アクリジニウムアシルスルホンア
ミド‐ＢＳＡ（３μg/ml）でコートされた微量滴定プレ
ートの各ウェルを上澄１００μＬで満たし、室温で１時
間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗マウスペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）複合体１００μＬを室温で更に１
時間かけて加えた。基質と共に３０分間インキュベート
後、４９２ｎｍでの発色をBehring-ELISA プロセッサー
（ＢＥＰ）で読み取った。適切な抗原特異性を有した抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、個別細胞マニピ
ュレーターを用いてクローニングした。多量のモノクロ
ーナル抗体の作製のために、クローンを集団培養で複製
した。その後の個別モノクローナル抗体の精製は、プロ
テインＡクロマトグラフィーにより行った。
【００２７】例２：遺伝子プローブの作製（図３） オリゴヌクレオチドの合成はＥＰ‐Ａ‐０ ６０２ ５
２４、ｐ．４９、例１４ｂ）で記載されている。アクリ
ジニウムアシルスルホンアミドとのカップリングは、例
えば上記欧州特許出願で記載された公知方法により行っ
た。
２４、ｐ．４９、例１４ｂ）で記載されている。アクリ
ジニウムアシルスルホンアミドとのカップリングは、例
えば上記欧州特許出願で記載された公知方法により行っ
た。
【００２８】例３：抗標識ＭＡｂなしのE.coli検出に関
する等質遺伝子プローブ試験 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μｌ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。測定は、発光計
（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分析器試
薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）および
分析器試薬２（０．２５ＭＮａＯＨ）の各場合に３００
μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サンプルであ
る。
する等質遺伝子プローブ試験 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μｌ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。測定は、発光計
（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分析器試
薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）および
分析器試薬２（０．２５ＭＮａＯＨ）の各場合に３００
μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サンプルであ
る。
【００２９】陽性および陰性標準間で明確なシグナル差
異を調べる（表参照）。
異を調べる（表参照）。
【００３０】例４：抗標識ＭＡｂを用いたE.coli検出に
関する等質遺伝子プローブ試験 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。
関する等質遺伝子プローブ試験 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。
【００３１】次いで抗標識ＭＡｂ溶液（１０μg/mlのト
リス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Triton X-100）
５０μＬをＲＴで１分間インキュベートする。測定は、
発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分
析器試薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）
および分析器試薬２（０．２５Ｍ ＮａＯＨ）の各場合
に３００μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サン
プルである。
リス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Triton X-100）
５０μＬをＲＴで１分間インキュベートする。測定は、
発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品名））で、分
析器試薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５％Ｈ２Ｏ２）
および分析器試薬２（０．２５Ｍ ＮａＯＨ）の各場合
に３００μＬの添加により行う。測定時間は１sec/サン
プルである。
【００３２】先のハイブリッド形成保護アッセイ（例
３）と比較して、陽性および陰性標準間のシグナル差異
は抗標識ＭＡｂの添加で明らかに改善されている（表参
照）。固相として磁気粒子を用いた異種態様だけで可能
になるシグナル差異が得られる（ＥＰ‐Ａ‐０ ６０２
５２４、ｐ．５０〜５１、例１７参照）。
３）と比較して、陽性および陰性標準間のシグナル差異
は抗標識ＭＡｂの添加で明らかに改善されている（表参
照）。固相として磁気粒子を用いた異種態様だけで可能
になるシグナル差異が得られる（ＥＰ‐Ａ‐０ ６０２
５２４、ｐ．５０〜５１、例１７参照）。
【００３３】例５：非特異的ＭＡｂを用いたE.coli検出
に関する等質遺伝子プローブ試験（コントロール実験） 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。
に関する等質遺伝子プローブ試験（コントロール実験） 標準（Gen Probe の Flash Track（商品名）試験、陽性
／陰性標準に関するLot 11276/11278 ）５０μＬをポリ
スチレンチューブ中にピペットで入れる。図３による遺
伝子プローブ５０μＬ（２．５×１０６ＲＬＵ、１Ｍト
リス緩衝液、ｐＨ７）を加え、６０℃で１５分間かけて
ハイブリッド形成させる。次いで選択試薬（０．２Ｍテ
トラボレート、ｐＨ８）３００μＬを加え、２×３秒間
振盪し、再び６０℃で１５分間インキュベートする。こ
の後、チューブを５分間冷却させる。
【００３４】次いで抗ＴＳＨ ＭＡｂ溶液（Medix のＴ
ＳＨ ＭＡｂ １μｇ、バッチ Ｎｏ．：ＳＰＨＹ０５
２／ｍｌのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Tr
itonX-100）５０μＬをＲＴで５分間インキュベートす
る。測定は、発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品
名））で、分析器試薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５
％Ｈ２Ｏ２）および分析器試薬２（０．２５Ｍ ＮａＯ
Ｈ）の各場合に３００μＬの添加により行う。測定時間
は１sec/サンプルである。
ＳＨ ＭＡｂ １μｇ、バッチ Ｎｏ．：ＳＰＨＹ０５
２／ｍｌのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１Ｍ、０．１％Tr
itonX-100）５０μＬをＲＴで５分間インキュベートす
る。測定は、発光計（BertholdのAutoCliniLumat（商品
名））で、分析器試薬１（０．１Ｍ ＨＮＯ３、０．５
％Ｈ２Ｏ２）および分析器試薬２（０．２５Ｍ ＮａＯ
Ｈ）の各場合に３００μＬの添加により行う。測定時間
は１sec/サンプルである。
【００３５】陽性および陰性標準間のシグナル差異は、
予想どおり、例３に相当する（表参照）。
予想どおり、例３に相当する（表参照）。
【００３６】
【表１】
【図１】従来知られた遺伝子プローブアッセイの一般原
理の説明図である。
理の説明図である。
【図２】ＢＳＡと反応させることでアクリジニウムアシ
ルスルホンアミド−ＢＳＡが得られる、Ｎ‐（４‐メト
キシフェニル）‐Ｎ‐〔４‐（２‐スクシンイミジルオ
キシカルボニルエチル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐
メチルアクリジニウム‐９‐カルボキサミドフルオロス
ルホネートまたはトリフルオロアセテートの化学構造式
である。
ルスルホンアミド−ＢＳＡが得られる、Ｎ‐（４‐メト
キシフェニル）‐Ｎ‐〔４‐（２‐スクシンイミジルオ
キシカルボニルエチル）ベンゼンスルホニル〕‐１０‐
メチルアクリジニウム‐９‐カルボキサミドフルオロス
ルホネートまたはトリフルオロアセテートの化学構造式
である。
【図３】本発明の好ましい態様による遺伝子プローブを
表す図である。
表す図である。
【図４】本発明による方法の原理を模式的に説明する図
である。
である。
【図５】本発明による好ましい変法の原理を模式的に説
明する図である。
明する図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ノルベルト、マドリー ドイツ連邦共和国マールブルク、ヘーエン ウェーク、68 (72)発明者 ラインハルト、ケスマルカー ドイツ連邦共和国シュワルバッハ、バーデ ナー、シュトラーセ、６ (72)発明者 トーマス、ロイツシュ ドイツ連邦共和国マールブルク、アム、ツ ィーゲンベルク、８ (72)発明者 オイゲン、ウールマン ドイツ連邦共和国グラスヒュッテン、ツー ム、タールブリック、31
Claims (7)
- 【請求項１】標的配列を含有しているであろうサンプル
がこの標的配列の決定に適した遺伝子プローブと接触さ
れて、標的配列および遺伝子プローブが互いにハイブリ
ッド形成する方法であって、更に（ａ）標的配列とハイ
ブリッド形成しない遺伝子プローブの場合により余分と
なる部分の標識と結合するレセプターを添加し、それに
より標識に起因するシグナルを定性的および／または定
量的に変化させ、次いで（ｂ）目的に適した方法を用い
て標識に起因するシグナルを定性的または定量的に検出
する工程を含んでなる標的配列の決定方法。 - 【請求項２】場合により余分な非ハイブリッド形成遺伝
子プローブの標識が選択試薬とのインキュベートにより
部分的に不活化される工程を更に含んでなる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】選択試薬とのインキュベートが最初に行わ
れ、その後レセプターの添加が行われる、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】レセプターがモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、抗体断片、化学的修飾後に抗原結合能力
が十分な程度に留められている化学的修飾抗体または化
学的修飾抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項５】標識が蛍光、りん光、化学発光、生物発光
または電圧発光の可能な基である、請求項１〜４のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項６】標識がアクリジニウムエステル、アクリジ
ニウムアシルスルホンアミド、ルミノール、イソルミノ
ールまたはその誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、
シュウ酸エステルあるいはオキサミドである、請求項５
に記載の方法。 - 【請求項７】標識が酵素である、請求項１〜４のいずれ
か一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE19534122A DE19534122A1 (de) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | Homogener Gensondentest mit einem gegen das Label gerichteten Rezeptor |
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|---|---|
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Family
ID=7772184
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24524996A Expired - Fee Related JP4286334B2 (ja) | 1995-09-14 | 1996-09-17 | 標識に対するレセプターを用いた等質遺伝子プローブ試験 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0763601B1 (ja) |
| JP (1) | JP4286334B2 (ja) |
| KR (1) | KR970015747A (ja) |
| AT (1) | ATE382709T1 (ja) |
| AU (1) | AU6560096A (ja) |
| CA (1) | CA2185516C (ja) |
| DE (2) | DE19534122A1 (ja) |
| ES (1) | ES2297834T3 (ja) |
| MX (1) | MX9604079A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US6723851B2 (en) | 2001-10-31 | 2004-04-20 | Quest Diagnostics Investment Incorporated | Chemiluminescent compounds and use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4743535A (en) * | 1984-11-07 | 1988-05-10 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
| JP2509574B2 (ja) * | 1985-08-15 | 1996-06-19 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
| ATE111083T1 (de) * | 1986-10-22 | 1994-09-15 | Abbott Lab | Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze. |
| ATE107654T1 (de) * | 1987-03-02 | 1994-07-15 | Gen Probe Inc | Polykationische träger zur reinigung, trennung und hybridisierung von nukleinsäure. |
| PT88550A (pt) * | 1987-09-21 | 1989-07-31 | Ml Tecnology Ventures Lp | Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas |
| EP0310312A3 (en) * | 1987-10-02 | 1990-08-16 | M.L. Technology Ventures, L.P. | Non-nucleotide reagents for substituting termini of oligonucleotides |
| PT88665B (pt) * | 1987-10-05 | 1992-12-31 | Ml Tecnology Ventures Lp | Metodo para a marcacao com ester de acridinio e purificacao de sondas nucleotidicas |
| EP0407816A3 (en) * | 1989-07-14 | 1993-01-27 | Abbott Laboratories | Base modified nucleosides |
| EP0492570B1 (en) * | 1990-12-24 | 2001-05-02 | Enzo Diagnostics, Inc. | Method for detecting a target polynucleotide in a sample using a background reducing reagent and composition and kit comprising such a reagent |
| US5830642A (en) * | 1992-04-03 | 1998-11-03 | Amersham Life Science, Inc. | Electrophoresis of nucleic acid fragments |
| EP0602524A1 (de) * | 1992-12-15 | 1994-06-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Chemilumineszenzmarkierte Gensonden und ihre Verwendung in Gensondentesten |
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- 1995-09-14 DE DE19534122A patent/DE19534122A1/de not_active Ceased
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1996
- 1996-08-16 AT AT96113136T patent/ATE382709T1/de active
- 1996-08-16 EP EP96113136A patent/EP0763601B1/de not_active Expired - Lifetime
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