MXPA06005451A - Metodos y composiciones para el tratamiento de trastornos metabolicos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos y composiciones novedosas para la intervencion terapeutica en hiperfenilalaninemia. Mas especificamente, la especificacion describe los metodos y composiciones para tratar diferentes tipos de fenilcetonurias utilizando composiciones que contengan BH4. Tambien se toman en cuenta los tratamientos combinados de BH4 y otros esquemas de tratamiento.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS METABÓLICOS Referencia a la solicitud relacionada Esta solicitud reclama el beneficio ante el titulo 35 del USC sección 119 (e) ante la solicitud de Patente Provisional ÜS Serie No. 60/520,767, presentada el 17 de noviembre de 2003, la descripción de la cual se incorpora por este medio como referencia en la presente .

ANTECEDENTE Campo La presente invención se dirige, en general, a la intervención terapéutica de alteraciones metabólicas, en particular aquellas que involucran el metabolismo de aminoácidos. Más específicamente, la presente invención se dirige a los métodos y composiciones para el tratamiento de fenilcetonuria, enfermedades vasculares, enfermedades isquémicas e inflamatorias o resistencia a la insulina, o los estados y pacientes que se beneficiarían del mejoramiento de la actividad de la óxido nítrico sintasa.

Antecedente de la técnica relacionada La fenilcetonuria (PKÜ) es una alteración metabólica heredada que se identificó por primera vez en la década de 1930. En la mayoría de los casos, y hasta mediados de la década de 1990, se pensó que ésta era una alteración del metabolismo de los aminoácidos resultante de una deficiencia en la enzima hepática fenilalanina hidroxilasa (PAH) . Las deficiencias en la PAH, a su vez, ocasionan un exceso de fenilalanina (Phe) en el cerebro y plasma. La deficiencia en PAH finalmente manifiesta en una carencia de tirosina, que es un precursor de los neurotransmisores .

Si no se detecta y no se trata en una etapa temprana de la vida de un recién nacido, la PKU origina un daño irreversible del sistema nervioso, retardo mental grave y deficiente desarrollo del cerebro. Las características además del retardo mental en pacientes no tratados consisten en calcificación del cerebro, pigmentación clara, peculiaridades de la marcha, postura y postura cedente, eczema y epilepsia. Se ha documentado que un recién nacido sufre una pérdida de 50 puntos IQ durante el primer año de infancia y la PKU invariablemente está acompañada por al menos alguna pérdida del IQ. Una vez detectado, el estado se trata proporcionando al recién nacido, y después al niño, una dieta baja en Phe. En adultos, los suplementos de proteínas habitualmente tomados por pacientes de PKU clásico pueden ser libres de Phe con la suposición de que estos adultos recibirán suficientes cantidades de Phe a través de la dieta, controlada en una forma rigurosa, de modo que la dieta total sea una dieta baja en Phe. Asimismo, las mujeres embarazadas que presentan este estado se recomienda que reciban una dieta que sea baja en Phe para evitar el riesgo de deterioro del desarrollo del feto y malformación congénita (síndrome de PKU materno) .

En fechas recientes se ha demostrado que los síntomas patológicos que se manifiestan del estado de exceso de Phe, denominado en forma colectiva hiperfenilalaninemia (HPA) , se pueden dividir en múltiples alteraciones discretas, las cuales se diagnostican de acuerdo con las concentraciones de Phe en plasma y la respuesta al cof ctor para PAH. En un principio, las HPA se pueden dividir en HPA causada como resultado de una deficiencia en el cofactor 6R-L-eritro-5,6,7,8, tetrahidrobiopterina (HB4; PKU maligno) y HPA resultante " de una deficiencia en PAH. Esta última categoría además se subdivide en por lo menos tres categorías dependiendo de la concentración plasmática de la Phe en ausencia de intervención dietética u otra terapéutica (mencionado en la presente como "concentración plasmática de Phe no restringida") .

La ho eostasia de Phe en plasma, normal, se controla estrechamente dando como resultado una concentración de Phe plasmática de 60 µmol/L ± 15 µmol/L. La PKU clásica (MIMIM No. 261600) es la forma más severa de PKU y resulta de mutaciones completas o graves de la PAH, lo cual da origen a concentraciones plasmáticas de Phe no restringidas mayores de 1200 µmol/L si se deja sin tratamiento. Las personas con PKU clásica (o grave) deben ser tratadas con un esquema dietético riguroso que se base en una dieta muy baja en Phe para reducir sus concentraciones hasta un intervalo seguro. También se han identificado formas más leves de HPA. Una forma menos severa de PKU es aquella que se manifiesta en las concentraciones plasmáticas de Phe de 10-20 mg/dL (600-1200 µmol/L, y generalmente se le denomina "PKU leve". Esta forma moderada de PKU se maneja mediante el uso de restricciones dietéticas moderadas, por ejemplo, una dieta baja en proteína total, pero por otra parte no necesariamente libre de Phe. Por último, la HPA leve, también conocida como HPA benigna o sin PKU se caracteriza por concentraciones plasmáticas de Phe entre 180-600 µmol/L. Las personas con HPA sin PKU habitualmente no se les tratan en vista de que se considera que tiene concentraciones plasmáticas de Phe dentro del intervalo "seguro". No obstante, como ya se menciono, estas concentraciones de Phe todavía son mucho más elevadas en estas personas en comparación con persona normales, sin PKU y pueden presentar secuelas perjudiciales en al menos las mujeres embarazadas y paciente muy jóvenes. Para una revisión más detallada de HPA resultante de la deficiencia de PAH, los expertos en la técnica deben referirse a Scriver y col., 2001 {Hyperphenylalaninemia : Phenylalanina Hydroxilasa Deficiency, In: Scriver CR, Baudet' AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B. eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 1667-1724). Los lineamientos del NIH indican que preferentemente niños con PKU, es preferible reducir la Phe en plasma para que este dentro de 360-420 µmol/L.

La HPA también resulta de defectos en el metabolismo de BH4. El BH4 es un cofactor esencial de tirosina y triptofano hidrosilasa, las enzimas limitadoras de la velocidad en la biosíntesis de los neurotransmisores dopamina y serotonina. Los efectos de las deficiencias en la dopamina y serotonina se conocen en forma colectiva como HPA "atípica" o "maligna". Así pues, los diagnósticos habituales de HPA han consistido en la determinación si la HPA es resultado de la deficiencia de BH4 o la deficiencia de PAH. Normalmente, el diagnóstico de PKU se establece basándose en la concentración continuamente elevada de la Phe en sangre. Después de una detección positiva de la concentración elevada de Phe en sangre (Phe plasmática > 120 µmol/L; Weglage y col., Inherit . Metab . Dis . , 25: 321-322, 2002), se realiza un tamizaje diferencial en el que se determina si la Phe elevada es resultado de la deficiencia de BH4 o la deficiencia de PAH. El diagnóstico diferencial consiste en determinar si la concentración elevada de Phe se disminuye como un resultado de la admisión de BH4 (prueba de carga de BH4) . La prueba de carga de BH4 normalmente consiste en una carga una sola vez de BH4, por ejemplo, la admisión de 5-20 mg/kg a una persona con una dieta normal (es decir, no restringida) y la determinación si el individuo experimenta una disminución en las concentraciones de Phe (ver por ejemplo Ponzoñe y col, Eur. J. Pediatr. 152: 655-661, 1993; Weglage y col., J. Inherit . Metab. Dis . , 25: 321-322, 2002).

Normalmente, los individuos que responden a una prueba de carga de NH4 por una disminución en las concentraciones plasmáticas de Phe son diagnosticados con un defecto en la homeostasia de BH4. Sin embargo, se han publicado algunos informes de pacientes con un tipo de deficiencia PAH sensible a BH4 (Kure y col., J. Pediatr. 135: 375-378, 1999; Lassker y col., J. Inherit . Metanol . Dis . 25: 65-70, 2002; Linder y col., Mol . Genet . Metab. 73: 104-106, 2001; Spaapen y col., Mol . Gent . And metabolism, 78: 93-99, 2003; Trefz y col., 2001). Estas personas tienen concentraciones plasmáticas de Phe que son normales de PKU moderada, es decir, menos de 1000 µmol/L y normalmente menos de 600 µmol/L. Los pacientes que presentan PKU clásica, grave no son sensibles a las pruebas de carga de BH4 de 24 horas, comunes (Ponzoñe y col., N. Engl . J. Med. 348(17): 1722-1723, 2003).

Se ha sugerido que las personas que son sensibles a BH4 no necesitan intervención dietética, sino más bien deben ser tratados con BH4. Del mismo modo, se ha sugerido lo contrario para personas que han sido diagnosticadas como no sensibles a la prueba de carga de BH4, es decir, estas personas deben ser tratadas con restricción dietética y no con tratamiento con BH4. Ponzoñe y col., particularmente indicaron que las personas que tienen fenilcetonuria grave no responderán al tratamiento con BH4 y este tratamiento no debe ser utilizado en estos pacientes (Ponzoñe y col., N. Engl . J. Med. 348(17): 1722-1723, 2003). Entonces, en la actualidad existen esquemas terapéuticos diferentes para el tratamiento de HPA dependiendo si la persona es sensible o no a BH4. Más aún, se ha sugerido que muy pocos pacientes se benefician del tratamiento con BH4. De hecho, se piensa que las únicas personas con una forma de HPA deficiente de PAH que se beneficiarán del tratamiento con BH4 son aquellas con PKU leve. En vista de que estas personas normalmente tendrán concentraciones de Phe en el intervalo seguro (es decir, menos de 600 µM) , el estado de la enfermedad se puede controlar utilizando restricción dietética moderada (véase Hanley, N. Engl . J. Med. 348(17): 1723,2003). Entonces, el tratamiento con BH4 por sí solo, o en combinación con cualquier otra intervención terapéutica, no tiene que ser considerado como una intervención terapéutica viable para la gran mayoría de las personas que presentan HPA.

El BH4 es una amina biogénica de la familia de las pterinas naturales. Las pterinas están presentes en los fluidos fisiológicos y tejidos en formas reducidas y oxidadas, no obstante, solo la 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina tiene actividad biológica. Esta es una molécula quiral y el enantiómero 6R del cofactor es conocido como el enantiómero biológicamente activo. Para una revisión detallada de la síntesis y las alteraciones de BH4 véase Blau y col., 2001 {Disorders of tetrahidrobiopterina and related biogenic amines . In. Scriver CR, Baudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8a ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 1275-1776) . A pesar de la investigación de la función de la deficiencia de BH4 en HPA, no se ha sugerido el tratamiento con BH4 porque tal tratamiento es muy costoso, tan elevado como 30,000 dólares por año para un adolescente o adulto, en comparación con 6000 dólares para el tratamiento de dieta restringida de fenilalanina (Hanley, N. Engl . J. Med. 348 (17): 1723, 2003). Otro problema importante con BH4 es que este compuesto es inestable y fácilmente sufre oxidación aeróbica a temperatura ambiente (Davis y col., Eur. J. Brochem . , Vol. 173, 345-351, 1988; Patente US No. 4,701,455) y tiene una vida útil de menos de 8 horas a temperatura ambiente (Berneggar y Blau, Mol . Genet . Metanol . 77:304-313. 2002) .

Así pues, a la fecha, la intervención dietética es la intervención terapéutica común que se utiliza en pacientes con PKU clásica, grave, y en muchos pacientes con PKU moderada. Tal intervención dietética normalmente consiste en restringir al paciente a productos alimenticios que estén compuestos de alimentos naturales que estén libres de, o bajos en el contenido de Phe. Sin embargo, además de eliminar la Phe, un esquema dietético como este elimina muchas fuentes de otros aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. En consecuencia, sin suplementación, una dieta así proporciona una cantidad inadecuada de proteína, energía, vitaminas y minerales para dar soporte al crecimiento y desarrollo normales. En vista de que la PKU es una manifestación de una falta de tirosina, la cual se origina por la falta de hidroxilación de fenilalanina, la tirosina se convierte en un aminoácido esencial y los suplementos dietéticos para PKU deben contener un suplemento de tirosina. Por tanto, es normal utilizar fórmulas nutritivas para suplementar las dietas de los pacientes con PKU. Así mismo, para bebés es común utilizar fórmulas para lactantes que tengan un bajo contenido de Phe como la única fuente o fuente principal de alimento.

Sin embargo, la restricción de proteínas en la dieta es en el mejor de los casos una forma ineficaz para regular la PKU en muchas clases de pacientes. Por ejemplo, el tratamiento es de importancia primordial durante el embarazo porque elevadas concentraciones de Phe pueden ocasionar retardo en el desarrollo del cerebro dentro del útero. No obstante, una dieta baja en proteínas durante el embarazo puede ocasionar desarrollo renal retardado y se piensa que produce una reducción ulterior en la cantidad de nefronas y tal vez conduzca a la hipertensión en la adultez (D'Agostino, N. Engl . J. Med. 348(17)1723-1724, 2003).

La mala observancia del paciente con una dieta restringida en proteínas también es un problema. Las fórmulas de proteínas libres de Phe disponibles son de sabor amargo, lo que dificulta que el paciente consuma suficientes cantidades de proteína para mantener las ingestas diarias necesarias de proteínas, aminoácidos, vitaminas, minerales y otros. Este es particularmente un problema con niños mayores que pueden necesitar hasta 70 g, de peso seco, de las fórmulas por día. Por ejemplo, Schuett, V. E.; 1990; DHHA publicación ?o. HRS-MCH-89-5, documenta que las de 40% de los pacientes con PKU en EUA de 8 años o mayores no se apegan al tratamiento dietético (Patente US ?o. 6,506,422). Muchos pacientes adolescentes no siguen rigurosamente la dieta restringida en proteínas por temores de las actitudes de sus compañeros .

Así pues, sería conveniente un medicamento terapéutico para sustituir o suplementar o aliviar las restricciones dietéticas que se imponen a los pacientes PKU. La presente invención se dirige a solucionar una necesidad como esta.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención describe la intervención en las alteraciones metabólicas, particularmente aquellas involucradas en el metabolismo de los aminoácidos. Más específicamente, la presente invención se dirige a los métodos y composiciones para el tratamiento de personas que muestran concentraciones elevadas de fenilalanina, por ejemplo, personas que sufren de hiperfenilalaninemia, fenilceteonuria leve o fenilceteonuria grave, clásica; y los métodos y composiciones para el tratamiento de las personas que sufren de estados que se beneficiarían del mejoramiento de la actividad de la óxido nítrico sintasa; y los métodos y composiciones para el tratamiento de personas que sufren de enfermedades vasculares, enfermedades isquémicas o inflamatorias, diabetes o resistencia a la insulina.

En un aspecto, la invención describe los métodos de tratamiento de la fenilcetonuria grave, clásica (PKU) en una persona, que consiste en administrar a la persona una dieta restringida en proteínas, en combinación con una composición que contenga tetrahidrobiopterina (BH4) o un precursor o derivado de este, en donde la admisión en combinación de la dieta restringida en proteínas y BH4 es eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en plasma de la persona, en comparación con la concentración en ausencia de la admisión combinada. En las modalidades específicas, la persona es aquella no manifiesta una deficiencia en la homeostasia de BH4. La persona puede ser un individuo que no manifieste síntomas de deficiencia del neurotransmisor L-dopa.

Una persona seleccionada para el tratamiento de conformidad con los métodos de la invención tendrá una concentración elevada de Phe en plasma, como puede ser una concentración mayor de 1800 µM/L en ausencia del tratamiento. Otras modalidades consideran que tenga una concentración plasmática de fenilalanina mayor de 100 µM en ausencia de un esquema de tratamiento. En modalidades preferidas, los métodos de admisión combinada de la invención disminuyen la concentración plasmática de fenilalanina de la persona a menos de 600 µM. más preferentemente, se disminuye a menos de 500 µM. incluso más preferentemente, la admisión combinada disminuye la concentración de fenilalanina en plasma de la persona a 360 µM + 15 µM.

El BH4 preferentemente se administra en una cantidad entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, mas preferentemente entre cerca de 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. El BH4 puede ser administrado en una sola dosis diaria o en múltiples dosis diario. En algunas modalidades, el tratamiento con BH4 no es continuo, más bien el BH4 se administra diario hasta que la concentración plasmática de fenilalanina de la persona se disminuye a menos de 360 µM. Preferentemente, cuando la concentración en plasma de fenilalanina de la persona se monitoriza diario y se administra BH4 cuando se observa un aumento de 10% en la concentración plasmática de fenilalanina. Preferentemente, el BH4 que se administra es una forma cristalizada, estabilizada de BH4 que tiene mayor estabilidad que BH4 estabilizada, no cristalizada. Se prefiere más que la forma cristalizadas, estabilizada de BH4 contenga 6R BH4 con al menos 99.5% de pureza. Precursores como dihidrobiopterina (BH2) y sepiapterina también pueden ser administrados. El compuesto BH4 se puede administrar por vía oral.

La dieta restringida en proteínas que se administra en los métodos de la presente es aquella dieta restringida en fenilalanina, en donde la ingesta total de fenilalanina para el individuo se limita a menos de 60 mg por día. En otras modalidades, la dieta restringida en proteínas es una dieta restringida en fenilalanina en donde la fenilalanina total se limita a menos de 300 mg por día. En todavía otras modalidades, la dieta restringida en proteínas es aquella que se suplementa con aminoácidos como tirosina, valina, isoleucina y leucina. En algunas modalidades, la dieta restringida en proteínas contiene un suplemento proteínico y el BH4 se proporciona en la misma composición que el suplemento proteínico.

En modalidades específicas, la persona es aquella que ha sido diagnosticada de tener una fenilalanina hidroxilasa (PAH) mutante. La PAH mutante puede tener una mutación en el dominio catalítico de la PAH. Los ejemplos de estas mutaciones pueden ser una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, 1373T, V388M, E390G, A395P, P407S e Y414C.

La presente también considera un método para el tratamiento de una mujer embarazada que tenga hiperfenilalaninemla (HPA) , que consiste en administrar a la persona una dieta restringida en proteínas en combinación con una composición que contenga tetrahidrobiopterina (BH4) o un precursor o derivado de este, en donde la administrar combinada de la dieta restringida en proteínas y BH4 es eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en el plasma de la persona, en comparación con la concentración en ausencia de la administración combinada. En algunas modalidades, la persona tiene una concentración de fenilalanina en plasma, con dieta no restringida, " mayor de 180 µM, pero menor de 600 µM. En otras modalidades, la persona tiene una concentración en plasma de fenilalanina, con dieta no restringida, mayor de 500 µM, pero menor de 1200 µM. En todavía otras modalidades, la persona tiene una concentración en plasma de fenilalanina con dieta no restringida, mayor de 1000 µM.

También se considera un método para tratar a un paciente que tenga concentración de fenilalanina en plasma arriba de la normal (por ejemplo mayor de 180 µM/L y más preferentemente mayor de 360 µM/L) consisten en la administración al paciente de una composición de BH4 estabilizada, en una cantidad eficaz para obtener una disminución en la concentración plasmática de fenilalanina del paciente. Preferentemente, la composición de BH4 estabilizada es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas . Probablemente el paciente tendrá una concentración plasmática de fenilalanina mayor de 180 µM antes de la administración de BH4. Más particularmente, el paciente tiene una concentración plasmática de fenilalanina entre 120 µM y 200 µM. En otras modalidades, el paciente tiene una concentración plasmática de fenilalanina entre 200 µM y 600 µM. En todavía otras modalidades, el paciente tiene una concentración plasmática de fenilalanina entre 600 µM y 120 µM. Todavía otra clase de pacientes que se pueden tratar son aquellos que tienen una ' concentración plasmática de fenilalanina completa no restringida mayor de 1200 µM. En modalidades específicas, el paciente es un recién nacido, más específicamente, un recién nacido que tenga una concentración plasmática de fenilalanina mayor de 120 µM. En otras modalidades, la paciente esta embarazada, y la paciente embarazada tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre aproximadamente 200 µM y aproximadamente 600 µM. Las pacientes embarazadas con una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1200 µM son candidatas particularmente importantes para este tipo de tratamiento, como lo son las pacientes que son mujeres en edades reproductivas que tengan como posibilidad el embarazado. En estas modalidades, en las que el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1200 µM, y el método además consiste en administrar una dieta restringida en proteínas a la paciente.

La invención también considera un método de tratamiento a un paciente que tenga fenilcetonuría, que consiste en administrar al paciente una composición de BH4 estabilizada en una cantidad eficaz para obtener una disminución en la concentración de fenilalanina en plasma del paciente, en donde el paciente haya sido diagnosticado como no sensible a la prueba de carga de BH4 en una sola dosis. Preferentemente, el paciente es no sensible hasta las 24 horas de la carga de BH4.

Otro aspecto relacionado de la invención proporciona una prueba de carga con múltiples dosis, que consiste en la administración de más de una dosis de BH4. Los datos descritos en la presente demuestran que las personas que son consideradas como "no sensibles" a una prueba de carga de BH4 en una sola dosis pueden responder a múltiples dosis de BH4 con una reducción importante de las concentraciones de fenilalanina. En una modalidad, por lo menos dos dosis de BH4 que pueden ser entre aproximadamente 5 mg a 40 mg, se administran a una persona durante un tiempo de más de un día, preferentemente 7 días.

Los métodos de tratamiento de conformidad con la invención pueden consistir en administrar entre aproximadamente 10 mg de BH4/kg de peso .corporal a aproximadamente 200 mg de BH4/kg de peso corporal. La BH4 se puede administrar por cualquier vía comúnmente utilizada en la práctica, por ejemplo por la vía oral, subcutánea, sublingual, parenteral, rectal, por las fosas nasales. La BH4 se puede administrar diario en algún otro intervalo, por ejemplo cada dos días o cada semana. La BH4 preferentemente se administra en combinación con una dieta restringida en proteínas, y como una opción al mismo tiempo que con folatos, incluidos los precursores de folato, ácidos folíeos, y derivados de folato.

Se considera la posibilidad de que BH4 se administre como parte de un componente de una formulación terapéutica de proteínas . La dieta restringida en proteínas puede consistir en una dieta normal de alimentos que contengan poca proteína. De otro modo, la dieta restringida en proteínas consiste en una ingesta de fórmula de proteínas que sea una dieta de proteínas libre de fenilalanina, y la persona obtiene su cantidad esencial de Phe de los componentes restantes de una dieta muy baja en proteínas. En algunas modalidades, la dieta restringida en proteínas es suplementaria con suplementos . proteínicos que no contenga fenilalanina. Más particularmente, los suplementos proteínicos que no contienen fenilalanina contienen tirosina y otros aminoácidos esenciales. En otras modalidades, los suplementos proteínicos también pueden contener folatos, incluidos los precursores de folato, ácidos folíeos y derivados de folato.

La invención considera los métodos de tratamiento de un bebé que tenga fenilcetonúría, consistentes en administrar una composición de BH4 estabilizada al paciente en una cantidad eficaz para obtener la disminución en la concentración plasmática de fenilalanina del bebé, en donde el bebé tiene entre 0 y 3 años de edad y el bebé tiene una concentración en plasma de fenilalanina entre aproximadamente 360 µM a aproximadamente 4800 µM.

Antes de la administración de BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 1200 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a aproximadamente 100 µM. En otras modalidades, antes de la administración de BH4 el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 800 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a aproximadamente 600 µM. en todavía otras modalidades, antes de la administración de BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 400 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a aproximadamente 300 µM. Los métodos terapéuticos a los que se refiere la presente preferentemente deben reducir la concentración de fenilalanina en plasma del bebé a 360 ± 15 µM.

También se considera una composición que contiene una -forma cristalina, estabilizada de BH4 que es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas y un portador, diluyente o excipiente aceptado para uso farmacéutico. La composición además puede contener un suplemento proteínico médico. En otras modalidades, la composición de BH4 es parte de una fórmula para lactantes, en todavía otras modalidades, el suplemento proteínico es esta libre de fenilalanina. El suplemento proteínico preferentemente se enriquece con L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina en una concentración de 20 µg/100 g de suplemento, L-taurina en una concentración de 40 mg/100 g de suplemento y selenio. Además este puede tener la dosis diaria recomendada de minerales, por ejemplo, calcio, fósforo y magnesio. El suplemento además puede contener la dosis diaria recomendada de uno ó más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L-leucina, L-prolina, acetato de L-licina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidratada, L-triptofano, L-cerina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutámico y ácido L-aspártico. Además, el suplemento se puede enriquecer con la dosis diaria recomendada de vitaminas A, D y E. El suplemento preferentemente tiene un contenido de grasa que proporciona por lo menos 40% de la energía del suplemento. Un suplemento como este puede proporcionarse en forma de un suplemento en polvo o en forma de una barra de proteína.

Otras peculiaridades y ventajas de la invención serán evidentes después de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican modalidades preferidas de la invención, se dan como ejemplo solamente, porque diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La intervención dietética es la intervención terapéutica que se utiliza para todos los pacientes con PKU clásica, grave, y en muchos pacientes con PKU moderada. No obstante, restricción proteínica en la dieta como esta da origen a un suministro inadecuado de proteína, energía, vitaminas y minerales para soportar el crecimiento normal y el desarrollo. Así pues, la restricción de proteína en la dieta es en el mejor de los casos un modo ineficaz para regular la PKU en muchas clases de pacientes, especialmente en mujeres embarazadas y en niño jóvenes, ambas categorías de individuos que necesitan cantidades elevadas de proteína en comparación con los individuos adultos normales. El uso de restricción dietética también se dificulta por la mala observancia de los pacientes con una dieta restringida en proteínas. En octubre de 2000, los institutos nacionales de salud emitieron una declaración consensuada sobre el escrutinio y manejo de PKU en la que se estimulaba en gran medida la investigación sobre alternativas no dietéticas para el tratamiento de PKU" así pues, existe en la técnica una necesidad de un medicamento terapéutico que sustituya y/o suplemente y alivie las restricciones dietéticas que se imponen a los pacientes con PKU.

La presente solicitud por primera vez describe una intervención farmacéutica de PKU con base en la administración de una forma estabilizada de BH4. Los métodos y composiciones para producir tales composiciones de BH4 estabilizada se describen con mayor detalle en el Ejemplo 2. Las composiciones de BH4 estabilizada de la presente invención contienen cristales de BH4 que son estables a temperatura ambiente durante más de 8 horas. Los métodos y composiciones de la presente invención se refieren a composiciones farmacéuticas de BH4 estabilizada sola que se pueden suministrar a través de cualquier vía de administración tradicional, que incluye pero no se limita a, la administración oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intravenosa y similares. Las composiciones de la presente invención además pueden contener composiciones de BH4 en combinación con un antioxidante que ayude a prolongar la estabilidad de la composición de BH4. Además, como se describe más adelante, la presente invención además comprende productos alimenticios que contiene BH4. Por ejemplo, la invención considera la posibilidad de composiciones en polvo de proteínas tradicionales como PHENEX, LOFENALAC, PHENIL-FREE y similares que se han modificado por la adición de BH4.

La presente invención además toma en cuenta la intervención terapéutica de los diferentes fenotipos de PKU mediante la administrar de BH4 en combinación con una dieta limitada de proteínas. La BH4 que ha de ser administrada en combinación con la dieta puede ser, pero no necesariamente, una composición de BH4 estabilizada como se describe en la presente. Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir una composición de BH4 que sea inestable a temperatura ambiente y a la luz. Si bien los tratamientos que utilizan una composición como esta se dificultan por la inestabilidad de la composición de BH4, su uso todavía es posible en algunos tratamientos de combinación donde paciente que no responden a BH4 y que sufren de PKU clásica, grave, son tratados con un esquema de tratamiento con BH4 y restricción de proteína en la dieta.

Los métodos y composiciones para efectuar el tratamiento de alteraciones metabólicas, incluida PKU, se describen con mayor detalle más adelante. 1. Pacientes que pueden ser tratados La presente invención se dirige al tratamiento de una variedad de poblaciones de pacientes HPA con métodos que comprenden el uso de composiciones de BH4 estabilizada, o composiciones de BH4 no estabilizada, sola o en combinación con otros esquemas de tratamiento, para el manejo de HPA y/o PKU. En particular, se considera que cualquier tipo de BH4, en una forma estabilizada u otra se puede utilizar para tratar la población de pacientes que tiene concentraciones de fenilalanina que sean bastante bajas en los que la intervención dietética normalmente no se utiliza (es decir, paciente con HPA leve) . Estos pacientes que se pueden manejar para todas las formas de tratamiento con composiciones de BH4 para mejorar los efectos de HPA moderada, incluyen mujeres embarazadas y recién nacidos con concentraciones en suero menores de 200 µM. Las diferentes poblaciones de pacientes, y sus diferentes necesidades terapéuticas, se describen con mayor detalle en la presente sección.

Algunas modalidades de la presente invención se dirigen al tratamiento de PKU severa, clásica administrando a la persona una dieta restringida en proteínas en combinación con una composición que contenga BH4 o un precursor o derivado de esta, en donde la administración combinada de la dieta restringida en proteínas y BH4 es eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en el plasma de estas personas en comparación con la concentración en ausencia de la administración en combinación. Además, la invención también considera posible el tratamiento de una mujer embarazada que tenga HPA administrando a la mujer una dieta restringida en proteínas en combinación con BH4 o un precursor derivado de esta, de modo que la administración combinada de la dieta restringida en proteínas y BH4 sea eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en el plasma de la mujer embarazada en comparación con una concentración como esta en ausencia de la administración combinada. En modalidades específicas, se considera el tratamiento para pacientes que manifiesten niveles de Phe mayores que 420 µM.

Otras modalidades de la invención consisten en la administración de una composición de BH4 estabilizada a alguna persona que tenga HPA, caracterizada por una concentración en plasma de PHe mayor que 180 µM antes de la administración de la BH4, en una cantidad eficaz para producir una disminución de una concentración de Phe en plasma del paciente. Los métodos de la invención también pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes PKU que hayan sido diagnosticados como no sensibles a una prueba de carga de BH4. Los métodos de la invención serán útiles en el tratamiento de un bebé que tenga PKU caracterizado por concentraciones elevadas de Phe entre más de 300 µM/L con las composiciones de BH4 estabilizada descritos en la presente. Por "bebé" la presente solicitud se refiere a un paciente que tenga entre 0 a aproximadamente 36 meses.

Los datos descritos en la presente demuestran que los individuos que son considerados "no sensibles" a la prueba de carga de BH4 de una sola dosis pueden de hecho responder a múltiples dosis de BH4 con una reducción importante en las concentraciones de fenilalanina. Así pues, otro aspecto de la invención propone una prueba de carga de dosis múltiples que incluye la administración de más de una dosis de BH4. Las pruebas de carga de dosis múltiples ejemplares consisten en la administración de entre 5 y 40 mg/kg de tetrahidrobiopterina, o más preferentemente de 10 a 20 mg/kg, durante un tiempo de por lo menos un día, o al menos dos días, o al menos 3, 4, 5, 6, 7, 10 ó 14 días, preferentemente 2-14, 3-14 ó 5-10 días, y más preferentemente 7 días.

La invención propone los métodos para utilizar cualquiera de los polimorfos de tetrahidrobiopterina descritos en la presente, o los preparados farmacéuticos estables que contengan cualquiera de estos polimorfos, para el tratamiento de los estados asociados con concentraciones elevadas de fenilalanina o concentraciones disminuidas de tirosina, los cuales pueden ser causados, por ejemplo, por la actividad reducida de la fenilalanina hidroxilasa, tirosina hidroxilasa o triptofano hidroxilasa. Los estados asociados con elevadas concentraciones de fenilalanina específicamente incluyen fenilcetonuria, leve y clásica, e hiperfenilalaninemia como se describe en otra parte de la presente, y poblaciones de paciente ejemplares incluyen los subgrupos de pacientes descritos en la presente así como cualquier otro pacientes "que presente concentraciones de fenilalanina por encima de los normales .

La invención además propone métodos para utilizar cualquiera de los polimorfos descritos en la presente, o preparados farmacéuticos estables que contengan cualquiera de estos polimorfos, para el tratamiento de personas que sufran de estados que beneficien del mejoramiento de la actividad de la óxido nítrico sintasa y pacientes que sufran de enfermedades vasculares, enfermedades isquémicas o inflamatorias o resistencia a la insulina. El tratamiento, por ejemplo puede aliviar una deficiencia en la actividad de la óxido nítrico sintasa o puede, por ejemplo, proporcionar un aumento de la activita de la óxido nítrico sintasa sobre los niveles normales. Se ha sugerido que un paciente que sufre de una deficiencia en la actividad de la óxido nítrico sintasa se beneficiaría del tratamiento con folatos, incluidos los precursores del folato, ácidos fólicos y derivados de folato. Así pues, se considera posible que las composiciones y métodos descritos en la presente incluyan el tratamiento concurrente con folatos, incluidos los precursores de folato, ácidos fólicos o derivados de folato. Los folatos ejemplares están descritos en las Patentes US Nos. 6,011,040 y 6,544,994, ambas se incorporan en la presente para referencia, e incluye el ácido fólico (pteroilmonoglutamato) , ácido dihidrofólico, ácido tetrahidrofólico, ácido 5-metiltetrahidrofólico, ácido 5, 10-metílentetrahídrofólíco, ácido 5,10-metilentetrahidrofólico, ácido 5,10-formiminotetrahidrofólico, ácido 5-formiltetrahidrofólico (leucovorina) , ácido 10-formiltetrahidrofólico, ácido 10-metiltetrahidrofólico, uno o más de los folilpoliglutamatos, compuestos en los que el anillo pirazina de la porción uterina del ácido fólico o de los folilpoliglutamatos se reduce para dar dihidrofolatos o tetrahidrofolatos, o derivados de todos los compuestos anteriores en los cuales las posiciones N-5 o N-10 llevan una unidad carbono en diferentes niveles de oxidación, o las sales compatibles para uso farmacéutico de éstas, o una combinación de dos o más de éstas. Los tetrahidrofolatos ejemplares pueden ser el ácido 5-formil- (6S) -tetrahidrofólico, ácido 5-metil (6S) -tetrahidrofólico, ácido 5, 10-metilen- (SR) -tetrahidrofólico, ácido 5, 10-metilen- (6R) -tetrahidrofólico, ácido 10-formil- (6R) -tetrahidrofólico, ácido 5-formimino- ( 6S) -tetrahidrofólico o ácido (6S)-tetrahidrofólico, y las sales de éstos, como tratamiento con una composición farmacéutica o producto alimenticio que contenga el polimorfo tetrahidrobiopterina y un folato.

El óxido nítrico se produce en forma constitutiva por las células endoteliales vasculares donde desempeña una función fisiológica importante en la regulación de la presión arterial y el tono vascular. Se ha sugerido que una deficiencia en la bioactividad del óxido nítrico está involucrada en la patogénesis de las disfunciones vasculares, incluida la cardiopatía coronaria, aterosclerosis de cualquier arteria, incluidas las arterias coronarias, carótidas, cerebrales o vasculares periféricas, lesión de repercusión isquemia, hipertensión, diabetes, vasculopatía diabética, enfermedad cardiovascular, enfermedad vascular - periférica o estados neurodegenerativos procedentes de isquemia y/o inflamación, como puede ser el accidente cerebro vascular, y que esta patogénesis incluye endotelio dañado, insuficiente flujo de oxígeno a los órganos y tejidos, resistencia vascular sistémica elevada (presión arterial elevada) , proliferación del músculo liso vascular, progreso de estenosis vascular (estrechamiento) e inflamación. Así pues, el tratamiento de algunos de estos estados es considerado de acuerdo con los métodos de la invención.

También se sugiere que el mejoramiento de la actividad de la óxido nítrico sintasa también da como resultado la reducción de concentraciones elevadas de súper óxido, sensibilidad aumentada a la insulina y reducción de la disfunción vascular asociada con la resistencia a la insulina, como se describe en la Patente US No. 6,410,535, incorporada en la presente para referencia. Así pues, el tratamiento de diabetes (tipo I o tipo II) , hiperinsulinemia o resistencia a la insulina están considerados de acuerdo con la invención. Las enfermedades que tienen disfunción vascular asociadas con resistencia a la insulina incluyen aquellas causadas por la resistencia a la insulina o que se agravan por la resistencia a la insulina, o aquellas para las cuales la cura es retardada por la resistencia a la insulina, como la hipertensión, hiperlipidemia, arterioesclerosis, angina vasoconstrictiva coronaria, angina por esfuerzo, lesión constrictiva cerebro vascular, insuficiencia cerebro vascular, vasoespasmo cerebral, alteración de la circulación periférica, arterio restenosis coronaria después de angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) o injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) , obesidad, diabetes independientemente de insulina, hiperinsulinemia, anomalías metabólicas de los lípidos, cardiopatías arterioescleróticas coronarias o similares siempre que estas se asocien con resistencia a insulina. Se considera que cuando se administra a los pacientes con estas enfermedades, la BH4 puede evitar o tratar estas enfermedades activando las funciones de NOS, aumentando la producción de NO y suprimiendo la producción de especies activas de oxígeno para mejorar las alteraciones de las células endoteliales vasculares.

A. Características de PKU grave, clásica y los métodos de tratamiento de esta de acuerdo con la presente invención Como se menciona en lo anterior en la presente en la sección del antecedente, la PKU grave se manifiesta en una concentración plasmática de Phe mayor de 1200 µM/L y se puede encontrar tan alta como 480 µM/L. Los pacientes que presentan esta alteración deben ser tratados con una dieta libre de fenilalanina para llevar sus concentraciones plasmáticas de Phe por debajo de un nivel que sea aceptable clínicamente (por lo regular menos de 600 µM/L, y preferentemente menores de 300 µM/L) . Estos pacientes solo pueden tolerar un máximo de entre 250-350 mg de Phe de la dieta por día (Spaápen y col., Genet and Metab. 78: 93-99, 2003). Como tales, estos pacientes se inician en una dieta de fórmula restringida de Phe entre 7-10 días después de su nacimiento y se les imponen restricciones dietéticas durante el resto de " sus vidas. Cualquier alivio a las restricciones dietéticas rigurosas que estos individuos soportan debe ser benéfico.

Las pruebas que se utilizan para el diagnóstico de las personas con Phe clásica se describen con mayor detalle más adelante en la sección III. Estas pruebas han revelado que los pacientes con PKU severa, clásica no son sensibles a BH4 y requieren una dieta baja en fenilalanina (Lucke y col., Pedia tr. Neurol . 28:228-230, 2003) . En la presente invención, no obstante, se considera que esta clase de paciente PKU deben ser tratados con BH4 para que se pueda aliviar la necesidad de una dieta libre de fenilalanina, rigurosa.

Así pues, se considera que los métodos de la invención comprenderán la determinación de que el paciente está sufriendo de PKU clásica monitoreando la concentración plasmática de Phe de la persona. El paciente luego es tratado administrando un esquema combinado de una dieta baja en proteínas y BH4 para que se produzca por lo menos un 25% de disminución en las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Preferentemente, el método producirá una disminución de 30% en la concentración plasmática de Phe. Incluso más preferentemente, el método producirá una disminución de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mayor en la concentración plasmática de Phe de la persona (por ejemplo, cuando un paciente con PKU clásica, grave, tiene una concentración de Phe de 4800 µM/L, una disminución de 90% en la concentración de Phe producirá una concentración plasmática de Phe de 480 µM/L, una concentración que es suficientemente baja para requerir poca restricción dietética) . Desde luego, debe entenderse que los métodos de tratamiento de la presente invención (ya sea para tratar PKU clásica grave o cualquier otra HPA descrita en la presente) , debe intentar reducir las concentraciones plasmática de Phe del paciente a niveles tan cercanos como 360 µM/L ± 15 µM/L tanto como sea posible.

En las modalidades preferidas, las concentraciones de Phe en plasma del paciente PKU clásica que se este tratando se reducen de cualquier cantidad de la concentración de Phe en plasma sin dieta restringida que sea mayor de 1000 µM/L a cualquier concentración plasmática de Phe que sea menor que 600 µM/L. Desde luego, incluso si el tratamiento combinado con la BH4 y la dieta restringida en proteínas produce una disminución menor en la concentración plasmática de Phe, por ejemplo a una concentración de entre 800 µM/L a aproximadamente 1200 µM/L, esto se observará como un resultado clínicamente útil del tratamiento porque los pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma en este intervalo pueden manejar la disminución limitando simplemente la cantidad de proteína en la dieta, contrario a comer una fórmula restringida en Phe, dando como resultado con ello un mejoramiento notable en la calidad de vida de la persona, así como dando origen a mayor cumplimiento por parte del paciente con la restricción dietética.

Cualquier aumento en la cantidad de las concentraciones de Phe en la dieta que se puedan tolerar por parte del paciente como resultado del tratamiento será considerado como un resultado terapéutico eficaz. Por ejemplo, se considera que como resultado de administrar el tratamiento a base de BH4, el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe dietética de 250 a 350 mg/día a 350-400 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a la Phe del paciente se altera de ser un paciente de PKU clásica a un paciente de PKU moderada) . Desde luego, sería preferible que la intervención terapéutica enseñada en la presente permitiera al paciente aumentar su ingesta de Phe dietética de 250 a 350 mg/día hasta 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a la Phe del paciente se altera de ser un paciente PKU clásica a un paciente de PKU moderada) , o incluso más preferentemente, para permitir al paciente tener una ingesta mayor de 600 mg de Phe/día (es decir, la ingesta normal en la dieta) .

B. Características de los pacientes de PKTJ no sensibles a BH4 y métodos de tratamiento de estos de acuerdo con la presente invención Un segundo grupo de pacientes que puede ser tratado con los métodos de la presente invención son aquellos individuos a los que se ha determinado que tienen concentraciones elevadas de Phe en plasma, es decir, cualquier concentración que sea mayor de 200 µM/L, pero que hayan sido diagnosticados como no sensibles al tratamiento con BH4 (según se determina por la prueba de carga de BH4 descrita más adelante) . Estos pacientes pueden ser aquellas personas qué tienen PKU leve (es decir, concentraciones plasmáticas de Phe de hasta 600 µM/L) , personas que tengan PKU moderada (es decir, concentraciones plasmáticas de Phe entre 600 µM/L a aproximadamente 1200 µM/L) , así como pacientes que tengan PKU grave, clásica (es decir, concentraciones plasmáticas de Phe mayores de 1200 µM/L) .

Los pacientes que son no sensibles al tratamiento de BH4 reciben BH4 en combinación con una cantidad reducida de proteína en su dieta para disminuir las concentraciones plasmáticas de Phe del paciente. Los métodos de la presente invención son tales ' que la administración del tratamiento con BH4 produce una disminución mayor en las concentraciones plasmáticas de Phe del paciente en comparación con la disminución que se produce con el mismo protocolo de dieta administrado en ausencia del tratamiento con BH4.

En las modalidades preferidas, se administra a los pacientes una composición que contiene una forma cristalizada, estabilizada, de BH4 caracterizada en el Ejemplo 2 que se describe más adelante en la presente. Esta composición de BH4 difiere de las anteriormente disponibles en la técnica en cuanto a que es más estable a temperatura ambiente comparado con las preparaciones antes conocidas para los expertos en la técnica, por ejemplo, las disponibles en los kits para carga de BH4 (Schircks Laboratorios, Joña, Suiza) así pues, la formulación de BH4 puede almacenarse a' temperatura ambiente o refrigerarse y conservar mayor potencia que las composiciones de BH4 anteriormente disponibles. Como tal, se contempla que esta forma de BH4 tendrá mayor eficacia terapéutica en comparación con una concentración semejante de las composiciones de BH4 antes disponibles. Esta mayor eficacia puede utilizarse para producir un resultado terapéutico eficaz incluso en pacientes que fueron anteriormente identificados como no sensibles a BH4.

Al igual que con la subserie de pacientes descrita en la sección IA anterior, los pacientes no sensibles a BH4 descritos en la presente sección pueden ser tratados por las composiciones de BH4 estabilizada solas o en combinación con restricciones dietéticas. Las restricciones dietéticas pueden ser como una dieta que limita la ingesta de Phe proporcionando una fórmula de proteína médica sintética que tenga una cantidad disminuida de Phe o de otro modo la restricción dietética puede ser aquella que simplemente requiere que el paciente limite su ingesta total de proteínas pero no obstante permita al paciente ingerir productos alimenticios normales en cantidades limitadas.

Los resultados preferidos descritos para pacientes de PKU clásica en la sección IA anterior se incorporan en la sección presente como referencia. Los resultados terapéuticos preferidos para pacientes con PKU moderada (es decir, pacientes que tengan una concentración de Phe en plasma sin dieta restringida de 600 µM/L a 1200 µM/L) incluyen por lo menos un 25% de disminución en las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Preferentemente, el método producirá una disminución de 30% en las concentraciones de Phe plasma. Incluso más preferentemente, el método producirá una disminución de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mayor en la concentración de Phe en plasma de la persona (por ejemplo, cuando un paciente con PKU clásica, moderada, tenga una concentración de Phe de 1000 µM/L, una disminución de 90% en la concentración de Phe producirá una concentración plasmática de Phe de 100 µM/L, una concentración que es suficientemente baja para necesitar poca restricción dietética) .

En las modalidades preferidas, las concentraciones de Phe en plasma de los pacientes PKU moderados que se estén tratando se reducen de cualquier cantidad de la concentración de Phe en plasma sin restricción que sea mayor de 600 µM/L a 1200 µM/L a cualquier nivel de Phe em plasma que sea menor que 300 µiM/L. Un tratamiento particularmente preferido con la BH4 (sola o en combinación con la restricción dietética) produce una disminución en la concentración de Phe en plasma, por ejemplo, hasta un nivel de entre 200 µM/L a aproximadamente 400 µM/L, que se observará como un resultado clínico útil del tratamiento porque los pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma en este intervalo pueden manejar la disminución simplemente restringiendo la cantidad de proteína en la dieta, contrario a comer una fórmula restringida en Phe.

En realidad, en muchos estudios, se piensa que estos pacientes pueden incluso comer una dieta normal.

Cualquier aumento en la cantidad de las concentraciones de Phe en la dieta que pueda tolerar el paciente como resultado del tratamiento será considerado como un resultado terapéutico eficaz. Por ejemplo, se piensa que como resultado de administrar el tratamiento a base de BH4 (solo o en combinación con otra intervención terapéutica) , el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe dietética de 350-400 mg/día a 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a la Phe del paciente se altera de el de un paciente de PKU moderada a un paciente de PKU leve) . Desde luego, sería preferible que la intervención terapéutica considerada en la presente permita al paciente aumentar su ingesta de Phe dietética de 350-400 mg/día a 400 para permitir que el paciente tenga una ingesta mayor de 600 mg de Phe/día (es decir, la ingesta dietética normal) .

Incluso si el paciente que esta siendo tratado es aquel que manifiesta solo PKU leve, es decir, si tiene una tolerancia dietética de 400-600 mg de la ingesta de Phe/día) se beneficiará de los tratamientos a base de BH4 de la presente invención porque se desea producir una concentración normalizada de Phe en plasma que este tan cercano a 360 µM/L ± 15 µM/L como sea posible. Para estos pacientes, un resultado terapéutico preferido incluirá por lo menos una disminución de 25% en la concentración plasmática de Phe del paciente. Preferentemente, el método producirá una disminución de 30% en la concentración plasmática de Phe. Incluso más preferentemente, el método producirá una disminución de 40%, 50%, 60% o mayor en la concentración de Phe en plasma de la persona (por ejemplo, cuando un paciente con PKU leve tiene una concentración de Phe de 600 µM/L, una disminución de 60% en la concentración de Phe producirá una concentración de Phe en el plasma de 360 µM/L, es decir, una concentración normal, aceptable de Phe en plasma) .

En las modalidades preferidas, las concentraciones de Phe en plasma del paciente con PKU leve que se este tratando se reduce de cualquier cantidad de concentración de Phe en plasma sin restricción que sea entre 400 µM/L a 600 µM/L a cualquier concentración de Phe en plasma que sea menor de 100 µM/L. Desde luego, incluso si el tratamiento con la BH4 (sola o en combinación con una restricción dietética) produce una disminución menor en la concentración de Phe en plasma, por ejemplo, a un nivel de entre 200 µM/L a aproximadamente 400 µM/L, esto se verá como un resultado clínico útil del tratamiento.

Cualquier aumento en la cantidad de las concentraciones de Phe en la dienta que pueda tolerar el paciente como resultado del tratamiento será considerado como un resultado terapéutico eficaz. Por ejemplo, se considera que como resultado de la administración del tratamiento a base de BH4 (solo o en combinación con otra intervención terapéutica) , el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe dietética de 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a la Phe del paciente se altera de la de un paciente con PKU leve a un paciente HPA leve) para permitir que el paciente tenga una ingesta mayor de 600 mg de Phe/día (es decir, la ingesta dietética normal) .

Cualquier aumento en la cantidad de las concentraciones de Phe en la dieta que pueda tolerar el paciente como resultado del tratamiento será considerado como un resultado terapéutico eficaz. Por ejemplo, se considera que como resultado de la administración del tratamiento a base de BH4 (solo o en combinación con otra intervención terapéutica) , el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe dietética de 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a la Phe del paciente se altera de la de un paciente con PKU leve a un paciente HPA leve (para permitir que el paciente tenga una ingesta mayor de 600 mg de Phe/día (es decir, la ingesta dietética normal) .

Más aún, incluso si el paciente es aquel que solo manifiesta los síntomas de HPA no PKU, es decir, que tenga una concentración de Phe en plasma elevada de hasta 600 µM/L, pero por el contrario puede comer una dieta normal en proteínas se beneficiará de los tratamientos con BH4 de la invención porque ha demostrado que las concentraciones de Phe elevadas tienen efecto significativos sobre el IQ de estas personas. Más aún, como se describe más adelante, la intervención terapéutica a base de BH4 de las personas con necesidades especiales, es decir, mujeres embarazadas y bebés, es particularmente importante incluso si las concentraciones plasmáticas de Phe de estos pacientes están dentro de las concentraciones consideradas como "seguras" menores de 200 µM/L.

C. PKU materna y métodos de tratamiento de esta de acuerdo con la presente invención El control metabólico de las concentraciones de Phe en plasma en mujeres con PKU que planean concebir y aquellas que están embarazadas es importante por las consecuencias graves al feto expuesto a concentraciones de Phe incluso moderadamente elevadas in útero, independientemente del estado PAH del feto. El control terapéutico de la concentración de Phe en plasma es importante especialmente en el primer trimestre del embarazo, en vista de que la falta de control adecuado dará como resultado alteraciones que incluyen microcefalia, deficiencia mental y cardipatía congénita.

Por ejemplo, la Declaración Consenso del NIH (vol 17 # 3, octubre de 2000) sobre la fenilcetonuria reporto que la exposición de un feto a concentraciones de Phe materna de 3-10 mg/dL produjo una incidencia de 24% de microcefalia, mientras que los expuestos a más de 20 mg/dL (es decir, mayores de 1200 µM/L) tuvieron una incidencia de 73% de microcefalia. De igual manera la cardiopatía congénita se encuentro en aproximadamente 10% de niños expuestos a concentraciones de Phe materna mayores de 20 mg/dL. Es importante señalar que se ha observado que los niveles de Phe mayores de 6 mg/dL disminuyen significativamente en el IQ del niño. Así pues, es importante garantizar que la concentración plasmática de Phe de mujeres con todas las formas de fenilcetonuria, incluso aquellas que manifiestan la HPA más leve, deben ser controladas estrechamente para evitar el riesgo del síndrome de PKU materna. No obstante, las concentraciones diana aceptables para las concentraciones de Phe en plasma de mujeres PKU que han sido utilizadas en las clínicas de EUA han abarcado entre 10 mg/dL y 15 mg/dL, las cuales son mucho mayores que las concentraciones de 2-6 mg/dL sugeridas para mujeres embarazadas o el 1-4 mg/dL que se utilizan en las clínicas de Inglaterra o Alemania para disminuir los riesgos de desarrollar síndrome de PKU materno.

Otro aspecto importante para mujeres embarazadas es su ingesta total de proteínas. Durante el embarazo es importante que la mujer coma suficiente proteína porque se ha sugerido que una dieta baja en proteínas durante el embarazo ocasionará desarrollo renal retardado y reducción posterior en el número de nefronas y conducirá potencialmente a la hipertensión en la adultez. (D'Agostino, N. Engl . J. Med. 348 (17) 1723-1724 2003) . La siguiente tabla proporciona lineamientos ejemplares para la ingesta total recomendada de proteína en la dieta para diferentes personas .

Tabla: Lineamientos en Estados Unidos para los requisitos de proteína en la dieta La cantidad real de proteína ingerida depende del contenido de Phe de la proteína. Los perfiles de aminoácidos de las proteínas vegetales son diferentes de las proteínas animales. Por ejemplo, con un enfoque en almidones y vegetales, una regla general de 45-50 mg/Phe por gramo de proteína puede ser suficiente. No obstante, una forma aceptada para evaluar los aminoácidos constituyentes de una proteína en una clara de huevo, la cual contiene 3.5 gramos de proteína de la cual 204 mg es Phe.

Como se puede observar de los lineamientos ejemplares anteriores, en Estados Unidos, la ingesta recomendada de proteína para mujeres de edad reproductiva (por ejemplo menores de 51) es desde aproximadamente 44 a 50 g/día, mientras que el requisito de mujeres embarazadas se recomienda una ingesta de aproximadamente 60 g/día. En Canadá y el Reino Unido la ingesta recomendada de proteínas para mujeres embarazadas es en el orden de aproximadamente 70 g/día y 52 g/día. Así pues, la necesidad de garantizar que las concentraciones de Phe en plasma de mujeres embarazadas se controle estrechamente se complica además por el hecho de que este grupo de pacientes PKU necesita más proteína que las mujeres PKU no embarazadas de la misma edad.

En vista de lo anterior, se considera que los tratamientos a base de BH4 de la presente invención serán particularmente útiles en mujeres embarazadas. Se considera que una mujer que sufre de cualquier forma de HPA que este embarazada o que contemple embarazarse se pondrá en tratamiento de BH4 para garantizar que sus concentraciones de Phe en plasma se mantengan tan cerca de 180 µM/L a aproximadamente 360 µM/L como sea posible. Un curso de tratamiento como este preferentemente permitirá que la mujer aumente su nivel de ingesta de proteína normal .

La discusión de las concentraciones de Phe en plasma y los grados a las que tales concentraciones de Phe deben ser disminuidas descritas en la presente en las secciones ÍA y IB se incorporan en la presente sección para mujeres embarazadas.

D. Manejo de PKU en recién nacidos y métodos de tratamiento de estos de acuerdo con la presente invención Como se describe a lo largo de la presente, se ha determinado que una elevación en la concentración plasmática de Phe en recién nacidos (en edades de 0 a 3 años) da como resultado una caída significativa en el IQ del niño. No obstante, como se ha descrito en otra parte de esta especificación, los pacientes que tienen una concentración elevada de Phe en plasma de cualquier otra hasta 400 µM/L no reciben normalmente ninguna intervención dietética. Así pues, los recién nacidos a la edad de 0 hasta 3 años de edad sufren de efectos perjudiciales significativos por los tratamientos presentes. La presente solicitud considera el tratamiento de cualquier bebé que tenga una concentración de Phe en plasma sin dieta restringida que sea mayor de 360 µM/L ± 15 µM/L con una composición terapéutica que contenga BH4 para producir una disminución benéfica en la concentración de Phe en plasma de ese individuo.

En modalidades preferidas, el bebé tiene entre cero y 3 años de edad y tiene una concentración de Phe en plasma no restringida de aproximadamente 1200 µM/L antes de la administración de BH4 y la administración disminuye la concentración de Phe en plasma. Preferentemente, la concentración de Phe en plasma se disminuye desde más de 1800 a aproximadamente 150 µM/L, aproximadamente 1200 µM/L, aproximadamente 1100 µM/L, aproximadamente 1000 µM/L, aproximadamente 900 µM/L, aproximadamente 800 µM/L, aproximadamente 700 µM/L, aproximadamente 600 µM/L, aproximadamente 550 µM/L, aproximadamente 500 µM/L, aproximadamente 450 µM/L, aproximadamente 400 µM/L, aproximadamente 350 µM/L, aproximadamente 300 µM/L, aproximadamente 275 µM/L, aproximadamente 250 µM/L tras la administración. En otras modalidades, el bebé tiene edades entre cero y 3 años de edad y tiene una concentración de Phe en plasma no restringida mayor de 1200 µM/L, y preferentemente, esta concentración de Phe en plasma disminuye a aproximadamente 800 µM/L, o más preferentemente a aproximadamente 500 µM/L o incluso más preferentemente a aproximadamente 360 µM/L, tras la administración de BH4, solo o en combinación con la dieta. Los expertos en la técnica comprenderán que la invención considera el tratamiento de los recién nacidos con concentraciones de Phe en plasma y dieta no restringida mayores de 360 µM/L con BH4 para producir disminuciones en estas concentraciones de Phe en plasma. La discusión de las reducciones terapéuticas de las concentraciones de Phe en plasma de las secciones 1A y IB anteriores se incorporan en la presente para referencia. Más aún, cualquier disminución de más o menos 10% de la concentración de Phe en plasma no restringida, inicial, será considerada como un resultado terapéutico para los esquemas terapéuticos para los niños. Debe entenderse que los tratamientos con BH4 pueden ser combinados con restricciones dietéticas para efectuar la disminución terapéutica de las concentraciones de Phe en plasma en estos bebés.

II Composiciones para el tratamiento La presente invención se refiere a la intervención terapéutica de PKU/HPA. Tal intervención se basa en principio en el uso de BH4. La BH4 puede utilizarse sola o en combinación con restricciones dietéticas. Además, la BH4 y/o las restricciones dietéticas además se pueden combinar con otras composiciones terapéuticas que estén diseñadas, por ejemplo, para combatir otras manifestaciones de PKU, por ejemplo, los aminoácidos neutros grandes para prevenir la acumulación de Phe en el cerebro (Ver Koch y col., Mol. Genet. Metanol. 79: 110-113, 2003) o suplementos de tirosina. La presente sección proporciona una discusión de las composiciones que se pueden utilizar en los tratamientos considerados en la presente.

A. Composiciones de BH4 BH4 es un cofactor en la hidroxilación de Phe y antes de la presente invención, se demostró que menos de 2% de los pacientes que tienen Phe elevada al nacer tienen defectos en la síntesis de BH4. Con estas personas que fueron identificadas como sensibles a BH4, se sugirió que los pacientes serían no sensibles a la intervención dietética y por tanto, estas personas serían alimentadas con una dieta normal pero administrándoles tratamiento de BH4 sola. Así pues, antes de la presente invención, había muchas dudas en cuanto a los beneficios terapéuticos de la administración de BH4 a pacientes PKU/HPA. No obstante, como se discute a lo largo de la presente, la BH4 puede ser administrada para una intervención terapéutica de pacientes que hayan sido diagnosticados como no sensibles a BH4. Más aún, la presente invención muestra que el tratamiento con BH4 puede combinarse con restricciones dietéticas para obtener un resultado terapéutico en individuos que sean sensibles a la prueba de carga de BH4 así como a personas que no sean sensibles a la carga de BH4.

Las Patentes US Nos. 5,698,408; 2,601,215; 3505329; 4,540,783; 4,550,109; 4,487,340; 4,595,752; 4/649,197; 4,665,182; 4,701,455; 4,713,454; 4,937,342; 5,037,981; 5,198,547; 5,350,851; 5,401,844; 5,698,408; y la solicitud Canadiense CA 2420374 (cada una incorporada en la presente para referencia) cada una describe los métodos para preparar dihidrobiopterinas, BH4 y derivados de estos que se pueden utilizar como composiciones para la presente invención. Cualquiera de estos métodos puede utilizarse para producir composiciones de BH4 para utilizarlas en los métodos terapéuticos de la presente invención.

Las Patentes US Nos. 4,752,573; 4,758,571; 4,774,244; 4,920,122; 5,753,656; 5,922,713; 5,874,433; 5,945,452; 6,274,581; 6,410,535; 6,441,038; 6,544,994; y las Publicaciones de Patentes US 20020187958; US 20020106645; US 2002/0076782; US 20030032616 (cada una se incorpora en la presente para referencia) cada una describe métodos para administrar composiciones de BH4 para tratamientos no PKU. Cada uno de estas patentes se incorpora en la presente para referencia proporcionando una enseñanza general de los métodos para administrar las composiciones de BH4 conocidas para los expertos en la técnica, los cuales pueden adaptarse para el tratamiento de PKU/HPA como se describe en la presente.

Además de los métodos generales anteriores para preparar BH4, la presente invención considera particularmente la preparación y uso de una composición de BH4 que sea una composición de BH4 estabilizada. Preferentemente, la composición de BH4 estabilizada es una forma cristalina. Los métodos para preparar las composiciones de BH4 estabilizada para utilizarla en la presente invención se describen en el ejemplo 2. Una forma cristalina como esta puede probar utilidad como aditivo a las fórmulas de proteína tradicionales para el tratamiento de PKU. La forma cristalina también puede formularse convenientemente en tabletas, polvo u otro sólido para administración oral. Las formas y vías de administración de BH4 se discuten además con detalle en la sección Composiciones Farmacéuticas más adelante.

En modalidades preferidas se considera que los métodos de la presente invención proporcionarán a un paciente que lo necesite una dosis diaria de entre aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de BH4. Desde luego, un experto en la técnica puede ajustar esta dosis hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la eficacia que este logrando mediante la administración. La dosis diaria puede ser administrada en una sola dosis o de lo contrario se puede administrar en múltiples dosis en intervalos convenientemente separados. En modalidades ejemplares, la dosis diaria puede ser 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 22 mg/kg, 24 mg/kg, 26 mg/kg, 28 mg/kg, 30 mg/kg, 32 mg/kg, 34 mg/kg, 36 mg/kg, 38 mg/kg, 40 mg/kg, 42 mg/kg, 44 mg/kg, 46 mg/kg, 48 mg/kg, 50 mg/kg o más mg/kg.

Independientemente de la cantidad de BH4 que se administre, es deseable que la administración disminuya la concentración de Phe en plasma de los pacientes a las concentraciones que se discuten en la sección I para los diferentes tipos de pacientes.

B. Proteína dietética Además de administrar BH4 y los análogos relacionados a los pacientes de HPA/PKU, se considera que la proteína dietética de los pacientes también se puede restringir o modificar. Los expertos en la técnica están concientes de las diferentes fórmulas de proteínas disponibles en el comercio para utilizarlas en el tratamiento de PKU. Estas fórmulas incluyen MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2, (Ross Laboratorios, Liverpool, UK) , LOFENALAC, PHENYL-FREE (Mead-Johnson) , y similares.

Los expertos en la técnica pueden utilizar las fórmulas de proteínas mencionadas que están 'generalmente libres de concentraciones de Phe. Las fórmulas de proteína muchas veces están suplementarias con aminoácidos que están en cantidades deficientes en los pacientes PKU. Estos aminoácidos pueden ser, por ejemplo, L-tirosina y L-glutamina. Se ha sugerido que puede ser deseable suplementar la dieta de los pacientes PKU con valina, isoleucina, y leucina (ver Patente US No. 4,252,822). En ciertas manifestaciones clínicas, los efectos tóxicos de PKU son causados por la Phe que bloquea la absorción de otros aminoácidos como tirosina y triptofano al cerebro. Se ha encontrado que la suplementación de la dieta de un paciente PKU con exceso de tales aminoácidos neutros, grandes, bloquea la absorción de Phe en el cerebro y reduce las concentraciones de Phe en el cerebro. Así pues, se considera que para los métodos de la presente invención, el esquema dietético además pueda ser suplementado con composiciones que contengan uno o más de estos aminoácidos (Koch y col., Mol. Genet. Metanol. 79: 110-113, 2003) .

Más aún, como es sabido que L-carnitina y taurina que normalmente se encuentra en la leche humana y otros productos alimenticios de origen animal también deben ser suplementarios además de la restricción de proteínas. En algunas modalidades, la L-carnitina puede ser suministrada como 20 mg/100 g del suplemento de proteínas, y la taurina puede ser suplementaria como 40 mg/g del suplemento de proteínas para ayudar a suministrar cantidades de estos factores que normalmente se encuentran en la leche humana y los productos alimenticios de origen animal.

Además, los expertos en la técnica pueden referirse al 2000 National Academy of Scieces-National Research Council Dieatary Reference Intakes para otro listado de otros componentes, como vitaminas y minerales esenciales que deben ser suministrados a los pacientes para garantizar que otros suplementos se están proporcionando a pesar de las restricciones proteínicas dietéticas.

En relación con la tabla que se presenta en la sección le anterior para las cantidades de proteína total y las cifras que se presentan en la Tabla Sección I en general para las concentraciones de Phe en plasma deseadas, un experto en la técnica podrá determinar la cantidad de restricción de la proteína en la dieta que sea necesaria y así ajustar la dieta del paciente en consecuencia. Tomando por ejemplo un hombre de aproximadamente 11-14 años de edad, esta persona debe preferentemente recibir 45 g de proteína/día. En el caso de que la persona tenga PKU clásica grave, su concentración de Phe en plasma sin restricción probablemente será mayor de 1200 µM/L, y en el mejor de los casos, si no toda la fuente de proteína dietética para ese individuo es probablemente de un suplemento de proteína en polvo que preferentemente reduzca sus concentraciones de Phe en plasma de menos de 600 µM/L.

Al administrar BH4 a esa persona, un resultado terapéutico sería aquel que produzca disminución mayor en las concentraciones de Phe en plasma del paciente o de otro modo, el resultado terapéutico será aquel en el que las concentraciones de Phe en el plasma de la persona se reduzcan en un grado semejante, pero que la persona pueda tolerar la proteína de una dieta normal en lugar de una fórmula dietética.

Del mismo modo, un varón de aproximadamente 11-14 años de edad es aquel que tiene PKU moderada, puede ser posible utilizar los métodos de la presente invención para darle los 45 g de proteína/diario permitidos a través de la ingesta normal de proteínas y no una fórmula restringida. La determinación si los métodos de la invención son eficaces consistirá en determinar las concentraciones de Phe en el plasma del paciente regularmente para garantizar que las concentraciones de Phe en plasma permanecen por debajo de por lo menos 400 µM/L. Las pruebas para determinar estas concentraciones se describen más adelante. Preferentemente es consiguen concentraciones menores o aproximadamente de 360 µM/L.

III . Identificación y monitorización de las poblaciones de pacientes Como se describe a lo largo de la presente, será necesario en diferentes modalidades de la presente invención determinar si una persona es sensible al tratamiento de BH4, y determinar las concentraciones de fenilalanina del paciente al principio para identificar la clase de paciente PKU que esta siendo tratado y durante un esquema de tratamiento continuo para monitorizar la eficacia del esquema. Los ejemplos de estos métodos se describen a cotinuación.

A. Prueba de carga de BH4 Para identificar a un paciente como sensible a BH4, los expertos en la técnica realizan una prueba ' de "carga de BH4". Se han utilizado dos tipos de prueba de carga para lograr el diagnóstico diferencial de HPA. La primera es una prueba de carga de BH4 oral, sencilla y la segunda es una prueba de carga combinada fenilalanina/BH4.

La prueba de carga de BH4 más sencilla es aquella en la que se administra BH4 hexógena y se determinan los efectos de la administración sobre la reducción de las concentraciones de Phe en plasma. La carga intravenosa de 2 mg/kg de BH4 inicialmente se propuso por Danks y col., {Lancet 1:1236,1976), en vista de que ahora se dispone de BH4 de mayor pureza se ha hecho posible realizar la prueba utilizando una administración oral de BH4 en cantidades de aproximadamente 2.5 mg/kg de peso corporal. Por último, Niederweiser y col., propusieron un enfoque normalizado en el que se administran 7.5 mg/kg en una dosis oral única de BH4 {Eur. J. Pediatr. 138: 441, 1982) , aunque algunos laboratorios todavía utilizan ascensos de 20 mg de BH4/kg de peso corporal. Esta prueba permite la discriminación entre pacientes que tienen HPA debido a una deficiencia en BH4 o por una deficiencia en PAH.

Para la prueba de carga de BH4 más sencilla para producir resultados confiables, las concentraciones de Phe en sangre del paciente necesitan ser mayores de 400 µM/L. Por tanto, se acostumbra muchas veces que el paciente sea retirado de la dieta PKU durante 2 días antes de lleva a cabo la prueba de carga. Un kit para la prueba de BH4 esta disponible y lo distribuye Dr.

Schircks Laboratorios (Joña, Suiza) . Este equipo sugiere una dosis de 20 mg de BH4/kg de peso corporal aproximadamente 30 minutos después de ingesta de un alimento normal .

Como ya se mencionó, la concentración de Phe de un paciente en teoría necesita ser mayor de 400 µM/L para obtener una lectura de BH4 exacta. En la prueba de carga de fenilalanina/BH4 combinada, una administración oral de Phe (100 mg/kg de peso corporal) más BH4 (20 mg/kg de peso corporal) permite la detección selectiva de todas las deficiencias de BH4. Por lo regular, la Phe se administra en una dosis oral y es seguida aproximadamente 1 hora después con BH4. Las concentraciones de Phe en plasma se monitorizan antes y en intervalos convenientes (por ejemplo a la 1, 3, 5,' 9, 13 y 25 horas) después de la administración de Phe.

En la prueba de carga de BH4 simple o la prueba de carga de Phe/BH4 combinada se ha sugerido que una disminución en Phe en plasma mayor de 30% del valor de Phe en plasma antes del desafío de BH4 en el transcurso de 24 horas después de la carga es indicativa de sensibilidad a BH4 (Spaapen y col., Mol . Genet . And Metabol 78:93-99,2003).

Otros métodos para llevar a cabo las pruebas de carga de BH4 también pueden utilizarse. Los ejemplos de estas pruebas están descritos por ejemplo en Muntau y col., (N. Engl. J. Med. 347 (26): 2002) y Berneggar and Blau (Mol. Genet. Metabol. 77: 304-313, 2002). " En Berneggar y Blau, la prueba de carga de BH4 utiliza 20 mg/kg de BH4 y el muestreo en sangre para fenilalanina y torisina se realiza a las 0, 4, 8 y 24 horas para diferenciar entre quienes responden y no responden a BH4. La prueba se lleva a cabo después de por lo menos 3 horas de ayuno. Muestras de orina de neopterina y biopteina se prueban antes de la prueba. Después de una aplicación oral de 6R BH4 (20 mg/kg de peso corporal) , la ingesta de alimentos normal es permitida durante todo el periodo de pruebas . Las muestras de sangre se analizan para ver las mediciones de Phe y Tyr a las 0, 4, 8 y 24 horas. Se recolecta otra muestra de orina entre 4 y 8 horas. Durante la prueba en cualquier momento se puede medir también la actividad de la dihidroteridina reductasa. En pacientes que tienen niveles en plasma de fenilalanina menores de 400 µM/L o pacientes ya en una dieta baja en fenilalanina, Berneggar y Blau recomendaron una prueba de BH4-fenilalanina combinada en la que 100 mg de Phe/kg de peso corporal se administración por vía oral 3 horas antes de la administración de BH4.

Berneggar y Blau calcularon la sensibilidad a la BH4 como "fenilalanina hidroxilación" a las 4 y 8 horas después de la carga y se expresó como porcentaje de la fenilalanina eliminada. La pendiente (S) de las gráficas de las "velocidades de hidroxilación" a las 0, 4 y 8 horas se comparan a partir de diferentes productos de BH4 y diferentes grupos de pacientes. La pendiente discrimina entre pacientes que no responden, pacientes de respuesta lenta y pacientes que responden. Los pacientes que tienen respuesta lenta (ver Figura 5 en Berneggar y Blau) necesitan más tiempo para llegar a lo valores de corte de 360 µM/L y que la eficacia de la BH4 administrada depende de las concentraciones iniciales de fenilalanina.

Estos autores recomendaron que para algunos pacientes con una concentración de Phe en plasma de menos de 800 µM/L y para la mayoría de los pacientes con concentraciones plasmáticas de Phe mayores de 1200 µM/L debe tomarse una medición de la Phe a las 21 horas. Se puede utilizar una gráfica de Phe/S contra tiempo para estimar el tiempo necesario para alcanzar valores terapéuticos "inocuos" en plasma de Phe menores de 360 µM/L .

Muntau y col., (2002) también proporcionan pruebas ejemplares de carga de BH4 que se pueden utilizar para calcular los tiempos y concentraciones de la administración de Phe. De nuevo estos autores emplearon una prueba de carga combinada de Phe/BH4 en la que los pacientes reciben un alimento que contiene 100 mg de Phe/kilogramo de peso corporal. Una hora después del alimento se da a los pacientes una dosis oral de 20 mg/kg de BH4 (Schirks Laboratorios) . Se determinan las concentraciones de fenilalanina en sangre por espectrometría de masas por energía dispersiva antes de la carga de Phe así como antes y a las 4, 8, y 15 horas después de la carga de BH4. Los recién nacidos pueden ser alimentados con la leche materna, mientras que los pacientes ancianos reciben una ingesta normalizada de proteínas (10 mg de Phe/kg) entre 6-8 horas después de la carga de BH4. Monrau también describe métodos para la oxidación de Phe. Después de un ayuno de 4 horas y un ayuno durante la noche se administra por vía oral un total de 6 mg/kg de Phe etiquetada con 13C disuelta en solución de dextrosa. Después se recolectaron muestras del aliento durante 180 minutos y se almacenaron en tubos de vidrio al vacío. Después se analizaron las muestras utilizando espectrometría de masas con radiación de isótopos y se cálculo la recuperación de carbono 13 (Treacy y col., Pediat . Res . 42: 430-5, 1997).

Muntau y col., clasifica a los pacientes como sensibles a BH4 cuando las concentraciones de Phe en sangre 15 horas después del desafío con BH4 han disminuido más de 30% del valor obtenido antes de la administración de BH4. Un mejoramiento en la velocidad de oxidación, según se determinó por las mediciones de dióxido de carbono obtenidas durante los 180 minutos de prueba, se considero importante cuando la suplementación con BH4 aumento el valor de oxidación de Phe al menos 15%.

Los expertos en la técnica podrán utilizar cualquier método de los antes mencionados para determinar si una persona será sensible a BH4. Sin embargo, otros métodos equivalentes y relacionados para determinar la sensibilidad a BH4 también pueden ser conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser utilizados en lugar de los métodos antes descritos.

B . Determinación de las concentraciones de Phe Existen diversos métodos para determinar la presencia de Phe en la sangre (Shaw y col., Analytical methods in Phenylketonuria-clinical Biochemistry, inBickett y col . , Eds . Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism, Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-56197,1). Por lo regular, las concentraciones de fenilalanina y tirosina se determinan a partir de del suero de un paciente utilizando una valoración fluorométrica. Esta valoración depende de la formación de sustancias fluorescentes cuando se calienta la fenilalanina con ninhidrina en presencia de leucilalanina (McCaman y col., J. Lab. Clin . Med. 59: 885-890,1962) .

El método más común para la determinación de las concentraciones de Phe es la prueba de Guthrie en la cual se perforan discos de papel filtro que se han saturado con una muestra de sangre del paciente. Los discos se incuban en una bandeja de agar que se ha sembrado con Bacillus subtilis y contiene un inhibidor específico de crecimiento de Bacillus subtilis. Cuando la fenilalanina pasa de los discos uniformes sobre el agar, la fenilalanina invierte la inhibición del crecimiento bacteriano produciendo con ello un área de crecimiento bacteriano que puede estar correlacionada con la concentración de fenilalanina comparando con un análisis semejante realizado utilizando discos que contengan cantidades conocidas de Phe.

Otros métodos para cuantificar la concentración de Phe pueden ser HPLC, espectrometría de masas, cromatografía de capa delgada, y similares. Estos métodos pueden ser utilizados para determinar la concentración de Phe en plasma de un paciente antes del tratamiento y para monitorizar la concentración de Phe durante el esquema de tratamiento y determinar la eficacia de este.

Se considera que las concentraciones de Phe en plasma de los pacientes serán monitorizadas en plazos convenientes (por ejemplo diario, cada 2 días o cada semana) a lo largo del tiempo del esquema de tratamiento. Al monitorizar las concentraciones de Phe en plasma con regularidad, el médico podrá evaluar la eficacia del tratamiento y ajustar en consecuencia los requisitos de BH4 y/o de proteína diaria.

IV. Tratamiento combinado Algunos métodos de la invención consisten en el uso combinado de BH4 y la restricción de proteína de la dieta para obtener un resultado terapéutico en pacientes con diferentes formas de HPA. Para lograr el resultado terapéutico apropiado en los tratamientos combinados que se toman en cuenta en la presente, por ló regular se administraría al individuo la composición de BH4 y la restricción en la dieta en una cantidad combinada eficaz para producir el resultado terapéutico deseado (es decir, una reducción en la concentración plasmática de Phe y/o la posibilidad de tolerar mayores cantidades de ingesta de Phe/proteína sin producir un aumento concurrente en las concentraciones plasmáticas de Phe) . Este proceso puede consistir en administrar la composición de BH4 y la composición terapéutica de la proteína dietética al mismo tiempo. Esto se puede obtener administrando una sola composición o la formulación farmacológica de proteínas que incluya todos los requisitos de la proteína diaria y también incluya la BH4 dentro de la formulación de proteínas. De otro modo, la proteína de la dieta (suplemento o alimento normal en proteínas) se toma aproximadamente al mismo tiempo que la formulación farmacológica (tableta, inyección o bebida) de BH4. También se puede formular la BH4 en una barra de proteínas u otro producto alimenticio como brownies, pastelillos, pastel, adecuados para la ingestión.

En otras alternativas, el tratamiento con BH4 puede continuar o seguir al tratamiento dietético de proteínas en plazos que abarquen desde minutos hasta horas. En modalidades donde se administran la proteína " y las composiciones de BH4 separadas, en general se podría garantizar que no transcurra un tiempo significativo entre el tiempo de cada suministro, de modo que la BH4 todavía pueda ejercer un efecto ventajoso sobre el paciente. En tales casos se considera que se podría administrar la BH4 en el transcurso de aproximadamente 2-6 horas (antes o después) de la ingestión de la proteína de la dieta, siendo preferible un retardo de solo aproximadamente una hora. En algunas modalidades, se considera que el tratamiento con BH4 será un tratamiento continuo donde se administre una dosis diaria de BH4 al paciente en forma indefinida. En otros casos, por ejemplo, en mujeres embarazadas que tengan solo las formas leves de PKU y HPA, puede ser que el tratamiento con BH4 solo se continúe durante tanto tiempo como la mujer este embarazada y/o lactando.

Más aún, además de los tratamientos basados solamente en el suministro de BH4 y el control de la proteína en la dieta, los métodos de la presente invención también toman en cuenta los tratamientos combinados con una tercer composición que se dirija específicamente a uno o más de los síntomas de HPA. Por ejemplo, se sabe que la deficiencia de tirosina causada por HPA da como resultado una deficiencia en los neurotransmisores dopamina y serotonina. Por tanto, en el contexto de la presente invención se considera que los métodos a base de BH4 y la proteína dietética podrían además combinarse con la administración de los neurotransmisores L-dopa, carbidopa y 5-hidroxitriptofano para corregir los defectos resultantes de las cantidades disminuidas de tirosina en la dieta.

Además, el tratamiento génico con PAH (Christesen y col., Mol . Gent . And Metabol . 76: 313-318, 2002; Cristensen y col, Gene. Therapy, 7: 1971-1978, 2000) y fenilalanina amoniaco-liasa (PAL Liu y col., Arts. Cells. Blood. Subs . And Immob. Biotech. 30 (4) 243-257, 2002) ha sido tomada en cuenta por los expertos en la técnica. Las técnicas de tratamiento génico como estas podrían utilizarse en combinación con los tratamientos combinados basados en BH4/restricción de proteína de la dieta de la invención. Otros tratamientos combinados se piensa que la fenilasa se puede proporcionar como enzima inyectable para destruir las concentraciones menores de Phe en el paciente. En vista de que la administración de fenilasa no produciría tirosina (a diferencia de la administración de PHA) , un tratamiento como este todavía daría como resultado que la tirosina siga siendo aminoácido esencial para estos pacientes. Por tanto, puede ser deseable para suplementación dietética con tirosina para pacientes que reciben fenilasa en combinación con tratamiento con BH4.

V. Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas para la administración de conformidad con la presente invención pueden contener una primera composición que contenga BH4 en una forma aceptada para uso farmacéutico, como una opción, en combinación con un portador aceptado para uso farmacéutico. Estas composiciones pueden ser administradas por cualquier medio que consigan sus fines propuestos. Las cantidades y esquemas para la administración de una composición de conformidad con la presente invención pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica para el tratamiento de PKU. Como ya se menciono, los expertos en la técnica al principio podrían emplear cantidades y esquemas de BH4 actualmente propuesto en un contexto médico, por ejemplo, aquellas composiciones que se estén proponiendo para modular la actividad de la NOS o para utilizarlos en el tratamiento del dolor o depresión como se describe en las patentes enlistadas en la sección II anterior. Cualquiera de los protocolos, formulaciones, vías de administración y similares descritos que se han utilizado para administración de BH4 para pruebas de carga se pueden modificar fácilmente para utilizarlos en la presente invención.

Las composiciones y métodos descritos en la presente no se limitan al uso de una forma específica de BH4, o forma de un análogo o derivado de BH4. En realidad, se considera que las composiciones y métodos dentro del alcance de esta invención incluyen todas las composiciones que contengan cualquier forma de BH4, y cualquier forma de un análogo o derivado de este en una cantidad eficaz para obtener su fin propuesto. Los ejemplos no limitadores de los análogos para utilizarlos en las composiciones y métodos descritos en la presente pueden ser pteridina, pterina, neopterina, biopterina, 7, 8-dihidrobiopterina, 6-metiltetrahidropterina, y otras tetrahidropterinas sustituidas en la posición 6 y tetrahidropterinas sustituidas en la posición 6, sepiapterina, 6, 7-dimetiltetrahidropterina, 6-metilbiopterina y otras biopterinas sustituidas en la posición 6 y otros análogos que se describen en la técnica. Los ejemplos no limitadores de los derivados que se utilizan en las composiciones y los métodos descritos en la presente pueden ser los derivados descritos en las Patentes US Nos, 4,758,571; 4,774,244; 6,162,806; 5,902,810; 2,955,110; 2,603,643; y 4,371,514, la descripciones de las cuales se incorporan por este medio como referencia.

Algunos métodos terapéuticos de la presente invención toman en cuenta un tratamiento combinado en el que las composiciones a base de BH4 se administran además de una dieta proteínica modificada, las composiciones farmacéuticas de la invención también toman en cuenta todas las composiciones que contengan un agente terapéutico a base de por lo menos BH4, análogos u homólogos de este en una cantidad eficaz para obtener la mejoría de uno o más de los síntomas de PKU si se administra en combinación con la dieta proteínica modificada. Desde luego, el síntomas más evidente que se puede aminorar es que el tratamiento combinado produce una disminución en la concentración plasmática de Phe, no obstante, se pueden monitorizar otros síntomas como los cambios en IQ, función ejecutiva, concentración, estado de ánimo, estabilidad conductual, desempeño en el trabajo y similares. Tales indicaciones se monitorizan utilizando las técnicas bien conocidas para los expertos en la materia.

Polimorfos cristalinos de la sal diclorhidrato de (6R)L-tetrahidrobiopterina Se ha encontrado que BH4, y en particular, la sal diclorhidrato de BH4, presenta polimorfismo cristalino. La estructura de BH4 se muestra a continuación: La forma (6R) de BH4 es la forma biológica activa conocida, no obstante, BH4 también es conocida por ser inestable a temperaturas ambientes. Se ha encontrado que un polimorfo cristalino de BH4 es más estable, y es estable a la descomposición en condiciones ambientales.

Es difícil manipular la BH4, y por tanto, se produce y distribuye como su sal diclorhidrato (Schircks Laboratories, Joña, Suiza) en ampolletas selladas bajo nitrógeno para evitar la degradación de la sustancia por su naturaleza higroscópica y sensibilidad a la oxidación. La Patente US No, 4,649,197 describe la separación del diclorhidrato de (6R)- y 6 (S) -L-eritro-tetrahirobiopterina en sus diasterómeros la cual es difícil por la deficiente cristalinidad del diclorhidrato de 6 (R, S) -L-eritro-tetrahidrobiopterina. La Patente Europea No. 0 079 574 describe la preparación de tetrahidrobiopterina, en la que se obtiene como intermediario un diclorhidrato de tetrahidrobiopterina sólido. S. Matsuura y col., describen en Chemistry Letters 1984, páginas 735-738 and Heterocicles, vol. 23, No. 12, 1985 páginas 3115-3120 el 6(R)-tetrahidrobiopterina como un sólido cristalino en forma de agujas incoloras, las cuales se caracterizan por el análisis de rayos X descrito en J. Biochem. 98, 1341-1348 (1985). Se encontró una rotación óptica de 6.81° del producto cristalino, la cual es muy semejante a la rotación óptica de 6.51° documentada para un sólido cristalino en forma de cristales blancos en el ejemplo 6 de EP-A2-0 191 335.

Los resultados obtenidos durante el desarrollo del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina indicó que el compuesto puede existir en diferentes formas cristalinas, incluidas las formas polimórficas y solvatos. El interés continuo en este campo requiere de un método eficiente y confiable para la preparación de las formas cristalinas individuales del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina y las condiciones de cristalización controladas para obtener las formas cristalinas, que preferentemente sean estables y fáciles de manipular y procesar en la fabricación y preparación de las formulaciones, y que proporcione una elevada estabilidad durante el almacenamiento en la forma de la sustancia o como producto formulado, o que proporcione formas menos estables adecuadas como intermediarios para la cristalización controlada para la fabricación de forma estables .

Polimorfo forma B El polimorfo cristalino que se ha encontrado más estable se conoce en la presente como "forma B", o de otro modo como "polimorfo B". Los resultados obtenidos en la investigación y desarrollo del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina revelaron que existen diferentes sólidos cristalinos conocidos que se han preparado, pero ninguno ha reconocido el polimorfismo y su efecto sobre la estabilidad de los cristales de BH4.

El polimorfo B es un anhidrato ligeramente higroscópico con la estabilidad termodinámica más alta por encima de aproximadamente 20 °C. Además, la forma B se puede procesar y manipular fácilmente por su estabilidad térmica, tal vez para la preparación en condiciones elegidas, su morfología y tamaño de partícula adecuado. El punto de fusión es casi 260°C (?Hf>1400 J/g), pero ningún punto de fusión claro se puede detectar por la descomposición antes y durante la fusión. Estas propiedades sobresalientes convierte a la forma B del polimorfo especialmente factible para aplicación farmacéutica, el cual se prepara a temperaturas elevadas. El polimorfo B se puede obtener como un polvo fino con un tamaño de partícula que puede abarcar desde 0.2 µm hasta 500 µm.

La forma B presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, expresado en valores d (Á) a: 8.7 (vs), 6.9 (w), 5JO (v ).5.63 (m), 5.07 (m), 4,76 (m), 4.40 (m), 4.15 (w 4,00 (s), 3.95 (m), 3.52 (m), 344 (w), 3.32 (m), 3.23 (s), 3.17 ( ), 3.1i (vs) 3.06 (w), 2.99 ( ), 2.96 (w), 2.94 ( )} 2.87 (w), 2.84 (s), 2.82 (m).2.69 ( ] 2.59 (w), 2.44 ( ).

La figura 1 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico mostrado por la forma B del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Cuando se utiliza en la presente, las siguientes abreviaturas en paréntesis significan: (vs) = intensidad muy fuerte; (s) = intensidad fuerte; (m) = intensidad media; (w) = intensidad débil; y (vw) = intensidad muy débil. El patrón de difracción de rayos X del polvo característico se presenta en la figura 1.

Se ha encontrado que otros polimorfos de BH4 tienen estabilidad química y física satisfactoria para el manejo inocuo durante la fabricación y formulación, así como proporciona una elevada estabilidad en almacenamiento en su forma pura o en las formulaciones. Además, se ha encontrado que la forma B, y otros polimorfos de BH4 se pueden preparar en cantidades muy grandes (por ejemplo en escala de 100 kilos) y se almacenan durante un tiempo prolongado.

Todas las formas cristalinas (polimorfos, hidratos y solvatos) inclusive la forma cristalina B se pueden utilizar para la preparación del polimorfo B más estable. El polimorfo B se puede obtener por equilibrio de fases de las suspensiones de las formas amorfas u otras en comparación con la forma B polimórfica, como puede ser el polimorfo A, en disolventes polares y no acuosos adecuados. Así pues, las preparaciones farmacéuticas que se describen en la presente se refieren a una preparación de la forma B polimórfica del diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahídrobiopterina .

Otras formas de BH4 se pueden convertir para la forma B dispersando las demás formas de BH4 en un disolvente a temperatura ambiente, agitando la suspensión a temperaturas ambientales durante un tiempo suficiente para producir la forma B polimórfica, después separando la forma B cristalina y eliminando el disolvente de la forma B purificada. Las temperaturas ambientales, cuando se utilizan en la presente, significa temperaturas en un intervalo desde 0°C hasta 69 °C, preferentemente 15 °C a 40°C. La temperatura aplicada puede cambiar durante el tratamiento y agitación disminuyendo la temperatura paso a paso o en forma continua. Los disolventes adecuados para la conversión de las otras formas a la forma B pueden ser pero, no se limitan a, metanol, etanol, isopropanol, otros alcoholes de C3 y C4, ácido acético, acetonitrilo, tetrhidrofurano, metil-t-butiléter, 1,4-dioxano, acetato de etilo, acetato de isopropilo, otros acetatos de C3-C6, metiletilcetona y otras metil-alquil de C3-C5-cetonas . El tiempo para lograr el equilibrio de fases puede ser hasta 30 y preferentemente hasta 20 horas o menos de 20 horas.

El polimorfo B también se puede obtener por cristalización a partir de mezclas de disolventes que contengan hasta aproximadamente 5% de agua, especialmente a partir de mezclas de etanol, ácido acético y agua. Se ha encontrado que la forma B polimórfica B del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopteriha se puede preparar por disolución, como una opción, a temperaturas elevadas, preferentemente de una forma con menor energía en el estado sólido en comparación con la forma B o de la forma B del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de disolventes que contenga etanol, ácido acético y agua, la adición de semillas a la solución, el enfriamiento de la suspensión obtenida y la separación de los cristales formados. La disolución se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o hasta 70 °C, preferentemente hasta 50 °C. Se puede utilizar la mezcla de disolventes final para la disolución o los materiales iniciales primero se pueden disolver en agua y los demás disolventes entonces se pueden adicionar ambos o uno después del otro disolvente. La composición de la mezcla de disolventes puede contener una relación en volumen de agua: ácido acético: tetrahidrofurano de 1:3:2 a 1:9:4, y preferentemente 1:5:4. De preferencia se agita la solución. El enfriamiento puede significar temperaturas bajas hasta -40 °C a 0°C, preferentemente bajas a 10 °C hasta 30 °C. Las semillas adecuadas son la forma B polimórfica de otro lote o cristales que tengan una morfología semejantes o idéntica. Después de la separación, la forma cristalina B se puede lavar con un no solvente como acetona o tetrahidrofurano y se seca en la forma normal.

El polimorfo B también se puede obtener por cristalización a partir de soluciones acuosas mediante la adición de no solventes como metanol, etanol y ácido acético. El procedimiento de cristalización y separación se puede llevar a cabo ventajosamente a temperatura ambiente sin enfriar la solución. Este proceso, por tanto, es muy adecuado para llevarse a cabo a escala industrial.

En una modalidad de las composiciones y métodos descritos en la presente, una composición que contenga la forma polimórfica B del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina se prepara disolviendo una forma sólida que no sea la forma B o la forma B del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en agua a temperaturas ambientales, adicionando un no solvente en una cantidad suficiente para formar una suspensión, opcionalmente con agitación de la suspensión durante un cierto tiempo, y después la separación de los cristales formados. La composición además se modifica en una composición farmacéutica como se describe más adelante.

La concentración del diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en la solución puede ser desde 10 hasta 80% en peso, más preferentemente desde 20 hasta 60% en peso, respecto a la solución. Los no solventes preferidos (es decir, los solventes útiles en la preparación de la suspensión de BH4) son metanol, etanol y ácido acético. El no solvente puede adicionarse a la solución acuosa. Más preferentemente, la solución acuosa se adiciona al no solvente. El tiempo de agitación después de la formación de la suspensión puede ser hasta 30 horas, y preferentemente hasta 20 horas o menos de 20 horas. La separación por filtración y secado se lleva a cabo en la forma conocida como ya se describió.

La forma polimórfica B es una forma cristalina muy estable, que se puede filtrar fácilmente, secar y triturar a los tamaños de partícula deseados para formulaciones farmacéuticas. Estas propiedades sobresalientes convierten a la forma polimórfica B especialmente conveniente para aplicación farmacéutica.

Forma polimórfica A Se ha encontrado que otro polimorfo cristalino de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, que debe mencionarse en la presente como "forma A" o "polimorfo A". El polimorfo A es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente 3% en peso, la cual se libera continuamente entre 50 °C y 200 °C cuando se calienta a una velocidad de 10°C/minuto. El polimorfo A un anhidrato higroscópico que es una forma metaestable con respecto a la forma B; sin embargo, es estable durante varios meses en condiciones ambientales si se guarda en un recipiente hermético. La forma A es especialmente conveniente como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables. La forma polimórfica A se puede preparar como un polvo sólido con el intervalo medio deseado en el tamaño de partícula que normalmente comprende desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

El polimorfo A que muestra un patrón de difracción de rayos X del polvo característico con los picos peculiares expresados en valores d (Á) de: 15.5 (vs), 12.0 (ni), 6.7 (m), 6.5 (m), 6.3 (w), 6.1 ( ), 5.96 (w), 5.49 (m), 4.89 (m), 3.79 (m), 3.70 (s), 3.48 (m)s 3.45 (m), 3.33 (s), 3.26 (s) 3,22 (m), 3.18 (m), 3.08 (m), 3.02 ( ), 2.95 (w),2.87 (m),2.79 ( ), 2.70 (w). La Figura 2 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma A del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina El polimorfo A presenta bandas características en el espectro Raman, que se expresan en números de onda > ( crn"1 ) en : 2934 (w), 2S80 (w), 1692 (s), 1683 ( ), 1577 (w), 1462 (m), 1360 (w), 1237 (w), 1108 (\v% 1005 (vw), 881 (vw), 813 (v )} 717 (m), 687 (m), 673 (m), 659 (m), 550 ( ), 530 (w), 492 (m\ 371 (m% 258 ( )5207 ( ), 101 (s), 87 (s) cm-1.

La forma polimórfica A puede obtenerse por secado por congelación o eliminación de agua de las soluciones de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en agua. La forma polimórfica A de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se pueden preparar disolviendo diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina a temperaturas ambientales en agua, (1) enfriando la solución a temperaturas bajas para solidificar la solución, y eliminando agua a presión reducida, o (2) eliminando agua de la solución acuosa.

La forma cristalina A puede separarse por filtración y luego secarse para evaporar del producto el agua adsorbida. Las condiciones de secado y los métodos son conocidos y el secado del producto separado o la eliminación de agua de acuerdo con la variante (2) descrita en la presente se pueden llevar a cabo aplicando temperaturas elevadas, por ejemplo, hasta 80 °C, preferentemente en el intervalo desde 30 °C hasta 80 °C, en vacío o temperaturas elevadas y vacío . Antes de la separación de un precipitado obtenido en la variante (2), se puede agitar la suspensión durante un cierto tiempo para el equilibrio de fases. La concentración de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en la solución acuosa puede ser desde 5 hasta 40% en peso, con referencia a la solución.

Un enfriamiento rápido se prefiere para obtener soluciones sólidas como material inicial. Se aplica presión reducida hasta que se elimina por completo el disolvente. El secado por congelación es una técnica bien conocida. El tiempo para la eliminación completa del disolvente depende del vacío que se aplique, el cual puede ser desde 0.01 hasta 1 mbar, el disolvente que se utilice y la temperatura de congelación.

La forma polimórfica A es estable a temperatura ambiente o por debajo de la temperatura ambiente en condiciones prácticamente sin agua, lo cual se demuestra con pruebas de equilibrio de fases de suspensiones en tetrahidrofurano o tert-butilmetíléter en agitación durante 5 días y 18 horas respectivamente en nitrógeno a temperatura ambiente. La filtración y secado al aire a temperatura ambiente produce la forma polimórfica A sin cambio.

Forma polimórfica F Se ha encontrado que otro polimorfo cristalino de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en una preparación farmacéutica descrita en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma F" o "polimorfo F". El polimorfo F es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente 3% en peso, la cual se libera continuamente entre 50 °C y 200 °C si se calienta a una velocidad de 10°C/minuto. El polimorfo F es una metaestable y un anhidrato higroscópico que es más estable que la forma A a temperaturas menores de la ambiente y menos estable que la forma B a temperaturas superiores, y la forma F es especialmente adecuada como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables. La forma polimórfica F puede prepararse como un polvo sólido con intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente comprende desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

El polimorfo F que muestra un patrón de difracción de rayos X característico del polvo con picos peculiares que se expresan en valores d (A) a: 14.6 (m) , 6.6 (w) , 6.4 (w), 5.47 (w) , 4.84 (w) , 3.29 (vs) y 3.21 (vs) . La Figura 3 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma F de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Es posible obtener el polimorfo F por equilibrio de fases de las suspensiones de la forma polimórfica A en disolventes polares y no acuosos adecuados, los cuales disuelven escasamente las formas de menor energía, especialmente los alcoholes como metanol, etanol, propanol e isopropanol. La forma polimórfica F de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina también se puede preparar dispersando partículas de la forma sólida A de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en un disolvente no acuoso que apenas disuelve el diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina por debajo de la temperatura ambiente, agitando la suspensión a estas temperaturas durante un tiempo suficiente para producir la forma polimórfica F, después separando la forma cristalina F y eliminando el disolvente de la forma separada F. La eliminación de disolvente y el secado se pueden llevar a cabo en aire, aire seco o un gas protector seco como nitrógeno o los gases nobles y en o por debajo de la temperatura ambiente, por ejemplo, debajo de 0°C. Durante el equilibrio de fases, la temperatura preferentemente es desde 5 hasta 15 °C, y más preferentemente alrededor de 10°C.

Forma polimórfica J Se ha encontrado que otro polimorfo cristalino de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, el cual debe mencionarse en la presente como "forma J" o "polimorfo J". El polimorfo J es ligeramente higroscópico y adsorbe agua cuando se maneja en la humedad del aire. El polimorfo J es una forma metaestable y un anhidrato higroscópico, y se puede transforma de nuevo en la forma E que se describe made adelante, a partir de la cual se obtiene por exposición a condiciones de elevada humedad relativa como por encima de 75% de la humedad relativa. La forma J es especialmente adecuada como intermediario y materia primar para producir las formas polimórficas estables. La forma polimórfica J puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm a aproximadamente 500 µm.

La forma J muestra un patrón de difracción de rayos X del polvo característico, con los picos peculiares expresados en valores d (Á) a: 14.6 (m) , 6.6 (w) , 6.4 (w) 5.47 (w) , 4.84 (w) , 3.29 (vs) , y 3.21 (vs) . La figura 4 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico mostrado por la forma J de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El polimorfo J puede ser obtenido por deshidratación de la forma E a temperaturas moderadas, y vacío. En particular, la forma polimórfica J de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser preparada tomando la forma E y eliminando el agua de la forma E por tratamiento de la forma E en un secador de vacío para obtener la forma J a temperaturas moderadas que pueden ser en el intervalo de 25 a 70°C, y más preferentemente de 30 a 50°C.

Forma polimórfica K Se ha observado que otro polimorfo cristalino de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, el cual debe mencionarse en la presente como "forma K" o "polimorfo K" . El polimorfo K es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente 2.0% en peso, la cual se libera continuamente entre 50 °C y 100 °C si se calienta a una velocidad de 10°C/minuto. El polimorfo K es una forma metaestable y un anhidrato higroscópico, el cual es menos estable que la forma B a temperaturas superiores y la forma K es especialmente adecuada como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables, en particular la forma B. La forma polimórfica K puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado en el tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

La forma K presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con los picos peculiares expresados en valores d (A) de: 14.0 (s), 9 A ( )46.6 (w), 6.4 (w 6.3 (w), ó.l (w), 6.0 (w), 5.66 (w), 5.33 (w), 5.13 (vw), 4.73 (m), 4.64 (m), 4.48 (\ 4.32 (vw), 4.22 (w), 4.08 (w), 3.88 (w), 3.79 (w), 3.54 (m), 3.49 (vs), 3.39 (m), 3.1 (vs), 3.13 (s), 3.10 ( ), 3.05 (ni), 3.01 (m), 2.99 ( ), y 2.90(m).La F±gura 5 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma K de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahídrobiopterina.

El polimorfo K puede ser obtenido por cristalización de mezclas de disolventes polares que contengan cantidades pequeñas de agua y en presencia de pequeñas cantidades de ácido ascórbico. Los disolventes para la mezcla de disolventes pueden ser seleccionados del ácido acético y un alcohol como metanol, etanol, n- o isopropanol. En particular, la forma polimorfita K de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser preparada disolviendo diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y un alcohol o tetrahidrofurano con un contenido de cantidades pequeñas de agua y una cantidad pequeña de ácido ascórbico a temperaturas elevadas, reduciendo la temperatura por debajo de la temperatura ambiente para cristalizar el diclorhidrato, separando el precipitado y secando el precipitado separado a temperatura elevada, como una opción, en vacío. Los alcoholes adecuados son por ejemplo metanol etanol, propanol e isopropanol, siendo preferido etanol. La proporción de ácido acético a alcohol o tetrahidrofurano puede ser desde 2:1 hasta 1:2 y preferentemente alrededor de 1:1. La disolución de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede llevar a cabo en presencia de un contenido mayor de agua y más de la mezcla antisolvente se puede adicionar para obtener la precipitación completa. La cantidad de agua en la composición final puede ser desde 0.5 a 5% en peso, y la cantidad de ácido ascórbico puede ser desde 0.01 hasta 0.5% en peso, con referencia a la mezcla de disolventes. La temperatura para la disolución puede ser en el intervalo desde 30 hasta 100 y de preferencia 35 a 70 °C, y la temperatura de secado puede ser en el intervalo desde 30 hasta 50°C. El precipitado puede ser lavado con un alcohol como etanol después de la separación, por ejemplo de la filtración. El polimorfo K puede ser convertido fácilmente en la forma más estable B por equilibrio de fases por ejemplo en isopropanol y como una opción sembrado con cristales de la forma B a la temperatura ambiente anterior, como a las temperaturas desde 30 hasta 40°C.

Las formas hidrato de la sal diclorhidrato de (6R)L-tetrahidrobiopterina Como se describe más ampliamente más adelante, se ha encontrado que el diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina se encuentra en diferentes hidratos cristalinos, los cuales se describen y definen en la presente como las forma C, D, E, H, y O. Estas formas hidrato son útiles como la forma estable de BH4 para las preparaciones farmacéuticas que se describen en la presente y para la preparación de composiciones que contengan polimorfos cristalinos estables de BH4.

Forma hidrato C Se ha observado que una forma cristalina diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 que puede utilizarse en un preparado farmacéutico descrito en la presente, el cual debe mencionarse en la presente como "forma C" o "polimorfo C". La forma hidrato C es ligeramente higroscópica y tiene un contenido de agua de aproximadamente 5.5% en peso, lo cual indica que la forma C es un monohidrato. El hidrato C tiene un punto de fusión cercano a 94 °C (?Hf es aproximadamente 31 J/g) y la forma hidrato C es especialmente adecuada como intermediario y materia prima para producir las formas polimórfica estables. La forma polimórfica C puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado en el tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

La forma C presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos peculiares expresados en valores d (A) de: 18.2 (m), 15.4 ( ), 13.9 (vs), 10.4 (w), 9.6 ( ), 9.1 (w), 8.8 ( )58,2 (w), 8.0 (w), 6.8 (n), 6.5 (w), 6.05 (m), 5.77 (w), 5.64 ( ), 5.44 ( ), 5.19 ( ), 4.89 (w), 4.76 ( ), 4.70 ( ), 4.41 (w), 4.25 (ni), 4,00 (m), 3.88 (m), 3.80 (m), 3.59 (s), 3.50 (ni), 3.44 (m), 3.37 (m), 3.26 (s), 3.19 (vs), 3.V. (s), 3.11 (m), 3.06 (na), 3.02 (m), 2.97 (vs), 2.93 ( ), 2.89 (m), 2.83 (m), y 2.43 (m). La figura 6 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico mostrado por la forma hidrato C de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma hidrato C puede obtenerse por equilibrio de fases a temperaturas ambientales de una forma polimórfica como la suspensión del polimorfo B en un no solvente que contenga agua en una cantidad preferente de cerca de 5% en peso, respecto al disolvente. La forma hidrato C de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede preparar haciendo la suspensión de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en un no solvente como heptano, alcoholes de C1-C4 como metanol, etanol, 1- ó 2-propanol, acetatos como ecetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres como tetrahidrofurano, dioxano, ter-butil metil éter o mezclas binarias o terciarias de tales no solventes, a los cuales se adiciona suficiente agua para formar un monohidrato, y agitando la suspensión a por debajo de las temperaturas ambientales (por ejemplo 0 a 30 °C) durante un tiempo suficiente para formar un monohidrato. Por agua suficiente se puede entender desde 1 hasta 10 y preferentemente desde 3 hasta 8% en peso de agua, con respecto a la cantidad del disolvente. Los sólidos pueden ser filtrados y secados en aire a aproximadamente la temperatura ambiente. El sólido puede absorber algo de agua y por tanto posee mayor contenido de agua que el valor teórico de 5.5% en peso. La forma hidrato C es inestable con respecto a las formas D y B, y se convierte fácilmente en la forma polimórfica B a temperaturas de aproximadamente 40 °C en aire y menor humedad relativa. La forma C puede ser transformada en el hidrato D más estable por equilibrio de la suspensión a temperatura ambiente .

Forma hidrato D Se ha observado que otra forma cristalina diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, el cual se debe mencionar en la presente como "forma D" o "hidrato D" . La forma hidrato D es ligeramente higroscópica y puede tener un contenido de humedad de aproximadamente 5.0 a 7.0% en peso, lo cual indica que la forma D es un monohidrato. El hidrato D tiene un punto de fusión cercano a 153 °C (?Hf es aproximadamente 111 J/g) y es mucho más estable que la forma C e incluso es más estable si se expone a la humedad del aire a temperatura ambiente. La forma hidrato D, por tanto, puede ser utilizada para preparar formulaciones o como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables. La forma polimórfica D se puede preparar como un polvo sólido con el intervalo medio deseado en el tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

La forma D presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos peculiares expresados en valores d (A) de: 8.6 (s), 6.8 (w), 5.56 ( ), 4.99 (ni), 4.67 (s), 4.32 (m)33.93 (vs), 3.88 (w), 3.64 (w), 3.41 (w), 3.25 ( ), 3.17 (m), 3.05 (s), 2.94 (w), 2.92 (w), 2.88 (m), 2.85 (w), 2.80 (w), 2.79 (m), 2.68 (w), 2.65 (w), 2.52 (vw) '.235 (w), 2.34 (w) J,* 2.30 (w),' and2.29 (%w) '. tLa f?gura7 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma D hidrato de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma hidrato D se puede obtener adicionando a aproximadamente temperaturas ambientales soluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina para un exceso de un no solvente como hexano, heptano, diclorometano, 1- ó 2-propanol, acetona, ecetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres como tetrahidrofurano, dioxano, ter-butil metil éter o mezclas de estos no solventes, y agitando la suspensión a temperaturas ambiente. El sólido cristalino se puede filtrar o secar bajo nitrógeno seco a temperaturas ambientales. Un no solvente preferido es isopropanol. La adición de la solución acuos puede llevarse a cabo gota a gota para evitar precipitación repentina. La forma hidrato D de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede prepararse adicionando a temperatura aproximadamente ambiental una solución acuosa concentrada de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina para un exceso de un no solvente y agitando la suspensión a temperaturas ambiente. El exceso de no solvente puede significar una proporción de disolvente acuoso al no acuosos desde 1:10 hasta 1:1000. La forma D contiene un pequeño exceso de agua, en relación con el monohidrato y se considera que es agua adsorbida por la propiedad ligeramente higroscópica de este hidrato cristalino. La forma hidrato D es considerada la más estable de los hidratos conocidos a temperaturas ambiente y una humedad relativa menor de 70%. La forma hidrato D puede utilizarse para formulaciones preparadas en condiciones donde este hidrato sea estable. La temperatura ambiente puede significar 20 a 30°C.

Forma hidrato E Se ha encontrado que otra forma cristalina hidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, el cual debe mencionarse en la presente como "forma E" o "hidrato E". La forma hidrato E tiene un contenido de agua de aproximadamente 10 a 14% en peso, lo cual sugiere que la forma E es un dihidrato. El hidrato E se forma temperaturas por debajo de la temperatura ambiente. La forma hidrato E es especialmente adecuada como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables, es especialmente adecuada para producir la forma J libre de agua después del secado en nitrógeno o como una opción en vacío. La forma E es no higroscópica y estable en humedades relativas más bien elevadas, es decir, en humedades relativas por encima de aproximadamente 60% y hasta aproximadamente 85%. La forma polimórfica E puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado en el tamaño de partícula que abarca normalmente desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

La forma E presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con los picos peculiares expresados en valores d (A) de: 15,4 (s), 6.6 (w), 6.5 (w), 5.95 (vw), 5.61 (vw), 5.48 (w), 5.24 (w), 4.87 (w), 4.50 (vw), 4.27 (w), 3.94 (w)s 3.78 (w), 3.69 ( ), 3.60 (w), 3.33 (s), 3.26 (vs), 3.16 (w), 3.08 (ni), 2.98 (w), 2.95 (m), 2.91 (w), 2.87 (m), 2.79 (w), 2.74 (w), 2.69 (w), and 2.62 (w). La figura 8 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma hidrato E de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma hidrato E puede ser obtenida adicionando soluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina para un exceso de un no solvente enfriado a temperaturas desde aproximadamente 10 a -10 °C y preferentemente entre 0 a 10 °C y agitando la suspensión a estas temperaturas. El sólido cristalino puede ser filtrado y luego secado bajo nitrógeno seco a temperaturas ambiente. Los no solventes son, por ejemplo, hexano, heptano, diclorometano 1- ó 2-propanol, acetona, ecetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres como tetrahidrofurano, dioxano, tert-butilmetiléter o mezclas de estos no solventes. Un no solvente preferido es isopropanol. La adición de la solución acuosa puede llevarse a cabo gota a gota para evitar precipitación repentina. La forma hidrato E de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser preparada adicionando una solución acuosa concentrada de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina para un exceso de un no solvente que se enfría a temperaturas desde aproximadamente 10 a -10 °C y agitando la suspensión a temperaturas ambiente. El exceso de no solvente puede significar una proporción de disolvente acuoso al no solvente desde 1:10 hasta 1:1000. Un no solvente preferido es tetrahidrofurano. Otro proceso de preparación consiste en exponer la forma polimórfica B a una atmósfera de aire con una humedad relativa de 70 a 90%, preferentemente alrededor de 80%. La forma hidrato E es considerada un dihidrato, por lo que algo del agua adicional puede ser absorbida. La forma polimórfica E puede ser transformada en el polimorfo J luego de secar en vacío a temperaturas moderadas, las cuales pueden significar entre 20 °C y 50 °C a presiones entre 0 y 100 mbar. La forma E es especialmente adecuada para formulaciones en formas semisólidas por su estabilidad a humedades relativas elevadas.

Forma hidrato H Se ha encontrado que otra forma cristalina hidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma H" o "hidrato H". La forma hidrato H tiene un contenido de agua de aproximadamente 5.5 a 7.0% en peso, lo cual sugiere que la forma H es un monohidrato higroscópico. La forma hidrato H se forma temperaturas por debajo de la temperatura ambiente. La forma hidrato H es especialmente adecuada como intermediario y materia prima para producir las formas polimórficas estables. La forma polimórfica H puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado del tamaño de partícula que abarca normalmente desde 1 µm a aproximadamente 500 µm.

La forma H presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con los picos peculiares expresados en valores d (Á) de: 8.6 15.8 (vs), 10.3 (w), 8.0(w), 6.6(w), 6.07(w), 4.81(w), 4.30(w), 3.87(m), 3.60(m), 3.27 (m), 3.21(m), 3.13 (w) , 3.05 (w) , 2.96(m), 2.89(m), 2.82 (w) y 2.67 (m) . La Figura 9 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma hidrato H de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina .

La forma hidrato H puede ser obtenida disolviendo a temperaturas ambiente de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y agua, adicionando entonces un no solvente para precipitar un sólido cristalino, enfriando la suspensión obtenida y agitando la suspensión enfriada durante un cierto tiempo. El sólido cristalino se filtrado y luego se seca en vacío a temperaturas ambiente. Los no solventes son, por ejemplo, hexano, heptano, diclorometano 1- ó 2-propanol, acetona, ecetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres como tetrahidrofurano, dioxano, tert-butilmetiléter o mezclas de estos no solventes. Un no solvente preferido es tetrahidrofurano. Forma hidrato H de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser preparada disolviendo a temperaturas ambiente en diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y una menor cantidad que la del ácido acético de agua, adicionando un no solvente y enfriando la suspensión obtenida a temperaturas en el intervalo de -10 a 10 °C, preferentemente -5 a 5°C, y agitando la suspensión a estas temperaturas durante un cierto tiempo, el cierto tiempo puede significar de 1 a 20 horas. La relación en peso del ácido acético al agua puede ser desde 2:1 hasta 25:1, y preferentemente 5: a 15:1. La relación en peso del ácido acético/agua al no solvente puede ser desde 1:2 a 1:5. La forma hidrato H parece ser un monohidrato con un leve exceso de agua adsorbida por su propiedad higroscópica.

Forma hidrato O Se ha encontrado que otra forma cristalina hidrato de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en un preparado farmacéutico descrito en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma O" o "hidrato O", la forma hidrato O se forma a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente. La forma hidrato 0 es especialmente adecuada como intermediario en materia prima para producir formas polimórficas estables. La forma polimórfica 0 puede ser preparada como polvo sólido con el intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm a 500 µm.

La forma O presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos peculiares expresados en valores d (Á) a: 15.9 (w), 14. (w), 12.0 (w), 8.8 (m), 7.0 (w), 6.5 (w), 6.3 (m), 6.00 (w), 5.75 (w), 5.65 (m), 5.06 (m), 4.98 (m), 4.92 (ni), 4.84 (w), 4.77 (w), 4.42 (w), 4.33 (w), 4.00 ( ), 3.88 (m), 3.78 (w), 3.69 (s), 3.6' (s), 3.52 (vs), 3.49 (s), 3,46 (s), 3.42 (s), 3.32 (m), 3.27 (m), 3.23 (s), 3.18 (s), 3.15 (vs), 3.12 ( ), 3.04 (vs), 2.95 (m), 2.81 ($)> 2.72 ( ), 2.67 (m) y 2.61 (m).

La figura 10 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma hidrato O de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma hidrato O puede ser preparada por exposición de la forma polimórfica F a una atmósfera de nitrógeno que contenga vapor de agua con una humedad relativa resultante de aproximadamente 52% durante aproximadamente 24 horas. El hecho de que la forma F, que es un anhidrato ligeramente higroscópico, puede ser utilizada para preparar la forma O con 52% de humedad relativa sugiere que la forma O es un hidrato, el cual es más estable que la forma F en condiciones de temperatura ambiente y humedad.

Formas solvato de la sal diclorhidrato 'de '(6R)-L-tetrahidrobiopterina Como se describe más adelante, se ha encontrado que el diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina presenta diversas formas solvato cristalinas, las cuales deben describirse y definirse en la presente como las formas G, I, L, M y N. Estas formas solvato son útiles como una forma estable de BH4 para las preparaciones farmacéuticas descritas en la presente y en la preparación de composiciones que contengan polimorfos cristalinos estables de BH4.

Forma solvato G Se ha encontrado que una forma cristalina solvato de etano del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en una preparación farmacéutica descrita en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma G" o "hidrato G", la forma solvato etanol G tiene un contenido de etanol de aproximadamente 8.0 a 12.5% en peso, lo cual sugiere que la forma G es un solvato monoetanol higroscópico. La forma solvato G se prepara a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente. La forma G es especialmente adecuada como intermediario en materia prima para producir formas polimórficas estables. La forma polimórfica G puede ser preparada como polvo sólido con un intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm a 500 µm.

La forma G presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos peculiares expresados en valores d (Á) de: 14.5 (vs).10.9 (wj 9.8 (w), 7. (w), 6.3 (w), 5.74 (w), 5.24 (vw), 5.04 (vw), 4.79 (wj, 4.41 (w), 4.02 (w), 3.86 (w), 3.77 (w), 3.69 (w), 3.63 (m), 3.57 (m), 3.49 (ni), 3.41 (m), 3.26 (m), 3.17'(m), 3.07 ( ), 2.97 (m), 2.95 (m), 2.87 (w), y 2.61 (w). La Figura es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la " forma solvato G de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma G solvato etanol puede obtenerse por cristalización del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina disuelto en agua y adicionando un gran exceso de etanol, agitando la suspensión obtenida a o por debajo de las temperaturas ambiente y secando el sólido separado bajo aire o nitrógeno a temperatura aproximadamente ambiente. En este caso, un gran exceso de etanol significa una mezcla resultante de etanol y agua con menos de 10% de agua, preferentemente cerca de 3 a 6%. La forma G etanolato de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser preparada disolviendo a temperatura aproximadamente ambiente hasta las temperaturas de 75 °C el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en agua o en una mezcla de agua y etanol, enfriando una solución calentada a temperatura ambiente y abajo hasta 5 a 10 °C, adicionando, como una opción, etanol para precipitación completa, agitando la suspensión obtenida a temperaturas de 20 a 5°C, filtrando el sólido cristalino blanco y secando el sólido en aire o un gas protector como nitrógeno a temperaturas de aproximadamente la temperatura ambiente. El proceso se puede llevar a cabo en una primera variante disolviendo diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina a aproximadamente la temperatura ambiente en una menor cantidad de agua, y luego adicionando un exceso de etanol y agitando la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases. En una segunda variante, el diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina puede ser suspendido en etanol, como una opción, adicionando una menor cantidad de agua y calentando la suspensión y el diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina disoluto, enfriando la solución a temperaturas de aproximadamente 5 a 15°C, adicionando más etanol a la suspensión y luego agitando la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases.

Forma solvato I Se ha encontrado que una forma cristalina solvato de ácido acético de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en las preparaciones farmacéutica descritas en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma I" o "hidrato I". La forma solvato de ácido acético I tiene un contenido de ácido acético de aproximadamente 12.7% en peso, lo cual sugiere que la forma I es un mono-solvato de ácido acético higroscópico. La forma solvato I se forma a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente . La forma solvato de ácido acético I es especialmente adecuada como intermediario en materia prima para producir formas polimórficas estables. La forma polimórfica I puede ser preparada como polvo sólido con el intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm a 500 µm.

La forma I presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos característicos expresados en valores d (A) de : 14.5 (m), 14.0 (w), 11.0 (w), 7.0 (vw), 6.9 (vw), 6.2 (vw), 5.30 (w), 4.79 (w), 4.44 (w), 4.29 (w), 4.20 (vw), 4.02 (w), 3.84 (w), 3.80 (w), 3.67 (vs), 3.61 (ra), 3.56 (w), 3.44 ( ), 3.27 (w), 3.19 (w), 3.110 3.00 ( ), 2.94 ( ), 2.87 (w), y 2.80 (w). La Figura 12 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma solvato I de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma solvato del ácido acético I puede obtenerse por disolución del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y agua a temperatura elevada, adicionando más ácido acético a una solución, enfriando a una temperatura de aproximadamente 10 °C, luego calentado la suspensión formada a aproximadamente 15 °C y luego agitando la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases, el cual puede durar hasta 3 días. El sólido cristalino entonces se filtra y se seca en aire o un gas protector como nitrógeno a temperaturas alrededor de la temperatura ambiente.

Forma solvato L Se ha encontrado que una forma cristalina mixta de solvato de etano/hidrato del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en una preparación farmacéutica descrita en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma L" o "hidrato L", la forma L puede contener hasta 4% pero hasta 13% de etanol y 0% hasta aproximadamente 6% de agua. La. La forma L puede ser transformada en la forma G si se trata en etanol a temperaturas desde aproximadamente 0°C hasta 20 °C. Además, la forma L puede ser transformada en la forma B si se trata en un disolvente orgánico a temperaturas ambiente (10°C a 60°C). La forma polimórfica L pude ser preparada como un polvo sólido con intervalo de tamaño de partícula medio, deseado, que normalmente abarca desde 1 µm a 500 µm.

La forma L presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, ' con picos peculiares expresados en valores d (A) de: ' 14.i (vs), 10.4(w), .5 (w), .0 (vw), 6.9 (w), 6.5 (w), 6.1 (w), 5.75 (w), 5.61 (w), 5.08 (w), 4.71 (w)/3.S6 (w), 3.78 (w), 3.46 (mX 336 (m), 3.06 (w).2.90(w> y 2.82 (w), La Figura 13 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma solvato L del diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma L puede ser obtenida suspendiendo la forma E hidrato a temperatura ambiente en etanol y agitando la suspensión a temperaturas desde O hasta 10 °C, preferentemente alrededor de 5°C, durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases, el cual puede ser 10 a 20 horas. El sólido cristalino entonces se filtra y se seca preferentemente a presión reducida, a 30 °C o bajo nitrógeno. El análisis por TG-FTIR sugiere que la forma L puede contener cantidades variables de etanol y agua, es decir, puede existir como un polimorfo (anhidrato) , como un solvato de etanol/hidrato mixto, o incluso como un hidrato.

Forma solvato M Se ha encontrado que una forma cristalina solvato de etanol del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en una preparación farmacéutica descrita en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma M" o "hidrato M", la forma M puede' contener 4% pero hasta 13% de etanol y 0% a aproximadamente 6% de agua, lo cual sugiere que la forma M es un solvato de etanol ligeramente higroscópico. La forma solvato M se prepara a temperatura ambiente. La forma M es especialmente adecuada como intermediario en materia prima para producir formas polimórficas estables . La forma M puede ser transformada en la forma G si se trata en etanol a temperaturas entre aproximadamente -10 °C a 15 °C, y en la forma B si se trata en disolventes como etanol, alcoholes de C3 y C4 o éteres cíclicos como THF y dioxano. La forma polimórfica M puede ser preparada como un polvo sólido con el intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm a 500 µm.

La forma M presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos característicos expresados en valores d (Á) de: 18.9 (s) , 6.4 (m) , 6.06 (w) , 5.66 (w) , 5.28 (w) , 4.50 (w) , 4.23 (w) y 3.22 (vs) .

La Figura 14 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma solvato M de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma solvato etanol M puede obtenerse por disolución del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina en etanol y la evaporación de la solución en nitrógeno a temperatura ambiente, es decir, entre 10°C y 40°C. La forma M también se puede obtener secando la forma G bajo un ligero flujo de nitrógeno seco a una velocidad de aproximadamente 20 a 100 ml/ i. Dependiendo del grado de secado bajo nitrógeno, la cantidad restante de etanol puede ser variable, es decir, desde alrededor de 3 hasta 13%.

Forma solvato N Se ha encontrado que otra forma cristalina solvato del diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de BH4 para utilizarla en una preparación farmacéutica descrita en la presente, la cual debe mencionarse en la presente como "forma N" o "hidrato N". La forma N puede contener en total hasta 10% de isopropanol y agua, lo cual sugiere que la forma N es un solvato de isopropanol ligeramente higroscópico. La forma N puede ser obtenida por lavado de la forma D con isopropanol y el secado posterior en vacío a aproximadamente 30 °C. La forma N es especialmente adecuada como intermediario en materia prima para producir formas polimórficas estables. La forma polimórfica N puede prepararse como un polvo sólido con intervalo medio deseado del tamaño de partícula que normalmente abarca desde 1 µm hasta aproximadamente 500 µm.

La forma N presenta un patrón de difracción de rayos X del polvo, característico, con picos característicos expresados en valores d (A) a: 19.5 (m) , 9.9 (m) , 6.7 (w) , 5.15 (w), 4.38 (w) , 3.91 (w) , 3.56 (m) , 3.33 (vs) , 3.15 (w) , 2.89 (w) , 2.81 (w) , 2.56 (w) , y 2.36 (w) . La Figura 15 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma solvato N del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma isopropanol N puede ser obtenida por disolución del diclorhidrato de L-eritro-tetrahidrobiopterina en 4.0 mi de una mezcla de isopropanol y agua (proporción del volumen del mezclado por ejemplo 4:1). A esta solución se adiciona lentamente isopropanol (IPA, por ejemplo aproximadamente 4.0 mi) y la suspensión resultante se enfría a 0°C y se agita durante varias horas (aproximadamente 10 a 18 horas) a esta temperatura. La suspensión se filtra y el residuo sólido se lava con isopropanol a temperatura ambiente. El material cristalino obtenido luego se seca a temperatura ambiente (por ejemplo aproximadamente 20 a 30 °C) y presión reducida (cerca de 2 a 10 mbar) durante varias horas (aproximadamente 5 a 20 horas) . El análisis TG-FTIR muestra una pérdida de peso de 9.0% entre 25 a 200°C, lo cual se atribuye al isopropanol y agua. Este resultado sugiere que la forma N puede existir en forma de un solvato de isopropanol o en forma de "solvato de isopropanol/hidrato, mixta, o como una forma no solvatada que contenga una cantidad de agua.

Para la preparación de las formas polimórficas, ahí se puede utilizar técnicas de cristalización bien conocidas, como la agitación de una suspensión (en equilibrio de fases) , precipitación, recristalización, evaporación, métodos de sorción de agua tipo solvente o descomposición de los solvatos. Las soluciones diluidas, saturadas o súper saturadas se pueden utilizar para la cristalización, con o sin sembrado con agentes de nucleación adecuados. Pueden aplicarse temperaturas de hasta 100°C para formar las soluciones. Es posible aplicar enfriamiento para iniciar la cristalización y precipitación a -100 °C y preferentemente a -30 °C. Es posible utilizar los polimorfos metaestables o formas pseudopolimórficas para preparar soluciones o suspensiones para la preparación de las formas más estables y obtener mayores concentraciones en las soluciones .

Fue sorprendente encontrar que la forma hidrato D es la forma más estable bajo los hidratos, y las formas B y D son especialmente adecuadas para utilizarlas en las formulaciones farmacéuticas. Las formas B y D presentan algunas ventajas como fabricación dirigida, buen manejo debido al tamaño y morfología de los cristales, conveniente, muy buen estabilidad bajo condiciones de producción de diferentes tipos de formulaciones, estabilidad durante el almacenamiento, mayor solubilidad y elevada pirodisponibilidad. Por consiguiente, en un método y/o una composición descrita en la presente la forma de BH4 presente en una mezcla preferentemente es una forma cristalina estabilizada de BH4 y se selecciona del grupo que consiste en la forma polimórfica cristalina A, la forma polimórfica cristalina B, la forma polimórfica cristalina F, la forma polimórfica cristalina J, la forma polimórfica cristalina K, la forma polimórfica hidrato cristalino C, la forma hidrato polimórfica cristalino D, la forma polimórfica hidrato cristalino E, la forma polimórfica hidrato cristalino H, la forma polimórfica hidrato cristalino O, la forma polimórfica cristalina solvato G, la forma polimórfica cristalina solvato I, la forma polimórfica cristalina solvato L, la forma polimórfica cristalina solvato M, la forma polimórfica cristalina solvato N y combinaciones de estas. Más preferentemente, la forma de BH4 es para utilizarla en una composición y método descrito en la presente en una composición farmacéutica que contenga la forma polimórfica B y/o la forma hidrato D del diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina y un portador o diluyente aceptado para uso farmacéutico.

Las formas cristalinas del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina pueden ser utilizadas junto con ácido fólico o ácido tetrahidrofólico o sus sales aceptadas para uso farmacéutico como las sales de sodio, potasio, calcio o amonio, cada una sola o además con arginina. La proporción en peso de la formas cristalinas: ácidos fólicos o sales de estos: arginina puede ser desde aproximadamente 1:10:10 a aproximadamente 10:1:1.

VI . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas que se describen en la presente preferentemente se administran como formulaciones orales. Las formulaciones orales de preferencia son formulaciones sólidas como cápsulas, tabletas, pildoras y trociscos, o formulaciones líquidas como suspensiones acuosas, elíxires y jarabes. Las diferentes formas de BH4 descritas en la presente pueden ser utilizadas directamente como polvo (partículas micronizadas) , granulos, suspensiones o soluciones, o pueden combinarse entre sí con otros ingredientes aceptados para uso farmacéutico mezclando los componentes y, como una opción, dividiéndolos finamente, y luego llenando cápsulas, compuestos por ejemplo de gelatina dura o blanda, comprimiendo tabletas, pildoras o trociscos, o suspendiendo o disolviéndolos en portadores para suspensiones, elíxires y jarabes. Es posible aplicar recubrimientos después de la compresión para formar pildoras.

Los ingredientes aceptados para uso farmacéutico son bien conocidos para los diferentes tipos de formulación y pueden ser, por ejemplo, aglutinantes como polímeros naturales o sintéticos, excipientes, lubricantes, agentes tensoactivos, edulcorantes y agentes saborizantes, materiales de recubrimiento, preservadores, colorantes, espesantes, adyuvantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes y portadores para los diferentes tipos de formulación. Los ejemplos no limitadores de los aglutinantes útiles en una composición descrita en la presente incluyen goma de tragancanto, acacia, almidón, gelatina, y polímeros biológicos degradables como homo- ó co-poliésteres de ácidos dicarboxílicos, alquilenglicoles, polialquilenglicoles y/o ' ácidos hidroxilcarboxílicos alifáticos; homo- ó copoliamidas de ácidos dicarboxílicos, alquilendiaminas y/o ácidos amino carboxílicos alifáticos; los poliéster-poliamida- copolímeros correspondientes, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfaseno y policarbonatos . Los polímeros biológicos degradables pueden ser lineales, ramificados o reticulados. Los ejemplos específicos son ácido poliglicólico, ácido poliláctico y poli-d,l-lacturo/glicoluro. Otros ejemplos para los polímeros son los polímeros solubles en agua como los polioxaalquilenos, polioxaetileno, polioxapropileno [sic] y polímeros mixtos de estos, poliacrilamidas o poliacrilamidas hidroxilalquiladas, ácido polimaléico y esteres o amidas de estos, ácido poliacrílico y esteres o amidas de estos, alcohol polivinílico y esteres o éteres de estos, polivinilimidazol, polivinilpirrolidona y polímeros naturales como quitosana.

Los ejemplos no limitadores de los excipientes útiles en una composición descrita en la presente incluyen fosfatos como fosfato dicálcico. Los ejemplos no limitadores de lubricantes útiles en una composición descrita en la presente pueden ser aceites naturales o sintéticos, grasas, ceras o sales de ácidos grasos como el estearato de magnesio.

Los agentes tensoactivos que pueden utilizarse en una composición descrita en la presente pueden ser aniónicos, catiónicos, anfotéricos o neutros. Los ejemplos no limitadores de los agentes tensoactivos útiles en una composición descrita en la presente pueden ser lecitina, fosfolípidos, sulfato de octilo, sulfato de decilo, sulfato de dodecilo, sulfato de tetradecilo, sulfato de hexadecilo y sulfato de octadecilo, oleato de Na o caprato de Na, ácidos l-acilaminoetan-2-sulfónico, como puede ser el ácido l-octanoilaminometan-2-sulfónico, ácido l-decanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-dodecanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-tetradecanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-hexanodecanoiol aminoetan-2-sulfónico y el ácido 1-octanodecanoil aminoetan-2-sulfónico, y ácido taurocólico y ácido taurodexicólico, ácidos biliares y sus sales como el ácido cólico, el ácido dexocicólico y glicocolatos de sodio, caprato de sodio o taurato de sodio, oleato de sodio, lauril sulfato de sodio, cetilsulfato de sodio, aceite de ricino sulfatado y dioctilsulfosuccinato de sodio, cocamido propilbetaina y laurilbetaina, alcoholes grasos, colesteroles, mono- o diestearato de glicerol, mono o dioleato de glicerol, y mono o dipalmitato de glicerol y estearato de polioxietileno.

Los ejemplos no limitadores de los agentes edulcorantes útiles en una composición descrita en la presente pueden ser sacarosa, fructuosa, lactosa o aspartame. Los ejemplos no limitadores de los agentes saborizantes que pueden utilizarse en una composición descrita en la presente pueden ser menta, aceite de galuteria y sabores frutales como cereza o sabor naranja. Los ejemplos no limitadores de los materiales de recubrimiento que pueden utilizarse en una composición descrita en la presente pueden ser gelatina, cera, goma laca, azúcar u otros polímeros biológicos degradables. Los ejemplos no limitadores de los preservadores que pueden utilizarse en una composición descrita en la presente pueden ser metil o propilparabenos, ácido sórbico, clorobutanol, fenol y ti erosal.

La forma hidrato D descrita en la presente también se puede formular como tableta o polvo efervescente, el cual se desintegra en un ambiente acuoso para obtener una solución para beber. Un jarabe o elíxir puede contener el polimorfo descrito en la presente, sacarosa o fructuosa como agente edulcorante y preservador como metilparabeno, un colorante y un agente saborizante.

Las formulaciones de liberación lenta también pueden ser preparadas a partir de los polimorfos descritos en la presente para obtener una liberación controlada del ingrediente activo en contacto con los fluidos corporales en el aparato gastrointestinal, y para obtener una concentración constante y eficaz del agente activo en el plasma sanguíneo. La forma cristalina puede ser incorporada para este propósito en una matriz polimérica de un polímero biológico degradable, un polímero soluble en agua o una mezcla de ambos, y como una opción agentes tensoactivos adecuados. La incorporación puede significar en este contexto la incorporación de micropartículas en una matriz de polímeros. Las formulaciones de liberación controlada también pueden obtenerse por encapsulación de micropartículas dispersadas o microgotas emulsificadas por las técnicas de recubrimiento en dispersión o emulsión conocidas.

Si bien las necesidades individuales son diferentes, la determinación de intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente está dentro de las habilidades en la técnica. Las dosificaciones comunes de BH4 contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, la cual normalmente representará aproximadamente 5 [sic] (1 mg/kg por 5 kg de peso corporal) a 3000 mg/día (30 mg/kg x 100 kg de peso corporal) . Una dosis como esta puede ser administrada en una sola dosis o se puede dividir en dosis múltiples. Aunque se considera una administración diaria, continua, puede ser necesario interrumpir el tratamiento con BH4 cuando los síntomas de las concentraciones de Phe se reduzcan por debajo de un cierto limite. Desde luego, se puede volver a iniciar el tratamiento en el caso de que las concentraciones de Phe se eleven otra vez.

Se entiende que la dosis adecuada de una composición de acuerdo con la presente invención dependerá de la edad, estado físico y peso de quien lo recibe, la clase de tratamiento concurrente si, es que hay alguno, la frecuencia del tratamiento y el tipo de efecto deseado (es decir, la cantidad que se desee disminuir en la concentración de Phe en plasma) . La frecuencia de la dosis también depende de los efectos farmacodinámicos en las concentraciones de Phe. Si el efecto dura 24 horas de una sola dosis. No obstante, la dosis más preferida se puede diseñar para la persona específica, como lo entiende y puede determinar un experto en la técnica, sin experimentación indebida. Esto normalmente consiste en ajustar la dosis estándar, por ejemplo, la reducción de la dosis si el paciente tiene bajo peso corporal.

Como ya se mencionó, la dosis total necesaria para cada tratamiento puede ser administrada en múltiples dosis o en una sola dosis. La BH4 y las composiciones de proteína pueden ser administradas solas o junto con otros tratamientos dirigidos a la enfermedad o dirigidos a otros síntomas de éstas.

Como es evidente de la descripción presentada en la presente, en un amplio aspecto, la presente solicitud considera la aplicación clínica de un tratamiento combinado que consiste en una primera composición que contiene una formulación de BH4 cristalizada, y una segunda composición que contenga una formulación médica de proteínas (por ejemplo PHENEX o similares) . Por tanto, las composiciones deben ser formuladas en composiciones farmacéuticas adecuadas, es decir, en una forma apropiada para aplicaciones in vivo en tales tratamientos combinados. En general, esto consistirá en preparar composiciones que estén prácticamente libres de pirógenos, así como otras impurezas que puedan dañar a los humanos o animales. Preferentemente, la composición de BH4 cristalizada puede ser tal que se pueda adicionar directamente a las formulaciones de proteínas ya existentes que se utilizan para el tratamiento de PKU.

En general, puede ser posible desear emplear sales apropiadas y soluciones amortiguadoras para hacer la BH4 adecuada para la ingestión. Las composiciones acuosas de la presente invención contienen una cantidad eficaz de BH4 disuelta o dispersada en un portador o medio acuoso aceptado para uso farmacéutico. Estas composiciones pueden ser administradas por vía oral o por inyección.

La frase "aceptado para uso farmacéutico o farmacológico" se refiere a las entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras no deseadas cuando se administran a un animal o humano. Cuando se utiliza en la presente "portador aceptado para uso farmacéutico" consiste en cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de las adsorción y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Salvo en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con las composiciones terapéuticas, su uso esta considerado en las composiciones terapéuticas. También es posible incorporar en las composiciones los ingredientes activos suplementarios. En las modalidades ejemplares, la formulación médica de proteínas puede contener sólidos de jarabe de maíz, aceite de cártamo con alto contenido de ácido oleico, aceite de coco, aceite de soya, L-leucina, fosfato de calcio tribásico, L-tirosina, L-prolina, acetato de L-licina, DATEM (un emulsificador) , L-glutamina, L-valina, fosfato de potasio dibásico, L-isoluecina, L-argínina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidrato, L-serina, citrato de potasio, L-treonina, citrato de sodio, cloruro de magnesio, L-histidina, L-metionina, ácido ascórbico, carbonato de calcio ácido L-glutámico, diclorhidrato de L-cistina, L-triptofano, ácido L-aspártico, cloruro de colina, taurina, m-inositol, sulfato ferroso, palmitato de ascorbilo, sulfato de zinc, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, cloruro de sodio, niacinamida, tocoferoles mixtos, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, sulfato de manganeso, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, betacaroteno, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenato de sodio, cloruro de cromo, molibdato de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina. Los aminoácidos, minerales y vitaminas en el suplemento deben ser provistos en cantidades que proporcionen las dosis diarias recomendadas de cada uno de los componentes.

Cuando se utiliza en la presente, "portador aceptado para uso farmacéutico" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la materia. Excepto en cuanto a lo que respecta a algún medio o agente convencional que sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas esta considerado. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención incluyen las preparaciones farmacéuticas tradicionales de BH4 que se han descrito en la presente, así como las conocidas para los expertos en la técnica. Las fórmulas de proteínas, como puede ser por ejemplo Phenex, también son conocidas para los expertos en la técnica. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención será a través de cualquier vía común para la suplementación dietética. La proteína preferentemente se administra por vía oral, como también la BH4.

Los compuestos activos pueden ser preparados por administración como soluciones de base libre o las sales aceptadas para uso farmacológico en agua adecuadamente mezclados con un agente tensoactivo, como puede ser hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de estos y en aceites. En las condiciones comunes de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un preservador para evitar el crecimiento de microorganismos .

Las composiciones de BH4 pueden ser preparadas como formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable. Estas composiciones contienen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación posterior de soluciones o dispersiones estériles, inyectables. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en el grado que facilite su aplicación por inyección. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua etanol, poliol (por ejemplo glicerol, polietilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de estos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, utilizando un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr por diferentes agentes antibacterianos y anti icóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables, estériles, se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria y en el disolvente apropiado con algunos de los demás ingredientes antes mencionados, según sea necesario, seguido por la esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los antes mencionados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado en vacío y las técnicas de secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado, adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de estos.

La BH4 utilizada en una composición descrita en la presente preferentemente se formula como una sal diclorhidrato, no obstante, se considera que otras formas salinas de BH4 poseen la actividad biológica deseada, y en consecuencial es posible utilizar otras formas salinas de BH4.

Las sales de adición básica aceptadas para uso farmacéutico pueden formarse con metales o aminas, como los metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Las sales aceptadas para uso farmacéutico de los compuestos también se pueden preparar con un catión aceptado para uso farmacéutico. Los cationes aceptados para uso farmacéutico, convenientes, son bien conocidos para los expertos en la técnica y pueden ser, cationes alcalinos, alcalino férreos, de amonio y de amonio cuaternario. Los carbonatos y carbonatos ácidos también son posibles. Los ejemplos de metales utilizados como cationes son sodio, potasio, magnesio, amonio, calcio o férrico y similares. Los ejemplos dé las aminas adecuadas pueden ser isopropilamina, trimetilamina, histidina, N,N' -dibenziletilendiamina, clorprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína.

Las sales de adición acida aceptadas para uso farmacéutico pueden ser sales acidas inorgánicas u orgánicas. Los ejemplos de las sales acidas adecuadas pueden ser clorhidratos, acetatos, citratos, salicilatos, nitratos, fosfatos. Otras sales aceptadas para uso farmacéutico son bien conocidas para los expertos en la materia y pueden ser, por ejemplo, ácido acético, cítrico, oxálico, tartárico o mandélico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico; con ácidos carboxílico, sulfónico, sulfo o fosfo orgánicos o ácidos sulfámicos sustituidos en la posición N, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzóico, ácido 2-acetoxibenzóico, ácido embónico, ácido nicotínico ó ácido isonicotínico; y con aminoácidos como los 20 alfa aminoácidos involucrados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo el ácido glutámico o ácido aspártico, y también con el ácido fenilacético, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan 1, 2-disulfónico, ácido benzensulfónico, ácido 4-metilbencensulfónico, ácido naftaleno 2-sulfónico, ácido naftaleno 1,5-disulfónico ó 3 fosfoglicerato, glucosa 6 fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos) , o con otros compuestos ácidos orgánicos, como el ácido ascórbico.

Específicamente, las sales de BH4 con ácidos inorgánicos u orgánicos son preferidas. Los ejemplos no limitativos de las formas salinas alternativas de BH4 incluyen las sales de BH4 del ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido fumárico y ácido mandélico.

La frecuencia de la dosificación de BH4 dependerá de los parámetros farmacocinéticos del compuesto y las vías de administración. La formulación farmacéutica óptima será determinada por un experto en la materia dependiendo de la vía de administración y la dosis deseada. Ver por ejemplo Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publ. Co. Easton PA 18042) pp 1425 1712, incorporado en la presente como referencia. Estas formulaciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo de los agentes administrados.

Dependiendo de la vía de administración, la dosis adecuada se puede calcular de acuerdo con el peso corporal, el área de superficie corporal o el tamaño del órgano. Otros factores para el cálculo necesario para determinar la dosis de tratamiento apropiada lo hacen de manera habitual los expertos en la técnica sin experimentación indebida, especialmente de acuerdo con la información de la dosificación y los ensayos descritos en la presente, así como de los datos farmacocinéticos que se observan en animales o en pruebas clínicas en humanos.

Las dosis apropiadas se pueden averiguar mediante el uso de los análisis establecidos para determinar niveles en sangre de Phe junto con los datos pertinentes de la dosis y la respuesta. El esquema de dosificación final determinado por el médico asistente, tomando en cuenta factores que modifiquen la acción de los medicamentos, por ejemplo, la actividad especifica del medicamento, la gravedad del daño y la respuesta del paciente, la edad, estado, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de alguna infección, el momento de la administración y otros factores clínicos. A medida que se lleven a cabo los estudios surgirá más información respecto a los niveles de dosis apropiados y la duración del tratamiento para enfermedades y estados específicos.

Se observará que las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento de la invención pueden ser útiles en el campo de la medicina humana y la medicina veterinaria. De este modo, el individuo que puede ser tratado puede ser un mamífero, preferentemente humano u otro animal. Para propósitos veterinarios, los individuos pueden ser por ejemplo animales de granja como vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de compañía como perros y gatos, animales extraños y/o de zoológicos, animales de laboratorio como ratones ratas, conejos, caballos y hámster; y aves como pollos, pavos, patos y gansos .

VII. Ejemplos Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Deben observar los expertos en la materia que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan las técnicas descubiertas por el inventor que han funcionado bien en la práctica de la invención, y de este modo deben ser consideradas que constituyen los modos preferidos para su práctica. No obstante, a la luz de la descripción presente, los expertos en la técnica deben saber que es posible hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y todavía obtener un resultado semejante sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Evaluación clínica con 6R-tetrahidrobiopterina El siguiente ejemplo proporciona una guía sobre los parámetros que deben utilizarse para la evaluación clínica de BH4 en los métodos terapéuticos de la presente invención. Como se describe en la presente, la BH4 se hará utilizada en el tratamiento de HPA incluida la HPA, fenilcetonuria moderada (PKU) y PKU clásica. Las pruebas clínicas serán realizadas para obtener una evaluación de las dosis orales diarias de BH4 para los aspectos de inocuidad, farmacocinética y respuesta inicial de los puntos finales clínicos sustitutos y definidos. La prueba será realizada durante un mínimo de, pero no se limita necesariamente a, 6 semanas para recolectar la información de inocuidad suficiente para 30 pacientes que se puedan evaluar.

La dosis inicial para las pruebas variará desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 mg/kg. En el caso de que esta dosis no produzca una reducción en los niveles excesivos de fenilalanina (Phe) en el plasma de un paciente, o no produzca un beneficio clínico directo significativo medido como la posibilidad de aumentar la ingestión oral diaria de Phe sin aumentar las concentraciones de Phe en plasma, la dosis debe aumentarse según sea necesario, y mantenerse durante un tiempo mínimo adicional, pero no necesariamente limitado a, 6 semanas para establecer la inocuidad y para evaluar la eficacia adicional. Se tomarán en cuenta dosis menores, por ejemplo dosis de entre 5 a 10 mg/kg.

Las mediciones de la inocuidad incluirán episodios adversos, reacciones alérgicas, él estudio completo de química clínica (la función hepática y renal') , urinálisis-y CBC con diferencial. Además, se monitorizan otros parámetros como la reducción en los niveles de Phe en sangre, la prueba neuropsicológica y cognitiva y las evaluaciones globales. El presente ejemplo también considera la determinación de los parámetros farmacocinéticos del medicamento en la circulación, y la distribución general y la vida media de 6R-BH4 en sangre. Se piensa de antemano que estás medidas ayudarán a relacionar la dosis con la respuesta clínica.

Métodos Los pacientes que tienen concentraciones elevadas de Phe en plasma serán sometidos a un examen inicial, un historial medico y examen físico, pruebas neurofisiológicas y cognitivas, una serie normalizada clínicas de laboratorio (CBC, panel 20, CH50, UA) , niveles de pterinas urinarias, niveles de dihidropterina reductasa (DHPR) y un panel preprandial en sangre (plasma) de los aminoácidos séricos. La dosis propuesta en humanos de 10 a aproximadamente 20 mg/kg de BH4 será administrada dividida en 1 a 3 dosis diarias. El paciente será observado estrechamente con visitas semanales a la clínica. Los pacientes regresarán a la clínica para una evaluación completa una semana después de completar el tiempo de tratamiento. Si fuera necesaria la escalación de la dosis, los pacientes seguirán el mismo procedimiento antes mencionado. A lo largo de la prueba será monitorizada la inocuidad.

Los pacientes participantes serán asignados al azar para recibir BH4 o placebo. Después de un tiempo inicial de 2 a 4 semanas todos los participantes en el estudio se podrán en una dieta controlada con una ingesta limitada de Phe durante un total de 4 a 6 semanas. Después de terminar las primeras 2 a 4 semanas en dieta restringida, todos los participantes del estudio serán cruzados en su asignación aletatoria y se realizará el seguimiento durante otras 2 a 4 semanas. Las concentraciones de Phe en sangre y otros parámetros bioquímicos serán supervisados estrechamente al término de cada periodo. La evaluación de los resultados neuropsicológicos incluirán mediciones de la atención prolongada; memoria de trabajo y habilidad para llevar a cabo operaciones complejas. Los pacientes que determinen la prueba, y quienes se beneficien del tratamiento mostrando concentraciones disminuidas, benéficas, de Phe en plasma, serán invitados a continuar el tratamiento de BH4 a lo largo de un protocolo a lo largo de un protocolo ampliado durante tanto tiempo como lo garanticen las condiciones de inocuidad y eficacia o hasta la aprobación BLA.

Diagnóstico y criterio de inclusión y exclusión El paciente puede ser varón o mujer, en edades de 12 o mayor, con un diagnostico documentado de HPA o PKU leve confirmado por pruebas genéticas y evidencia de niveles elevados de Phe en sangre. El estudio incluirá pacientes HPA o PKU que no sigan exactamente un control dietético. Las pacientes mujeres en edad reproductiva deben tener una prueba de embarazo negativa (ß-hCG en orina) poco antes de cada dosificación y se les debe aconsejar el uso de un método de contracepción aceptado por un médico, a lo largo del estudio. Un paciente será excluido de este estudio si el paciente tiene evidencia de una deficiencia de BH4 primaria, si ha recibido anteriormente dosis múltiples de BH4 durante más de una semana de tratamiento; si esta embarazada o lactando; si ha recibido un medicamento de investigación en el transcurso de 30 días antes de participar en este estudio o si tiene un estado médico si presenta enfermedad concurrente seria u otra circunstancia extenuante que pueda disminuir significativamente la observancia en el estudio.

Dosis, vía y esquema Los pacientes recibirán BH4 en una dosis de 5-10 mg/kg por día. En el caso de que los niveles de Phe en sangre no estén disminuidos en una cantidad razonable y no se observe ningún beneficio clínico, la dosis será aumentada según sea necesario. La escalación de la dosis se hará solo después de que todos los pacientes hayan sido sometidos por lo menos a dos semanas de tratamiento. La dosis diaria de BH4 será administrada por vía oral como líquido, polvo, tabletas o cápsulas. La dosis diaria total puede ser administrada como una sola dosis o tal vez dividida en dos o tres dosis diarias. Los pacientes serán supervisados clínicamente así como para observar cualquier reacción adversa. Si se observa algún síntoma poco común, se interrumpirá de inmediato la administración del medicamento del estudio y se tomará una decisión sobre la continuación en el estudio.

Intervención dietética Luego de la asignación aleatoria inicial y el tiempo de tratamiento de dos semanas, todos los participantes en el estudio serán sometidos al asesoramiento dietético y seguirán una dieta restringida en Phe, normalizada, complementada con alimentos medicinales específicos para Phe durante un total de 4 a 6 semanas. Las dietas serán manejadas en el hogar y se documentará la ingesta dietética en bitácoras diarias. Los análisis de las ingestas de nutrientes y alimentos medicinales y el porcentaje de las Ingestas Dietéticas Recomendadas (RDI) serán comparados entre los grupos de tratamiento.

Inocuidad de BH4 Se determinará que el tratamiento con BH4 es inocuo si durante el transcurso del estudio no ocurre ninguna reacción aguda o crónica significativa del medicamento. Se determinará que la administración del medicamento durante más tiempo es inocua si en los exámenes clínicos, estudios de laboratorio clínico u otros estudios apropiados no se observan anormalidades significativas.

EJEMPLO 2 Preparación de la forma cristalizada, estabilizada de BH4 La Solicitud de Patente Provisional US serie No. 60/520,377, titulada "Polimorfos de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina" presentada el 17 de noviembre de 2003 a nombre de los solicitantes Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiza y Viola GROEHN de Dachsen, Suiza, y el número de referencia interno 2156 de Merck-Eprova cedido y la solicitud de patente US Serie No.: , titulada "Polimorfos de diclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina" presentada al mismo tiempo con la presente el 17 de noviembre de 2004 a nombre de los Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiza y Viola GROEHN de Dachsen, Suiza, y el número de referencia interno de Merck-Eprova 2156/US CIP cedido (ambas solicitudes de Moser y col., se mencionan en forma colectiva en la presente como "las solicitudes Moser" y ambas se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades. Los ejemplos de esta especificación describen estudios de los espectros de rayos X y Raman para caracterizar los polimorfos de BH4. Cada una de las composiciones de BH4 de esta solicitud puede ser utilizada en los métodos de tratamiento que se describen en la presente. La siguiente descripción proporciona más antecedentes y una breve caracterización de algunas de aquellas composiciones ejemplares.

Los resultados obtenidos durante el desarrollo de diclorhidrato de ( 6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina (ver las solicitudes de Moser) indicaron que el compuesto puede poseer formas polimórficas. El interés continuo en esta área requiere de un método eficaz y confiable para la preparación de los polimorfos individuales de dihiclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina y las condiciones controladas para la cristalización a fin de obtener polimorfos, que preferentemente sean estables y se manejen fácilmente y se procesen en la fabricación y preparación de formulaciones.

Las técnicas de cristalización bien conocidas en la materia para producir cristales de medicamento se utilizan para preparar las formas polimórficas. Estas técnicas pueden ser, pero no se limitan a, las técnicas como suspensión, precipitación, recristalización, evaporación, métodos de sorción de agua tipo disolvente o descomposición de los solvatos. Las soluciones diluidas, saturadas o súper saturadas de BH4 se pueden utilizar para la cristalización, con o sin sembrado con agentes de nucleación adecuados. Se pueden aplicar temperaturas de hasta 150 °C para formar las soluciones del medicamento. El enfriamiento para iniciar la cristalización y precipitación por debajo de -100 °C y preferentemente por debajo de -30 °C pueden ser aplicadas. Las formas metaestables polimórficas o pseudopolimórficas pueden ser utilizadas para preparar soluciones o suspensiones para la preparación de formas más estables y para obtener concentraciones superiores en las soluciones.

Como se describe en las solicitudes de Moser, la forma polimórfica se puede obtener por cristalización de BH4 a partir de mezclas de disolventes polares'. Las solicitudes de Moser también describen un proceso para la preparación de la forma polimórfica del dihidroclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina, que consiste en la disolución, como una opción a temperaturas elevadas, de una forma sólida de menor energía que la forma reclamada del diclorhídrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de disolventes polares, la adición de semillas a la solución, el enfriamiento de la suspensión obtenida y la separación de los cristales formados.

La disolución se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o hasta 70 °C. Más preferentemente, la disolución se lleva a cabo a temperaturas de hasta 50 °C. El material inicial puede ser adicionado a la mezcla final de disolventes para la disolución, o en otra versión la materia prima primero se puede disolver en agua y otros disolventes pueden entonces ser adicionados juntos o uno después de otro disolvente. La solución de BH4 preferentemente es con agitación. El enfriamiento puede significar temperaturas por debajo de -80°C, de preferencia por debajo de -40°C hasta 0°C. En algunas modalidades, para inicializar la cristalización del polimorfo de BH4, la solución puede ser sembrada. Las semillas adecuadas pueden incluir una parte de la forma polimórfica procedente de otro lote de cristales, los cristales que tengan una morfología similar o idéntica. Después de la separación, la forma cristalina puede ser lavada con acetona o tetrahidrofurano y secar utilizando las técnicas comúnmente empleadas para secar cristales de medicamento.

Las formas polimórficas de BH4 descritas en las solicitudes de Moser son una forma cristalina muy estable del medicamento. La forma polimórfica se puede filtrar fácilmente, se puede secar y triturar a los tamaños de partícula deseados para las formulaciones farmacéuticas. Estas propiedades sobresalientes convierte a esta forma polimórfica especialmente conveniente para aplicación farmacéutica. La estabilidad de la forma polimórfica de BH4 se determino después de que la BH4 X2 HCl (la forma polimórfica) había sido almacenada durante 8 meses en una bolsa a 40°C y 75% de humedad relativa. Se comprobó la calidad en diferentes intervalos a lo largo de 8 meses por HPLC. Después de 8 meses, la calidad y estabilidad del polimorfo fue sorprendentemente semejante a la estabilidad observada en el tiempo cero.

Por consiguiente, las solicitudes de Moser proporcionan las descripciones de composiciones farmacéuticas que contienen una forma polimórfica de díclorhidrato de (6R) -L-eritro-tetrahidrobiopterina y un portador diluyente aceptado para uso farmacéutico. Estas composiciones serán útiles en los métodos terapéuticos descritos en la presente.

Además de las solicitudes de Moser, los expertos en la técnica también pueden revisar las Patentes US Nos. 6,596,721; 6,441,168 y 6271,374 las cuales describen diferentes métodos y composiciones para producir sales cristalinas estables del ácido 5-metiltetrahidrofólico y los métodos y composiciones para producir las formas estables del ácido 6R tetrahidrofólico y los métodos y composiciones para producir las formas estables del ácido 6S y 6R tetrahidrofólico. Cada una de estas patentes está incorporada en la presente para referencia en su totalidad así como los métodos de enseñanza para producir las formas cristalinas de los agentes y las técnicas para caracterizarlos. Estos métodos pueden ser utilizados para producir las formas estables de BH4 para utilizarlo como composición farmacéutica en los métodos del tratamiento que se enseñan en la presente.

Todas las composiciones y/o los métodos descritos y reclamados en la presente se pueden preparar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Si bien las composiciones y los métodos de esta invención han sido descritos en términos de las modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que es posible aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que algunos agentes que estén química y fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente siempre que se obtengan resultados iguales o semejantes. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica serán considerados dentro del espíritu, campo de aplicación y concepto de la invención como se define por las cláusulas anexas .

EJEMPLO 3 Administración de tetrahidrobiopterina á humanos con concentraciones elevadas de Phe en suero Se llevó a cabo un estudio con dosis única y múltiple, con etiqueta a la vista, en un total de 20 pacientes para demostrar la inocuidad y eficacia de tetrahidrobiopterina en humanos con concentraciones elevadas de fenilalanina en sangre (> 600 µmol/L) . Los criterios para la inclusión en el estudio fueron: (1) concentraciones de Phe en sangre iniciales de 600 µmol/L, (2) edad de por lo menos 8 años. Los criterios para la exclusión del estudio fueron: (1) embarazo o lactancia, (2) enfermedades o estados concomitantes que requieren medicamento o tratamiento, (3) tratamiento concomitante con algún medicamento conocido para inhibir la síntesis de folato, y (4) tratamiento con algún medicamento de investigación en el transcurso de 30 días. Cada uno de los pacientes también fue identificado con una mutación en el gen de la fenilalanina hidroxilasa (PAH) . Los participantes en el estudio fueron sometidos a evaluaciones iniciales, incluido el historial médico con evaluación de signos y síntomas relacionados con fenilcetonuria (PKU) o hiperfenilalaninemia (HPA) , exámenes médicos, signos vitales, concentraciones de aminoácidos séricos (es decir, fenilalanina, tirosina y triptofano) y pruebas de laboratorio de rutina (químicos, hematología y urinálisis) antes de la inclusión en el estudio.

El medicamento analizado fue ( 6R) -5, 6, 7, 8-tetrahidrobiopterina, también conocido como 2-amino-6- (1, 2,-dihidroxipropil) -5,6,7, 8-tetrahidro-3H-pterin-4-ona, tetrahidrobiopterina o sapropteina (BH4 ó 6R-BH4) . El medicamento fue obtenido en tabletas orales de 10 mg o 50 mg de Schircks Laboratories, Suiza (producto No. 11.212 diclorhidrato de (6R) -5, 6, 7, 8, tetrahidro-L-tetrahidrobiopterina) . La vida media de la sal diclorhidrato de 6R-BH4 de Schircks es de aproximadamente 3.5 horas .

Los medicamentos conocidos por inhibir la síntesis de folato como bactrim, metrotrexato o 5-Fu no fueron permitidos durante el estudio. Antes de comenzar la dosificación de 6R-BH4, fue necesario un tiempo de lavado de 7 días para cualquiera de los medicamentos conocidos por inhibir la síntesis de folato. No se permitieron medicamentos de investigación durante la participación en el estudio o durante 30 días antes de la participación en el estudio.

En un lapso máximo de 4 semanas después de terminar las evaluaciones iniciales, los individuos elegibles comenzaron la primera etapa del estudio. Se administró por vía oral dosis ascendentes, individuales, de 10 mg/kg, 20 mg/kg y 40 mg/kg de 6R-BH4, con un tiempo de lavado de por lo menos 7 días entre cada dosis, y los individuos fueron monitorizados 24 horas después de cada dosis. Las personas fueron sometidas a una evaluación de inocuidad y mediciones de las concentraciones de aminoácidos en sangre (es decir, fenilalanina, tirosina y triptofano) antes y 24 horas después de cada dosis de 6R-BH4. Se midió la presión arterial 30 minutos y una hora después de cada dosis. Las evaluaciones de la inocuidad consistieron en exámenes médicos, signos vitales, evaluación en serie de signos y síntomas relacionados con PKU o HPA, documentación de episodios adversos y monitorización de cambios en los parámetros de laboratorio (química, hematología y urinálisis) . Se les pidió a los individuos que continuaran su dieta normal sin modificación, y que documentaran la ingesta diaria de alimentos y bebidas a lo largo del estudio.

Después de que habían terminado la primera etapa del estudio, los individuos entraron en la segunda etapa del estudio, durante la cual recibieron 10 mg/kg de 6R-BH4 diario en una forma de dosificación oral, durante un total de 7 días . Después de un tiempo de lavado de por lo menos 7 días, cada participante recibió 20 mg/kg de 6R-BH4 diario durante un total de 7 días . Durante la segunda etapa del estudio, los individuos fueron monitorizados antes de la dosificación, a las 24 y 72 horas después de la primera dosis y durante el séptimo día de la dosificación en cada uno de los dos niveles de dosis. La monitorización incluyó una evaluación de inocuidad como ya se describió, la medición de los niveles de aminoácidos en suero (es decir, fenilalanina, tirosina y triptofano) y la evaluación de la ingesta oral de fenilalanina y tirosina. Se les pidió a las personas que continuarán su dieta normal sin modificación, y documentarán la ingesta diaria de alimentos y bebidas a lo largo del estudio.

Después de una sola dosis de 6R-BH4 (10 mg/kg) , la Phe en sangre declinó 10% ± 0.26% a partir de los datos iniciales. Las dosis individuales de 6R-BH4 en concentraciones de 20 mg/kg y 40 mg/kg mostraron declinaciones medias de 17% ± 0.28% y 27% ± 0.25%, respectivamente. Según se observó, la reducción en las concentraciones de Phe en sangre depende de la dosis.

La Figura 16 muestra concentraciones medias de fenilalanina en sangre después de 10 y 20 mg/kg de 6R-BH4 diarios durante 7 días, en los 14 de 20 pacientes que respondieron al tratamiento. Para el objetivo de este estudio, una declinación en las concentraciones de Phe en sangre de 30% fue considerada "sensible", aunque los pacientes que mostraron menos declinación todavía se beneficiaron del tratamiento con BH4. El estudio de 7 días demostró una disminución sostenida en la concentración de Phe en sangre en 70% de los pacientes (14/20) que tomaban 20 mg/kg. De estos 14 pacientes, 10 (71%) respondieron favorablemente a 10 mg/kg/día. Se observo que la tirosina en sangre aumenta en algunos, pero no en todos los pacientes; algunos pacientes tuvieron aumentos de >80% a partir de las concentraciones iniciales de tirosina. Las respuestas individuales de Phe en sangre a múltiples dosis de 10 mg/kg de BH4 se muestran en 11 adultos (Figura 17) y 9 niños (Figura 19) . Las respuestas individuales de Phe en sangre a las dosis múltiples de 20 mg/kg de BH4 se muestran en 11 adultos (Figura 18) y en 9 niños (Figura 20) .

Así pues, una prueba de carga de una sola dosis fue inadecuada para identificar a los pacientes que respondieron al tratamiento con BH4 con una reducción en la concentración de Phe en sangre de 30% o más. Una prueba de carga de 7 días identificó con muy buenos resultados un elevado porcentaje de pacientes que respondieron. La prueba de carga de 7 días, de 20 mg/kg con 6R-BH4 identificó 70% de los pacientes PKU que respondieron a 20 mg/kg de BH4. De las 14 personas que respondieron, 71% también mostró una reducción de 30% o mayor en la concentración de Phe en sangre con la menor dosis de 10 mg/kg de 6R-BH4.

Claims (83)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar fenilcetonuria grave, clásica (PKU) en una persona, que consiste en administrar a la persona una dieta restringida en proteínas en combinación con una composición que contenga tetrahidrobiopterina (BH4) o un precursor o derivado de esta, en donde la administración combinada de la dieta restringida en proteínas y BH4 es eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en el plasma de la persona, en comparación con la concentración en ausencia de la administración combinada.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la persona no tiene una deficiencia en la ho eostasia de BH4.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la persona tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1000 µM en ausencia del esquema de tratamiento.

4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque la administración combinada disminuye la concentración de fenilalanina en plasma de la persona a menos de 600 µM.

5. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque la administración combinada disminuye la concentración de fenilalanina en plasma de la persona a menos de 500 µM.

6. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque la administración combinada disminuye la concentración de fenilalanina en plasma de la persona a menos de 300 µM ± 15 µM.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la BH4 se administra en una cantidad entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque la BH4 se administra en una cantidad entre aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

9. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque la BH4 se administra en una sola dosis diaria.

10. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque la BH4 se administra en múltiples dosis diarias.

11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la BH4 se administra diario hasta que la concentración de fenilalanina en plasma de la persona este disminuida a menos de 360 µM.

12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración de fenilalanina en plasma de la persona se supervisa diario y la BH4 se administra cuando se observa un 10% de aumento en la concentración de fenilalanina en plasma.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la BH4 se administra como forma cristalizada estabilizada.

14. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque la forma cristalizada estabilizada de BH4 contiene al menos 99.5% de 6R BH4 pura.

15. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el precursor de BH4 es dihidrobiopterina (BH2) .

16. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el precursor de BH4 es sepiapterina.

17. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas es una dieta restringida en fenilalanina, en donde la fenilalanina total se limita a menos de 600 mg por día.

18. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas es una dieta restringida en fenilalanina en donde la fenilalanina total se limita a menos de 300 mg por día.

19. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas se suplementa con tirosina.

20. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas contiene un elevado contenido de uno o más aminoácidos seleccionados de valina, isoleucina y leucina.

21. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la BH4 se administra por vía oral.

22. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque a la persona se la ha diagnosticado que tiene una fenilalanina hidroxilasa mutante (PAH) .

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la PHA mutante contiene una mutación en el dominio catalítico de PAH.

24. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la mutación comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, R300S, L308F, A313T, K320N, A383T, V388M, E390G, A395P, P407S y Y414C.

25. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la persona no manifiesta síntomas de deficiencia en el neurotransmisor L-dopa.

26. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas comprende un suplemento de proteínas y la BH4 se proporciona en la misma composición que el suplemento de proteínas.

27. Un método para el tratamiento de una mujer embarazada que tenga hiperfenilalaninemia (HPA) consiste en administrar a la persona una dieta restringida en proteínas en combinación con una composición que contenga tetrahidrobiopterina (BH4) o un precursor o derivado de ésta, en donde la administración combinada de la dieta restringida en proteínas y BH4 es eficaz para reducir la concentración de fenilalanina en el plasma de la persona, en comparación con la concentración en ausencia de la administración combinada.

28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la persona tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 180 µM, pero menor de 600 µM.

29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la persona tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 600 µM, pero menor de 1200 µM.

30. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la persona tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 120 µM.

31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque la composición además contiene un folato.

32. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque el folato consiste en un tetrahidrofolato seleccionado del grupo que consiste en tetrahidrofolato es el ácido 5-formil- (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éste, el ácido 5-metil (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éste, el ácido 5, 10-metilen- (6R) - tetrahidrofólico y las sales de éste, ácido 5, 10-metenil- (6R) - tetrahidrofólico y las sales de éste, el ácido 10-formil- (6R) -tetrahidrofólico, el ácido 5-formimino— (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éste, el ácido- (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éste, y combinaciones de los anteriores.

33. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque la composición además contiene arginina.

34. Un método para tratar a un paciente que tenga una concentración por encima de la normal de fenilalanina en plasma, el cual consiste en administrar al paciente una composición de BH4 estabilizada en una cantidad eficaz para producir una disminución en la concentración de fenilalanina en plasma del paciente.

35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque la composición de BH4 estabilizada es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas .

36. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 180 µM antes de la administración de la BH .

37. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 180 µM, y 360 µM.

38. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 200 µM, y 600 µM.

39. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 600 µM, y 1200 µM.

40. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 600 µM, y 1200 µM.

41. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 200 µM.

42. El método de la reivindicación 34, en donde el paciente es un recién nacido.

43. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque el recién nacido tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1200 µM.

44. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque la paciente esta embarazada.

45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre aproximadamente 200 µM, a 600 µM.

46. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1200 µM.

47. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque la paciente es una mujer en edad reproductiva con posibilidades de embarazo.

48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque la paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre aproximadamente 200 µM a aproximadamente 600 µM.

49. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque la paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor de 1200 µM, y el método además consiste en administrar una dieta restringida en proteínas a la paciente.

50. Un método para tratar a un paciente que tenga fenilcetonuria, que consiste en administrar al paciente una composición de BH4 estabilizada en una cantidad eficaz para producir una disminución en la concentración de fenilalanina en el plasma del paciente, en donde el paciente ha sido diagnosticado como no sensible a la prueba de carga de BH4.

51. El método de la reivindicación 50, el método consiste en administrar entre aproximadamente 10 mg de BH4/kg de peso corporal a aproximadamente 200 mg de BH4/kg de peso corporal.

52. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra por la vía oral, subcutánea, sublingual, parenteral, rectal, y por las fosas nasales.

53. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra diario.

54. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra cada 2 días.

55. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra semanalmente.

56. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra en combinación con una dieta restringida en proteínas.

57. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la BH4 se administra como parte de un componente de una formulación proteínica terapéutica.

58. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas consiste en una dieta normal de productos alimenticios con bajo contenido de proteínas.

59. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas consiste en una dieta de proteínas sin fenilalanina.

60. El método de la reivindicación 56, caracterizado porque la dieta restringida en proteínas es suplementada con suplementos proteínicos que no contengan fenilalanina.

61. El método de la reivindicación 60, caracterizado porque los suplementos proteínicos que no contienen fenilalanina contiene tirosina.

62. Un método para tratar a un bebé que tenga fenílcetonuria, consiste en administrar una composición de BH4 estabilizada al paciente en una cantidad eficaz para producir una disminución en la concentración de fenilalanina en plasma del bebé, en donde el bebé tiene entre 0 y 3 años y el bebé tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre aprox. 360 µM a aprox. 4800 µM.

63. El método de la reivindicación 62, caracterizado porque antes de la administración de BH4 el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 1200 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma hasta aproximadamente 1000 µM.

64. El método de la reivindicación 63, caracterizado porque antes de la administración de BH4 el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 800 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a aproximadamente 600 µM.

65. El método de la reivindicación 63, caracterizado porque antes de la administración de BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de aproximadamente 400 µM y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a aproximadamente 300 µM.

66. El método de la reivindicación 63, caracterizado porque la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a 360 ± 15 µM.

67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 66 además consiste en administrar un folato.

68. El método de la reivindicación 67, caracterizado porque el folato consiste en un folato seleccionado del grupo que consiste en tetrahidrofolato y es ácido 5-formil-(6S) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5-metil(6S)-tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5, 10-metilen- (6R) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5, 10-metenil- (6R) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 10-formil- (6R) -tetrahidrofólico, ácido 5-formimíno- (6S) -tetrahidrofólico y sales de éstos, ácido (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éstos y combinaciones de las anteriores.

69. El método de la reivindicación 68, además consiste en administrar arginina.

70. Una composición que contiene una forma cristalizada, estabilizada de BH4 que es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas y un portador, diluyente o excipiente aceptado para uso farmacéutico.

71. La composición de la reivindicación 70, caracterizada porque la composición además contiene un suplemento proteínico médico.

72. La composición de la reivindicación 70, caracterizada porque la composición de BH4 es parte de una fórmula para bebés.

73. La composición de la reivindicación 71, caracterizada porque el suplemento proteínico no contiene fenilalanina.

74. La composición de la reivindicación 73, caracterizada porque el suplemento proteínico está enriquecido con L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina en una concentración de 20 mg/100 g de suplemento, L-taurina en una concentración de 40 mg/100 g del suplemento y selenio.

75. La composición de la reivindicación 74, caracterizada porque el suplemento proteínico además contiene la dosis diaria recomendada de calcio y fósforo.

76. La composición de la reivindicación 74, caracterizada porque el suplemento proteínico además contiene la dosis diaria recomendada de uno o más aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en L-leucina, leucina, L-prolina, acetato de L-licina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, monohidratado L-asparagina, L-triptofano, L-cerina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutámico y ácido L-aspártico.

77. La composición de la reivindicación 74, caracterizado porque el suplemento proteínico además está enriquecido con la dosis diaria recomendada de vitaminas A, D y E.

78. La composición de a reivindicación 73, caracterizada porque el suplemento proteínico tiene un contenido de grasa que proporciona por lo menos 40% de la energía del suplemento.

79. La composición de la reivindicación 73, caracterizado porque la composición está en forma de polvo .

80. La composición de la reivindicación 71, caracterizado porque la composición esta en forma de una barra de proteína.

81. La composición de la reivindicación 70, además contiene un folato.

82. La composición de la reivindicación 81, caracterizada porque el folato consiste en un tetrahidrofolato seleccionado del grupo que consiste en tetrahidrolato y es ácido 5-formil- (6S) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5-metil (6S) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5, 10-metilen- (6R) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 5, 10-metenil- (6R) -tetrahidrofólico y sales de éste, ácido 10-formil- (6R) -tetrahidrofólico, ácido 5-formimino- (6S) -tetrahidrofólico y sales de éstos, ácido (6S) -tetrahidrofólico y las sales de éste y combinaciones de las anteriores .

83. La composición de la reivindicación 82, además contiene arginina.