CN102481338A - 用于苯丙酮尿症和其他代谢疾病的营养控制的糖巨肽药用食物 - Google Patents

Abstract

公开含糖巨蛋白(glycomacroprotein)和其他补充量的精氨酸、亮氨酸和任选地其他氨基酸如酪氨酸的药用食物。所述药用食物可用于给患有代谢疾病如苯丙酮尿症的患者提供完备蛋白需求。

Description

用于苯丙酮尿症和其他代谢疾病的营养控制的糖巨肽药用食物

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月12日提交的美国临时申请第61/186,690号的权益，该申请的全文通过引用纳入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在由以下机构授予的美国政府资助下完成：NIH-基金号DK071534。美国政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明一般涉及用于代谢疾病如苯丙酮尿症的营养控制的药用食物。具体地，本发明涉及含糖巨肽作为主要蛋白来源的补充有附加量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸的药用食物。

发明背景

苯丙氨酸(Phe)是必需氨基酸，其在正常代谢个体内由酶苯丙氨酸羟化酶(PAH；EC 1.14.16.1)转化成酪氨酸。每年，在每15000个新生婴儿中约有1个新生儿的此酶的功能缺失或减损，诊断为患有代谢疾病苯丙酮尿症(PKU)(ScriverC.R.2001，The Metabolic & Molecular Bases of Inherited disease，8th ed.(遗传疾病的代谢和分子基础，第八版)，纽约：麦格劳-希尔教育出版集团(McGraw-Hill)。若患有PKU个体的饮食没有在生命前20天内得到更改，Phe及其降解产物会积累在血液和脑中，造成神经损伤和认知障碍。

PKU的膳食控制需要低Phe饮食，建议维持终生。由于高Phe含量，患PKU的个体必须避免如肉、乳品、豆类和面包等食物。尽管一些低蛋白天然食物可用于低Phe饮食中(主要是某些水果和蔬菜)，标准PKU饮食中的大多数膳食蛋白通常由无Phe氨基酸制剂提供。超过19岁成人的每日总Phe消耗的记录不能超过女性220-770毫克/天和男性290-1200毫克/天的目标值(Acosta P和Yanicelli S.2001，方案1-苯丙酮尿症(PKU)，见Division，R.P.，(编者)，The Ross MetabolicFormula System Nutrition Support Protocols.(洛氏代谢制剂系统营养支持方案)，第4版：洛氏产品部(Ross Product Division))。

针对PKU的基于标准氨基酸制剂的饮食很难遵守、具有限制性且不可口。不遵守是标准PKU饮食的常见问题，可引起严重的神经心理损伤。因此，本领域需要比基于标准氨基酸的制剂更可口且为PKU患者提供必要的蛋白，包括必需氨基酸，同时有效维持血液和大脑中低Phe水平的药用食物。

发明内容

本发明提供设计用于增加患代谢疾病如PKU的个体的饮食适应性和生活质量的药用食物。一方面，本发明包括用于控制代谢疾病的药用食物。该食物含糖巨肽(GMP)和附加补充量的某些氨基酸，包括精氨酸和亮氨酸。所述药用食物中，氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白；所述重量比更优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。所述药用食物中，氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比优选为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白；更优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

在某些实施方式中，所述药用食物还含有补充量的氨基酸酪氨酸。所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白；更优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

在一些实施方式中，所述药用食物中附加的补充氨基酸总重量约为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起总重量的22％-38％。所述食物还可补充有其他氨基酸，包括但不限于组氨酸和色氨酸。在还含补充量的氨基酸色氨酸和组氨酸的实施方式中，优选所述附加的补充氨基酸总重量约为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起总重量的25％-42％。任选地，所述药用食物不附加补充氨基酸甲硫氨酸。

在某些实施方式中，本发明所包括的药用食物可通过改变所述食物中含有的附加补充氨基酸的优选组合来靶向特定代谢疾病。例如，对于控制苯丙氨酸代谢疾病如苯丙酮尿症，所述食物优选在GMP以外还含有补充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸。然而，对于控制酪氨酸代谢疾病如酪氨酸血症，所述食物不含任何补充量的酪氨酸。

本发明所包括的药用食物可以是各种标准食物产品的形式。优选形式包括饮品、棒、薄饼(wafer)、布丁、凝胶体、脆饼干、果泥干、果仁奶油、酱、色拉酱、脆谷片、薄片、泡夫、丸或挤压固体。

在某些实施方式中，所述药用食物可在生产中经热处理，例如烘焙所述食物。发明人已确定在加热处理期间，氨基酸水平可能降低；特别是任何添加的色氨酸、酪氨酸、组氨酸、亮氨酸或精氨酸的氨基酸水平。因此，在一些这种实施方式中，用于制作所述药用食物的附加补充氨基酸的起始量高于用于非热处理食物的量，从而最终重量比落入所述优选范围内。作为非限制性示例，在优选实施方式中，药用食物中热处理前的氨基酸色氨酸与总蛋白的起始重量比大于约12毫克色氨酸/克总蛋白，药用食物中热处理前的氨基酸酪氨酸与总蛋白的起始重量比大于约85毫克酪氨酸/克总蛋白，药用食物中热处理前的氨基酸组氨酸与总蛋白的起始重量比大于约23毫克组氨酸/克总蛋白，药用食物中热处理前的氨基酸亮氨酸与总蛋白的起始重量比大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白，和/或药用食物中热处理前的氨基酸精氨酸与总蛋白的起始重量比大于约75毫克精氨酸/克总蛋白。

在这种示例性实施方式中，药用食物中的起始氨基酸水平可以是使所述药用食物中的氨基酸色氨酸与总蛋白的最终重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，使所述药用食物中的氨基酸酪氨酸与总蛋白的最终重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，使所述药用食物中的氨基酸组氨酸与总蛋白的最终重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白，使所述药用食物中的氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白，和/或使所述药用食物中的氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白。

用于PKU控制饮食的本发明药用食物必须含非常低的苯丙氨酸水平。因此，在某些优选实施方式中，所述药用食物所含GMP中每克GMP蛋白含不多于2.0毫克苯丙氨酸污染物。尽管该纯度的GMP可由供应商提供，但在某些这种实施方式中，所述GMP可在将其纳入所述药用食物前加以纯化。由于向食物中添加纯化GMP中所没有的补充量的氨基酸，所以在某些优选实施方式中，本发明的药用食物含有低于1.5毫克苯丙氨酸/克总蛋白。某些非蛋白成分如巧克力可向所述药用食物提供痕量的苯丙氨酸；因此在某些实施方式中，所述药用食物含约1.2到约1.8毫克苯丙氨酸/克总蛋白。

用于控制酪氨酸代谢疾病的本发明药用食物必须含非常低的苯丙氨酸和酪氨酸水平。因此，这种实施方式不含补充量的酪氨酸。在控制酪氨酸代谢疾病的实施方式中，所述药用食物优选优选含少于2.0毫克的苯丙氨酸与酪氨酸加和/克总蛋白。

在用于控制酪氨酸代谢疾病的含补充量氨基酸精氨酸和亮氨酸的一些实施方式中，所述药用食物中添加的补充氨基酸总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸的总重量的约16％-29％。在用于控制酪氨酸代谢疾病的另一些实施方式中，在亮氨酸和精氨酸以外，所述药用食物含有附加的补充量氨基酸组氨酸和色氨酸。在一些实施方式中，所述药用食物中附加补充氨基酸的总重量优选为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约19％-33％。为了在没有酪氨酸时维持其他补充氨基酸的推荐补充水平，可在所述药用食物中加入额外GMP。

第二方面，本发明包括制备上述药用食物的方法。所述方法包括步骤：提供糖巨肽(GMP)和附加补充量的某些氨基酸，包括精氨酸和亮氨酸，和将所提供的材料与一种或多种非蛋白成分混合以制备食物。所提供氨基酸精氨酸与所提供总蛋白的重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白；更优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。所提供氨基酸亮氨酸与所提供总蛋白的重量比优选为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白；所述比值更优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

在所述方法的一些优选实施方式中，还提供补充量的氨基酸酪氨酸。所提供氨基酸酪氨酸与所提供总蛋白的重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白；所述比值更优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。在一些此类实施方式中，所述药用食物中附加补充氨基酸的总重量是来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约22％-38％。

在某些实施方式中，本发明所包括的方法可以通过改变所提供的补充氨基酸组合而改进以使药用食物靶向特定代谢疾病。例如，对于制备用于控制苯丙氨酸代谢疾病如苯丙酮尿症的药用食物，在GMP以外还提供补充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸。然而，对于制备用于控制酪氨酸代谢疾病如酪氨酸血症的药用食物，不提供补充量的酪氨酸。

在某些优选实施方式中，所述方法包括纯化所述GMP的步骤使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克GMP蛋白。在一些这种实施方式中，纯化GMP的步骤可通过一种或多种下述技术进行：阳离子交换色谱、超滤、和渗滤。这种实施方式还可包括用冻干或喷雾干燥法干燥所述纯化GMP的额外步骤。

某些实施方式可包括额外步骤以使所述食物形成布丁、凝胶体或果泥干的形式。其他实施方式可包括将所述食物形成棒、脆饼干、薄片、泡夫、丸，或将所述食物挤压成挤压固体的步骤。

在制备所述食物时，某些实施方式可包括热处理所提供的混合物的额外步骤。该步骤的非限制性示例为在烘箱或其他加热室中烘焙所述食物。发明人已确定某些氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、亮氨酸和组氨酸在热处理期间有损失或降解。因此，在这种实施方式中，所提供用于制作所述药用食物的附加补充氨基酸的起始量优选高于用于非热处理食物的量，从而由于氨基酸在热处理时有损失或降解，最终重量比落入优选范围内。

作为非限制性示例，在优选实施方式中，热处理前所提供氨基酸色氨酸与所提供总蛋白的起始重量比可大于约12毫克色氨酸/克总蛋白；热处理前所提供氨基酸酪氨酸与所提供总蛋白的起始重量比可大于约85毫克酪氨酸/克总蛋白；热处理前所提供氨基酸组氨酸与所提供总蛋白的起始重量比可大于约23毫克组氨酸/克总蛋白；热处理前所提供氨基酸亮氨酸与所提供总蛋白的起始重量比可大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白；和/或热处理前所提供氨基酸精氨酸与所提供总蛋白的起始重量比可大于约75毫克精氨酸/克总蛋白。

热处理期间，所述食物中这些氨基酸水平可能降低。优选地，热处理后所述药用食物中氨基酸色氨酸与总蛋白的最终重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，热处理后所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的最终重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，热处理后所述药用食物中氨基酸组氨酸与总蛋白的最终重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白，热处理后所述药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白，和/或热处理后所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白。

第三方面，本发明包括治疗代谢疾病的方法，所述疾病包括但不限于苯丙氨酸代谢疾病、酪氨酸代谢疾病、色氨酸代谢疾病、或组氨酸代谢疾病。这些方法包括步骤：给予患代谢疾病的人含糖巨肽(GMP)和附加补充量的两种或更多氨基酸包括精氨酸和亮氨酸的药用食物。所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白；所述比值更优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。所述药用食物中氨基酸亮氨酸与蛋白的重量比优选为约100-200毫克精氨酸/克总蛋白；更优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

在所述药用食物没有补充酪氨酸的实施方式中，用所述药用食物治疗的人可患有酪氨酸代谢疾病，包括但不限于I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症/霍金素尿症、或尿黑酸尿症/黄褐病。在这种实施方式中，所述药用食物优选含低于2.0毫克的苯丙氨酸与酪氨酸加和/克总蛋白。

在其他实施方式中，所给予的药用食物还含有补充量的氨基酸酪氨酸。所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白；所述比值更优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。在这种实施方式中，用药用食物治疗的人可患有苯丙氨酸代谢疾病，包括但不限于苯丙酮尿症(PKU)；色氨酸代谢疾病，包括但不限于高色氨酸血症；或组氨酸代谢疾病，包括但不限于肌肽血症、组氨酸血症或尿刊酸尿症。在患有色氨酸代谢疾病的人接受治疗的实施方式中，所给予的药用食物不含补充量的色氨酸。在患有组氨酸代谢疾病的人接受治疗的实施方式中，所给予的药用食物不含补充量的组氨酸。

在被治疗的人患有苯丙酮尿代谢疾病的实施方式中，该人优选至少2岁。所给予的药用食物优选含低于1.5毫克苯丙氨酸/克总蛋白。

结合附图，通过以下详细描述，本发明的这些和其他特征对本领域技术人员变得显而易见。

附图简要说明

图1显示喂食含酪蛋白、补充有限制IAA的GMP(GMP充足)或补充有除Phe外的限制IAA的GMP(GMP Phe缺乏)的断奶野生小鼠在42天中体重对时间的函数。数值为均值±SEM；n＝10。对于GMP Phe-缺乏组，从第4天至研究结束，将Phe加入饮用水中(1g Phe/L)。第14天到第42天的每天BW变化没有显著差异。

图2显示喂食GMP或氨基酸(AA)饮食47天的PKU小鼠脑的5部分：小脑、脑干、下丘脑、顶叶皮层和前梨状皮层中的Phe浓度。数值为均值±SEM；n＝8。*与AA不同，P≤0.001。

图3显示喂食GMP或氨基酸(AA)饮食47天的PKU小鼠的小脑Phe水平与血浆苏氨酸(Thr)+异亮氨酸(Iso)+缬氨酸(Val)水平的函数。

图4显示糖巨肽(BioPURE-GMP；达维思科食品国际有限公司(Davisco FoodsInternational Inc.)，明尼苏达州勒苏尔)和酪蛋白(ALACID；新西兰乳品公司(NewZealand Milk Products)，加利福尼亚州圣罗莎)的氨基酸分布，表示为克氨基酸/100克产品。

图5显示在家持续15周进食氨基酸(AA)或糖巨肽(GMP)的单一PKU对象在过夜禁食后早餐前获得的平均Phe浓度。数据显示15周研究时间中的6周仅给对象提供已知Phe浓度的食物：第3周及15周(AA饮食)和4、7、11及13(GMP饮食)。血液和血浆中的Phe浓度用Phe摄入校正，表示为每100mg Phe摄入的mmol Phe/L。用两种方法之一测定Phe浓度，串联质谱(MS/MS)分析血点采集(blood spot collection)和AA分析仪测量血浆Phe。数值为均值±SE；AA饮食(血浆Phe n＝4和血液Phe n＝4)，GMP饮食(血浆Phe 100克和血液Phe n＝8)。*与AA饮食不同，p＜0.05。

图6显示摄取糖巨肽(GMP)或AA饮食的餐后血浆中总氨基酸(AA)和血液尿素氮的浓度。早餐后2.5小时获取血浆；n＝11，例外是研究第5和6天的血液尿素氮，其n＝6。总血浆AA表示血浆中所测所有AA的总和。数值为均值±SEM。与所述AA饮食的第4天相比，摄取所述GMP饮食的总血浆AA增加且血液尿素氮减少。在重复测量ANOVA中时间具有显著的效果。*与所述AA饮食第4天有显著差异，P＜0.05(成对t检验，对象配对)。

图7显示患苯丙酮尿症的个体对象(n＝11)在进食氨基酸饮食或糖巨肽(GMP)饮食4天后血浆中的苯丙氨酸浓度。早餐后2.5小时获取血液，并分离血浆用于分析完整AA分布。进食所述AA饮食或所述GMP饮食4天后，对象显示一定血浆苯丙氨酸浓度范围。所述AA饮食最后一天(第4天)与所述GMP饮食最后一天(第8天)相比，血浆苯丙氨酸浓度没有显著差异；对象配对的成对t检验所得P＝0.173。组均值±SEM为619±82μmol/L(AA饮食)和676±92μmol/L(GMP饮食)。血浆中苯丙氨酸浓度的变化均值为57±52μmol/L。phe，苯丙氨酸。

图8显示食用4天糖巨肽(GMP)和氨基酸(AA)饮食相比，患苯丙酮尿症的对象中餐后(PP；早餐后2.5小时)血浆苯丙氨酸浓度与禁食血浆(禁食，禁食过夜)的比较。显示组均值和个体对象的响应；n＝6(第4天与第8天相比)。进食所述GMP饮食时，禁食与PP的浓度相比的血浆苯丙氨酸浓度没有显著变化(P＝0.349)；然而对象配对的成对t检验发现所述AA饮食显示血浆苯丙氨酸显著增加(P＝0.048)，。phe，苯丙氨酸。

图9显示出进食4天(第5-8天)所述糖巨肽(GMP)饮食后餐后血浆中的苏氨酸和异亮氨酸浓度。数值为均值±SEM；n＝11，早餐后2.5小时获取血浆。研究第3和4天，所有对象进食氨基酸(AA)饮食；第5-8天，所有AA制剂换为GMP食物产品。在重复测量ANOVA中时间具有显著的效果。*与所述AA饮食最后一天(第4天)有显著差异，P＜0.05(成对t测试，对象配对)。**与所述AA饮食最后一天(第4天)有显著差异，P＜0.0001。异亮氨酸和苏氨酸的血浆浓度分别在第5和7天后不再显著增加。ile，异亮氨酸；thr，苏氨酸。

图10显示GMP草莓布丁与氨基酸制剂(Phlexy-10混合饮品，北美SHS公司(SHS North America)，美国马里兰州罗克维尔)相比的氨基酸分布。数值为均值±SD。样本数为n＝2。GMP草莓布丁和氨基酸棒上方的相同字母表示数值没有统计差异(P＞0.05)。

图11的柱状图显示用四种不同标准(气味、味道、余味和总分)对本发明的GMP食物Bettermilk^TM和常用氨基酸制剂Phenex-2^TM，的接受度评分。所述评分为27个无PKU成人(无斜纹柱)和4个PKU成人(斜纹柱)的平均。数值为均值±SD；＊p≤0.01，成对t检验。接受度评分为：1-极讨厌、2-非常讨厌、3-讨厌、4-有点讨厌、5-有点喜欢、6-喜欢、7-非常喜欢和8-极喜欢。

图12的柱状图显示进行GMP饮食和氨基酸饮食的PKU对象的生长素释放肽、胰岛素和氨基酸的血浆水平。生长素释放肽和胰岛素数值表示所述AA早餐的第3+4天、所述GMP早餐的第7+8天的各对象的等体积血浆合并。所述AA饮食最后一天(第4天)和所述GMP饮食最后一天(第8天)的餐后(PP)血浆AA值总和。所有数值为均值±SEM；生长素释放肽禁食数值的n＝6。*表明与所述AA早餐的餐后生长素释放肽有显著差异(p＝0.03，成对t检验，对象配对；n＝10)。**表明与所述AA早餐的胰岛素有中等显著差异(p＝0.053，成对t检验，对象配对；n＝10)。***表明与所述AA早餐的血浆AA总值有显著差异(p＝0.049，成对t检验，对象配对；n＝11)。

图13为进行GMP(空心圆)和氨基酸(实心圆)饮食的PKU对象早餐开始180分钟后血浆生长素释放肽浓度(x轴)和早餐后2小时饱食感(y轴)的关系图。较低的餐后生长素释放肽与较高的饱食感关联。线表示针对个体饮食治疗数据拟合的最小二乘回归线；AA早餐为虚线，GMP早餐为实线。线具有显著差异。使用后退淘汰和混合效应模型，预测餐后饱食评分的最佳模型包括饮食治疗、餐后生长素释放肽和生长素释放肽与饮食治疗之间的相互关系。

具体实施方式

I.概述

描述本发明材料和方法之前，应理解，本发明不限于所述具体方法、方案、材料和试剂，这些可发生变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，所述范围仅受任何随后提交的非临时申请的限制。

必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非文中另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但对优选的方法和材料加以描述。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明关联使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。

本文所用术语“约”表示在比给定值低10％或高10％范围内。

本文所用的术语“药用食物”表示“制备以用于在医师监督下进食或肠道给予的食物，且该食物针对疾病或病症的特定饮食控制，所述疾病或病症的的独特营养需求已基于公认的科学原理由医学评估确立”(罕见病药物法(Orphan Drug Act)第5(b)部分，21 U.S.C.360ee(b)(3))。药用食物与用于特殊饮食应用的广义食物类别和实现健康要求的食物的区别在于药用食物需要用于满足疾病或病症的独特营养需求、在医学监督下使用且用于疾病或病症的特殊饮食控制。

所述术语“药用食物”并不涉及给带病患者喂食的所有食物。药用食物为针对严重患病或需要所述产品作为主要治疗形式的患者的特殊配制和加工的食物(不同于以天然状态使用的天然产生的食材)。被视为药用食物的产品至少必须满足以下标准：所述产品必须为用于口服或管饲的食品；所述产品必须标记为用于有独特营养需求的特定医学紊乱、疾病或病症的饮食控制；且所述产品必须在医学监督下使用(摘自美国食品和药品管理局，Guidance for Industry：Frequently Asked QuestionsAbout Medical Foods(《行业指南：关于药用食物的常见问题》)，食品安全和应用营养中心，2007年5月)。

本文所用“补充量”的氨基酸表示添加到混合物中或包含在食物中且不是来自(a)GMP蛋白的痕量污染，或(b)非蛋白产品中所含痕量氨基酸的氨基酸量。非蛋白产品的非限制性示例为巧克力，其含有痕量Phe但不被认为是蛋白或氨基酸的显著来源。补充的量可来自被认为含有显著含量的给定氨基酸或含该氨基酸的蛋白的任何其他来源，包括但不限于市售氨基酸补充物。

本文所用食物中“总蛋白”表示所述食物中来自GMP的蛋白和所述食物中来自附加补充氨基酸的蛋白总和。

在本公开中全文使用以下缩写：AA，氨基酸；Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰胺；Asp，天冬氨酸；BW，体重；Cys，半胱氨酸；DRI，膳食参考摄入量；Gln，谷氨酰胺；Glu，谷氨酸；Gly，甘氨酸；GMP，糖巨肽；His，组氨酸；IAA，必需氨基酸；Iso或Ile，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；LNAA，大型中性氨基酸；Met，甲硫氨酸；MS/MS，串联质谱；PAH，苯丙氨酸羟化酶；PE，蛋白等价物；Phe，苯丙氨酸；PKU，苯丙酮尿症；Pro，脯氨酸；SEM，均值标准差；Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸；Tyr，酪氨酸；Trp，色氨酸；Val，缬氨酸；WT，野生型。

II.本发明

发明人近期确定，用补充有添加量的氨基酸精氨酸、组氨酸、亮氨酸和任选地其他氨基酸的糖巨肽蛋白制作的药用食物由于食物中所含氨基酸/蛋白源而给患PKU或其他代谢疾病的个体在饮食中提供完备的低Phe蛋白源。这些食物比标准AA制剂更可口，且优化GMP使血液和脑中Phe水平更低的能力。因此，本发明提供药用食物、制作所述食物的方法和给予患代谢疾病如PKU的个体所述食物的方法。

一方面，本发明提供含完备低Phe蛋白来源的药用食物。本发明的药用食物中的主要蛋白源是糖巨肽(GMP)，一种在其纯形式中不含Phe的天然产生的蛋白。奶酪制作中，当凝乳酶在κ-酪蛋白的105-106氨基酸残基之间特异切割时形成GMP。副-κ-酪蛋白(残基1-105)凝固形成奶酪凝乳，而GMP(残基106-109)留在乳清中。GMP高度极性且在一个或多个苏氨酸位点被半乳糖胺、半乳糖和o-唾液酸糖基化。

“GMP蛋白”指没有糖基化部分的纯GMP多肽。GMP蛋白含47％(w/w)必需氨基酸，但不含组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)或Phe。

可使用许多方法从乳清中分离GMP。纯化方法的详细示例可参见例如美国专利号5,968,586。从乳清中分离GMP的现行大规模技术使用离子交换色谱或超滤。GMP的等电点(pI)低于3.8，而其他主要乳清蛋白的pI值高于4.3。GMP和其他乳清蛋白的这种物理化学差异常用于分离方法以乳清中分离GMP。

市售GMP含来自残留乳清蛋白的Phe污染物。市售GMP中的Phe污染物含量相差很大(即，5mg Phe/g产品，生产商文献，达维思科食品国际有限公司，美国明尼苏达州勒苏尔；2.0mg Phe/g产品，Lacprodan cGMP-20生产商文献，阿拉食品公司(Arla Foods)，丹麦奥尔胡斯)。传统氨基酸制剂不含Phe，这使患有PKU的个体能食用含Phe的天然食物以满足其每日摄入。本发明所用GMP优选含不多于2.0mg Phe/g GMP。

在某些优选实施方式中，市售获得的GMP在用于本发明的药用食物前可纯化以去除Phe污染物。可能的纯化过程本领域已熟知，且包括但不限于通过吸收到阳离子交换树脂上来捕获粗GMP中污染的乳清蛋白和收集流通物组分中的纯化GMP。本领域已知的其他技术例如超滤/渗滤(UF/DF)可用于浓缩GMP和清除肽、盐和非蛋白氮。纯化和浓缩步骤后，可用本领域已知的很多技术干燥该纯化的浓缩GMP，包括但不限于冻干和喷雾干燥。

纯化的GMP不含His、Tyr、Trp、Cys、Arg或Phe、且亮氨酸(Leu)含量低。His、Trp、Phe和Leu都是必需氨基酸。Tyr和Arg为条件必需氨基酸，由于Phe是Tyr的前体，且谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸是Arg的前体。因此，GMP作为食物中主要蛋白源必须加以补充以提供营养完备的蛋白。发明人已确定氨基酸精氨酸、亮氨酸、和酪氨酸的补充量的优选范围，其与本领域以前建议的有所不同。

因此，在某些优选实施方式中，本发明包括用于控制代谢疾病的药用食物，所述药用食物含糖巨肽(GMP)和附加的优化补充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和/或酪氨酸。其他氨基酸也可包含在本发明的药用食物中。然而，由于发明人已确定甲硫氨酸补充不是必需，且事实上其会使药用食物较不可口，所以在某些优选实施方式中，本发明的药用食物不含附加补充量的氨基酸甲硫氨酸。批准用于食品生产的氨基酸获自本领域已知的多种商业来源。

所述药用食物中各补充氨基酸的优选重量比表示成该氨基酸在最终药用食物中每克总蛋白的毫克数，一克总蛋白定义为来自GMP的蛋白(克氮x 6.25)和来自附加补充氨基酸的蛋白(克氮x 6.25)之和。在某些优选实施方式中，所述药用食物中的附加补充氨基酸总重量优选为来自GMP的蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约22％-38％。

所述药用食物中氨基酸精氨酸与蛋白的重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白；所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比更优选为约75毫克精氨酸/克总蛋白。

所述药用食物中氨基酸亮氨酸与蛋白的重量比优选为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白；所述药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比更优选为约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

在含补充量的酪氨酸的那些实施方式中，所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白；所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比更优选为约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

在某些实施方式中，所述药用食物可任选包含附加的补充氨基酸。例如，组氨酸和/或色氨酸可包含在所述药用食物中。对于组氨酸补充，所述药用食物中氨基酸组氨酸与总蛋白的重量比优选为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白；所述药用食物中氨基酸组氨酸与总蛋白的重量比更优选为约23毫克组氨酸/克总蛋白。

对于色氨酸补充，所述药用食物中氨基酸色氨酸与总蛋白的重量比优选为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白；所述药用食物中氨基酸色氨酸与总蛋白的重量比更优选为约12毫克色氨酸/克总蛋白。

在某些实施方式中，所述药用食物可额外补充有必需维生素和矿物质，在完备蛋白来源外提供所需的非蛋白营养补充。此外，所述药用食物可包含常规食物中通常包含的多种其他低Phe物质(非蛋白成分)。

本发明不限于治疗Phe代谢疾病如PKU的药用食物；相反，本发明的药用食物还包括用于控制不存在于GMP中的其他氨基酸的代谢疾病的食物(即，His、Trp、Tyr或Phe的代谢疾病)。对于用于控制酪氨酸代谢疾病如酪氨酸血症的实施方式，所述食物中包含优化的补充量精氨酸和亮氨酸，但不包含补充量的酪氨酸。为了适应酪氨酸的缺失，可增加GMP含量。在一些这种实施方式中，附加补充的氨基酸总重量优选为来自GMP的蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约16％-29％。在这种实施方式中，酪氨酸和苯丙氨酸的总含量优选低于2.0mg/克总蛋白。

本发明的药用食物包括各种食物类型，包括但不限于制剂、饮品、棒、薄饼、布丁、凝胶体、脆饼干、果泥干、果仁奶油、酱、色拉酱、薄片、脆谷片、泡夫、丸或挤压固体。本领域技术人员可容易地识别这些和其他可能的食物类型，且常规制备方法可使用本发明的成分和常规食物常用的其他低Phe物质来制作本发明的药用食物。

本发明包含的许多可能类型的食物在生产中经热处理。作为非限制性示例，脆饼干、棒和脆谷片可能经烘焙。挤压固体可能在挤压前被加热。果泥干、酱和脆谷片可通过加热混合物然后冷却，和在一些情况下干燥最终产物而制作。因此，在某些实施方式中，本发明的药用食物在生产中经热处理。

发明人已确定热处理可导致附加补充氨基酸显著损失。例如，游离氨基酸如Trp、Tyr、His、Leu和Arg可能发生麦拉德反应。光照可加速Tyr光解反应。热处理或光照所导致附加补充量氨基酸的损失将增加需要加入所述药用食物中的附加补充氨基酸含量。因此，在一些优选实施方式中，经热处理的食物中各补充氨基酸的起始重量比会设成高于不经热处理食物的量，从而各补充氨基酸在损失后的最终剩余量落入优选的重量比。

另一方面，本发明包括用于管理代谢疾病如PKU的药用食物的制作方法。所述方法包括步骤：提供糖巨肽(GMP)和附加补充量的某些氨基酸包括精氨酸和亮氨酸，并将所提供的材料与其他物质混合以制备所述食物。在本方法的某些实施方式中，所提供氨基酸精氨酸与所提供蛋白的重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。在本方法的某些实施方式中，所提供氨基酸亮氨酸与所提供总蛋白的重量比为约100-200毫克精氨酸/克总蛋白，优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

如上所述，各种其他物质可用于制作所述食物，包括通常用于制作常规食物的非蛋白成分。然而，所用的其他物质必须为低Phe或无Phe物质。

在一些实施方式中，所述方法中使用的附加补充氨基酸总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约22％-38％。本方法包括用于制作各种食品类型的常规技术。作为非限制性示例，所述食物混合物可形成布丁、凝胶体或果泥干；所述食物混合物可制成棒、脆饼干、薄片、泡夫或丸；或者所述食物可挤压为挤压固体。在本方法的一些实施方式中，所述食物混合物经热处理。热处理的示例包括但不限于烘焙所述食物混合物、对所述食物混合物进行巴式灭菌、煮沸所述加热混合物或对所述混合物进行热挤压。

在本方法的某些实施方式中，所提供氨基酸酪氨酸与所提供蛋白的重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

在本方法的某些实施方式中，所提供氨基酸组氨酸与所提供蛋白的重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白，优选约23毫克组氨酸/克总蛋白。

在本方法的某些实施方式中，所述食物中氨基酸色氨酸与蛋白的重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，优选约12毫克色氨酸/克总蛋白。

本方法还包括纯化所述GMP的步骤使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克GMP蛋白。本领域已知的许多技术可用于纯化所述GNP，包括但不限于使用阳离子交换色谱、超滤和渗滤。所述纯化的GNP还可用许多已知的干燥技术中的任意方法进行干燥，所述方法包括但不限于冻干或喷雾干燥。

在另一方面，本发明包括治疗代谢疾病的方法。该方法包括步骤：选择患代谢疾病的患者并给予该患者含糖巨肽(GMP)和附加优化补充量氨基酸精氨酸和亮氨酸的药用食物。所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白；更优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。所述食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比优选为约100-200毫克精氨酸/克总蛋白；更优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

所述代谢疾病优选Phe代谢疾病、His代谢疾病、Trp代谢疾病、Tyr代谢疾病或Phe代谢疾病之一。在一些实施方式中，所给予的药用食物中附加补充氨基酸的总重量为GMP蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约22％-38％。

在本方法的某些实施方式中，所述药用食物不补充酪氨酸，且所选患者患有酪氨酸代谢疾病。在这种实施方式中，所述药用食物优选含低于2.0毫克的苯丙氨酸与酪氨酸加和/克总蛋白。在一些这种实施方式中，所给予的药用食物中的附加补充氨基酸总重量为GMP蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约16％-29％。

本方法的某些实施方式中，本方法所用的药用食物还包含附加的优化补充量的氨基酸酪氨酸。所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白；更优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。如果包含优化量的精氨酸、亮氨酸和酪氨酸，则所选的患者可患有苯丙氨酸代谢疾病、组氨酸代谢疾病或色氨酸代谢疾病。若患者患有组氨酸代谢疾病，则所给予的药用食物不含补充量的组氨酸。若患者患有色氨酸代谢疾病，则所给予的药用食物不含补充量的色氨酸。

在上述的限制下，其他氨基酸可任选地包含在本方法所用的药用食物中。在本方法的某些实施方式中，所述药用食物中的氨基酸组氨酸与总蛋白的重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白，优选约23毫克组氨酸/克总蛋白。

在本方法的某些实施方式中，所述食物中的氨基酸色氨酸与总蛋白的重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，优选约12毫克色氨酸/克总蛋白。

在某些优选实施方式中，所选患者患有代谢疾病PKU。本发明的药用食物比传统氨基酸制剂更可口，有助于降低血浆和脑中的有害Phe水平，并有助于提高此类患者中的蛋白存留。在一些实施方式中，所述食物给予至少2岁的人。

尽管在某些优选实施方式中，所选患者具有代谢疾病PKU，但本方法包括将所述药用食物给予患有其他代谢疾病的患者。给予本发明的食物可有效治疗的其他代谢疾病包括：酪氨酸代谢疾病(I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症/霍金素尿症和尿黑酸尿症/黄褐病)；色氨酸代谢疾病(高色氨酸血症)；和组氨酸代谢疾病(肌肽血症、组氨酸血症和尿刊酸尿症)。

提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，本发明所示和描述以外的各种变化通过以上描述以及以下的实施例对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。

III.实施例

实施例1：PKU鼠模型中补充的糖巨肽饮食

在本实施例中，申请人证明在PKU的标准小鼠模型中，与氨基酸饮食相比，补充的糖巨肽饮食支持生长并降低血浆和脑中的苯丙氨酸浓度。PAH缺失的小鼠模型Pah^enu2小鼠(PKU小鼠)是研究PKU营养控制的合适模型，因为其表现出与患PKU人类相似的高苯丙氨酸血症和认知缺陷。此外，与膳食蛋白主要由氨基酸提供的人低Phe饮食相对应，PKU小鼠研究使用的基于氨基酸的饮食常不含Phe而在饮用水中提供Phe。我们的目的是评估摄取含GMP饮食作为单一蛋白来源对野生型(WT)和PKU小鼠支持生长并影响血浆和脑中氨基酸特别是Phe的浓度的情况。结果表明，与氨基酸饮食相比，喂食GMP的PKU小鼠能适当生长且血浆及脑中Phe浓度显著降低。

材料和方法

小鼠.报道的动物设施和实验方案经威斯康星大学麦迪逊分校动物护理和使用委员会(University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。重量18-22g的4-6周龄雄性和雌性野生型小鼠与PKU小鼠(C57B1/6，杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories))在相同环境下饲养。PKU小鼠为Pah突变纯合体，但其经繁殖并在C57B1/6背景上回交以提高交配能力。PKU小鼠交配对由俄勒冈州波特兰市的俄勒冈健康和科学大学的Cary O.Harding提供。对尾生物活检样品DNA在外显子7上的扩增区域用PCR分析进行Pah^enu2突变存在的基因分型。小鼠以12-∶12-小时明∶暗周期在维持22℃屋内的不锈钢、网底笼中独立饲养，不禁水。所述小鼠每天10点称重并测定每日食物摄取。各实验结束时，在8点和10点之间通过麻醉仪器(IsoFlo，雅培公司(AbbottLaboratories))用异氟烷麻醉小鼠并通过心脏穿刺/放血杀死小鼠，杀死前一小时移去食物。

饮食。设计纯化的的饮食以提供相似量的维生素、矿物质、能量和主要营养素(参见表1)。所述饮食中的蛋白来源由酪蛋白、游离氨基酸、GMP(BioPURE GMP，达维思科食品公司)和经加工以减少残留Phe含量的GMP(参见Etzel M.R.，J Nutr.2004；134：S996-1002)提供。所述GMP饮食以NRC推荐所需量(参见NRC，NutrientRequirement of Laboratory Animals(《实验室动物营养需求》)，第4版，华盛顿特区：国家科学出版；1995中“小鼠的营养需求”)的1.5倍补充下述限制IAA以弥补氨基酸比完整蛋白更快速的吸收和降解：精氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。所述氨基酸和GMP低Phe饮食的氮含量相似，分别为24.1和22.9克氮/千克饮食，且两种饮食都提供175克氨基酸/千克饮食。所述饮食的完整氨基酸分析在密苏里大学哥伦比亚分校(密苏里州哥伦比亚)的试验中心化学实验室中进行(见表2)。

表1：实验饮食

¹BioPURE GMP；达维思科食品国际有限公司，明尼苏达州勒苏尔。

²经加工以减少Phe含量的市售GMP。

³此外，下述L-氨基酸包括在总计175克氨基酸/千克饮食中：丙氨酸，3.5；天冬酰胺，6.0；天冬氨酸，3.5；谷氨酸，40；甘氨酸，23.3；异亮氨酸，8.2；盐酸赖氨酸，18.0；脯氨酸，3.5；丝氨酸，3.5；苏氨酸，8.2；和缬氨酸，8。

⁴报道于Reeves等，AIN-93 purified diets for laboratory rodents：final report of the AmericanInstitute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet(用于实验啮齿动物的AIN-93纯化饮食：美国营养研究院专门书面委员会关于AIN-76A啮齿动物饮食重新配制的最终报告)J Nutr.1993；123：1939-51。

表2：饮食的氨基酸分布

实验设计。进行三项实验。实验1检测4周龄雄性WT小鼠喂食42天补充有IAA的GMP以维持食物摄取和生长是否充足。包括三组膳食治疗组(n＝10/组)：酪蛋白对照、补充所有限制IAA的GMP(GMP充足)、和为了证实Phe限制性而经加工以减少残留Phe并补充有除Phe外的所有限制IAA的GMP(GMP Phe缺乏)。在喂食GMP Phe缺乏的饮食3天后食物摄取衰退时，我们在第4天将Phe加入饮用水中(1g Phe/L)。

实验2检测在饮用水中提供21天的Phe(1g Phe/L)时含氨基酸和GMP的饮食维持雄性和雌性PKU小鼠(5-8周龄)生长的能力。包括三组膳食治疗组(n＝10/组)：喂食Phe缺乏的GMP饮食的PKU小鼠，喂食Phe缺乏的氨基酸饮食的PKU小鼠，和喂食GMP充足饮食的WT小鼠。我们测定PKU小鼠的每日饮用水摄取并根据蒸发调整以确定Phe消耗量。

实验3评估喂食47天含补充有最小量Phe(实验2中确定)的氨基酸和GMP的饮食维持雄性和雌性PKU小鼠生长和影响其血浆和脑中氨基酸浓度的能力。包括四组膳食治疗组：喂食酪蛋白(n＝8)或GMP充足饮食(n＝7)的6周龄WT小鼠和喂食所述低Phe氨基酸(n＝10)或低Phe的GMP饮食(n＝11)的8-10周龄PKU小鼠。各治疗组中的雄性和雌性小鼠数量相似。喂食21天后通过眼眶放血获取血液样品用肝素化毛细管进行氨基酸分析(n＝5/组)。47天后小鼠经麻醉，用心脏放血杀死并取下头部。迅速移出脑并置于干冰冷却的玻璃板上。用可见标志从下述5个区域取样品：小脑、脑干、下丘脑、顶叶皮层和前梨状皮层。样品放入预先称重的聚苯乙烯管中，称重测定样品质量并-80℃保存直至处理。

氨基酸分析。通过心脏穿刺将血液收集到含终浓度2.7mmol/L EDTA的注射器中，并通过4℃ 1700xg离心15分钟来分离血浆。用装有离子色谱系统的Beckmann6300氨基酸分析仪用茚三酮柱后衍生法检测血浆中游离氨基酸的分布。加入内标和注入所述柱中前，用磺基水杨酸将样品去蛋白化、离心(14000xg；5分钟)并通过0.2-μm注射过滤器。

脑中游离氨基酸分布在加州大学戴维斯分校兽药学院的氨基酸分析实验室(加利福尼亚州，戴维斯)中用Biochrom 30氨基酸分析仪(生物色谱公司(Biochrom))进行测定。从脑样品中提取氨基酸的过程包括以1∶10(重量∶体积)的比值添加含100μmol/L正亮氨酸为内标的3％磺基水杨酸(西格玛化学品公司(Sigma Chemicals))，用超声针均质2分钟，4℃ 14,000xg离心20分钟，和用0.45-μm注射器驱动的过滤器过滤上清液。用0.4mol/L LiOH将所述滤液调到pH2.2并将0.05mL注入柱中。数值表示为纳摩尔氨基酸/克组织湿重。

统计。用SAS 8.2版(SAS研究院)和R(维也纳大学，奥地利维也纳)进行统计分析。用普通线性模型分析数据。膳食治疗组之间的差异用保护性最小显著差异技术确定。当残差图表明组间的方差不齐(unequal variance)时(一些数据中出现)，对经自然对数变换的数据进行统计分析。适当时，将性别包括为协变量以调整其潜在影响。治疗组之间的体重(BW)变化用实验1中的重复测量分析进行评价。在PKU小鼠中，用简单线性回归检测死亡前48小时的氨基酸膳食摄取和血浆及脑中氨基酸浓度之间的关系。所有数值表示为均值±SE；P≤0.05视为显著。

结果

实验1。3组膳食治疗组之间的初始和最终BW没有差异(见图1)。整个42天的研究中酪蛋白和GMP充足组之间的食物摄取和BW没有差异。3天后小鼠停止进食所述Phe缺乏的GMP饮食，此时将Phe加入饮用水中并恢复食物摄取。第14天到第42天，3个膳食组的每天BW变化没有差异。

与酪蛋白相比，摄取GMP的血浆中氨基酸的分布显著改变。喂食GMP充足或Phe缺乏饮食的野生型小鼠显示血浆IAA浓度升高，苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸分别为喂食酪蛋白饮食小鼠中浓度(数据未显示)的3倍、2.4倍和1.6倍。与GMP充足和酪蛋白组相比，喂食Phe缺乏GMP饮食的小鼠显示的血浆Phe和酪氨酸浓度显著较低。

实验2。3个治疗组之间21天的初始(16-18±1.4g)和最终(19-21±1.3g)BW及食物摄取(3.3-4.1±0.3g/d)没有显著差异。PKU小鼠的平均Phe摄取，摄取Phe缺乏的氨基酸饮食的为6.5±0.5mgPhe/d，摄取Phe缺乏的GMP饮食的为5.9±0.3mg Phe/d(P＞0.10)。考虑到我们从实验1和2中观察到生长可能受到饮用水中Phe供给的限制，我们决定在实验3中补充低Phe氨基酸和GMP饮食以包括2.5g Phe/kg饮食。这为生长的PKU小鼠提供每天7.5-10mg Phe的Phe摄取。

实验3。4个膳食治疗组之间的BW增长、基于饲料摄取与BW增长之比的饲料利用以及蛋白效率比没有显著差异(见表3)。PKU小鼠比WT小鼠重约2g(P＜0.05)，这与前者大2周相一致。研究结束时，两种基因型的雌性小鼠的体重都比雄性小鼠轻(20±1g与25±1g；n＝17-18；P＜0.0001)。

表3：喂食含酪蛋白、GMP或氨基酸的WT和PKU小鼠的BW、饲料利用和器官质量(实验3)¹

¹数值为均值±SE。一行中不含相同字母上标的均值有差异，P＜0.05。

²蛋白效率比，克BW增长/克蛋白摄取。

相对器官质量因饮食和性别表现出显著差异。喂食氨基酸饮食的PKU小鼠的肾脏质量显著大于其他组。喂食GMP充足饮食的WT小鼠的心脏质量显著大于其他组。喂食氨基酸或GMP饮食的PKU小鼠与WT小鼠相比具有显著较大的相对肝脏质量。与雄性小鼠相比，两种基因型的雌性小鼠都显示显著较低的相对肾脏质量和显著较高的相对心脏质量。

血浆中氨基酸分布受饮食和性别的影响(见表4)。

表4：喂食含酪蛋白、GMP或氨基酸的WT和PKU小鼠的血浆氨基酸浓度(实验3)¹

¹数值为均值±SE，n＝8。一行中不含相同字母上标的均值有差异，P＜0.05。

²BCAA，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸之和。

与喂食酪蛋白或GMP饮食的WT小鼠相比，喂食氨基酸或GMP低Phe饮食的PKU小鼠显示15倍的血浆Phe浓度且血浆酪氨酸和脯氨酸浓度降低60-70％。喂食GMP饮食的WT和PKU小鼠的血浆苏氨酸和异亮氨酸浓度是喂食酪蛋白或氨基酸饮食的WT和PKU小鼠数值的约2倍(P＜0.002)。注意到喂食GMP饮食的WT和PKU小鼠的血浆赖氨酸浓度(272±11μmol/L)低于喂食酪蛋白或氨基酸饮食的WT和PKU小鼠(443±31μmol/L；P＜0.0001；n＝17-18)。两种基因型的雌性小鼠的血浆酪氨酸浓度(74±6与53±8μmol/L)和色氨酸浓度(113±5与81±5μmol/L)都比雄性小鼠高(P＜0.01；n＝17-18)。

与氨基酸饮食的小鼠相比，喂食GMP的PKU小鼠在血浆氨基酸浓度上有显著差异。与摄取氨基酸饮食的小鼠相比，摄取GMP 47天的PKU小鼠的血浆Phe浓度显著降低11％，在21天未观察到这个现象。杀死小鼠前48小时PKU小鼠的Phe摄入相似(16-18mg Phe/48h)，但显著低于WT小鼠(58-66mg Phe/48h)。在喂食GMP的PKU小鼠中，支链氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的血浆浓度总和比氨基酸饮食的小鼠增加50％；然而，亮氨酸浓度没有差异。PKU小鼠中，杀死小鼠前48h的膳食氨基酸摄入和血浆氨基酸浓度相关。最高的正相关(P＜0.0001；n＝15)包括：甘氨酸，R²＝0.88；苏氨酸，R²＝0.45；异亮氨酸，R²＝0.44；和缬氨酸，R²＝0.34。

小脑中氨基酸分布因饮食而非性别有显著差异(见表5)。PKU小鼠的小脑中Phe的浓度为WT小鼠数值的3-4倍(P＜0.0001)。无论何种饮食，PKU小鼠的小脑中酪氨酸浓度和支链氨基酸总浓度均为WT小鼠的约50％(P＜0.0001)。与喂食氨基酸饮食的PKU小鼠相比，喂食所述GMP饮食的PKU小鼠小脑中的Phe浓度降低20％。

此外，在样品脑的5部分都观察到Phe浓度降低20％的响应：小脑、脑干、下丘脑、顶叶皮层和前梨状皮层(图2)。喂食GMP饮食的PKU小鼠小脑中的苏氨酸和异亮氨酸浓度与氨基酸饮食的小鼠相比增加了70-100％(P＜0.0001)。注意到喂食GMP饮食的PKU小鼠小脑中缬氨酸浓度比氨基酸饮食高的相似趋势(P＜0.10)。PKU小鼠小脑中的Phe浓度与血浆中苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的浓度以及血浆中苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的浓度之和逆相关，R²＝0.65-0.77(P＜0.0001)(图3)。无论何种饮食，PKU小鼠小脑中谷氨酰胺浓度都比WT小鼠低11％(P＜0.05)。小脑中神经递质血清素前体色氨酸和脑的甘氨酸神经递质系统前体甘氨酸的浓度在各组之间没有差异。

表5：喂食含酪蛋白、GMP或氨基酸的WT和PKU小鼠小脑中的氨基酸浓度(实验3)¹

¹数值为均值±SE，n＝8。对于PKU小鼠，下述氨基酸的样本数为3：丙氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、牛磺酸和色氨酸。一行中不含相同字母上标的均值有差异，P＜0.05。

²BCAA，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸之和。

讨论

本研究评估含补充有IAA的GMP作为单一蛋白源的饮食支持生长和影响PKU小鼠血浆及脑中氨基酸浓度的能力。我们观察到喂食GMP的PKU小鼠与氨基酸饮食的相比有相似的生长和显著较低的血浆及脑Phe浓度，这支持利用GMP作为PKU饮食中低Phe蛋白来源。

当作为单一膳食蛋白来源喂食时，用于小鼠生长的含有限量多种IAA的GMP包含：精氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、Phe、色氨酸和酪氨酸。我们的结果表明喂食补充有这些限制IAA的GMP小鼠能充分生长。在实验1中，喂食酪蛋白或GMP充足饮食的断奶WT小鼠6周内生长几乎相同。实验3中，具有相似Phe摄取的喂食GMP或氨基酸饮食的PKU小鼠在BW增长、饲料效率和蛋白效率比上没有显著差异。这些数据证明补充有限制IAA的GMP为生长小鼠提供营养充足的膳食蛋白来源。

在大鼠中，进食缺少某IAA的饮食快速抑制血浆和脑中限制IAA的浓度，并降低的食物摄取(Harper等，Physiol Rev.1970；50：428-39)。因此，实验1中小鼠停止食用Phe缺乏的GMP饮食并在该饮食仅3天后就损失BW，以及在饮用水中添加Phe使食物摄取和BW增长正常化并不令人惊讶。喂食所述GMP充足饮食的WT小鼠中异亮氨酸和苏氨酸的血浆浓度为喂食酪蛋白饮食的WT小鼠的2-3倍。然而，一旦Phe缺乏得到纠正，血浆氨基酸浓度的这些变化就不影响喂食GMP小鼠的食物摄取。因此，我们的结论是摄取补充有所有限制IAA的GMP改变了血浆氨基酸分布而不减少生长小鼠的食物摄取。

与其他IAA相比，苏氨酸的肝脏摄取较低且通过肝脏苏氨酸脱水酶活性(EC4.2.1.16)将苏氨酸氧化为CO₂在人(Darling等，Am J Physiol Endocrinol Metab.2000；278：E877-84)和大鼠(Harper等，Physiol Rev.1970；50：428-39)内都受到限制。因此，若饮食提供的苏氨酸低于正常水平的15倍，则增加膳食苏氨酸而不增加总蛋白摄取导致血浆苏氨酸池扩大而无毒性。在所有3个实验中，摄取GMP的血浆苏氨酸浓度与酪蛋白和氨基酸饮食相比都有最大增长。

通过苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)将苏氨酸降解为甘氨酸在大鼠中是主要的分解代谢途径，但在人中不是(Darling等，Am J Physiol Endocrinol Metab.2000；278：E877-84)。由于甘氨酸神经递质系统能抑制或刺激神经脉冲的传输，甘氨酸水平上升在脑中具有潜在的神经毒性(Spencer等，J Neurosci.1989；9：2718-36)。然而，我们证明血浆和脑中的甘氨酸浓度没有增加，表明喂食提供3倍于正常苏氨酸摄取的GMP饮食不足以改变脑中甘氨酸浓度。总之，这些发现支持膳食GMP的安全性。

此外，喂食GMP47天的PKU小鼠血浆中的Phe浓度比氨基酸饮食的降低11％，这对PKU营养控制来说是积极的结果。与PKU控制和已知Phe神经毒性效应最密切相关的发现是，我们观察到喂食GMP的PKU小鼠脑5部分的Phe浓度比氨基酸饮食的降低20％。脑中Phe浓度与患PKU个体精神损伤关系最密切(Scriver等编著，Hyperphenylalaninemia：Phenylalanine Hydroxylase Deficiency(《高苯丙氨酸血症：苯丙氨酸羟化酶缺陷》)，第8版，第77章中Donlon等，Metabolic andMolecular Basis of Inherited Disease(遗传病的代谢和分子基础)，纽约：麦格劳-希尔教育出版集团；2007)。喂食GMP的PKU小鼠脑中Phe浓度降低最可能的解释是由于摄取GMP上升的血浆LNAA水平通过LNAA载体蛋白竞争性抑制通过血脑屏障的Phe运输，所述载体蛋白在脑中的Km比肠中低很多。较高的血浆苏氨酸、异亮氨酸及缬氨酸浓度和较低的脑Phe浓度之间显著的逆相关支持这一结论。有趣的是，先前的研究表明是异亮氨酸而不是苏氨酸竞争抑制大鼠脑中Phe运输(Tovar等，J Neurochem.1988；51：1285-93)。

总体来说，我们证明喂食含20％补充有IAA的GMP的PKU小鼠与氨基酸饮食的相比具有相似的生长和较低浓度的血浆和脑Phe浓度。这些数据证明GMP可配置成营养充足的完备蛋白用于生长小鼠，且表明长期饲养研究可提供GMP代谢的进一步认识。我们的发现支持继续研究以证明用GMP制备的食物和饮品在人PKU的营养控制中的功效。

实施例2：用GMP和补充AA所制备食物的可口度

在本实施例中，申请人用GMP制备了各种可口的、低phe食物和饮品并通过在PKU个体中进行消费者感官研究评估其可接受度。结果证明了用GMP所制备产品的可接受度。

材料和方法

食物和饮品。在威斯康星大学麦迪逊分校(University of Wisconsin-Madison，UW)的威斯康星乳品研究中心(Wisconsin Center for Dairy Research，CDR)的食品应用实验室(Food Applications Laboratory)开发含GMP的草莓布丁、草莓果泥干、巧克力饮品、点心饼干和橙子运动饮品用于本研究。用BioPURE GMP(达维思科食品国际有限公司，明尼苏达州勒苏尔)配制GMP产品。图4显示BioPURE-GMP与酪蛋白的氨基酸分布对比。

味道测试中包括基于氨基酸的市售巧克力饮品和低蛋白饼干以提供GMP产品和PKU饮食中当前所用产品之间的对比。GMP和氨基酸饮品中的氮浓度相似。所有检测食品的能量和蛋白含量如表6所示。

表6：PKU个体中测试用GMP制备的食物和饮品的平均可接受度评分

所测试的食物的能量和蛋白含量为：GMP草莓布丁，213千卡和5.7g蛋白/1/2杯食物(113g)；GMP果泥干，60千卡和0.7g蛋白/15g；GMP橙子运动饮品67千卡和7.9g蛋白/8盎司(234g)；GMP巧克力饮品，148千卡和10.2g蛋白/8盎司(236g)；氨基酸巧克力饮品，187千卡和11.4g蛋白/8盎司(202g)；GMP点心饼干，110千卡和1.3g蛋白/30g；低蛋白饼干，135千卡和0.1g蛋白/30g。

均值±标准差(分数参考：1非常讨厌；2讨厌；3既不喜欢也不讨厌；4喜欢；5非常喜欢)，

B或C的同一列中有不同上标字符(a或b)的均值有显著差异，p≤0.05。

评估食物和饮品可接受度的感官研究。感官研究的实验方案经UW社会和行为科学审查委员会(Social and Behavioral Sciences Institutional Review Board，UW)批准。参加2004年和2005年PKU夏令营以及2005年PKU家庭会议的PKU对象进行3项感官研究(n＝49；年龄范围12-42岁)。该研究在UW食品科学系的感官分析实验室(Sensory Analysis Laboratory，Department of Food Science，UW)或威斯曼中心(Waisman Center)进行。

将20-30g测试样品以平衡随机顺序用三位盲码给予对象。用5点嗜好程度(1＝非常讨厌，2＝讨厌，3＝既不讨厌也不喜欢，4＝喜欢，5＝非常喜欢)对食品和饮品评分以评价5种感官类别，包括外观、气味、味道、口感、总体可接受度。

统计学分析。进行非独立t检验以分析GMP巧克力饮品和氨基酸巧克力饮品的平均可接受度评分。组均值在p6 0.05时视为显著差异，p值用统计分析软件包(Statistical Analysis Software package)(SAS研究院有限公司，9.1.3版，美国北卡罗来纳州卡雷)通过双尾t检验确定。用普通线性模型过程(PROC GLM)然后用费氏最小二乘法进行均值分离来对比GMP点心饼干和低蛋白饼干的可接受度评分，。数据表示为平均值±标准差。

结果

2004和2005年的PKU活动期间，PKU对象品尝了总计7种产品(表6)。这些食物和饮品中，GMP草莓布丁是最可接受的(总分4.2±0.9)，其他食品以总可接受度排序为GMP点心饼干(3.6±1.4)、GMP草莓果泥干(3.4±1.0)、GMP巧克力饮品(3.3±1.0)、GMP橙子运动饮品(3.3±1.1)和低蛋白饼干(2.9±1.3)。氨基酸巧克力饮品最不可接受(2.5±1.4)。小于3的评分表明食物或饮品就某一具体种类而言不能被接受，而3分表明中性的接受度。

PKU对象将GMP巧克力饮品的外观、气味、味道和总体可接受度评为比基于氨基酸的饮品显著地更可被接受(p≤0.05，表6B)。GMP点心饼干的外观、气味和味道被评为比低蛋白饼干显著地更可被接受(p≤0.05)，但在两种饼干之间总体可接受度没有显著差异(表6C)。

讨论

这些数据证明GMP的功能特性特别适合用在饮品和半固体食品如布丁中。例如，GMP溶于等电点低于3.8的酸中，形成凝胶或泡沫，并具有良好的热稳定性。GMP确实提高了饮品中的巧克力风味，该巧克力风味还有助于掩盖GMP的乳味。这些数据表明GMP可用于制备比当前需要作为PKU饮食中主要蛋白源的氨基酸制剂更可口的饮品。

实施例3：10周GNP饮食后的PKU成人案例研究

本实施例为29岁PKU男性的案例报告，该男性在十周内用GMP基食品作为单一蛋白来源。该测试对象报告说GMP基食品比标准氨基酸制剂味道更好，且进食该GMP基饮食的十周内其血浆Phe水平总体较低。

获得威斯康星大学麦迪逊分校健康科学审查委员会批准以进行PKU对象的门诊患者研究来评估膳食GMP的安全性和可接受度。研究了基因型为R261Q和R408W的29岁男性PKU对象。该对象从出生到12岁坚持低Phe饮食但青少年时期未控制饮食，这导致痉挛性四肢轻瘫和癫痫病发作，其用标准抗痉挛的治疗法治疗。该对象完成了15周的研究，比较GMP和其常用的处方氨基酸制剂(芬来得(Phenylade)和氨基酸混剂；应用营养公司(Applied Nutrition)，美国新泽西州锡达诺尔斯)作为其膳食蛋白主要来源。

所述实验方案包括研究的前3周和后2周进食他常用的氨基酸制剂。研究的中间10周期间，用对象所选GMP食物产品替代所有氨基酸制剂，所选产品包括：GMP橙子运动饮品(28盎司/天；28克蛋白)，GMP布丁(1.5杯/天；15克蛋白)和GMP点心棒(1棒/天；5克蛋白)。所述GMP食品的营养组成见表7。

研究中有6周将含精确控制Phe含量的称重食物份额送到对象家中。所述饮食的Phe含量通过分析所选食品的氨基酸含量并计算两种饮食中数量和包装批次相匹配的剩余食品中的Phe含量来确定(美国农业部ARS(2005)美国农业部标准参比营养数据库，第18次发布)。本研究余下9周内，该对象使用代谢营养师所计划的菜单，购买并称重其自己的食品。尽管Phe摄取在15周内得到良好控制，但本文提供的血液和血浆中Phe浓度的结果是基于提供食品给对象的那6周。

表7：GMP食物产品的营养组成^a

^aGMP食物产品在威斯康星乳品研究中心开发，但除了牧园色拉酱和肉桂松脆棒在波斯顿堪布鲁克(Cambrooke)食品公司开发。

氨基酸和GMP饮食提供的主要营养素分布恒定且包括：10 880-11 300kJ/天(2600-2700千卡/天)，10-11％能量来自蛋白(0.84克蛋白/千克)，24-26％能量来自脂肪，且63-66％能量来自碳水化合物。研究期间对象体重保持在87kg。每日Phe含量为4周1100mg Phe和2周1180mg Phe，这提供约13mg Phe/kg体重。所述氨基酸制剂和GMP食物产品各提供0.6g蛋白/kg体重。补充所述GMP食物产品以完备蛋白的氨基酸评分模式的130％，或对于酪氨酸为150％，提供下述限制氨基酸，表示为毫克氨基酸/克GMP蛋白：组氨酸，23；亮氨酸，72；色氨酸，9；和酪氨酸，71。一天两次的多种维生素/矿物质补充物、钙/磷补充物和50mg L-酪氨酸与所述GMP饮食一起摄取以确保与氨基酸制剂所提供的摄取相似。

过夜禁食后和早餐前获取血液样品用于使用两种已知分析方法之一检测Phe浓度以提供不同数值(Gregory等(2007)Genet Med 9：761-765)。串联质谱(MS/MS)用于分析对象在09:00到09:30之间收集在滤纸上的血液斑点中的Phe浓度(Rashed等.(1995)Pediatr Res 38：324-331)，Beckman 6300氨基酸分析仪用于分析12:00到12:30之间在当地诊所通过静脉穿刺获得的血浆的氨基酸分布(Hommes，FA，编著的Techniques in Diagnostic Human Biochemical Genetics：A Laboratory Manual(《诊断性人生化遗传中的技术：实验室手册》)中的Slocum和Cummings(1991)，AminoAcid Anaylsis of Physiological Samples(生理样品的氨基酸分析)，纽约：威利斯公司(Wiley-Liss)，87-126)。

氨基酸和GMP膳食期间血液和血浆氨基酸浓度的统计学差异通过假定氨基酸测量对时间独立的t检验评估；p＜0.05视为显著。当基于提供已知Phe含量的饮食用相对于100mg Phe摄取来表达时，消耗GMP饮食的平均禁食血浆和血液Phe浓度与氨基酸饮食相比显著降低13-14％(图5)。消耗GMP饮食的血浆Phe的绝对浓度比氨基酸饮食的降低约10％(从736降至667mmol/L，见表8)。GMP和氨基酸饮食的血浆酪氨酸浓度没有显著差异。基于身体检查和包括电解质、白蛋白、前白蛋白和肝功能测试的生化组分析的结果，进食GMP饮食未见不良影响。

与GMP的氨基酸分布和PKU小鼠中的研究(见实施例1)一致，摄取GMP饮食的血浆LNAA浓度比氨基酸饮食显著增长(表8)。GMP饮食的苏氨酸增至2.6倍，异亮氨酸增至1.7倍，支链氨基酸总计增长了16％。有趣的是，该对象先前曾给予必须LNAA混合物(PreKUnil；丹麦科瑟的尼莱公司(NiLab))的补充实验，但由于其癫痫加剧而终止。LNAA制剂的氨基酸比GMP含更多来自酪氨酸和色氨酸的部分并相应含更少的来自苏氨酸和支链氨基酸的部分，GMP所含必需氨基酸约80％来自苏氨酸和支链氨基酸的组合。因此，GMP看来为该对象提供安全的LNAA膳食来源。GMP饮食的血浆脯氨酸的浓度增长了40％，这与摄取GMP的脯氨酸是氨基酸制剂的2倍有关。GMP饮食的血浆谷氨酰胺和瓜氨酸浓度与氨基酸饮食相比小有增长，其与肝功能测试变化无关。

表8：单个PKU对象摄取氨基酸饮食和GMP饮食的禁食血浆氨基酸浓度对比a

*，**与AA饮食的差异，*p＜0.05，**p＜0.01。

a数值为均值±TSE，n＝4；分散在氨基酸饮食的5周和GMP饮食的10周中内的不同日子里于12:00-12:30之间获取过夜禁食和早餐前的血液样品。

b p＝0.073。

c BCAA＝亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸之和。

总体上，该对象喜欢GMP饮食并报道说该饮食比其常用氨基酸饮食使其感觉更活跃。由于喜欢GMP食物产品，该对象更倾向于将所述产品全天分配。他每天进食GMP食物产品约3次，而氨基酸制剂为每天一次。众所周知，把PKU的氨基酸药用食物分隔在全天中能降低血液Phe水平，这是由于其改善了用于蛋白合成的氨基酸的利用。因此，进食GMP能降低血液Phe水平的一种解释是由于全天进食了足量高品质蛋白，蛋白合成得到改善。或者，与GMP一起摄取的更多LNAA，特别是摄取大量苏氨酸(每天约70mg/kg)，有助于降低血浆Phe水平。

总之，PKU控制所需的对高度约束性、低Phe饮食的遵守性在青少年和成年期仍然较差，引起血液Phe水平升高、神经心理恶化和母性PKU的可悲后果。Phe含量天然较低的丰富的食品成分膳食GMP，提供创新方法以改善PKU营养控制。本实施例表明将用GMP制备的低Phe食品和饮品纳入PKU饮食能改善饮食的味道、品种和方便性。更可口和多能的低Phe饮食可导致PKU个体的膳食遵守性、代谢控制和根本上生活质量的改善。

实施例4：比较补充有限制氨基酸的GMP和氨基酸制剂作为PKU营养控制主要蛋白源的11个对象的临床试验

本实施例表明PKU营养控制中用补充有限制氨基酸的GMP作为蛋白源替代合成AA制剂安全且高度可接受。作为完备蛋白源，GMP相比AA能提高蛋白存留和苯丙氨酸利用。

为了进一步评估GMP在PKU饮食中的潜在益处，在PKU个体中进行8天的临床研究。目的是研究用GMP食物产品替代AA制剂在PKU对象中对可接受度、安全性、血浆AA浓度和蛋白利用测定方面的影响。

对象和方法

对象。在威斯康星大学麦迪逊分校的威斯曼中心生化遗传组常规监控的12个PKU对象于2006年3月-2008年6月间参与本研究。一名对象(年龄：10岁)由于不能完成实验方案退出本研究。因此，报道来自11个对象(年龄11-31岁；7个男性和4个女性)的数据(见表9)。威斯康星大学麦迪逊分校健康科学审查委员会批准本研究。

参与标准包括诊断为典型或变异PKU和自愿进食≥50％处方体积的AA制剂。然而，血浆苯丙氨酸浓度的最佳控制不是参与的前提。最佳控制包括苯丙氨酸浓度维持到新生儿至12岁在120-360μmol/L之间，青少年在120-600μmol/L之间，和成人＜900μmol/L。PKU诊断基于膳食治疗开始前婴儿期测量的苯丙氨酸浓度；典型PKU患者的苯丙氨酸浓度≥1200μmol/L(见表9)。本研究中的所有对象诊断为典型PKU，除了一个对象检测出为PKU变型(对象1)。

用Guldberg等设计的引物(Hum Mol Genet 1993；2：1703-7)通过PAH基因的DNA序列(德克萨斯州奥斯丁的德克萨斯州立健康服务部实验室服务部门)完成各对象的突变分析。所有对象为PAH突变的复合杂合体(表9)。5个对象为主要表现典型表型的2拷贝突变，6个对象为典型突变和PKU患者中观察到的变异突变和/或非PKU的高苯丙氨酸血症突变。

由于2年的研究征集内没有完成各对象膳食处方的正式评价，所以研究开始前检测所有对象的苯丙氨酸裕度。对于本研究，苯丙氨酸裕度定义为使血浆苯丙氨酸浓度恒定(±5％变化)的膳食苯丙氨酸摄入量，其由苯丙氨酸摄入依序升高和频繁监控血液斑点内的血液苯丙氨酸浓度检测。通过完成一次或多次“空运行(dryrun)”来证实各对象的膳食苯丙氨酸裕度，空运行中提供5天的所有食品、饮品和制剂并在各空运行前和结束时测量血液斑点中苯丙氨酸浓度。研究开始时血浆苯丙氨酸浓度为192μmol/L(对象10)-1011μmol/L(对象2；表9)。为了维持这些血浆苯丙氨酸浓度，对象的膳食苯丙氨酸裕度为5.8mg/kg(对象10)-26.7mg/kg(对象2)。

表9：11个苯丙酮尿症对象的个体特征

¹诊断时年龄和苯丙氨酸浓度表示婴儿期开始的饮食治疗时的数值。

²数值表示进食指定氨基酸饮食时第3天早餐后2.5小时血浆中苯丙氨酸浓度。

研究方案。本代谢研究中各对象作为他或她自己的对照，各包括2项4天的膳食治疗：AA饮食(1-4天)和GMP饮食(5-8天)。设计了一份AA饮食的和另一份GMP饮食的24小时菜单；各饮食治疗每天重复相同菜单(表10)。在各饮食中，将AA制剂或GMP产品各自平均分配在全天的3餐中。蛋白等价物分至全天改善了蛋白利用并能较低血浆苯丙氨酸浓度。研究中，由威斯曼中心或威斯康星大学临床和转化型研究中心(UW-CTRC)的受训膳食人员以克称重所有食品、饮品、点心、制剂和GMP产品。为了保证研究每天摄入相同，鼓励对象进食所有食品和饮品。没有对象未能做到这点。

表10：氨基酸(AA)和糖巨肽(GMP)饮食的典型菜单比较

¹所有食物由受训人员在克量级上测量。本研究结束后，已开发改善的配方以进一步降低本典型菜单中所示的所有GMP产品的苯丙氨酸含量(12)。例如，相比33mg苯丙氨酸，GMP棒现在仅用14mg苯丙氨酸制得，相比本研究所用的原始制剂中的38mg苯丙氨酸，GMP巧克力布丁现在含21mg苯丙氨酸。PKU，苯丙酮尿症。

²本菜单中所用的PKU制剂为40g Phenex 2(俄亥俄州哥伦布市的雅培公司)。

给每个对象提供本研究开始前和AA饮食第1天与第2天的居家进食的所有食品和制剂。第2天晚饭前，各对象进入UW-CTRC继续AA饮食(第3和4天)和4天GMP饮食(第5-8天)。UW-CTRC接收期间每天完成身体检查。所有对象需每天行走或完成身体活动2-3次以使活动水平与其日常一致。正餐和点心的时间也和各对象日常相似。

在第1和第2天，各对象在滤纸上收集血液斑点用于苯丙氨酸和酪氨酸分析。UW-CTRC接收期间，每日提取血液用于血浆AA和自动化学组分析以测量前白蛋白、白蛋白、总蛋白、电解质、葡萄糖、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐、钙、镁、磷酸盐、尿酸、总胆红素与直接胆红素、碱性磷酸酶和肝脏酶(γ-谷氨酰转肽酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶)的血清浓度。所有餐后血液样品在每天早餐开始3小时后或早餐后2.5小时提取(第3-8天)。

前5个对象完成实验方案后，数据安全和监控委员会评价该实验方案并研究过程。由于委员会的建议，对于剩下的6个对象，取消GMP饮食的前2天(第5和6天)用于化学组的血液提取，并在AA饮食的后2天(第3和4天)和GMP饮食的后2天(第7和8天)的早餐前添加额外的禁食血液样品。对所有禁食样品分析血浆AA。禁食和餐后血液样品均获得的6个对象的平均年龄为26±2岁且包括4女2男(对象6-11；表9)。

由于GMP食物产品没有补充维生素和矿物质，所以在GMP饮食期间给予所有对象完备的多种维生素和矿物质补充(Phlexy-Vits；北美营养公司(Nutritia NorthAmerica)，马里兰州盖瑟斯堡)或Theragran M(沃尔格林公司(Walgreen Co)，伊利诺伊州德尔菲尔德)和Target-Mins(乡村生活公司(Country Life)，纽约州霍波格)的组合。AA饮食期间，将提供给GMP饮食的相同补充物给予进食不含微生物和矿物质的制剂或多种制剂的任何对象。若需要，给予额外的钙以满足根据年龄的膳食参考摄取量(DRI)推荐(药物研究院，Dietary Reference Intakes forEnergy，Carbohydrates，Fiber，Fat，Protein and Amino Acids(《能量、碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食参考摄取量》)，华盛顿特区：国家科学出版，2002)。

研究饮食。在密苏里大学实验中心化学实验室分析GMP(Bio-Pure GMP；明尼苏达州勒苏尔的达维思科公司)的AA含量。市售GMP的苯丙氨酸含量为0.4g苯丙氨酸/100g GMP和蛋白含量为86.0g/100g GMP。该GMP用于具有较高苯丙氨酸耐受的3个对象。对于具有较低苯丙氨酸耐受的9个对象，GMP原始物料经进一步纯化以将苯丙氨酸含量降到平均0.21±0.01g苯丙氨酸/100g GMP和平均蛋白含量75.0±0.7g/100g GMP。GMP纯化仅降低苯丙氨酸含量；与市售GMP相比，纯化的GMP中其他AA比例保持不变。

所述GMP补充4种限制AA，以毫克AA/克GMP蛋白表示终浓度：组氨酸，23；亮氨酸，72；甲硫氨酸，28；和色氨酸，9。这相对于基于2002DRI(药物研究院，Dietary Reference Intakes for Energy，Carbohydrates，Fiber，Fat，Protein andAmino Acids(《能量、碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食参考摄取量》)，华盛顿特区：国家科学出版，2002)所预测需求的130％。由于PKU中酪氨酸为必须AA，因此以预测需求的150％补充酪氨酸以达到终浓度71mg/g GMP蛋白。对于GMP饮食，没有试图复制各对象进食的各种制剂中的补充酪氨酸浓度，因为大多数情况下，制剂的酪氨酸含量显著高于预测需求。因此，对于所有对象，AA饮食中的酪氨酸摄取高于替代GMP产品时的酪氨酸摄入。

威斯康星大学麦迪逊分校的威斯康星乳品研究中心为本研究开发了用GMP为蛋白源制作的低苯丙氨酸食物产品。开始研究前，各对象品尝用GMP制作的各种食物产品并选择2-3种产品包括在所述GMP饮食菜单中。GMP饮品和食品包括橙子风味的运动饮品、巧克力风味或焦糖风味的饮品、巧克力或草莓布丁和肉桂松脆棒(如实施例3；见表7)。所述GMP食物产品中苯丙氨酸含量范围根据GMP纯度和用于生产这些食物和饮品的额外成分而不同，但通常一份GMP食物产品提供5-10g蛋白和15-30mg苯丙氨酸。

饮食复合物。所述AA和GMP饮食基于各对象苯丙氨酸摄入的预研究评估来计算并根据能量、蛋白、苯丙氨酸和脂肪来控制(见表11)。所述AA饮食(第1-4天)包括对象常用的AA制剂，各对象有所不同。对于所述GMP饮食(第5-8天)，GMP产品替代对象全天摄取的AA制剂。通过AA分析所选食品和计算剩余食品的苯丙氨酸含量来确定计划菜单所用食品的苯丙氨酸含量。两种饮食中的未分析食品在数量、品牌和包装批次上相匹配，而已分析苯丙氨酸含量的食品以不同量使用来产生所述GMP产品的苯丙氨酸含量。

由于用以定量食品的苯丙氨酸含量的数据的局限性，收集膳食组分用于分析苯丙氨酸以证实苯丙氨酸含量的计算。因此，所述AA饮食和所述GMP饮食期间收集2天各对象在24小时里进食的所有食物、制剂和GMP食物产品的副本。各副本经研磨和冻干，将各复合物的等分样送到密苏里大学进行AA分析。对比各对象的复合物分析时，所述AA饮食和所述GMP饮食中的苯丙氨酸含量没有显著差异(P＝0.061)。

表11：氨基酸(AA)和糖巨肽(GMP)饮食的营养组分¹

¹数值为均值±SEM并基于计算的膳食摄取；n＝11。

²来自合成AA的蛋白占AA饮食中总蛋白的75％而仅占GMP饮食中总蛋白的10％(来自用限制性必须AA补充GMP)。所述AA和GMP饮食中所有其他蛋白来自完整蛋白的天然来源。

³总脂肪摄取为总能量的18％-31％。低脂肪摄取在苯丙酮尿症患者中常见，因为他们选择基于碳水化合物的食品且许多AA制剂的脂肪含量低，这些是为患该疾病的老年个体设计的(28)。

⁴与AA饮食有显著差异，P＜0.0001(成对t检验，对象配对)。

测定。各对象采集血点以确定其苯丙氨酸裕度，并在预研究第1和2天用串联质谱(MS/MS)分析苯丙氨酸和酪氨酸(数据未显示)。用装有离子色谱系统的Beckman 6300氨基酸分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter Inc)，加州富勒敦)使用茚三酮柱后衍生法完成第3-8天收集的所有禁食和餐后血浆样品的AA分析。加入内标和注入柱中之前，用磺基水杨酸将样品去蛋白化、离心(14000xg；5分钟)并通过0.2-μm注射过滤器。

在威斯康星大学麦迪逊分校医院的临床实验室通过用标准技术分析血清化学分布。通过使用人胰岛素特异性放射性免疫试验(林可研究公司(LincoResearch)，密苏里州圣查尔斯)对按对象合并的第3+4天和第7+8天样品测定餐后样品的血浆胰岛素。通过HPLC移除IGF结合蛋白后测量第4和8天餐后血浆样品中的胰岛素样生长因子I(IGF-I)；IGF-1的回收率为85-90％。

统计学分析。所有统计分析由用于Mac操作系统(Mac OS)X版本1.12的统计学程序R(维也纳经济与商业大学(

)的统计计算R项目，奥地利维也纳)进行。分析膳食组分后，各饮食内的AA值根据各对象(n＝2)平均，然后通过成对t检验比较两种饮食之间的数值。还进行对象配对的成对t检验以比较餐后和禁食样品的所述AA饮食最后一天(第4天)到所述GMP饮食最后一天(第8天)的血浆AA数值。化学组和肝脏功能测试中的变化用相同方法比较。此外，进行成对t检验以比较6个对象的亚组中各饮食内禁食和餐后AA浓度，可从这些对象中获得禁食血浆。所有比较在P≤0.05时认为是统计学显著的。基于比较所述AA饮食最后一天(第4天)和所述GMP饮食最后一天(第8天)苯丙氨酸浓度的主要终点，若血浆苯丙氨酸浓度的变化为150μmol/L，则所得样本数(n＝11)足以在P＝0.05提供80％的检定力。

结果

饮食可接受度和AA组合物。进食GMP饮食4天后，11个对象中10个声称该GMP产品在感官品质上优于其常用AA制剂。此外，研究结束时，7个成人对象中6个表示若GMP成为可用的膳食选择时，他们强烈优选进食GMP产品而不是其常用AA制剂。

与现有推荐相比，AA和GMP饮食的所有必须AA的分析摄取(毫克氨基酸/克膳食蛋白)满足需求(世界卫生组织，Protein and Amino Acid Requirements inHuman Nutrition(《人营养中的蛋白和氨基酸需求》)，瑞士日内瓦：联合国大学，2007)。然而，膳食复合物的AA分析表明所述AA饮食与所述GMP饮食相比AA摄取上有很多显著差异(见表12)。由于GMP含高浓度的LNAA苏氨酸和异亮氨酸，所以所述GMP饮食的这些AA的摄取均值显著高于所述AA饮食。尽管补充GMP的酪氨酸为DRI的150％且亮氨酸、组氨酸、色氨酸和甲硫氨酸为DRI的130％，除甲硫氨酸外，所述GMP饮食的这些AA的摄取显著低于所述AA饮食。与所述AA饮食相比，所述GMP饮食的包括必须AA赖氨酸和非必须AA精氨酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸在内其他AA的摄取显著较低。

表12：氨基酸(AA)和糖巨肽(GMP)饮食复合物的24小时AA分布分析¹

¹数值为均值±SEM；n＝22。BCAA，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸之和。

²代表成对t检验所得AA和GMP饮食之间的差异.

身体检查和血液化学。对象进食GMP为主要蛋白源的4天时间中没有任何表明对身体状况有负面影响的身体问题被检测到或由任何对象表现出。所述AA饮食的最后一天(第4天)所测的和所述GMP饮食(第8天)相比，血清中作为蛋白状态指标的白蛋白、前白蛋白或总蛋白浓度之间或作为肾状态指标的肌酸酐浓度之间没有显著差异(表13)。然而，作为肝脏尿素生成指标的BUN在第7天和第8天所述GMP饮食时显著低于所述AA饮食第4天(见图6)。所述AA和GMP饮食的血浆IGF-I浓度没有显著差异，这说明两种饮食的蛋白营养充足。所述GMP饮食比所述AA饮食的血浆胰岛素浓度较高且有边际显著性(P＝0.053)，而血清葡萄糖浓度没有显著差异。所述GMP饮食的血清二氧化碳(主要为碳酸氢盐)含量显著高于所述AA饮食，这与较低的全身酸含量相一致。两种饮食中其他标准化学物质包括电解质的平均浓度和肝功能测试都维持在正常范围(数据未显示)。例外是正处于癫痫病抗痉挛治疗中的对象2中测量的各种肝功能测试(丙氨酸转氨酶和Υ-谷氨酰转肽酶)的浓度上升。然而，与参加本研究时测量到的上升相比，进食所述GMP饮食没有检测到这些肝功能测试的进一步上升。

表13：氨基酸(AA)和糖巨肽(GMP)饮食对餐后蛋白和糖代谢指数的影响¹

¹数值为均值±SEM；n＝11，除了总蛋白和胰岛素为n＝10；所有数值都在正常范围内。数值为血清数据，除了胰岛素样生长因子I和胰岛素为血浆数据。

²AA饮食最后一天(第4天)和GMP饮食最后一天(第8天)的差异，成对t检验，对象配对。

血浆AA浓度。早餐后2.5小时测量时，所述GMP饮食与所述AA饮食相比血浆中总AA浓度显著较高，BUN浓度显著较低(见图6)。这与从完备蛋白来源吸收AA比从合成AA吸收慢和GMP饮食的胰岛素浓度较高相一致。

苯丙氨酸和酪氨酸。所述AA饮食(第4天)与所述GMP饮食(第8天)的餐后血浆平均苯丙氨酸浓度没有显著差异(P＝0.173，图7)。血浆中苯丙氨酸浓度的变化均值为57±52μmol苯丙氨酸/L。各对象之间，血浆苯丙氨酸浓度对进食GMP饮食的响应是不均匀的，从下降175μmol苯丙氨酸/L到上升257μmol苯丙氨酸/L。总体上，所述AA饮食相比所述GMP饮食的phe血浆浓度的变化与性别、基因型和年龄之间没有一致关联。

对6个成人对象的亚组可获得第4天(AA饮食)和第8天(GMP饮食)的禁食和餐后血浆苯丙氨酸浓度。该亚组(n＝6)与前5个对象对所述GMP饮食的餐后响应没有显著差异。进食所述AA饮食4天导致获自过夜禁食的血浆苯丙氨酸浓度比获自早餐后2.5小时的餐后血浆的苯丙氨酸浓度显著上升10％(P＝0.048；见图8)。相反，进食所述GMP饮食4天没有导致禁食状态获得的血浆与餐后状态获得的血浆的苯丙氨酸浓度产生显著变化。

酪氨酸是PKU饮食中的重要AA，因为其为必须且是肾上腺素、去甲肾上腺素、黑色素、甲状腺素的前体。进食所述GMP饮食或AA饮食的餐后或禁食样品的血浆酪氨酸浓度没有显著变化(表14)。进食所述GMP饮食和AA饮食的过夜禁食后的血浆酪氨酸浓度与餐后浓度相比有所下降；然而，所述GMP饮食导致平均禁食酪氨酸浓度低于正常范围。

附加AA。进食所述GMP与所述AA饮食相比血浆AA分布中最显著的变化是无毒LNAA异亮氨酸和苏氨酸的餐后浓度升至2.25-2.47倍，这使这些数值高于正常临床范围(见表14)。所述GMP饮食的血浆异亮氨酸和苏氨酸浓度的显著上升发生在进食所述GMP饮食的24小时内且与GMP中的这些AA的高浓度一致(见图9)。然而，异亮氨酸和苏氨酸的血浆浓度分别在第5和7天后不再显著增加。进食所述GMP与所述AA饮食相比，禁食过夜所得血浆的异亮氨酸浓度没有差异，而前者的血浆苏氨酸浓度维持在后者的约2倍。

与所述GMP和AA饮食复合物的AA分布相一致，GMP与AA饮食相比餐后血浆鸟氨酸和色氨酸浓度显著较低，而血浆异亮氨酸和苏氨酸浓度显著较高。过夜禁食后，所述GMP与所述AA饮食相比血浆精氨酸浓度显著较低而苏氨酸浓度显著较高(见表14)。

表14：氨基酸(AA)和糖巨肽(GMP)饮食对禁食和餐后(PP)血浆AA浓度的影响¹

¹数值为均值±SEM；n＝6，除了胱氨酸为n＝5。BCAA，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸之和。

²进食GMP饮食和AA饮食相比，PP血浆鸟氨酸(P＝0.019)和色氨酸(P＝0.003)浓度显著较低，但在正常范围内，而异亮氨酸(P＝0.003)和苏氨酸(P＝0.004)显著较高且高于正常范围。进食GMP饮食和AA饮食相比的禁食AA浓度唯一显著不同的是精氨酸下降(P＝0.008)和苏氨酸上升(P＝0.001)。

³重复测量ANOVA中时间有显著效应。对象配对的成对t检验的统计分析来自AA饮食的最后一天(第4天)和GMP饮食的最后一天(第8天)所采集的数据。

⁴通过先找到AA饮食和GMP饮食的各对象禁食和PP的AA浓度之间的差异，然后用对象配对的成对t检验比较该差异来计算对饮食的响应。

这是研究用来自GMP食物产品的完备蛋白替代当前PKU营养控制所需合成AA制剂的功效的首次临床试验。在此受控代谢饮食研究中，PKU对象进食GMP 4天作为其主要蛋白源，没有发现不良健康问题，血液化学物质维持正常(表13)。此外，所述GMP产品被对象所优选，这证实了PKU对象中GMP与AA产品味道盲测对比的结果(见实施例2)。因此，用GMP制作的食物和饮品用在PKU的苯丙氨酸受限饮食中安全且高度可接受。

4天后，进食GMP产品与AA制剂相比，血浆苯丙氨酸浓度没有显著变化(图7)。与合成AA源相比，GMP作为完备蛋白源可延缓AA吸收并改善苯丙氨酸和其他AA用于蛋白合成。本研究中，所述AA饮食的禁食苯丙氨酸浓度显著高于餐后苯丙氨酸浓度(图8)，而GMP饮食的禁食和餐后苯丙氨酸浓度没有表现出显著差异(表14)。这表明所述GMP饮食在24小时内诱发的变化较少且可能降低血浆苯丙氨酸平均浓度。相一致的是，与游离AA源如AA制剂相比，当膳食蛋白源为完备蛋白如GMP时，与AA吸收速率较低相关联，蛋白存留增加而AA氧化降低。

相比含AA的早餐，食用含GMP的早餐后2.5小时测量的血清BUN较低和血浆胰岛素和总AA浓度较高也证明GMP饮食改善蛋白存留(表13，图6)。尿素响应血浆AA浓度而线性生成，且氮平衡的控制主要由尿素生成调节。BUN作为肝脏利用AA用于尿素生成的度量，预期在内脏AA释放较慢时维持较低水平。因此，用GMP代替合成AA用作主要蛋白源时，完备蛋白源下更慢、更平缓和持续的血浆AA浓度上升与更低的BUN浓度一起表明有更少的AA降解用于尿素生成，而其被保留用于蛋白合成。

已知吸收后AA包括异亮氨酸和苏氨酸(Calbet等，J Nutr 2002；132：2174-82)能刺激胰岛素释放并随后刺激蛋白合成和抑制蛋白降解(Schmid等，Pancreas1992；7：698-704)。由于GMP诱发的氨基酸释放更慢时间更长，所以胰岛素响应和网络蛋白合成的刺激可能增强。此外，乳清蛋白比其他乳蛋白组分或其他完备蛋白源能以更高程度增加胰岛素浓度(Nilsson等，Am J Clin Nutr 2004；80：1246-53)。因此，GMP降低AA代谢和尿素生成的能力可能表明作为胰岛素分泌促进剂的苏氨酸和异亮氨酸的餐后浓度增加和AA吸收减缓。

基于2002 DRI推荐，本研究的GMP补充有下述5种限制AA：组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。血浆组氨酸、亮氨酸和色氨酸浓度维持在正常范围内，这表明GMP饮食中这些AA的补充足够(表14)。相反，禁食状态测量时血浆酪氨酸浓度低于正常水平(表14)，这表明GMP可能需要补充额外酪氨酸。事实上，持续10周给进食GMP作为主要蛋白源的对象提供1000mg/d补充的额外酪氨酸使血浆酪氨酸浓度维持在正常范围内(见实施例3)。总之，我们的数据表明GMP必须补充精氨酸、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸以在PKU饮食中提供完备膳食蛋白源。

终生坚持PKU饮食非常困难，常导致遵守较差和高苯丙氨酸血症的神经心理后果。本研究通过使用由完整、低苯丙氨酸的蛋白GMP替代合成AA制作的可口的食品和饮品展示了PKU饮食的新的改善范例。当补充限制性必须AA时，用GMP替代合成AA作为主要蛋白来源用于PKU营养控制看起来是安全并可接受的。与由AA提供大部分氮的饮食相比，GMP作为完整蛋白能延缓AA吸收并改善蛋白存留和苯丙氨酸利用。

实施例5：增加GMP纯度和将质量衡算用于GMP基食品的氨基酸补充

本实施例描述提高制作GMP基食品所用GMP的纯度的方法。此外，本实施例描述了使用质量衡算来确定GMP基食品的必需氨基酸补充程度。介绍

大于1岁个体的必需氨基酸每日推荐摄取量(DRI)已基于食品氮含量建立(见表15)。

表15：年龄≥1岁的儿童和所有其他年龄组的必需氨基酸每日推荐摄取量(DRI)。(改编自医药研究院2005，Dietary Reference Intakes for Energy，Carbohydrates，Fiber，Fat，Protein and Amino Acids(《能量、糖、纤维、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食参考摄取量》)，华盛顿特区：国家科学出版)。

^aPE＝N×6.25。

^b仅Tyr用于补充GMP。

常以基于总氮(N)乘以转化因子6.25所得蛋白当量(PE)报道氨基酸的DRI数值(医药研究院2005)。大多数蛋白含约16％的氮，从而转化因子6.25(100g蛋白/16g N＝6.25g蛋白/gN)是适当的(Nielsen SS 2003，Food Analysis(《食品分析》)，第3版.纽约：克鲁学术/普林诺出版社(Kluwer Academic/PlenumPublishers))。然而，氮对蛋白的转化因子在食品间不同。例如，大多数乳蛋白的氮对蛋白的转化因数为6.38(同上)。GMP为非均质肽，一些GMP分子被糖基化而其他没有。由于此，GMP分子的转化因数可为6.70-9.55，取决于其糖基化程度(Dziuba和Minkiewicz 1996，Int Dairy J 6(11-2)：1017-44)。某个GMP生厂商使用6.47的转化因子报道蛋白，而用7.07报道GMP说明了蛋白质量定义的模糊性(达维思科食品国际有限公司)。

氮对蛋白的确切转化因子未知时，食品的实际蛋白含量难以测量。蛋白可能含非蛋白氮或基本氨基酸，其氮含量高于其他氨基酸。为使GMP在饮食中提供推荐水平的必需氨基酸，必须用什么构成1g蛋白的明确定义了解进食食品的蛋白组分。在本实施例中，按照医药研究院(医药研究院2005)对用于建立大于1岁个体的必需氨基酸DRI的定义使用6.25的转化因子(见表15)。

从乳清中分离GMP的现行大规模技术使用离子交换色谱或超滤。GMP的等电点(pI)低于3.8，而其他主要乳清蛋白的pI值高于4.3。GMP和其他乳清蛋白的这种物理化学差异常用于分离方法以从乳清中分离GMP。市售可得的用离子交换色谱分离的GMP对PKU食物来说通常不够纯，因为其含过多来自残留乳清蛋白的Phe(即5mg Phe/g产物，生产商文献，达维思科食品国际有限公司，美国明尼苏达州勒苏尔)。传统氨基酸制剂不含Phe，这使患有PKU的个体能食用含Phe的天然食物以满足其每日裕度。为了使GMP成为替代PKU饮食中氨基酸制剂的可行蛋白，需要改善的过程以提高GMP纯度并降低Phe含量。

为了进行人临床试验测试GMP食品对PKU个体的安全性和可行性，开发小规模工艺以制备足以供15个对象进食4天的高度纯化GMP。利用食品级材料和批准用于食品的设施加工5kg纯化GMP，按顺序使用下述单元操作(1)阳离子交换色谱，(2)超滤和渗滤(UF/DF)，和(3)冻干。此外，开发质量衡算以为氨基酸补充提供明确定义的基础。纯化的补充GMP用于制备在所述人临床试验中进食的GMP食品。

材料和方法

本部分分为3个小部分：(1)用食品级材料加工纯化GMP所用的单元操作，(2)检测GMP回收和用于补充纯化GMP的氨基酸质量所用的质量衡算，和(3)在所述临床试验和1患者响应中进食的GMP食品的制备和分析。

GMP纯化过程

粗制GMP(BioPure GMP，达维思科食品国际有限公司)中的污染乳清蛋白通过吸附到阳离子交换树脂来捕获，并收集流通物组分中的GMP。用超滤/渗滤(UF/DF)浓缩所述GMP并洗去肽、盐和非蛋白氮。用冻干法干燥所述纯化的浓缩GMP。

阳离子交换色谱。直径20厘米的色谱柱(INdEX，新泽西州皮斯卡特维的GE医疗保健公司(GE Healthcare))用SP琼脂糖大珠(SP Sepharose Big Beads，GE医疗保健公司)填充。柱体积(CV)为5.34升，床程高为18厘米。

通过混合粗制GMP(BioPure GMP，达维思科食品国际有限公司)和10mMpH4的乳酸钠，并通过0.45-μm孔径滤器(Sartobran P，美国纽约州艾哲伍德的萨托瑞斯公司(Sartorius))过滤来制备进料溶液(75g/L)。平衡和洗脱缓冲液分别为食品级50mM pH4的乳酸钠和10mM pH 12的NaOH。平衡缓冲液和GMP进料溶液保持于4℃以抑制微生物生长。洗脱缓冲液保持于22℃。流速950mL/分。各阳离子交换循环由4步组成：(1)用2CV平衡缓冲液将所述柱调为pH 4，(2)将0.5CV进料溶液上样至所述柱，(3)用平衡缓冲液淋洗所述柱，弃去其中前0.3CV洗脱液(柱死体积)并收集接下来的2CV纯化GMP，和(4)用2.5CV洗脱液从柱中释放结合蛋白。5次运行各由9-11个连续循环组成。各运行中产生约100L洗脱GMP蛋白溶液。所述阳离子交换柱通过泵入0.2M NaOH保持1小时来清洗，然后将该柱保存于10mM NaOH中。

超滤和渗滤。将来自所述阳离子交换柱的GMP洗脱液通过添加1M NaOH调节为pH 7，并用中空纤维超滤膜(3kDa，3.3m²，UFP-3-C-55，GE医疗健康公司)在60℃浓缩。施加的压力为1.4巴。GMP溶液从100升浓缩为10升，然后加入20升蒸馏水并再将该溶液浓缩为10升。将所述浓缩液用0.45μm孔径滤器(萨托瑞斯公司)过滤到消毒容器中并4℃保存。所述UF膜在每次使用之前和之后用含100ppm NaOCl(漂白剂)的0.2M NaOH于50℃清洗。所述UF膜保存于10ppm NaOCl中。

冻干。浓缩、无菌过滤的GMP溶液在1.2或2升玻璃冻干瓶上冷冻为薄层并干燥48h(Lyphlock6，美国密苏里州堪萨斯城的莱布康可公司(Labconco))。回收GMP粉末、称重并部分用于分析。

组分分析。粗蛋白分析(CP)和完全氨基酸分布(AAP)在试验中心化学实验室(美国密苏里州哥伦比亚的密苏里大学哥伦比亚分校)进行。AOAC官方方法982.30用于APP，AOAC官方方法990.03用于CP([AOAC]国际官方分析化学协会，2005，Official methods of analysis of official analytical chemists(《官方分析化学家的官方分析方法》)，第18版，马里兰州盖瑟斯堡：AOAC)。结果报道为g/100g纯化GMP干重。用转化因子6.25乘以总氮表达PE基准的结果。对所有样品进行重复分析。

质量衡算

质量衡算用于描述(1)确定从加工过程中GMP收率所用的计算，(2)氨基酸补充所用的赖氨酸基础，和(3)确定补充氨基酸需要量所用的方法。

GMP收率。以PE基准计算回收。进料溶液中的PE克数(M_PE，feed)用GMP进料浓度(75g/L)乘以PE克数/克粉末(CP分析所得)然后乘以加工的进料溶液总体积来确定。PE回收总克数(M_PE，收回)用纯化GMP粉末的质量乘以PE克数/克纯化GMP(CP分析所得)获得。GMP收率(％)等于M_PE，收回/M_PE，进料×100。

氨基酸补充的赖氨酸基准。纯化GMP需要氨基酸补充以满足DRI和临床试验设定的营养目标。选择赖氨酸(Lys)作为质量平衡补充计算的基准，因为其与目标数值最接近(见表16，C列与D列比较)。PKU仅需要补充5种必需氨基酸：His、Leu、Met、Trp和Tyr。不补充非必需和条件必须氨基酸。

游离氨基酸的吸收和降解比完整蛋白提供的氨基酸更快。因此，临床试验的目标氨基酸组分设为高于DRI水平。His、Leu、Met和Trp的目标设为DRI水平的130％。Tyr以DRI水平的150％补充，这是因为氨基酸制剂通常富含高水平的Tyr。在涉及满足DRI的GMP补充的表和图中，Phe和Thr列在一起，Met和Cys也是，这是因为Tyr和Cys分别为能从Phe和Met合成的条件必需氨基酸。然而，在PKU患者中，Tyr不能从Phe合成。

表16：补充氨基酸(AA)计算方法。

^A分析获得的组分。数值为均值±SD。样本数为n＝2。

F和H列中的相同字母表示没有显著的统计学差异(P＞0.05)。

氨基酸补充计算。补充的难题在于添加到纯化GMP中的氨基酸通过同时改变分子(mg氨基酸)和分母(g PE)而改变了氨基酸目标(mg氨基酸/g PE)。将描述两种用于所述补充物计算的方法：一种涉及分母的变化，另一种不涉及。两种方法都有分子的变化。用于计算氨基酸补充的步骤示于上表16。AAP的实验结果用于获得各氨基酸的毫克/克纯化GMP(A列)。CP的实验结果(B列)除列A以获得PE基准的GMP氨基酸组分(C列)。需要转化至PE基准(C列)以比较所述纯化GMP氨基酸组分与所述临床试验目标数值(D列)。各临床试验目标数值减去纯化GMP的氨基酸数值产生各补充氨基酸的所需质量(E列)。通过将需要的氨基酸数值(E列)添加到纯化GMP氨基酸数值中(C列)，计算补充GMP的组分(F列)。本方法用于所述补充物计算忽略了添加氨基酸对氨基酸组分分母(mg/g PE)的影响。

为考虑分母的变化，必须考虑由于补充产生的PE克数/克纯化GMP的增加(表16，G和H列)。为此，1g纯化GMP中需要的补充氨基酸对总氮的贡献由分子式确定并乘以6.25产生添加氨基酸对总PE克数的贡献。来自补充氨基酸的PE克数加PE克数/1g纯化GMP(B列)得到校正的PE克数/克纯化GMP(G列)。所述补充组分(F列)乘以B列并除以G列得到分母的变化(H列)。

校正的补充GMP组分与未校正的组分没有统计学显著差异(表16，H与F列比较)(P＞0.05)。因此，本研究补充纯化GMP所用的计算方法假定添加的氨基酸对分母的影响可以忽略。

GMP食品的制备和分析。GMP草莓布丁的配方见表17。纯化的GMP、补充的氨基酸和非乳奶精(SuperValu风味非乳奶精，美国明尼苏达州伊登普雷里的超值公司(SuperValu))为该GMP草莓布丁提供氨基酸。用来自纯化GMP、非乳奶精和附加氨基酸的氨基酸贡献使用前文表16所示方法计算PE基准的该布丁氨基酸组成。

表17：GMP草莓布丁配方

^a纯化GMP，补充氨基酸和非乳奶精对最终产物贡献氨基酸。

统计学分析。用单向方差分析法(ANOVA)进行统计学分析(Minitab统计分析软件，13.32版，美国宾夕法尼亚州州立学院)以比较考虑和不考虑分母的补充GMP的组成(表16)建立置信区间以进行GMP草莓布丁的计算组成与观察到的组成和DRI数值的对比。用95％置信度建立置信区间，α＜0.05时统计学上显著。

结果

本研究的目标是生产足量含低Phe的纯化GMP以在对象参加的8天临床实验期间为15名PKU对象提供GMP食品。纯化的GMP需要补充必需的限制性氨基酸以提供营养完全的蛋白源用在GMP食品中。测试GMP食品作为PKU饮食蛋白的可口来源的安全性和功效。以下部分讨论了如何实现这些目标，所述部分分为所述试验场工艺(pilot plant process)对纯化GMP的收率和Phe含量的影响，GMP草莓布丁中的氨基酸质量平衡和该GMP草莓布丁的氨基酸组成与DRI和氨基酸制剂的对比的影响，以及所述纯化的补充GMP食品对PKU对象的血浆氨基酸水平的影响。

纯化工艺对Phe含量和GMP收率的影响。表18包括各次运行中的Phe含量、收率和阳离子交换循环数。粗GMP中的Phe通过纯化工艺降低了47％，从4.7±0.5mg/g PE降至2.7±0.4mg/g PE。平均GMP收率为52±4％。GMP收率较低主要是由于部分GMP结合阳离子交换柱而未在流通物组分中回收。用于提高市售GMP纯度的纯化工艺产生稳定的可重复Phe浓度，并且5次运行生产的纯化GMP中Phe浓度之间没有统计学差异(P＞0.05)。

表18：纯化和市售GMP的Phe含量

^a分析获得的组成。数值为均值±SD。样本数为n＝2。

各运行中通过UF膜的GMP穿透率见表19。总体上，通过UF膜的GMP持留为96±2％。尽管GMP的分子重量为约7kDa，其在pH 4及以上时的表观分子重量为45kDa。将UF/DF步骤中GMP溶液的pH升至7以使通过3kDa膜的GMP穿透率最小化。这可能解释了UF步骤所见的高回收率。

表19：通过UF膜的GMP穿透率

氨基酸补充计算和GMP食品组成的比较。分析所述GMP草莓布丁并将组成与计算的氨基酸组成比较(表20)。纯化的GMP(表20，A列)用氨基酸补充(B列)，补充量用忽略了添加氨基酸造成的分母变化的质量平衡方法确定；所添加来自非乳奶精的氨基酸类似确定(C列)。A、B和C列之和为所述GMP布丁忽略分母变化的计算组成(D列)。

表20：GMP草莓布丁氨基酸(AA)组成的计算和分析

^A分析获得的组成。数值为均值±SD。样本数为n＝2。

^B计算时分母中不包括添加氨基酸(表2的方法，F列)。

^C计算时分母中包括添加氨基酸(表2的方法，H列)。

D、E和F列之间的相同字母表明均值之问没有检测到差异(P＞0.05)。

E和F列之间在α＜0.05时检测到Tyr+Phe有统计学显著差异，但α＜0.01时没有。

为了比对，计算所述GMP草莓布丁的氨基酸组成以包括分母的变化(表20，E列)。忽略对分母的贡献导致氨基酸的计算组成比观察值平均高估30％(表20，D与F列相比)。包括对分母的贡献后，除Tyr(P＜0.05)以外，校正的氨基酸计算组成与观察的组成没有统计学差异(P＞0.05)(表20，E与F列比较)。所述GMP草莓布丁中观察到的氨基酸组成(F列)达到或超出所有DRI目标数值(表15)。

将GMP草莓布丁的氨基酸组成与氨基酸制剂比较(见图10)。所述氨基酸制剂所含的His、Leu、Met+Cys、Tyr和Trp显著多于所述GMP草莓布丁(P＜0.05)。然而，氨基酸制剂和GMP草莓布丁的所有必需氨基酸都达到或超出DRI目标(P＞0.05，表15)。

讨论

纯化GMP的加工。GMP总收率较低(52±4％)归因于GMP和阳离子交换柱之间的相互作用并导致部分GMP与柱结合。GMP与柱的结合是由于GMP的非均质性。操作pH为4时，一些GMP分子所带负电荷比其他分子少并因此结合阳离子交换柱。在较高pH操作可通过增加GMP上的负电荷来将GMP与柱的结合最小化。这也导致残留乳清蛋白由于所带正电荷减少而和阳离子交换柱之间的静电吸引降低。提高操作pH超过4会影响纯度。生产临床试验使用的GMP中，纯度优先于回收率。

最终干燥步骤前，UF/DF去除低分子量的溶质并浓缩GMP。UF/DF不能去除污染的乳清蛋白如ALA和BLG，这是因为这些蛋白太大而不能穿透3kDa膜。另一方面，低分子量溶质如乳清肽足够小所以能通过UF/DF去除且可能含Phe。

冻干产生没有风味或气味的细白粉末，其能清澈地溶于水(数据未显示)。然而，这种干燥方法的缺点是加工时间长。所述方法的其他各步可在1天内完成，但冻干需要数天完成。尽管需要耗时，冻干仍是干燥本研究所用纯化GMP的最实用选择。不用喷雾干燥是因为可能的GMP损失以及该方法在干燥少量产品时的局限。在大规模生产中，喷雾干燥可以是首选方法。

已加工GMP的氨基酸补充。用于GMP补充物的计算方法忽略了分母中来自添加氨基酸的PE克数，但其易于执行且所得GMP草莓布丁达到或超过所有必需氨基酸的DRI目标(表20)。对GMP本身，忽略添加氨基酸对分母的改变没有导致GMP组成的统计学显著差异(表16，F与H列比较)。

忽略添加非乳奶精和补充氨基酸对分母的改变导致氨基酸比观察值高估30％且9种氨基酸中6种在统计学上显著低于观察值(表20，D与F列比较)。另一方面，当分母内考虑添加氨基酸对PE的贡献时，除Tyr(P＜0.05)以外，校正的计算值与观察值匹配(P＞0.05)(表20，E与F列比较)。然而，α＜0.01时Tyr与观察值没有统计学显著差异(P＞0.01)。Tyr值低于预期是由于Tyr补充物纯度较低。Tyr可发生光解且加工或储存期间可能已经发生，这会导致纯度低于预期。尽管所述GMP食品中的Tyr满足DRI，提高Tyr补充会提供较高的Tyr水平。

由于对氨基酸组成的影响可以忽略和容易执行，在仅计算GMP的补充物中简单化是合理的，但进行GMP食品的质量衡算时则不合理。GMP和补充的氨基酸占GMP布丁的15％(W/W)，而所述非乳奶精占该布丁的近40％(W/W)，且对最终组成有显著影响。

尽管氨基酸的营养需求不是静态问题，但本研究的质量衡算方法可通用于根据最近的科学研究来补充GMP食品以达到或超过人饮食的营养需求。

实施例6：本发明的GMP食品与AA基制剂可接受度比较

本实施例中，发明人进行感官研究以比较马萨诸塞州艾尔的凯布鲁克食品有限公司(Cambrooke Foods，LLC)制作的本发明药用食物)Bettermilk^TM和俄亥俄州哥伦布的雅培营养公司生产的PKU饮食的常规氨基酸制剂Phenex-2^TM的可接受度。Bettermilk含GMP和补充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸。两种制剂都补充有维生素和矿物质以提供营养完备的药用食物。结果表明在成人PKU和非PKU对象中GMP Bettermilk比AA基的Phenex-2显著更易接受。

在本研究中，27个非PKU成人和4个PKU成人品尝Bettermilk和Phenex-2。然后参与者将各产品的可接受度按1-8级打分。1-极度讨厌；2-非常讨厌；3-讨厌；4-有点讨厌；5-有点喜欢；6-喜欢；7-非常喜欢和8-极度喜欢。结果见图11。从所示数据中可见，参与者给所述GMP食品的打分在所有可接受度标准上(气味、味道、余味和总体)都比所述AA制剂高很多，且对PKU参与者的可接受度差异显著大于非PKU参与者。这为本发明GMP药用食品相对传统氨基酸制剂的优势提供了进一步证据。

实施例7：GMP食品与氨基酸相比对PKU个体中生长素释放肽水平的影响

由于GMP药用食物可能改善饱腹感，本研究的目的是用直观类比标度(VAS)评估和比较PKU个体进食GMP药用食物早餐和基于AA早餐的血浆生长素释放肽浓度。

使用上述实施例4中报道研究的额外数据，该研究证明在PKU对象中GMP食品的早餐与基于AA的早餐相比能改善饱腹感和影响血浆食欲刺激激素生长素释放肽浓度。实施例4中分析的11个PKU对象(8个成人和3个年龄11-14的男孩)作为其自身对照在住院代谢研究中进行2次4天的治疗：基于AA的饮食，然后用GMP食品替代所有AA制剂。早餐前和早餐后180分钟获取血浆生长素释放肽浓度。用直观类比标度在早餐前、早餐后立即和早餐150分钟后评估饱腹感。与基于AA的早餐相比，GMP餐后生长素释放肽浓度显著较低(p＝0.03)，而禁食生长素释放肽没有差异。更低的餐后生长素释放肽浓度与早餐后更高的饱食感有关，说明GMP比AA有更大的饱腹感。这些结果表明持续的生长素释放肽抑制，并说明进食含GMP的饮食比AA有更大的饱腹感。

材料和方法

血浆生长素释放肽测定

所有餐后血液样品于早餐开始后180分钟(结束后150分钟)获取。对后6个对象(对象6-11)，还在所述AA饮食最后2天(第3和4天)和所述GMP饮食最后2天(第7和8天)的早餐前获取禁食血液样品。用放射免疫试验(林可研究公司，密苏里州圣查尔斯)测量禁食(n＝6)和餐后(n＝11)样品的总血浆生长素释放肽；将各对象第3+4天(AA饮食)和第7+8天(GMP饮食)的等体积血浆合并，因为观察到这些天的血浆AA情况稳定。从分析中移除对象2的总生长素释放肽，因为该内插数值明显为统计异常值，其大大超出标准曲线的最高浓度。

进食动机VAS问答

各对象在早餐前、早餐后立即、和早餐结束后2小时完成3次4问题的进食动机VAS问答以评估食欲和饱腹感的主观测定。各问题由两端为相反内容的100mm线组成。要求对象用垂直标记表示出该线上何处最好的描述了其当时就以下问题的感觉：(1)进食欲望有多强烈？，(2)有多饿？，(3)有多饱？和(4)你觉得能吃掉多少食物？(预期食品消耗，PFC)。使用如下公式计算各问答在进食动机VAS问答中反应四个问题的食欲评分：食欲评分(mm)＝[进食欲望+饥饿+(100-饱食)+PFC]/4

统计分析

所有统计分析由用于Mac操作系统(Mac OS)X版本2.9的统计学程序R进行(维也纳经济与商业大学的统计计算R项目，奥地利维也纳)。用对象配对的双尾成对t检验进行主要分析。p＜0.05时检验视为显著；数值为均值±SEM。用对象配对的成对t检验在各饮食治疗内(如禁食AA与餐后AA)和饮食治疗之间(如禁食AA与禁食GMP)比较禁食和餐后血浆生长素释放肽值。所述AA饮食最后一天和所述GMP饮食最后一天的进食动机VAS问答在饮食内(如禁食AA与餐后AA)和饮食之间(如禁食AA与禁食GMP)作比较。次要分析用线性混合效应模型检测以下因素：BMI、饮食治疗、年龄、早餐主要营养素摄取、血浆phe和血浆数值(生长素释放肽、胰岛素和/或总AA)对每日VAS问答的答案和生长素释放肽血浆值的影响，就随机对象效应作对照。若无对象效应，使用固定效应线性模型。用反向淘汰找到最佳模型，消除不显著的变量。

结果

进食动机VAS分布

所述AA饮食(第4天)和所述GMP饮食(第8天)之间进食动机的VAS分布在任何时间都没有显著差异。然而正如预期，进食所述AA或GMP早餐前、之后立即和之后2小时的食欲分布显著改变(数据未显示)。蛋白摄取由混合效应统计模型鉴定为VAS问答的最常见显著变量。早餐的蛋白含量显示与早餐后立即的食欲评分显著负相关(p＝0.01)从而早餐蛋白摄取较多使食欲评分降低。早餐后立即的食欲评分的最终模型中，蛋白含量之外的其他显著因子包括BMI、年龄和饮食治疗与研究日间的相互作用。混合效应模型分析中，BMI在所有时间显著影响VAS的答案。更高的BMI与更大的饮食欲望、饥饿和食欲评分以及更低的饱腹感关联。

血浆生长素释放肽

过夜禁食后获得的血浆生长素释放肽浓度在所述AA和GMP饮食之间没有显著差异(见图12)且禁食血浆生长素释放肽浓度和各变量之间没有显著相关性。具体地，在此多种样品群体中没有发现禁食生长素释放肽和BMI之间有直接关联。两种饮食之间的禁食血浆总AA浓度也没有显著差异(数据未显示)。于所述AA早餐开始后180分钟获取的餐后血浆生长素释放肽浓度与所述AA早餐前的禁食生长素释放肽没有差异(图12)。相反，所述GMP早餐导致餐后血浆生长素释放肽浓度显著较低，这是预期的餐后响应。此外，所述GMP早餐后的餐后生长素释放肽显著低于所述AA早餐后的餐后生长素释放肽。餐后生长素释放肽和BMI之间没有显著关联。使用反向淘汰与线性混合效应模型，预测餐后生长素释放肽的唯一因子是饮食治疗，因为所述GMP早餐的餐后血浆生长素释放肽较低。餐后血浆生长素释放肽浓度是预测早餐后2小时饱食度的显著因子(见图13)。更高的饱食评分与更低的餐后生长素释放肽浓度、饮食治疗和生长素释放肽与饮食之间的相互作用显著相关。

讨论

饮食中缺失蛋白源可能导致全天饥饿感增加。味道和偏好的改善与用GMP制作各种美味食品的能力一同支持GMP能通过提供更容易全天分配的蛋白源来改善PKU的膳食控制的观点。此外，我们首次报道了进食来自GMP的完整蛋白与合成AA相比导致PKU患者餐后生长素释放肽持续抑制。

生长素释放肽是唯一已知的刺激食欲激素，在禁食状态和期望进食时浓度最高，而餐后浓度受到抑制。对比患PKU的3个儿童(年龄11-14)和8个成人(其作为自身对照)的AA和GMP早餐时，我们未发现禁食生长素释放肽浓度的差异。

所述数据为生长素释放肽对进食的响应提供了新的信息。我们证明含完整蛋白GMP的等热量早餐治疗与合成AA相比引起不同的生长素释放肽响应。在将来自蛋白或糖的20％或更多能量进行等热量替代的研究中，餐后生长素释放肽水平下降与卡路里含量成正比且蛋白和糖以相似程度抑制生长素释放肽。因此，GMP早餐中糖提供的高比例能量(7.8％)不太可能解释本研究观察到的不同生长素释放肽响应。

仅在禁食和早餐开始后180分钟这两个时间点测定生长素释放肽浓度，因此可能错过最低点。然而，观察到GMP早餐的这两个时间点间生长素释放肽浓度显著下降，但AA的没有，说明摄取AA早餐在早餐后180分钟时没有持续抑制生长素释放肽。事实上，AA饮食3小时后的生长素释放肽饥饿信号与禁食12小时后没有差异。完整蛋白较AA的餐后生长素释放肽抑制更高可能是由于合成AA与GMP的吸收速率不同。血浆中的AA在进食AA后1小时出现A，而在进食相当的完整蛋白后约2小时出现。已显示AA的快速吸收对大鼠和人中蛋白的存留和利用有负面影响。

尽管长期进食AA的最显著结果可能是蛋白存留减少，但血浆AA的急速增加仍影响饱腹感的生理信号。恒氨基酸理论提出血浆AA浓度的增加伴随着GI激素的更强刺激的加强和食欲降低，随后当血浆AA浓度下降时食欲恢复(S.M.Mellinkoff，M.Frankland，D.Boyle，M.Greipel，Relationship between serum aminoacid concentration and fluctuations in appetite(血清氨基酸浓度和食欲波动的关系)，1956，Obes.Res.5(1997)381-384)。因此，乳清蛋白如GMP可由于血浆AA的快速吸收和持久水平而减低食欲，而合成AA造成血浆AA的急速增加，这一AA增加与完整蛋白所造成的相比更快从血浆中消失且程度更高，导致食欲在餐后很快上升。含GMP的早餐比合成AA诱发更高的餐后总血浆AA和更低的生长素释放肽，支持这一假说。此外，我们的数据显示较低餐后生长素释放肽浓度和较高饱食感之间的关系，说明GMP饮食比AA能维持饱腹感。

生长素释放肽抑制受到胃后反馈的调节(D.L.Williams，D.E.Cummings，H.J.Grill，J.M.Kaplan，Meal-related ghrelin suppression requires postgastric feedback(饮食相关的生长素释放肽抑制需要胃后反馈)，(Endocrinology 144(2003)2765-2767)，需要肠道末端而不是胃或十二指肠中的管腔营养素。进食基于AA的制剂后血浆AA的快速上升表明管腔营养素存在时间较短，因此限制了其抑制生长素释放肽的能力。

此外，生长素释放肽和胰岛素以交互方式起作用(D.E.Cummings，J.Q.Purnell，R.S.Frayo，K.Schmidova，B.E.Wisse，D.S.Weigle，A preprandial rise in plasmaghrelin levels suggests a role in meal initiation in humans(餐前血浆生长素释放肽水平上升在人进食开始中的作用)，Diabetes 50(2001)1714-1719)。相似地，我们的结果显示含GMP的早餐较基于AA的早餐后的餐后血浆胰岛素浓度更高且生长素释放肽更低。因此，与常规氨基酸饮食相比，GMP食品可改善PKU个体的胰岛素和生长素释放肽调节、饱腹感信号传导和蛋白存留。

结论

PKU的营养控制需要除合成AA外的新膳食选择以促进全天进食低phe蛋白源从而改善代谢控制并控制饥饿。这些结果证实了进食中蛋白摄入对改善饱腹感的重要性，并为GMP早餐较AA早餐能长期抑制血浆饱腹感激素生长素释放肽水平提供了新证据。用完整的低phe蛋白GMP制作的食物产品是提供生理上更完整的饮食从而改善膳食选择并促进PKU的蛋白分布和代谢控制的第一步。

实施例8：推荐用于本发明的氨基酸补充

在本预示性实施例中，发明人介绍本发明推荐的氨基酸补充量。具体地，发明人提供了先前操作实施例中所用的补充量的推荐变化。

甲硫氨酸。发明人不推荐在本发明的药用食物中添加甲硫氨酸。近期已确定学龄儿童和成人的甲硫氨酸和胱氨酸的最低需求显著低于先前认定(Turner，等，AmJ Clin Nutr 2006；83：619-23；Ball，等.，J Nutr 2006；136(增刊2)：1682S-93S)。这表明GMP含足量的甲硫氨酸，不需要甲硫氨酸补充。由于甲硫氨酸为味道不好的含硫氨基酸，基于GMP的食品中不补充甲硫氨酸还会提高该食品的可口度。

精氨酸。与前述实施例不同，发明人推荐在本发明的药用食物中的GMP中补充额外精氨酸。具体地，发明人提出在本发明的药用食物中添加精氨酸使该食品中精氨酸与蛋白的总重量比优选为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，更优选约75毫克精氨酸/克总蛋白。

尽管本领域认为精氨酸是营养性非必须氨基酸(Tharakan等.，Clin Nutr2008；27：513-22)，但精氨酸具有多种非营养功能，包括作为合成蛋白、尿素和一氧化氮的底物(PAH的辅因子四氢生物蝶呤也是一氧化氮合成的辅因子)。精氨酸在肾中由源自谷氨酸的肠瓜氨酸合成，并在尿素循环中氧化为鸟氨酸。与GMP中的最低精氨酸一致，实施例4的临床试验中报道的进食所述GMP的血浆精氨酸和鸟氨酸浓度显著低于所述AA饮食(见表14)。因此，发明人的结论是GMP需要补充精氨酸以用于PKU饮食。

亮氨酸。发明人建议本发明的药用食物补充的亮氨酸量要显著超过任何已发表的推荐摄取需求或超过任何前述操作实施例中所用的量。具体地，发明人提出在本发明的药用食物中添加亮氨酸使该食品中亮氨酸与蛋白的总重量比优选为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白，更优选约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

发明人已确定血浆亮氨酸水平上升可甲状腺抑制Phe利用某种载体蛋白通过肠粘膜和血脑屏障的转运。因此，超出营养需求水平的亮氨酸补充可惊人的降低血浆和脑中的Phe水平，脑是Phe行使其神经毒性效应的主要器官。然后，推荐较高亮氨酸水平可导致使用本发明GMP基食品的PKU个体的血浆和脑中Phe水平降低。

此外，近期有证据证明亮氨酸通过提高mRNA翻译起始率来刺激骨骼肌蛋白合成(Norton LE等，J Nutr 2009；139：1103-1109和Crozier，SJ等，J Nutr 2005；135：376-382)。PKU患者中骨骼肌蛋白合成的改善会降低血液phe水平并可增加瘦体重(lean body mass)。

酪氨酸。治疗酪氨酸代谢疾病如酪氨酸血症的药用食物中不添加补充量的酪氨酸。对于其他应用，包括PKU饮食，发明人推荐本发明的药用食物补充的酪氨酸量略多于任何上述操作实施例中的量。具体地，发明人提出在本发明的非热处理药用食物中添加酪氨酸使该食品中酪氨酸与蛋白的起始总重量比优选为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，更优选约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

酪氨酸是PKU饮食中的重要氨基酸，因为其为必需且为肾上腺素、去甲肾上腺素、黑色素和甲状腺素的前体。在上述实施例4中，发明人发现进食所述GMP或AA饮食的餐后或禁食样品中获得的血浆酪氨酸浓度没有显著差异(见上表14)。进食所述GMP和所述AA饮食的过夜禁食后血浆酪氨酸浓度都比餐后浓度低。然而，所述GMP饮食导致平均禁食酪氨酸浓度低于正常范围。因此，发明人推荐酪氨酸补充高于实施例4所测的食品DRI补充水平的150％。

此外，在上述实施例5中，发明人发现当考虑分母内添加氨基酸对PE的贡献时，除Tyr(P＜0.05)外，所有测定氨基酸的校正计算值都匹配观察值(P＞0.05)(见上表20，E与F列比较)。Tyr数值低于预期说明Tyr在加工或储存过程中有所降解。尽管所述GMP食品中的Tyr满足DRI(其补充为DRI的150％)，提高Tyr补充会提供更高水平的Tyr。

色氨酸。治疗色氨酸代谢疾病如高色氨酸血症的药用食物中不添加补充量的色氨酸。对于其他应用，包括PKU饮食，发明人提出在本发明的药用食物中任选添加色氨酸使该食品中色氨酸与蛋白的总重量比优选为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，更优选约12毫克色氨酸/克总蛋白。

在实施例4中，发明人观察到所述GMP的餐后血浆trp水平比AA饮食减少29％。所述GMP饮食中的trp水平远低于AA制剂中的trp范围(约15mg trp/g蛋白)。也有证据证明trp在神经递质、血清素合成中很重要(Passcuchi等，Intl JNeuropsychopharmacology(2009)，12：1067-79)。因此，推荐水平显著高于用WHO出版的推荐最低摄取指南(世界卫生组织，Protein and Amino Acid Requirements inHuman Nutrition(《人体营养中蛋白和氨基酸的需求》)，瑞士日内瓦：联合国大学，2007)的130-160％建立的范围或基于2002 DRI(药物研究院，《能量、碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食参考摄取》)，华盛顿特区：国家科学出版，2002)的130％的推荐量。

组氨酸。治疗组氨酸代谢疾病如组氨酸血症的药用食物中不添加补充量的组氨酸。对于其他应用，包括PKU饮食，发明人提出在本发明的药用食物中任选添加组氨酸使该食品中组氨酸与蛋白的总重量比优选为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白，更优选约23毫克组氨酸/克总蛋白。优选范围基于WHO出版的推荐最低摄取指南(世界卫生组织，《人体营养中蛋白和氨基酸的需求》，瑞士日内瓦：联合国大学，2007)的130-160％。更优选的数值基于2002 DRI(《药物研究院，能量、碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食参考摄取》)，华盛顿特区：国家科学出版，2002)的130％。不同于其他氨基酸的推荐，这些组氨酸推荐值与所述操作实施例中使用的GMP药用食物中所含的没有不同。

基于本实施例所示的氨基酸补充量，可生产改善的GMP基药用食物以提供PKU个体所需的蛋白，并起到使血浆和脑组织中Phe水平最小化的功能。

本领域技术人员应了解或能仅采用常规实验来确定本文所述的具体材料和方法的许多等同形式。应认为该等同形式在本发明的范围内且被下述权利要求包括。

Claims (47)

1.一种用于控制代谢疾病的药用食物，所述药用食物包含糖巨肽(GMP)和补充量的两种或更多氨基酸，其中一种补充氨基酸为精氨酸且所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，且其中另一种补充氨基酸为亮氨酸且所述药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白。

2.如权利要求1所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物还包含补充量的氨基酸酪氨酸，且其中所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白。

3.如权利要求2所述的药用食物，其特征在于，所述附加补充氨基酸的总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约22％-38％。

4.如权利要求2所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物还包括补充量的氨基酸色氨酸和组氨酸，其中所述附加补充氨基酸的总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约25％-42％。

5.如权利要求1-4中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比为约75毫克精氨酸/克总蛋白。

6.如权利要求1-5中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比为约100毫克亮氨酸/克总蛋白。

7.如权利要求2-4中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比为约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

8.如权利要求1所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物不含补充量的氨基酸酪氨酸。

9.如权利要求8所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物含有的苯丙氨酸与酪氨酸之和低于2.0毫克/克总蛋白。

10.如权利要求8或9所述的药用食物，其特征在于，所述附加补充氨基酸的总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约16％-29％。

11.如权利要求8-10中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物还包括补充量的氨基酸色氨酸和组氨酸，其中所述附加补充氨基酸的总重量为来自GMP中蛋白和补充氨基酸一起的总重量的约19％-33％。

12.如权利要求1-11中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物为饮品、棒、薄饼、布丁、凝胶体、脆饼干、果泥干、果仁奶油、酱、沙拉酱、脆谷片、薄片、泡夫、丸或挤压固体的形式。

13.如权利要求1-12中任一项所述的药用食物，其特征在于：

(a)所述药用食物在生产期间经热处理；

(b)热处理前的药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的起始重量比大于约75毫克精氨酸/克总蛋白，且热处理前的药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的起始重量比大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白；和

(c)热处理后的药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，且热处理后的药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白。

14.如权利要求2-4或7中任一项所述的药用食物，其特征在于：

(a)所述药用食物在生产期间经热处理；

(b)热处理前的药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的起始重量比大于约85毫克酪氨酸/克总蛋白，热处理前的药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的起始重量比大于约75毫克精氨酸/克总蛋白，且热处理前的药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的起始重量比大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白；和

(c)热处理后的药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的最终重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，热处理后的药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，且热处理后的药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白。

15.如权利要求14所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物还包括补充量的氨基酸色氨酸和组氨酸，且其中：

(a)热处理前的药用食物中氨基酸色氨酸与总蛋白的起始重量比大于约12毫克色氨酸/克总蛋白，且热处理前的药用食物中氨基酸组氨酸与总蛋白的起始重量比大于约23毫克组氨酸/克总蛋白；和

(b)热处理后的药用食物中氨基酸色氨酸与总蛋白的最终重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，且热处理后的药用食物中氨基酸组氨酸与总蛋白的最终重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白。

16.如权利要求1-15中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述食物不含补充量的氨基酸甲硫氨酸。

17.如权利要求1-16中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述GMP经纯化使该GMP含不多于2.0毫克苯丙氨酸污染物/克GMP蛋白。

18.如权利要求1-17中任一项所述的药用食物，其特征在于，所述药用食物含低于1.5毫克的苯丙氨酸/克总蛋白。

19.一种制备控制代谢疾病的药用食物的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供糖巨肽(GMP)和补充量的两种或更多氨基酸，其中一种补充氨基酸为精氨酸且所提供的氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，且其中第二种补充氨基酸为亮氨酸且所提供的氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白；和

(b)将所提供的材料与一种或多种非蛋白成分混合以制作食品。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，还提供补充量的第三种氨基酸酪氨酸，所提供的氨基酸酪氨酸与所提供的总蛋白的重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白。

21.如权利要求19或20中所述的方法，其特征在于，所提供的氨基酸精氨酸与所提供的总蛋白的重量比为约75毫克精氨酸/克总蛋白。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所提供的氨基酸酪氨酸与所提供的总蛋白的重量比为约85毫克酪氨酸/克总蛋白。

23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其特征在于，所提供的氨基酸亮氨酸与所提供的总蛋白的重量比为约100毫克赖氨酸/克总蛋白。

24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括纯化所述GMP使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克GMP蛋白的步骤。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，纯化所述GMP使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克GMP蛋白的步骤进一步包括使用下组的一种或多种方法：阳离子交换色谱、超滤和渗滤。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用冻干或喷雾干燥法干燥所述纯化GMP的步骤。

27.如权利要求19-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述食品成形为布丁、凝胶体或果泥干的步骤。

28.如权利要求19-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述食品形成棒、脆饼干、薄片、泡芙或丸的步骤。

29.如权利要求19-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述食品挤压成挤压固体的步骤。

30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，其中不提供酪氨酸。

31.如权利要求19-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括热处理所述食品的步骤。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述热处理所述食品的步骤包括烘培所述食品。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于：

(a)热处理前的所提供的氨基酸精氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约75毫克精氨酸/克总蛋白，且热处理前的氨基酸亮氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白；和

(b)热处理后食品中氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，和热处理后食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白。

34.如权利要求20或22中所述的方法，其特征在于，所述方法还包括热处理所述食品的步骤。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述热处理所述食品的步骤包括烘培所述食品。

36.如权利要求34所述的方法，其特征在于：

(a)热处理前氨基酸亮氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约100毫克亮氨酸/克总蛋白，热处理前所提供的氨基酸酪氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约85毫克酪氨酸/克总蛋白，且热处理前所提供的氨基酸精氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约75毫克精氨酸/克总蛋白；和

(b)热处理后的食品中氨基酸亮氨酸与总蛋白的最终重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白，热处理后的食品中氨基酸酪氨酸与总蛋白的最终重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白，且热处理后的食品中氨基酸精氨酸与总蛋白的最终重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白。

37.如权利要求33或36所述的方法，其特征在于：

(a)还提供补充量的氨基酸色氨酸和组氨酸，使热处理前所提供的氨基酸色氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约12毫克色氨酸/克总蛋白，和热处理前所提供的氨基酸组氨酸与所提供的总蛋白的起始重量比大于约23毫克组氨酸/克总蛋白；和

(b)热处理后的食品中氨基酸色氨酸与总蛋白的最终重量比为约12-14毫克色氨酸/克总蛋白，和热处理后的食品中氨基酸组氨酸与总蛋白的重量比为约20-24毫克组氨酸/克总蛋白。

38.一种治疗代谢疾病的方法，所述方法包括将药用食物给予患代谢疾病的人，所述药用食物含糖巨肽(GMP)、补充量的氨基酸精氨酸和补充量的氨基酸亮氨酸，其中所述药用食物中氨基酸精氨酸与总蛋白的重量比为约60-90毫克精氨酸/克总蛋白，其中所述药用食物中氨基酸亮氨酸与总蛋白的重量比为约100-200毫克亮氨酸/克总蛋白，且其中所述代谢疾病选自苯丙氨酸代谢疾病、酪氨酸代谢疾病、色氨酸代谢疾病和组氨酸代谢疾病。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述药用食物还包括补充量的氨基酸酪氨酸，从而所述药用食物中氨基酸酪氨酸与总蛋白的重量比为约62-93毫克酪氨酸/克总蛋白。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述药用食物不含补充量的氨基酸酪氨酸。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述药用食物含有的苯丙氨酸与酪氨酸之和少于2.0毫克/克总蛋白。

42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述药用食物不含补充量的氨基酸苯丙氨酸，且其中所述代谢疾病为苯丙氨酸代谢疾病苯丙酮尿症(PKU)。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述药用食物含低于1.5毫克的苯丙氨酸/克总蛋白。

44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其特征在于给予所述药用食物的所述人至少2岁。

45.如权利要求40所述的方法，其特征在于所述代谢疾病选自下组：酪氨酸代谢疾病I型酪氨酸血症、II型酪氨酸血症、III型酪氨酸血症/霍金素尿症和尿黑酸尿症/黄褐病。

46.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述药用食物不含补充量的氨基酸色氨酸，且其中所述代谢疾病为色氨酸代谢疾病高色氨酸血症。

47.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述药用食物不含补充量的氨基酸组氨酸，且其中所述代谢疾病选自下组：组氨酸代谢疾病肌肽血症、组氨酸血症和尿刊酸尿症。

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