KR20180029963A - 아미노산 보충제 - Google Patents

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리차드 휴 던스탄
티모씨 킬고우어 로버츠
다이앤 리사 스파크스
벤자민 제임스 다스콤
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뉴캐슬 이노베이션 리미티드
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Abstract

운동, 병 또는 부상으로부터의 회복, 운동 중 수행, 극한 기후 조건에서의 생존을 돕고 피로를 감소시키기 위한 아미노산을 포함하는 조성물 및 이러한 조성물의 용도가 본원에 제공된다. 본 발명은 땀에서 손실된 아미노산을 보충하기 위해 제공될 수 있는 아미노산 보충물에 관한 것이다.

Description

아미노산 보충제
본 발명은 일반적으로 운동, 병 또는 부상(injury)으로부터의 회복, 운동 중 수행, 및 극한 기후 조건에서의 생존을 돕는, 아미노산을 포함하는 조성물 및 땀에서 손실된 아미노산을 보충하기 위한 보충물과 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
아미노산은 체내 구조 및 기능 단백질의 생합성을 위해 사용되는 필수적인 대사물이다. 특정 역할에 따라, 다양한 기능 단백질은 운동, 음식 섭취, 병원성 공격 및 조직 손상 복구에 기인한 생리적 요구에 대한 대사 조절 및 적응을 제공하기 위해 지속적인 턴오버(turnover)를 겪는다. 아미노산은 또한 "유리" 대사물로서 광범위한 필수적인 역할을 하며, 상기 대사물의 일부는 억제성 신경 전달 물질(예를 들면, 글리신)로서 직접적으로 작용하거나 호르몬(티로신으로부터 에피네프린 및 노르에피네프린) 및 신경 전달 물질(글루탐산으로부터 감마-아미노부티르산)의 합성을 위한 전구체로서 작용할 수 있다.
포유동물에 의한 음식 섭취 후, 단백질은 소화되고, 생성된 유리 아미노산 및 작은 펩타이드는 체내 이용을 위해 흡수된다. 운동 동안, 혈액 공급은 능동 근육에 산소를 제공하기 위해 소화관으로부터 우회되어 음식의 소화가 유지될 수 없다. 따라서, 신체는 운동 중일 때, 운동 동안 및 운동 직후 비-원섬유 근육 저장 단백질을 이화하여 자유롭게 순환하는 아미노산의 감소를 보상한다. 이것은 혈액 내에서 순환할 수 있고, 에너지 생산을 위한 산화적 인산화 또는 글루코스-알라닌 사이클을 포함하는 대사 경로에서 사용될 수 있는 아미노산을 제공한다.
쉽게 산화 가능한 에너지 공급원으로서의 유리 아미노산의 유용성 및 조직 이화작용의 지표로서 특정 아미노산 잔기의 관련성으로 인해, 혈장 아미노산 수준의 측정은 운동에 대응한 운동 선수의 근육 상태, 단백질 턴오버 및 에너지 대사에 대한 통찰력의 잠재적으로 가치있는 길을 나타낸다. 건강한 휴식기(resting) 성인에서, 혈장 아미노산 수준은 체내에서의 조직 흡수 및 배출에 비해, 조직에서의 영양 섭취와 방출 사이에 엄격히 조절된 항상성을 반영한다. 운동의 개시는 근육의 대사 요건을 유지하는데 필요한 휴식기 항상성의 교란을 나타낸다. 운동 전 프로파일에 비해 운동 후 혈장 프로파일의 변화를 초래하는 요구를 지지하기 위해 근육 조직 흡수 및 특정 아미노산 방출 속도의 변화가 발생한다.
운동 중단시 조직에서 혈장으로 방출되는 유리 아미노산은 이론적으로 재흡수 또는 배출 및 항상성의 회복에 이용될 수 있다. 아미노산 및 전해질은 피부 표면을 땀과 물로 습윤시켜 피부의 외부 각질층으로부터 침출될 수 있다. 이러한 침출은 땀 유체 내 아미노산 농도의 순 증가로 이어진다. 소변 및 땀에서 배출된 아미노산 수준은 아미노산의 순 손실을 나타내며, 이는 궁극적으로 식이 섭취를 통해 보충되어야 한다.
본 발명은 피부 표면으로부터의 기여와 최종 땀에서 우세한 아미노산의 조합에 관한 발명자의 발견에 입각하여, 아미노산의 땀-촉진된 손실을 보상하기 위한 아미노산의 특정 조합을 포함하는 조성물 및 제형을 결정하게 된다. 또한, 아미노산의 땀-촉진된 손실에 대한 특정 프로파일 또는 표현형(phenotype)의 확인에 의해 개개의 요구에 따라 보충제를 조정할 수 있는 이점을 갖는 아미노산 보충에 대한 프로파일 또는 표현형-지시된 접근법을 구상하고 실행할 수 있게 된다.
본 발명은 상기한 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
제1 양태에서, 히스티딘, 세린 및 라이신을 포함하는 아미노산 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 히스티딘, 세린 및 라이신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 25%를 구성한다.
일 구현예에서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%를 구성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 30% 내지 50%를 구성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 32% 내지 47%를 구성할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 히스티딘은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 10% 내지 21%, 세린은 약 13% 내지 16%, 라이신은 약 9% 내지 10%를 구성할 수 있다.
제1 양태의 아미노산 조성물은 추가로 오르니틴 및 글리신 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 오르니틴은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 12%를 구성할 수 있고/있거나 글리신은 적어도 약 8%를 구성할 수 있다. 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신을 포함할 수 있으며, 여기서 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 40%, 또는 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 50% 내지 약 80%를 구성한다.
제1 양태의 아미노산 조성물은 추가로 글루타민, 글루탐산, 류신 및 아스파르트산 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 글루타민 및/또는 글루탐산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 10%, 류신은 적어도 약 10%, 및/또는 아스파르트산은 적어도 약 7%를 구성할 수 있다. 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산을 포함할 수 있으며, 여기서 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 35%, 또는 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 40% 내지 약 60%를 구성한다.
예시적인 구현예에서, 아미노산 조성물은 세린, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 라이신, 아스파르트산, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌, 및 티로신을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 말에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
제2 양태에서, 히스티딘, 세린, 오르니틴, 라이신 및 글리신을 포함하는 아미노산 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 히스티딘, 세린, 오르니틴, 라이신 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%를 구성한다.
예시적인 구현예에서, 히스티딘, 세린, 오르니틴, 라이신 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 60%, 적어도 약 64% 또는 적어도 약 76%를 구성할 수 있다.
제3 양태에서, 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘 및 프롤린을 포함하는 아미노산 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘 및 프롤린은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 20%를 구성한다.
일 구현예에서, 제3 양태의 아미노산 조성물은 암컷 대상체에 대한 투여를 위해 제형화된다.
전형적으로, 본원에 개시된 아미노산 조성물은 식이 보충물로서 사용된다. 특정 구현예에서, 조성물은 대상체에서 운동, 병 또는 부상으로부터의 회복을 촉진하거나 돕거나, 피로를 감소시키거나, 고온 기후에서 대상체의 생존을 돕거나, 운동 수행을 촉진하거나 돕는다.
본원에 개시된 아미노산 조성물은 명시된 아미노산을 포함하거나, 명시된 아미노산으로 구성되거나, 명시된 아미노산으로 본질적으로 구성될 수 있다.
제4 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 운동, 병 또는 부상으로부터의 회복을 촉진하거나 돕는 방법이 본원에 제공된다.
제5 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 고온 기후에서 대상체의 생존을 돕는 방법이 본원에 제공된다.
제6 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 운동 수행을 촉진하거나 돕는 방법이 본원에 제공된다.
제7 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 혈액에서 헤모글로빈 및/또는 적혈구용적률(haematocrit) 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
제8 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 노인에게 영양 지원을 제공하는 방법이 본원에 제공된다.
제9 양태에서, 대상체에게 제1 양태 또는 제2 양태의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 피로를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 대상체는 만성 피로를 앓고 있을 수 있다. 대상체는 만성 피로 증후군을 앓고 있을 수 있다. 대상체가 암컷인 구현예에서, 투여될 아미노산 조성물은, 예를 들면, 적어도 아스파르트산, 아스파라긴, 오르니틴 및 메티오닌을 포함할 수 있다. 대상체가 수컷인 구현예에서, 투여될 아미노산 조성물은, 예를 들면, 적어도 세린, 알라닌, 글리신, 아스파르트산, 발린, 프롤린, 티로신, 아스파라긴 및 메티오닌을 포함할 수 있다.
제4 양태 내지 제9 양태 중 어느 하나의 방법에서, 대상체는 인간일 수 있으며, 투여될 조성물의 유효량은 1일당 약 50 mg 내지 10 g일 수 있다.
제4 양태 내지 제9 양태 중 어느 하나의 방법에서, 대상체는 말일 수 있으며, 투여될 조성물의 유효량은 1일당 약 5 g 내지 50 g일 수 있다.
제10 양태에서, 대상체에게 투여될 식이 보충물을 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은
a) 대상체가 땀을 흘리기에 충분한 운동을 하는 단계;
b) 상기 땀에서 아미노산 조성을 결정하는 단계;
c) 상기 땀의 총 아미노산 농도에 기초하여 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 약 4,000 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 '낮은' 프로파일을 나타내고, 약 4,000 μmol L-1 내지 10,000 μmol L-1은 '중간' 프로파일을 나타내며, 약 10,000 μmol L-1 초과는 '높은' 프로파일을 나타내며;
아미노산의 낮은, 중간 또는 높은 땀-촉진된 손실 프로파일로 대상체를 분류하여 투여될 보충물의 양(또는 투여량), 및 선택적으로 투여될 상기 보충물의 양 또는 투여량을 결정한다.
예시적인 구현예에서, 땀은 단계 c)에서 아미노산 농도의 결정을 위해 대상체의 등으로부터 수집된다.
예시적인 구현예에서, 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 추가로 땀에서 개별 아미노산 농도를 결정하는 것을 포함하며, 여기서: (i) 땀에서 아미노산의 약 50%를 구성하는 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘이 '낮은' 프로파일을 나타내며, 세린이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (ii) 땀에서 아미노산의 약 70%를 구성하는 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신이 '중간' 프로파일을 나타내며, 오르니틴이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (iii) 땀에서 아미노산의 약 60%를 구성하는 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신이 '높은' 프로파일을 나타내며, 히스티딘이 땀의 주요 아미노산 성분이다.
제11 양태에서, 대상체에게 투여될 식이 보충제를 위한 요건을 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은
a) 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; 및
b) 상기 혈장에서 총 아미노산 조성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 약 2,800 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 보충제의 필요를 지시하는 아미노산의 '낮은' 작동 수준을 나타낸다.
제10 양태 및 제11 양태에 따르면, 아미노산의 '낮은' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것일 수 있으며, 여기서 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 60%를 구성한다.
아미노산의 '중간' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것일 수 있으며, 여기서 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 64%를 구성한다.
아미노산의 '높은' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것일 수 있으며, 여기서 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 76%를 구성한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 구현예는 하기 도면을 참조하여 단지 비-제한적인 예로서 본원에 기재된다.
도 1. 조합 코호트(n=19)로부터의 땀에서 아미노산의 농도에 대한 로그-변환된 아미노산 농도 데이터의 주성분 분석(principle component analysis; PCA). 각각의 운동 선수는 땀에서 측정된 아미노산의 낮은(L), 중간(I) 및 높은(H) 총 수준으로 정의된 3가지 클러스터 중 하나의 멤버쉽(membership)으로 코딩되었다. 각각의 운동 선수는 이들의 대응하는 아미노산 프로파일에 따라 플롯 상에 배치된다. 각각의 SFLAA 그룹의 운동 선수는 색으로 코딩되었고, 각각의 그룹의 구성원은 함께 클러스터되어 있다는 것이 분명하다. 이것은 이들의 아미노산 조성 특성이 이들의 SFLAA에 의해 정의된 그룹 내에서 유사하다는 증거를 제공한다.
도 2. 낮은, 중간 및 높은 SFLAA 클러스터로부터의 땀에서 아미노산의 상대 퍼센트 존재비의 혈장 아미노산의 상응하는 조성과의 비교. 각각의 아미노산에 대해: 앞쪽 막대 = 혈장; 두 번째 막대 = 땀 '낮은' SFLAA; 세 번째 막대 = 땀 '중간' SFLAA; 네 번째(뒤쪽) 막대 = '높은' SFLAA. 혈장 수준은 모든 그룹으로부터의 대상체간에 변화가 없었으며, 알라닌, 글루타민, 발린 및 프롤린이 주요 구성 성분으로 존재하였다. 신체 표면으로부터 수집된 땀의 조성은 땀 조성의 차별적인 패턴을 보여주며, 세린은 "낮은" SFLAA 클러스터에 대한 주요 성분이고, 오르니틴은 "중간" SFLAA 클러스터에 대한 주요 성분이고, 히스티딘은 "높은" SFLAA 클러스터에 대한 주요 성분이다.
도 3. 운동 후 땀에서의 총 아미노산 농도를, 대상체가 샤워하고 18 내지 24에서 밤새 휴식한 후 12시간 뒤 피부 표면의 세척물로부터 수득된 아미노산 수준과 비교하였다. 그 다음 대상체는 샤워하고, 건조시키고, 아미노산이 피부 표면의 습윤에 의해 각질층에서 침출될 수 있음을 입증하기 위해 갓 건조 피부 표면을 세척하여 세 번째 샘플을 수득하였다. 3개의 샘플 수집물이 데이터를 생성하기 위해 각각의 수집 사이에 1주의 간격을 두고 사용되었다. 이러한 결과는 아미노산이 피부의 천연 보습 인자의 중요한 부분으로 존재하며, 물의 단순한 첨가에 의해 표면으로부터 침출될 수 있다는 개념을 지지한다.
도 4. (a) 운동 후 땀(앞쪽 막대)에서의 아미노산의 퍼센트 상대 존재비를 (b) 운동 후 샤워에 이어서 12시간 휴식 후 채취된 샘플에서 관찰된 수준(두 번째 막대) 및 (c) 샤워하고 건조한 직후(세 번째 또는 뒤쪽 막대)와 비교. 값은 1명의 남성 참여자로부터 3번의 개별적인 샘플링 사건으로부터의 평균이다. 운동 후 채취된 땀에 의한 아미노산 조성의 유사성은 표면을 세정하고 건조한 직후 피부로부터의 표면 세척물에 의한 조성 프로파일을 반영한다. 유사성은 땀에 의한 피부 습윤에 의한 아미노산 손실의 주요 원인으로 침출 과정을 뒷받침하는 강력한 증거이다. 조합하여, 침출액 및 땀에서 배출된 양은 운동 중에 상당한 잠재적인 손실을 가져온다.
도 5. (a) 47명의 건강한 대상체 및 만성 피로를 앓고 있는 7명의 대상체로부터의 땀에서 측정된 아미노산의 상대 존재비로부터 플롯팅된 주성분 분석(PCA). 각각의 사례는 그룹 내의 편차(variance)를 최소화하고 그룹 간의 차이를 최대화하기 위해 대상체를 그룹으로 분할하는 K-평균 클러스터링에 의해 정의된 4개의 클러스터 중 하나의 구성원으로 코딩되었다. PCA 분석 결과는 플롯에서 각각의 그룹 내에서 멤버를 명확하게 구분함으로써 K-평균 클러스터링 접근법을 입증하였다. 만성 피로를 겪은 대상체는 그룹 1 또는 그룹 3의 멤버로서 나타났다. (b) 아미노산이 클러스터 구분에 기여함을 나타내는 요인(factor) 1 및 요인 2에 대한 PCA 로딩.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 전체 개시 동안 내내 지칭된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 공보, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판된 자료는, 달리 언급되지 않는 한, 그 전체가 참조로 포함되어 있다. 용어에 대한 정의가 여럿인 경우, 이 섹션의 정의가 우선한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 전형적인 방법 및 물질이 기재되어 있다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상이 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)임을 지칭하는데 본원에 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "약"은, 당업자가 동일한 기능 또는 결과를 달성한다는 맥락에서 열거된 값과 동등한 것으로 간주할 수의 범위를 지칭하는 것으로 이해된다.
본 명세서 및 하기 청구항 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는, 비제한적으로, 인간, 수행 동물(예를 들면, 순종 및 다른 경주마), 가축 및 다른 농장 동물(예를 들면, 소, 염소, 양, 말, 돼지 및 닭), 반려 동물(예를 들면, 고양이 및 개) 및 실험실 시험 동물을 포함하는 임의의 포유동물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 하나 이상의 유익한 또는 바람직한 결과를 초래하기에 충분한 조성물 또는 보충물의 양을 지칭한다. "유효량"은 1회 이상의 투여에 제공될 수 있다. 요구되는 정확한 양은 이용된 개별 프로바이오틱 균주의 동질성(identity) 및 수, 치료되는 대상체, 치료될 대상체가 앓고 있는 질병(들) 또는 질환(들)의 특성 및 대상체의 연령 및 일반적인 건강, 및 조성물이 투여되는 형태와 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 임의의 주어진 경우에, 적합한 "유효량"은 통상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "운동"은 땀을 흘리기에 충분한 운동을 포함하여 개체에 의한 임의의 신체적 운동을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "운동"은 훈련 또는 스포츠 시도(endeavour), 활동 또는 이벤트에서의 공식 참가를 통한 임의의 스포츠 활동을 포함한다. 용어 "운동" 및 "스포츠(sport)" 또는 "스포츠(sports)"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
운동으로부터의 회복에 관하여 본원에 사용된 용어 "회복"은 보충이 없을 때와 비교하여 본 발명에 따른 아미노산 보충 후 개선된 회복 시간을 포함할 수 있다. 생리적(예를 들면, 혈중 산소 수준, 심박수, 헤모글로빈 수준, 적혈구용적률 수준), 행동 및 관찰 파라미터를 포함하는 다양한 파라미터가 회복 시간을 결정하고 평가하기 위해 당분야에 공지되어 있다.
운동 또는 스포츠에 관하여 본원에 사용된 용어 "수행"은 예를 들면 강도, 속도 및/또는 지구력을 포함하는, 수행되는 운동 또는 스포츠에 적합한 임의의 수행 파라미터를 지칭한다. 향상된 수행은 또한 근육 피로를 극복하는 능력, 장기간 동안 활동을 유지하는 능력, 훈련 또는 운동 활동의 개선된 효율, 또는 근육량의 유지 또는 발달로 나타날 수 있다.
본원에 사용된 용어 "고온 기후"는 적어도 연중 일부 동안 열이 개체에게 불편함을 유발하기에 충분하고, 대상체가 땀을 흘려 아미노산의 땀 촉진된 손실이 발생하는 임의의 기후를 의미한다. 예로서, 기후는 24, 30℃, 35, 40 또는 45를 초과하는 온도를 경험할 수 있다.
개체는 운동 중, 고온 조건 또는 기후에서, 또는 다른 신체 활동 기간에 땀을 통해 상당량의 아미노산이 손실될 가능성이 있다. 대상체가 운동할 때, 아미노산은 운동을 유지하기 위해 대사에 이용되므로 순환 혈장에서 제거된다. 피부가 땀으로 젖을 때, 유체는, 피부 표면에서 수집된 땀 유체에서 측정된 주요 성분의 프로파일과 유사한 아미노산 조성을 갖는 천연 보습 인자를 생산하는 외부 각질층으로부터 아미노산을 추가로 침출시킬 수 있다(도 4 참조). 이를 보충하기 위해, 통상적으로 비-원섬유 근육 저장소로부터 아미노산이 인출될 것이다. 그러나, 대상체가 고강도 운동 또는 훈련, 또는 과도한 훈련을 받는다면, 이는 비-원섬유(non-myofibrillar) 단백질 저장고의 고갈을 초래할 수 있으며, 이때 신체는 선택의 여지 없이 근육 손상, 통증 및 말초 피로를 초래하는 구조 요소 액틴과 미오신의 단백질분해를 수반하는 원섬유 이화작용으로 전환될 수 있다(Niblett et al., 2007; Macintosh and Rassier, 2002). 따라서, 회복 동안 근육 단백질 저장고에 대한 잠재적인 수요를 최소화하도록 아미노산을 순환계(circulation)에 직접 전달할 목적으로 운동 동안 또는 운동 직후 섭취를 위한, 소화가 필요 없는 아미노산 보충물이 본원에 기재된다. 이러한 전략은 회복의 중요한 기간으로서 운동이 종료된 후에도 계속되는 근육 조직의 이화 반응에 미치는 영향을 최소화하도록 고안되었다.
유사하게, 소화 기능 장애를 동반한 만성 병 또는 만성 피로가 지속되는 환자는 땀과 소변을 통해 아미노산이 손실되어 아미노산에 대한 신체의 요구를 충족시키기 위해 지속적인 이화 과정이 야기될 수 있다. 고온 기후에서 사는 개체는 또한, 비교적 낮은 수준의 운동 또는 활동(그래도 다량의 지속적인 발한을 유도함) 중의 아미노산의 주기적인 고갈로부터 쉽게 역효과를 경험할 수 있다.
본원에 기재된 인간 및 말 연구에서, 혈장 내 대응하는 수준과 비교한 아미노산의 땀 촉진된 손실 프로파일은 땀이 단지 혈장 아미노산 조성을 반영하지 않았음을 암시했다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 데이터는, 예를 들면, 피부 표면으로부터의 아미노산의 침출에 의해 땀에서 특정 아미노산의 농축을 촉진하기 위한 기전이 있음을 시사한다. 본원에 예시된 바와 같이, 땀의 주요 손실 성분으로 확인된 아미노산을 갖는 아미노산 보충물의 제공은 혈장 아미노산 농도를, 작업 동안 혈장 아미노산의 최대 로딩을 나타낼 수 있는 수준으로 상승시킬 수 있다. 또한, 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은, 아미노산의 혈장 농도를 증가시키는 것이 근육 저장고에 대한 수요를 감소시키면서 운동 및 회복을 유지하기 위해 보다 많은 기질을 이용할 수 있게 한다는 것을 제안한다. 본원에 예시된 바와 같이, 본 개시에 따른 아미노산 보충제는 헤모글로빈 및 적혈구용적률 수준을 상승시키는 것으로 나타났다.
본원에 기재되고 예시된 아미노산의 땀-촉진된 손실 '표현형' 또는 프로파일을 결정하는 능력은 고강도 운동, 만성적인 나쁜 건강(chronic ill health) 상황, 만성 피로 또는 고온 조건에의 노출 하에서 아미노산 유지를 필요로 하는 이들의 확인에 적용되며, 신체적으로 요구되는 운동, 훈련 조건 및 극한 기후 조건 하에서 가장 효과적으로 생존하는데 가장 적합한 이들을 결정하는 데 도움을 줄 수 있다.
본원에 기재되고 예시된 아미노산의 땀-촉진된 손실 '표현형' 또는 프로파일을 결정하는 능력은 성별을 기초로 특별히 고안된 아미노산 보충물 제형의 개발을 용이하게 한다. 따라서, 남성 인간 대상체에 의한 소비를 위해 특별히 고안된 아미노산 조성물이 본원에 제공된다. 특히, 남성 인간 대상체를 위해 제형화된 아미노산 보충제는 α-아미노-아디프산, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 하이드록시라이신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌 및 세린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 남성 아그룹의 경우, 아미노산 보충물은 주요 아미노산 구성 요소로서, 예를 들면, 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신을 포함할 수 있다. 남성의 또 다른 아그룹의 경우, 보충물은 주요 아미노산 구성 요소로서, 예를 들면, 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 남성용 보충물은, 특히, 글루타민 및/또는 글루타민, 프롤린, 세린, 글리신, 알라닌, 히스티딘, 오르니틴 및/또는 라이신을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 여성 인간 대상체에 의한 소비를 위해 특별히 고안된 아미노산 조성물이 본원에 제공된다. 특히, 여성 인간 대상체에 의한 소비를 위해 특별히 고안된 아미노산 조성물은 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘, 아스파르트산, 트레오닌, 글루타민 및/또는 글루탐산, 발린 프롤린, 티로신 및 아스파라긴으로 이루어진 그룹 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 여성용 보충물은, 예를 들면, 오르니틴, 메티오닌, 시스테인, 메티오닌을 추가로 포함할 수 있다. 특정 보충물은 주요 아미노산 구성 요소로서, 예를 들면, 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘, 프롤린, 아스파르트산; 아스파라긴, 오르니틴 및 메티오닌; 시스테인 및 메티오닌을 포함할 수 있다.
또한, 만성 피로, 예를 들면, 만성 피로 증후군을 갖는 개체를 위해 특별히 고안된 아미노산 보충물 제형이 본원에 제공된다. 여성 만성 피로 대상체를 위한 이러한 보충물은 조성물 내 주요 아미노산으로서 아스파르트산, 아스파라긴, 오르니틴 및/또는 메티오닌을 포함할 수 있다. 남성 만성 피로 대상체를 위한 보충물은 주요 아미노산 구성 요소로서 세린, 알라닌, 글리신, 아스파르트산, 발린, 프롤린, 티로신, 아스파라긴, 및/또는 메티오닌을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 다양한 환경, 직업 및 산업에서 개체의 평가 또는 분석, 및 개체를 위한 보충물의 제공, 운동 또는 다른 형태의 신체적 활동으로부터 회복의 촉진 또는 보조 및/또는 상기 운동 또는 신체 활동에서 수행의 개선에 적용된다. 본 개시에 따르면, 조성물은 운동 또는 다른 신체적 활동 전, 동안 또는 후에 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 개체는, 예를 들면, 운동 선수(프로, 세미-프로(semi-professional) 또는 아마추어), 개인 트레이너 또는 피트니스 또는 체중 감량 프로그램을 받는 이들, 군인, 경찰 및 기타 보안 직원, 소방관, 건설 근로자, 광업 및 관련 산업체, 농업 종사자 및 축산업자일 수 있다. 당업자는, 이것이 단지 적합한 개체의 예시적인 목록이며 본 발명은 이에 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한, 예를 들면, 만성 피로 증후군, 면역 결핍, 트라우마 또는 다른 손상을 겪는 이들, 및 소화 기능 장애를 갖는 이들과 같이 만성적인 나쁜 건강을 경험한 이들의 평가 또는 분석, 및 이들을 위한 보충물의 제공에 적용된다. 본 개시에 따르면, 조성물은 병, 트라우마, 부상 또는 소화 장애로 고통 받기 전, 고통 받는 동안 또는 고통 받은 후에 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자는 소화 효율이 연령에 따라 감소한다는 것을 인식할 것이다. 그러므로 본원에 기재된 방법 및 조성물의 추가 적용은 노인에게 영양 지원을 제공하는데 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 비-인간 대상체의 평가 또는 분석, 및 비-인간 대상체를 위한 보충물의 제공에 적용된다. 예시적인 비-인간 동물은 말(예를 들면, 순종 및 스탠더드브레드(standardbred) 경주마, 작업말(working horse)), 개(예를 들면, 그레이하운드(greyhound)를 포함하는 경주용 개, 및 작업견(working dog)), 및 고온 기후에서 살고/살거나 작업하는 다른 동물을 포함한다.
당업자는, 본원에 개시된 조성물 및 보충물 내 각각의 아미노산의 비율이, 예를 들면, 특정 개체 또는 동물, 또는 개체 또는 동물 그룹(예를 들면, 운동 선수, 경주마 등의 그룹)의 땀에서 이들 아미노산에 대해 관찰된 상대적 손실을 반영하도록 조정될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시는 특정 개체 또는 동물 또는 개체 또는 동물 그룹의 요구에 따른 조성물 및 보충물의 조정을 고려한다. 땀에서 아미노산 손실의 결정은 본원에 기재되고 예시되며, 따라서 조성물 및 보충물을 위한 특정 제형의 결정은 당업자의 능력 내에 있으며, 과도한 실험 부담을 필요로 하지 않는다.
당업자(skilled addressee)는 또한, 본원에 개시된 조성물 및 보충물이 본원에 기재된 아미노산을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있음을 이해할 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 히스티딘, 세린 및 라이신을 포함하는 아미노산 조성물을 제공하며, 여기서 히스티딘, 세린 및 라이신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 25%를 구성한다. 특정 대상체에 대한 요건에 따라, 예를 들면, 대상체에서 아미노산의 땀-촉진된 손실의 분석에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%를 구성할 수 있다. 특정 대상체에 대한 요건에 따라, 예를 들면, 대상체에서 아미노산의 땀-촉진된 손실의 분석에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총량의 약 30% 내지 50%, 예를 들면, 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 또는 50%를 구성할 수 있다.
히스티딘은 조성물 내 아미노산의 총량의 약 10% 내지 21%, 예를 들면 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 또는 21%를 구성할 수 있다. 세린은 조성물 내 아미노산의 총량의 약 13% 내지 16%, 예를 들면 약 13%, 14%, 15% 또는 16%. 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 9% 내지 10%.
조성물은 추가로 오르니틴, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 류신 및 아스파르트산 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 오르니틴은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 12%를 구성할 수 있고/있거나 글리신은 적어도 약 8%를 구성할 수 있고/있거나 글루타민 및/또는 글루탐산은 적어도 약 10%, 류신은 적어도 약 10%, 및/또는 아스파르트산은 적어도 약 7%를 구성할 수 있다. 예시적인 구현예에서 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%를 구성한다. 또 다른 예시적인 구현예에서 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산을 포함하며, 여기서 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%를 구성한다.
추가의 양태에서 본 발명의 아미노산 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신을 포함하며, 여기서 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%를 구성한다. 특정 대상체에 대한 요건에 따라, 예를 들면, 대상체에서 아미노산의 땀-촉진된 손실의 분석에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75% 또는 76%를 구성할 수 있다.
명시된 아미노산 이외에, 본 발명의 조성물은 또한 임의의 하나 이상의 다른 아미노산을 포함할 수 있으며, 당업자는 본 개시의 범위가 임의의 특정 추가 아미노산의 포함에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 말 투여에 적합한 예시적인 일 구현예에서, 본 개시의 조성물은, 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 60%를 나타내는, 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산을 포함할 수 있으며, 추가로 아미노산의 총 중량의 나머지 40%를 구성하는 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌, 및 티로신을 포함한다.
본 발명의 조성물은 추가로, 다른 적합한 영양 성분(예를 들면, 미네랄, 비타민, 코엔자임, 지방산, 탄수화물, 단백질 또는 펩타이드)뿐만 아니라 회복 또는 수행 측면에서 부수적인 이익을 가동시키기 위한 추가의 성분, 예를 들면 산소 대사를 개선시키는 성분, 항산화제, 직접 또는 간접적으로 라디칼 소거제(radical scavenger)와 관련되거나 심장 기능을 개선시키는 인자를 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분의 양은 소비에 안전한 것으로 간주되고 관련 규제 당국의 허용되는 지침에 의해 승인된 임의의 양일 수 있다. 당업자는 원하는 결과를 달성하기 위해 이러한 양을 조정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 임의의 적합한 첨가제, 담체, 추가의 치료제, 생체이용률 개선제, 부작용 억제 성분, 희석제, 버퍼, 향미제, 결합제, 보존제 또는 조성물의 효능에 해롭지 않은 다른 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 및 영양 및 기능 식품(nutraceutical) 산업에서 잘 알려진 공지된 기술 및 공정을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있으며, 경구 투여를 위해 적절하게 제형화될 수 있다. 적합한 경구 투여형은 액체, 과립, 분말, 겔, 페이스트, 가용성 샤쉐(sachet), 경구 가용성 형태, 캡슐, 당의정(caplet), 로젠지, 정제, 발포정, 저작성 정제, 예를 들면, 시간-의존적 및/또는 pH-의존적 방출을 갖는 다층 정제, 등을 포함할 수 있다.
경구 투여에 적합한 조성물은, 예를 들면, 분말, 과립, 겔, 수성 액체 또는 비 수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서 조성물의 각각의 성분의 소정량을 각각 함유하는 별개의 단위로 제공될 수 있다. 조성물은, 하기에 예시된 바와 같이, 다양한 음료, 사료 보충 제품, 기능 식품, 영양 보충물, 식품 첨가제, 약제 및 처방전 없이 구입할 수 있는(over-the-counter) 제형에 편리하게 혼입될 수 있다. 그러나 당업자는 조성물이 당업계에 공지된 임의의 적합한 형태로 제형화되고 사용자에게 제공될 수 있음을 이해할 것이다.
조성물은 다양한 음료 제품에 편리하게 혼입될 수 있다. 적합한 유형의 음료의 구체적인 예는 물, 탄산 음료, 스포츠 음료, 영양 음료, 과일 주스, 야채 주스, 우유, 및 물-기반, 우유-기반, 요거트-기반, 다른 유제품-기반, 우유-대용물 기반(예를 들면, 두유 또는 오트 밀크(oat milk)) 또는 주스-기반 음료인 다른 제품을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 조성물은 분말, 과립 또는 다른 고체 형태로 제공되어 사용자에 의해 음료에 첨가되거나 음료에 미리 혼합될 수 있거나, 농축된 액체, 겔 또는 페이스트 형태로 제공되어 적합한 음료에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 적합한 음료와 미리 혼합된, 액체 형태로 사용자에게 제공될 수 있다. 예시적인 일 구현예에서 조성물은, 음료의 정확한 특성 및 용량에 따라, 약 20 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1500 mg 또는 2000 mg 이상의 용량으로 물-기반 음료(예를 들면, 스포츠 음료)에 포함될 수 있다.
조성물은 또한 다양한 식료품, 기능 식품, 또는 식품 첨가제에 편리하게 포함될 수 있다.　식료품 또는 식품 첨가제는 분말과 같은 고체 형태 또는 액체 형태일 수 있다. 적합한 식료품은 제과 제품, 예를 들면, 크래커, 빵, 머핀, 롤, 베이글, 비스킷, 시리얼, 바, 예를 들면, 뮤즐리 바, 건강 식품 바 등, 드레싱, 소스, 커스터드, 요거트, 푸딩, 미리 포장된 냉동 음식, 수프 및 과자류를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 단순히 추가의 음료 또는 식료품 없이 분말, 과립, 겔, 페이스트, 고체 투여형 또는 농축된 액체 형태로서 소비될 수 있다. 캡슐 및 정제와 같이 다른 고체 투여형이 또한 고려된다. 예를 들면, 대상체가 말과 같은 동물인 경우, 아미노산은 적절한 비율로 미리 혼합되고, 크산탄 검과 같은 결합제와 적합한 비로 액체(예를 들면, 물)와 함께 조합되어 경구 시린지를 통한 투여를 위한 페이스트 전달 시스템을 형성하는 것을 도울 수 있다. 당업자는 대상체의 동질성 및 내성에 따라 다수의 기타 경구 전달 시스템이 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
조성물이 캡슐로 제형화되는 경우, 조성물의 성분은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 전분, 락토스, 미세결정성 셀룰로스 및/또는 이산화규소와 함께 제형화될 수 있다.　추가 성분은 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 칼슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 캡슐은 선택적으로, 예를 들면, 필름 코팅물 또는 장용 코팅물로 코팅될 수 있고/있거나 그 안의 조성물의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
정제는 압축 또는 성형에 의해, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 제조될 수 있다.　압축 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유-유동 형태의 조성물의 성분을 적합한 기계에서 압축하여 제조될 수 있으며, 선택적으로 결합제, 윤활제(예를 들면 마그네슘 스테아레이트 또는 칼슘 스테아레이트), 불활성 희석제 또는 표면 활성제/분산제와 혼합될 수 있다.　성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말화된 조성물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조될 수 있다.　정제는 선택적으로, 예를 들면, 필름 코팅물 또는 장용 코팅물로 코팅될 수 있고/있거나 그 안의 조성물의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
당업자는 본원에 개시된 조성물의 단일 또는 다중 투여가 대상체의 필요성 및 치료될 대상체의 상태에 따라 요구되는 바와 같이 결정되는 용량 수준 및 투여 요법(regime)에 따라 수행될 수 있음을 이해할 것이다.　당업자는 적합한 투여 요법을 쉽게 결정할 수 있다.　광범위한 용량이 적용 가능할 수 있다.　투여 요법은 최적의 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.　당업자는, 투여의 정확한 양 및 속도가 조성물이 투여되는 형태를 포함하는 투여되는 특정 조성물, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이 요건, 뿐만 아니라 조성물과 함께 사용되거나 조성물과 동시에 사용되는 임의의 약물 또는 제제와 같은 다수의 인자에 의존적일 것임을 이해할 것이다. 예를 들면, 몇몇 분할 용량은 매시간, 매일, 매주, 매달 또는 기타 적절한 시간 간격으로 투여될 수 있거나, 용량은 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소될 수 있다.　본원의 교시에 기초하여, 당업자는, 일상적인 시험 및 실험에 의해, 사례별로 적합한 투여 요법을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 본 개시의 조성물은 원하는 건강 결과를 달성하기 위해 건강 보충물, 식품 보충물, 식품 첨가제, 및/또는 치료제로서 효과적인 임의의 적합한 용량으로 투여될 수 있다.
대상체가 인간인 일부 구현예에서, 유효량은 약 50 mg 내지 15 g, 약 100 mg 내지 15 g, 약 200 mg 내지 15 g, 약 400 mg 내지 15 g, 약 600 mg 내지 15 g, 약 800 mg 내지 15 g, 약 1000 mg 내지 15 g, 약 2 g 내지 15 g, 약 3 g 내지 15 g, 약 4 g 내지 15 g, 약 5 g 내지 15 g, 약 6 g 내지 15 g, 약 7 g 내지 15g, 약 8 g 내지 15 g, 약 9 g 내지 15 g, 약 10 g 내지 15 g, 약 11 g 내지 15 g, 약 12 g 내지 15 g, 약 13 g 내지 15 g, 또는 약 14 g 내지 15 g의 범위일 수 있다. 유효량은 약 50 mg 내지 14 g, 약 50 mg 내지 13 g, 약 50 mg 내지 12 g, 약 50 mg 내지 11 g, 약 50 mg 내지 10 g, 약 50 mg 내지 9 g, 약 50 mg 내지 8 g, 약 50 mg 내지 7 g, 약 50 mg 내지 6 g, 약 50 mg 내지 5 g, 약 50 mg 내지 4 g, 약 50 mg 내지 3 g, 약 50 mg 내지 2 g, 약 50 mg 내지 1000 mg, 약 50 mg 내지 800 mg, 약 50 mg 내지 600 mg, 약 50 mg 내지 400 mg, 약 50 mg 내지 200 mg, 또는 약 50 mg 내지 100 mg의 범위일 수 있다. 이러한 용량은 매일 또는 필요에 따라 투여될 수 있다. 일정 투여량의 조성물은, 대상체의 필요성 및 조성물이 투여되는 형태에 따라, 예를 들면, 1일 약 50 mg, 1일 약 100 mg, 1일 약 200 mg, 1일 약 400 mg, 1일 약 600 mg, 1일 약 800 mg, 1일 약 1000 mg, 1일 약 1200 mg, 1일 약 1400 mg, 1일 약 1600 mg, 1일 약 1800 mg, 1일 약 2 g, 1일 약 2.2 g, 1일 약 2.4 g, 1일 약 2.6 g, 1일 약 2.8 g, 1일 약 3 g, 1일 약 3.2 g, 1일 약 3.4 g, 1일 약 3.6 g, 1일 약 3.8 g, 1일 약 4 g, 1일 약 4.2 g, 1일 약 4.4 g, 1일 약 4.6 g, 1일 약 4.8 g, 1일 약 5 g 최대 1일 약 6 g, 1일 약 7 g, 1일 약 8 g, 1일 약 9 g, 1일 약 10 g, 1일 약 11 g, 1일 약 12 g, 1일 약 13 g, 1일 약 14 g 또는 1일 약 15 g으로 경시적으로 투여될 수 있다. 소아 투여량은 성인 투여량의 15% 내지 90%의 범위일 수 있다.
대상체가 말인 일부 구현예에서, 유효량은 약 1 g 내지 50 g, 약 5 g 내지 50 g, 약 10 g 내지 50 g, 약 15 g 내지 50 g, 약 20 g 내지 50 g, 약 25 g 내지 50 g, 약 30 g 내지 50 g, 약 35 g 내지 50 g, 약 40 g 내지 50 g, 또는 약 45 g 내지 50 g의 범위일 수 있다. 유효량은 약 1 g 내지 45 g, 약 1 g 내지 40 g, 약 1 g 내지 35 g, 약 1 g 내지 30 g, 약 1 g 내지 25 g, 약 1 g 내지 20 g, 약 1 g 내지 15 g, 약 1 g 내지 10 g, or 약 1 g 내지 5 g의 범위일 수 있다. 일정 투여량의 조성물은, 말 대상체의 필요성에 따라, 예를 들면, 1일 약 1 g, 1일 약 2 g, 1일 약 4 g, 1일 약 6 g, 1일 약 8 g, 1일 약 10 g, 1일 약 12 g, 1일 약 14 g, 1일 약 16 g, 1일 약 18 g, 1일 약 20 g, 1일 약 22 g, 1일 약 24 g, 1일 약 26 g, 1일 약 28 g, 1일 약 30 g, 1일 약 32 g, 1일 약 34 g, 1일 약 36 g, 1일 약 38 g, 1일 약 40 g, 1일 약 42 g, 1일 약 44 g, 1일 약 46 g, 1일 약 48 g 또는 1일 약 50 g으로 경시적으로 투여될 수 있다.
대상체의 아미노산 수준이 정상 또는 허용되는 수준이거나 정상 또는 허용되는 수준으로 회복된 경우에, 본 개시는 대상체의 아미노산 수준을 정상 또는 허용되는 수준으로 유지하거나 유지하는 것을 돕도록 설계된 용량으로 본원에 개시된 조성물을 투여하는 것을 고려한다. 이러한 유지 용량은 아미노산을 정상 또는 허용되는 수준으로 회복시키거나 대상체의 회복을 돕는데 필요한 용량보다 더 낮을 수 있지만, 그럼에도 여전히 전형적으로 본원에 예시된 용량의 범위 내에 속할 것이다. 예를 들면, 대상체가 인간인 경우, 본 개시의 조성물은 허용되는 또는 정상 아미노산 수준을 유지하기 위해 1일 약 50 mg, 1일 약 100 mg, 1일 약 150 mg, 1일 약 200 mg, 1일 약 250 mg, 1일 약 300 mg, 1일 약 350 mg, 1일 약 400 mg, 1일 약 450 mg, 1일 약 500 mg, 1일 약 550 mg, 1일 약 600 mg, 1일 약 650 mg, 1일 약 700 mg, 1일 약 750 mg, 1일 약 800 mg, 1일 약 850 mg, 1일 약 900 mg, 1일 약 950 mg, 1일 약 1000 mg, 1일 약 2 g, 최대 1일 약 10 g의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 대상체가 말인 경우, 본 개시의 조성물은 허용되는 또는 정상 아미노산 수준을 유지하기 위해 1일 약 1 g, 1일 2 g, 1일 3 g, 1일 4 g, 1일 5 g, 1일 6 g, 1일 7 g, 1일 8 g, 1일 9 g, 1일 10 g, 1일 11 g, 1일 12 g, 1일 13 g, 1일 14 g, 1일 15 g, 최대 1일 약 30 g의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 유지 용량은 또한, 예를 들면, 운동, 훈련 또는 경기 시간 또는 일정을 벗어난 인간 운동 선수 또는 말에게 적합할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에게 투여될 조성물에 가장 적합한 아미노산 조성, 및 가장 적합한 투여 수준을 결정하는 방법을 제공한다. 전형적으로 이러한 결정은 임의의 소정의 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실의 분석 및/또는 대상체로부터 수득된 혈장 샘플 내 총 아미노산 농도를 기초로 한다. 예를 들면, 일 구현예에서 본원에 예시된 바와 같이, 본 발명은 대상체에게 투여될 식이 보충물을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 대상체가 땀을 흘리기에 충분한 운동을 하는 단계;
b) 상기 땀에서 아미노산 조성을 결정하는 단계;
c) 상기 땀의 총 아미노산 농도에 기초하여 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 약 4,000 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 '낮은' 프로파일을 나타내고, 약 4,000 μmol L-1 내지 10,000 μmol L-1은 '중간' 프로파일을 나타내며, 약 10,000 μmol L-1 초과는 '높은' 프로파일을 나타내며;
아미노산의 낮은, 중간 또는 높은 땀-촉진된 손실 프로파일로 대상체를 분류하여 투여될 보충물의 양(또는 투여량), 및 선택적으로 투여될 상기 보충물의 양 또는 투여량을 결정한다.
대상체를 아미노산의 낮은, 중간 또는 높은 땀-촉진된 손실 프로파일로 분류하는 것은, 예를 들면, 높은 수행(high performance) 운동 선수 또는 동물의 경우에, 또는 심각한 병 또는 부상으로 고통받거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에게 바람직할 수 있다.
또한, 대상체에게 투여될 식이 보충제에 대한 요건을 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은
a) 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; 및
b) 상기 혈장에서 총 아미노산 조성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 약 2,800 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 보충제의 필요를 나타내는 아미노산의 '낮은' 작동 수준을 나타낸다.
본원에 예시된 바와 같이, 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 추가로 땀에서 개별 아미노산 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서: (i) 땀에서 아미노산의 적어도 약 50%를 구성하는 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘이 '낮은' 프로파일을 나타내며, 세린이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (ii) 땀에서 아미노산의 적어도 약 70%를 구성하는 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신이 '중간' 프로파일을 나타내며, 오르니틴이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (iii) 땀에서 아미노산의 적어도 약 60%를 구성하는 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신이 '높은' 프로파일을 나타내며, 히스티딘이 땀의 주요 아미노산 성분이다.
더욱이, 본원에 예시된 바와 같이, 본 발명은 투여를 위한 아미노산 보충물을 결정할 대상체의 혈장 내 총 아미노산 수준을 결정하기 위한 혈액 또는 혈장 시험의 이용을 고려한다.
기재된 방법은, 예를 들면, 현재 및 과거 수행 수준 및 작업량(workload), 대상체 상태, 및 차후 요건을 고려하여 피험자에게 적합한 아미노산 보충 프로그램의 개발 및 실행을 용이하게 하기 위해 지속적으로 사용될 수 있다. 이는 투여될 보충물의 특정 아미노산 조성을 고안하고/하거나 상이한 시간에 이용될 적절한 용량 또는 용량들을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시의 조성물 및 방법은 운동, 병, 트라우마, 또는 부상으로부터의 회복을 촉진하거나 돕기 위한 또는 운동 또는 스포츠 수행을 촉진하거나 돕기 위한 다른 보충 프로그램 또는 다른 치료법 또는 치료제에 보조적인 것으로서 이용될 수 있다. 따라서 본원에 개시된 조성물 및 방법은 원하는 결과를 촉진할 수 있는 다른 제제와 공-투여될 수 있다. "공-투여된"은 동일한 제형에서의 또는 동일한 또는 상이한 경로를 통한 2개의 상이한 제형에서의 동시 투여 또는 동일한 또는 상이한 경로에 의한 순차적인 투여를 의미한다. "순차적인" 투여는 제제, 조성물 또는 치료제의 투여 사이에 수 초, 수 분, 수 시간 또는 수 일의 시차를 의미한다. 순차적인 투여는 임의의 순서일 수 있다.
임의의 선행 공보(또는 이로부터 파생된 정보), 또는 알려진 모든 자료에 대한 본 명세서의 참조는, 선행 공보(또는 이로부터 파생된 정보) 또는 알려진 자료가 본 명세서와 관련된 시도 분야의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 승인하거나 어떠한 형태의 제안으로 받아들여지지 않으며, 받아들여서도 안된다.
본 개시는 이제 하기 구체적인 실시예를 참조하여 기재될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 명세서 전체에 걸친 설명의 개시내용의 일반적인 성질을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 - 남성 운동 선수의 운동중 아미노산의 땀 촉진된 손실
본 발명자들은 규정된 운동 조건 및 일정한 온도 및 습도 하에서 상당한 양의 아미노산이 땀에서 소실되는지 여부를 조사하였다. 하기 본원에 기재된 바와 같이, 분석을 위해 총 19명의 참여자가 땀을 제공하기 위해 조절된 운동 및 환경 조건 하에서 2개의 개별적인 연구를 수행하였다. 한 연구에서는 땀 아미노산 조성과의 비교를 위해 상응하는 운동 후 혈장 샘플을 갖는 11명의 대상체가 제공되었다. 두 번째 연구에서는, 운동 선수의 아그룹이 32 내지 34 및 20% 내지 30% 상대 습도(RH)에서의 운동 요법 하에서 총 아미노산 농도 및 시간당 유체 손실과 같은 땀 특성을 토대로 설명될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 추가 8개의 땀 샘플이 제공되었다. 연구는 뉴캐슬 대학교 인간 연구 윤리 위원회(University of Newcastle Human Research Ethics Committee)에 의해 승인되었고, 모든 참여자는 연구에 포함되기 전 서면 사전 동의서를 제공하였다.
연구 참여자
지난 2년 내 최소 10회 5km 경쟁적 경주(competitive run)를 완료한, 11명의 잘-훈련된 남성 지구력 운동 선수로 구성된 연구 그룹이 채용되었다(연령: 29 ± 9세, 키: 179 ± 7, 체질량: 73 ± 10 kg, Σ7 피지후(skinfold): 58 ± 24 mm). 잠재적인 참여자는 운동 중 부작용을 경험할 위험을 증가시킬 임의의 의학적 질환(심혈관, 근골격 또는 대사 질환)이 보고된 경우 제외되었다. 참여자는 7일 간격으로 고온 환경(32 내지 34 및 20% 내지 30% RH)을 제공하기 위한 환경 챔버 내 다양한 냉각 개재(cooling intervention)를 갖춘 비-전동 트레드밀(non-motorised treadmill) 상에서 3회의 모의 5 km 자기-보속 시간 시험(simulated 5km self-paced time trial)을 수행하였다. 참여자는 얼음 슬러리 섭취[실행 30분 전에 7.5 g·kg-1·BM-1의 얼음 슬러리(-1)(게토레이(Gatorade), 펩시코(PepsiCo), 미국 뉴욕]로 사전 냉각되거나 멘톨 구강 세정제[버킷 내로 배출하기 전 5초 동안 마우스에서 25 mL의 L-멘톨 용액(0.01% 농도; 22; 멘타 아벤시스(Mentha Arvensis), 뉴 디렉션즈(New Directions), 호주 시드니)을 마심]로 중간 냉각되거나, 개재 없이 반복 5 km 자기-보속 시간 시험을 무작위로 완료하였다.
땀 조성 특성의 확장된 아그룹 평가를 용이하게 하는 땀 샘플을 제공하기 위해 8명의 남성 트라이애슬리트(triathlete)를 포함하는 추가 연구 그룹이 채용되었다. 이들 운동 선수는 25세 내지 35세였고, 지난 12개월 내에 올림픽 거리 3종 경기(Olympic distance triathlon)를 완료하였다(연령: 29.6 ± 3.4세, 체질량(BM): 77.8 ± 11.1 kg, VO2max: 62.1 ± 4.9 mL kg-1 min-1, 지난 12개월 내 올림픽 거리 3종 경기 시간: 2:10:12 ± 0:9:12 시간:분:초, 평균 ± SD). 잠재적인 참여자는 운동 중 부작용을 경험할 위험을 증가시킬 임의의 의학적 질환(심혈관, 근골격 또는 대사 질환)이 보고된 경우 제외되었다. 참여자는 7일 간격으로 고온 환경(32 내지 34 및 20% 내지 30% RH)을 제공하기 위한 환경 챔버에서 2회의 모의 올림픽 거리 3종 경기 시험을 수행하였다. 3종 경기는 50 m 실내 수영장에서의 수영(1500 m), 사이클 에르고미터(cycle ergometer)(로드 엑스칼리버 스포트(Lode Excalibur Sport), 네덜란드 흐로닝겐) 상의 사이클(1시간) 및 전동 트레드밀(파워조그(Powerjog) JM100, 엑스퍼트 피트니스 UK(Expert Fitness UK), 웨일스 미드 글래모건) 상의 10 km 자기-보속 시간 시험을 포함하는 3개의 표준화된 레그(standardised leg)로 구성되었다. 사이클 및 달리기 레그(leg)는 환경 챔버 내에서 수행되었다. 각각의 참여자는 수화된 채로 운동 시험을 개시하도록 요구되었으며, 운동 개시 직전 체중이 측정되었다. 사이클 부문 동안, 참여자는 10 g.kgBM-1의 얼음 슬러리 (1 미만) 또는 실온(32 내지 34) 스포츠 음료(게토레이, 펩시코, 호주 채스우드)를 섭취하였다. 이러한 냉각 전략 사이에는 땀 조성에 영향을 미치지 않았다.
땀 수집 및 분석
각질층으로부터의 잠재적인 기여를 평가하기 위해, 피부의 땀 및 물 세척물을 매주 3번의 상이한 시기에 수집하였다. 피부 물 세척물로부터 수집된 샘플과의 비교를 위해 표준화된 30분 운동 일과 후 1명의 추가 남성(57세)의 등에서 땀을 수집하였다. 운동을 28 내지 32에서 초저녁에 착수한 다음 참여자는 샤워를 하고 18 내지 24 범위의 온도에서 밤새 수면을 취하였다. 운동 후 12시간에, 세척 샘플은, 멸균 시료 용기 내에 적어도 1 mL의 액적이 수집되도록 하기에 충분한 여과수를 등 피부에 분무하여 수집되었다. 그 다음 대상체는 분무하고 피부로부터 액적을 수집하여 제2 샘플을 수집하기 직전 샤워하고, 완전히 건조하였다. 이 접근법은 침출이 일어난 경우 예상되는 바와 같이 각질층이 아미노산을 피부 표면의 물에 공급할 수 있는지 여부를 나타내기 위해 고안되었다. 이 프로젝트는 각각 뉴캐슬 대학교 인간 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었고(승인 번호: H-2015-0534), 참여자는 연구에 포함되기 전 서면 사전 동의서를 제공하였다.
혈장 샘플은 1차 연구 그룹에 대해 운동 전 및 운동 후 샘플링 시간에 채취되었다. 반복 세션에 각각의 참여자로부터의 다중 혈장 샘플 결과를 평균하여 연구에서 각각의 개체의 단일 대표 값을 제공하였다. 땀 샘플은 멸균 70 mL 시료병(자르슈테트(Sarstedt), 독일) 내에 직접 수집하여 두 시험 동안 수집되었다. 코호트 1에서, 8명의 운동 선수 중 5명이 2번의 시기에 땀 샘플을 제공하였고; 1번은 냉각 슬러리의 제공 조건 하에서이고, 1번은 주위 온도 유체의 제공 하에서이다. 운동 선수 중 3명은 냉각 슬러리 또는 주위 온도 유체의 제공 하에서 1개의 땀 샘플만을 제공하였다. 코호트 2에서, 11명의 운동 선수 각각은 3번의 모든 시기에 땀 샘플을 제공하였다. 땀은 트레드밀 실행 직후 연구원에 의해 각각의 참여자의 중간 상부 등, 삼두근 및 이마의 피부 상에서 스퀴지(squeegee)로 긁어내고, 즉시 땀을 멸균 용기 내로 이동시켜 수집되었다. 각각의 참여자로부터의 다중 땀 샘플로부터의 결과를 평균하여 연구에서 각각의 개체의 단일 대표 값을 제공하였다. 운동 일과 후, 대상체를 타월로 건조시키고, 체중을 측정하여 운동 요법 동안 총 유체 손실을 결정하였다. 총 땀 용량은 모의 3종 경기에 걸쳐 유체 및 음식 섭취에 대해 보정된 3종 경기 전체에 걸쳐 손실된 총 체질량으로 계산되었다. 땀 샘플은 4에서 유지되었고, 수집하고 60분 내에 동결되었다. 땀 샘플은 에반스 등(Evans et al., 2008)에 의해 이전에 기재된 바와 같이 기체 크로마토그래피/불꽃 이온화 검출(gas chromatography/flame ionisation detection; GC/FID)에 의해 아미노산 분석용 EZ:Faast™(Phenomenex® Inc.) 유도체화 키트를 사용하여 아미노산 조성에 대해 분석될 때까지 -80에서 저장되었다.
데이터 및 통계 분석
상이한 냉각 처리는 ANOVA에 의해 평가된 바와 같이 혈장 또는 땀 샘플의 아미노산 조성에 영향을 미치지 않았다. 따라서 각각의 운동 선수에 대한 반복된 땀 및 운동 전 또는 운동 후 혈장 샘플을 평균하여 각각의 운동 선수에 대한 하나의 대표 값을 포함하였다. 데이터세트는 일원 ANOVA에 의한 운동 전 및 운동 후 혈장 아미노산 프로파일을 비교하도록 구성되었고, 통계적 유의 수준은 P < 0.05로 설정되었다. 또한, 땀에서의 총 아미노산 농도를 기초로 규정된 그룹들 사이의 혈장 및 땀 조성도 ANOVA를 통해 평가되었다. 땀 배출물 클러스터는 Statistica™ V12 소프트웨어(스타트소프트(Statsoft))를 사용하는 주성분 분석, 판별 함수 분석 및 상관 분석을 사용하여 분석되었다.
결과
1차 운동 선수 그룹 1(n=11)로부터 수집된 땀에서 26개의 아미노산이 검출되었다. 이는 운동 전 및 운동 후 시점에 취해진 상응하는 혈장 아미노산과의 비교를 위해 표 1에 요약되어 있다. 아스파르트산 및 하이드록시라이신이 땀에 존재하였지만 운동 전 및 운동 후 혈장 샘플에는 부재하였다. 땀에서 아미노산의 평균 총 농도는 혈장에서 관찰된 것보다 3배 이상 더 높았다. 총 13개의 아미노산은 운동 후 혈장에서 기록된 것보다 유의미하게 더 높은 농도로 존재하였으며, α-아미노-아디프산, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 하이드록시라이신, 이소류신, 류신, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌 및 세린이 포함되었다. 4개의 아미노산은 운동 후 혈장과 비교하여 유의미하게 더 낮은 농도로 땀에 존재하였으며, α-아미노-부티르산, 글루타민, 시스틴 및 프롤린이 포함되었다. 운동 후 혈장 아미노산은 알라닌에서 통계적으로 유의미한 증가를 나타냈으며, 아스파라긴, 라이신, 오르니틴, 세린, 및 트레오닌에서 통계적으로 유의미한 감소를 나타냈다. 그러므로, 운동 요법은 단순히, 예를 들면, 혈액량의 변화에 의해 설명될 수 없는 순환 혈장의 아미노산 조성에 영향을 주었다고 결론지을 수 있다.
2차 운동 선수 그룹(n=8)에 대한 땀의 아미노산 조성을 결정하였고, 1차 그룹(n=11) 데이터와 비교하여 두 그룹 사이에 땀에서 총 아미노산 수준의 유의미한 차이가 없었음을 보여주었다. 함께 땀의 조성 중 5%를 나타내는 3개의 아미노산만이 1차 및 2차 연구 그룹 사이에서 통계적으로 상이하였다. 이들 3개의 아미노산은 295 ± 158 μM에서의 1차 운동 선수 그룹 대 106 ± 28 μM에서의 2차 그룹에서 측정된 류신; α-아미노-아디프산 74.5 ± 23 μM 대 6.5 ± 0.6 μM; 및 티로신 15.6 ± 7.4 μM 대 127 ± 32 μM(P < 0.05)로 구성되었다. 따라서 대상체는 땀 아미노산 농도에 대해 얻어진 높은 편차를 설명하기 위하여 더 큰 데이터세트(n = 19)를 형성하도록 조합되었다. 데이터는 아미노산 농도, 땀 용적 및 땀을 통해 손실된 총 아미노산과 같은 발한 특성의 명백한 차이에 대해 평가되었다. 개체가 땀에서의 총 아미노산 농도를 기준으로 등급이 매겨질 때, 운동 선수를 아미노산의 땀 촉진된 손실(SFLAA)로 특성화되는 3개의 뚜렷한 클러스터 또는 아그룹에 배치할 수 있었다: 1) "낮은" 클러스터는 2.4 ± 0.7 mM의 평균 ± SD로 4.0 mM 미만(n=8)의 땀에서의 총 아미노산 농도를 갖는 것으로 정의되었고; 2) "중간" 클러스터는 5.9 ± 1.7 mM의 평균으로 4.0 mM 내지 10.0 mM(n=7)로 정의되었고; "높은" 클러스터는 15.2 ± 3.3 mM의 평균으로 10.0 mM.(n=4) 초과로 정의되었다. 아미노산 농도의 땀 프로파일(총 아미노산 수준 제외)을 주성분 분석(PCA)에 적용하여 땀에서의 프로파일이 클러스터 멤버쉽을 객관적으로 구별하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 결정하였다. 표 1에 제시된 분석은, PCA에 의해 생성된 요인이 각각의 개체의 땀에서의 아미노산 조성 패턴을 기초로 3개의 클러스터의 멤버를 완전히 해명하였음을 명확히 보여준다.
[표 1]
Figure pct00001
3개의 클러스터 각각으로부터의 땀 특성 및 땀의 아미노산 조성은 표 2에 요약되었다. "낮은" SFLAA 그룹은 2.3 L/h에서 시간당 가장 높은 땀 추정량을 나타냈으며, 2.4 μM에서 땀에서 가장 낮은 총 아미노산 농도를 나타냈고, 땀을 통해 시간당 손실된 아미노산의 추정된 양은 5.5 mmol이었다. 그에 반해, "높은" SLAA 그룹은 1.5 L/h에서 시간당 가장 낮은 땀 추정량을 가졌으며, 15.2 mM에서 가장 높은 아미노산 농도를 가졌고, 시간당 땀을 통해 손실된 아미노산의 추정된 양은 22.8 mmol이었다(표 3). "중간" SFLAA 그룹은 시간당 땀 용량이 1.8 L/h이고, 땀 아미노산 농도가 5.9 mM로, "높은" 및 "낮은" 그룹 값 사이에 속하며, 시간당 땀을 통해 손실된 추정된 양은 10.6 mmol이었다. 아미노산은 "낮은" 클러스터로부터의 땀에서 측정된 가장 높은 농도를 갖는 성분 순으로 등급이 매겨졌고, 3개의 클러스터 사이의 아미노산 프로파일의 차이는 농도뿐만 아니라 프로파일에서의 상대 존재비에서도 명백하였다.
"낮은" SFLAA 클러스터는 땀의 아미노산 조성 중 57%를 구성하는 4개의 우세한 아미노산 성분으로서 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘을 갖는 것을 특징으로 하였고; "중간" 클러스터는 71%를 구성하는 주요 성분으로서 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신을 가졌으며; "높은" 클러스터는 땀 아미노산 조성 중 62%를 구성하는 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신을 가졌다. "중간" 및 "높은" 클러스터에 대한 땀 아미노산 대부분은 혈장에서 관찰된 것보다 더 높은 농도로 존재하지만 글루타민과 프롤린은 항상 모든 그룹에 대해 땀에서 더 낮은 농도로 존재하였다. 발린은 혈장과 비교하여 "중간" 및 "낮은" 클러스터에 대한 땀에서 더 낮았고, 알라닌과 트립토판도 또한 혈장과 비교하여 "낮은" 클러스터에 대한 땀에서 더 낮았다. 아스파르트산은 혈장에서 검출되지 않았지만 "낮은" 클러스터로부터의 땀에서 6번째로 가장 풍부한 아미노산으로 존재하였고, 나머지 그룹에서는 더 높은 농도로 관찰되었다. 휴식기 혈장 수준의 총 아미노산은 "낮은" 클러스터에서 가장 높았고, "높은" 클러스터에서 가장 낮았으며, 차이가 유의미하지 않더라도, 휴식기 총 혈장 농도와 총 땀 농도 사이에는 강한 음의 상관 관계가 관찰되었다(r 2 = -0.99)(즉 땀에서 아미노산 농도가 높을수록 혈장에서 아미노산의 휴식기 농도가 낮아진다).
[표 2]
Figure pct00002
땀 프로파일에서 아미노산의 백분율 상대 존재비의 분석은 또한 3개의 그룹 사이의 조성에서 실질적인 정량적 차이를 입증하였다. 이는 도 2에서 실증되며, 여기서 땀에서 각각의 SFLAA 클러스터에 대한 아미노산의 % 상대 존재비(도 2a)는 혈장 내 상응하는 수준(도 2b)과 비교하기 위해 플롯팅된다. 세린, 글리신, 히스티딘 및 오르니틴은 모든 3개의 그룹에서 땀의 주요 성분을 나타내지만, 각각의 그룹은 우세한 성분으로서 상이한 아미노산을 특징으로 하며; "낮은" 클러스터의 경우 세린, 중간 클러스터의 경우 오르니틴, 높은 클러스터의 경우 히스티딘이 우세한 성분이다. 알라닌 및 라이신이 또한 5% 초과 수준으로 땀 내 이들의 존재에 대해 주목되었다. 그에 반해, 아미노산의 60.1%를 나타내는 상응하는 운동 후 혈장 내 주요 성분은 22.3%의 알라닌, 17%의 글루타민, 11.5%의 발린 및 9.3%의 프롤린이었고, 이들 모두는 그룹 C 아미노산으로 존재하였다.
피부 표면 자체로부터의 땀에서 아미노산 로딩에 대한 잠재적인 기여를 조사하기 위해 별개의 연구를 수행하였다. 아미노산 수준을 3번의 상이한 시기에 1명의 남성 참여자에 의한 저녁 운동 세션 후 땀에서 측정하여 4.5 ± 1.2 mM의 평균 총 아미노산 농도를 산출하였다. 운동시 땀의 수집 후, 남성은 샤워하고, 18 내지 24에서 12시간 동안 밤새 휴식한 후 물 분무기로 등의 피부 표면을 습윤시키고 즉시 표면 유체를 수집하여 물 세척 샘플을 수집하였다. 운동 및 샤워 후 12시간에 채취된 표면 세척 샘플은 초기 운동 후 땀 샘플의 27%에 상응하는 1.2 mM의 총 아미노산 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 제2 물 세척 샘플은 샤워 및 건조 직후, 다시 피부 표면을 물 분무기로 습윤시켜 채취되었다. 이 샘플은 운동 후 땀 샘플의 4%에 상응하는 대략 0.18 mM의 총 아미노산 함량을 함유하는 것으로 밝혀졌다(도 3). 이들 3 유형의 샘플에 대한 백분율 상대 존재비(도 2)는, 갓 세척한 피부 표면으로부터의 유체의 아미노산 조성 프로파일이 운동 후 땀의 조성 프로파일을 반영하였음을 나타냈다(도 4).
이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은 운동 중 발한이 에너지 대사, 조직 복구 및 회복을 위한 아미노산 이용을 넘어서, 휴식 상태에 비해 아미노산 손실의 추가적인 길을 제시한다고 제안한다. 아미노산 손실 과정은 발한에 의한 피부의 습윤시 일어나는 아미노산의 침출에 의한 피부 표면으로부터의 땀에 대한 기여를 포함할 것이다. 현재 연구에서 세린, 아스파르테이트, 글리신, 오르니틴 및 알라닌의 높은 손실은 신체에서 합성될 수 있는 아미노산에 해당하지만, 운동 중 이들 대사물의 생체내 합성은 반드시 요구를 충족시키지 않을 수 있다. 장기간 및 격렬한 운동 조건 하에서, 또는 고온 기후에서, 아미노산 손실은 비-원섬유 저장고에서 이들을 불러들이거나 새로(de novo) 이들을 합성하는 신체의 능력을 초과할 수 있다. 이러한 저장고가 대사 산화 및 땀에 의한 손실을 통해 고갈되면, 원섬유 단백질은 아미노산에 대한 요구를 충족시키기 위해 이화되어 잠재적인 근육 손상을 초래할 수 있다. 이러한 형태의 원섬유 이화 작용은 근육이 효과적으로 수행할 수 없게 하여 말초 피로로 알려진 상태를 초래할 수 있다. 만성 근육 이화 작용은 사코페니아(sarcopenia), 만성 피로, 장기간 무활동 및 다양한 다른 질병 상태뿐만 아니라 수반되는 고강도 운동이나 과도한 훈련과 같은 조건에 필수적인 과정이다. 땀을 통해 손실된 아미노산의 양이 하루 평균 섭취량의 비교적 적은 비율에 해당할 수 있지만, 신체의 저장소가 이화 반응을 통해 이용될 경우 높은 수요가 있을 때 발생되는 손실(시간당 0.3 g 내지 1.3 g 또는 5.5 mmol 내지 22.8 mmol)은 빠를 것이다. 세계 보건 기구 권고된 하루 허용량을 기준으로, 본 발명자들은 "높은" SFLAA 클러스터 멤버에 대한 운동 요법 중 땀 내 히스티딘 손실이 10 mg·kg-1·일-1로 RDA의 40% 이하를 나타낼 수 있다고 계산하였다. 유사한 방식으로, 소화 기능 장애를 동반한 만성 병이 지속되는 환자는 땀과 소변을 통해 아미노산이 손실되어 아미노산에 대한 신체의 요구를 충족시키기 위해 지속적인 이화 과정이 야기될 수 있다. 고온 기후에서 사는 인간은 또한, 다량의 지속적인 발한을 유도하는 비교적 낮은 수준의 운동 또는 활동 중의 아미노산의 주기적인 고갈로부터 쉽게 역효과를 경험할 수 있다. 클러스터 멤버쉽을 유도하기 위해 현재 연구에 사용되는 방법은 또한 고강도 운동 또는 만성적인 나쁜 건강 상황 하에서 아미노산 유지를 필요로 하는 이들을 확인하기 위한 차후 연구에 이용될 수 있으며, 또한 고온 조건 하에서 생존하고 효과적으로 운동하는데 가장 적합한 이들을 결정하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 2 - 운동 중 땀에서 아미노산의 배출은 콜라겐 턴오버가 성인 인간 남성보다 성인 인간 여성에서 더 높다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 땀의 조성에서 성별 차이를 평가하고 땀 아미노산 손실 패턴이 질소 균형에 유의미한 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 일반 인구 집단의 성인으로부터의 땀의 아미노산 조성을 특성화하였다. 또한, 만성 피로를 갖는 대상체가 음의 순 질소 균형을 초래하는 더 높은 아미노산 배출율을 나타내는지 여부를 조사하기 위해 만성 피로 대상체의 코호트로부터 땀을 측정하였다.
참여자는 일반 인구 집단으로부터 채용된 성인 남성 및 여성뿐만 아니라 만성 피로 증후군으로 진단된 개체의 소 그룹(n=7)이었다. 21명의 여성 및 33명의 남성을 포함하여 총 54명의 인간 대상체로부터 땀을 수집하였다. 4명의 여성 및 3명의 남성은 3년이 넘게 만성 피로를 앓고 있는 것으로 보고되었다. 땀은 건강한 코호트로부터 운동 후 이들의 팔뚝의 피부 표면 위에서 부드럽게 긁어내어 멸균 시료병(70 mL, 독일 자르슈테트)을 사용하여 수집되었다. 땀은 피로한 코호트로부터 따뜻한 위치에서 움직이지 않고 앉아 있으면서 팔꿈치 아래에 고정된 플라스틱 백으로 둘러싸인 이들의 팔뚝으로부터 수집되었다. 땀 샘플은 4에서 저장되었고, 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출(GC-FID; EZ:Faast™)에 의한 분석을 위해 상업용 키트를 사용하여 채취하고 48시간 내에 처리되었다. 연구는 뉴캐슬 대학교 인간 윤리 위원회에 의해 승인되었다(H-2014-0086).
땀 아미노산 상대 존재비 데이터는 정규성(normality)을 향상시키기 위해 아크사인(arcsine)-변환되었다. CF 및 건강한 그룹으로부터의 데이터를 조합하고, k-평균 클러스터링 분석에 적용하여 땀 아미노산 프로파일에 기초한 개별 그룹을 확인할 수 있는지 여부를 결정하였다. k-평균 클러스터링에 의해 생성된 각각의 그룹으로부터의 아미노산 농도 데이터는 ANOVA 및 비균등 샘플 크기를 위한 터키 HSD를 사용하여 비교되었다. 아크사인-변환된 아미노산 데이터에 대해 주성분 분석을 수행하였다. 모든 통계는 델 스타티스티카(Dell Statistica) 버전 13(델 인코포레이티드(Dell Inc.) 2015)을 사용하여 수행되었다.
결과
54명의 대상체의 땀으로부터 아미노산 조성을 결정하였다. 개별 아미노산 수준의 초기 평가는 건강하고 만성 피로인 것으로 보고되지 않은 30명의 남성 및 17명의 여성으로부터의 아미노산의 땀 조성을 비교하는 것에 초점을 두었다. 표 3a는 결과를 요약하며, 남성과 비교된 여성의 땀에서 유의미하게 높은 농도를 갖는 아미노산을 나타낸다. 여성보다 남성에서 유의미하게 더 높은 아미노산은 없었다. 건강한 여성의 땀에서의 총 아미노산 수준은 건강한 남성에서 관찰된 것보다 1.5배 더 높았다(P<0.05). 하이드록시프롤린, 시스틴 및 메티오닌은 남성 땀에서의 상응하는 수준보다 여성 땀에서 각각 3.8배, 2.8배 및 2.5배 더 높았고, 히스티딘을 제외하고 제시된 다른 아미노산은 남성에서 측정된 수준보다 여성에서 1.8배 내지 2.2배 더 농축되었다(P<0.05). 여성의 경우 글루타민 수준은 95 ± 16mol/L였고, 남성의 경우 79 ± 14 mol/L였다. 백분율 상대 존재비 데이터는 또한, 건강한 여성 코호트에 비해 건겅한 남성 코호트에 대해 아미노산 알라닌, 글리신 히스티딘, 프롤린 및 하이드록시프롤린에서의 유의미한 차이를 입증하였다.
만성 피로를 보고한 대상체에 대한 땀에서의 아미노산 조성은 여성 및 남성에 대해 따로따로 비교되었다(표 3b). 만성 피로 그룹에 대한 낮은 반복 횟수로 인해 편차는 컸지만 유의미한 차이는 분명히 있었다. 만성 피로를 갖는 여성은 일반적으로 건강한 여성보다 더 높은 수준의 대부분의 아미노산이 측정되었고, 아스파르트산, 아스파라긴, 오르니틴 및 메티오닌의 수준이 유의미하게 더 높았다(P<0.05). 만성 피로를 갖는 남성은 건강한 남성의 땀에 비해 땀에서 아미노산의 총 로딩의 유의미한 증가를 나타냈고, 특이적인 증가는 세린, 알라닌, 글리신, 아스파르트산, 발린, 프롤린, 티로신, 아스파라긴, 하이드록시프롤린 및 메티오닌에서 주목되었다(P<0.05).
아미노산 농도 데이터는 상대(백분율) 존재비로 전환되었고, 다변량 통계 분석을 위해 아크사인-변환되었다. K-평균 클러스터링 분석에 의해 4개의 클러스터는 n>6으로 생성될 수 있음을 보여주었다(표 4). 여성은 클러스터 3에서 더 자주 발견되었고, 동일한 수의 남성 및 여성이 클러스터 1에서 관찰되었다. 클러스터 2는 주로 남성으로 구성되었고, 클러스터 4는 전부 남성으로 구성되었다.
각각의 클러스터의 아미노산 조성은, 함께 아미노산의 57% 내지 61%를 구성하는 각각의 클러스터에서의 4개의 주요 성분이 지배적이었다. 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘/아스파르트산은 클러스터 1, 2 및 3에 대한 땀 프로파일에서 우세한 아미노산이었다. 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 클러스터 4에서 가장 풍부한 아미노산이었다(표 4).
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
클러스터 1은 땀에서 최고 농도의 아미노산을 갖는 것으로 확인되며, 다른 클러스터와 비교하여 유의미하게 더 높은 농도의 필수 아미노산을 포함하였다(P<0.05). 이 동일한 클러스터에서, 땀에서의 총 아미노산 로드의 상승은 주로 고농도의 세린, 글리신, 알라닌, 아스파르트산, 오르니틴 및 히스티딘에 의해 유발되었다. 클러스터 3은 또한 클러스터 2와 비교하여 글리신, 알라닌 및 발린의 수준이 더 높았다. 클러스터 1 및 2는 땀에서 하이드록시프롤린 및 프롤린을 가졌지만, 클러스터 2 및 4는 갖지 않았다. 클러스터 4는 최고 농도의 히스티딘, 라이신 및 오르니틴을 갖는 것으로 확인되었다. 클러스터 2는 대부분의 아미노산에 대해 높은 편차를 나타냈으며, 더 면밀한 검사에 의해 남성(n=11)은 땀에서 총 아미노산 수준이 11,144(±5,294)의 여성에 비해 3,851(±856)이었음을 보여주었다.
아미노산에 대한 상대 존재비 데이터는 주성분 분석(PCA)에 적용되었고, 사례는 k-평균 클러스터링에 의해 결정된 그룹 멤버쉽을 기초로 하여 색으로 코딩되었다 도 5a의 산점도로부터 각각의 클러스터의 사례가 서로 잘 해결되었음이 분명하였다. 클러스터 4의 사례는 도 5b의 요인 부하값(factor loading)에서 도시된 바와 같이 히스티딘, 오르니틴 및 라이신으로부터의 기여에 따라 정렬된 요인 1을 따라 확산되었다.
건강한 여성의 땀에서의 13개의 아미노산의 농도는 남성에서 측정된 상응하는 수준보다 더 높았고, 그 결과 여성의 땀에서 총 아미노산 로딩이 유의미하게 더 높았다. 글루탐산(8.1 x), 히스티딘(7.3 x) 및 글리신(7.2 x)도 혈장에 비해 땀에서 실질적으로 농축되었다. 이러한 결과는, 이들 아미노산이 각질층의 피부 표면에서 발견되는 천연 보습 인자(natural moisturising factor; NMF)로부터 아미노산의 침출 과정을 통해 땀에서 농축될 수 있다는 제안과 일치한다.
땀에서 글리신, 세린 및 알라닌의 높은 농도, 및 높은 배출 손실 가능성은 고강도 운동 훈련, 고온의 장기간 노출, 부상 및 병원성 공격의 조건 하에서의 대사 항상성에 대한 예상되는 문제를 제시한다. 이는 땀을 통한 손실이 일반적인 단백질 합성 및 세포 분열과 관련된 유지, 복구 및 회복 과정을 제한할 수 있기 때문이다. 예를 들면, 이들 아미노산은, 프롤린과 함께, 콜라겐 단백질의 합성을 위해 비교적 높은 비율로 필요하다. 그러므로 매우 높은 수준의 땀 촉진된 글리신 및 세린의 손실은 특히 여성에서 콜라겐 합성을 제한할 수 있다. 여성의 땀에서 프롤린의 농도는 남성에서 측정된 것의 2배였으며, 이는 감소된 콜라겐 합성 능력에 대한 여성의 추가의 감수성을 나타낼 수 있다. 남성은 여성이 갖지 못한 땀을 통한 프롤린의 손실을 제한하는 어느 정도의 능력을 가질 수도 있다. 여성의 경우 더 높은 수준의 프롤린은 단순히 더 높은 콜라겐 분해 속도 및 프롤린의 후속적 방출을 반영할 수 있다. 여성에서 하이드록시프롤린의 배출(이는 또한 콜라겐 이화 작용 동안 방출됨)은 남성의 땀에서 측정된 것의 거의 4배였으며, 이는 여성에서 더 높은 콜라겐 턴오버 속도를 나타낸다. 따라서 프롤린 및 글리신, 알라닌 및 세린을 보유하는 더 낮은 능력과 결합된 더 높은 콜라겐 턴오버 속도는, 여성이 더 느린 근육 조직 회복 및 복구 속도를 가질 수 있음을 시사하였다.
여성은 남성과 비교하여 땀에서 더 높은 아미노산 손실 속도를 지속적으로 나타냈다. 또한, 만성 피로를 갖는 개체는 동일한 성별의 건강한 개체보다 땀에서 더 많은 양의 아미노산을 나타냈다. 글리신 및 히스티딘은 땀에서 발견된 주요 성분이었고, 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은, 땀에서 손실된 아미노산이 단백질 턴오버를 유지하고, 대사, 복구 및 회복 과정을 유지하는 성분의 제한을 나타낸다고 제안한다. 여성 및 만성 피로 대상체의 땀에서 프롤린 및 하이드록시프롤린의 더 높은 수준(농도 및 상대 존재비)은 일반적으로 이들 대상체에서 더 높은 콜라겐 턴오버 속도를 가리켰다. 땀에서 글루타민 농도는 지속적으로 낮았으며, 이는 천연 보습 인자의 일부로서 글루탐산 및 피로글루타메이트를 생성하기 위해 아마 각질층에서 탈아민화되었을 것임을 나타낸다.
소변 중 아미노산 농도는 땀에서의 아미노산 농도 및 문헌 값 혈장 농도와 비교되었다(표 4). 소변 중 평균 1일 손실을 추정하기 위하여, 인간에서 평균 1일 소변 배출율을 나타내기 위해 1,500 mL의 용량을 취하였고; 이는 순환 혈장 및 땀의 총 아미노산 로딩과의 비교가 가능하도록 하였다. 땀 분비량(sweat rate)은 성별, 온도 및 습도 및 활동 수준뿐만 아니라 BMI 및 체력 수준과 같은 신체 특성을 조절하는 내재 유전 인자에 따라 가변적일 것이다. 최대 발한량(sweating rate)은 운동 중 시간당 1 L 내지 2 L에서 확립되었다. 이 속도는 1일 10 L 내지 12 L의 땀이 손실될 수 있는 장기간 고온 조건에 있는 작업자에서 관찰되었다. 대부분의 스포츠에서의 훈련과 경쟁은, 19 내지 33 범위의 온도에서, 남성 및 여성에 대해 시간당 0.7 L 내지 2 L의 땀 분비량을 생성할 수 있으며, 한편 조정(rowing)은 10에서 시간당 0.8 L를 생성하는 것으로 나타났다. 그러므로 0.5 L 및 2 L의 1일 땀 용량에 대한 소변 산출량 및 혈장 농도를 비교하기 위해 땀에서 잠재적 손실을 나타내는 것은 합당한 것으로 여겨졌다(표 3) 이러한 비교는, 운동을 하지 않을 때와 일치하는, 비교적 보존적인 1일 발한량 추정치에 근거한 총 아미노산 손실이 소변 손실과 비교하여 더 낮은 아미노산의 손실량을 초래할 것임을 보여주었다. 땀 손실은 남성과 비교하여 여성에서 더 높았음이 주목되었다. 이러한 비교는 또한 모든 아미노산이 소변 및 땀에서 동등하게 손실되는 것이 아니라는 것을 입증하였다. 신장 재흡수 과정은 분지 사슬 아미노산 및 프롤린에 대해 매우 효율적이지만, 히스티딘 및 글리신은 혈장에서 측정된 농도의 4배 초과로 소변에서 손실되었다. 땀과 달리, 에크린선(eccrine gland)에서 배출된 땀의 아미노산 조성이 혈장에 대해 이전에 관찰된 것과 유사할 것이지만 각질층에서 NMF의 침출로 인해 농축될 것으로 제안된 경우, 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘 및 아스파르트산의 손실에 대한 상당한 가능성이 있다. 따라서 발한은 피부 표면에서 NMF의 기능과 관련된 아미노산의 손실에 대한 주요 경로를 나타낸다고 결론 내려졌다.
하루 중 운동을 포함한다는 것을 설명하기 위해 땀 분비량을 2 L로 상승시켰을 때, 아미노산 손실 모델은 남성의 경우 소변에서 거의 2배였고, 여성의 경우 소변에서 3배였다. 남성에서는 혈장에서 순환하는 아미노산의 총 로딩의 78%가 땀 매 L마다 손실되고, 여성에서는 혈장 로드의 116%가 땀 1 L에서 손실된다. 이는 체내에서 유지되어야 하는 아미노산의 혈장 자원에 대한 상당한 수요를 나타낸다. 운동시 음식 섭취가 가능하지 않은 동안 혈장에서 아미노산 항상성을 보장하기 위해, 아미노산은 에너지, 회복 및 복구를 위한 아미노산을 제공하기 위해 비-원섬유 단백질의 단백질 분해를 통해 유도된다. 새로운 단백질 합성 요구는 운동 후 운동 선수에서 24시간 내지 36시간 동안 그리고 훈련되지 않은 개체에서 최대 48시간 동안 상승된 채 유지될 수 있다. 따라서 여성은 운동, 고온 기후 조건의 노출, 불량한 식이, 스트레스, 부상 또는 병원성 공격의 결과로서 음의 순 질소 균형을 발생시키는 것이 더 쉬울 것이라고 결론 내려졌다.
실시예 3 - 말에서 아미노산의 땀 촉진된 손실 및 아미노산 보충제
본 발명자들은 운동에 기인한 아미노산의 땀 촉진된 손실 가능성을 평가하기 위해 말의 땀의 아미노산 조성을 확인하였고, 훈련 기간 동안 말의 상태를 개선시키기 위해 보충제를 통한 아미노산 대체 가능성을 조사하였다.
연구는, 연구 개시시 유의미한 질병 이력이 없거나 임의의 유의미한 병 또는 부상으로 고통 받고 있지 않은, 3세 내지 5세의 스탠더드브레드 하니스 경마 거세마 5마리 내지 6마리를 갖는 2개의 코호트를 포함하였다. 연구는 뉴캐슬 대학교 동물 관리 및 윤리 위원회(University of Newcastle Animal Care and Ethics Committee)에 의해 승인되었다.
제1 코호트
제1 코호트(n=5)에서 모든 말은 한 명의 조련사의 감독 하에 동일한 훈련 스케쥴에 따랐으며, 연구 과정 내내 경쟁적 경주에 적극적으로 참여하였다. 샘플링은 말의 정규 훈련 방식(regular training regime)에 통합되었으며, 고강도 트랙 운동을 수반하는 세션과 동시에 일어날 예정이었다. 그 결과, 샘플을 3주 동안에 1주당 1회 수집하여 말당 최대 5개의 운동 전 및 5개의 운동 후 샘플을 제공하였다. 각각의 훈련 세션 전, 말은 속도, 거리, 노력(effort) 및 회복을 측정할 수 있도록 GPS/심박수 모니터링 장치가 장착되었다. 말은 보충제 및 사료를 제공받기 전에 월요일부터 토요일까지(경주 일(race day)은 제외) 매일 오전마다 훈련을 받았다. 말은 오전 운동 후 및 다시 저녁에 1 kg의 하이게인 포워토크(Hygain Powatorque)(조단백질 17%, 조지방 10%, 최대 조섬유 10%, 첨가된 세일(added sale) 1.5%, 칼슘 1.5%, 인 0.6%, 라이싱(lysing) 11 g/kg, 비타민 E 1000 IU/kg, 셀레늄 1.5 mg/kg; 하이 게인 피즈 피티와이 엘티디.(Hy Gain Feeds Pty Ltd.), 호주 빅토리아)를 제공받았다. 말은 또한 크기 및 상태에 따라 각각의 동물에 대해 2.5 kg 내지 4.5 kg의 Hygain Microbarley®(조단백질 11%, 조지방 2%, 최대 조섬유 9%)를 제공받았다. 모든 말은 자유로운 양의 밀 왕겨(wheaten chaff) 및 자주개자리 왕겨(Lucerne chaff)를 제공받았고, 이 섭식 방식은 기저선, 보충 및 최종 평가 기간 내내 일정하게 유지되었다. 실험 기간 동안 다른 비타민 또는 보충물은 제공되지 않았다. 일요일에, 말은 개방 방목장에서 풀을 뜯어 먹을 수 있었다.
아미노산 보충을 위해, 말은 2주의 보충 후 샘플링 및 평가를 개시하기 전에 34일 동안 매일(경주 일 제한 제외) 복합 아미노산 보충물(Fatigue Reviva™; 탑 뉴트리션 피티와이 엘티디(Top Nutrition Pty Ltd))이 제공되었다. 아미노산 보충물은 20가지 L-아미노산(글리신, 프롤린, 글루타민, 카르니틴, 트레오닌, 라이신, 알라닌, 발린, 타우린, 세린, 시스테인, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 페닐알라닌, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 및 티로신), 프럭토-올리고당, 말산, 시트르산, 석신산, 리보오스, 및 13가지 미네랄 및 13가지 비타민으로 구성되었다. 제형은 대형 재밀봉 가능한 플라스틱 용기에 제공되었고, 60 mL 플라스틱 시린지를 통한 경구 전달 전 페이스트를 형성하기 위해 MCT(중간-사슬 트리글리세라이드) 오일과 1:1로 매일 혼합되었다. 인간 투여량은 말에 맞게 적절하게 조정되었고, 14.1 g의 아미노산을 전달하는, 30 g의 Fatigue Reviva™가 각각의 말에 매일(경주로 불가능한 날은 제외) 제공되었다. 보충하고 34일 후, 혈액 및 땀 샘플을, 보충을 지속하면서 2주의 기간에 걸쳐 3번의 상이한 시기에 힘든 훈련 세션 전후에 채취하였다.
제2 코호트
말의 제2 코호트는 동물의 상이한 샘플을 사용하여 제1 코호트로부터의 땀 조성 분석을 반복할 목적으로 연구되었다. 다시 모든 말은 같은 조련사의 감독 하에 같은 훈련 스케쥴에 따랐으며, 연구 기간 내내 경쟁적 경주에 적극적으로 참여하였다. 말은 기저선 측정치를 얻기 위해 초기 2주 기간에 걸쳐 4회 샘플링되었고, 그 다음 64일 동안의 훈련 및 경주 동안 아미노산 보충물(하기 참조)이 제공되었다. 마지막 2주의 보충 시험에 걸쳐 각각의 말로부터 4개의 땀 및 혈장 샘플을 채취하였다. 2마리의 말은 부상 우려로 인해 단계 1 기저선 시험 후 그리고 보충 전 제외되었고, 또 다른 스탠더드브레드 말로 대체되었다. 이는 단계 1 평가를 위해 6마리의 동물을 제공하였으며, 그 다음 4마리가 40일 동안의 훈련 및 경주 동안 보충물이 제공되었다. 보충 후 혈액 샘플을 힘든 훈련 세션 전후에 채취하고, 한편 땀 샘플을, 보충을 지속하면서 2주의 기간에 걸쳐 4번의 상이한 시기에 훈련 후 채취하였다. 샘플 수집 기간은 악천후로 인한 지연으로 인해 연장되었다. 휴식기 혈장 샘플은 7마리의 말 세트로부터 조련사의 소유지에서 평가되었고, 일하지 않은 말(horses not in work)(4개월 내지 7년)로 평가되었고, 연령이 3세 내지 14세(6마리의 거세마 및 1마리의 번식용 말) 범위였다. 이들 말은 평가 전 적어도 4개월 동안 어떠한 하이게인 높은 단백질 함유량 사료도 제공되지 않았고, 방목장에서 풀을 뜯어 먹었다. 이들 말이 높은 단백질 식이 지원을 받지 않았기 때문에, 이들은 혈장의 아미노산 수준에 대한 비교를 위한 참조 그룹으로 사용되었다.
이러한 제2 코호트의 말은 땀에서 손실된 주요 아미노산 성분을 나타내는 것으로 확인된 오직 14종의 아미노산(세린, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 라이신, 아스파르트산, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌, 및 티로신)만을 함유하도록 제형화된 보충물(하이게인 옴미나(Hygain Omina) R3, 하이 게인 피즈 피티와이 엘티디)이 제공되었다. 아미노산의 비율은 이들 동물의 땀에서의 아미노산에 대해 관찰된 상대적 손실을 반영하도록 조정되었다. 이들 아미노산을 적절한 비율로 미리 혼합하였고, 60 mL 시린지를 통한 페이스트 전달 시스템을 형성하기 위해 아쿠아 겔 베이스 생성물(하이게인 피즈 피티와이 엘티디)과 1:1로 배합하였고, 이는 동물에게 잘 수용되었다. 페이스트는 1회 제공당 30 ml 아쿠아 겔 중에서 500 mg 글루코스와 함께 30 g의 아미노산을 포함하였다.
실험 절차
두 코호트의 말에 대해, 운동 세션은 말이 경주하지 않았을 때 주당 2회의 힘든 작업 세션, 또는 1회의 힘든 작업 세션 및 경주를 포함하였다. 말은 3주마다 평균 1회 경주를 하였다. 힘든 작업 세션은 설키(sulky) 및 기수(driver)를 끌면서 전체 경주 하니스에서 700 m 트랙 주위에서 페이싱(pacing)하는 것을 포함하였다. 각각의 세션은 중간 페이스로 트랙의 대략 2.5 바퀴 '준비 운동(warm up)', 3 내지 4 바퀴 동안 경주 속도로 가속, 그 다음 최종 '정리 운동(warm down)'으로 2.5 바퀴 동안 서서히 감속으로 구성되었다. 모든 샘플은 이른 아침 힘든 작업 세션 전후 그리고 사료 또는 보충물의 제공 전에 채취되었다. 가벼운 훈련 세션은 중간 페이스로 트랙의 2.5 바퀴 '준비 운동' 및 그 다음 9 km 내지 12 km 동안 대략 19 km/h의 가벼운 조그(jog)를 포함하였다. 말들간 및 샘플링 사건들간 훈련 템포 및 요구의 일관성을 제공하기 위해, 모든 세션에서 모든 말에 대해 동일한 기수를 썼다. 지속기간, 세션 시간, 거리, 속도 및 심박수 파라미터를 포함하는, 훈련의 다양한 양상은 말들간 및 보충 전 및 보충 후 단계 프로젝트간 일관성을 평가하기 위해 제1 코호트에서 정기적으로 모니터링되었다.
각각의 말은 기저선 및 보충 후 단계 모두에서 운동 전 혈액 및 혈장뿐만 아니라 운동 후 혈액, 혈장 및 땀의 평가를 위해 반복 샘플(replicate sample)이 채취되었다. 각각의 시험 단계에 대한 반복 샘플을 평균하여 기저선 및 후속적 보충 후 단계 모두에서 각각의 동물에 대한 하나의 대표 혈액, 혈장 또는 땀 샘플을 나타냈다. 두 코호트의 데이터 세트를 따로 분석하여 땀에서 아미노산 조성의 일관성 및 2개의 상이한 동물 코호트에서 아미노산 보충에 대한 반응을 평가하였다. 보충 개시 전 각각의 말에 대한 혈장 아미노산의 기저선 수준은 4번 또는 5번의 상이한 시기에 운동 훈련 상황 전 및 직후 혈액 샘플을 채취함으로써 확립되었다. 제1 코호트에서 35일의 보충 후, 말은 보충물을 계속 유지하면서 제2 세트의 샘플을 3번의 상이한 시기에 채취하여 혈장 및 땀의 보충 후 조성을 확립하였다. 동일한 접근법이 제2 코호트에서도 채택되었고, 여기서 기저선 수준은 보충 전 4번의 상이한 샘플링 사건 동안 각각의 말에 대해 확립되었다. 제2 코호트에 대해 40일의 보충 후, 말은 보충물을 계속 유지하면서 제2 세트의 샘플을 4번의 상이한 시기에 채취하여 혈장 및 땀의 보충 후 조성을 확립하였다.
혈액을 각각의 말의 경정맥에서 20 mL 시린지에 수집하고, 표지된 9 mL 나트륨 헤파린 Vacutainer®에 바로 옮겼다. 땀은 각각의 말의 훈련 세션 종료시 용기 내로 유체가 흐를 수 있도록 말의 털 표면 위에서 상향 모션으로 멸균 70 mL 샘플병에 긁어내어 수집되었다. 제1 코호트에서, 합쳐진 땀 샘플은 신체의 3 구역: 앞다리 사이 및 바로 위 가슴; 몸통의 측면과 하복부; 및 뒷다리의 윗 부분 안쪽에서 수집되었다. 제2 코호트에서, 아미노산의 땀 조성의 임의의 차이가 신체의 상이한 위치에서 발생했는지 여부를 결정하기 위해 동일한 3 부위에서 개별적으로 땀을 수집하였다. 수집될 때, 각각의 땀 샘플을 멸균 Monovette® 튜브(자르슈테트 오스트레일리아 피티와이 엘티디(Sarstedt Australia Pty Ltd))로 옮기고, 실험실로의 수송을 위해 냉각된 용기에 수집 직후 저장되었다. 모든 혈액 샘플은 보충 및 섭식 전 수집되었다.
채혈 후, 100 μL의 전혈 샘플을 헤파린화된 모세관(박토 래보러토리즈(Bacto Laboratories), 리버풀, NSW)에 넣었다. 샘플을 즉시 모세관에서 iSTAT CG8 + 카트리지의 샘플 웰 내로 방출시켰다. 카트리지가 폐쇄되기 전에 샘플에서 모든 기포를 제거하였다. 적혈구용적률(Hct), 헤모글로빈(Hb), 이온화된 칼슘(iCa), 글루코스(Glu), 나트륨(Na), 칼륨(K), pH, 바이카보네이트(HCO3), 혈액 기체(pO2, pCO2, TCO2, sO2) 및 염기 과량의 측정을 위해 카트리지를 iSTAT 임상 분석기(clinical analyser)로 분석하였다. 각각의 시험 세션 전, i-STAT 분석기를 제조업체의 설명서에 따라서 전자 자극 및 레벨 2 i-STAT 제어 솔루션(i-STAT 코포레이션(i-STAT Corporation), 미국 뉴저지)으로 보정하였다. 제조업체의 지침서에 따라 사용 전 카트리지를 저장하고(2 내지 8), 사용하기 대략 5분 전에 실온으로 이동시켰다.
혈장 분획은 원심분리(3000 rpm, 10분)에 의해 혈액 샘플로부터 단리되었고, 이후 혈장 상청액을 멸균 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮겼다. Monovette® 튜브로부터 땀 샘플 분취액을 이동시키고, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 맑은 상청액을 추출을 위한 깨끗한 튜브로 옮겼다. 샘플의 아미노산 조성은 EZ:Faast™ 유도체화(페노메넥스 인코포레이티드(Phenomenex Inc.))에 이어서 GC/FID 분석을 통해 결정되었다. EZ:Faast™ 절차는 고체상 추출 단계에 이어서 유도체화 및 액체/액체 추출로 이루어진다. 모든 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라서 다음의 변경을 적용하여 유도체화되었다: i) 모든 혈장 샘플에 대해 200 μL의 멸균된 탈이온수를 초기 반응 혼합물에 첨가; ii) 모든 땀 샘플에 대해 200 μL의 0.1 M HCl을 초기 반응 혼합물에 첨가. EZ:Faast™ 유도체화된 샘플의 분석은 페노메넥스 인코포레이티드에 의해 공급된, 불꽃 이온화 검출기 및 ZB-PAAC-MS 컬럼(10 m x 0.25 mm i.d.)이 장착된 휴렛 패커드(Hewlett Packard) HP 6890 시리즈 GC 시스템에서 수행되었다. 기기 방법은 250℃의 인젝터 온도 및 0.5 ml/분의 컬럼 유속으로의 분할 주입(split injection)(비 15:1)을 포함하였다. 주입 용량은 모든 샘플에 대해 2.5 μL로 설정되었다. 오븐 프로그램은 110의 초기 온도, 320까지 32/분의 증가로 구성되었다(실행 시간 = 8.56분). 표적 화합물은 분석 표준의 사전 확립된 체류 시간에 따라 확인되었고, 정량화는 내부 표준의 신호 반응에 대해 보정되었다.
통계 분석
샘플 세트 사이의 혈액 파라미터, 운동 요법 및 아미노산 농도의 비교는 Statistica™ 12(스타트소프트, 미국 오클라호마 털사)를 사용하여 일원 ANOVA에 의해 완료되었다. 기저선에서 및 보충 후 평가된 적혈구용적률 및 헤모글로빈의 평균 사이의 차이의 크기를 평가하기 위해 효과 크기를 계산하고, 이에 따라 해석하였다(코헨의 d; 작음 = 0.2 내지 0.49, 중간 = 0.5 내지 0.79, 큼 ≥ 0.8). 두 코호트의 샘플은 스타티스티카에서 대응-표본 t-시험(paired-samples t-test)을 사용한 휴식기 혈장에서 총 아미노산의 보충 전 및 보충 후 수준의 비교를 위해 풀링되었다. 스타티스티카를 사용하여 기저선에서 및 다시 보충 기간 후 말에서 아미노산의 혈장 휴식기 혈장 수준 및 상응하는 적혈구용적률 및 헤모글로빈 수준에 대한 상관 분석을 수행되었다. 통계적 유의 수준은 p < 0.05로 설정되었다.
결과
훈련 방식을 실험 기간 내내 가능한 한 일관되게 유지하여 보충 전후에 실시한 다양한 측정 사이에 의미있는 비교가 가능하도록 하였다. 제1 코호트에 대한 2 단계 사이의 운동 부하의 잠재적인 변화를 확인하기 위해 훈련 방식의 파라미터 범위가 객관적으로 평가되었다. 데이터는 표 5에 요약되어 있다. 측정된 파라미터의 75%가 2 단계의 평가 사이에서 유의미한 차이를 나타내지 않았음이 분명하였다. 훈련 평균 속도 및 세션 거리는 우세한 계절(prevailing season), 날씨 및 트랙 상태에 따라 어느 정도 가변적일 것으로 예상되었다. 이에 비추어 볼 때, 훈련 방식은 비교가 가능하도록 연구의 보충 전 및 보충 후 아암(arm) 사이에서 충분히 일관되었다고 결론 내려졌다. 유사한 방식이 제2 코호트에 적용되었다.
코호트 1의 각각의 동물의 3곳의 수집 부위에서 수집된 땀은 각각의 말에 대해 풀링되었고, 아미노산 농도에 대한 높은 가변성을 나타냈다(표 6). 코호트 2 샘플의 각각의 샘플 부위에서 수집된 땀은 개별적으로 분석되어 가슴 샘플이 2,777 ± 428 μmol/L의 하복부 및 1,876 ± 315 μmol/L의 뒷다리와 비교하여 3,214 ± 411 μmol/L의 총 아미노산 농도를 가졌음을 보여주었다(p<0.05). 가슴 부위의 땀은 또한 최고 수준의 세린, 히스티딘 및 트레오닌을 나타냈고,
[표 5]
Figure pct00005
동물 취급자를 위한 가장 용이하고 가장 안전한 수집 부위로 여겨졌다. 그러므로 이 샘플링 부위는 코호트 2에 대한 땀 데이터를 보고하는데 사용되었다. 기저선에서, 코호트 2에 대한 운동 중 발생하는 평균 체중 손실은 5.1 ± 0.7 kg이었다.
22개의 아미노산이 말에서 채취된 운동 후 혈장에서 검출되고 정량화되었다. 코호트 1 및 코호트 2의 혈장 조성 사이의 비교에 의해, 평균 혈장 프로파일 패턴은 2개의 연구에서 유사했으며(표 6), 주요 혈장 아미노산으로서 글리신에 이어서 알라닌, 글루타민, 발린 및 세린은 혈장 아미노산의 61% 내지 64%를 차지하였음을 보여주었다. 2개의 코호트의 혈장 내 총 아미노산 수준은 개별 아미노산 규모 및 분포 둘 모두가 유사하였다.
땀의 아미노산 조성은 2개의 코호트에 대해 상응하는 혈장 샘플의 것과 유의미하게 상이하였다(표 6). 땀 샘플에서 아미노산의 평균 총 농도는 코호트 1에 대해 혈장의 농도의 2배였고(P < 0.05), 코호트 2에서 1.2배 더 높았지만, 이러한 후자의 차이는 통계적 유의 수준에 도달하지 못했다. 땀은 2개의 연구 코호트에 대해 상응하는 혈장 수준과 비교하여 땀에서 더 높은 농도로 일관되게 존재하는 5개의 아미노산을 함유하였으며, 세린(3.9배 내지 5.4배 더 높음), 글루탐산(7.0배 내지 9.5배 더 높음) 히스티딘(4.3배 내지 4.5배 더 높음), 페닐알라닌(1.9배 내지 3.4배 더 높음), 및 아스파르트산을 포함하였다.
아스파르트산은 코호트 1에서 말의 혈장에서 검출되지 않았지만 땀에서 262 ± 29 μmol/L로 존재하였다. 유사하게, 아스파르트산은 코호트 2의 혈장에서 2 ± 2 μmol/L로 측정되었고, 이는 땀에서 상응하는 154 ± 21 μmol/L와 비교되었다. 알라닌, 류신, 발린, 프롤린 및 티로신은 코호트 1에서 혈장에 비해 땀에서 더 높았지만, 코호트 2에서는 그렇지 않았다. 발린 및 오르니틴 둘 모두는 코호트 1에서 혈장에 비해 땀에서 더 농축되었지만 코호트 2에서는 땀에서 더 적게 농축되었다. 글루타민, 시스틴, 메티오닌 및 아스파라긴은 두 코호트 모두에서 혈장에 비해 땀에서 농도가 일관되게 더 낮았다. 글리신 및 트립토판은 코호트 2에서 혈장과 비교하여 땀에서 더 낮았고, 코호트 1의 양쪽 매트릭스에서 동등한 수준으로 존재하였다.
[표 6]
Figure pct00006
보충 후 휴식기 혈액, 혈장 및 땀의 변화
평균 아미노산 수준을 기저선에서 및 보충 후 휴식기 혈장 샘플에서 평가하여 아미노산 보충에 따른 대사 항상성의 잠재적인 변화를 평가하였다(표 7). 코호트 1은 2,044 ± 135 μmol/L의 코호트 2와 비교하여 더 높은 2,293 ± 68 μmol/L의 총 혈장 아미노산의 평균 기저선 수준을 나타냈지만, 휴식기 수준은 2년 사이에 유사한 프로파일 특성을 나타냈다. 보충 후, 평균 총 혈장 아미노산 수준은 상응하는 평균 기저선 수준과 비교하여 두 코호트 모두에서 각각 2,674 ± 41 μmol/L 및 2,663 ± 124 μmol/L까지 증가하였다(P < 0.05). 그러므로 혈장에서 아미노산의 평균 총 수준은 보충 후 2개의 코호트에서 동등하였다. 2개의 코호트를 풀링하여 본페로니 보정(Bonferroni correction)과 함께 기저선에서 및 보충 후 혈장 아미노산 농도를 비교하기 위해 대응-표본 t-시험을 수행하였다. 글리신(기저선: 582 μmol/L 대 보충 후: 769 μmol/L), 트레오닌(93 μmol/L 대 118 μmol/L), 세린(175 μmol/L 대 312 μmol/L), 및 글루타민(213 μmol/L 대 343 μmol/L)(n=9, P<0.002)에 대한 기저선 수준과 비교하여 보충 기간 후 휴식기 혈장에서 유의미한 증가가 관찰되었다. 보충 후 혈장에서 평균 총 아미노산 농도(평균 = 2,669 μmol/L, SD = 165)는 또한 대응-표본 t-시험을 사용하여 평가되었고, 보충 전 관찰된 수준과 비교하여 유의미하게 더 높은 것으로 밝혀졌다(평균 = 2,138 μmol/L SD = 313) (t(8) = -4.29, P <0.003). 데이터는, 운동 직후 아미노산 보충 과정이 휴식기 혈장에서 아미노산 수준의 순환 수준을 증가시켰음을 나타냈다.
코호트 2는, 기저선에서 더 낮은 혈장 총 아미노산 함량을 가질 뿐만 아니라, 또한 5,696 ± 932 μmol/L의 코호트 1 수준과 비교하여 3,213 ± 411 μmol/L로 땀에서 더 낮은 초기 평균 총 아미노산 수준을 나타냈다(표 8). 보충 후, 평균 총 땀 아미노산 수준은 코호트 1에 대해 6,228 ± 546 μmol/L로 유의미하게 증가하지 않았지만, 코호트 2에 대해 8,682 ± 563 μmol/L로 농도가 2배 넘게 증가하였다(P < 0.05). 측정된 모든 아미노산은 코호트 2에서 기저선 수준과 비교하여 보충 후 땀에서 더 높은 수준으로 관찰되었다(P < 0.05).
[표 7]
Figure pct00007
[표 8]
Figure pct00008
평균 휴식기 적혈구용적률 및 헤모글로빈 수준은 보충 프로그램을 완료한 기저선에서의 4마리의 코호트 2 말에 대해 각각 0.41 ± 0.025 및 141 ± 8.6 g/L였다. 보충 후, 큰 증가(코헨의 d > 0.8)가 두 파라미터에서 관찰되었고, 이때 휴식기 적혈구용적률은 0.46 ± 0.015로 증가하였고, 헤모글로빈은 155 ± 5.3 g/L로 증가하였다. 혈장 아미노산의 휴식기 수준의 상관 분석에 의하면, 트레오닌은 헤모글로빈의 휴식기 혈액 수준과 강한 상관 관계를 갖는 유일한 아미노산이었음을 나타냈다. 보충 기간 후, 다수의 아미노산은 헤모글로빈과 강한 연관성을 나타냈으며, 이때 히스티딘, 발린, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민 및 라이신은 R2>0.98을 나타냈다. 초기 낮은 헤모글로빈(117 g/L)을 갖는 추가의 말에서, 동물은 땀에서 손실된 주요 아미노산 성분을 나타내는 것으로 확인된 오직 14종의 아미노산(세린, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 라이신, 아스파르트산, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌, 및 티로신)만을 함유하도록 제형화된 아미노산 보충물이 1일 30 g으로 제공되었다. 아미노산의 비율은 이들 동물의 땀에서의 아미노산에 대해 관찰된 상대적 손실을 반영하도록 조정되었다. 이들 아미노산은 적절한 비율로 미리 혼합되었고, 60 mL 시린지를 통한 페이스트 전달 시스템의 생성을 돕기 위해 첨가된 크산탄 검과 3:1로 물과 함께 배합되었고, 이는 동물에게 잘 수용되었다. 페이스트는 1회 제공당 500 mg 글루코스와 함께 30 g의 아미노산을 포함하였다. 헤모글로빈은 보충하고 4일 후 125 g/L로 증가하였다. 헤모글로빈은 보충하고 13일 후 132 g/L로 더 증가하였다. 13일의 기간에는, 적혈구 수도 6.9 x 1012/L에서 7.7 x 1012/L로 증가하였다. 이들 데이터는 아미노산 보충이, 특히 개시 수준이 140 g/L 미만인 경우에, 헤모글로빈 수준을 상승시킬 수 있음을 뒷받침한다.
제1 코호트로부터의 수행 평가에 의해, 운동을 완료하고 10분 후에 측정된 평균 회복 심박수는 보충 전 83.3 ± 5.6 bpm에서 보충 기간 후 77.2 ± 4.3 bpm(P<0.05)으로 감소되었음을 보여주었다. 동물의 상태는 연구 기간 내내 모니터링되었고, 조련사는 두 연구 코호트에서 각각의 동물에 대한 귀중한 피드백을 제공하였으며, 이는 표 9에 요약되어 있다. 말 조련사에 의해 주관적으로 평가되고 보고된 주요 특징은 보충이 건강, 웰빙(well-being) 및 수행을 포함한 다양한 개선을 초래했다는 것이었다. 시험 기간 동안 개선된 털, 밝은 눈뿐만 아니라 더 우수한 경주 상태 유지 및 근육량의 발달을 언급하는 코멘트가 특히 주목되었다.
2개의 코호트의 분석에 의해, 아미노산의 땀 촉진된 손실(SFLAA)은 추정 1.6 g 내지 3 g의 유리 아미노산을 손실한 말의 훈련 또는 운동 요법 동안 상당할 수 있음을 보여주었다. 이러한 손실은 이화 반응을 통한 아미노산의 근육 저장소의 이용 요구의 즉각적인 증가를 초래할 것이다. 문맥에서 이를 설정하기 위해, 말의 혈장 용적은 품종과 체력 및 수화(hydration) 수준 사이에서 가변적이지만, 평균 450 kg 말은 대략 16 L의 혈장 용적 및 대략 20 L의 상응하는 적혈구 용적을 가질 것이다. 따라서 16 L 혈장 용적에서 총 아미노산 로딩은 본 연구에서 말의 2개의 코호트에서 3.8 g 내지 4.3 g으로 계산되었다. 상기 계산을 토대로, 아미노산의 혈장 로딩 중 대략 40% 내지 70%는 운동 중 땀을 통해 손실되어 발한을 통한 체질량의 1% 감소를 초래할 수 있다. 이는 발한이 근육 저장 단백질의 이화 턴오버를 통해 순환계로 들어가려는 아미노산의 요구를 증가시켰음을 나타냈다. 따라서, 땀을 통한 아미노산의 손실이 에너지 생산(글루코스-알라닌 사이클), 산소 전달, 근육 복구 및 회복을 포함하는 대사 과정을 유지하기 위해 요구되는 혈장 수준을 보충하기 위해 근육 저장소에 대한 추가의 요구를 제기할 것이라고 주장되었다.
[표 9]
Figure pct00009
이러한 1.6 g 내지 3 g의 유리 아미노산 손실은 이화 반응을 통한 아미노산의 근육 저장소의 이용 요구의 즉각적인 증가를 초래할 것이다. 단백질 분해는 에너지 생산(글루코스-알라닌 사이클), 산소 전달 및, 및 근육 복구 회복을 포함하는 유지적 대사 과정에 요구되는 아미노산의 대체를 가능하게 할 것이다. 땀의 아미노산 프로파일과 혈장의 상응하는 수준의 비교에 의해, 모든 연구에서 혈장의 상응하는 수준에 비해 상당히 더 높은 농도로 땀에서 존재하는, 유형 A로 지칭되는 6개의 아미노산 그룹, 및 연구 중 하나에서 혈장과 비교하여 땀에서 상당히 더 높은 유형 B 아미노산을 보여주었다.. 이들 아미노산 중 일부는 비-필수 아미노산이었고, 말에 의해, 그러나 장기간 운동 또는 열의 노출 조건 하에 합성될 수 있으며, 합성이 수요를 충족시킬 수 없으면 이러한 대사물은 조건적으로 필수적일 수 있다. 세린은 땀에서 측정된 주요 아미노산이었다. 세린 및 이의 유도체는, 단백질 합성을 위한 요구 외에도, 포스파티딜세린, 포스포티딜콜린 및 포스포티딜에탄올아민과 같은 주요 막 인지질에서 작용기를 형성한다. 세린은 말 혈장에서 가장 풍부한 아미노산인 글리신의 합성을 위한 직접적인 전구체이다. 세린으로부터 글리신의 형성은 또한 핵산의 합성에 필수적인 테트라하이드로폴레이트로부터 메틸렌-테트라하이드로폴레이트를 생성한다. 따라서 체내 공급이 수요를 따라갈 수 없다면 세린의 상당한 땀 촉진된 손실은 수행 및 회복에 영향을 미치는 광범위한 대사 결손을 야기할 수 있다.
제1 코호트에 사용된 보충제는 인간의 피로를 해결하도록 고안된 상업적 아미노산 보충물을 이용했으며(던스탄 2013, 2014), 반면 제2 코호트는 구체적으로 유형 A 아미노산으로 확인된 아미노산을 제공함으로써 말에서 발한을 통한 손실을 해결하도록 고안된 보충물로 시험되었다. 제형은 혈장에 비해 땀에서 최고 농도를 나타내는 6개의 아미노산: 세린, 라이신, 히스티딘, 류신, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하였다. 말의 땀에서 손실된 주요 성분으로서의 이들 아미노산은, 나머지 40%를 구성하는 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌 및 티로신과 더불어, 제형에서 아미노산의 60%를 나타냈다. 발린은 잠재적인 고손실 필수 아미노산으로 포함되었고, 글리신은 땀에서의 이의 농도가 혈장에서와 동일하지만, 땀에서 손실된 두 번째 또는 세 번째로 가장 풍부한 아미노산을 나타냈기 때문에 포함되었다.
40일에 걸친 아미노산 보충의 주요 결과는, 두 제품 모두 휴식기 혈장 수준을 각각 2,674 ± 41 μmol L-1 및 2,663 ± 124 μmol L-1의 등가 수준까지 상승시킨다는 것이었다. 이 결과는, 보충 과정이 두 코호트 모두에서 말의 아미노산 항상성을 변경시키는데 효과적이었음을 입증하였다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 유사한 수준으로 평균 총 아미노산 농도의 상승은 훈련 및 정규 작업 조건 하에서 보충에 의해 추가로 증가되지 않을 수 있는 아미노산(POLAA)의 혈장 최적화된 수준이 존재한다는 가설을 시사한다. 작업을 쉬었던 말로부터의 데이터는, 혈장 내 총 아미노산 농도가 작업중인 말에서 보충 후 평가된 POLAA보다 대략 30% 더 높은 수준까지 증가하였음을 보여주었다. 이는 정기적인 격렬한 훈련 및 경주 조건 하에서, 동물이 더 낮은 수준의 순환 혈장 아미노산과 함께 상이한 항상성으로 작용한다는 것을 반영하여 해석되었다. 고강도 훈련 조건 하에서, 지속적인 1일 운동 사이클은 근육 저장고로부터 아미노산을 제공하는 이화 반응의 활성화를 필요로 한다. 운동 후, 말은 보충 및 회복을 위한 제한된 시간이 있어 전신 대사를 위한 아미노산 전달에 과도한 수요가 발생할 수 있다. 휴식 기간 후, 저장고는 보충되고, 항상성은 일하지 않는 말에서 관찰된 바와 같이 더 높은 수준의 혈장 아미노산 농도로 이동된다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은, 과도한 훈련 또는 감염성 공격에 의해 자극된 장기간 이화 작용은 신체가 신규 합성(de novo synthesis)을 통해 수요를 충족시키지 못하는 경우 아미노산 저장고를 감소시킬 수 있다고 제안한다. 또한 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은, 총 아미노산 수준에 대한 간단한 혈장 검사가 훈련 및 경주 기간 동안 수행 및 상태를 최적화하기 위한 보충 요건을 결정하기 위해 말의 아미노산 상태 표시를 제공할 것이라고 제안한다. 이는 훈련 기간 내내 투여 수준을 관리하고 최적화하기 위한 툴을 제공할 것이다.
여기서 기재된 결과는, 14가지 아미노산의 단순화된 제형이, 20가지 아미노산, 프럭토-올리고당(FOS), 말산, 시트르산, 석신산, 리보오스, 및 13가지 미네랄 및 13가지 비타민을 함유하는 더 복잡한 Fatigue Reviva™ 제형만큼 POLAA를 달성하는데 효과적이었음을 나타냈다. 제2 코호트에서 사용된 보충물은 동물의 웰빙에 잠재적인 이익을 줄 수 있는 프롤린, 류신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 시스틴 및 아스파르트산을 포함한 제형에 포함된 주요 아미노산 수준이 더 높은 말을 산출하였다.
땀에서 아미노산의 상응하는 수준도 보충 후 상당히 증가하였다. 이는 보충 후 3,213 ± 411 μmol L-1에서 8,682 ± 563 μmol L-1로 증가한 제2 코호트에서 더 현저했다(표 8). 땀 내 아미노산의 더 높은 수준은 주로 제2 보충물의 주요 성분인, 세린, 글리신, 알라닌, 류신, 라이신 및 글루탐산의 차이에 기인하였다. 이러한 결과는 땀 촉진된 손실에 기초하여 제형화된 보충물이 아미노산을 전달할 때 매우 효율적이었음을 나타내는 것으로 해석되었다. 보충 후 땀에서 아미노산 조성의 증가는 또한 말에서 수집된 땀에서 측정된 아미노산이 말의 대사 항상성 및 영양 상태를 반영한다는 것을 시사한다.
두 코호트 모두에서 조련사의 피드백은, 보충이 근육량의 발달, 윤이 나는 털, 밝은 눈 및 장기간 열심히 일할 수 있는 능력을 유지하면서, 말의 일반적인 상태와 관련하여 이익을 제공한다는 중요한 주관적 증거를 제공하였다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 더 높은 수준의 혈장 아미노산은 산소 전달, 근육 성장 및 운동 회복 과정을 유지하는 작업 및 단백질 합성 동안 에너지 공급을 잠재적으로 더 잘 지원할 수 있을 것이라고 제안된다. 이는 보충 기간 후 헤모글로빈 수준의 증가를 나타내는 2마리의 말과 함께 보충 기간 동안 체중의 유지를 나타내는 표 9의 결과에 의해 입증된다.
참고 문헌
Dunstan, R. H., Sparkes, D. L., Roberts, T. K., Crompton, M. J., Gottfries, J., & Dascombe, B. J. (2013). Development of a complex amino acid supplement, Fatigue Reviva™, for oral ingestion: initial evaluations of product concept and impact on symptoms of sub-health in a group of males. Nutrition journal, 12(1), 115.
Dunstan, R. H., Sparkes, D. L., Roberts, T. K., & Dascombe, B. J. (2014). Preliminary evaluations of a complex amino acid supplement, fatigue revivaTM, to reduce fatigue in a group of professional male athletes and a group of males recruited from the general public. FNS, 5, 231-235.
Evans, C. R. Hugh Dunstan, Tony Rothkirch, Tim K. Roberts1, Karl L. Reichelt, Robyn Cosford, Gary Deed, Libby B. Ellis, Diane L. Sparkes. (2008) Altered amino acid excretion in children with autism, Nutritional Neuroscience 11 (1), 9-17. IF = 1.3
Macintosh, B. R., & Rassier, D. E. (2002). What is fatigue? Canadian Journal of Applied Physiology, 27(1), 42-55.
McDonald, R. E., Fleming, R. I., Beeley, J. G., Bovell, D. L., Lu, J. R., Zhao, X., . . . Kennedy, M. W. (2009). Latherin: A surfactant protein of horse sweat and saliva. PLOS One, 4(5), e5726.
Niblett, S. N. (2007). Hematologic and urinary excretion anomalies in patients with chronic fatigue syndrome. Exp Biol Med, 232, 1041-1049.

Claims (40)

  1. 히스티딘, 세린 및 라이신을 포함하는 아미노산 조성물로서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 25%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 30% 내지 50%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 히스티딘, 세린 및 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 32% 내지 47%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 10% 내지 21%를 구성하고, 세린은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 13% 내지 16%를 구성하고, 라이신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 9% 내지 10%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 오르니틴 및 글리신 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 아미노산 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 존재하는 경우, 오르니틴은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 12%를 구성하고, 글리신은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 8%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 40%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 오르니틴 및 글리신을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 50% 내지 80%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글루타민, 글루탐산, 류신 및 아스파르트산 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 아미노산 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 존재하는 경우, 글루타민 및/또는 글루탐산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 10%를 구성하고, 류신은 적어도 약 10%를 구성하고, 아스파르트산은 적어도 약 7%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 35%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 40% 내지 60%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  14. 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신을 포함하는 아미노산 조성물로서, 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 30%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 60%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 64%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 76%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  18. 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘 및 프롤린을 포함하는 아미노산 조성물로서, 세린, 알라닌, 글리신, 히스티딘 및 프롤린은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 20%를 구성하는, 아미노산 조성물.
  19. 세린, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 라이신, 아스파르트산, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 트레오닌, 및 티로신을 포함하는 아미노산 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 식이 보충물인, 아미노산 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 대상체에서 운동, 병 또는 부상(injury)으로부터의 회복을 촉진하거나 돕는, 아미노산 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 고온 기후에서의 생존을 돕는, 아미노산 조성물.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 운동 수행을 촉진하거나 돕는, 아미노산 조성물.
  24. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 운동, 병 또는 부상으로부터의 회복을 촉진하거나 돕는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 병은 만성 피로인, 방법.
  26. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 고온 기후에서 대상체의 생존을 돕는 방법.
  27. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 운동 수행을 촉진하거나 돕는 방법.
  28. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 혈액에서 헤모글로빈 및/또는 적혈구용적률(haematocrit) 수준을 증가시키는 방법.
  29. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 노인에게 영양 지원을 제공하는 방법.
  30. 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 아미노산 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 피로를 감소시키는 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 투여되는 조성물은 히스티딘, 라이신, 세린, 오르니틴 및 글리신을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 50% 내지 80%를 구성하는, 방법.
  33. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 말인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 투여되는 조성물은 히스티딘, 세린, 라이신, 글루타민 및/또는 글루탐산, 류신 및 아스파르트산을 포함하며, 이들 아미노산은 조성물 내 아미노산의 총 중량의 약 35% 내지 60%를 구성하는, 방법.
  35. 대상체에게 투여될 식이 보충물을 결정하는 방법으로서,
    a) 대상체가 땀을 흘리기에 충분한 운동을 하는 단계;
    b) 상기 땀에서 아미노산 조성을 결정하는 단계;
    c) 상기 땀의 총 아미노산 농도에 기초하여 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 약 4,000 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 '낮은' 프로파일을 나타내고, 약 4,000 μmol L-1 내지 10,000 μmol L-1은 '중간' 프로파일을 나타내며, 약 10,000 μmol L-1 초과는 '높은' 프로파일을 나타내며;
    아미노산의 낮은, 중간 또는 높은 땀-촉진된 손실 프로파일로 대상체를 분류하여 투여될 보충물, 및 선택적으로 투여될 상기 보충물의 양 또는 투여량을 결정하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 대상체에 대한 아미노산의 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 추가로 땀에서 개별 아미노산 농도를 결정하는 것을 포함하며, 여기서: (i) 땀에서 아미노산의 적어도 약 50%를 구성하는 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘이 '낮은' 프로파일을 나타내며, 세린이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (ii) 땀에서 아미노산의 적어도 약 70%를 구성하는 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신이 '중간' 프로파일을 나타내며, 오르니틴이 땀의 주요 아미노산 성분이고; (iii) 땀에서 아미노산의 적어도 약 60%를 구성하는 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신이 '높은' 프로파일을 나타내며, 히스티딘이 땀의 주요 아미노산 성분인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 아미노산의 '낮은' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것이며, 여기서 세린, 글리신, 알라닌 및 히스티딘은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 60%를 구성하는, 방법.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 아미노산의 '중간' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것이며, 여기서 오르니틴, 세린, 히스티딘 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 64%를 구성하는, 방법.
  39. 제35항 또는 제36항에 있어서, 아미노산의 '높은' 땀-촉진된 손실 프로파일의 결정은 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신을 포함하는 대상체에 대한 아미노산 보충물을 권고하는 것이며, 여기서 히스티딘, 세린, 오르니틴 및 글리신은 함께 조성물 내 아미노산의 총 중량의 적어도 약 76%를 구성하는, 방법.
  40. 대상체에게 투여될 식이 보충제를 위한 요건을 결정하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; 및
    b) 상기 혈장에서 총 아미노산 조성을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 약 2,800 μmol L-1 미만의 아미노산 농도는 보충제의 필요를 지시하는 아미노산의 '낮은' 작동 수준을 나타내는, 방법.
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