CN112362785B - 一组诊断标志物在诊断精索静脉曲张所致弱精子症中的应用 - Google Patents
一组诊断标志物在诊断精索静脉曲张所致弱精子症中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一组诊断标志物在诊断精索静脉曲张所致弱精子症中的应用，属于临床检验诊断领域。具体来说，本发明提供该诊断标志物在制备用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒和检测仪器方面的应用，所述诊断标志物为乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺。采用乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺联合诊断精索静脉曲张所致弱精子症，具有特异性强、灵敏度高、只需痕量样本的特点。同时检测乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺，能够快速诊断精索静脉曲张所致弱精子症，为精索静脉曲张所致弱精子症的早期预警、临床诊断、治疗及预后评价提供重要依据。
Description
技术领域
本发明属于临床检验诊断领域，具体涉及一组诊断标志物在诊断精索静脉曲张所致弱精子症中的应用。
背景技术
弱精子症是导致男性不育的主要原因。流行病学和临床研究均证实精索静脉曲张男性罹患弱精子症风险大增。
目前临床主要通过测定精子数量，结合精子活力形态等精液参数诊断弱精子症，至少检查两次；且精液参数检查只限于针对生殖道感染、染色体异常等病因，尚无针对精索静脉曲张所致弱精子症诊断的特异性指标，也就是说现有检测方法仅能检测出患者是否患病，但是不能检测出是由精索静脉曲张所致弱精子症。
发明内容
本发明的目的是提供一组诊断标志物在诊断精索静脉曲张所致弱精子症中的应用，具体来说是一组诊断标志物在制备用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒和检测仪器方面的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一组诊断标志物在制备用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒和检测仪器中的应用，所述诊断标志物为乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺。
在本发明中，所述试剂盒中含有乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺标准品。
在本发明中，所述试剂盒中含有内标化合物和外标化合物的标准品。
在本发明中，所述试剂盒或检测仪器的检测物质为精液。
本发明还提供一种用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒，包括乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺标准品。
在本发明中，包括内标化合物和外标化合物的标准品。
有益效果：本发明通过气相色谱-质谱技术对患者的精液进行痕量代谢组学分析，发现正常人群和精索静脉曲张人群之间的差异代谢物；进一步通过该技术分析正常人群与精索静脉曲张且弱精子症患者之间的差异代谢物；最终找到由精索静脉曲张引起的弱精子症患者的特异性差异代谢产物，即精索静脉曲张所致弱精子症的诊断标志物。采用乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺联合诊断精索静脉曲张所致弱精子症，具有特异性强、灵敏度高、只需痕量样本的特点。同时检测乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺，能够快速诊断精索静脉曲张所致弱精子症，为精索静脉曲张所致弱精子症的早期预警、临床诊断、治疗及预后评价提供重要依据。
附图说明
图1是正常对照组、精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症三组总离子流谱图(TIC图)，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应值(mAU)；图1(A)正常对照组TIC图；图1(B)精索静脉曲张组TIC图；图1(C)精索静脉曲张且弱精子症组TIC图。
图2是正常对照组和精索静脉曲张组的PCA，PLS-DA得分图，横坐标为主成分1，纵坐标为主成分2。图2(A)是正常对照组和精索静脉曲张组的PCA得分图(R2＝0.728，Q2＝0.249)，图2(B)正常对照组和精索静脉曲张组的PLS-DA得分图(R2X＝0.295，R2Y＝0.917，Q2＝0.704)。
图3是正常对照组和精索静脉曲张所致弱精子症组的PCA，PLS-DA得分图，横坐标为主成分1，纵坐标为主成分2。图3(A)是正常对照组和精索静脉曲张所致弱精子症组的PCA得分图(R2＝0.659，Q2＝0.34)，图3(B)是正常对照组和精索静脉曲张所致弱精子症组的PLS-DA得分图(R2X＝0.442，R2Y＝0.979，Q2＝0.886)。
图4是正常组对照、精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症三组的PCA，PLS-DA得分图，横坐标为主成分1，纵坐标为主成分2。图4(A)是正常组对照组、精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症组3组的PCA得分图(R2＝0.686，Q2＝0.338)，图4(B)是正常组对照组、精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症组3组的PLS-DA得分图(R2X＝0.55，R2Y＝0.944，Q2＝0.815)。
图5是训练集及测试集下的ROC曲线，图5(A)是训练集ROC曲线，图5(B)是测试集ROC曲线，横坐标为假阳性率(1-特异性)，纵坐标为真阳性率(灵敏度)。
图6显示了正常对照组与精索静脉曲张且弱精子症组的预测准确度，图6(A)显示了训练集预测准确度，图6(B)显示了测试集预测准确度，纵坐标为乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺联合诊断的预测概率值，A为正常对照组，B为精索静脉曲张且弱精子症组。当预测概率值大于或等于Cut-off值时，判为阳性，即为患精索静脉曲张所致弱精子症。
具体实施方式
下面结合实例来进一步说明本发明内容。
实施例1精索静脉曲张所致弱精子症患者潜在生物标志物的筛选
1.样本基本信息
收集初次门诊无用药史、且排除其它明显临床病因(染色体异常、感染、肥胖和环境因素)的精索静脉曲张(DR≥1.8mm)且弱精子症患者(精子浓度≥15×106个/ml，精子总活力<40％或前向运动<32％)的精液样本作为“精索静脉曲张且弱精子症组”，样本数量n＝24。使用彩色多普勒超声诊断平静呼吸时精索静脉的最大内径(DR)，超声平静呼吸时DR<1.8mm为精索静脉正常，DR≥1.8mm为精索静脉曲张。其中，精子总活力是指前向运动和非前向运动的精子数占精子总数的百分率，缩写为PR+NP，非前向运动精子是指活动精子中非前向运动的精子。“前向运动<32％”、“前向运动＞32％”中的前向运动是指前向运动精子数占精子总数的百分率，缩写为PR。
取精索静脉正常(DR<1.8mm)且精液参数正常(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP＞40％且PR＞32％)的男性精液作为“正常对照组”,样本数量n＝28。
取精索静脉曲张(DR≥1.8mm)且精液参数正常(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP＞40％且PR＞32％)的男性精液作为“精索静脉曲张组”，样本数量n＝30。
2.仪器与方法
2.1仪器与试剂
仪器：气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)Agilent 7890A-5975C。
色谱柱：HP-5MS capillary column毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，购自Agilent J&W Scientific。
试剂：甲醇、庚烷、肉豆蔻酸-d27、肉豆蔻酸甲酯、甲氧胺、吡啶、三甲基氯硅烷(缩写为TMCS)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氯乙酰胺(缩写为MSTFA)为美国Merck公司色谱级试剂。
2.2样本的前处理条件
对本实施例标题1中各样本分别进行如下前处理：取出精液100μL，加入400μL浓度为15μg/mL的肉豆蔻酸-d27的甲醇溶液，涡旋10分钟，4℃下14000rpm离心10分钟，取上清液350μL真空挥干3小时，加入40μL浓度为15mg/ml的甲氧胺的吡啶溶液，室温衍生化16小时，加入40μL三甲基硅烷化试剂室温反应1小时，加入40μL浓度为30μg/mL的肉豆蔻酸甲酯的庚烷溶液，涡旋10min，在4℃、14000rpm离心10min，取75μL上清入内衬管进样。其中三甲基硅烷化试剂是MSTFA和TMCS按照体积比为100:1混合所得。其中肉豆蔻酸-d27是内标化合物，肉豆蔻酸甲酯是外标化合物。
2.3气相色谱条件
进样量：1μL；进样口温度：250℃；进样口压力：8.8085pai；载气为高纯氦气，载气流速：1mL/min；升温程序：70℃保持3min，再以10℃/min的速率线性升温至310℃，310℃保持6min。
2.4质谱条件
溶剂延迟时间：5min；数据采集模式：全扫描方式(scan)；扫描范围：m/z 50-550。
3.数据分析
3.1精液特征色谱图
按照前述的气相色谱-质谱条件，对前处理后的各组样本进行分析，各组样本典型总离子流图(TIC)见图1。
3.2数据预处理
利用气相色谱-质谱自带软件Automated Mass Spectral Deconvolution System(AMDIS)对所有总离子色谱图解卷积分析，分别对色谱峰进行基线过滤(去除信噪比>30的峰)，峰匹配，初步解析各色谱峰的碎片离子、保留时间和峰面积。参照National instituteof standards and technology(NIST)，Wiley library，Fiehn对各色谱峰进行鉴定。各色谱峰的峰面积由GCMSD Data Analysis软件自动积分所得。根据内标化合物、外标化合物的峰面积进行积分，将峰面积表导入SIMCA-P 14.1软件进行多元统计分析。
3.3多元统计分析
为了考察精索静脉曲张且弱精子症组、精索静脉曲张组与正常对照组间的代谢变化，采用无监督的PCA和有监督的PLS-DA的分析方法来表征差异。结果见图2和图3。
相应模型的评价指标为R2、R2X、R2Y和Q2，其中R2、R2X代表模型解释的所有GC-MS响应变量(自变量X)的百分比，R2Y代表模型解释的样本变量(因变量Y)的百分比，Q2代表模型能够预测样本变量的程度，它们的范围在0-1之间，越接近1说明模型的解释能力或预测能力越强。
根据正常对照组与精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症组的PCA、PLS-DA得分图可以看出，正常对照组与精索静脉曲张组、精索静脉曲张且弱精子症组有一定的分离趋势。为了表征各组之间整体的差异情况，对三组整体进行PCA与PLS-DA分析，见图4。
从三组的PCA，PLS-DA的得分图(图4)可以看出，正常对照组和精索静脉曲张组，正常对照组和精索静脉曲张且弱精子症组均有一定分离趋势。PLS-DA的拟合度和预测能力均良好。
在建立模型有效的基础上，综合以下指标：PLS-DA模型相应的变量重要性投影(Variable importance in the projection，VIP)、代谢物倍数变化(Fold Change，缩写为FC)以及单变量统计分析所得p值。VIP值表征代谢物对PLS-DA模型分组的贡献大小，代谢物的VIP值越大，其对组间分类的贡献越大，VIP值大于1有意义。Fold Change为两组数据的比值，p<0.05为显著性差异的统计阈值。因此，将VIP>1，p<0.05的代谢物认为是差异代谢物。
接着将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比对，如HMDB(http://www.hmdb.ca)和KEGG(http://www.kegg.jp)，最后确定了乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺为诊断精索静脉曲张致弱精子症的潜在生物标志物(见表1)。
表1潜在生物标志物的分析
实施例2精索静脉曲张所致弱精子症患者潜在生物标志物的分析及验证
训练集样本：包括正常对照组22例和精索静脉曲张且弱精子症组26例。精索静脉曲张且弱精子症组的每例样本要满足如下条件：初次门诊无用药史、且排除其它明显临床病因(染色体异常、感染、肥胖和环境因素)的精索静脉曲张(DR≥1.8mm)且弱精子症患者(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP<40％或PR<32％)的精液样本。正常对照组的每例样本要满足如下条件：精索静脉正常(DR＜1.8mm)且精液参数正常(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP＞40％且PR＞32％)的男性精液。
测试集样本：包括正常对照组12例和精索静脉曲张且弱精子症组15例。精索静脉曲张且弱精子症组的每例样本要满足如下条件：初次门诊无用药史、且排除其它明显临床病因(染色体异常、感染、肥胖和环境因素)的精索静脉曲张(DR≥1.8mm)且弱精子症患者(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP<40％或PR<32％)的精液样本。正常对照组的每例样本要满足如下条件：精索静脉正常(DR<1.8mm)且精液参数正常(精子浓度≥15×106个/ml，PR+NP＞40％且PR＞32％)的男性精液。
利用受试者工作曲线(ROC)分别来考量训练集样本和测试集样本中四个诊断标志物乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺用于精索静脉曲张所致弱精子症的诊断性能，ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异性)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线越靠近左上角,标志物的诊断准确性就越高，最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。
计算4个潜在标志物的联合诊断ROC曲线下面积(AUC)可判断潜在标志物的诊断价值，AUC越大其诊断价值就越大。AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。另外，计算灵敏度和特异性。
结果：4个潜在诊断标志物的联合诊断曲线在训练集和测试集中的曲线下面积(AUC)见图5。训练集中，曲线下面积(AUC)为0.988，最优灵敏度为100％，最优特异性为90.91％；测试集中，曲线下面积(AUC)为0.983，最优灵敏度93.33％，最优特异性91.67％。在训练集中，基于最优灵敏度和特异性，得到的最优临界值(cut-off value)为0.392。在测试集中，基于最优灵敏度和特异性，得到的最优临界值(cut-off value)为0.446。
运用该最优临界值进行样本预测，以预测正确的样本数除以总样本数即为4种生物标志物组区分正常组与精索静脉曲张且弱精子症组患者的准确度。结果：如图6，此4种生物标志物联合诊断对训练集的预测准确率为95.83％，对测试集的预测准确率为92.59％。
综上所述，本发明针对精索静脉曲张所致弱精子症筛选诊断标志物，具有特异性强、灵敏度高、只需痕量样本的特点。
本发明能够快速预测精索静脉曲张所致弱精子症，为精索静脉曲张所致弱精子症的早期预警、临床诊断、治疗及预后评价提供重要依据。
实施例3用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒和检测仪器
用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒，包括用于检测乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺含量的试剂。
用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的检测仪器，该仪器可以检测精液中乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺含量。
Claims (4)
1.一组诊断标志物在制备用于诊断精索静脉曲张所致弱精子症的试剂盒和检测仪器中的应用，所述诊断标志物为乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述试剂盒中含有乳酸、甲基马来酸、琥珀酸和天冬酰胺标准品。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于所述试剂盒中含有内标化合物和外标化合物的标准品。
4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于所述试剂盒或检测仪器的检测物质为精液。
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