ES2905305T4 - Tratamiento de la fenilcetonuria con BH4 - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

T ratamiento de la fenilcetonuria con BH4

Antecedentes

Campo

La presente invención se refiere, de forma general, a la intervención terapéutica de trastornos metabólicos, en particular los que implican el metabolismo de aminoácidos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un polimorfo cristalino de BH4 para su uso en el tratamiento de un sujeto con fenilcetonuria (“phenylketonuria”, PKU), en el que la BH4 se administra una vez al día en una sola dosis.

Antecedentes de la tecnología relacionada

La fenilcetonuria (PKU) es un trastorno metabólico heredado que se identificó por primera vez en la década de 1930. En la mayor parte de casos, y hasta la mitad de la década de 1990, se pensaba que era un trastorno del metabolismo de los aminoácidos que surge de una deficiencia en la enzima hepática fenilalanina hidroxilasa (PAH). Las deficiencias de PAH, a su vez, dan como resultado un exceso de fenilalanina (Phe) en el cerebro y el plasma. La deficiencia de PAH finalmente se manifiesta en una carencia de tirosina, que es un precursor de neurotransmisores.

Si queda sin detectar y sin tratar al principio de la vida de un bebé, la PKU conduce a una lesión irreversible del sistema nervioso, retraso mental grave y escaso desarrollo del cerebro. Los rasgos diferentes al retraso mental en pacientes no tratados incluyen calcificación cerebral, pigmentación escasa, peculiaridades en la deambulación, postura, y postura estando sentado, eccema, y epilepsia. Se ha notificado que un bebé padece una pérdida de 50 puntos de CI en el primer año de su infancia, y la PKU está invariablemente acompañada por al menos algo de pérdida de CI. Una vez detectada, la afección se trata proporcionando al bebé, y posteriormente al niño, una dieta baja en Phe. En adultos, los suplementos de proteínas tomados normalmente por los pacientes de PKU clásica pueden estar exentos de Phe con la suposición de que tales adultos recibirán suficiente cantidad de Phe a través del resto de la dieta, controlada según un régimen estricto, de forma que la dieta globalmente es una dieta baja en Phe. Asimismo, las mujeres embarazadas que padecen esta enfermedad reciben la recomendación de seguir una dieta que sea baja en Phe para evitar el riesgo de alteraciones en el desarrollo del feto y malformación congénita (síndrome de PKU materna).

En los últimos años, se ha demostrado que los síntomas patológicos que se manifiestan por la afección de un exceso de Phe, denominados colectivamente hiperfenilalaninemia (HPA), se pueden clasificar en varios trastornos individuales, que se diagnostican de acuerdo con las concentraciones de Phe en plasma y la sensibilidad a un cofactor de PAH. A un nivel inicial, las HPA se pueden dividir en HPA causada como resultado de una deficiencia en el cofactor 6R-L-eritro-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4; PKU maligna) y HPA como resultado de una deficiencia de PAH. Esta última categoría se subdivide a su vez en al menos tres categorías dependiendo de la concentración de Phe en plasma en ausencia de intervenciones en la dieta o cualquier otra intervención terapéutica (denominada en el presente documento como “concentración de Phe en plasma no restringida”).

La homeostasis normal de la Phe en plasma está estrechamente controlada, dando como resultado una concentración de Phe en plasma de 60 pmol/l ± 15 pmol/l. La PKU clásica (OMIM n.° 261600) es la forma más grave de la PKU y es resultado de mutaciones en PAH insignificantes o graves, que conducen a concentraciones de Phe en plasma no restringidas mayores que 1200 pmol/l cuando se deja sin tratamiento. Los individuos con la PKU clásica (o grave) deben tratarse con un régimen dietético estricto que se basa en una dieta muy baja en Phe para reducir sus concentraciones de Phe a un intervalo seguro. Las formas más leves de HPA también se han caracterizado. Una forma menos grave de la PKU es la que se manifiesta por concentraciones de Phe en plasma de 10-20 mg/dl (600­ 1200 pmol/l), y se denomina por lo general "PKU leve". Esta forma moderada de la PKU se gestiona mediante el uso de restricciones dietéticas moderadas, por ejemplo, una dieta baja en proteínas totales, pero, por lo demás, no necesariamente exenta de Phe. Finalmente, la HPA leve, también denominada benigna o HPA no PKU se caracteriza por concentraciones de Phe en plasma de entre 180-600 pmol/l. Los individuos con HPA no PKU no se tratan de forma habitual ya que se considera que tienen unos niveles de Phe en plasma que se encuentran dentro del intervalo "seguro". Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, estos niveles de Phe siguen siendo significativamente elevados en estos individuos en comparación con los sujetos normales no PKU y pueden presentar secuelas perjudiciales al menos en mujeres embarazadas y pacientes muy jóvenes. Para un análisis más detallado de la HPA como resultado de la deficiencia en PAH, los expertos en la técnica deben dirigirse a Scriver et al., 2001 (Hyperphenylalaninemia: Phenylalanine Hydroxylase Deficiency, en: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8a ed. New York: McGraw-Hill, 2001: 1667-1724). Las directrices de NIH indican que, para los niños con PKU, es preferible reducir la Phe en plasma a 360­ 420 pmol/l.

La HPA también surge de defectos en el metabolismo de BH4. La BH4 es un cofactor fundamental tanto de tirosina como de triptófano hidroxilasa, las enzimas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de los neurotransmisores dopamina y serotonina. Los efectos de las deficiencias de serotonina y dopamina se denominan colectivamente como HPA "atípica" o "maligna". Por tanto, el diagnóstico tradicional de la HPA ha implicado una determinación de si la HPA es el resultado de una deficiencia de BH4 o una deficiencia de PAH. Normalmente, el diagnóstico de la PKU se establece sobre la base de una concentración elevada persistente de Phe en sangre. Después de un cribado positivo para Phe elevada en sangre (Phe en plasma >120 pmol/l; Weglage et al., J. Inherit. Metab. Dis., 25:321-322, 2002), se realiza un cribado diferencial en el que se determina si la Phe elevada es el resultado de una deficiencia de BH4 o una deficiencia de PAH. El diagnóstico diferencial implica determinar si la concentración elevada de Phe disminuye como resultado de la administración de BH4 (ensayo de carga de BH4). El ensayo de carga de BH4 implica de forma típica una carga de una sola vez de BH4, por ejemplo, 5-20 mg/kg que se administran al sujeto que sigue una dieta normal (es decir, no restringida) y la determinación de si el sujeto experimenta una disminución en los niveles de Phe (véase, por ejemplo, Ponzone et al., Eur. J. Pediatr., 152:655-661,1993; Weglage et al., J. Inherit. Metab. Dis., 25:321-322, 2002).

Normalmente, los individuos que responden a un ensayo de carga de BH4 con una disminución en los niveles de Phe en plasma reciben el diagnóstico de tener un defecto en la homeostasis de BH4. Sin embargo, existen varios informes de pacientes con un tipo de sensibilidad a BH4 típica de la deficiencia en PAH (Kure et al., J. Pediatr., 135:375-378, 1999; Lassker et al., J. Inherit. Metabol. Dis., 25:65-70, 2002; Linder et al., Mol. Genet. Metab., 73:104-106, 2001; Spaapen et al., Mol. Genet. and Metabolism, 78:93-99, 2003; Trefz et al., 2001). Estos sujetos tienen unos niveles de Phe en plasma que son típicos de la PKU moderada, es decir, menos de 1000 pmol/l y típicamente menos de 600 pmol/l. Los pacientes que tienen la PKU clásica grave no son sensibles a los ensayos de carga de BH4 típicos de 24 horas (Ponzone et al., N. Engl. J. Med., 348(17):1722-1723, 2003).

Se ha sugerido que los individuos que son sensibles a BH4 no requieren intervención dietética, sino que, en su lugar, deben tratarse con BH4. Del mismo modo, se ha sugerido lo contrario para sujetos que han sido diagnosticados como no sensibles al ensayo de carga de BH4, es decir, estos sujetos deberían tratarse con restricción dietética y no con terapia de BH4. Ponzone et al. advirtieron especialmente que los individuos que tenían fenilcetonuria grave no respondían a la terapia con BH4 y que dicha terapia no debería usarse en dichos pacientes (Ponzone et al., N. Engl. J. Med., 348(17):1722-1723, 2003). Por tanto, en la actualidad existen diferentes regímenes terapéuticos para el tratamiento de la HPA dependiendo de si el individuo es sensible o no a BH4. Además, se ha sugerido que muy pocos pacientes se beneficiarán de la terapia con BH4. De hecho, se cree que los únicos individuos con una forma de HPA deficiente en PAH que se beneficiarían de la terapia con BH4 son los que tienen una PKU leve. Como estos individuos tendrán normalmente niveles de Phe en el intervalo seguro (es decir, menos de 600 pM), la patología se puede controlar usando una restricción dietética moderada (véase Hanley, N. Engl. J. Med., 348(17):1723, 2003). Por tanto, la terapia con BH4, por sí sola o combinada con cualquier otra intervención terapéutica, no se ha considerado como una intervención terapéutica viable para la gran mayoría de los individuos con HPA.

La BH4 es una amina biogénica de la familia de pterina natural. Las pterinas se encuentran en los tejidos y fluidos fisiológicos en formas oxidadas y reducidas, aunque solamente la 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina es biológicamente activa. Se trata de una molécula quiral, y se sabe que el enantiómero 6R del cofactor es el enantiómero biológicamente activo. Para un análisis detallado de la síntesis y los trastornos de BH4, véase Blau et al., 2001 (Disorders of tetrahydrobiopterin and related biogenic amines, en: Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., Childs B., Vogelstein B., eds., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a ed., Nueva York, McGraw-Hill, 2001, 1275-1776). A pesar de la elucidación del papel de la deficiencia de BH4 en la HPA, no se ha sugerido un tratamiento con BH4 porque dicho tratamiento es muy caro, tanto como 30.000 dólares estadounidenses anuales por adolescente o adulto, en comparación con los 6.000 dólares estadounidenses de la terapia dietética con restricción de fenilalanina (Hanley, N. Engl. J. Med., 348(17):1723, 2003). Otro problema significativo de la BH4 es que este compuesto es inestable y experimenta fácilmente una oxidación aerobia a temperatura ambiente (Davis et al., Eur. J. Biochem., vol.

173, 345-351, 1988; patente de Estados Unidos n.° 4.701.455) y tiene una caducidad inferior a 8 horas a temperatura ambiente (Berneggar y Blau, Mol. Genet. Metabol., 77:304-313, 2002).

Por tanto, hasta la fecha, la intervención dietética es la intervención terapéutica típica utilizada para todos los pacientes con PKU clásica grave y en muchos pacientes con PKU moderada. Dicha intervención dietética normalmente implica que el paciente se limite a alimentos que estén compuestos por alimentos naturales que estén exentos de Phe, o tengan un contenido bajo de Phe. Sin embargo, además de eliminar la Phe, dicho régimen alimenticio elimina muchas de las fuentes de otros aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. En consecuencia, sin suplementos, dicha dieta proporciona una cantidad inadecuada de proteínas, energía, vitaminas y minerales para mantener el crecimiento y desarrollo normales. Como la PKU es una manifestación de una falta de tirosina, que surge de la falta de hidroxilación de la fenilalanina, la tirosina se convierte en un aminoácido esencial y los suplementos dietéticos de PKU deben incluir un suplemento de tirosina. Por tanto, es habitual utilizar fórmulas nutricionales para complementar las dietas de los pacientes con PKU. Asimismo, para los bebés, es habitual utilizar fórmulas para lactantes que tengan un contenido bajo en Phe como la única o la principal fuente de alimentos.

Sin embargo, una restricción proteínica en la dieta es, en el mejor de los casos, una forma ineficaz de controlar la PKU en muchos tipos de pacientes. Por ejemplo, el tratamiento es de suma importancia durante el embarazo ya que los elevados niveles de Phe pueden dar como resultado un retraso intrauterino del desarrollo del cerebro. Sin embargo, una dieta baja en proteínas durante el embarazo puede dar como resultado un retraso en el desarrollo renal y, por tanto, se cree que ocasiona una reducción posterior en el número de nefronas y potencialmente conduce a hipertensión en el adulto (D'Agostino, N. Engl. J. Med., 348(17):1723-1724, 2003).

El mal cumplimiento del paciente de una dieta con restricción de proteínas resulta también un problema. Las fórmulas de proteínas exentas de Phe que están disponibles tienen un gusto amargo, lo que dificulta garantizar que el paciente consuma cantidades suficientes de la proteína para mantener la ingesta diaria necesaria de proteínas, aminoácidos, vitaminas y/o minerales. Este es un problema, en particular, con los niños mayores que pueden requerir hasta 70 g, en peso en seco, de las fórmulas por día. Por ejemplo, Schuett, V. E., 1990; Publicación DHHS n.° HRS-MCH-89-5, indica que más del 40 % de pacientes de PKU de ocho años de edad o mayores en EE. UU. no consiguen cumplir el tratamiento dietético (patente de Estados Unidos n.° 6.506.422). Muchos pacientes adolescentes no logran seguir rigurosamente la dieta con restricción de proteínas debido al temor por la respuesta de sus iguales.

Spaapen L. J. M. (2003), Molecular Genetics and Metabolism, 78(2), 93-99, se refiere a la sensibilidad a BH4 en pacientes deficientes en PHA, incluyendo PKU, y sus posibles mecanismos subyacentes, y describe el uso oral de 12­ 15 mg de BH4/kg/día divididos en tres dosis para el tratamiento de la PKU leve.

Blau et al., R. G. H. y Hyland, Keith (2001), “Disorders of tetrahydrobiopterin and related biogenic amines”, proporcionan un análisis general de los trastornos relacionados con la tetrahidrobiopterina y su tratamiento.

Neiderwiesser et al. (1987), European Journal of Pediatrics, vol. 146, n.° 3, págs. 228-232, describen la deficiencia en BH4 con HPA debida a una deficiencia o heterocigosidad en 6-piruvoíl tetrahidropterina sintasa incompleta.

Tanaka et al. (1989), European Journal of Pediatrics, vol. 148, n.° 5, págs. 450-452, también describen la deficiencia en BH4 debida a una deficiencia en 6-piruvoíl tetrahidropterina sintasa.

Munteanu et al., New England Journal of Medicine, vol. 37, n.° 26, págs. 2122-2132, describen el uso de la BH4 como un tratamiento alternativo para la fenilcetonuria leve.

Bernegger et al., Molecular Genetics and Metabolism, vol. 77, n.° 4, págs. 304-313, describen la sensibilidad a la BH4 entre las hiperfenilalaninemias, y Neiderwiesser et al. (1982), European Journal of Pediatrics, vol. 138, n.° 2, págs.

110-112, describen una fenilcetonuria atípica con un metabolismo de biopterina defectuoso.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un medicamento terapéutico para sustituir o complementar y aliviar las restricciones en la dieta a las que se somete un paciente PKU. La presente invención se dirige a resolver dicha necesidad.

Sumario de la invención

La invención describe la intervención en trastornos metabólicos, en particular los que implican el metabolismo de aminoácidos.

La presente invención se dirige a un polimorfo cristalino del clorhidrato de (6R)-L-tetrahidrobiopterina (BH4) para su uso en el tratamiento de un sujeto con fenilcetonuria (PKU), en el que la BH4 se administra en una sola dosis una vez al día, en el que la forma cristalina muestra un patrón de difracción de rayos X de polvos, expresado en valores de d (Á) en: 8,7 (vs), 6,9 (w), 5,90 (vw), 5,63 (m), 5,07 (m), 4,76 (m), 4,40 (m), 4,15 (w), 4,00 (s), 3,95 (m), 3,52 (m), 3,44 (w), 3,32 (m), 3,23 (s), 3,17 (w), 3,11 (vs), 3,06 (w), 2,99 (w), 2,96 (w), 2,94 (m), 2,87 (w), 2,84 (s), 2,82 (m), 2,69 (w), 2,59 (w), 2,44 (w).

Otras realizaciones de la invención se especifican en las reivindicaciones dependientes. Los aspectos y las realizaciones descritos en el presente documento que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención.

En un aspecto, la invención describe métodos para tratar la fenilcetonuria (PKU) clásica grave en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una dieta con restricción de proteínas junto con una composición que comprende el polimorfo de tetrahidrobiopterina (BH4), en los que la administración combinada de la dieta con restricción de proteínas y BH4 es eficaz para disminuir la concentración de fenilalanina en el plasma del sujeto en comparación con la concentración en ausencia de la administración combinada. En realizaciones específicas, el sujeto es un sujeto que no manifiesta una deficiencia en la homeostasis de BH4. El sujeto puede ser un individuo que no manifiesta síntomas de deficiencia del neurotransmisor L-dopa.

Un sujeto seleccionado para el tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención tendrá una elevada concentración de Phe en plasma, y dicha concentración puede ser superior a 1800 gM/l en ausencia del producto terapéutico. Otras realizaciones contemplan que el sujeto tenga una concentración de fenilalanina en plasma mayor que 1000 gM en ausencia de un régimen terapéutico. En realizaciones preferidas, la administración combinada de acuerdo con la invención disminuye la concentración de fenilalanina en plasma del sujeto a menos de 600 gM. Más preferiblemente, disminuye a menos de 500 gM. Incluso más preferiblemente, la administración combinada disminuye la concentración de fenilalanina en plasma del sujeto a 360 gM ± 15 gM.

La BH4 se administra preferiblemente en una cantidad comprendida entre 1 mg/kg y 30 mg/kg, más preferiblemente entre 5 mg/kg y 30 mg/kg.La BH4 se administra en una única dosis diaria. En algunas realizaciones, la terapia con BH4 no es continua, sino en su lugar, la BH4 se administra diariamente hasta que la concentración de fenilalanina en plasma del sujeto disminuye a menos de 360 pM. Preferiblemente, la concentración de fenilalanina en plasma del sujeto se controla diariamente y la BH4 se administra cuando se observa un aumento del 10 % de la concentración de fenilalanina en plasma. La BH4 que se va a administrar es una forma cristalizada estabilizada de BH4 que tiene mayor estabilidad que la BH4 no cristalizada estabilizada. Más preferiblemente, la forma cristalizada estabilizada de BH4 comprende al menos un 99,5 % de BH4 6R pura. Los precursores, tales como la dihidrobiopterina (BH2) y la sepiapterina, también se pueden administrar. La BH4 se puede administrar por vía oral.

La dieta con restricción de proteínas administrada en los métodos del presente documento es una dieta en la que la fenilalanina está restringida, en la que la ingesta total de fenilalanina del sujeto se restringe a menos de 600 mg por día. En otras realizaciones, la dieta con restricción de proteínas es una dieta con restricción de fenilalanina en la que la fenilalanina total está restringida a menos de 300 mg por día. En otras realizaciones adicionales, la dieta con restricción de proteínas es una dieta suplementada con aminoácidos, tales como tirosina, valina, isoleucina y leucina. En determinadas realizaciones, la dieta con restricción de proteínas comprende un suplemento de proteínas y la BH4 se proporciona en la misma composición que el suplemento de proteínas.

En realizaciones específicas, el sujeto es un sujeto que ha recibido un diagnóstico de tener una fenilalanina hidroxilasa (PAH) mutante. La PAH mutante puede comprender una mutación en el dominio catalítico de PAH. Los ejemplos de dichas mutaciones incluyen una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M, E390G, A395P, P407S, y Y414C,

También se contempla en el presente documento una BH4 para su uso en un método para tratar a una mujer embarazada que tiene hiperfenilalaninemia (HPA), que comprende administrar al sujeto una dieta con restricción de proteínas junto con una composición que comprende tetrahidrobiopterina (BH4), en la que la administración combinada de la dieta con restricción de proteínas y BH4 es eficaz para disminuir la concentración de fenilalanina en el plasma del sujeto en comparación con la concentración en ausencia de la administración combinada. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene una concentración de fenilalanina en plasma no restringida mayor que 180 pM, pero inferior a 600 pM. En otras realizaciones, el sujeto tiene una concentración de fenilalanina en plasma no restringida mayor que 500 pM, pero inferior a 1200 pM. En otras realizaciones adicionales, el sujeto tiene una concentración de fenilalanina en plasma no restringida mayor que 1000 pM.

También se contempla tratar a un paciente que tiene una concentración de fenilalanina en plasma superior a la normal (por ejemplo, mayor que 180 pM/l y más preferiblemente, mayor que 360 pM/l), que comprende administrar al paciente una composición de BH4 estabilizada en una cantidad eficaz para producir una disminución de la concentración de fenilalanina en plasma del paciente. Preferiblemente, la composición de BH4 estabilizada es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas. El paciente probablemente tendrá una concentración de fenilalanina en plasma mayor que 180 pM antes de administrar la BH4. Más particularmente, el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 120 pM y 200 pM. En otras realizaciones, el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 200 pM y 600 pM. En otras realizaciones adicionales, el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 600 pM y 1200 pM. Otra clase adicional de pacientes que se tratan son los que tienen una concentración de fenilalanina en plasma no restringida mayor que 1200 pM. En realizaciones específicas, el paciente es un bebé, más en concreto, un bebé que tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor que 1200 pM. En otras realizaciones, la paciente está embarazada y la paciente embarazada tiene una concentración de fenilalanina en plasma entre 200 pM y 600 pM. Las pacientes embarazadas con una concentración de fenilalanina en plasma mayor que 1200 pM son candidatas especialmente atractivas para este tipo de terapia, así como aquellas pacientes que sean mujeres en edad de procrear que están pensando en quedarse embarazadas. En estas realizaciones en las que el paciente tiene una concentración de fenilalanina en plasma mayor que 1200 pM, el método comprende además administrar una dieta con restricción de proteínas al paciente.

La invención también contempla la BH4 para su uso en un método para tratar un paciente que tiene fenilcetonuria, que comprende administrar al paciente la composición de BH4 estabilizada en una cantidad eficaz para producir una disminución de la concentración de fenilalanina en plasma del paciente, en el que el paciente ha recibido un diagnóstico de insensibilidad a un ensayo de carga de BH4 en una sola dosis. Preferiblemente, el paciente es insensible en las 24 horas posteriores a la carga de BH4.

En el presente documento también se describe un ensayo de carga de múltiples dosis que implica la administración de más de una dosis de BH4. Los datos descritos en el presente documento demuestran que los sujetos que se consideran "insensibles" en el ensayo de carga de BH4 de una sola dosis pueden responder a varias dosis de BH4 con una reducción significativa en los niveles de fenilalanina. En una realización, por ejemplo, al menos dos dosis de BH4, que pueden estar entre 5 mg y 40 mg, se administran a un sujeto durante un periodo de más de un día, preferiblemente 7 días.

Los métodos de tratamiento pueden comprender administrar entre 10 mg de BH4/kg de peso corporal a 200 mg de BH4/kg de peso corporal. La BH4 se puede administrar mediante cualquier vía normalmente utilizada en la práctica, por ejemplo, por vía oral, subcutánea, sublingual, parenteral, rectal, nasal. La BH4 se administra diariamente. La BH4 preferiblemente se administra junto una la dieta con restricción de proteínas, y opcionalmente al mismo tiempo que folatos, incluyendo precursores de folato, ácidos fólicos y derivados de folato.

Se contempla que la BH4 se administrará como parte de un componente de una formulación terapéutica de proteínas. La dieta con restricción de proteínas puede comprender una dieta normal de alimentos que contienen un bajo contenido en proteínas. Como alternativa, la dieta con restricción de proteínas comprende una ingesta de una fórmula de proteínas que es una dieta de proteínas exenta en fenilalanina, y el sujeto obtiene su cantidad esencial de Phe del resto de los componentes de una dieta muy baja en proteínas. En determinadas realizaciones, la dieta con restricción de proteínas está suplementada con suplementos de proteínas que no contienen fenilalanina. Más particularmente, los suplementos de proteínas que no contienen fenilalanina comprenden tirosina u otros aminoácidos esenciales. En otras realizaciones, los suplementos de proteínas pueden comprender también folatos, incluyendo precursores de folato, ácidos fólicos y derivados de folato.

La invención contempla la BH4 para su uso en métodos para tratar un bebé que tiene fenilcetonuria, que comprenden administrar la composición estabilizada de BH4 al paciente en una cantidad eficaz para producir una disminución de la concentración de fenilalanina en plasma del bebé, en los que el bebé tiene entre 0 y 3 años de edad y el bebé tiene una concentración de fenilalanina en plasma de entre 360 pM y 4800 pM. Antes de administrar la BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de 1200 pM, y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a 1000 pM. En otras realizaciones, antes de administrar la BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de 800 pM, y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a 600 pM. En otras realizaciones adicionales, antes de administrar la BH4, el bebé tiene una concentración de fenilalanina de 400 pM, y la administración de BH4 disminuye la concentración de fenilalanina en plasma a 300 pM. Los métodos terapéuticos contemplados en el presente documento deberían reducir preferiblemente la concentración de fenilalanina en plasma del bebé a 360 ± 15 pM.

Se contempla una composición que comprende una forma cristalizada estabilizada de BH4 que es estable a temperatura ambiente durante más de 8 horas y un vehículo, diluyente o excipiente, farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además un suplemento de proteínas médico. En otras realizaciones, la composición de BH4 puede ser parte de una fórmula para bebés. En otras realizaciones, el suplemento de proteínas puede estar exento de fenilalanina. El suplemento de proteínas preferiblemente está reforzado con L-tirosina, L-glutamina, L-carnitina a una concentración de 20 mg/100 g de suplemento, L-taurina a una concentración de 40 mg/100 g de suplemento y selenio. Puede comprender además las dosis diarias recomendadas de minerales, por ejemplo, calcio, fósforo y magnesio. El suplemento puede comprender además la dosis diaria recomendada de uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en L-leucina, L-prolina, acetato de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidratada, L-triptófano, L-serina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutámico y ácido L-aspártico. Además, el suplemento pude estar reforzado con la dosis diaria recomendada de vitaminas A, D y E. El suplemento preferiblemente comprende un contenido en grasa que proporciona al menos el 40 % de la energía del suplemento. Dicho suplemento se puede proporcionar en forma de un suplemento en polvo o en forma de una barrita de proteínas.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Deberá entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan con fines meramente ilustrativos.

Descripción de las realizaciones preferidas

La intervención dietética es la intervención terapéutica utilizada para todos los pacientes con PKU clásica grave y en muchos pacientes con PKU moderada. Sin embargo, dicha restricción de proteínas de la dieta conduce a un suministro inadecuado de proteínas, energía, vitaminas y minerales para mantener el crecimiento y el desarrollo normales. Por tanto, la restricción de proteínas de la dieta es, en el mejor de los casos, una forma ineficaz de controlar la PKU en muchos tipos de pacientes, especialmente en mujeres embarazadas y en los niños pequeños, categorías ambas de sujetos que requieren grandes cantidades de proteínas en comparación con individuos adultos normales. El uso de la restricción dietética también se ve obstaculizado por el mal cumplimiento del paciente de una dieta con restricción de proteínas. En octubre de 2000, National Institutes of Health emitió una declaración de consenso sobre el cribado y la gestión de la PKU en la que "se alentaba decididamente la investigación sobre alternativas no dietéticas para el tratamiento de la PKU". Por tanto, existe una necesidad reconocida en la técnica de un medicamento terapéutico para sustituir y/o suplementar y aliviar las restricciones dietéticas que padece un paciente con PKU.

La presente solicitud describe, por primera vez, una intervención farmacéutica de la PKU basada en la administración de una forma estabilizada de BH4. Los métodos y las composiciones para producir dichas composiciones de BH4 estabilizada se describen con mayor detalle en el ejemplo 2. Las composiciones de BH4 estabilizada pueden comprender cristales de BH4 que son estables a temperatura ambiente durante más de 8 horas. La presente invención contempla la BH4 para su uso en composiciones farmacéuticas de la BH4 estabilizada por sí sola que se pueden administrar mediante cualquier vía de administración convencional, por ejemplo, oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea e inyección intravenosa. Las composiciones descritas en el presente documento pueden comprender además composiciones de BH4 junto con un antioxidante que ayuda a prolongar la estabilidad de la composición de BH4. Además, tal como se analiza en detalle a continuación, en el presente documento también se describen alimentos que comprenden BH4. Por ejemplo, en el presente documento se describen composiciones de proteínas en polvo convencionales, tales como PHENEX, LOFENALAC y PHENYL-FREE, que se han modificado mediante la adición de BH4.

La presente invención contempla la intervención terapéutica de varios fenotipos de PKU mediante la administración de BH4 junto con una dieta con restricción de proteínas.

Los métodos y las composiciones para realizar el tratamiento de trastornos metabólicos, incluyendo la PKU, se describen con más detalle a continuación en el presente documento.

I. Pacientes para tratar

La presente invención se refiere al tratamiento de una diversidad de poblaciones de pacientes con HPA, con métodos que comprenden el uso de composiciones de BH4 estabilizada, tanto por sí solas como combinadas con otros regímenes terapéuticos, para gestionar la HPA y la PKU. En particular, se contempla que la BH4 se pueda utilizar para tratar dicha población de pacientes que tienen concentraciones de fenilalanina que son lo suficientemente bajas como para que no se utilice normalmente la intervención en la dieta (es decir, pacientes con HPA leve). Dichos pacientes que son adecuados para todas las formas de tratamiento con composiciones de BH4 para mejorar los efectos de la HPA leve incluyen las mujeres embarazadas y los bebés con concentraciones séricas inferiores a 200 pM. Las diferentes poblaciones de pacientes, y sus diferentes necesidades terapéuticas, se discuten con más detalle en la presente sección.

Algunas realizaciones se dirigen a tratar la PKU clásica grave mediante la administración al sujeto de una dieta con restricción de proteínas junto con una composición que comprende BH4, en la que la administración combinada de la dieta con restricción de proteínas y BH4 es eficaz para disminuir la concentración de fenilalanina en el plasma de dicho sujeto en comparación con dicha concentración en ausencia de dicha administración combinada. Además, la invención también contempla el tratamiento de una mujer embarazada que tiene HPA mediante la administración a la mujer de una dieta con restricción de proteínas junto con BH4, de tal forma que la administración combinada de la dieta con restricción de proteínas y BH4 sea eficaz para disminuir la concentración de fenilalanina en el plasma de la mujer embarazada en comparación con dicha concentración en ausencia de dicha administración combinada. En realizaciones específicas, se contempla una terapia para pacientes que manifiestan niveles de Phe mayores que 420 pM.

Otras realizaciones de la invención conllevan la administración de una composición de BH4 estabilizada a cualquier individuo que tenga HPA, caracterizada por una concentración de Phe en plasma mayor que 180 pM antes de administrar la BH4, en una cantidad eficaz para producir una disminución en dicha concentración de Phe en plasma del paciente. Los métodos también se pueden usar en el tratamiento de pacientes de PKU que han recibido un diagnóstico de insensibilidad en un ensayo de carga de BH4. Los métodos serán útiles para tratar un bebé que padece una PKU caracterizada por concentraciones elevadas de Phe mayores que 300 pM/l con las composiciones de BH4 estabilizada descritas en el presente documento. Con "bebé", la presente solicitud se refiere a un paciente que tiene una edad comprendida entre 0 y 36 meses.

Los datos descritos en el presente documento demuestran que los sujetos que se consideran "insensibles" en el ensayo de carga de BH4 de una sola dosis pueden responder, de hecho, a varias dosis de BH4 con una reducción significativa en los niveles de fenilalanina. Por tanto, un ensayo de carga de múltiples dosis que implica la administración de más de una dosis de BH4. Los ejemplos de ensayos de carga de múltiples dosis incluyen la administración de entre 5 y 40 mg/kg de tetrahidrobiopterina, o más preferiblemente de 10 a 20 mg/kg, durante un período de tiempo de al menos 1 día, o al menos 2 días, o al menos 3, 4, 5, 6, 7, 10 o 14 días, preferiblemente 2-14, 3-14, o 5-10 días, y lo más preferiblemente 7 días.

También se describen métodos para usar cualquiera de los polimorfos de tetrahidrobiopterina descritos en el presente documento, o preparaciones farmacéuticamente estables que comprenden los polimorfos, para el tratamiento de afecciones asociadas con niveles elevados de fenilalanina o niveles disminuidos de tirosina, que pueden estar causados, por ejemplo, por una actividad reducida de la fenilalanina hidroxilasa, tirosina hidroxilasa o triptófano hidroxilasa. Las afecciones asociadas con niveles de fenilalanina elevados incluyen específicamente la fenilcetonuria, tanto leve como clásica, y la hiperfenilalaninemia tal como se describe en otra parte del presente documento, y los ejemplos de poblaciones de pacientes incluyen los subgrupos de pacientes descritos en el presente documento, así como cualquier otro paciente que muestre niveles de fenilalanina por encima de lo normal.

En el presente documento también se describe el uso de cualquiera de los polimorfos descritos en el presente documento, o preparaciones farmacéuticas estables que comprenden cualquiera de dichos polimorfos, para el tratamiento de sujetos que padecen afecciones que se beneficiarían de una potenciación de la actividad óxido nítrico sintasa y de pacientes que padecen enfermedades vasculares, enfermedades isquémicas o inflamatorias, o resistencia a la insulina. El tratamiento, por ejemplo, puede aliviar una deficiencia en la actividad óxido nítrico sintasa o, por ejemplo, puede proporcionar un aumento en la actividad óxido nítrico sintasa frente a los niveles normales. Se ha sugerido que un paciente que padece una deficiencia en la actividad óxido nítrico sintasa se beneficiaría de un tratamiento con folatos, incluyendo precursores de folato, ácidos fólicos o derivados de folato. Así, también se indica que las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen el tratamiento concurrente con folatos, incluyendo precursores de folato, ácidos fólicos o derivados de folato. Se describen ejemplos de folatos en las patentes de EE. u U. n.os 6.011.040 y 6.544.994, e incluyen ácido fólico (pteroilmonoglutamato), ácido dihidrofólico, ácido tetrahidrofólico, ácido 5-metiltetrahidrofólico, ácido 5,10-metilentetrahidrofólico, ácido 5,10-meteniltetrahidrofólico, ácido 5,10-formiminotetrahidrofólico, ácido 5-formiltetrahidrofólico (leucovorina), ácido 10-formiltetrahidrofólico, ácido 10-metiltetrahidrofólico, uno o más de los folilpoliglutamatos, compuestos en los que el anillo de pirazina del resto pterina del ácido fólico o de los folilpoliglutamatos está reducido para producir dihidrofolatos o tetrahidrofolatos, o derivados de todos los compuestos anteriores en los que las posiciones N-5 o N-10 portan una unidad de carbono de diversos niveles de oxidación, o sus sales farmacéuticamente compatibles, o una combinación de dos o más de estos. Los ejemplos de tetrahidrofolatos incluyen ácido 5-formil-(6S)-tetrahidrofólico, ácido 5-metil-(6S)-tetrahidrofólico, ácido 5,10-metilen-(6R)-tetrahidrofólico, ácido 5,10-metenil-(6R)-tetrahidrofólico, ácido 10-formil-(6R)-tetrahidrofólico, ácido 5-formimino-(6S)-tetrahidrofólico o ácido (6S)-tetrahidrofólico y sus sales, como tratamiento con una composición farmacéutica o alimento que comprende tanto un polimorfo de tetrahidrobiopterina como un folato.

El óxido nítrico es producido constitutivamente por las células endoteliales vasculares donde desempeña un papel fisiológico clave en la regulación de la presión sanguínea y el tono vascular. Se ha sugerido que una deficiencia en la bioactividad del óxido nítrico está implicada en la patogénesis de disfunciones vasculares, que incluyen la enfermedad de la arteria coronaria, la aterosclerosis de cualquier arteria, incluyendo las arterias coronaria, carótida, cerebral o vasculares periféricas, la lesión de isquemia-reperfusión, la hipertensión, la diabetes, la vasculopatía diabética, la enfermedad cardiovascular, la enfermedad vascular periférica o las afecciones neurodegenerativas que surgen de isquemia y/o inflamación, tales como los accidentes cerebrovasculares, y que estas patogénesis incluyen un endotelio dañado, un flujo insuficiente de oxígeno hacia los órganos y los tejidos, una elevada resistencia vascular sistémica (alta presión sanguínea), la proliferación vascular en el músculo liso, el avance de la estenosis vascular (estrechamiento) y la inflamación.

Además, se ha sugerido que la potenciación de la actividad óxido nítrico sintasa también provoca una reducción de los niveles elevados de superóxido, un aumento de la sensibilidad a la insulina, y una reducción en la disfunción vascular asociada con la resistencia a la insulina, según se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.410.535. Por tanto, en el presente documento también se describe el tratamiento de la diabetes (de tipo I o de tipo II), la hiperinsulinemia o la resistencia a la insulina. Las enfermedades que presentan disfunción vascular asociada con la resistencia a la insulina incluyen las provocadas por la resistencia a la insulina o las agravadas por la resistencia a la insulina, o las que ven retrasada su curación por la resistencia a la insulina, tales como la hipertensión, hiperlipidemia, arteriosclerosis, angina coronaria vasoconstrictora, angina de esfuerzo, lesión constrictiva cerebrovascular, insuficiencia cerebrovascular, vasoespasmo cerebral, trastorno de la circulación periférica, arterioestenosis coronaria tras angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) o injerto de bypass de la arteria coronaria (CABG), obesidad, diabetes independiente de la insulina, hiperinsulinemia, anomalías del metabolismo de lípidos o enfermedades cardíacas arterioscleróticas coronarias, en la medida en que están asociadas con la resistencia a la insulina. En el presente documento también se indica que, cuando se administra a pacientes con estas enfermedades, la BH4 puede prevenir o tratar estas enfermedades activando las funciones de NOS, aumentando la producción de NO y suprimiendo la producción de especies de oxígeno activas para mejorar los trastornos de las células endoteliales vasculares.

A. Características de la PKU clásica grave y métodos de tratamiento de la misma

Tal como se ha mencionado anteriormente en la sección de antecedentes, la PKU grave se manifiesta por una concentración de Phe en plasma mayor que 1200 pM/l y puede ser incluso tan alta como 4800 pM/l. Los pacientes que tienen este trastorno deben tratarse con una dieta exenta de Phe para poder disminuir sus concentraciones de Phe en plasma hasta un nivel que sea clínicamente aceptable (normalmente, inferior a 600 pM/l, y preferiblemente inferior a 300 pM/l). Estos pacientes solamente pueden tolerar un máximo de entre 250-350 mg de Phe en la dieta por día (Spaapen et al., Mol. Genet and Metab., 78:93-99, 2003). De este modo, estos pacientes inician una fórmula dietética restringida en Phe de 7 a 10 días después de su nacimiento y deben soportar esta restricción dietética el resto de su vida. Cualquier alivio de las estrictas restricciones dietéticas que estos individuos soportan se consideraría un beneficio.

Los ensayos utilizados para el diagnóstico de individuos con la Phe clásica se describen con más detalle a continuación en la sección III. Estos ensayos han revelado que los pacientes con la PKU clásica grave no son sensibles a BH4 y necesitan una dieta baja en fenilalanina (Lucke et al., Pediatr. Neurol., 28:228-230, 2003). Sin embargo, en la presente invención, se contempla que esta clase de pacientes de PKU se deberían tratar con BH4 para que se pueda aliviar la necesidad de una estricta dieta exenta de fenilalanina.

Por tanto, se contempla que los métodos conlleven determinar que el paciente padece PKU clásica mediante un seguimiento de la concentración de Phe en plasma del individuo. A continuación, el paciente se trata mediante la administración de un régimen combinado de una dieta baja en proteínas y BH4 de tal forma que se produzca al menos una disminución del 25 % en las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Preferiblemente, el método producirá una disminución de un 30 % en la concentración de Phe en plasma. Incluso más preferiblemente, el método producirá una disminución del 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en la concentración de Phe en plasma del individuo (por ejemplo, cuando un paciente con PKU clásica grave tiene una concentración de Phe de 4800 pM/l, una disminución del 90 % en la concentración de Phe producirá una concentración de Phe en plasma de 480 pM/l, una concentración que es lo suficientemente baja como para necesitar poca restricción dietética). Por supuesto, se deberá entender que los métodos de tratamiento (tanto para tratar la PKU clásica grave o cualquier otra HPA descrita en el presente documento) deberían intentar disminuir las concentraciones de Phe en plasma del paciente hasta niveles cercanos a 360 pM/l ± 15 pM/l tanto como sea posible.

En realizaciones preferidas, las concentraciones de Phe en plasma del paciente de PKU clásica en tratamiento se reducen desde cualquier cantidad de concentración de Phe en plasma no restringida que es mayor que 1000 pM/l a cualquier nivel de Phe en plasma que sea inferior a 600 pM/l. Por supuesto, incluso si el tratamiento combinado con la BH4 y la dieta con restricción de proteínas produce una disminución menor en la concentración de Phe en plasma, por ejemplo, hasta un nivel entre 800 pM/l y 1200 pM/l, esto se considerará un resultado clínicamente útil de la terapia, porque los pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma que está en dicho intervalo pueden gestionar la enfermedad simplemente restringiendo la cantidad de proteína en la dieta, en oposición a ingerir una fórmula restringida en Phe, dando como resultado, por tanto, una notable mejora en la calidad de vida del individuo, así como conduciendo a un mayor cumplimiento del paciente con la restricción dietética.

Cualquier aumento en la cantidad de los niveles de Phe en la dieta que el paciente pueda tolerar como resultado del tratamiento se considerará un resultado terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, se contempla que, como resultado de administrar la terapia basada en BH4, el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe de la dieta desde 250-350 mg/día hasta 350-400 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a Phe del paciente se altera desde el de un paciente de PKU clásica al de un paciente de PKU moderada). Por supuesto, sería preferible que la intervención terapéutica indicada en el presente documento permitiera al paciente aumentar su ingesta de Phe en la dieta desde 250-350 mg/día a 400­ 600 mg/día, (es decir, el fenotipo de tolerancia a Phe del paciente se altera desde el de un paciente de PKU clásica al de un paciente de PKU leve), o incluso más preferiblemente, permitiera al paciente tener una ingesta superior a 600 mg/día de Phe/día (es decir, una ingesta dietética normal).

B. Características de los pacientes de PKU no sensibles a BH4 y métodos de tratamiento de los mismos

Un segundo grupo de pacientes que se puede tratar con los métodos descritos son aquellos individuos para los que se ha determinado que tienen concentraciones de Phe en plasma elevadas, es decir, cualquier concentración que sea mayor que 200 pM/l, pero que se han diagnosticado como no sensibles a la terapia con BH4 (como se determina mediante el ensayo de carga de BH4 descrito a continuación). Dichos pacientes pueden incluir aquellos individuos que tienen una PKU leve (es decir, concentraciones de Phe en plasma de hasta 600 pM/l), individuos que tienen una PKU moderada (es decir, concentraciones de Phe en plasma de entre 600 pM/l a 1200 pM/l), así como pacientes que tienen la PKU clásica grave (es decir, concentraciones de Phe en plasma que son mayores que 1200 pM/l).

Los pacientes que no son sensibles a la terapia con BH4 reciben BH4 junto con una cantidad reducida de proteína en su dieta para disminuir las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Los métodos son tales que la administración de la terapia con BH4 produce una mayor disminución en las concentraciones de Phe en plasma del paciente en comparación con la disminución que se produce con el mismo protocolo dietético administrado en ausencia de la terapia con BH4.

En realizaciones preferidas, los pacientes reciben una composición que comprende una forma cristalizada estabilizada de BH4 caracterizada en el ejemplo 2 que se describe más adelante en el presente documento. Esta composición de BH4 se diferencia de las anteriormente disponibles en la técnica en que es más estable a temperatura ambiente que las preparaciones anteriormente conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, las disponibles en los kits de carga de BH4 (Schircks Laboratories, Jona, Suiza). Por tanto, la formulación de BH4 se puede conservar tanto a temperatura ambiente o refrigerada y conserva mayor potencia que las composiciones de BH4 anteriormente disponibles. De este modo, se contempla que esta forma de BH4 tendrá mayor eficacia terapéutica que una concentración similar de las composiciones de BH4 anteriormente disponibles. Esta mayor eficacia se puede utilizar para producir un resultado terapéuticamente eficaz incluso en los pacientes que previamente se identificaron como no sensibles a BH4.

Como en el caso del subconjunto de pacientes descritos en la sección IA anterior, los pacientes no sensibles a BH4 descritos en la presente sección se pueden tratar mediante las composiciones de BH4 estabilizada por sí solas o junto con restricciones dietéticas. Las restricciones dietéticas pueden ser una dieta que restringe la ingesta de Phe proporcionando una fórmula de proteínas médica sintética que tiene una cantidad disminuida de Phe o, como alternativa, la restricción dietética puede ser una restricción que simplemente requiera que el paciente limite su ingesta de proteínas total pero que, sin embargo, permite al paciente comer alimentos normales en cantidades limitadas.

Los resultados terapéuticos preferidos analizados para los pacientes de PKU clásica en la sección IA anterior se incorporan en la presente sección como referencia. Los resultados terapéuticos preferidos para los pacientes con PKU moderada (es decir, pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma no restringida de 600 pM/l a 1200 pM/l) incluyen al menos una disminución del 25 % en las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Preferiblemente, el método producirá una disminución de un 30 % en la concentración de Phe en plasma. Incluso más preferiblemente, el método producirá una disminución del 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en la concentración de Phe en plasma del individuo (por ejemplo, cuando un paciente con PKU clásica moderada tiene una concentración de Phe de 1000 pM/l, una disminución del 90 % en la concentración de Phe producirá una concentración de Phe en plasma de 100 pM/l, una concentración que es los suficientemente baja como para necesitar poca restricción dietética).

En realizaciones preferidas, las concentraciones de Phe en plasma del paciente de PKU moderada en tratamiento se reducen desde cualquier cantidad de concentración de Phe en plasma no restringida que está entre 600 pM/l y 1200 pM/l a cualquier nivel de Phe en plasma que sea inferior a 300 pM/l. Un tratamiento especialmente preferido con la BH4 (tanto por sí sola como junto con una restricción dietética) produce una disminución en la concentración de Phe en plasma, por ejemplo, hasta un nivel entre 200 pM/l y 400 pM/l, que se considerará un resultado clínicamente útil de la terapia, porque los pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma que está en dicho intervalo pueden gestionar la enfermedad simplemente restringiendo la cantidad de proteína en la dieta, en oposición a ingerir una dieta restringida en Phe. De hecho, en muchos estudios se indica que estos pacientes pueden incluso tomar una dieta normal.

Cualquier aumento en la cantidad de los niveles de Phe en la dieta que el paciente pueda tolerar como resultado del tratamiento se considerará un resultado terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, se contempla que, como resultado de administrar la terapia basada en BH4 (tanto por sí sola como junto con otra intervención terapéutica), el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe de la dieta desde 350-400 mg/día hasta 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia a Phe del paciente se altera desde el de un paciente de PKU moderada al de un paciente de PKU leve). Por supuesto, sería preferible que la intervención terapéutica indicada en el presente documento permitiera al paciente aumentar su ingesta de Phe en la dieta desde 350-400 mg/día a 400 para permitir que el paciente pueda tener una ingesta mayor que 600 mg de Phe/día (es decir, una ingesta dietética normal).

Incluso si el paciente que va a tratarse es un paciente que manifiesta solamente una PKU leve, es decir, tiene una concesión dietética de 400-600 mg de ingesta de Phe/día, se beneficiará de las terapias basadas en BH4 de la presente invención, porque es deseable producir una concentración de Phe en plasma normalizada tan cercana a 360 pM/l ± 15 pM/l como sea posible. Para este tipo de pacientes, un resultado terapéutico preferido incluirá al menos una disminución del 25 % en las concentraciones de Phe en plasma del paciente. Preferiblemente, el método producirá una disminución de un 30 % en la concentración de Phe en plasma. Incluso más preferiblemente, el método producirá una disminución del 40 %, 50 %, 60 %, o más en la concentración de Phe en plasma del individuo (por ejemplo, cuando un paciente con PKU leve tiene una concentración de Phe de 600 pM/l, una disminución del 60 % en la concentración de Phe producirá una concentración de Phe en plasma de 360 pM/l, es decir, una concentración de Phe en plasma normal y aceptable).

En realizaciones preferidas, las concentraciones de Phe en plasma del paciente de PKU leve en tratamiento se reducen desde cualquier cantidad de concentración de Phe en plasma no restringida que está entre 400 pM/l y 600 pM/l a cualquier nivel de Phe en plasma que sea inferior a 100 pM/l. Por supuesto, incluso si el tratamiento con la BH4 (tanto por sí sola como junto con una restricción dietética) produce una disminución menor en la concentración de Phe en plasma, por ejemplo, hasta un nivel entre 200 pM/l y 400 pM/l, esto se considerará un resultado clínicamente útil de la terapia.

Cualquier aumento en la cantidad de niveles de Phe en la dieta que el paciente pueda tolerar como resultado del tratamiento se considerará un resultado terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, se contempla que, como resultado de administrar la terapia basada en BH4 (tanto por sí sola como junto con otra intervención terapéutica), el paciente podrá aumentar su ingesta de Phe de la dieta desde 400-600 mg/día (es decir, el fenotipo de tolerancia del paciente se altera desde el de un paciente con PKU leve al de un paciente con HPA leve) que permite al paciente tener una ingesta superior a 600 mg de Phe/día (es decir, una ingesta dietética normal).

Además, incluso si el paciente es un paciente que solamente manifiesta los síntomas de HPA no PKU, es decir, tiene una concentración de Phe en plasma elevada de hasta 600 pM/l, pero, por lo demás, puede consumir una dieta normal en proteínas, este se beneficiará de las terapias con BH4 de la invención, porque se ha demostrado que unas concentraciones de Phe elevadas tienen efectos significativos sobre el CI de dichos individuos. Además, tal como se analiza más adelante, la intervención terapéutica basada en BH4 de los sujetos con necesidades especiales, por ejemplo, mujeres embarazadas y bebés, es especialmente importante incluso si los niveles de Phe en plasma de este paciente están en el nivel considerado "seguro" inferior a 200 pM/l.

C. PKU materna y métodos de tratamiento de la misma

El control metabólico de los niveles de Phe en plasma en mujeres con PKU que planifican la concepción y aquellas que están embarazadas es importante debido a las graves consecuencias para el feto expuesto incluso a niveles moderadamente elevados de Phe in utero, independientemente del estado de PAH del feto. El control terapéutico de la concentración de Phe en plasma es especialmente importante en el primer trimestre del embarazo, ya que, si no se consigue un control adecuado, esto dará como resultado trastornos que incluyen microcefalia, deficiencia mental y cardiopatía congénita.

Por ejemplo, la declaración de consenso de NIH (vol. 17 n.° 3, octubre de 2000) sobre la fenilcetonuria notificó que la exposición de un feto a niveles de Phe maternos de 3-10 mg/dl produce una incidencia del 24 % de microcefalia, mientras que los expuestos a más de 20 mg/dl (es decir, más de 1200 pM/l) tuvieron un 73 % de incidencia de microcefalia. Del mismo modo, se descubrió una cardiopatía congénita en el 10 % de niños expuestos a niveles de Phe maternos mayores que 20 mg/dl. De forma importante, se ha indicado que unos niveles de Phe superiores a 6 mg/dl disminuyen significativamente el CI del niño. Por tanto, es urgente garantizar que la concentración de Phe en plasma de las mujeres con cualquier forma de fenilcetonuria, incluso las mujeres que manifiestan la HPA más leve, debe estar rigurosamente controlada para evitar el riesgo de síndrome de PKU materna. Sin embargo, los niveles diana aceptables para las concentraciones de Phe en plasma de mujeres con PKU que se han usado en las clínicas estadounidenses están comprendidos entre 10 mg/dl y 15 mg/dl, que son mucho más elevados que los niveles de 2­ 6 mg/dl recomendados para mujeres embarazadas o los 1 -4 mg/dl que se utilizan en las clínicas británicas y alemanas para disminuir el riesgo de desarrollar el síndrome de PKU materno.

Otra consideración importante para las mujeres embarazadas es su ingesta de proteínas totales. Durante el embarazo, es importante que la mujer consuma las proteínas suficientes, porque se ha sugerido que una dieta baja en proteínas durante el embarazo dará como resultado un retraso en el desarrollo renal y la consiguiente reducción en el número de nefronas y potencialmente conduce a la hipertensión en el adulto (D'Agostino, N. Engl. J. Med., 348(17):1723-1724, 2003). La siguiente tabla proporciona ejemplos de directrices para la ingesta recomendada de proteínas totales en la dieta para diferentes individuos.

Tabla: Directrices estadounidenses para los requisitos de proteínas en la dieta

La cantidad real de proteínas ingeridas depende del contenido de Phe de la proteína. Los perfiles de aminoácidos de las proteínas de origen vegetal son diferentes de los de las proteínas de origen animal. Por ejemplo, centrándose en almidones y hortalizas, una regla general de 45-50 mg/Phe por gramo de proteína puede ser suficiente. Sin embargo, una norma aceptada para evaluar los aminoácidos constituyentes de una proteína es una clara de huevo, que contiene 3,5 gramos de proteína, de los que 204 mg son Phe.

Como puede verse en las directrices de ejemplo anteriores, en Estados Unidos, la ingesta recomendada de proteínas para mujeres en edad de procrear (por ejemplo, menos de 51) es de 44 a 50 g/día, mientras que las mujeres embarazadas tienen una ingesta recomendada de 60 g/día. En Canadá y Reino Unido, la ingesta recomendada de proteínas para mujeres embarazadas es de aproximadamente 70 g/día y 52 g/día. Por tanto, la necesidad de garantizar que los niveles de concentración de Phe en plasma de las mujeres embarazadas esté rigurosamente controlada se complica aún más porque este grupo de pacientes de PKU requiere más proteínas que las mujeres no embarazadas con PKU de edad comparable.

A la vista de lo anterior, se contempla que las terapias basadas en BH4 serán especialmente útiles en las mujeres embarazadas. Se contempla que una mujer que padece cualquier forma de HPA que está embarazada o que planea quedarse embarazada iniciará un ciclo de terapia con BH4 para garantizar que sus niveles de concentración de Phe en plasma se mantienen lo más cercanos posible a entre 180 pM/l y 360 pM/l. Dicho ciclo de terapia permitirá preferiblemente que la mujer aumente su nivel de ingesta normal de proteínas.

El análisis de los niveles de concentraciones de Phe en plasma y los grados a los que dichas concentraciones de Phe deberían disminuir analizados anteriormente en el presente documento en las secciones IA y IB se incorporan en la presente sección para mujeres embarazadas.

D. Gestión de la PKU en bebés y métodos de tratamiento de los mismos

Tal como se ha analizado detalladamente en el presente documento, se ha determinado que un aumento en la concentración de Phe en plasma en bebés (edades de cero a 3 años de edad) da como resultado una disminución significativa en el CI del niño. Sin embargo, tal como se ha analizado en otra parte de la memoria descriptiva, los pacientes que tienen una concentración de Phe en plasma elevada de cualquier concentración hasta 400 pM/l no suelen recibir ninguna intervención dietética. Por tanto, los bebés con edades de 0 a 3 años de edad sufren unos efectos perjudiciales significativos por las terapias actuales. La presente solicitud contempla el tratamiento de cualquier bebé que tenga una concentración de Phe en plasma no restringida que sea mayor que 360 pM/l ± 15 pM/l con una composición terapéutica que comprende BH4 con el fin de producir una disminución beneficiosa en la concentración de Phe en plasma de dicho sujeto.

En realizaciones preferidas, los bebés con edades entre cero y 3 años de edad tienen una concentración de Phe en plasma no restringida de 1200 pM/l antes de administrar la BH4, y dicha administración disminuye la concentración de Phe en plasma. Preferiblemente, la concentración de Phe en plasma disminuye desde más de 1800 a 1500 pM/l, 1200 pM/l, 1100 pM/l, 1000 pM/l, 900 pM/l, 800 pM/l, 700 pM/l, 600 pM/l, 550 pM/l, 400 pM/l, 350 pM/l, 300 pM/l, 275 pM/l, 250 pM/l tras la administración. En otras realizaciones, el bebé tiene una edad entre 0 y 3 años de edad y tiene una concentración de Phe en plasma no restringida mayor que 1200 pM/l y preferiblemente, esta concentración de Phe en plasma disminuye a 800 pM/l, o más preferiblemente a 500 pM/l o incluso más preferiblemente a 360 pM/l tras administrar la BH4, tanto por sí sola como combinada con una dieta. Los expertos en la técnica entenderán que la invención contempla el tratamiento de bebés con concentraciones de Phe en plasma no restringidas mayores que 360 pM/l con BH4 para producir disminuciones en dichas concentraciones de Phe en plasma. El análisis de las reducciones terapéuticas de las concentraciones de Phe en plasma en las secciones IA y IB anteriores se incorpora como referencia en el presente documento. Además, cualquier disminución superior al 10 % de la concentración de Phe en plasma no restringida inicial se considerará un resultado terapéutico para los regímenes terapéuticos de los bebés. Se deberá entender que las terapias con BH4 se pueden combinar con restricciones dietéticas para conseguir la disminución terapéutica en las concentraciones de Phe en plasma en dichos bebés.

II. Composiciones para su uso en el tratamiento

La presente invención contempla la intervención terapéutica de PKU/HPA. Dicha intervención está basada inicialmente en el uso de BH4. La BH4 se puede usar por sí sola o junto con restricciones dietéticas. Además, la BH4 y/o las restricciones dietéticas pueden combinarse también con otras composiciones terapéuticas que están diseñadas, por ejemplo, para combatir otras manifestaciones de la PKU, tales como, por ejemplo, aminoácidos neutros grandes para evitar la acumulación de Phe en el cerebro (véase Koch et al., Mol. Genet. Metabol., 79:110-113, 2003) o un suplemento de tirosina. La presente sección proporciona un análisis de las composiciones que se pueden utilizar en los tratamientos considerados en el presente documento.

A. Composiciones de BH4

La BH4 es un cofactor de la hidroxilación de la Phe y, antes de la presente invención, se demostró que menos del 2 % de los pacientes con una cantidad elevada de Phe al nacer tienen defectos en la síntesis de BH4. Para estos individuos, que se identificaron como sensibles a la BH4, se sugirió que los pacientes no serían sensibles a una intervención dietética y, por tanto, dichos individuos se alimentaban con una dieta normal, pero se les proporcionaba solamente una terapia de BH4. Por tanto, antes de la presente invención, existía mucho escepticismo en la técnica sobre los beneficios terapéuticos de la administración de BH4 a pacientes de PKU/HPA. Sin embargo, como se ha analizado detalladamente en el presente documento, la BH4 se puede administrar para una intervención terapéutica en pacientes que han recibido un diagnóstico de insensibilidad a BH4. Además, los presentes inventores demuestran que la terapia con BH4 se puede combinar con restricciones dietéticas para producir un resultado terapéutico tanto en individuos que son sensibles a un ensayo de carga de BH4 como en individuos que no son sensibles a una carga de BH4.

Cada una de las patentes de Estados Unidos n.os 5.698.408; 2.601.215; 3505329; 4.540.783; 4.550.109; 4.587.340; 4.595.752; 4.649.197; 4.665.182; 4.701.455; 4.713.454; 4.937.342; 5.037.981; 5.198.547; 5.350.851; 5.401.844; 5,698,408 y la solicitud canadiense CA 2420374 describen métodos para fabricar dihidrobiopterinas, BH4 y derivados de las mismas.

Cada una de las patentes de Estados Unidos n os 4.752.573; 4.758.571; 4.774.244; 4.920.122; 5.753.656; 5.922.713; 5.874.433; 5.945.452; 6.274.581; 6.410.535; 6.441.038; 6.544.994; y las publicaciones de patentes estadounidenses US 20020187958; US 20020106645; US 2002/0076782; US 20030032616 describen métodos para administrar composiciones de BH4 para tratamientos no de PKU. Cada una de dichas patentes proporciona una indicación general de los métodos de administrar composiciones de BH4 conocidas por los expertos en la técnica.

La presente invención contempla el uso de una composición de BH4 que es una composición de BH4 estabilizada. La composición de BH4 estabilizada está en forma cristalina. Los métodos para fabricar las composiciones de BH4 estabilizada para su uso en la presente invención se describen en el ejemplo 2. Dicha forma cristalina puede demostrar su utilidad como aditivo en las fórmulas de proteínas convencionales para el tratamiento de la PKU. La forma cristalina también puede conformarse convenientemente en comprimidos, polvo, o cualquier otra forma sólida para la administración oral. Las formas y vías para la administración de BH4 se analizan con mayor detalle en la sección siguiente, Composiciones farmacéuticas.

En realizaciones preferidas, se contempla que los métodos proporcionarán a un paciente que lo necesita una dosis diaria entre 10 mg/kg y 20 mg/kg de BH4. Por supuesto, un experto en la técnica puede ajustar esta dosis hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la eficacia conseguida mediante la administración. La dosis diaria se puede administrar en una única dosis. En realizaciones de ejemplo, la dosis diaria puede ser de 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 22 mg/kg, 24 mg/kg, 26 mg/kg, 28 mg/kg, 30 mg/kg, 32 mg/kg, 34 mg/kg, 36 mg/kg, 38 mg/kg, 40 mg/kg, 42 mg/kg, 44 mg/kg, 46 mg/kg, 48 mg/kg, 50 mg/kg, o más mg/kg.

Independientemente de la cantidad de BH4 administrada, es deseable que la administración disminuya la concentración de Phe en plasma de los pacientes hasta las concentraciones analizadas en la sección I para los diversos tipos de pacientes.

B. Proteínas de la dieta

Además de administrar BH4 y los análogos relacionados a pacientes de HPA/PKU, se contempla que las proteínas en la dieta de los pacientes también se pueden restringir o modificar. Los expertos en la técnica conocen las diferentes fórmulas de proteínas comercialmente disponibles para su uso en el tratamiento de la PKU. Dichas fórmulas incluyen MAXIMAID, PHENEX 1, PHENEX 2 (Ross Laboratories, Liverpool, Reino Unido), LOFENALAC, PHENYL-FREE (Mead-Johnson).

Los expertos en la técnica pueden utilizar las fórmulas de proteínas citadas, que generalmente están exentas de concentraciones de Phe. Las fórmulas de proteínas frecuentemente están suplementadas con aminoácidos para los que los pacientes de PKU suelen mostrar carencias. Dichos aminoácidos incluyen, por ejemplo, L-tirosina y L-glutamina. Se ha sugerido que puede ser deseable suplementar la dieta de los pacientes de PKU con valina, isoleucina y leucina (véase la patente de Estados Unidos n.° 4.252.822). En algunas manifestaciones clínicas, los efectos tóxicos de la PKU están causados por el bloqueo por Phe de la captación en el cerebro de otros aminoácidos, tales como la tirosina y el triptófano. Se ha descubierto que al suplementar la dieta de un paciente de PKU con un exceso de dichos aminoácidos grandes neutros se bloquea la captación de Phe en el cerebro y se disminuyen los niveles de Phe en el cerebro. Por tanto, se contempla que el régimen dietético pueda suplementarse además con composiciones que comprendan uno o más de estos aminoácidos (Koch et al., Mol. Genet. Metabol., 79:110-113, 2003).

Además, es sabido que la L-carnitina y la taurina, que se encuentran normalmente en la leche humana y en otros alimentos de origen animal, también deben suministrarse además de la restricción de proteínas. En determinadas realizaciones, por ejemplo, la L-carnitina se puede suministrar a 20 mg/100 g de suplemento de proteínas, y la taurina se puede suministrar a 40 mg/100 g de suplemento de proteínas para ayudar a suministrar las cantidades de estos factores que normalmente se encuentran en la leche humana y alimentos de origen animal.

Además, los expertos en la técnica deben consultar las Ingestas Dietéticas de Referencia del 2000 National Academy of Sciences-National Research Council para un listado adicional de otros componentes, tales como vitaminas y minerales esenciales que deben suministrarse al paciente para garantizar que se proporcionan otros suplementos a pesar de la restricción de proteínas en la dieta.

Con respecto a la tabla presentada en la sección IC anterior para las cantidades totales de proteínas y las cifras presentadas en la sección I de forma general para las concentraciones de Phe en plasma deseadas, los expertos en la técnica podrán determinar la cantidad de restricción de proteínas en la dieta que se necesita y, por tanto, ajustar de acuerdo con ello la dieta del paciente. Tomando, por ejemplo, un varón de aproximadamente 11-14 años de edad, este individuo debería recibir preferiblemente 45 g de proteína/día. En el caso en que el individuo sea una persona que tiene la PKU clásica grave, su concentración de Phe en plasma no restringida probablemente será mayor que 1200 pM/l, y es probable que la mayoría, sino la totalidad de las fuentes de proteínas de la dieta de dicho individuo, provenga de un suplemento de proteínas en polvo, que preferiblemente disminuya sus concentraciones de Phe en plasma a menos de 600 pM/l. Mediante la administración de BH4 a dicho sujeto, un resultado terapéutico será un resultado que produzca una mayor disminución en las concentraciones de Phe en plasma del paciente o, como alternativa, el resultado terapéutico es un resultado en que las concentraciones de Phe en plasma del individuo disminuyen en un grado similar, pero dicho individuo puede tolerar las proteínas de una dieta normal en lugar de una fórmula dietética.

De manera similar, en un varón de aproximadamente 11-14 años de edad que tenga una PKU moderada, puede ser posible utilizar los métodos descritos para proporcionarle los 45 g proteínas/día asignados mediante una ingesta normal de proteínas, en lugar de una fórmula restringida. La determinación de si los métodos son eficaces conllevará determinar las concentraciones de Phe en plasma del paciente de forma habitual para garantizar que las concentraciones de Phe en plasma permanecen por debajo de al menos 400 pM/l. Los ensayos para determinar dichas concentraciones se describen a continuación. Preferiblemente, se pueden conseguir unas concentraciones de 360 pM/l o menores.

III. Identificación y control de poblaciones de pacientes

Tal como se ha analizado detalladamente en el presente documento, será necesario, en diversas realizaciones, determinar si un paciente dado es sensible a la terapia con BH4, y determinar las concentraciones de fenilalanina del paciente tanto inicialmente para identificar qué clase de paciente con PKU se está tratando, como durante un régimen terapéutico en curso para controlar la eficacia del régimen. Se describen ejemplos de dichos métodos más adelante en el presente documento.

A. Ensayo de carga de BH4

Para identificar un paciente como sensible a BH4, los expertos en la técnica realizan un ensayo de "carga de BH4". Se han utilizado dos tipos de ensayos de carga para realizar el diagnóstico diferencial de la HPA. El primero es un ensayo de carga de BH4 simple por vía oral y el segundo es un ensayo de carga de BH4/fenilalanina combinado.

En el ensayo de carga de BH4 más sencillo, se administra BH4 exógena, y se determinan los efectos de esta administración sobre la disminución de las concentraciones de Phe en plasma. Una carga intravenosa de 2 mg/kg de BH4 se propuso inicialmente en Danks et al. (Lancet, 1:1236, 1976), puesto que ya estaba disponible una BH4 de mayor pureza para realizar el ensayo, usando una administración oral de BH4 en cantidades de aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal. Finalmente, en Niederwieser et al. se propuso una estrategia normalizada, en la que se administra una única dosis oral de 7,5 mg/kg de BH4 (Eur. J. Pediatr., 138:441, 1982), aunque algunos laboratorios siguen utilizando hasta 20 mg de BH4/kg de peso corporal. Este ensayo permite diferenciar entre pacientes que tienen HPA ocasionada por un déficit en la BH4 o por una deficiencia en la PAH.

Para que el ensayo de carga de BH4 simple produzca resultados fiables, los niveles de Phe en sangre del paciente deben ser mayores que 400 pM/l. Por tanto, a veces es normal que el paciente suspenda la dieta de PKU durante los 2 días anteriores a la realización del ensayo de carga. Un kit de ensayo de la BH4 está disponible, y lo distribuye Dr. Schircks Laboratories (Jona, Suiza). Este kit recomienda una dosificación de 20 mg de BH4/kg de peso corporal aproximadamente 30 minutos después de ingerir una comida normal.

Tal como se ha indicado anteriormente, la concentración de Phe de un paciente idealmente debe ser mayor que 400 pmol/l para obtener una lectura precisa de BH4. En el ensayo de carga de BH4/fenilalanina combinado, una administración oral de Phe (100 mg/kg de peso corporal) junto con BH4 (20 mg/kg peso corporal) permite la diferenciación selectiva de todas las deficiencias de BH4. Normalmente, la Phe se administra en una dosis oral y va seguida aproximadamente una hora después por la BH4. Los niveles de Phe en plasma se controlan antes y en intervalos de tiempo adecuados (por ejemplo, 1, 3, 5, 9, 13 y 25 horas) después de la administración de Phe.

Tanto en el ensayo de carga de BH4 simple como en el ensayo de carga de Phe/BH4 combinado, se ha sugerido que una disminución de la Phe en plasma superior al 30 % del valor de la Phe en plasma antes del estímulo con BH4 en las 24 horas posteriores a la carga es indicativo de una sensibilidad a la BH4 (Spaapen et al., Mol. Genet. and Metabol., 78:93-99, 2003).

También se pueden utilizar otros métodos para realizar los ensayos de carga de BH4. Se describen ejemplos de dichos ensayos, por ejemplo, en Muntau et al. (N. Engl. J. Med., 347(26):2002) y Berneggar y Blau (Mol. Genet. Metabol., 77:304-313, 2002).

En Berneggar y Blau, los ensayos de carga de BH4 utilizan 20 mg/kg de BH4 y la extracción de sangre para determinación de fenilalanina y tirosina se realiza a las 0,4, 8, y 24 horas para diferenciar entre pacientes sensibles y no sensibles a BH4. El ensayo llevado a cabo por los inventores se realizó después de al menos 3 horas de ayuno. Las muestras de orina de neopterina y biopterina se analizaron antes del ensayo. Después de una aplicación oral de la 6R BH4 (20 mg/kg de peso corporal), se permite una ingesta de alimento normal durante el resto del ensayo. Las muestras de sangre se analizaron para realizar las mediciones de Phe y Tyr a las 0, 4, 8 y 24 horas. Otra muestra de orina se recogió a las 4-8 horas. La actividad de la dihidropteridina reductasa también se puede medir en cualquier momento durante el ensayo. En los pacientes que tienen niveles de fenilalanina en plasma inferiores a 400 pM/l o pacientes que ya siguen una dieta baja en fenilalanina, Berneggar y Blau recomiendan un ensayo de fenilalanina-BH4 combinado en el que se administran 100 mg de Phe/kg de peso corporal por vía oral 3 horas antes de administrar BH4.

Berneggar y Blau calculan la sensibilidad a BH4 como "hidroxilación de la fenilalanina" a las 4 y 8 horas después de la carga, y se expresa como porcentaje de la fenilalanina eliminada. La pendiente (S) de los gráficos de las "tasas de hidroxilación" a 0, 4 y 8 horas se comparan para diferentes productos de BH4 y diferentes grupos de pacientes. La pendiente discrimina entre sujetos no sensibles, sensibles lentos y sensibles. Los sujetos sensibles lentos (véase la figura 5 de Berneggar y Blau) necesitan más tiempo para alcanzar los valores de corte de 360 pM/l y la eficacia de la BH4 administrada depende de los niveles de fenilalanina iniciales. Estos autores recomiendan que, para algunos pacientes con Phe en plasma inferior a 800 pM/l y para la mayoría de los pacientes con una Phe en plasma mayor que 1200 pM/l, la medida de Phe se realice a las 21 horas. Se puede usar una representación gráfica de Phe/S frente al tiempo para calcular el tiempo necesario para alcanzar los valores de Phe en plasma "seguros" inferiores a 360 pM/l.

Muntau etal. (2002) también proporcionan ejemplos de ensayos de carga de BH4 que se pueden utilizar para calcular los tiempos y las concentraciones de la administración de BH4. De nuevo, estos autores utilizan un ensayo de carga de BH4/Phe combinado en el que se proporciona a los pacientes una comida que contiene 100 mg de Phe/kg de peso corporal. Una hora después de la comida, los pacientes reciben una dosis oral de 20 mg/kg de BH4 (Schirks Laboratories). Las concentraciones de fenilalanina en sangre se determinan mediante espectrometría de masas con ionización por electronebulización antes de la carga de Phe, así como antes y a 4, 8, y 15 horas después de la carga de BH4. Los recién nacidos pueden alimentarse con el pecho, mientras que los pacientes mayores reciben una ingesta de proteínas normalizada (10 mg Phe/kg) a las 6-8 horas de la carga de BH4. Muntau también describe métodos para oxidar la Phe. Después de un ayuno de 4 horas y un ayuno nocturno, se administran por vía oral un total de 6 mg/kg de Phe marcada con 13C disuelta en una disolución de dextrosa. A continuación, se recogen muestras de la respiración durante un periodo de 180 minutos y se almacenan en tubos de vidrio a los que se ha practicado el vacío. Las muestras se analizan a continuación mediante espectrometría de masas con proporción de isótopos, y se calcula la recuperación de carbono 13 (Treacy et al., Pediat. Res., 42:430-5,1997).

Muntau et al. clasifican los pacientes como sensibles a BH4 cuando los niveles de Phe en sangre 15 horas después del estímulo con BH4 han disminuido en más del 30 % del valor obtenido antes de la administración de BH4. Una mejora en la tasa de oxidación de la Phe, determinada por mediciones del dióxido de carbono obtenido durante los 180 minutos del ensayo, se considera significativa cuando el suplemento de BH4 aumenta el valor de la oxidación de Phe en al menos un 15 %.

Los expertos en la técnica podrán utilizar cualquiera de los métodos anteriormente citados para determinar si un individuo será sensible a BH4. Sin embargo, los expertos en la técnica también pueden conocer otros métodos equivalentes y relacionados para determinar la sensibilidad a BH4, y estos se pueden utilizar en lugar de los métodos descritos anteriormente.

B. Determinación de las concentraciones de Phe

Existen numerosos métodos para determinar la presencia de Phe en sangre (Shaw et al., Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry, InBickett et al. eds. Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism, Stuttgart, Georg Thiem Verlag, 47-561971). Normalmente, las concentraciones de fenilalanina y tirosina se determinan a partir del suero de un paciente usando un ensayo fluorométrico. Este ensayo se basa en la formación de sustancias fluorescentes cuando la fenilalanina se calienta con ninhidrina en presencia de leucilalanina (McCaman et al., J. Lab. Clin. Med., 59:885-890,1962).

El método más popular para determinar las concentraciones de Phe es el ensayo de Guthrie en el que se recortan discos de papel de filtro que se ha saturado con una muestra de sangre del paciente. Los discos uniformes se incuban en una bandeja de agar que se ha sembrado con Bacillus subtilis y que contiene un inhibidor específico del crecimiento de Bacillus subtilis. A medida que la fenilalanina se transfiere desde los discos uniformes al agar, la Phe invierte la inhibición del crecimiento bacteriano, proporcionando de esta forma una zona de crecimiento bacteriano que se puede correlacionar con la concentración de fenilalanina por comparación con ensayos similares realizados con discos que contengan cantidades conocidas de Phe.

Otros métodos para la cuantificación de la concentración de Phe incluyen HPLC, espectrometría de masas o cromatografía en capa fina. Dichos métodos se pueden utilizar para determinar la concentración de Phe en plasma de un paciente antes de la terapia y para el seguimiento de la concentración de Phe durante el régimen terapéutico para determinar su eficacia.

Se contempla que los niveles de Phe en plasma de los pacientes se controlen en intervalos convenientes (por ejemplo, diariamente, en días alternos o semanalmente) a lo largo de todo el ciclo temporal del régimen terapéutico. Mediante el seguimiento de los niveles de Phe en plasma con dicha regularidad, el especialista podrá evaluar la eficacia del tratamiento y ajustar la BH4 y/o los requisitos de proteínas de la dieta de acuerdo con ello.

IV. Terapias combinadas

Algunos métodos implican el uso combinado de BH4 y restricción de proteínas de la dieta para conseguir un resultado terapéutico en pacientes con diversas formas de HPA. Para conseguir el resultado terapéutico adecuado con las terapias de combinación contempladas en el presente documento, se administrará por lo general a los sujetos la composición de BH4 y la restricción dietética en una cantidad combinada eficaz para producir el resultado terapéutico deseado (es decir, una disminución en la concentración de Phe en plasma y/o la capacidad de tolerar mayores cantidades de ingesta de Phe/proteínas sin producir un aumento paralelo en las concentraciones de Phe en plasma). Este proceso puede implicar administrar la composición de BH4 y la composición terapéutica con proteínas de la dieta al mismo tiempo. Esto se puede conseguir mediante la administración de una sola composición o una formulación farmacológica de proteínas que incluya todas las proteínas de la dieta necesarias y que incluya también la BH4 dentro de dicha formulación de proteínas. Como alternativa, las proteínas de la dieta (suplemento o comida con proteínas normal) se toman aproximadamente a la misma hora que la formulación farmacológica (comprimido, inyección o bebida) de BH4. La BH4 también se puede formular en una barrita de proteínas u otros alimentos como pastelitos, tortitas, tartas, adecuados para su ingestión.

En otras alternativas, el tratamiento con BH4 puede preceder o seguir a la terapia de proteínas de la dieta en intervalos que varían de minutos a horas. En realizaciones en las que las proteínas y las composiciones de BH4 se administran por separado, se debería garantizar de manera general que no transcurra un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de tal manera que la BH4 siga siendo capaz de ejercer un efecto de forma ventajosa sobre el paciente. En tales casos, se contempla que se administraría la BH4 en aproximadamente 2-6 horas (antes o después) de la ingesta de las proteínas de la dieta, prefiriéndose más un tiempo de retraso de solo 1 hora. En determinadas realizaciones, se contempla que la terapia con la BH4 sea una terapia continua en la que una dosis diaria de BH4 se administra al paciente indefinidamente. En otras situaciones, por ejemplo, en mujeres embarazadas que tienen solo las formas más leves de PKU y HPA, puede ser que la terapia con BH4 se continúe solo durante el tiempo en el que la mujer está embarazada y/o está dando el pecho.

Adicionalmente, además de las terapias basadas únicamente en la administración de BH4 y en la regulación de las proteínas de la dieta, los métodos también contemplan la terapia combinada con una tercera composición que se dirige específicamente a uno o más de los síntomas de la HPA. Por ejemplo, se sabe que el déficit de tirosina producido por la HPA da como resultado una deficiencia en los neurotransmisores dopamina y serotonina. Por tanto, en el presente contexto, se contempla que los métodos basados en BH4 y en las proteínas de la dieta podrían combinarse además con la administración de los neurotransmisores L-dopa, carbidopa and 5-hidroxitriptófano para corregir los defectos que son el resultado de cantidades disminuidas de tirosina en la dieta

Además, la terapia génica con PAH (Christensen et al., Mol. Gent. and Metabol., 76: 313-318, 2002; Christensen et al., Gene Therapy, 7:1971-1978, 2000) y fenilalanina amoníaco liasa (PAL Liu et al., Arts. Cells. Blood. Subs and Immob. Biotech., 30(4)243-257, 2002) ha sido contemplada por los expertos en la técnica. Dichas técnicas de terapia génica se podrían usar junto con las terapias combinadas basadas en BH4/restricción de proteínas de la dieta. En otras terapias combinadas se contempla que se pueda proporcionar fenilasa como una enzima inyectable para destruir las concentraciones más bajas de Phe en el paciente. Como la administración de fenilasa no genera tirosina (a diferencia de la administración de PAH), dicho tratamiento seguirá dando como resultado que la tirosina continúe siendo un aminoácido esencial para dichos pacientes. Por tanto, el suplemento de la dieta con tirosina puede ser deseable para pacientes que reciben fenilasa en combinación con la terapia con BH4.

V. Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas para la administración pueden comprender una primera composición que comprende BH4 en una forma farmacéuticamente aceptable combinada opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden administrar por cualquier medio que consiga sus fines previstos. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las cantidades y regímenes para administrar una composición para tratar la PKU. Tal como se ha analizado anteriormente, los expertos en la técnica podrían emplear inicialmente las cantidades y los regímenes de BH4 propuestos actualmente en un contexto médico, por ejemplo, aquellas composiciones que se proponen para modular la actividad de NOS, o para su uso en el tratamiento del dolor o la depresión, tal como se analiza en las patentes enumeradas en la sección II anterior.

Determinados aspectos de los métodos terapéuticos contemplan una terapia combinada en la que las composiciones de BH4 se administran junto con una dieta modificada en proteínas, y las composiciones farmacéuticas contemplan todas las composiciones que comprenden al menos BH4 en una cantidad eficaz para conseguir la mejora de uno o más de los síntomas de la PKU cuando se administran junto con la dieta modificada en proteínas. Por supuesto, el síntoma más evidente que se puede aliviar es que la terapia combinada produce una disminución en la concentración de Phe en plasma, aunque otros síntomas, tales como los cambios en el CI, la función ejecutiva, la concentración, el estado de ánimo y/o la estabilidad conductual en el rendimiento laboral, también se pueden vigilar. Dichos indicios se vigilan usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Polimorfos cristalinos de la sal diclorhidrato de (6R) L-tetrahidrobiopterina

Se ha descubierto que BH4, y en particular, la sal de diclorhidrato de BH4, presenta polimorfismo cristalino. A continuación, se muestra la estructura de BH4:

La forma (6R) de BH4 es la forma biológicamente activa conocida, sin embargo, se sabe también que la BH4 es inestable a temperatura ambiente. Se ha descubierto que un polimorfo cristalino de BH4 es más estable, y es estable frente a la descomposición en condiciones ambientales.

La BH4 es difícil de manipular y por tanto se produce y ofrece en forma de su sal de diclorhidrato (Schircks Laboratories, Jona, Suiza) en ampollas selladas en atmósfera de nitrógeno para evitar la degradación de la sustancia debido a su naturaleza higroscópica y su sensibilidad a la oxidación. La patente de Estados Unidos n.° 4.649.197 indica que la separación del diclorhidrato de (6R)- y 6(S)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en sus diastereómeros es difícil debido a la mala cristalinidad del diclorhidrato de 6(R,S)-L-eritro-tetrahidrobiopterina. La patente europea número 0 079 574 describe la preparación de tetrahidrobiopterina, en la que se obtiene diclorhidrato de tetrahidrobiopterina sólido como un intermedio. S. Matsuura et al. describen, en Chemistry Letters 1984, págs. 735-738 y Heterocycles, vol. 23, n.° 12, 1985, págs. 3115-3120, el diclorhidrato de 6(R)-tetrahidrobiopterina como un sólido cristalino en forma de agujas incoloras, que se caracterizan por el análisis de rayos X descrito en J. Biochem., 98, 1341-1348 (1985). Se descubrió una rotación óptica de 6,81° en el producto cristalino, que es muy similar a la rotación óptica de 6,51° notificada para un sólido cristalino en forma de cristales blancos en el ejemplo 6 del documento EP-A2-0191 335.

Los resultados obtenidos durante el desarrollo del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina indicaron que el compuesto puede existir en formas cristalinas diferentes, incluyendo formas polimórficas y solvatos. El interés continuado en este campo requiere un método eficaz y fiable para preparar las formas cristalinas individuales del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina y unas condiciones de cristalización controladas para proporcionar formas cristalinas que sean preferiblemente estables y fáciles de manipular, y de procesar en la fabricación y preparación de formulaciones, y que proporcionen una elevada estabilidad durante su conservación en forma de sustancia o como producto formulado, o que proporcionen formas menos estables adecuadas como compuestos intermedios para una cristalización controlada para la fabricación de formas estables.

Forma B de polimorfo

El polimorfo cristalino que se ha descubierto que es más estable se denomina en el presente documento "forma B" o, como alternativa, “polimorfo B”. Los resultados obtenidos durante la investigación y el desarrollo del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina revelaron que existen varios sólidos cristalinos conocidos que se han preparado, pero ninguno ha reconocido el polimorfismo y su efecto sobre la estabilidad de los cristales de BH4.

El polimorfo B es un anhidrato ligeramente higroscópico con la mayor estabilidad termodinámica por encima de aproximadamente 20 °C. Además, la forma B puede procesarse y manipularse fácilmente debido a su estabilidad térmica, la posibilidad de su preparación en condiciones concretas, su adecuada morfología y tamaño de partículas. El punto de fusión está próximo a 260 °C (AHf > 140 J/g), pero no se puede detectar un punto de fusión evidente debido a la descomposición antes y durante la fusión. Estas propiedades excepcionales hacen que la forma B de polimorfo sea especialmente factible para la aplicación farmacéutica, que se preparan a temperaturas elevadas. El polimorfo B puede obtenerse como un polvo fino con un tamaño de partículas que puede variar de 0,2 gm a 500 gm.

La forma B presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos, expresado en valores de d (Á) en: 8,7 (vs), 6,9 (w), 5,90 (vw), 5,63 (m) 5,07 (m) 4,76 (m) 4,40 (m), 4,15 (w), 4,00 (s), 3,95 (m) 3,52 (m) 3,44 (w), 3,32 (m) 3,23 (s), 3,17 (w), 3,11 (vs), 3,06 (w), 2,99 (w), 2,96 (w), 2,94 (m) 2,87 (w), 2,84 (s), 2,82 (m) 2,69 (w), 2,59 (w), 2,44 (w). La figura 1 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma B del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Tal como se usan en el presente documento, las siguientes abreviaturas entre paréntesis significan: (vs) = intensidad muy fuerte; (s) = intensidad fuerte; (m) = intensidad media; (w) = intensidad débil; y (vw) = intensidad muy débil. En la figura 1 se presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico.

Se ha descubierto que otros polimorfos de BH4 tienen una estabilidad química y física satisfactorias para una manipulación segura durante su fabricación y formulación, y proporcionan una elevada estabilidad durante la conservación en su forma pura o en formulaciones. Además, se ha descubierto que la forma B y otros polimorfos de BH4 pueden prepararse en cantidades muy grandes (por ejemplo, a escala de 100 kilos) y almacenarse durante un periodo prolongado de tiempo.

Todas las formas cristalinas (polimorfos, hidratos y solvatos), incluida la forma B cristalina, pueden utilizarse para la preparación del polimorfo B más estable. Se puede obtener el polimorfo B mediante equilibrio de fases de suspensiones de formas amorfas u otras formas diferentes a la forma B de polimorfo, tales como el polimorfo A, en disolventes polares y no acuosos adecuados. Por tanto, las preparaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se refieren a una preparación de la forma B de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina.

Se pueden convertir otras formas de BH4 en la forma B dispersando la otra forma de BH4 en un disolvente a temperatura ambiente, agitando la suspensión a temperatura ambiente durante un tiempo suficiente para producir la forma B de polimorfo, aislando posteriormente la forma B cristalina y eliminando el disolvente de la forma B aislada. La temperatura ambiente, tal como se usa en el presente documento, significa unas temperaturas en un intervalo de 0 °C a 60 °C, preferiblemente de 15 °C a 40 °C. La temperatura aplicada puede cambiarse durante el tratamiento y agitación disminuyendo la temperatura de forma discontinua o de forma continua. Los disolventes adecuados para la conversión de otras formas en la forma B incluyen metanol, etanol, isopropanol, otros alcoholes C3 y C4, ácido acético, acetonitrilo, tetrahidrofurano, metil t-butil éter, 1,4-dioxano, acetato de etilo, acetato de isopropilo, otros acetatos C3-C6, metil etil cetona y otras metil-alquil C3-C5-cetonas. El tiempo hasta completar la fase de equilibrio puede ser de hasta 30 horas y preferiblemente de hasta 20 horas o menos de 20 horas.

Se puede obtener también el polimorfo B mediante cristalización de las mezclas de disolventes que contienen hasta aproximadamente un 5 % de agua, especialmente a partir de mezclas de etanol, ácido acético y agua. Se ha descubierto que la forma B de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede prepararse mediante disolución, opcionalmente a temperaturas elevadas, preferiblemente de una forma sólida de menor energía que la forma B o de la forma B del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de disolventes que comprende etanol, ácido acético y agua, la adición de semillas a la disolución, el enfriamiento de la suspensión obtenida y el aislamiento de los cristales formados. La disolución se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o hasta 70 °C, preferiblemente hasta 50 °C. Se puede usar la mezcla de disolventes final para la disolución o el material de partida puede disolverse en primer lugar en agua y los otros disolventes pueden añadirse a continuación a la vez o uno después del otro. La composición de la mezcla de disolventes puede comprender una proporción en volumen de agua:ácido acético:tetrahidrofurano de 1:3:2 a 1:9:4 y preferiblemente 1:5:4. La disolución se agita preferiblemente. El enfriamiento puede significar unas temperaturas de hasta -40 °C a 0 °C, preferiblemente de hasta 10 °C a 30 °C. Las semillas adecuadas son la forma B de polimorfo procedente de otro lote o cristales que tengan una morfología similar o idéntica. Tras el aislamiento, la forma B cristalina puede lavarse con un no disolvente, tal como acetona o tetrahidrofurano y secarse de una manera normal.

Se puede obtener también el polimorfo B mediante cristalización a partir de disoluciones acuosas a través de la adición de no disolventes, tales como metanol, etanol y ácido acético. El procedimiento de cristalización y aislamiento puede llevarse a cabo ventajosamente a temperatura ambiente sin enfriar la disolución. Este proceso es por tanto muy adecuado para llevarse a cabo a escala industrial.

En las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, se prepara una composición que incluye la forma B de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina mediante la disolución de una forma sólida diferente de la forma B o de la forma B del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en agua a temperatura ambiente, la adición de un no disolvente en cantidad suficiente para formar una suspensión, la agitación opcional de la suspensión durante un determinado tiempo, y el aislamiento posterior de los cristales formados. La composición se modifica aún más para obtener una composición farmacéutica como se describe a continuación.

La concentración de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en la disolución acuosa puede ser del 10 % al 80 % en peso, más preferiblemente del 20 % al 60 % en peso, con respecto a la disolución. Los no disolventes preferidos (es decir, los disolventes útiles en la preparación de suspensiones de BH4) son metanol, etanol y ácido acético. El no disolvente puede añadirse a la disolución acuosa. Más preferiblemente, la disolución acuosa se añade al no disolvente. El tiempo de agitación tras la formación de la suspensión puede ser de hasta 30 horas y preferiblemente de hasta 20 horas o menos de 20 horas. El aislamiento mediante filtración y secado se lleva a cabo de manera conocida como se ha descrito anteriormente.

La forma B de polimorfo es una forma cristalina muy estable, que fácilmente se puede eliminar mediante filtración, secarse y molerse hasta los tamaños de partículas deseados para las formulaciones farmacéuticas. Estas propiedades excepcionales hacen que la forma B de polimorfo sea especialmente factible para la aplicación farmacéutica.

Forma A de polimorfo

Se ha descubierto que otro polimorfo cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma A", o "polimorfo A". El polimorfo A es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente un 3 % en peso, que se libera continuamente entre 50 °C y 200 °C, cuando se calienta a una velocidad de 10 °C/minuto. El polimorfo A es un anhidrato higroscópico que es una forma metaestable con respecto a la forma B; sin embargo, es estable durante algunos meses en condiciones ambientales si se mantiene en un recipiente bien sellado. La forma A es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma A de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

El polimorfo A presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 15,5 (vs), 12,0 (m) 6,7 (m) 6,5 (m) 6,3 (w), 6,1 (w), 5,96 (w), 5,49 (m) 4,89 (m) 3,79 (m) 3,70 (s), 3,48 (m) 3,45 (m) 3,33 (s), 3,26 (s), 3,22 (m) 3,18 (m) 3,08 (m) 3,02 (w), 2,95 (w), 2,87 (m) 2,79 (w), 2,70 (w). La figura 2 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma A del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El polimorfo A presenta bandas de espectros Raman características, expresadas en números de onda (cm-1) en: 2934 (w), 2880 (w), 1692 (s), 1683 (m) 1577 (w), 1462 (m) 1360 (w), 1237 (w), 1108 (w), 1005 (vw), 881 (vw), 813 (vw), 717 (m) 687 (m) 673 (m) 659 (m) 550 (w), 530 (w), 492 (m) 371 (m) 258 (w), 207 (w), 101 (s), 87 (s) cm-1.

Se puede obtener la forma A de polimorfo mediante liofilización o eliminando el agua de disoluciones de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en agua. La forma A de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina puede prepararse disolviendo el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a temperatura ambiente en agua, (1) enfriando la disolución hasta alcanzar temperaturas bajas para solidificar la disolución, y eliminando el agua a presión reducida, o (2) eliminando el agua de dicha disolución acuosa.

La forma A cristalina puede aislarse mediante filtración y a continuación secarse para evaporar el agua absorbida del producto. Se conocen las condiciones y métodos de secado, y el secado del producto aislado o la eliminación del agua según la variante (2) descrita en el presente documento puede llevarse a cabo aplicando temperaturas elevadas, por ejemplo, hasta 80 °C, preferiblemente en el intervalo de 30 °C a 80 °C, al vacío o a temperaturas elevadas y vacío. Antes de aislar un precipitado obtenido en la variante (2), la suspensión puede agitarse durante un determinado tiempo para el equilibrio de las fases. La concentración de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en la disolución acuosa puede ser del 5 % al 40 % en peso, con respecto a la disolución.

Se prefiere un enfriamiento rápido para obtener disoluciones sólidas como material de partida. Se aplica una presión reducida hasta que se elimina completamente el disolvente. La liofilización es una tecnología bien conocida en la técnica. El tiempo hasta completar la eliminación del disolvente depende del vacío aplicado, que puede ser de 0,01 a 1 mbar (1 Pa a 100 Pa), del disolvente utilizado y de la temperatura de congelación.

La forma A de polimorfo es estable a temperatura ambiente o por debajo de la temperatura ambiente en condiciones sustancialmente exentas de agua, lo cual se demuestra con ensayos de equilibrio de fases de suspensiones en tetrahidrofurano o terc-butil metil éter en agitación durante cinco días y 18 horas respectivamente bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La filtración y el secado al aire a temperatura ambiente dan como resultado la forma A de polimorfo.

Forma F de polimorfo

Se ha descubierto que otro polimorfo cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma F", o "polimorfo F". El polimorfo F es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente un 3 % en peso, que se libera continuamente entre 50 °C y 200 °C, cuando se calienta a una velocidad de 10 °C/minuto. El polimorfo F es una forma metaestable y un anhidrato higroscópico, que es más estable que la forma A a menores temperaturas ambiente y menos estable que la forma B a temperaturas más altas, y la forma F es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables, Se puede preparar la forma F de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

El polimorfo F presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 17,1 (vs), 12,1 (w), 8,6 (w), 7,0 (w), 6,5 (w), 6,4 (w), 5,92 (w), 5,72 (w), 5,11 (w), 4,92 (m) 4,86 (w), 4,68 (m) 4,41 (w), 4,12 (w), 3,88 (w), 3,83 (w), 3,70 (m) 3,64 (w), 3,55 (m) 3,49 (s), 3,46 (vs), 3,39 (s), 3,33 (m) 3,31 (m) 3,27 (m) 3,21 (m) 3,19 (m) 3,09 (m) 3,02 (m) y 2,96 (m). La figura 3 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma F del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Se puede obtener el polimorfo F mediante el equilibrio de fases de suspensiones de la forma A de polimorfo en un disolvente polar y no acuoso adecuado, que apenas disuelve dichas formas de energía más baja, especialmente alcoholes, tales como metanol, etanol, propanol e isopropanol. La forma F de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede prepararse también dispersando partículas de la forma A sólida del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en un disolvente no acuoso que apenas disuelve dicho diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina por debajo de la temperatura ambiente, agitando la suspensión a dichas temperaturas durante un tiempo suficiente para producir la forma F de polimorfo, aislando posteriormente la forma F cristalina y eliminando el disolvente de la forma F aislada. La eliminación del disolvente y el secado se pueden llevar a cabo al aire, en aire seco o bajo protección de un gas seco, tal como nitrógeno o gases nobles y a la temperatura ambiente o por debajo de esta, por ejemplo, hasta 0 °C. La temperatura durante la fase de equilibrio es preferiblemente de 5 a 15 °C y lo más preferente 102C.

Forma J de polimorfo

Se ha descubierto que otro polimorfo cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma J", o "polimorfo J”. El polimorfo J es ligeramente higroscópico y adsorbe agua cuando se manipula en la humedad ambiental. El polimorfo J es una forma metaestable y un anhidrato higroscópico, y se puede transformar posteriormente de nuevo en la forma E descrita a continuación, a partir de la cual se obtiene tras exposición a condiciones de humedad relativa alta, tales como por encima de un 75 % de humedad relativa. La forma J es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma J de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

El polimorfo J presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 14,6 (m) 6,6 (w), 6,4 (w), 5,47 (w), 4,84 (w), 3,29 (vs) y 3,21 (vs). La figura 4 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma J del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Se puede obtener el polimorfo J mediante deshidratación de la forma E a temperaturas moderadas al vacío. En particular, la forma J de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede preparar tomando la forma E y eliminando el agua de la forma E tratando la forma E en un secador a vacío para obtener la forma J a temperaturas moderadas que pueden significar una temperatura en el intervalo de 25 a 70 °C, y lo más preferiblemente de 30 a 50 °C.

Forma K de polimorfo

Se ha descubierto que otro polimorfo cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma K", o "polimorfo K". El polimorfo K es ligeramente higroscópico y adsorbe agua hasta un contenido de aproximadamente un 2,0 % en peso, que se libera continuamente entre 50 °C y 100 °C, cuando se calienta a una velocidad de 10 °C/minuto. El polimorfo K es una forma metaestable y un anhidrato higroscópico, que es menos estable que la forma B a temperaturas más altas, y la forma K es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables, en particular la forma B. La forma K de polimorfo puede prepararse como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

El polimorfo K presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 14,0 (s), 9,4 (w), 6,6 (w), 6,4 (w), 6,3 (w), 6,1 (w), 6,0 (w), 5,66 (w), 5,33 (w), 5,13 (vw), 4,73 (m) 4,64 (m) 4,48 (w), 4,32 (vw), 4,22 (w), 4,08 (w), 3,88 (w), 3,79 (w), 3,54 (m) 3,49 (vs), 3,39 (m) 3,33 (vs), 3,13 (s), 3,10 (m) 3,05 (m) 3,01 (m) 2,99 (m) y 2,90 (m). La figura 5 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por la forma K del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

Se puede obtener el polimorfo K mediante cristalización en mezclas de disolventes polares que contienen pequeñas cantidades de agua y en presencia de pequeñas cantidades de ácido ascórbico. Los disolventes de la mezcla de disolventes se pueden seleccionar de ácido acético y un alcohol, tal como metanol, etanol, n-propanol o isopropanol. En particular, la forma K de polimorfo de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina puede prepararse disolviendo el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y un alcohol o tetrahidrofurano que contiene pequeñas cantidades de agua y una pequeña cantidad de ácido ascórbico a temperaturas elevadas, disminuyendo la temperatura por debajo de la temperatura ambiente para cristalizar dicho diclorhidrato, aislando el precipitado y secando el precipitado aislado a temperatura elevada, opcionalmente al vacío. Los alcoholes adecuados son, por ejemplo, metanol, etanol, propanol e isopropanol, y se prefiere el etanol. La proporción entre ácido acético a alcohol o a tetrahidrofurano puede ser de 2:1 a 1:2 y preferiblemente de aproximadamente 1:1. La disolución del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede llevar a cabo en presencia de un elevado contenido en agua y se puede añadir más cantidad de mezcla de antidisolventes para obtener una precipitación completa. La cantidad de agua en la composición final puede ser del 0,5 % al 5 % en peso, y la cantidad de ácido ascórbico puede ser del 0,01 % al 0,5 % en peso, ambos con respecto a la mezcla de disolventes. La temperatura de disolución puede estar comprendida en el intervalo de 30 a 100 y preferiblemente de 35 a 70 °C y la temperatura de secado puede estar en el intervalo de 30 a 50 °C. El precipitado se puede lavar en un alcohol, tal como etanol, tras el aislamiento, por ejemplo, mediante filtración. El polimorfo K se puede convertir fácilmente en la forma más estable B mediante equilibrio de fases, por ejemplo, en isopropanol, y opcionalmente sembrando con cristales de la forma B por encima de la temperatura ambiente, tal como temperaturas de 30 a 40 °C.

Formas hidratadas de la sal diclorhidrato de (6R)-L-tetrahidrobiopterina

Tal como se describe con más detalle a continuación, se ha descubierto que el diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina existe como numerosos hidratos cristalinos, que se describen y definen en el presente documento como las formas C, D, E, H y O. Estas formas de hidrato son útiles como una forma estable de BH4 para las preparaciones farmacéuticas descritas en el presente documento y en la preparación de composiciones que incluyen polimorfos cristalinos estables de BH4.

Hidrato de forma C

Se ha descubierto que una forma de hidrato cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma C", o "hidrato C”. El hidrato de forma C es ligeramente higroscópico y tiene un contenido de agua de aproximadamente un 5,5 % en peso, lo que indica que la forma C es un monohidrato. El hidrato C tiene un punto de fusión cercano a 94 °C (AH^f es de aproximadamente 31 J/g) y el hidrato de forma C es especialmente adecuado como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma C de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

La forma C presentâ un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 18,2 (m) 15,4 (w), 13,9 (vs), 10,4 (w), 9,6 (w), 9,1 (w), 8,8 (m) 8,2 (w), 8,0 (w), 6,8 (m) 6,5 (w), 6,05 (m) 5,77 (w), 5,64 (w), 5,44 (w), 5,19 (w), 4,89 (w), 4,76 (w), 4,70 (w), 4,41 (w), 4,25 (m) 4,00 (m) 3,88 (m) 3,80 (m) 3,59 (s), 3,50 (m) 3,44 (m) 3,37 (m) 3,26 (s), 3,19 (vs), 3,17 (s), 3,11 (m) 3,06 (m) 3,02 (m) 2,97 (vs), 2,93 (m) 2,89 (m) 2,83 (m) y 2,43 (m). La figura 6 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el hidrato de forma C del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El hidrato de forma C puede obtenerse mediante equilibrio de fases a temperatura ambiente de una forma polimórfica, tal como una suspensión del polimorfo B, en un no disolvente que contiene agua en una cantidad preferiblemente de aproximadamente un 5 % en peso, con respecto al disolvente. El hidrato de forma C del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina puede prepararse suspendiendo el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en un no disolvente, tal como heptano, alcoholes C1-C4, tales como metanol, etanol, 1- o 2-propanol, acetatos, tales como acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético, o éteres, tales como tetrahidrofurano, dioxano, terc-butil metil éter, o mezclas binarias o ternarias de dichos no disolventes, a los que se añade el agua suficiente para formar un monohidrato, y agitando la suspensión a temperatura ambiente o inferior (por ejemplo, de 0 a 30 °C) durante un tiempo suficiente para formar un monohidrato. Agua suficiente puede significar del 1 % al 10 % y preferiblemente del 3 % al 8 % en peso de agua, con respecto a la cantidad de disolvente. Los sólidos se pueden eliminar por filtración y secarse al aire a aproximadamente la temperatura ambiente. El sólido puede absorber parte de agua y tener por tanto un mayor contenido en agua que el valor teórico del 5,5 % en peso. El hidrato de forma C es inestable con respecto a las formas B y D, y se convierte fácilmente en la forma B de polimorfo a temperaturas de aproximadamente 40 °C en aire y humedad relativa baja. La forma C se puede transformar en el hidrato D, más estable, mediante equilibrio en suspensión a temperatura ambiente.

Hidrato de forma D

Se ha descubierto que otra forma de hidrato cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma D", o "hidrato D”. El hidrato de forma D es ligeramente higroscópico y puede tener un contenido de agua de aproximadamente del 5,0 al 7,0 % en peso, lo que sugiere que la forma C es un monohidrato. El hidrato D tiene un punto de fusión próximo a 153 °C (AH^f es de aproximadamente 111 J/g) y es mucho más estable que la forma C e incluso es estable cuando se expone a la humedad del aire a temperatura ambiente. El hidrato de forma D puede usarse, por tanto, para preparar formulaciones o como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma D de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 pm y 500 pm.

La forma D presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 8,6 (s), 6,8 (w), 5,56 (m) 4,99 (m) 4,67 (s), 4,32 (m) 3,93 (vs), 3,88 (w), 3,64 (w), 3,41 (w), 3,25 (w), 3,17 (m) 3,05 (s), 2,94 (w), 2,92 (w), 2,88 (m) 2,85 (w), 2,80 (w), 2,79 (m) 2,68 (w), 2,65 (w), 2,52 (vw), 2,35 (w), 2,34 (w), 2,30 (w) y 2,29 (w). La figura 7 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el hidrato de forma D del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El hidrato de forma D se puede obtener añadiendo a aproximadamente la temperatura ambiente disoluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a una cantidad en exceso de un no disolvente, tal como hexano, heptano, diclorometano, 1- o 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres, tales como tetrahidrofurano, dioxano, terc-butil metil éter, o mezclas de dichos no disolventes, y agitando la suspensión a temperatura ambiente. El sólido cristalino se puede eliminar por filtración y después secarse bajo una atmósfera de nitrógeno seco a temperatura ambiente. Un no disolvente preferido es el isopropanol. La adición de la disolución acuosa se puede llevar a cabo gota a gota para evitar una repentina precipitación. El hidrato de forma D del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede preparar añadiendo a aproximadamente temperatura ambiente disoluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a una cantidad en exceso de un no disolvente y agitando la suspensión a temperatura ambiente, Un exceso de no disolvente puede significar una proporción de medio acuoso a no disolvente entre 1:10 y 1:1000. La forma D contiene un pequeño exceso de agua, relacionada con el monohidrato, y se cree que absorbe agua debido a la naturaleza ligeramente higroscópica de su hidrato cristalino. El hidrato de forma D se considera el más estable de los hidratos conocidos a temperatura ambiente y a una humedad relativa inferior al 70 %. El hidrato de forma D se puede utilizar en las formulaciones preparadas en condiciones en las que este hidrato es estable. Temperatura ambiente puede significar de 20 a 302C.

Hidrato de forma E

Se ha descubierto que otra forma de hidrato cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma E", o "hidrato E”. El hidrato de forma E tiene un contenido de agua de aproximadamente un 10 % a un 14 % en peso, lo que sugiere que la forma E es un dihidrato. El hidrato E se forma a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente. El hidrato de forma E es especialmente adecuado como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Es especialmente adecuado para producir la forma J exenta de agua tras un secado bajo una atmósfera de nitrógeno u opcionalmente al vacío. La forma E no es higroscópica y es estable en humedades relativas relativamente elevadas, es decir, a humedades relativas superiores a aproximadamente 60 % y hasta aproximadamente 85 %. Se puede preparar la forma E de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma E presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 15,4 (s), 6,6 (w), 6,5 (w), 5,95 (vw), 5,61 (vw), 5,48 (w), 5,24 (w), 4,87 (w), 4,50 (vw), 4,27 (w), 3,94 (w), 3,78 (w), 3,69 (m) 3,60 (w), 3,33 (s), 3,26 (vs), 3,16 (w), 3,08 (m) 2,98 (w), 2,95 (m) 2,91 (w), 2,87 (m) 2,79 (w), 2,74 (w), 2,69 (w) y 2,62 (w). La figura 8 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el hidrato de forma E del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El hidrato de forma E se puede obtener mediante la adición de disoluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a una cantidad en exceso de un no disolvente enfriado hasta unas temperaturas de aproximadamente 10 a -10 °C y preferiblemente entre 0 y 10 °C, y agitando la suspensión a dichas temperaturas. El sólido cristalino se puede eliminar por filtración y después secarse bajo una atmósfera de nitrógeno seco a temperatura ambiente. Los no disolventes son, por ejemplo, hexano, heptano, diclorometano, 1- o 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres, tales como tetrahidrofurano, dioxano, terc-butil metil éter, o mezclas de dichos no disolventes. Un no disolvente preferido es el isopropanol. La adición de la disolución acuosa se puede llevar a cabo gota a gota para evitar una precipitación súbita. El hidrato de forma E del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina se puede preparar añadiendo disoluciones acuosas concentradas de diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina a una cantidad en exceso de un no disolvente que se enfría hasta unas temperaturas de aproximadamente 10 a -10 °C, y agitando la suspensión a temperatura ambiente. Un exceso de no disolvente puede significar una proporción de medio acuoso a no disolvente entre 1:10 y 1:1000. Un no disolvente preferido es el tetrahidrofurano. Otro proceso de preparación comprende exponer la forma B de polimorfo al aire atmosférico con una humedad relativa de 70 a 90 %, preferiblemente aproximadamente a un 80 %. Se considera que el hidrato de la forma E es un dihidrato, que puede absorber algo de agua adicional. La forma E de polimorfo se puede transformar en el polimorfo J tras secado al vacío a temperaturas moderadas, lo que puede significar entre 20 °C y 50 °C a presiones entre 0 y 100 mbar (0 y 10 kPa). La forma E es especialmente útil para formulaciones en formas semisólidas debido a su estabilidad a humedades relativamente altas.

Hidrato de forma H

Se ha descubierto que otra forma de hidrato cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma H", o "hidrato H”. El hidrato de forma H tiene un contenido de agua de aproximadamente un 5,0 % a un 7,0 % en peso, lo que sugiere que la forma H es un monohidrato higroscópico. El hidrato de forma H se forma a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente. El hidrato de forma H es especialmente adecuado como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma H de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma H presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 8,6 15,8 (vs), 10,3 (w), 8,0 (w), 6,6 (w), 6,07 (w), 4,81 (w), 4,30 (w), 3,87 (m) 3,60 (m) 3,27 (m) 3,21 (m) 3,13 (w), 3,05 (w), 2,96 (m) 2,89 (m) 2,82 (w) y 2,67 (m). La figura 9 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el hidrato de forma H del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El hidrato de forma H se puede obtener por disolución a temperatura ambiente del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y agua, añadiéndola después a un no disolvente para precipitar un sólido cristalino, enfriando la suspensión obtenida y agitando la suspensión enfriada durante un determinado tiempo. El sólido cristalino se elimina por filtración y después se seca al vacío a temperatura ambiente. Los no disolventes son, por ejemplo, hexano, heptano, diclorometano, 1- o 2-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, ácido acético o éteres, tales como tetrahidrofurano, dioxano, terc-butil metil éter, o mezclas de dichos no disolventes. Un no disolvente preferido es el tetrahidrofurano. El hidrato de forma H del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina se puede preparar disolviendo a temperatura ambiente el diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y una cantidad de agua inferior a la de ácido acético, añadiendo un no disolvente y enfriando la suspensión obtenida hasta unas temperaturas en el intervalo de -10 a 10 °C, y preferiblemente de -5 a 5 °C, y agitando la suspensión a dicha temperatura durante un determinado tiempo. Un determinado tiempo puede significar de 1 a 20 horas. La proporción en peso entre el ácido acético y el agua puede ser de 2:1 a 25:1 y preferiblemente de 5:1 a 15:1. Esta proporción en peso de ácido acético/agua respecto al no disolvente puede ser de 1:2 a 1:5. El hidrato de forma H parece ser un monohidrato con un ligero exceso de agua absorbida debido a su naturaleza higroscópica.

Hidrato de forma O

Se ha descubierto que otra forma de hidrato cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma O", o "hidrato O”. El hidrato de forma O se forma a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente. El hidrato de forma O es especialmente adecuado como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma O de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma O presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 15,9 (w), 14,0 (w), 12,0 (w), 8,8 (m) 7,0 (w), 6,5 (w), 6,3 (m) 6,00 (w), 5,75 (w), 5,65 (m) 5,06 (m) 4,98 (m) 4,92 (m) 4,84 (w), 4,77 (w), 4,42 (w), 4,33 (w), 4,00 (m) 3,88 (m) 3,78 (w), 3,69 (s), 3,64 (s), 3,52 (vs), 3,49 (s), 3,46 (s), 3,42 (s) 3,32 (m) 3,27 (m) 3,23 (s), 3,18 (s), 3,15 (vs), 3,12 (m) 3,04 (vs), 2,95 (m) 2,81 (s), 2,72 (m) 2,67 (m) y 2,61 (m). La figura 10 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el hidrato de forma O del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El hidrato de forma O se puede preparar exponiendo la forma F de polimorfo a una atmósfera de nitrógeno que contiene vapor de agua con una humedad relativa resultante de aproximadamente 52 % durante aproximadamente 24 horas. El hecho de que la forma F, que es un anhidrato ligeramente higroscópico, se pueda usar para preparar la forma O con una humedad relativa del 52 % sugiere que la forma O es un hidrato, que es más estable que la forma F en condiciones ambientales de temperatura y humedad.

Formas solvatadas de la sal diclorhidrato de (6R) L-tetrahidrobiopterina

Tal como se describe con más detalle a continuación, se ha descubierto que el diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina existe en numerosas formas de solvato cristalinas, que se describen y definen en el presente documento como las formas G, I, L, M, y N. Estas formas de solvato son útiles como una forma estable de la BH4.

Solvato de forma G

Se ha descubierto que una forma cristalina de solvato en etanol del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma G", o "hidrato G”. El solvato de forma G en etanol tiene un contenido de etanol de aproximadamente de un 8,0 % a un 12,5 % en peso, lo que sugiere que la forma G es un monosolvato en etanol higroscópico. El solvato de forma G se forma a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente. La forma G es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma G de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma G presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 14,5 (vs), 10,9 (w), 9,8 (w), 7,0 (w), 6,3 (w), 5,74 (w), 5,24 (vw), 5,04 (vw), 4,79 (w), 4,41 (w), 4,02 (w), 3,86 (w), 3,77 (w), 3,69 (w), 3,63 (m) 3,57 (m) 3,49 (m) 3,41 (m) 3,26 (m) 3,17 (m) 3,07 (m) 2,97 (m) 2,95 (m) 2,87 (w) y 2,61 (w). La figura 11 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el solvato de forma G del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El solvato de forma G en etanol se puede obtener mediante cristalización del diclorhidrato de L-eritrotetrahidrobiopterina disuelto en agua y la adición de un importante exceso de etanol, agitando la suspensión obtenida a la temperatura ambiente o inferior, y secando el sólido aislado al aire o bajo una atmósfera de nitrógeno a aproximadamente la temperatura ambiente. En el presente documento, un importante exceso de etanol significa una mezcla resultante de etanol y agua con menos del 10 % de agua, preferiblemente de aproximadamente 3 al 6 %. El etanolato de forma G del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede preparar disolviendo el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina de aproximadamente temperatura ambiente a temperaturas de 75 °C en agua o en una mezcla de agua y etanol, enfriando una disolución calentada hasta la temperatura ambiente y hasta de 5 a 10 °C, añadiendo opcionalmente etanol para completar la precipitación, agitando la suspensión obtenida a temperaturas de 20 a 5 °C, eliminando por filtración el sólido cristalino de color blanco y secando el sólido al aire o con un gas de protección, tal como nitrógeno, a temperaturas de aproximadamente la temperatura ambiente. El proceso se puede llevar a cabo en una primera variante disolviendo el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina a aproximadamente temperatura ambiente en una cantidad menor de agua y añadiendo a continuación un exceso de etanol y agitando después la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases. En una segunda variante, el diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se puede suspender en etanol, añadiendo opcionalmente una cantidad menor de agua, y calentando la suspensión y el diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina disuelto, enfriando la disolución hasta temperaturas de aproximadamente 5 a 15 °C, añadiendo más cantidad de etanol a la suspensión y agitando después la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases.

Solvato de forma I

Se ha descubierto que una forma cristalina de solvato en ácido acético del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma I", o "hidrato I”. El solvato de forma I en ácido acético tiene un contenido de ácido acético de aproximadamente un 12,7 % en peso, lo que sugiere que la forma I es un monosolvato en ácido acético higroscópico. El solvato de forma I se forma a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente. El solvato de forma I en ácido acético es especialmente adecuado como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma I de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma I presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 14,5 (m) 14,0 (w), 11,0 (w), 7,0 (vw), 6,9 (vw), 6,2 (vw), 5,30 (w), 4,79 (w), 4,44 (w), 4,29 (w), 4,20 (vw), 4,02 (w), 3,84 (w), 3,80 (w), 3,67 (vs), 3,61 (m) 3,56 (w), 3,44 (m) 3,27 (w), 3,19 (w), 3,11 (s), 3,00 (m) 2,94 (w), 2,87 (w) y 2,80 (w). La figura 12 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el solvato de forma I del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El solvato de forma I en ácido acético se puede obtener por disolución del diclorhidrato de L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de ácido acético y agua a temperatura elevada, la adición de más cantidad de ácido acético a la disolución, el enfriamiento hasta una temperatura de aproximadamente 10 °C, y el posterior calentamiento de la suspensión formada hasta aproximadamente 15 °C, y la posterior agitación de la suspensión obtenida durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases, que puede tardar hasta 3 días. El sólido cristalino después se elimina por filtración y se seca al aire o con un gas de protección, tal como nitrógeno, a temperaturas de aproximadamente la temperatura ambiente.

Solvato de forma L

Se ha descubierto que una forma cristalina mixta de hidrato/solvato en etanol del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento “forma L”, o “hidrato L”. La forma L puede contener un 4 % pero hasta un 13 % de etanol y de 0 % a aproximadamente un 6 % de agua. La forma L se puede transformar en la forma G cuando se trata en etanol a temperaturas de aproximadamente 0 °C a 20 °C. Además, la forma L se puede transformar en la forma B cuando se trata en un disolvente orgánico a temperaturas ambientales (de 10 °C a 60 °C). Se puede preparar la forma L de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma L presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 14,1 (vs), 10,4 (w), 9,5 (w), 9,0 (vw), 6,9 (w), 6,5 (w), 6,1 (w), 5,75 (w), 5,61 (w), 5,08 (w), 4,71 (w), 3,86 (w), 3,78 (w), 3,46 (m) 3,36 (m) 3,06 (w), 2,90 (w) y 2,82 (w). La figura 13 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el solvato de forma L del diclorhidrato de (6R)-L-eritrotetrahidrobiopterina.

La forma L se puede obtener mediante la suspensión del hidrato de forma E a temperatura ambiente en etanol y agitando la suspensión a temperaturas de 0 a 10 °C, preferiblemente de aproximadamente 5 °C, durante un tiempo suficiente para el equilibrio de fases, que puede tardar de 10 a 20 horas. El sólido cristalino después se elimina por filtración y se seca preferiblemente a presión reducida a 30 °C o bajo una atmósfera de nitrógeno. El análisis mediante TG-FTIR sugiere que la forma L puede contener cantidades variables de etanol y agua, es decir, puede existir como polimorfo (anhidrato), como solvato/hidrato en etanol mixto, o incluso como hidrato.

Solvato de forma M

Se ha descubierto que una forma cristalina de solvato en etanol del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento "forma M", o "hidrato M". La forma M puede contener un 4 % pero hasta un 13 % de etanol y de 0 % a aproximadamente un 6 % de agua, lo que sugiere que la forma M es un solvato en etanol ligeramente higroscópico. El solvato de forma M se forma a temperatura ambiente. La forma M es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables, ya que la forma M se puede transformar en la forma G cuando se trata en etanol a temperaturas entre aproximadamente -10° y 15 °C, y en la forma B cuando se trata en disolventes orgánicos, tales como etanol, alcoholes C3 y C4, o éteres cíclicos, tales como THF y dioxano. Se puede preparar la forma M de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma M presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 18,9 (s), 6,4 (m) 6,06 (w), 5,66 (w), 5,28 (w), 4,50 (w), 4,23 (w) y 3,22 (vs). La figura 14 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el solvato de forma M del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

El solvato de forma M en etanol se puede obtener por disolución del diclorhidrato de L-eritro-tetrahidrobiopterina en etanol y la evaporación de la disolución bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente, es decir, entre 10 °C y 40 °C. La forma M también se puede obtener por secado de la forma G con una pequeña corriente de nitrógeno seco a una velocidad de aproximadamente 20 a 100 ml/min. Dependiendo de la medida del secado bajo una atmósfera de nitrógeno, la cantidad remanente de etanol puede ser variable, es decir, de aproximadamente 3 % a 13 %.

Solvato de forma N

Se ha descubierto que otra forma cristalina de solvato del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina es una forma estable preferida de la BH4 que se denominará en el presente documento “forma N”, o “hidrato N”. La forma N puede contener en total hasta un 10 % de isopropanol y agua, lo que sugiere que la forma N es un solvato en isopropanol ligeramente higroscópico. La forma N se puede obtener mediante el lavado de la forma D con isopropanol y el posterior secado al vacío a aproximadamente 30 °C. La forma N es especialmente adecuada como intermedio y material de partida para producir formas polimórficas estables. Se puede preparar la forma N de polimorfo como un polvo de sólido con un intervalo de tamaño de partículas medio deseado que varía normalmente entre 1 gm y aproximadamente 500 gm.

La forma N presenta un patrón de difracción de rayos X de polvos característico con picos característicos expresados como valores de d (Á) en: 19,5 (m) 9,9 (w), 6,7 (w), 5,15 (w), 4,83 (w), 3,91 (w), 3,56 (m) 3,33 (vs), 3,15 (w), 2,89 (w), 2,81 (w), 2,56 (w) y 2,36 (w). La figura 15 es una gráfica del patrón de difracción de rayos X característico presentado por el solvato de forma N del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina.

La forma N en isopropanol se puede obtener por disolución del diclorhidrato de L-eritro-tetrahidrobiopterina en 4,0 ml de una mezcla de isopropanol y agua (proporción del volumen de mezclado, por ejemplo, 4:1). A esta disolución se le añade lentamente isopropanol (IPA, por ejemplo, aproximadamente 4,0 ml) y la suspensión resultante se enfría hasta 0 °C y se agita durante varias horas (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 18 horas) a esta temperatura. La suspensión se filtra, y el residuo sólido se lava con isopropanol a temperatura ambiente. El material cristalino obtenido se seca a continuación a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente de 20 a 30 °C) y presión reducida (de aproximadamente 2 a 10 mbar (200 a 1000 Pa) durante varias horas (por ejemplo, aproximadamente de 5 a 20 horas). Un TG-FTIR muestra una pérdida de peso del 9,0 % a entre 25 a 200 °C, que se atribuye tanto al isopropanol como al agua. Este resultado sugiere que la forma N puede existir en forma de un solvato en isopropanol, o en forma de un solvato/hidrato en isopropanol mixto, o como una forma no solvatada que contiene una pequeña cantidad de agua.

Para la preparación de las formas del polimorfo, se pueden utilizar técnicas de cristalización bien conocidas en la técnica, tales como agitación de una suspensión (con equilibrio de fases), precipitación, recristalización, evaporación, métodos de adsorción de agua de tipo disolvente o descomposición de los solvatos. Se pueden utilizar disoluciones diluidas, saturadas o supersaturadas para la cristalización, con o sin siembra de los agentes nucleantes adecuados. Se pueden aplicar temperaturas de hasta 100 °C para formar disoluciones. Se puede aplicar un enfriamiento para iniciar la cristalización y precipitación hasta -100 °C y preferiblemente hasta -30 °C. Los polimorfos metaestables o las formas pseudopolimóficas se pueden utilizar para preparar disoluciones o suspensiones para la preparación de formas más estables y conseguir concentraciones más elevadas de las disoluciones.

Se ha descubierto sorprendentemente que el hidrato de forma D es la forma más estable de los hidratos, y las formas B y D son especialmente adecuadas para su uso en formulaciones farmacéuticas. Las formas B y D presentan algunas ventajas, tales como sencillez de fabricación, buena manipulación debido a un tamaño y morfología del cristal cómodos, muy buena estabilidad en condiciones de producción de diferentes tipos de formulación, estabilidad durante su conservación, mayor solubilidad y elevada biodisponibilidad. Por consiguiente, en un método descrito en el presente documento, la forma de la BH4 presente en una mezcla es una forma B de polimorfo cristalina estabilizada.

Las formas cristalinas del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina se pueden usar junto con ácido fólico o ácido tetrahidrofólico o sus sales farmacéuticamente aceptables, tales como las sales de sodio, potasio, calcio o amonio, por sí solas o junto con arginina. La proporción en peso entre formas cristalinas : ácidos fólicos o sus sales : arginina puede ser de aproximadamente 1:10:10 a aproximadamente 10:1:1.

VI. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones descritas en el presente documento se administran preferiblemente como formulaciones orales. Las formulaciones orales son preferiblemente formulaciones sólidas, tales como cápsulas, comprimidos, píldoras y trociscos, o formulaciones líquidas, tales como suspensiones acuosas, elixires y jarabes. Las diferentes formas de BH4 descritas en el presente documento se pueden utilizar directamente en forma de polvo (partículas micronizadas), gránulos, suspensiones o disoluciones, o se pueden combinar junto con otros principios activos farmacéuticamente aceptables por mezcla de los componentes y, opcionalmente, sometiéndolos a una división fina, y a continuación rellenar cápsulas, compuestas, por ejemplo, por gelatina dura o blanda, pueden prensarse en comprimidos, píldoras o trociscos, o suspenderse o disolverse en vehículos para suspensiones, elixires y jarabes. Los recubrimientos se pueden aplicar tras la compresión para formar píldoras.

Los ingredientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los diferentes tipos de formulación, y pueden ser, por ejemplo, aglutinantes, tales como polímeros naturales o sintéticos, excipientes, lubricantes, tensioactivos, agentes edulcorantes y aromatizantes, materiales de recubrimiento, conservantes, tintes, espesantes, adyuvantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes y vehículos para los diferentes tipos de formulaciones. Los ejemplos de aglutinantes útiles en una composición descrita en el presente documento incluyen goma de tragacanto, goma arábiga, almidón, gelatina y polímeros biológicos degradables, tales como homo- o copoliésteres de ácidos dicarboxílicos, alquilenglicoles, polialquilenglicoles y/o ácidos hidroxilcarboxílicos alifáticos; homo- o copoliamidas de ácidos dicarboxílicos, alquilendiaminas y/o ácidos aminocarboxílicos alifáticos; los correspondientes copolímeros de poliésterpoliamida, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfacenos y policarbonatos. Los polímeros biológicos degradables pueden ser lineales, ramificados o reticulados. Los ejemplos específicos son poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), y poli-d,l-lactida/glicólido. Otros ejemplos de polímeros son los polímeros solubles en agua, tales como polioxaalquilenos (polioxaetileno, polioxapropileno y polímeros mixtos de los mismos, poliacrilamidas y poliacrilamidas hidroxialquiladas, poli(ácido maleico) y ésteres o amidas de este, poli(ácido acrílico) y ésteres o amidas de este, poli(alcohol vinílico) y ésteres o éteres de este, polivinilimidazol, polivinilpirrolidona y polímeros naturales, tales como quitosano.

Los ejemplos de excipientes útiles en una composición descrita en el presente documento incluyen fosfatos, tales como fosfato de dicalcio. Los ejemplos de lubricantes para su uso en una composición descrita en el presente documento incluyen aceites tanto naturales como sintéticos, grasas, ceras, o sales de ácidos grasos, tales como estearato de magnesio.

Los tensioactivos para su uso en una composición descrita en el presente documento puede ser aniónicos, aniónicos, anfóteros o neutros. Los ejemplos de tensioactivos útiles en una composición descrita en el presente documento incluyen lecitina, fosfolípidos, sulfato de octilo, sulfato de decilo, sulfato de dodecilo, sulfato de tetradecilo, sulfato de hexadecilo y sulfato de octadecilo, oleato de Na o caprato de Na, ácidos 1-acilaminoetan-2-sulfónicos, tales como ácido 1-octanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-decanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-dodecanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-tetradecanoilaminoetan-2-sulfónico, ácido 1-hexadecanoilaminoetan-2-sulfónico, y ácido 1-octadecanoilaminoetan-2-sulfónico, y ácido taurocólico y ácido taurodesoxicólico, ácidos biliares y sus sales, tales como ácido cólico, ácido desoxicólico y glicolatos de sodio, caprato de sodio o laurato de sodio, oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, cetilsulfato de sodio, aceite de ricino sulfatado y dioctilsulfosuccinato de sodio, cocamidopropilbetaína y laurilbetaína, alcoholes grasos, colesterol, mono- o diestearato de glicerol, mono- o dioleato de glicerol y mono- o dipalmitato de glicerol y estearato polioxietileno.

Los ejemplos de agentes edulcorantes útiles en una composición descrita en el presente documento incluyen sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo. Los ejemplos de agentes aromatizantes para su uso en una composición descrita en el presente documento incluyen menta piperita, aceite de gaulteria o sabores frutales, tales como sabor a cereza o naranja. Los ejemplos de materiales de recubrimiento para su uso en una composición descrita en el presente documento incluyen gelatina, cera, goma laca, azúcar u otros polímeros biológicos degradables. Los ejemplos de conservantes para su uso en una composición descrita en el presente documento incluyen metil o propilparabenos, ácido sórbico, clorobutanol, fenol y timerosal.

El hidrato de forma D descrito en el presente documento también se puede formular como comprimido o polvo efervescente, que se desintegra en un medio acuoso para proporcionar una disolución que se puede beber. Un jarabe o elixir pueden contener el polimorfo descrito en el presente documento, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, un conservante, tal como metilparabeno, un colorante y un agente aromatizante.

Las formulaciones de liberación lenta también se pueden preparar a partir del polimorfo descrito en el presente documento para conseguir una liberación controlada del agente activo en contacto con los fluidos corporales en el tracto gastrointestinal, y para proporcionar un nivel sustancialmente constante y eficaz del principio activo en el plasma sanguíneo. Con este fin, la forma cristalina puede estar incluida en una matriz polimérica de un polímero biológico degradable, un polímero soluble en agua o una mezcla de ambos, y opcionalmente con tensioactivos adecuados. La inclusión puede significar, en este contexto, la incorporación de micropartículas en una matriz de polímeros. También se obtienen formulaciones de liberación controlada mediante la encapsulación de micropartículas dispersas o microgotas emulsionadas mediante técnicas de recubrimiento por emulsión o dispersión conocidas.

Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente está entre las capacidades de los expertos en la técnica. Las dosificaciones típicas de la BH4 comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, que suelen aumentar hasta aproximadamente 5 (1 mg/kg x 5 kg de peso corporal) a 3000 mg/día (30 mg/kg x 100 kg de peso corporal). Dichas dosis se pueden administrar en una sola dosis o se pueden dividir en múltiples dosis. Aunque se contempla una administración continua diaria, puede ser deseable cesar la terapia con BH4 cuando los síntomas de los niveles de Phe se reducen por debajo de un determinado umbral. Por supuesto, el tratamiento se puede reiniciar en el caso de que los niveles de Phe aumenten de nuevo.

Se entiende que la dosis adecuada de una composición dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si es el caso, la frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado (es decir, la cantidad de disminución en la concentración de Phe en plasma deseada). La frecuencia de la dosificación también depende de los efectos farmacodinámicos sobre los niveles de Phe. Si el efecto dura 24 horas para una sola dosis. Sin embargo, la dosificación más preferida se puede personalizar para cada sujeto, y se entiende que los expertos en la técnica pueden determinarla sin experimentación excesiva. Esto suele implicar un ajuste de una dosis normalizada, por ejemplo, la reducción de la dosis si el paciente tiene un bajo peso corporal.

Tal como se ha analizado anteriormente, la dosis total necesaria para cada tratamiento puede administrarse en una sola dosis. Las composiciones de BH4 y proteínas se pueden administrar por sí solas o junto con otros productos terapéuticos dirigidos a la enfermedad o dirigidos a otros síntomas de la misma.

Como es evidente a partir de la memoria descriptiva presentada en el presente documento, en un amplio aspecto, la presente solicitud contempla la aplicación clínica de una terapia combinada que comprende una primera composición que contiene una formulación de BH4 cristalizada, y una segunda composición que contiene una formulación de proteínas médica (por ejemplo, PHENEX). Por tanto, las composiciones deberán formularse como composiciones farmacéuticas adecuadas, es decir, en una forma adecuada para aplicaciones in vivo en dichas terapias combinadas. En general, esto conlleva la preparación de composiciones que fundamentalmente están exentas de pirógenos, así como otras impurezas que podrían ser perjudiciales para los seres humanos o animales. Preferiblemente, la composición de BH4 cristalizada puede ser tal que se puede añadir directamente a las formulaciones de proteínas ya existentes utilizadas para el tratamiento de la PKU.

En general, se deseará utilizar sales y tampones adecuados para convertir la BH4 en adecuada para su captación. Las composiciones acuosas para su uso de acuerdo con la presente invención comprenden una cantidad eficaz de la BH4 disuelta o dispersada en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden administrarse por vía oral o mediante una inyección.

La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas, u otro tipo de reacciones indeseables cuando se administran a un animal o ser humano. Tal como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con las composiciones terapéuticas, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos suplementarios en las composiciones. En ejemplos de realizaciones, la formulación de proteínas médica puede comprender sólidos de jarabe de maíz, aceite de cártamo con alto contenido en oleico, aceite de coco, aceite de soja, L-leucina, fosfato de calcio tribásico, L-tirosina, L-prolina, acetato de L-lisina, DATEM (un emulsionante), L-glutamina, L-valina, fosfato de potasio dibásico, L-isoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, L-asparagina monohidratada, L-serina, citrato de potasio, L-treonina, citrato de sodio, cloruro de magnesio, L-histidina, L-metionina, ácido ascórbico, carbonato de calcio, ácido L-glutámico, diclorhidrato de L-cistina, L-triptófano, ácido L-aspártico, cloruro de colina, taurina, m-inositol, sulfato ferroso, palmitato de ascorbilo, sulfato de cinc, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, cloruro de sodio, niacinamida, tocoferoles mixtos, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, sulfato de manganeso, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, beta-caroteno, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenato de sodio, cloruro de cromo, molibdato de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina. Los aminoácidos, minerales y vitaminas del suplemento se deben proporcionar en cantidades que proporcionan la dosis diaria recomendada de cada uno de los componentes.

Tal como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el ingrediente activo, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones activas para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen las preparaciones farmacéuticas clásicas de la BH4 que se han analizado en el presente documento, así como las conocidas por los expertos en la técnica. Las fórmulas de proteínas, tales como, por ejemplo, Phenex, son también conocidas por los expertos en la técnica. La administración de estas composiciones se realizará mediante cualquier vía habitual para la suplementación de la dieta. Las proteínas se administran preferiblemente por vía oral, al igual que la BH4.

Los compuestos activos se pueden preparar para su administración en forma de disoluciones de la base libre o como sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas, de modo adecuado, con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de conservación y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones de BH4 se pueden preparar como formas farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable. Dichas composiciones incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida en la medida que se pueda administrar fácilmente mediante una jeringuilla. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y tiene que conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse por medio de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timerosal. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con el resto de los diversos ingredientes indicados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado a vacío y liofilización, que dan como resultado un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una de sus disoluciones anteriormente esterilizadas mediante filtración.

La BH4 usada en una composición descrita en el presente documento se formula en forma de una sal de diclorhidrato.

Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se pueden formar con metales o aminas, tales como metales alcalinos o alcalinotérreos o aminas orgánicas. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos se pueden preparar también con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, cationes de amonio y amonio cuaternario. Son también posibles los carbonatos o bicarbonatos. Los ejemplos de metales utilizados como cationes son sodio, potasio, magnesio, amonio, calcio, o férrico. Los ejemplos de aminas adecuadas incluyen isopropilamina, trimetilamina, histidina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína.

Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen sales de ácidos orgánicos o inorgánicos. Los ejemplos de sales de ácidos adecuadas incluyen clorhidratos, acetatos, citratos, salicilatos, nitratos, fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, las formadas con ácidos acético, cítrico, oxálico, tartárico, o mandélico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos, sulfo- o fosfoácidos o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, tales como los 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de proteínas natural, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan-1,2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 4-metilbencensulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosfoglicerato, glucosa 6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con formación de ciclamatos), o con otros compuestos de ácido orgánico, tales como ácido ascórbico.

Específicamente, se prefieren las sales de BH4 con ácidos orgánicos o inorgánicos. Los ejemplos de formas salinas alternativas de BH4 incluyen las sales de BH4 de ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido fumárico, y ácido mandélico.

La frecuencia de la dosificación de BH4 dependerá de los parámetros farmacocinéticos del agente y de las vías de administración. La formulación farmacéutica óptima será determinada por los expertos en la técnica dependiendo de la vía de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042), págs. 1435 1712. Dichas formulaciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la eliminación in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, la dosis adecuada se puede calcular según el peso corporal, la superficie específica corporal o el tamaño del órgano. Otros ajustes de los cálculos necesarios para determinar la dosis de tratamiento adecuada se realizan de forma rutinaria por los expertos en la técnica sin experimentación excesiva, especialmente a la luz de la información de la dosificación y los ensayos descritos en el presente documento, así como los datos farmacocinéticos observados en ensayos clínicos con seres humanos o animales.

Las dosificaciones adecuadas se pueden determinar mediante el uso de ensayos establecidos para determinar los niveles de Phe en sangre junto con datos importantes de respuesta a la dosis. El médico a cargo del paciente determinará el régimen de dosificación final, teniendo en cuenta factores que pueden modificar la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y alimentación del paciente, la gravedad de cualquier infección, el momento de la administración y otros factores clínicos. A medida que se lleven a cabo estudios, se obtendrá más información con respecto a los niveles de dosificación adecuados y la duración del tratamiento para enfermedades y afecciones específicas.

Se apreciará que la invención puede ser útil en los campos de la medicina humana y la medicina veterinaria. Así, el sujeto que se va a tratar puede ser un mamífero, preferiblemente un ser humano u otro animal. Para fines veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja, que incluyen vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de compañía, tales como perros y gatos, animales exóticos y/o de zoológico, animales de laboratorio, que incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsteres; y aves de corral, tales como pollos, pavos, patos y gansos.

VII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se han incluido para demostrar realizaciones preferidas de la presente invención. Los expertos en la técnica deberán apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y, por tanto, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica.

EJEMPLO 1

Evaluación clínica con 6R-tetrahidrobiopterina

El siguiente ejemplo proporciona una guía sobre los parámetros a utilizar para la evaluación clínica de la BH4. Tal como se ha analizado detalladamente en el presente documento, la BH4 se utilizará en el tratamiento de la HPA, incluyendo la HPA, la fenilcetonuria (PKU) leve y la PKU clásica. Se realizarán ensayos clínicos que proporcionarán una evaluación de las dosis orales diarias de BH4 en relación con la seguridad, la farmacocinética, y la respuesta inicial de los criterios de valoración clínicos tanto derivados como definidos. El ensayo clínico se realizará durante un mínimo de 6 semanas para recoger suficiente información de seguridad de 30 pacientes evaluables.

La dosis inicial de los ensayos clínicos variará de 10 a 20 mg/kg. En el caso en que dicha dosis no produzca una reducción del exceso de niveles de fenilalanina (Phe) en el plasma de un paciente, o que produzca un beneficio clínico directo significativo medido como la capacidad de aumentar la ingesta diaria oral de Phe sin aumentar los niveles de Phe en plasma, la dosis deberá aumentarse según sea necesario, y mantenerse durante un periodo mínimo adicional de 6 semanas para establecer la seguridad y evaluar también la eficacia. Las dosis inferiores, por ejemplo, unas dosis de entre 5 y 10 mg/kg, también están incluidas.

Las mediciones de la seguridad incluirán acontecimientos adversos, reacciones alérgicas, analítica completa (función renal y hepática), análisis de orina, y CBC con diferencial. Además, se realizará el seguimiento de otros parámetros, incluyendo la reducción de los niveles de Phe en sangre, análisis neuropsicológicos y cognitivos, y valoraciones globales. El presente ejemplo también incluye determinar los parámetros farmacocinéticos del fármaco en la circulación, y una distribución general y semivida de la 6R-BH4 en sangre. Se anticipa que estas medidas ayudarán a relacionar la dosis con la respuesta clínica.

Métodos

Los pacientes que tienen niveles elevados de Phe en plasma se someterán a un análisis inicial que incluye anamnesis y exploración física, pruebas neuropsicológicas y cognitivas, un conjunto normalizado de ensayos de laboratorio clínico (CBC, panel 20, CH50, UA), niveles de pterinas en orina, niveles de dihidropteridina reductasa (DHPR), y un panel sanguíneo (plasma) de los aminoácidos séricos en ayunas. La dosis propuesta para seres humanos de 10 a 20 mg/kg de BH4 se administrará dividida en una a tres dosis diarias. El paciente se seguirá de cerca con visitas semanales a la clínica. Los pacientes volverán a la clínica para una evaluación completa una semana tras completar el período de tratamiento. En caso de necesitar aumento de la dosis, el paciente deberá seguir el mismo programa detallado anteriormente. La seguridad se controlará durante la totalidad del ensayo clínico.

Los pacientes inscritos se aleatorizarán para recibir BH4 o un placebo. T ras un periodo inicial de dos a cuatro semanas, todos los participantes del estudio comenzarán una dieta controlada con una ingesta limitada de Phe durante un total de cuatro a seis semanas. Tras completar las primeras dos a cuatro semanas con la restricción dietética, todos los participantes del estudio se retrocruzarán en su aleatorización y seguirán durante un periodo adicional de dos a cuatro semanas. Los niveles de Phe en sangre y otros parámetros bioquímicos se seguirán de cerca al finalizar cada periodo.

La evaluación de los resultados neuropsicológicos incluirá mediciones del mantenimiento de la atención; memoria de trabajo; y capacidad para realizar operaciones complejas. Los pacientes que completen en ensayo clínico, y que se beneficien del tratamiento mostrando una disminución beneficiosa de los niveles de Phe en plasma, recibirán la oferta de continuar con la terapia con BH4 a través de un protocolo extendido siempre que las condiciones de seguridad y eficacia lo permitan, o hasta aprobación de la BLA.

Diagnóstico y criterios de inclusión/exclusión

El paciente puede ser varón o mujer, de edad de doce o más años con un diagnóstico documentado de HPA o PKU leve confirmada por ensayos genéticos y evidencia de niveles elevados de Phe en sangre. El estudio incluirá pacientes de HPA o PKU que no siguen estrictamente un control dietético. Las pacientes femeninas en edad de procrear deben tener un resultado negativo en una prueba de embarazo (p-hCG en orina) antes de cada dosis y se les aconseja utilizar un método anticonceptivo médicamente aceptado durante la totalidad del estudio. Un paciente quedará excluido de este estudio si el paciente muestra evidencias de una deficiencia primaria en BH4, ha recibido anteriormente varias dosis de BH4 durante más de 1 semana de tratamiento; está embarazada o en periodo de lactancia; ha recibido un fármaco en investigación en los 30 días anteriores a inscribirse en el estudio; o tiene una afección médica, enfermedad recurrente grave, u otra circunstancia excluyente que pueda disminuir significativamente el cumplimiento del estudio.

Dosis, vía y posología

Los pacientes recibirán BH4 a una dosis de 5-10 mg/kg por día. En el caso en que los niveles de Phe en sangre no disminuyan en una cantidad razonable y no se observen beneficios clínicos, la dosis se aumentará según sea necesario. El aumento de la dosis se producirá solamente después de que todos los pacientes se hayan sometido a un mínimo de 2 semanas de tratamiento. La dosis de BH4 diaria se administrará por vía oral como líquido, polvo, comprimidos o cápsulas. La dosis diaria total puede proporcionarse como una sola dosis o quizás dividirse en dos o tres dosis diarias. Los pacientes se seguirán clínicamente, así como para cualesquiera reacciones adversas. Si se observa cualquier síntoma inusual, la administración del fármaco del estudio se detendrá inmediatamente, y se tomará una decisión sobre la continuación del estudio.

Intervención en la dieta

Tras la aleatorización inicial y el período de tratamiento de dos semanas, todos los participantes del estudio se someterán a una asesoría dietética y seguirán una dieta con restricción de Phe convencional complementada con alimentos médicos específicos de Phe durante un total de cuatro a seis semanas. Las dietas se gestionarán en el domicilio, y la ingesta se registrará en diarios. El análisis de las ingestas de nutrientes y alimentos médicos y el porcentaje de ingesta diaria recomendada (IDR) se comparará entre los grupos de tratamiento.

Seguridad de la BH4

La terapia con BH4 se considerará segura si no se producen reacciones al fármaco agudas o crónicas significativas durante el estudio. La administración a largo plazo del fármaco se determinará como segura si no se observan anomalías significativas en las exploraciones clínicas, los resultados del laboratorio clínico u otros estudios adecuados.

EJEMPLO 2

Preparación de una forma estabilizada cristalizada de BH4

La solicitud de patente provisional de Estados Unidos con número de serie 60/520.377, titulada "Polymorphs of (6R)-L-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride" presentada el 17 de noviembre de 2003 a nombre de los solicitantes Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiza y Viola GROEHN de Dachsen, Suiza, y número de expediente interno asignado de Merck-Eprova 216, y la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie US 10/990.316, titulada "Polymorphs of (6R)-L-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride" presentada conjuntamente con la presente el 17 de noviembre de 2004 a nombre de los solicitantes Rudolf MOSER, de Schaffhausen, Suiza y Viola GROEHN de Dachsen, Suiza y número de expediente interno asignado de Merck-Eprova 216/US CIP (ambas solicitudes de Moser et al. se denominan conjuntamente en el presente documento como "solicitudes de Moser"). Los ejemplos de dicha memoria descriptiva describen estudios de espectros de rayos X y Raman para caracterizar los polimorfos de la BH4. La siguiente descripción proporciona antecedentes adicionales y una caracterización breve de algunas de dichas composiciones de ejemplo.

Los resultados obtenidos durante el desarrollo del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina (solicitudes de Moser) indican que el compuesto puede poseer formas polimórficas. El interés continuado en este campo requiere un método eficaz y fiable para preparar los polimorfos individuales del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina y condiciones de cristalización controladas para proporcionar polimorfos, que son preferiblemente estables y fáciles de manipular y procesar durante el proceso de fabricación y preparación de formulaciones.

Las técnicas de cristalización bien conocidas en la técnica para producir cristales de fármacos se utilizan para preparar las formas polimórficas. Dichas técnicas incluyen técnicas, tales como suspensión, precipitación, recristalización, evaporación, métodos de adsorción de agua similares a disolventes o descomposición de los solvatos. Se pueden utilizar disoluciones diluidas, saturadas o supersaturadas de la BH4 para la cristalización, con o sin siembra de los agentes nucleantes adecuados. Se pueden aplicar temperaturas de hasta 150 °C para formar disoluciones del fármaco. Se puede aplicar un enfriamiento para iniciar la cristalización y precipitación hasta -100 °C y preferiblemente hasta -30 °C. Las formas polimórficas o pseudopolimórficas metaestables se pueden utilizar para preparar disoluciones o suspensiones de formas más estables y conseguir concentraciones más elevadas en las disoluciones.

Tal como se analiza en las solicitudes de Moser, la forma polimórfica se puede obtener mediante la cristalización de BH4 en mezclas de disolventes polares. Las solicitudes de Moser también describen un proceso para preparar la forma polimórfica del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina, que comprende la disolución, opcionalmente a temperaturas elevadas, de una forma sólida de menor energía que la forma reivindicada del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina en una mezcla de disolventes polares, la adición de semillas a la disolución, el enfriamiento de la suspensión obtenida y el aislamiento de los cristales formados.

La disolución se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o hasta 70 °C. Más preferiblemente, la disolución se lleva a cabo a temperaturas de hasta 50 °C. El material de partida se puede añadir a la mezcla final de disolventes para su disolución, o como alternativa, el material de partida primero se puede disolver en agua y otros disolventes se pueden añadir juntos o uno después de otro. La disolución de la BH4 preferiblemente se agita. El enfriamiento puede significar temperaturas de hasta -80 °C, preferiblemente hasta de -40 °C a 0 °C. En algunas realizaciones, para iniciar la cristalización del polimorfo de BH4, la disolución se puede sembrar. Las semillas adecuadas pueden incluir una parte de la forma polimórfica de otro lote de cristales, o cristales de una morfología similar o idéntica. Tras el aislamiento, la forma cristalina se puede lavar con acetona o tetrahidrofurano y secarse con las técnicas usadas habitualmente para secar cristales de fármacos.

Las formas polimórficas de BH4 descritas en las solicitudes de Moser son formas cristalinas muy estables del fármaco. La forma polimórfica se puede eliminar mediante filtración fácilmente, secarse y molerse hasta los tamaños de partículas deseados para las formulaciones farmacéuticas. Estas propiedades excepcionales convierten esta forma polimórfica en especialmente factible para la aplicación farmacéutica. La estabilidad de la forma polimórfica de BH4 se determinó una vez que la BH4x2HCl (la forma polimórfica) se había almacenado durante 8 meses en una bolsa de autocierre Minigrip a 40 °C y una humedad relativa del 75 %. La calidad se comprobó en diferentes intervalos durante el periodo de 8 meses mediante HPLC. Después de 8 meses, la calidad y la estabilidad del polimorfo fueron sorprendentemente similares a la estabilidad observada al principio:

De acuerdo con ello, las solicitudes de Moser proporcionan descripciones de composiciones farmacéuticas que comprenden una forma polimórfica del diclorhidrato de (6R)-L-eritro-tetrahidrobiopterina y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Además de las solicitudes de Moser, los expertos en la técnica también deben consultar las patentes de Estados Unidos con números 6.596.721; 6.441.168; y 6271.374, que describen diferentes métodos y composiciones para producir sales cristalinas estables del ácido 5-metiltetrahidrofólico y métodos y composiciones para producir formas estables del ácido 6R-tetrahidrofólico, y métodos y composiciones para producir formas estables de los ácidos 6S- y 6R-tetrahidrofólico. Cada una de estas patentes indica métodos para producir formas cristalinas de agentes y técnicas para caracterizar dichos agentes. Dichos métodos se pueden utilizar para producir formas estables de BH4 para su uso en composiciones farmacéuticas para los métodos de tratamiento indicados en el presente documento.

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en el presente documento pueden ser realizados y ejecutados sin experimentación excesiva, considerando la presente descripción.

EJEMPLO DE REFERENCIA 3

Administración de tetrahidrobiopterina a seres humanos con elevados niveles de Phe en suero

Se llevó a cabo un estudio abierto, de dosis individual y múltiple en un total de 20 pacientes para demostrar la seguridad y eficacia de la tetrahidrobiopterina en seres humanos con elevados niveles de fenilalanina en sangre (> 600 pmol/l). Los criterios para la inclusión en el estudio incluyeron (1) valor inicial de los niveles de Phe en sangre de >600 pmol/l, (2) edad de al menos 8 años. Los criterios para la exclusión del estudio incluyeron (1) embarazo o lactancia, (2) enfermedades o afecciones concurrentes que requieren medicación o tratamiento, (3) tratamiento concurrente con cualquier fármaco conocido por inhibir la síntesis de folato, y (4) tratamiento con cualquier fármaco en investigación en los últimos 30 días. Cada uno de los pacientes se identificó también por tener una mutación en el gen de la fenilalanina hidroxilasa (PAH). Los sujetos del estudio se sometieron a evaluaciones de los valores iniciales, incluyendo los antecedentes médicos con evaluación de signos y síntomas relacionados con la fenilcetonuria (PKU) o la hiperfenilalaninemia (HPA), exploración física, signos vitales, niveles de aminoácidos en suero sanguíneo (es decir, fenilalanina, tirosina y triptófano), y ensayos de laboratorio habituales (química, hematología y análisis de orina) antes de la inclusión en el estudio.

El fármaco sometido a ensayo era (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina, conocido también como 2-amino-6-(1,2-dihidroxipropil)-5,6,7,8-tetrahidro-3H-pteridin-4-ona tetrahidrobiopterina, o sapropterina (BH4 o 6R-BH4). El fármaco se obtuvo en comprimidos orales de 10 mg o 50 mg de Schircks Laboratories, Suiza (producto n.° 11.212, diclorhidrato de (6R)-5,6,7,8-tetrahidro-L-biopterina). La semivida de la sal diclorhidrato 6R-BH4 de Schircks es de aproximadamente de 3,5 horas

No se permitió la administración de fármacos conocidos por inhibir la síntesis de folato, tales como bactrim metotrexato, o 5-FU durante el estudio. Antes del inicio de la dosificación con 6R-BH4, se requirió un periodo de descanso terapéutico de 7 días de cualquier fármaco conocido por inhibir la síntesis de folato. No se permitió tomar fármacos en investigación durante la participación en el estudio o en un plazo de 30 días antes de la inscripción en el estudio.

En un máximo de 4 semanas tras la finalización de las evaluaciones de los valores iniciales, los sujetos candidatos comenzaron la primera etapa del estudio. Se administraron por vía oral dosis individuales crecientes de 10 mg/kg, 20 mg/kg y 40 mg/kg de 6R-BH4, con un periodo de descanso terapéutico de al menos 7 días entre cada dosis y se controlaron los sujetos 24 horas después de cada dosis. Los sujetos se sometieron a una evaluación de la seguridad y a mediciones de los niveles de aminoácidos en sangre (es decir fenilalanina, tirosina, y triptófano) antes y 24 horas después de cada dosis de 6R-BH4. Se midió la tensión arterial 30 minutos y 1 hora después de cada dosis. Las evaluaciones de la seguridad incluyeron exámenes físicos, signos vitales, evaluación en serie de signos y síntomas relacionados con PKU o HPA, registro de acontecimientos adversos y control de los cambios en los parámetros de laboratorio (química, hematología y análisis de orina). Se pidió a los sujetos que continuaran su dieta habitual sin ninguna modificación y que registraran la ingesta diaria de alimentos y bebidas durante el estudio.

Después que se completara la primera etapa del estudio, los sujetos iniciaron la segunda etapa del estudio durante la cual recibieron 10 mg/kg de 6R-BH4 diariamente en una forma farmacéutica oral, durante un total de 7 días Tras un periodo de descanso terapéutico de al menos 7 días, cada sujeto recibió 20 mg/kg de 6R-BH4 diariamente durante un total de 7 días. Durante la segunda etapa del estudio, se controló a los sujetos antes de la dosificación, a las 24 y 72 horas después de la primera dosis, y en el 7° día de la dosificación en cada uno de los dos niveles de la dosis. El control incluyó una evaluación de la seguridad como se ha descrito anteriormente, la medición de los niveles de aminoácidos en suero sanguíneo (es decir, fenilalanina, tirosina y triptófano) y la evaluación de la ingesta oral de fenilalanina y tirosina. Se pidió a los sujetos que continuaran su dieta habitual sin ninguna modificación y que registraran la ingesta diaria de alimentos y bebidas durante el estudio

Tras una sola dosis de 6R-BH4 (10 mg/kg), la Phe en sangre disminuyó en un 10 % ± 0,26 % del valor inicial. Las dosis individuales de 6R-BH4 a 20 mg/kg y 40 mg/kg mostraron una disminución media del 17 % ± 0,28 % y 27 % ± 0,25 % respectivamente. La reducción de los niveles de Phe en sangre pareció ser dependiente de la dosis

La figura 16 muestra el nivel medio de fenilalanina en sangre después de 10 y 20 mg/kg de 6R-BH4 diariamente durante 7 días, en 14 de 20 pacientes que respondieron al tratamiento Para los fines de este estudio una disminución en los niveles de Phe en sangre del 30 % se consideró que era "sensible", aunque los pacientes que presentan menos disminución se beneficiarían también del tratamiento con BH4. El ensayo de siete días mostró una disminución sostenida de la concentración de Phe en sangre en un 70 % de los pacientes (14/20) que tomaron 20 mg/kg. De estos 14 pacientes, 10 (71 %) respondieron favorablemente a 10 mg/kg/día. Se observó que la tirosina en sangre aumentaba en algunos pacientes, pero no en todos; algunos pacientes mostraron unos aumentos de >80 % de los niveles de tirosina desde los valores iniciales. Las respuestas de Phe en sangre individuales a las dosis múltiples de 10 mg/kg de BH4 se muestran en 11 adultos (figura 17) y 9 niños (figura 19). Las respuestas de Phe en sangre individuales a dosis múltiples de 20 mg/kg de BH4 se muestran en 11 adultos (figura 18) y en 9 niños (figura 20).

Por tanto, un ensayo de carga de una sola dosis fue inadecuado para identificar pacientes que respondían al tratamiento de BH4 con una reducción en el nivel de Phe en sangre del 30 % o más. Un ensayo de carga de 7 días identificó satisfactoriamente un alto porcentaje de pacientes sensibles. El ensayo de carga de 7 días con 6R-BH4 a 20 mg/kg identificó el 70 % de los pacientes con PKU que respondieron a los 20 mg/kg de BH4. De los 14 respondedores, un 71 % mostró también un 30 % o más de reducción en el nivel de Phe en sangre con la dosis inferior de 10 mg/kg de 6R-BH4.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. - Un polimorfo cristalino del diclorhidrato de (6R)-L-tetrahidrobiopterina (BH4) para su uso en el tratamiento de un sujeto con fenilcetonuria (PKU), en el que la BH4 se administra en una única dosis una vez diaria, en el que la forma cristalina muestra un patrón de difracción de rayos X de polvos, expresado en valores de d (Á) en: 8,7 (vs), 6,9 (w), 5,90 (vw), 5,63 (m), 5,07 (m), 4,76 (m), 4,40 (m), 4,15 (w), 4,00 (s), 3,95 (m), 3,52 (m), 3,44 (w), 3,32 (m), 3,23 (s), 3,17 (w), 3,11 (vs), 3,06 (w), 2,99 (w), 2,96 (w), 2,94 (m), 2,87 (w), 2,84 (s), 2,82 (m), 2,69 (w), 2,59 (w), 2,44 (w).

2. - La BH4 para su uso en el tratamiento de la reivindicación 1, en la que dicha BH4 se administra en combinación con una dieta con proteínas restringidas.

3. - La BH4 para su uso en el tratamiento de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha BH4 se administra por vía oral.

4. - La BH4 para su uso en el tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha BH4 se administra en una única dosis diaria de 5 mg/kg a 30 mg/kg.

5. - La BH4 para su uso en el tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la dosis diaria es de 10 mg/kg a 20 mg/kg.

6.- La BH4 para su uso en el tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la dosis diaria es de 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg o 20 mg/kg.