MXPA04006279A - Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora, formulaciones y usos del licopeno obtenido. - Google Patents

Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora, formulaciones y usos del licopeno obtenido.

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Abstract

El procedimiento de fermentacion con cepas seleccionadas de B. Trispora expuesto en la presente invencion permite alcanzar unos niveles de produccion de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los metodos de aislamiento, purificacion y formulacion son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los generos Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extraccion permite una simplificacion en el proceso de recuperacion y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulacion proporcionan un alto valor anadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicacion directa en los campos alimentario y farmaceutico.

Description

con (una) indicación es) relativa(s) a material biológico Para códigos de dos letras y otras abreviaturas, véase la sección depositado en virtud de lo dispuesto en la Regla 13bis, "Guidance Notes on Codes and Abbreviations" que aparece al aparte de la descripción principio de cada número regular de la Gacela del PCT.
PROCEDIMIENTO MEJORADO DE PRODUCCION DE LICOPENO MEDIANTE LA FERMENTACION DE CEPAS SELECCIONADAS DE Blakeslea trispora, FORMULACIONES Y USOS DEL LICOPENO OBTENIDO.
CAMPO DE LA INVENCION El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.
Estado de la técnica Los carotenoides están ampliamente distribuidos en la naturaleza, confiriendo su característico color, desde amarillo hasta roj o profundo, a numerosas sustancias naturales como zanahorias, pimientos, tomates, flores o determinados microorganismos entre los que se encuentran ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos . Los o licopeno y (ii) moléculas denominadas xantofilas, las cuales contienen oxígeno en diferentes i formas (grupos hidroxi, epoxi , etc.), entre las que se encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina , luteína, etc. Ambos grupos de compuestos presentan un comportamiento diferente en cuanto a sus propiedades físico-químicas y solubilidad en disolventes orgánicos. Todos estos compuestos juegan ur. papel importante en la dieta humana habiéndose estudiado ampliamente sus propiedades como antioxidantes para la prevención del cáncer y otras enfermedades humanas y como precursores de la vitamina A. Recientemente se ha¡ demostrado en ratas que el licopeno inhibe el efecto dañino del nitriloacetato férrico sobre el ADN y previene la necrosis del hígado [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys . vol . 396]. Adicionalmente, debido a sus coloraciones desde amarilla hasta roja, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivps alimentarios debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ. , Perlman D. (eds) . icrobial Technology, !2nd. Edn, vol . 1 Academic Press, NY, pp. 529-544]. El licopeno (C4oH56) es un intermediario de la ruta biosintética de ß-caroteno y las xantofilas. Posee un peso molecular de 536,85 y la siguiente fórmula molecular: Licopeno El licopeno, además de actuar como antioxidante, previene enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer y actúa en el control del crecimiento [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cáncer Inst . 87: 1767-1776; Stahl . y Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336: 1-9; Clinton, SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Esto ha dado lugar a un incremento de la demanda por parte de los consumidores. La obtención de licopeno como compuesto de alta pureza ha estado ligada en el pasado I a la síntesis química [US 5208381; US 5166445; US 4105855; I US 2842599]. No obstante, actualmente existen vías alternativas basadas en fuentes de licopeno de origen natural y procesos de extracción específicos. La producción de j carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Las preparaciones de licopeno de i origen biológico se obtienen a partir de tomate [PCT WO 97/48287, EP 608027] o mediante la fermentación de hongos mucorales de los généros Phycomyces, Blakeslea y Choanephora [GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416,' WO 00/77234]. Para conseguir una máxima producción de carotenoides con B . trispora es preciso fermentar conjuntamente las cepas (+) y (-) [Ciegler, A. (1965) Advances in Applied Microbiology 7: 1-34; Plempel, M. (1965) Planta 65: 225-231; Sutter, RP . y Rafelson, ME. (1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. El incremento de producción de carotenoides en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor ß o ácidos trispóricos [WO 00/77234, Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7: 175-187]. Para biosintetizar ácidos trispóricos, el ß-caroteno producido por las cepas (+) y (-) es metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4 -idihidrotrisporol . La cepa ( +) utiliza el 4 -dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4-dihidrotrisporato) . Por su parte, la cepa(-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol . Finalmente, el metil-4-dihidrotrisporato es .convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+) . Esta descripción de la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos , algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos son variables en función de las cepas. La ruta biosintética de ß-caroteno (ver esquema 1) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados con B. trispora como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloid.es [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas: (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato para formar fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenaba, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclása, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de ß-caroteno. El análisis de mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de ß-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B.J. y Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Para la producción de licopeno es preciso disponer de cepas de B. trispora carentes de actividad licopeno ciclasa o alternativamente adicionar al medio de fermentación compuestos químicos inhibidores de la citada actividad enzimática.
Mevalonato 4 Isopentenil-PP OPP -OPP -OPP Geranilgeranil-PP U Fitoeno sintasa [carRP) Fitoeno ' JJ_ Fitoeno deshidrogenasa (carB) Fitoflueno Fitoeno deshidrogenasa (carB) ?-caroteno Fitoeno deshidrogenasa (carB) Neurosporeno jj^ Fitoeno deshidrogenasa (carB) Licopeno Licopeno ciclasa (carRP) ?-Caroteno Jt JJ^ Licopeno ciclasa (carRP) P-Caroteno ¾ ESQUEMA 1 En las patentes' GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 y WO 00/77234 se describe la obtención de licopeno mediante la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora. Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen métodos de fermentación de B. trispora basados en el control del pH entre valores de 7,0 y 9,5, obteniendo producciones de 99,7 mg/1 de licopeno tras 7 días de fermentación. Las patentes JP 73016189 Y JP 73016190 describen métodos de producción de licopeno con hongos mucorales basados en la adición aminas terciarias. La patente RU 2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las sustancias descritas en dichas patentes, ¡se ha publicado el uso de otras bases nitrogenadas heterocíclicas para bloquear la síntesis de carotenoides a nivel de licopeno: nicotina [JP 09313167], imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados sustituidos [US 3369^74 ; Ninet L., Renaut J. (1979) En: Peppler HJ, Perlman D (eds) . Microbial Technology, 2nd. Edn, vol . 1 Academic Preós, NY, p . 529-544]. Asimismo, se han descrito mutantes de B. trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de adicionar aminas terciarias [Menta B.J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Appl¡. Microbiol . Biotechnol . 42 :836-838]. Además de los ¡hongos mucorales anteriormente mencio-nados, se ha descritd la producción de licopeno con algas [JP 09313167 y JP 2000152778], mediante la fermentación de Streptomyces chrestoípyceticus var. rubescens [US 3467579] y modificando la ruta biosintética de carotenoides de Fla ojbacte ium sp. R1534 [US 6124113]. El licopeno puede ser obtenido a partir de productos vegetales tales como|: tomate, zanahoria, pimiento, aceites vegetales, etc. Así, en la patente WO 97/48287 se describe un procedimiento para la preparación de oleorresinas ricas en licopeno a partir de tomates mediante el estrujado del tomate hasta la obtención de| la pulpa, extracción del licopeno de la pulpa con disolventes orgánicos y posterior eliminación del solvente por evaporación, dando lugar a una oleorresina con un contenido en licopeno entre el 2-10%. Procedimientos similares de obtención de oleorresinas ricas en carotenoides en general y licopeno en particular a partir de vegetales y aceites sé describen en diferentes patentes, como en la US 5245095 y la EP 580745, mediante la precipitación con sales de calcio, la US 5019668, utilizando un procedimiento de transesterificación con aceites y posterior destilación, la WO 95¡/16363, que describe el fraccionamiento del tomate en diferentes fracciones que incluyen una oleorresina rica en carotenoides, y la PCT WO 90/08584, que describe la extracción de licopeno mediante la utilización de fluidos en estado supercrítico, aunque el extracto obtenido es una mezcla de diferentes carotenoides y los rendimientos de extracción son muy bajos debido a su baja solubilidad.
En todos estos casos, debido a la baja concentración de licopeno en estos productos naturales y la disposición intracelular de este compuesto en determinados orgánulos como cloroplastos o cromoplastos , los rendimientos de extracción y la pureza del producto obtenido son bajos, obteniéndose oleorresinas ricas en licopeno o productos crudos deshidratados junto a cantidades variables de otros compuestos, carotenoides o no . En la mayoría de los casos los procedimientos de extracción descritos requieren la preparación del fruto mediante molienda o extrusión para facilitar la extracción del disolvente y así liberar el contenido intracelular rico en licopeno. Por último en la mayoría de los procesos descritos en estas patentes se requiere el uso de disolventes orgánicos que aparecen como trazas en la oleorresina obtenida. Asimismo en la patente IL 107999 se describe la preparación de oleorresinas muy ricas en licopeno a partir de pulpas de tomates, aunque al igual que en los casos a teriores no se obtienen cristales de licopeno de alta pureza sino concentrados lipidíeos ricos en licopeno. Por otro lado, en la patente WO 97/15554 se describe la extracción de carotenoides de origen vegetal a partir de zanahorias y tomates, entre los que se incluyen el licopeno, mediante el aislamiento de cloroplastos y cromoplastos , para proceder a continuación a la digestión de dichos orgánulos con enzimas hidrolíticas de proteínas como pectinas y/o proteasas que permiten la liberación del licopeno unido a diferentes proteínas estructurales. Mediante un tratamiento alcalino posterior y una extracción con mezclas alcohólicas de bajo peso molecular es posible obtener extractos de licopeno con una riqueza y pureza superior a las oleorresinas, aunque sin obtenerse cristales purificados de licopeno sino extractos crudos ricos en licopeno. Igualmente en la patente EP 608027 A2 se obtienen extractos concentrados de licopeno mediante el aislamiento de cromoplastos de tomates en los cuales se encuentra el licopeno en forma cristalina. Dichos extractos de cromoplastos de tomate ricos en licopeno son utilizados directamente como colorantes sin extracción posterior de los cristales de licopeno, evitando el cambio de coloración del licopeno durante la extracción y obviando el uso de solventes orgánicos. De acuerdo al procedimiento descrito en esta patente no es posible obtener licopeno puro en forma cristalina apto para uso en composiciones alimenticias o farmacéuticas, sino únicamente como colorante alimentario en forma deshidratada, liofilizada o congelada .
Otra fuente importante de licopeno son determinadas microalgas ricas en carotenoides del tipo Dunaliella. Existen diferentes procedimientos de extracción de carotenoides, y en particular de licopeno, a partir de estos organismos, tal como se refleja en las patentes US 5378369, US 4713398 y US 4680314, mediante laj extracción con disolventes orgánicos (clorocarbonados , hidrocarburos, etc.) o aceites comestibles (DE 4342798) . Un proceso diferente aparece descrito en la PCT WO 98/08584 donde la obtención de un extracto de licopeno se realiza utilizando G02 en estado supercrítico, aunque el extracto así obtenido presenta una baja pureza en licopeno. El licopeno también puede ser obtenido a partir de determinados hongos mucorales como Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor por fermentación en medio líquido, pre-sentando como ventaja frente a la obtención de licopeno a partir de productos vegetales o algas la elevada concentración de este compuésto, en algunos casos superior al 5% en peso respecto a la cantidad de biomasa seca, concentraciones superiores a las obtenidas de las mejores variedades vegetales, así como la posibilidad del desarrollo biotecnológico de cepas superproductoras de estos microorganismos, ya sea mediante técnicas de mutagénesis clásica o bien mediante la aplicación de las nuevas tecnologías de biología molecular que permiten la manipulación genética de estos microorganismos, incrementando la concentración y producción de licopeno, y eliminando la producción de otros carotenoides estructuralmente relacionados. La preparación de licopeno cristalino de elevada pureza a partir de fuentes naturales exige por lo general, como ya se ha comentado, una etapa de extracción con disolventes orgánicos o fluidos en estado supercrítico y posteriormente diversas etapas de purificación adicionales como cromatografía, procesos de adsorción y elución y etapas de preci-pitación o cristalización, como por ejemplo se describe en las patentes US 3369974, EP 818255 y EP 242148. En la mayoría de los casos en los que no se utilizan estas etapas de purificación posterior y la cristalización se realiza directamente a partir de extracto por evaporación del disolvente hasta superar la solubilidad, la pureza del producto obtenido es müy baja y es preciso proceder posteriormente a prdcesos de recristalización del licopeno obtenido, con el agravante de que la baja solubilidad del producto implica el ¡uso de una gran cantidad de disolvente para llevar a cabo la etapa de recristalización, lo que además conduce a ün bajo rendimiento (NL 6411184, US 4439629) . En la solicitud! de patente WO 96/13178 se describe la preparación de concentrados de licopeno cristalino esta-bilizado en un medio liquido compatible alimentario en el cual el licopeno es insoluble, como etilenglicol , etanol o glicerol, obteniendo por molienda cristales pequeños (1-3 mieras) de licopeno en suspensión en un medio liquido. Asimismo en la solicitud de patente WO 98/43620 se describe un procedimiento de aislamiento de cristales de licopeno a partir de una óleorresina mediante saponificación de diferentes triglicéridos y fosfonatos a alta temperatura y posterior dilución con agua, obteniendo cristales de licopeno entre el 75 y el 95% de pureza. Un procedimiento similar ha sido descrito recientemente para la preparación de cristales de ß-caroteno de elevada pureza en la PCT WO 98/03480 por lavado con agua, alcoholes de bajo peso molecular o acetona, aunque no ha sido descrita su aplicación para la obtención de cristales de licopeno de alta pureza. Es bien conocida la inestabilidad de los carotenoides en forma cristalina, siendo un procedimiento de estabilización de los mismos la preparación de dispersiones oleosas. Además, se cree que los carotenoides en dispersión de aceite son absorbidos más fácilmente por el organismo. Un procedimiento alternativo para la estabilización de compuestos inestables es la microencapsullación de los mismos en matrices de almidón. Así en las1 patentes US 2876160, US 2827452, US 4276312, US 5976575 se describe un aumento considerable en la estabilidad de diversos compuestos, entre ellos los carotenoides, mediant|e encapsulación de los mismos en matriz de almidón. j Uno de los inconvenientes principales para la utili-zación de los carotenoides en el campo de los colorantes es su nula solubilidad en agua, ya que muchas de las aplicaciones de los Lismos tienen lugar en medios acuosos. Este problema de solubilidad se menciona en el documento US 3998753, y se resolvió preparando disoluciones de caro tenoides en disolventes orgánicos volátiles, tales como hidrocarburos halogenados, y emulsionándolas con una solución acuosa de lauril sulfáto sódico. La patente US 5364563 describe un procedimiento para producir una preparación de carotenoides en polvo, que impli- i I ca formar una suspensión de un carotenoide en aceite de alto punto de ebullición. La suspensión se sobrecalienta con vapor de agua durante un pe íodo máximo de 30 segundos para formar una solución de carotenoide en aceite. A continuación esta solución se emulsiona | sobre una solución acuosa de un coloide y seguidamente la emulsión se seca por pulverización.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I La presente invención describe una serie de procedimientos para la obtención de producciones elevadas de lico- I peno con el hongo B.\ trispora, así como procedimientos para su recuperación y formulación. La invención consiste en (i) el diseño de métodos para la obtención y selección de mutantes de 23. trispora superproductores de licopeno, (ii) el desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación, (iii) el establecimiento de p'rocesos de recuperación de licopeno a partir del micelio y |(iv) la consecución de formulaciones que superen los problemas de estabilidad y solubilidad en diferentes medios, presentes en el Estado de la Técnica. B. trispora es un hongo que posee una gran importancia industrial para la producción biotecnologica de licopeno. De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el procedimiento sintético utilizado iijidustrialmente en la actualidad. Con la finalidad de obtener cepas superproductoras de licopeno, en primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas ( + ) y (-) de B. trispora con los agentes mutagénicos étil metano sulfonato (EMS) y N-metil- ' -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) . Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio I YpSs . Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 mi de una solución de Tritón X-ÍL00 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaronj mediante filtración a través de filtro de nylon de 20 µp? de poro. La concentración de esporas en la suspensión se ajustó a 106 esporas / mi. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 10 esporas / mi en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 j M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas dé mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a ^3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 106 esporas / mi eh una solución que contenía 250 |og/ml de NTG y tampón citratp sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%|. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15 °C durante 2 minutos. Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que | contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Tritjon X-100 al 0,1% y se incubaron a 25°C durante 4 días para obtener colonias aisladas. Las estrategias utilizadas para la selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de licopeno fueron las siguientes: (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. La selección de mutantes productores j de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos consistió en colocar filtros impregnados en ácidos trispóricos1 sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron a l partir de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora. Las colonias con los filtros se incubaron a 25 °C, observándose que los mutantes productores de licopeno adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los productores de ß-caroteno cuyo color era naranja. Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó el mutante LMA1 (-) (Esquema 2) .' La selección de mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (-) (productora de ß-caroteno; ver Esquema 2) y las esporas mutadas se crecieron en placas de medio sólido YEPDA. Seguidamente se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naij-anj a más intenso que la cepa parental CMA1 (-) . De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMBl (-) y CMB2 (-)).
ESQUEMA 2 VKPM F-208 (-) uv SN M6 (-) NTG SN VKPM F-551 (-) Ácido nitroso SN VKPM F-727 (-) NTG SN VKPM F-736 (-) NTG SN Ll25 (-) VKPM F-744 (-) CMA1 (-) CMA2 (-) CMA3 (-) CMA4 (-) NTG NTG SN SN C B1 (-) LMA1 (-) C B2 (-) ? Filogenia de las cepas de B. trispora (-) obtenidas a partir de B. trispora VKPMJ F—208 (-) utilizando procedi-mientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato . La selección de mutantes superproductores de licopeno de B. trispora (+) se realizó creciendo esporas mutadas en placas Petri que | contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1%. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-) . El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estimó en función de la intensidad de coloración en la zona de intersección de la cojlonia de la cepa (+ ) con la de la cepa (-) . De esta forma se : seleccionó la cepa B . trispora CPA1 (+) (Esquema 3) , la cual- daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (- ). El nivel de producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio líquido. El sistema de siglas empleado para la denominación de las cepas seleccionadas es el siguiente: CM: Caroteno minus (-) . LM : Licopeno minus (-) . CP: Caroteno plus (+) . LP : Licopeno plus (+) . La relación entre generaciones parentales sigue el orden del alfabeto: A es parental de B, B es parental de C, etc. El número situado tras las letras se corresponde con el número del mutante. Así por ejemplo, la denominación CMAl(-) significa que se trata de una cepa productora de caroteno (C) , menos (M) , parental de CMB y mutante número 1. Del mismo modo, CMAl(-), CMA2(-), CMA3(-) y CMA4(-) se corresponden con los mutantes 1, 2, 3 y 4 de una misma generación. i ESQUEMA 3 VKPM F-117 (+) uv SN P202 (+) NTG SN VKPM F-674 (+) UV SN VKPM F-726 (+) NTG SN VKPM F-741 (+) UV SN VKPM F-816 (+) EMS SN CPA1 (+) Filogenia de las cepas de B. trispora ( +) obtenidas a partir de B. trispora VKPM F—11 (+) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato . Las cepas (+ ) y (-) de B. trispora seleccionadas ¦ en medio sólido se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio liquido y cultivo mixto. Para ello, se sembraron matraces de inoculo independientes con las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora CMB2 (-) y posteriormente se realizó una fermentación mixta de ambas cepas en matraz. Al inicio de la fermentación (0-50 horas) se añadió un inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo imidazol en una concentración de 0.7-0.8 g/1) . Una vez concluida la fermentación (alrededor de 6 días) , el micelio de B. trispora se lisó mediante agitación en vortex, se extrajo el licopeno con solventes orgánicos' (por ejemplo acetona) y se determinó su concentración y pureza mediante HPLC. Los niveles de producción obtenidos fueron de 3,0 g/1.
El mismo tipo de fermentación se realizó con las cepas B. tríspora CPA1 ( +) y B. trispora LMA1 (-), con la diferencia de que en este caso no fue necesario adicionar un inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Los niveles de producción obtenidos con estas cepas en cultivo mixto fueron de 1,2 g/1.
Las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) se cultivaron en termentador pre- industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se crecieron separadamente en matraces, se transfirieron separadamente a tanques intermedios de crecimiento y por último se fermentaron conjuntamente. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se incubó durante 100-14? horas. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) : y CMB2 (-) fue de 3,4 g/1. Las cepas CPA1 (+) y LMAl (-) se cultivaron en termentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se realizó tal y como se ha indicado anteriormente para las cepas CPA1 (+ ) y CMB2 (-), pero sin adicionar imidazol. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) i fue de 1,6 g/1. Un mayor rendimiento en esta fase de fermentación se obtiene mediante el control de la edad de las fases vegetativas de crecimiento de las cepas de B. trispora. Así los cultivos utilizados como inóculos tienen una edad de 30-60 horas, preferentemente de 48 horas, tanto para las cepas (+) como las (-), pero variando el número de esporas a sembrar: 800-1.000 esporas/ml y 40.000-60.000 esporas/ml, respectivamente. La incubación se realiza a unos 25°C con un 0.1% v/v de cada inoculo se siembra en la fase de cultivo primario. La edad de dichos cultivos primarios oscila entre las 30-60 horas, preferentemente 36-48 horas, a temperaturas que oscilan entre 26-28°C. Posteriormente se mezclan en proporción 1/10 v/v l|as fases primarias (+)/(-) y se siembran los termentadores 10 20% v/v con la mezcla de dichas fases. i Dada la característica intracelular del componente carotenoide biosintetizado en la fermentación, el procedimiento de recuperación a partir del caldo de cultivo, preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica como primera etapa ía separación de la biomasa del caldo. Esta separación puede hacerse por los procedimientos establecidos de filtración, empleando las tecnologías al uso de filtros, bien sean de bandas, rotatorios, prensa, etc., en los que una barrera constituida por la tela filtrante separa la biomasa y permite pasar la fase líquida sin biomasa, o de centrifugación, en la que haciendo uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa (normalmente mayor) se emplea una máquina del tipo de un separador centrifugo, decanter o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la fase líquida con la menor cantidad posible de biomasa. Uno de los objetivos de esta etapa consiste en reducir pérdidas y optimizar las características de cada fase consiguiendo la mayor cantidad de biomasa con el mayor contenido de residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentación, con la menor cantidad de materia activa . El micelio húmedo resultante contiene más del 95% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 97% y más preferiblemente más del 99%. El contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5%, preferiblemente ¡inferior al 3% y más preferiblemente inferior al 1%. Este ¡micelio húmedo estaría en disposición de permitir, mediante las etapas ulteriores, la separación de licopeno. Sin embargo se ha comprobado que, relacionado con la fermentación, éste micelio mantiene un porcentaje relativamente elevado de componentes lipofílieos, entre 15 y (ácidos gras y aceites) que en etapas ulteriores plantean problemas de purificación, lo que conduce a introducir, en este punto, una etapa de purificación de la biomasa. Esta etapa de purificación implica una resuspensión de la biomasa en alcohol: metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, en proporción adecuada para conseguir la máxima purificación de los componentes lipidíeos. Así, el micelio húmedo se resuspende con una cantidad de alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La temperatura de resuspensión oscila entre 0°C y la de ebullición del alcohol, preferiblemente entre 10 y 50 °C. El tiempo de contacto oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica así preparada se filtra o centrifuga, de modo; que el contenido en sólidos en el filtrado o clarificado sea prácticamente nulo. El micelio húmedo resultante, que contendrá alcohol más agua en diversa proporción, contiene1 más del 93% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 95% y más preferiblemente más del 97%. En la fase sobrenadante o filtrada que contiene restos de caldo y alcohol, el contenido en carotenoides es inferior al 2%, preferiblemente inferior al 1%, referido al caldo inicial . Mediante este tratamiento con alcohol se consigue eliminar una serie de sustancias lipofílicas solubles en alcohol, en cantidad variable en función de las características del : caldo utilizado, efectuando una purificación previa que nos va a permitir obtener un producto final cristalino de elevada pureza. Adem s, al eliminar una proporción variable de agua del micelio húmedo inicial, se facilita considerablemente el posterior proceso de secado. Mezclando directamente el caldo de cosecha con el alcohol y manteniendo un tiempo mínimo de contacto se consigue un efecto de purificación equivalente al descrito anterior-mente, con lo que se simplifica el proceso al eliminar una operación de separación sólido liquido. La proporción caldo/alcohol puede oscilar entre 1/0,5 hasta 1/5, preferiblemente entre' 1/1 y 1/3. La temperatura de la mezcla oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición de la mezcla, preferiblemente entre la temperatura ambiente y 60 °C.
El micelio deshidratado/purificado se seca. El secado puede hacerse por los procedimientos habituales en batch o en continuo. La temperatura de secado oscila entre la temperatura ambienté y 150 °C, preferiblemente no debe sobrepasar los 60 °C y más preferiblemente estar por debajo de 50°C. El tiempo de secado es función de la temperat empleada, oscilando entre 1 hora y 72 horas. Debido a posible descomposición de estos carotenoides por oxidación con el oxigeno atmosférico, es conveniente efectuar esta operación de secado en ausencia de oxígeno, bien bajo atmósfera de nitrógenó o al menos a vacío. El hecho de que el producto carotenoide sea intracelular implica un acondicionamiento de la biomasa purificada, bien mediante secado más molienda, secado más disgregación o disgregación de la biomasa, que favorezca la mezcla con disolventes y facilite la extracción a estos. Para conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a extractar es necesaria previa del micelio, de modo que sea máxima. El tamaño de partícula óptimo del micelio seco y roto debe ser inferior a 3 mm, preferiblemente inferior de 1 mm y más preferible-mente inferior a 0,5 mm. La molienda puede hacerse sobre el producto seco, mediante sistemas mecánicos con partes giratorias o fijas: mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilindros giratorios presionando uno sobre el otro (compactación o extrusión) . También es posible efectuar el secado y molienda en una única etapa mediante un sistema de secado tipo flash (instantáneo) en un equipo jet mili (molino de chorro) donde el producto húmedo se alimenta a una corriente de un gas en recirculación y a iemperatura elevada, de manera que el tiempo de residencia1 sea el mínimo para conseguir vaporizar el contenido de componentes líquidos, y el producto sea transportado, al variar las densidades, hasta un ciclón donde se recupera. Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lugar asimismo un efecto de homogeneización al chocar las partículas con las paredes. Para la extracción del licopeno a partir de un micelio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear diversos disolventes orgánicos. Esta invención se referirá al uso de disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carbtenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel nacional como comunitario, en los ámbitos tanto farmacéutico como alimentario (RDL12/oi/90 y RDL16/10/96) El contenido de disolventes residuales debe ser, según el ICH, inferior a 5000 ppm, preferentemente inferior a 1000 ppm y más preferentemente inferior a 100 ppm, siempre referido a la materia seca de la mezcla líquida. La temperatura de extracción oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 50°C y 80°C. El tiempo de extracción será el mínimo necesario para conseguir la solubilización, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre' 1 minuto y 15 minutos. La cantidad de disolvente empleada depende de la temperatura y de la riqueza del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 30 ml/g de biomasa. El número de extracciones varía desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides extractados es superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y más preferiblemente superior al 95%. I Una vez obtenidó el extracto rico en carotenoides es necesario concentrarlo hasta un determinado volumen. La concentración final de carotenoides en el disolvente tras concentrar oscila preferentemente entre 10 y 50 g/1. La temperatura de concentración debe ser inferior a 80 °C, preferiblemente inferior a 70 °C y más preferiblemente inferior a 50 °C. Una j vez concentrado el extracto al volumen requerido se hace necesario adicionar un insolubilizante de los carotenoides, concretamente un alcohol y más concretamente metanol, etanol, propanol, isopropanol o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, con | lo cual el rendimiento en licopeno cristalino aumenta considerablemente. La adición del alcohol ejerce también un j efecto purificante. El tiempo de cristalización oscila entre 15 min y 24 horas, preferiblemente entre 1 h y 12 h y más preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización deli>e ser inferior a 25°C, preferiblemente inferior a 5°C. j La separación de los cristales de las aguas de cristalización se puede efectuar por filtración o centrifugación, desplazando las aguas de cristalización que bañan los cristales mediante un lavado con el mismo alcohol I empleado para insolubilizar . Los cristales obtenidos se secan a vacío y temperatura ambiente durante al menos 1 h hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones establecidas por la legislación anteriormente mencionada y que, en el caso del licopeno, se establece una pérdida. por secado inferior al 0,5%. La pureza de los cristales obtenidos corresponde a un título superior a 95%, determinado por espectrofotometría mediante lectura de l|a absorción a 472 nm de una disolución de los cristales enj n-hexano (El% lcm = 3450) , con un contenido en otros carotenoides inferior al 3%. El contenido I en cis licopeno es inferior al 3%. El método de estla invención es especialmente aplicable para la recuperación ¡ de licopeno cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, más preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y más preferiblemente B. trispora . La extrema pureza conseguida en los cristales obtenidos por la presente metodología y el empleo de disolventes considerados como naturales hace que estos cristales sean .aplicables en la industria alimentaria, farmacéutica o de cosméticos. El producto cristalino obtenido mediante la metodología descrita en esta invención se puede envasar en recipientes opacos que impidan j la fotodegradación del producto, en ausencia de oxígeno (atmósfera inerte o vacío) para evitar la oxidación y a temperaturas entre 0 y 5°C. El producto adecuadamente envasado puede manejarse y comercializarse como tal. No obstante es | conveniente incrementar la estabilidad del mismo mediante j etapas ulteriores de formulación o acabado, que implican adición de antioxidantes que permiten obtener un producto acabado con una estabilidad superior a 6 meses en condiciones adecuadas de envasado. Objeto fundamental también de esta invención es un procedimiento de preparación de licopeno que incluye su formulación en diferentes presentaciones en función de las i características de la aplicación para la cual se desee emplear el licopenoJ Una primera aplicación, denominada suspensión microcristjalina de licopeno en aceite vegetal, consiste en la premezcla del licopeno cristalino anterior con una cantidad variable! de aceite vegetal. El tipo de aceite vegetal puede ser muy variado, siendo los más habituales, aunque no los únicosj aceites de girasol, de oliva, de maíz, de soja, de algodón, i etc. La dosificación del licopeno será función de la riquezaj final que se desee alcanzar, siendo los valores más habituales suspensiones con un contenido en licopeno entre el 5 y el 60%, preferiblemente entre el 10 y el 30%. Para incrementar la estabilidad de la mezcla se adicionan antioxidarftes liposolubles al uso, como los tocoferóles naturales, y preferentemente el D,L-alfa-tocoferol . La proporción de este compuesto oscila entre el i 0,2 y el 15% respecto al peso del licopeno, preferiblemente entre el 0,5 y el 5%. Para que las formulaciones que contienen licopeno [presenten una actividad fisiológica satisfactoria es necesario reducir el tamaño del cristal de licopeno. Esto se consigue con los sistemas habituales de molienda aplicables a mezclas líquidas. Objeto preferente de esta invención son ülos molinos de bolas que permiten una reducción del tamaño I del cristal por debajo de 10 mieras, preferiblemente por debajo de 5 mieras, y aún preferiblemente por debajo de 2 mieras, empleando microesferas de diámetro comprendido 0,5 y 0,75 mm. No obstante el tamaño de cristal puede variar en función de la aplicación particular de la suspensión, emplean-do en cada caso las esferas y las condiciones de molienda adecuadas. Este tamaño de cristal I también condicionará las propiedades reológicas de la mezcla, en especial la viscosidad de la misma, que también se podrá adaptar en función dé los requerimientos. Estas suspensiones micro-cristalinas de ' licopeno en aceite son adecuadas para aplicaciones del ^licopeno en entornos lipofílicos: margarinas, mantequillas, cremas, etc. Una segunda aplicación, denominada formulación de licopeno dispersable j en agua fría (CWD) , se basa en la disolución del licopeno en un disolvente orgánico y su posterior microencapsulación en almidones modificados. Los disolventes más adecJados para efectuar esta disolución, por presentar esta molécula una elevada solubilidad, son cloroformo, benceno, ¡tolueno, etc. Especialmente adecuado es el cloruro de metileno. No obstante debido al carácter I halogenado de este último se pueden utilizar disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, ! isobutilo, etc. que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. La concentración de licopeno en el disolvente orgánico puede oscilar ente 1 y 50 g/1, preferiblemente entré 10 y 30 g/1. La temperatura de disolución puede oscilar entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 20 y 130°C. El hecho de ¡que el porcentaje de cis licopeno sea función de la relación temperatura/tiempo en la operación de disolución del licopeno en el disolvente orgánico implica que si se pretende obtener un producto con un bajo contenido en este isómero, o bienlse emplea una temperatura de disolución baja o en caso contrario un tiempo de disolución muy corto. Así, para conseguir bajos niveles de cis, si el disolvente empleado es cloruro 1 de metileno, la disolución se puede efectuar a 20-35°C durante un tiempo comprendido entre 1 y 15 minutos. Por el contrario si el disolvente es acetato de isobutilo la disolución se efectuará preferentemente entre 70 y 130°C durante unos segundos. Por el contrario, si los niveles de isómero c|is no son relevantes la disolución se puede llevar a cabo s^in restricción en las condiciones de la misma más que la consecución de la solubilidad total a nivel molecular del licopeno en el disolvente empleado. Para incrementar la estabilidad de la formulación final se disuelve conjuntamen e con el licopeno en el disolvente orgánico uno o una mezcla de varios antioxidantes, preferiblemente de tipo tocoferol, palmitato de ascorbilo, etc., cada uno de ellos en proporción entre 1 y el 30%, preferiblemente entrej el 10 y el 20%, respecto al peso del licopeno. También es posible incorporar en la mezcla aceite vegetal, bien de girasol, oliva, maíz, soja, algodón, etc. con objeto de favorecer la disolución del licopeno, y aportar una estabilidad adicional a la preparación. La relación licopeno/aceite puedej oscilar entre 10/1 y 1/10. La disolución de licopeno así obtenida se mezcla y emulsiona con una disolución acuosa que contiene un agente emulsionante, como por ejemplo almidón modificado, más concretamente esteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato derivados de almidón de diversos pesos moleculares, siendo de especial interés, aunque no exclusi- vamente, el Purity Gum 2000® de National Starch o el Cleargum CO 01® de Roquette, jy un agente microencapsulante, formado por ejemplo por almidón modificado, más concretamente ésteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato derivados de almidón de diversos pesos moleculares, siendo de especial interés, aunq 'ue no exclusi -vamente, el Hi Cap 100Aw o el Capsul® de National Starch. La proporción en la que se mezclan el agente emulsionante y el agente microencapsulante puede oscilar entre 5^/95 y 95/5, preferiblemente entre 25/75 y 75/25, más preferiblemente entre 40/60 y 60/40. La concentración en agua de cada uno de los componentes de la mezcla de agente emulsionante y agente microencapsulante es variable, pudiendo ser entre el 1 y el 30%, preferentemente entre el 5 y el 20%, y más preferentemente del 10%. La mezcla de fases acuosa y j orgánica se emulsiona y la emulsión obtenida se homogeneiza empleando sistemas de homogenización por diferencial de presión tipo Mantón Gaulin o Microfluidizer, habituales al uso, y preferiblemente mediante homogenización por fricción tangencial, como por ejemplo con un emulsionador tipo | Ultraturrax durante un tiempo variable en función de la energía proporcionada por el equipo y el volumen de mezcla a emulsionar, con objeto de obtener un i tamaño medio de micela inferior a 10 mieras, preferiblemente inferior a 2 mieras^ y más preferiblemente entre 0,1 y 1 miera. ! Una vez formada j la emulsión se efectúa la evaporación del disolvente orgánico, preferentemente por destilación a vacío a temperatura inferior a 50 °C. A medida que tiene lugar la evaporación del disolvente se produce la micro-cristalización del licopeno en la matriz de almidones. Una vez evaporado el disolvente se continúa la evaporación, con adiciones sucesivas de agua hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones de concentración máxima establecidas por la legislación y un residuo seco idóneo para el tipo de secado que se vaya a aplicar a esta mezcla' líquida. Valores adecuados de materia seca de la suspensión de licopeno microencapsulado están comprendidos entre el ,1 y el 30%, preferentemente entre el 10 y el 20%. De acuerdo con lia presente invención se encuentra que para secar la suspensión acuosa de licopeno obtenida son adecuados tanto el método de secado por pulverización a alta temperatura (atomización) como el método de pulverización sobre lecho fluidizado (granulación) . Otra alternativa sería el Secado por liofilización. De acuerdo con el método de secado ¡por atomización, temperaturas adecuadas de entrada del aire dp secado estarían comprendidas entre 100 y 200°C mientras que las de salida entre 60 y 120°C. El producto atomizado tiene un tamaño de partícula comprendido entre ente 10 y 100 mieras. Con objeto de aumentar el tamaño de partícula y con ello disminuir la superficie disponible, y de esta forma aumentar la estabilidad del producto frente a la oxidación, el producto atomizado puede ser aglomerado mediante pulverización de una disolución de uno de los almidones modificados utilizados en la formulación, o la propia suspensión de licopeno microencapsulado en el seno de un lecho fluidizado del propio producto atomizado, permitiendo alcanzar ¡tamaños de partícula que oscilan entre 50 y 500 mieras, preferiblemente entre 200 y 300 mieras. El método de granulación implica el uso de un granulador de lecho fluidizado en el que se pone material de siembra, que puede ser material inerte típico, tal como partículas de azúcar, o polvo finoj del mismo material a secar obtenido en procedimientos de granulación previos o en un procedimiento de secado por pulverización. Las partículas se mantienen en í movimiento por medio de aire, y la temperatura del lecho se mantiene entre 30 y 9|0°C, preferiblemente entre 50 y 80°C. La suspensión de licopeno microencapsulado se pulveriza mediante aire precalentado a una temperatura entre 20 y 140 °C en el i seno del lecho fluido, a una velocidad que asegure que las partículas que se van| a revestir no se mojan demasiado ni se aglomeran. El producto granulado tiene un tamaño de partícula comprendido entre 100 y 2000 mieras, preferiblemente entre 100 y 800 mieras y aún preferiblemente entre 100 y 300 mieras. Una vez terminada la pulverización por uno u otro método las partículas se pueden revestir. Este revestimiento se puede efectuar con aproximadamente 0,5-10% en peso seco de soluciones acuosas de diversos azúcares o incluso de alguno o una mezcla de los almidones que constituyen la fórmula objeto de la presente invención.
DEPOSITO DE MICROORGANISMOS DE ACUERDO CON EL TRATADO DE BUDAPEST . Las cepas de Blakeslea trispora han sido depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) , GNU Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscú 113545, (Rusia), con los siguientes números y; fechas: VKPM F-117 el 21-12-1979, VKPM F-208 el 20-12-1979, VKPM F-551 el 19-11-1992, VKPM F-674 el 19-11-1992, VKPM F-7Í26 el 21-01-1997, VKPM F-727 el 21-01-1997, VKPM F-736 el 07-10-1997, VKPM F-741 el 28-01-1998, VKPM F-744 el 28-01-1998 y VKPM F-816 el 13-12-2000. Los siguientes ejemplos describen en detalle y sin limitación la presente invención.
EJEMPLO 1 Estrategias de mutación de las cepas (+) y (-) de S. trispora En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas ( +) y (-) de B. trispora, para lo cual se analizaron: (i) diferentes tipos de agentes mutagénicos, (ii) j concentración del mutágeno, (iii) concentración de esporas, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) . Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs, cuya composición es la siguiente: extracto de levadura 4 g/1, almidón soluble 15 g/1, K2HP04 1 g/1, MgS04-7H20 0,5 g/1 y agar 15 g/1, a un pH final de 5,8. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 mi de una solución de Tritón X-100 al 0,1% a cada slant . Los restos de micelio se l eliminaron mediante filtración a través de un filtro de nylon de 20 µtt? de poro. La concentración de esporas en la suspensión fue alrededor de 106 esporas/ml. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 106 esp'oras/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódicb 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Lais esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al ¡0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos . | El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 106 esporas/ml en una solución que contenía 250 µ9/tt?1 de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente jdurante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces cón Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15 °C duraijite 2 minutos. Con las esporas i mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Tritón X100 al 0,1%. La composicilón por litro del medio Sutter IV es la siguiente: 40 g de gjlucosa, 4 g de L-asparragina , 10 g de KH2P0 , 40 mi de solución de microelementos 50x, y 30 g de Agar. La solución de microelementos 50x está compuesta por: 25 g/1 de MgS04.7H2Q, 1,82 g/1 de CaCl2.2H20, 0,05 g/1 de tiamina, 0,1 g/1 de ácido cítrico, 0,075 g/1 de Fe (N03) 3.9H20, 0,05 g/1 de ZnS04.7H20, 0,17 g/1 de MnSO4.H20, 0,025g/l de CuS04.5H20 y 0,025 g/1 de Na o04.2H20. Las placas sembradas se incubaron a 25 °C durante 4 días para obtener colonias aisladas. EJEMPLO 2 Estrategias de selección de imitantes de B. trispora (-) superprod ctores de licopeno En este ejemplo jse describen estrategias de selección de cepas de B. trispora. (-) superproductoras de licopeno basadas en (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. En la Figura 1 se muestra la filogenia de las c¡epas de B. trispora (-) utilizadas en la presente invención. La selección de mutantes productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos se realizó colocando filtros estériles de unos 0,6 mm de diámetro, impregnados en ácidos trispóricos, sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron mediante la extracción del sobrenadante de un cultivo mixto de las cepas ( + ) y (-) de B. trispora con un volumen de cloroformo después de acidificar la muestra a pH 2. La fracción orgánica se extrajo con un volumen de una solución de bicarbonato sódico al 4% y se recogió la fase acuosa, la cual se acidificó para extraerla nuevamente con cloroformo. Posteriormente el cloroformo se evaporó hasta sequedad y el residuo enriquecido en ácidos trispóricos se disolvió en etanol . Los ácidos trispóricos se cuantificaron midiendo la absorbancia a 325 nm y asumiendo un coeficiente de absortividad de 70| mi x mg"1 x crrf1 (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL . , Keen WAj. 1973. J. Bacteriology 114:1074-1082).
Los filtros estériles se incubaron en una solución de 1,2 mg/ml de ácidos trispóricos en etanol y seguidamente se dejaron secar a temperatura ambiente en condiciones estériles. Posteriormente, los filtros se colocaron sobre las colonias mutantes previamente crecidas durante 4 días a 25°C. Las placas se incubaron a 25 °C durante 3 días adicionales, observándose que los mutantes productores de licopeno adquirían unj color rojo intenso, a diferencia de los productores de ß-caroteno cuyo color era naranja. Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó el mutante LMA1 (-) ! (Figura 1) , el cual podría presentar alguna mutación en ejl gen caRP, el cual codifica para la actividad enzimática licopeno ciclasa y, por tanto, en lugar de producir ß-caroteno, acumularía el intermediario licopeno durante el proceso de fermentación de caro-tenoides . Por lo tanto, la cepa LMAlj es capaz de producir licopeno sin necesidad de adicionar inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (Ejemplo 5) . La selección dé mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (productora de ß-caroteno; ver Figura 1) tal y como se indica en el ejemplo 1. Las esporas mutadas se sembraron en placas de medio sólido YEPDA (bacto-peptona j 20 g/1, extracto de levadura 10 g/1, glucosa 20 g/1 y agár 20 g/1, a un pH final de 6,0), se incubaron a 25 °C durante 24 horas y seguidamente a 20 °C durante 48-72 horas. ¡ Por último, se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso ? que la cepa parental : CMA1 (-) . De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-)) . Las cepas CMB1 y CMB2 podrían ser superproductores de licopeno en fermentaciones mixtas con adición de inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (por ejemplo, iimidazol; ejemplo 4) .
EJEMPLO 3 Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (+) superproductores de licopeno La selección de mutantes superproductores de licopeno de B. trispora (+) se realizó a partir de esporas mutadas tal y como se indica en ejl ejemplo 1. Dichas esporas se sembraron en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1% y se incubaron a 25°C durante 7 días para obtener colonias aisladas. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-) . La distancia entre los puntos de siembra de las cepas (+) y (-) debe ser de aproximadamente 2 cm. El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estima por la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (i) con la de la cepa (-) . De esta forma se seleccionó la cep|a B. trispora CPA1 ( + ) , la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos i sólidos con una serie de cepas (-) . El nivel de producción de la cepa B. trispora IcPAl ( +) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio líquido tal y como se describe en los ejemplos 4 y 5. En el Esquema 3 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (+) utilizadas en la presente invención. | 1 EJEMPLO 4 Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante el cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa Las cepas (+) y (-) de B. trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de ??2?04, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y pH ajustado a 6,3. La cepa B. trispora CPA1 (+) se sembró en matraces de 500 mi con 67 mi de medio a razón de 103 esporas por mi. La cepa B. trispora CMB2 (-) se sembró en matraces de 500 mi con 100 mi de medio a razón de 104 esporas por mi. Ambos tipos de inóculos se incubaron a 25 °C y 250 rpm durante 44 horas. Una vez finalizada la incubación, se mezclaron los inóculos de las cepas (+) y (-) en una relación 1/10 (v/v) , y con la mezcla se inocularon matraces de 250 mi con 20 mi de medio de fermentación a razón de 4 mi de la mezcla de cepas por matraz. Estos matraces se incubaron a 25 °C y 250 rpm durante 5-6 días. El medio de fermentación utilizado posee la siguiente por litro: 44 g de harina de soja, 19 g de harina 5 g de KH2P0 , 0,002 g de clorhidrato de tiamina, 100 mi de aceite vegetal y pH ajustado a 7,5. El medio se repartió en matraces de 250 mi, los cuales se inocularon con el 20% de una mezcla de las cepas (+) y (-) de B. trispora . Entre las 0 y las 36 horas de fermentación se añadió un inhibidor de la actividad enzimatica licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo, 0,75 mg/ml de imidazol) . Los matraces se incubaron a 25 °C y 250 rpm durante 6 días. Una vez concluida la fermentación, se preparó una mezcla de caldo de fermentación, perlas de vidrio y cloruro de metileno/metanol (l/l) . El micelio de B. trispora se lisó mediante agitación ¡ en vortex, liberando el licopeno intracelular . El licopeno extraído con la mezcla de cloruro de metileno: metanol (proporción 1:1) fue diluido en acetona. La concentración y pureza del licopeno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida HPLC en fase reversa. El nivel de producción obtenido en fermentaciones mixtas de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora CMB2 (-) fue de 3 g/1 de licopeno en presencia de imidazol (figura 1) .
EJEMPLO 5 Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B . trispora LMA1 (-) sin. adición de inhibidores de la actividad enzimatica licopeno ciclasa Las cepas de Bl trispora LMA1 (-) y CPA1 ( + ) seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello, se prepararon inóculos de las cepas (+) y (-) y se realizó la fermentación en matraz tal y como se indica en el ejemplo 4. La diferencia es que en este caso no se adicionó el compuesto químico inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Una vez concluida la fermentación se realizó la valoración del licopeno producido tal y como se describe en el ejemplo 4. Los niveles de producción obtenidos mediante fermentación mixta de las cepas B . trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-) fueron de j 1,2 g/1 de licopeno en ausencia de imidazol (figura 2) . j EJEMPLO 6 Procedimiento de producción de licopeno en fermentador pre-industrial mediante cultivo mixto de las cepas ( +) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa Las cepas CPAlj (+ ) y CMB2 (-) de B . trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en fermentador pre- industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2PO4, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. Las cepas ( +) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 mi con 500 mi de medio y se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44-48 horas. Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2PO4,- 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas (+ ) y (-} en una proporción 1/10 y con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de KH2P04, 3,3] g de Na2HP04, 0,184 g de NaH2P04, 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas una temperatura de 25-28' 'C con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol estéril a una concentración final del 0,75 g/1.
La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/1 (figura 2) EJEMPLO 7 Procedimiento de producción de licopeno en fermentador pre-industrial mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B. trispora LMA1 (-) sin adición de inhibidores de la actividad enzim tica licopeno ciclasa Las cepas CPAli ( + ) y LMA1 (-) de B. trispora seleccionadas tal y cómo se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en fermentador pre- industrial con la finalidad de determinar el nivel dé producción de licopeno sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2P04, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. La cepas ( + ) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 mi con 500 mi de medio y se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44-48 horas.
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro! es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2P04; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas ( +) y (-) en una proporción 1/10 y, con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentlación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de KH2P04, 3,36 g de Na2HP04, 0,184 g de NaH2P04, 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas a una temperatura de 25-28 °C con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El; valor medio de producción de licopeno obtenido sin adición de imidazol en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) fue de 1,6 g/1 (figura 2) .
EJEMPLO 8 Procedimiento de recuperación de licopeno por resuspensión de la biomasa en alcohol Se cosecharon 3 litros de caldo fermentación correspondiente a un proceso de biosíntesis en el cual la ruta biosintética estaba interrumpida a nivel de licopeno. El titulo del caldo fue de 3 g de licopeno por litro. La biomasa de este caldo se recuperó mediante filtración por buchner (filtro-embudo de porcelana que soporta un disco de papel o cartulina que ejerce de lámina filtrante) , obteniendo 750 g de biomasa húmeda. La1 biomasa húmeda se resuspendió en 5,2 1 de isopropanol aceótropo 85/15 y se agitó durante 30 minutos a 45+5 °C. La biomasa purificada se volvió a recuperar mediante buchner. Esta biomasa se secó en estufa bajo vacío a temperatura inferior a 45±5° C y en un tiempo de 18 horas, hasta que el contenido en disolventes residuales/agua fue inferior al 8%. Se obtuvieron 150 g de biomasa seca y purificada con un cóntenido de licopeno equivalente a una riqueza del 5,5%. La biomasa seca se molió en molino de martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma riqueza especifica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente. La extracción se efectuó mezclando los 150 g de biomasa molida con 2500 mi de acetato de isobutilo a 70±5° C, manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno filtrando por placa filtrante. La biomasa agotada se lavó con 300 mi de acetato de isobutilo caliente sobre el propio filtro, mezclando el disolvente de lavado con el filtrado. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se con-centró bajo vacío y manteniéndose la temperatura por debajo de 45±5°C hasta reducir el volumen a 300 mi, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización y obtener un licopeno más puro, se añadieron 900 mi de isopropanol. La mezcla se mantuvo en agitación entre 0-5°C y bajo nitrógeno durante 3 horas. Se filtró por buchner, lavando los cristales con 25 mi de isopropanol sobre el buchner. Se recogieron los cristales y se secaron a vacío, obteniéndose 6,5 g de cristales de licopeno con una pureza espectrofotométrica del 95%. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de cis licopeno.
EJEMPLO 9 Procedimiento de formulación de licopeno en suspensión oleosa En un molino de bolas de laboratorio tipo Minizeta 003 de Netzsch se cargaron, por este orden, microesferas de 0,5- 0,75 mm de diámetro, 23,5 g de aceite de girasol (Koipe) , 0,065 g de D, L-alfa- tocoferol (Merck) y los 6,5 g de licopeno cristalino obtenidos según se describe en el ejemplo 8. La mezcla se molió a 3000 rpm durante 5 minutos, obteniendo 25 g un líquido viscoso de color rojo púrpura intenso. El análisis epectrofotométrico de la suspensión oleosa puso de manifiesto un contenido en licopeno del 21%. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis de licopeno. El tamaño del cristal fue inferior a 10 mieras.
EJEMPLO 10 Procedimiento de recuperación de licopeno por tratamiento directo con alcohol del caldo de fermentación Se mezclaron ¡directamente 1500 1 de caldo de fermentación de licopeno (potencia en licopeno 2,3 g/1) con 4500 litros de aceótropo isopropanol/agua 85/15. Después de mantener en agitación durante 30 min a 45±5°C se procedió a separar la biomasa del líquido empleando un decanter centrífugo. Se recogieron del orden de 250 Kg de biomasa húmeda purificada. Esta biomasa empapada de agua e isopropanol se secó en secadero rotativo bajo vacío hasta un contenido en disolventes residuales/agua inferior al 8%. La temperatura de secado fue 45±5°C, y el tiempo medio de residencia en el secadero de 14 horas;. Se obtuvieron 85 Kg de biomasa seca con un contenido en licopeno equivalente a una riqueza específica del 3,75% La biomasa seca se extrusionó en un compactador Hutt-Compacktor de BEPEX, obteniendo un sólido con la misma riqueza específica acondicionado para permitir extracción con el disolvente.
La extracción se: efectuó mezclando los 85 Kg de sólido molido con 1650 1 de acetato de isobutilo. La mezcla se calentó en línea a 60±5°C durante un tiempo medio aproximado de contacto de 2 minutos y se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno mediante un decanter centrífugo. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se concentró bajo vacío y manteniendo la temperatura por debajo de 45+5 °C hasta reducir el volumen a 100 1, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización del licopeno se añadieron 300 1 de isopropanol . Se mantuvo la mezcla en agitación durante 3 h a 0-5°C. Se filtró por 1 un Buchner, recogiendo los cristales de licopeno, que se secaron a vacío y temperatura ambiente. Se obtuvieron 2 Kg de producto con una pureza de 96% por i espectrometría. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de is'ómeros cis .
EJEMPLO 11 Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente 3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 mi de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D, L-alfa-tocoferol (Merck) . La mezcla se calentó a ebullición (114 CC) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se disolvieron 12 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 12 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 mi de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa i utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA., alcanzando un tamaño medio de micela de 1,2 mieras, medido con un i analizador Coulter ÜS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 410 mi de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 mi de agua. Se obtuvieron 203 g de formulación líquida (12,75% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,25% (9,8% referido a masa seca) . Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 23,3%, no detectándose la presencia de otros carotenoides . Esta formulación líquida . se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190°C y a la salida de 90°C, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,4% y una humedad del 6,5%. Por HPLC se detectó un contenido i en cis licopeno del 23%, no detectándose la presencia de otros carotenoides .
EJEMPLO 12 Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente 3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se .resuspendieron en 410 mi de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D, L-alfa- tocoferol (Merck), 0,7 g de palmitato de ascorbilo (Merck) y 3,5 g de aceite de girasol (Koipe) . La mezcla se calentó a ebullición (114°C) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se disolvie-ron 10 g de Hi-Cap 100 (National Starch)' y 10 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 mi de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizanjdo un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,4 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 410 mi de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 mi de agua. Se obtuvieron 195 g de formulación líquida (13,25% de materia seca) con un conte-nido en licopeno del 1,3% (9,8% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 25%, no detectándose la presencia de otros carotenoides . Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190 °C y a la salida de 90 °C, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,5% y una humedad del 6,0%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 24,5%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
EJEMPLO 13 Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente 7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 101 se resuspendieron en 500 mi de diclorometano, adicionando 0,75 g de D, L-alfa-Tocoferol (Merck), calentando la mezcla a 35°C durante 5 minutos. Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 mi de agua destilada^ La fase orgánica se emulsionó durante 15 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,4 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión sé transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 500 mi de diclorometano con aproximadamente 600 mi de agua. Se Obtuvieron 400 g de formulación líquida (13,1% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,5% (11,5% referido a masa seca) . Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,5%, no detectándose la presencia de otros cárotenoides . Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador de labo-ratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190 °C y a la salida de 90 °C, obteniendo jun polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,6% y con una humedad del 5,3%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,4%, no detectándose la presencia de otros cárotenoides.
EJEMPLO 14 Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente 7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 10,, se resuspendieron en 500 mi de diclorometano, adicionando 0,75 g de D, L-alfa-Tocoferol (Merck) , calentando la mezcla a 35°C durante 5 minutos Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 mi de agua destilada i La fase orgánica se emulsionó durante 60 minutos en una etjapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,23 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión sJ transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 500 mi de diclorometano con aproximadamente 650 mi de agua. Se obtuvieron 350 g de formulación líquida (14,4% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,6% (11,4% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 20%, no detectándose la presencia de otros cajrotenoides . Esta formulación líquida se liofilizó en un equipo de laboratorio durante 24 horas, obteniendo un polvo esponjoso de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,7% y con una humedad del 7,4%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 15%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
Descripción detallada de las figuras Figura 1. Producción I de licopeno mediante fermentación mixta en matraz de la cepa B. trispora CPA1(+) con cada una de las siguientes cepas de B. trispora (-) : L25, CMA1, CMA2 , CMA3 , CMA4, CMB1, CMB2 y LMA1. Salvo en la fermentación mixta CPA1 ( + ) / LMA1 (-) , en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la activjidad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas : % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F-744) .
Figura 2. Producción de licopeno mediante fermentación mixta en fermentador de la Jcepa B. trispora CPA1( + ) con cada una de las siguientes cepas de B. trispora (-) : L25, CMA1 , CMA2 , CMA3, CMB1, CMB2 y L A1. Salvo en la fermentación mixta CPA1 ( + ) / LMA1 (-), en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas : % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F- 744) .

Claims (48)

    - 63 -
  1. REIVINDICACIONES 1. Proceso para| la producción de licopeno a partir de fuentes biosintéticds, caracterizado por comprender las siguientes etapas en Secuencia: a. Mezclar cepas sobreproductoras de Blakeslea trispora [ +) Y (-) de licopeno, cuya edad de etapa vegetativa de crecimiento ha sido controlada, en una biomasa de medio de cultivo en condiciones de fermentación adecuadas para producir licopeno. b. Tratamiento de la biomasa del medio de cultivo de la etapa a) con alcohol y separación de una biomasa purificada húmeda. c. Acondicionamiento de la biomasa húmeda purificada mediante secado¡ y desintegración o rompimiento. d. Extracción sólido-líquido del licopeno contenido en la biomasa purificada con un solvente orgánico, controlando la temperatura y el tiempo de disolución en función al solvente orgánico utilizado. e. Concentración del extracto de licopeno enriquecido. f. Precipitación/cristalización del licopeno a partir del extracto concentrado por adición de alcohol . g. Filtración y secado. h. Formulación. - 64 -
  2. 2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las cepas utilizadas como inoculo de cultivo tienen una edad que varía de 30 a 60 horas, de preferencia 48 horas, con un número de esporas en semilla de 800 a 1000 esporas/ml para las cepas (+) y 40000^-60000 esporas/ml para las cepas (-), en donde se siembran 0.1% v/v de cada inoculo en la fase de cultivo primaria.
  3. 3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual la edad de los cultivos primarios varía de 30 a 60 horas, de preferencia 36 a 48 horas.
  4. 4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa opcional a., junto con las cepas (+) se utilizan cepas de Blakeslea trispora (-), mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, preferentemente las descritas en el esquema 2.
  5. 5. Proceso dei acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque; la etapa opcional a., junto con las cepas (-) se utilizan cepas de Blakeslea trispora (+) , mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, preferentemente las descritas en el esquema 3.
  6. 6. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 4 y 5, en el cual las cepas (-) y (+) de Bakeslea trispora mezcladas en - 65 - la biomasa del medio de cultivo son, respectivamente, VKP F-744 y VKPM F-816 jo cepas sobreproductoras de licopeno seleccionadas de los mismos.
  7. 7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa opcional a. se utilizan cultivos mixtos de cepas de Blakeslea trispora (-) y (+) o mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, en ausencia de compuestos inhibidores de la actividad licopeno: ciclasa.
  8. 8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa opcional a. se utilizan cultivos mixtos de cepas de Blakeslea trispora (-) y (+) o mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, en presencia de compuestos inhibidores de la actividad licopeno' ciclasa.
  9. 9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por adicionar imidazol durante el proceso de fermentación, como compuesto inhibidor de la actividad licopeno ciclasa.
  10. 10. Proceso dé acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el imidazol se adiciona entre las 0 y 50 horas de fermentación, preferentemente entre las 25 y 35 horas . - 66 -
  11. 11. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque la concentración de imidazol se mantiene entre 0,7 y 0,8 g/1, preferentemente 0,75 g/1.
  12. 12. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado por producir al menos 3,4 g/1 de licopeno en los días 5-6 del cultivo, en un fermentador semicomercial o piloto.
  13. 13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por producir al menos 1,6 g/1 de licopeno en los días 5-6 días del cultivo, en termentador semicomercial o piloto.
  14. 14. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque:1 i) Se siembran inóculos de la cepa ( + ) de B. trisporá en un rango de 800-1000 esporas/ml . ii) Se siembran inóculos de las cepa (-) de B. trisporá en un rango de 10000-60000 esporas/ml. iii) Se cultivan los inóculos de las cepas (+) y (-) de B. trisporá durante al menos 48 horas a 25°C. iv) Se siembran fases de cultivo primario de la cepa ( + ) de B. trisporá con al menos un 0,1% (v/v) dé la fase de inoculo. - 67 - v) Se siembran fases de cultivo primario de la cepa (-) de B. trispora con al menos un 0,1% (v/v) d† la fase de inoculación. vi) Se cultivan las fases primarias de la cepa (+ ) de S. trispora durante 36-48 horas a 26°C. vii) Se cultivan las fases primarias de la cepa (-) de B. trispora durante 36-48 horas a 28°C. viii) Se mezclan las fases primarias de las cepas ( + ) y !(-) de B. trispora en una proporción 1 ( + ) / 10 (-) (v/v) . ix) Se siembra cada termentador con el 10-20% (v/v) de la mezcla de las cepas ( + ) y (-) de B. trispora descrita en el apartado viii. x) Se incuba el cultivo mezclado durante 5-6 días a 26°C. ¦
  15. 15. Proceso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por proáucir al menos 3,6 g/1 de licopeno a los 5-6 días.
  16. 16. Proceso de; acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por producir al menos 30 mg de licopeno por gramo de peso seco de micelio a los días 5 y 6 de cultivo.
  17. 17. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a Í6, caracterizado por que la etapa b. se lleva a cabo separando previamente la biomasa del medio de - 68 - cultivo y resuspendiendo dicha biomasa en alcohol, con una proporción alcohol/biomasa del orden 1 ml/g a 10 ml/g.
  18. 18. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por utilizar en la etapa b. alcohol a temperatura comprendida entre 0°C y la correspondiente a su punto de ebullición, preferiblemente entre 10° y 50 °C.
  19. 19. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado en que la etapa b. se lleva a cabo directamente mezclando el medio de cultivo de fermentación que contiene la biomasa sin separar previamente dicha biomasa, en alcohol, con un índice de alcohol/medio de cultivo entre 1/0.5 y 1/5, de preferencia entre l/l y 1/3, a una temperatura entre temperatura ambiente y el punto de ebullición de la mezcla, de preferencia entre temperatura ambiente y 60 °C.
  20. 20. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por utilizar en la etapa d. de extracción sólido-líquido un solvente tipo éster, preferentemente acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo, acetato de n-butilo o acetato de isobutilo.
  21. 21. Proceso de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado por utilizar una cantidad de solvente del orden de 5 a 30 mi por g de la biomasa que resulta en la etapa c.
  22. 22. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 20 y 21, caracterizado en que, cuando el solvente utilizado es acetato - 69 - de isobutilo, la extracción es llevada a cabo a temperaturas que varían de 60 a 70 + 5°C.
  23. 23. Proceso de: acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado en que el solvente es utilizado de tal modo que el tiempo de contacto con el licopeno es menor de 15 minutos, de preferencia 2-5 minutos.
  24. 24. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque en la etapa f. la precipitación/cristalización del producto concentrado después de la extracción se consigue mediante adición de un solvente en el que el licopeno tiene baja solubilidad, tipo metanol, etanol , propanol o isopropanol, y que asegura que las sustancias de carácter lipofílico que acompañan al licopeno se mantengan disueltas.
  25. 25. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24, en que la etapa h. de formulación consiste en la formación de una suspensión microcristalina de licopeno mediante la premezcla de cristales de licopeno, antioxidantes y aceites en proporciones adecuadas, seguida de una molienda.
  26. 26. Proceso de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el aceite utilizado es de origen vegetal, preferentemente de girasol, oliva, maíz, algodón o soja.
  27. 27. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado por efectuar la molienda en un molino de bolas. 70
  28. 28. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado por utilizar antioxidantes liposolubles, preferentemente tocoferóles naturales, en proporción 0,2 a 15%, preferiblemente 0,5-5j% respecto al peso del licopeno en la mezcla.
  29. 29. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 24, en que la etapa h. de| formulación comprende la preparación de licopeno dispersable en agua fría (CWD) , mediante un proceso que engloba las siguientes fases: i) Disolución del licopeno cristalino acompañado de compuestos antioxidantes en un solvente orgánico. ii) Emulsión y/o microencapsulación de la fase orgánica anterior en una solución acuosa de almidones modificados. iii) Eliminación del solvente y parte del agua por evaporación, obteniendo la formulación líquida. iv) Secado y acabado final .
  30. 30. Proceso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado por utilizar cloruro de metileno como solvente en la fase i. de disolución del licopeno.
  31. 31. Proceso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado por utilizar ésteres de acilo como solvente en la fase i. de disolución del licopeno, especialmente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, n-butilo o isobutilo. - 71 -
  32. 32. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado por utilizar en la fase i. de disolución del licopeno uno o una mezcla de antioxidantes, preferiblemente antioxidantes de tipo tocoferol o palmitato de ascorbilo, en proporción entre 1-30%, preferiblemente 10-20%, respecto al peso de licopeno.
  33. 33. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado por utilizar además un aceite vegetal en la fase i. de disolución del licopeno en el solvente orgánico.
  34. 34. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 33, caracterizado por emplear en la fase ii . como agentes emulsionantes y/o microencapsulantes almidones modificados, preferentemente en forma de ásteres, y más preferentemente ésteres de octenil -succinato .
  35. 35. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 34, caracterizado por efectuar la fase iv. de secado de la formulación líquida mediante un proceso a seleccionar entre: atomización por pulverización a alta temperatura, granulación por pulverización sobre un lecho fluidizado a temperatura relativamente baja o secado por congelación.
  36. 36. Proceso de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual el secado por granulación realizado en la etapa iv se lleva a cabo por atomización y el producto atomizado obtenido del mismo además es aglomerado en un proceso de lecho - 72 - fluidizado mediante la pulverización de una solución de uno de los almidones modificados o la suspensión de licopeno microencapsulada en sí, obteniendo con ello un producto granulado con tamaño de partícula incrementado.
  37. 37. Proceso de acuerdo con la reivindicación 35, en el i cual la granulación comprende secar una suspensión de l licopeno microencapsulada sobre un material en semilla, de preferencia material I inerte y mejor partículas de azúcar o polvo fino de material previamente granulado.
  38. 38. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 37, caracterizado porque en la fase iv. el acabado final consiste en revestir las partículas con soluciones acuosas de azúcares o almidones modificadas en una proporción de 0.5-10%.
  39. 39. Licopeno cristalino obtenible según el proceso de las reivindicaciones 1 a' 24, que tiene una pureza de cristal, determinada por absorción espectrofotomética de los cristales en n-hexano a 4/2nm (iEl% lcm=3450) , que es mayor de 95%, el contenido de los otros carotenoides siendo menor del 3% y el contenido del cis-licopeno siendo menor del 3%.
  40. 40. Formulación j de licopeno que consiste en una suspensión de aceite de licopeno cristalino de la reivindicación 39, teniendo un tamaño de cristal de licopeno inferior a 10 mieras,1 preferiblemente inferior a 5 mieras y más preferiblemente inferior a 2 mieras. I - 73 -
  41. 41. Formulación de licopeno C D obtenible según el proceso de las reivindicaciones 1 a 24 y 29 a 38, que consiste en microcrístales de licopeno atomizado con un tamaño de partícula promedio entre 10 y 100 mieras.
  42. 42. Formulación de licopeno CWD obtenible según el procedimiento de las reivindicaciones 1-24 y 29-38, que consiste en un aglomerado de microcristales de licopeno atomizado con un tamaño de partícula promedio comprendido entre 50-500 mieras, preferiblemente entre 200-300 mieras.
  43. 43. Formulación de licopeno CWD obtenible según el procedimiento de las reivindicaciones 1-24 y 29-38, que consiste en un aglomerado de microcristales de licopeno atomizado con un tamaño de partícula promedio comprendido entre 100-2000 mieras, preferiblemente entre 100-800 mieras, y mejor entre 100 y 300 mieras.
  44. 44. Formulación ¡de licopeno CWD de acuerdo con las reivindicaciones 41 j a 44, que consiste en partículas revestidas en las cuales el revestimiento fue constituido por 0.5-10% en peso seco de soluciones acuosas de azúcares o almidón modificado. |
  45. 45. Uso del licopeno cristalino de la reivindicación 39 como colorante, particularmente en los sectores alimenticio, farmacéutico y cosmético.
  46. 46. Uso del licop'eno cristalino de la reivindicación 39 - 74 - como suplemento nutricional .
  47. 47. Uso de cualquiera de las formulaciones de las reivindicaciones 40 a 44 como colorantes, particularmente en los sectores alimenticio, farmacéutico y cosmético.
  48. 48. Uso de cualquiera de las formulaciones de las reivindicaciones 40 a 44 como suplementos nutricionales . - 75 - : RESUMEN El procedimientoj de fermentación con cepas seleccionadas de B. Trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de¡ los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación n el proceso de recuperación y un incremento de purezja del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.
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