WO2003056028A1 - Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora, formulaciones y usos del licopeno obtenido - Google Patents

Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora, formulaciones y usos del licopeno obtenido Download PDF

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WO2003056028A1
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trispora
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microns
formulation
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Ana Teresa Marcos Rodriguez
Antonio Estrella De Castro
Javier Costa Perez
Manuel Antonio Oliver Ruiz
Nieves Fraile Yecora
Juan Luis De La Fuente Moreno
Marta Rodriguez Saiz
Bruno Diez Garcia
Enrique Peiro Cezon
Angel MUÑOZ RUIZ
Walter Cabri
Juan Francisco Lopez Ortiz
José Luis BARREDO FUENTE
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Vitatene, S.A.
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Definitions

  • the fermentation process with selected strains of B. trispora set forth in the present invention allows to reach lycopene production levels higher than those currently described.
  • the methods of isolation, purification and formulation are applicable to any natural source of lycopene, especially submerged cultures of mucoral fungi of the genera Blakeslea, Choanephora, Phycomyces or Mucor.
  • the extraction procedure allows a simplification in the recovery process and an increase in product purity with respect to the procedures described above.
  • the formulation procedures provide a high added value, since they allow to obtain stabilized preparations of lycopene for direct application in the food and pharmaceutical fields.
  • Carotenoids are widely distributed in nature, conferring their characteristic color, from yellow to deep red, to numerous natural substances such as carrots, peppers, tomatoes, flowers or certain microorganisms among which are certain bacteria, fungi and photosynthetic organisms. Carotenoids can be classified into two types: (i) pure hydrocarbons called carotenes, 'among which are ' compounds such as ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene- - or. lycopene and (ii) molecules called xanthophylls, which contain oxygen in different
  • SUBSTITUTE SHEET forms (hydroxy, epoxy groups, etc.), among which are astaxanthin, zeaxanthin, capsantin, canthaxanthin, lutein, etc. Both groups of compounds have a different behavior in terms of their physicochemical properties and solubility in organic solvents. All these compounds play an important role in the human diet having studied extensively their properties as antioxidants for the prevention of cancer and other human diseases and as precursors of vitamin A. It has recently been shown in rats that lycopene inhibits the harmful effect of nitriloacetate ferric on DNA and prevents liver necrosis [Matos HR et al. (2001) Arch. Biochem.
  • Lycopene (C 0 H 56 ) is an intermediary of the biosynthetic pathway of ⁇ -carotene and xanthophylls. It has a molecular weight of 536.85 and the following molecular formula:
  • Lycopene in addition to acting as an antioxidant, prevents cardiovascular diseases and some types of cancer and acts in growth control [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cancer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. and Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys 336: 1-9; Clinton, SK (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. This has led to an increase in demand from consumers. Obtaining lycopene as a high purity compound has been linked in the past to chemical synthesis [US 5208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599]. However, there are currently alternative routes based on sources of lycopene of natural origin and specific extraction processes.
  • Lycopene preparations of biological origin are obtained from tomato
  • Trispora has allowed us to conclude that the biosynthetic pathway of ⁇ -carotene in this fungus is similar to that described for P. blakesleeanus [Metha B.J. and Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838].
  • P. blakesleeanus the yellow color of its mycelium can be modified by mutation, resulting in strains with
  • SUBSTITUTE SHEET RULE 26 Mycelium red, white or several gradations of yellow. Red mutants accumulate lycopene, while whites lack carotenoid production or accumulate phytoene. For the production of lycopene it is necessary to have strains of B. trispora lacking lycopene cyclase activity or alternatively add chemical compounds that inhibit said enzymatic activity to the fermentation medium.
  • OPP ⁇ OPP
  • Patents JP 73016189 and JP 73016190 describe methods of producing lycopene with mucoral fungi based on the addition of tertiary amines.
  • RU 2102416 describes the addition of aminomethylpyridines and tobacco residues to induce the accumulation of lycopene.
  • the use of other heterocyclic nitrogen bases to block the synthesis of carotenoids at the level of lycopene: nicotine [JP 09313167], imidazole, pyridine, morpholine, quinoline and some substituted derivatives [US 3369974] has been published. ; Ninet L., Renaut J. (1979) In: Peppler HJ, Perlman D (eds). Microbial Technology, 2 nd . Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-
  • Lycopene can be obtained from plant products such as: tomato, carrot, pepper, vegetable oils, etc.
  • WO 97/48287 describes a process for the preparation of oleoresins rich in lycopene from tomatoes by crushing the tomato until obtaining the pulp, extracting the lycopene from the pulp with organic solvents and subsequent elimination of the solvent by evaporation, resulting in an oleoresin with a lycopene content between 2-10%. Similar procedures for obtaining oleoresins rich in carotenoids in general and lycopene in particular
  • SUBSTITUTE SHEET RULE 26 from vegetables and oils are described in different patents, as in US 5245095 and EP 580745, by precipitation with calcium salts, US 5019668, using an oil transesterification procedure and subsequent distillation, WO 95/16363, which describes the fractionation of tomatoes in different fractions that include a carotenoid-rich oleoresin, and PCT WO 90/08584, which describes the extraction of lycopene by using fluids in the supercritical state, although the extract obtained is a mixture of different carotenoids and the extraction yields are very low due to its low solubility.
  • WO 97/15554 describes the extraction of carotenoids of vegetable origin from carrots and tomatoes, which include
  • lycopene Another important source of lycopene is certain carotenoid-rich microalgae of the Dunaliella type.
  • organic solvents chlorocarbons, hydrocarbons, etc. .
  • edible oils DE 4342798
  • RULE 26 INSTITUTION Lycopene can also be obtained from certain mucoral fungi such as Blakeslea, Choanephora, Phycomyces or Mucor by fermentation in liquid medium, presenting as an advantage over obtaining lycopene from vegetable products or algae the high concentration of this compound, in some cases greater than 5% by weight with respect to the amount of dry biomass, concentrations higher than those obtained from the best plant varieties, as well as the possibility of biotechnological development of superproductive strains of these microorganisms, either by classical mutagenesis techniques or by applying the new molecular biology technologies that allow the genetic manipulation of these microorganisms, increasing the concentration and production of lycopene, and eliminating the production of other structurally related carotenoids.
  • mucoral fungi such as Blakeslea, Choanephora, Phycomyces or Mucor by fermentation in liquid medium
  • SUBSTITUTE SHEET Tenoids in volatile organic solvents, such as halogenated hydrocarbons, and emulsifying them with an aqueous solution of sodium lauryl sulfate.
  • US 5364563 discloses a process for producing a carotenoid powder preparation, which involves forming a suspension of a carotenoid in high boiling oil. The suspension is superheated with water vapor for a maximum period of 30 seconds to form a carotenoid solution in oil. This solution is then emulsified on an aqueous solution of a colloid and then the emulsion is spray dried.
  • the present invention describes a series of procedures for obtaining high lycopene productions with the JB fungus. Trispora, as well as procedures for recovery and formulation.
  • the invention consists in (i) the design of methods for obtaining and selecting B mutants. trispora lycopene superproducers, (ii) the development of improved fermentation conditions,
  • Trispora is a fungus that has great industrial importance for the biotechnological production of lycopene. In fact, this process is competitive with the synthetic process used industrially today.
  • NTG N '-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the spore suspensions to be mutated were obtained from slants with YpSs medium.
  • the spores were resuspended by adding 10 ml of a 0.1% solution of Triton X-100 to each slant.
  • the mycelium residues were removed by filtration through a 20 ⁇ m pore nylon filter. The concentration of spores in the suspension was adjusted to 10 6 spores / ml.
  • the EMS mutation procedure consisted of the incubation of 10 6 spores / ml in a 3% EMS solution in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 at room temperature for 60 minutes, achieving mortality rates of around 99%
  • the mutated spores were washed three times with 0.1% Triton X-100 centrifuging at 3,000 rpm and 15 ° C for 2 minutes.
  • the NTG mutation procedure consisted of the incubation of 10 6 spores / ml in a solution containing 250 ⁇ g / ml of NTG and 0.1 M sodium citrate buffer pH 5.0 at room temperature for 30 minutes, achieving mortality rates of about 95%.
  • Trispora (-) lycopene superproducers were the following: (i) the use of trisporic acids and (ii) the color intensity of the colony.
  • Trisporic acids were obtained from a mixed culture of the (+) and (-) strains of B. Trispora Colonies with filters were incubated at 25 ° C, observing that lycopene-producing mutants
  • CM Carotene minus (-).
  • LM Lycopene minus (-).
  • CP Carotene plus (+).
  • CMAl (-) means that it is a strain of carotene (C), minus (M), parental of CMB and mutant number 1.
  • CMAl (-), CMA2 (-) , CMA3 (-) and CMA4 (-) correspond to mutants 1, 2, 3 and 4 of the same generation.
  • the CPAl (+) and CMB2 (-) strains were grown in a pre-industrial Krutator in order to determine the level of lycopene production. For this, they were grown separately in flasks, transferred separately to intermediate growth tanks and finally fermented together. Between 25 and 35 hours of fermentation, imidazole was added as an inhibitor of the lycopene cyclase enzyme activity. The fermentation was incubated for 100-140 hours. The average lycopene production value obtained in a series of different fermentations of the CPAl (+) and CMB2 (-) strains was 3.4 g / 1.
  • ITUTION RULE 26 the level of lycopene production without the addition of inhibitors of the lycopene cyclase enzyme activity. Fermentation was performed as indicated above for the CPAl (+) and CMB2 (-) strains, but without adding imidazole. The average lycopene production value obtained in a series of different fermentations of the CPAl (+) and LMA1 (-) strains was 1.6 g / 1.
  • a higher yield in this fermentation phase is obtained by controlling the age of the vegetative growth phases of the B. trispora strains.
  • the cultures used as inoculums have an age of 30-60 hours, preferably 48 hours, for both strains
  • Incubation is performed at about 25 ° C with 0.1% v / v of each inoculum sown in the primary culture phase.
  • the age of said primary cultures ranges from 30-60 hours, preferably 36-48 hours, at temperatures ranging between 26-28 ° C.
  • the primary (+) / (-) phases are mixed in proportion 1/10 v / v and the 10-20% v / v air fresheners are sown with the mixture of said phases.
  • the recovery procedure from the culture broth, prepared according to the procedures for use implies as a first stage the separation of the biomass from the broth.
  • This separation can be done by the established filtration procedures, using the technologies to use filters, be they bands, rotary, press, etc., in which a barrier constituted by the filter cloth separates the biomass and allows the liquid phase to pass without biomass, or centrifugation, in which making use of the difference in densities between the broth and the biomass (normally greater) a machine of the type of a
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) centrifugal separator, decanter or similar, in which the heavy phase is concentrated and separated from the liquid phase with the least possible amount of biomass.
  • One of the objectives of this stage is to reduce losses and optimize the characteristics of each phase, obtaining the greatest amount of biomass with the highest dry residue content and eliminating the greatest amount of fermentation broth, with the least amount of active material.
  • the resulting wet mycelium contains more than 95% of the carotenoids produced in the fermentation, preferably more than 97% and more preferably more than 99%.
  • the carotenoid content of the aqueous phase is therefore less than 5%, preferably less than 3% and more preferably less than 1%.
  • This wet mycelium would be able to allow lycopene separation through subsequent stages.
  • this mycelium maintains a relatively high percentage of lipophilic components, between 15 and 20% (fatty acids and oils) that in later stages pose purification problems, which leads to introducing, in this point, a stage of biomass purification.
  • This purification stage implies a resuspension of the biomass in alcohol: methanol, ethanol, propanol, isopropanol, or any other alcohol in which the solubility of lycopene is very low, in adequate proportion to achieve maximum purification of the lipid components.
  • the wet mycelium is resuspended with an amount of alcohol ranging from 1 ml / g to 10 ml / g of wet mycelium.
  • the resuspension temperature ranges between 0 ° C and the boiling temperature of the alcohol, preferably between 10 and 50 ° C.
  • the contact time ranges from 5 minutes to 24 hours.
  • the alcoholic resuspension thus prepared is filtered or centrifuged, so that the solids content in the filtrate or clarified is practically nil.
  • the resulting wet mycelium which
  • SU SHEET it will contain alcohol plus water in different proportions, it contains more than 93% of the carotenoids produced in the fermentation, preferably more than 95% and more preferably more than 97%.
  • the carotenoid content is less than 2%, preferably less than 1%, based on the initial broth.
  • the broth / alcohol ratio can range from 1 / 0.5 to 1/5, preferably between 1/1 and 1/3.
  • the temperature of the mixture ranges between room temperature and boiling temperature of the mixture, preferably between room temperature and 60 ° C.
  • Dehydrated / purified mycelium is dried. Drying can be done by the usual batch or continuous procedures.
  • the drying temperature ranges from room temperature to 150 ° C, preferably it should not exceed 60 ° C and more preferably be below 50 ° C.
  • the drying time is a function of the temperature used, ranging from 1 hour to 72 hours. Due to the possible decomposition of these carotenoids by oxidation with atmospheric oxygen, it is convenient to carry out this drying operation in the absence of oxygen, very low
  • the grinding can be done on the dry product, by mechanical systems with rotating or fixed parts: mallets, sieves, etc., by passing through rotating cylinders by pressing one on the other (compaction or extrusion). It is also possible to carry out the drying and grinding in a single stage by means of a flash (instantaneous) drying system in a jet mili equipment (jet mill) where the wet product is fed to a stream of a recirculating gas and at a high temperature, so that the residence time is the minimum to be able to vaporize the content of liquid components, and the product is transported, by varying densities, to a cyclone where it is recovered. During the drying time and the path there is also a homogenization effect when the particles collide with the walls.
  • acyl esters preferably ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl acetates, which reasonably combine solubility.
  • SUBSTITUTE SHEET RULE 26 high for carotenoid components with their compatibility as solvents included in the ICH Class III Group. These solvents are admissible both at national and community level, in both pharmaceutical and food fields (RDL12 / 04/90 and RDL16 / 10/96)
  • the content of residual solvents must be, according to the ICH, less than 5000 pp, preferably less than 1000 ppm and more preferably less than 100 ppm, always referred to the dry matter of the liquid mixture.
  • the extraction temperature ranges between ambient and boiling temperature of the solvent, preferably between 50 ° C and 80 ° C.
  • the extraction time will be the minimum necessary to achieve solubilization, between 1 second and 1 hour, preferably between 1 minute and 15 minutes.
  • the amount of solvent used depends on the temperature and the richness of the mycelium in carotenoids, ranging between 5 ml / g and 30 ml / g of biomass.
  • the number of extractions varies from 1 to 3.
  • the amount of carotenoids extracted is greater than 85%, preferably greater than 90% and more preferably greater than 95%.
  • the final concentration of carotenoids in the solvent after concentrating preferably ranges from 10 to 50 g / 1.
  • the concentration temperature should be below 80 ° C, preferably below 70 ° C and more preferably below 50 ° C.
  • an insolubilizer of the carotenoids specifically an alcohol and more specifically methanol, ethanol, propanol, isopropanol or any other alcohol in which the solubility of lycopene is very low, so which yield in crystalline lycopene increases considerably.
  • the addition of alcohol also has a purifying effect.
  • the crystallization time ranges from 15 in to 24 hours, preferably between 1 h and
  • the crystallization temperature should be below 25 ° C, preferably below 5 ° C.
  • the crystals can be separated from the crystallization waters by filtration or centrifugation, displacing the crystallization waters that bathe the crystals by washing with the same alcohol used to insolubilize.
  • the crystals obtained are dried under vacuum and at room temperature for at least 1 h until a residual solvent content is obtained in accordance with the specifications established by the aforementioned legislation and that, in the case of lycopene, a drying loss of less than 0 is established. ,5%.
  • the content in cis lycopene is less than 3%.
  • the method of this invention is especially applicable for the recovery of crystalline lycopene from a microbial source, preferably algae, fungi or yeasts, more preferably from fungi of the order of Mucorales, and more preferably B. Trispora
  • a microbial source preferably algae, fungi or yeasts, more preferably from fungi of the order of Mucorales, and more preferably B. Trispora
  • the crystalline product obtained by the methodology described in this invention can be packaged in opaque containers that prevent photodegradation of the product, in the absence of oxygen (inert or empty atmosphere) to prevent oxidation and at temperatures between 0 and 5 ° C.
  • the properly packaged product can be handled and traded.
  • Fundamental object also of this invention is a lycopene preparation process that includes its formulation in different presentations depending on the characteristics of the application for which it is desired to use lycopene.
  • a first application called microcrystalline suspension of lycopene in vegetable oil, consists of the premix of the previous crystalline lycopene with a variable amount of vegetable oil.
  • the type of vegetable oil can be very varied, the most common, although not the only ones, being sunflower, olive, corn, soybean, cotton, etc.
  • the dosage of lycopene will be a function of the final richness that is desired to be achieved, the most common values being suspensions with a lycopene content between 5 and 60%, preferably between 10 and 30%.
  • fat-soluble antioxidants are added to the use, such as natural tocopherols, and preferably D, L-alpha-tocopherol.
  • the proportion of this compound ranges between 0.2 and 15% with respect to the weight of lycopene, preferably between 0.5 and 5%.
  • Preferred object of this invention are the ball mills that allow a reduction of the crystal size below 10 microns, preferably below 5 microns, and still preferably below 2 microns, using microspheres of diameter between 0.5 and 0 , 75 mm.
  • the crystal size may vary depending on
  • methylene chloride Especially suitable is methylene chloride.
  • food grade solvents considered natural such as acyl esters, preferably ethyl acetates, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, etc. can be used. which combine reasonably high solubility for carotenoid components with their compatibility as solvents included in the ICH Class III Group.
  • the concentration of lycopene in the organic solvent may range between 1 and 50 g / 1, preferably between 10 and 30 g / 1.
  • the dissolution temperature may range between ambient and boiling temperature of the solvent, preferably between 20 and 130 ° C.
  • the solution can be carried out at 20-35 ° C for a time between 1 and 15 minutes. On the contrary, if the solvent is isobutyl acetate, the solution will preferably be carried out between 70 and 130 ° C for a few seconds. On the contrary, if the cis isomer levels are not relevant, the solution can be carried out without restriction under the conditions of the solution, rather than the achievement of the total molecular solubility of the lycopene in the solvent used.
  • one or a mixture of several antioxidants preferably of tocopherol, ascorbyl palmitate, etc.
  • lycopene in the organic solvent, each in proportion between 1 and 30%, preferably between 10 and 20%, based on the weight of lycopene.
  • vegetable oil, sunflower, olive, corn, soybean, cotton, etc. into the mixture. in order to favor the dissolution of lycopene, and provide additional stability to the preparation.
  • the lycopene / oil ratio can range between 10/1 and 1/10.
  • the lycopene solution thus obtained is mixed and emulsified with an aqueous solution containing an emulsifying agent, such as modified starch, more specifically starch-derived esters, preferably starch-derived octenyl succinates of various molecular weights, being of particular interest, although not exclusively, the National Starch Pu ⁇ ty Gum 2000 or the
  • Roquette Cleargum CO 01 and a microencapsulating agent, formed for example by modified starch, more specifically starch-derived esters, preferably starch-derived octenylsuccinate of various molecular weights, the Hi Cap 100 being of special interest, although not exclusively ® or the National Starch Capsul®.
  • modified starch more specifically starch-derived esters, preferably starch-derived octenylsuccinate of various molecular weights, the Hi Cap 100 being of special interest, although not exclusively ® or the National Starch Capsul®.
  • SUBSTITUTE SHEET proportion in which the emulsifying agent and the microencapsulating agent are mixed can range between 5/95 and 95/5, preferably between 25/75 and 75/25, more preferably between 40/60 and 60/40.
  • concentration in water of each of the components of the mixture of emulsifying agent and microencapsulating agent is variable, being able to be between 1 and 30%, preferably between 5 and 20%, and more preferably 10%.
  • the aqueous and organic phase mixture is emulsified and the emulsion obtained is homogenized using pressure differential homogenization systems such as Gaulin Shawl or Microfluidizer, customary to use, and preferably by tangential friction homogenization, such as with an Ultraturrax emulsifier during a variable time depending on the energy provided by the equipment and the volume of the mixture to be emulsified, in order to obtain an average micelle size of less than 10 microns, preferably less than 2 microns and more preferably between 0.1 and 1 millimeter.
  • pressure differential homogenization systems such as Gaulin Shawl or Microfluidizer, customary to use, and preferably by tangential friction homogenization, such as with an Ultraturrax emulsifier during a variable time depending on the energy provided by the equipment and the volume of the mixture to be emulsified, in order to obtain an average micelle size of less than 10 microns, preferably less than 2 microns and more preferably between 0.1 and 1 mill
  • the evaporation of the organic solvent is carried out, preferably by vacuum distillation at a temperature below 50 ° C. As evaporation of the solvent takes place, the crystallization of lycopene in the starch matrix occurs. Once the solvent has evaporated, evaporation is continued, with successive additions of water until a residual solvent content is obtained in accordance with the maximum concentration specifications established by the legislation and a dry residue suitable for the type of drying to be applied to this liquid mixture Suitable dry matter values of the microencapsulated lycopene suspension are between 1 and 30%, preferably between 10 and 20%.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) high temperature (atomization) as the spray method on fluidized bed (granulation).
  • Another alternative would be freeze drying. According to the method of spray drying, suitable temperatures of inlet of the drying air would be between 100 and 200 ° C while those of outlet between 60 and 120 ° C.
  • the atomized product has a particle size between 10 and 100 microns.
  • the atomized product can be agglomerated by spraying a solution of one of the modified starches used in the formulation, or the microencapsulated lycopene suspension itself within a fluidized bed of the atomized product itself, allowing particle sizes ranging between 50 and 500 microns, preferably between 200 and 300 microns.
  • the method of granulation involves the use of a fluidized bed granulator in which planting material is placed, which can be inert material type, such as sugar particles, " or - fine powder of the same material to be dried obtained in granulation processes. prior to or in a spray drying process.
  • planting material which can be inert material type, such as sugar particles, " or - fine powder of the same material to be dried obtained in granulation processes.
  • the particles are kept moving by air, and the bed temperature is maintained between 30 and 90 ° C, preferably between 50 and 80 ° C.
  • the microencapsulated lycopene suspension is sprayed by preheated air at a temperature between 20 and 140 ° C in the fluid bed, at a speed that ensures that the particles to be coated do not get too wet or agglomerate.
  • the granulated product has a particle size between 100 and 2000 microns, preferably between 100 and 800 microns and still preferably between 100 and 300 microns, once the spraying is finished by one or the other method,
  • REGL SUBSTITUTE SHEET particles can be coated. This coating can be carried out with approximately 0.5-10% by dry weight of aqueous solutions of various sugars or even of some or a mixture of the starches that constitute the formula object of the present invention.
  • mutagenic procedure of the (+) and (-) strains of B was developed.
  • trispora for which we analyzed: (i) different types of mutagenic agents, (ii) concentration of the mutagen, (iii) concentration of spores, (iv) incubation pH and (v) treatment time.
  • EMS ethylmethanesulfonate
  • NTG N-methyl-N '-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the spore suspensions to be mutated were obtained from slants with YpSs medium, whose composition is the
  • SUBSTITUTE SHEET next: yeast extract 4 g / 1, soluble starch 15 g / 1, K 2 HP0 4 1 g / 1, MgS0 4 -7H 2 0 0.5 g / 1 and agar 15 g / 1, at a final pH of 5.8.
  • the spores were resuspended by adding 10 ml of a 0.1% solution of Triton X-100 to each slant.
  • the mycelium residues were removed by filtration through a 20 ⁇ m pore nylon filter.
  • the concentration of spores in the suspension was about 10 6 spores / ml.
  • the EMS mutation procedure consisted of the incubation of 10 6 spores / ml in a 3% EMS solution in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 at room temperature for 60 minutes, achieving mortality rates of around 99%
  • the mutated spores were washed three times with 0.1% Triton X-100 centrifuging at 3,000 rpm and 15 ° C for 2 minutes.
  • the NTG mutation procedure consisted of the incubation of 10 ⁇ spores / ml in a solution containing
  • Petri dishes containing seeded Sutter IV solid medium supplemented with 0.1% Triton X100 were seeded with the mutated spores.
  • the composition per liter of Sutter IV medium is as follows: 40 g of glucose, 4 g of L-asparagine, 10 g of KH 2 P0, 40 ml of 50x microelements solution, and 30 g of agar.
  • the 50x microelements solution is composed of: 25 g / 1 MgS0 4 .7H 2 0, 1.82 g / 1 CaCl 2 .2H 2 0, 0.05 g / 1 thiamine, 0.1 g / 1 of citric acid, 0.075 g / 1 of Fe (N0 3 ) 3 .9H 2 0, 0.05 g / 1 of ZnS0 4 .7H 2 0, 0.17 g / 1 of MnSO 4 .H 2 0, 0.025g / l of CuS0 4 .5H 2 0 and 0.025 g / 1 of NaMo0.2H 2 0.
  • the seeded plates were incubated at 25 ° C for 4 days to obtain isolated colonies.
  • This example describes strategies for selecting strains of B. trispora (-) lycopene superproducers based on (i) the use of trisporic acids and (ii) the color intensity of the colony.
  • the phylogeny of the strains of B. trispora (-) used in the present invention is shown in Figure 1.
  • Trisporic acids were obtained by extracting the supernatant from a mixed culture of strains (+) and (-) of B. trispora with a volume of chloroform after acidifying the sample at pH 2. The organic fraction was extracted with a volume of a 4% sodium bicarbonate solution and the aqueous phase was collected, which was acidified to extract it again with chloroform. Subsequently, the chloroform was evaporated to dryness and the residue enriched in trisporic acids was dissolved in ethanol.
  • Trisporic acids were quantified by measuring absorbance at 325 nm and assuming an absorptivity coefficient of 70 ml x mg -1 x cm -1 (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114 : 1074-1082).
  • the sterile filters were incubated in a solution of 1.2 mg / ml of trisporic acids in ethanol and then allowed to dry at room temperature under sterile conditions. Subsequently, the filters were placed on the previously grown mutant colonies for 4 days at 25 ° C. The plates were incubated at 25 ° C for an additional 3 days, observing that the mutants producing
  • the mutant LMA1 (-) was selected ( Figure 1), which could present some mutation in the caRP gene, which codes for the lycopene cyclase enzyme activity and, therefore, instead to produce ⁇ -carotene, accumulate the lycopene intermediate during the carotenoid fermentation process. Therefore, the LMA1 strain is capable of producing lycopene without the need to add specific inhibitors of lycopene cyclase activity (Example 5).
  • the selection of lycopene-producing mutants based on the color intensity of the colony was performed as follows: The CMA1 strain ( ⁇ -carotene producer; see Figure 1) was mutated as indicated in example 1. The mutated spores were seeded on YEPDA solid medium plates (bacto-peptone 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, glucose 20 g / 1 and agar 20 g / 1, at a final pH of 6.0), they were incubated at 25 ° C for 24 hours and then at 20 ° C for 48-72 hours. Finally, those colonies that had a more intense yellow-orange color than the parental strain CMA (-) were selected.
  • CMBl (-) and CMB2 (-) 2 colonies with intense yellow-orange color
  • CMB1 and CMB2 strains could be superproducers of lycopene in mixed fermentations with the addition of specific inhibitors of lycopene cyclase activity (for example, imidazole; example 4).
  • Trispora CPAl (+) was planted in 500 ml flasks with 67 ml of medium at the rate of 10 3 spores for me.
  • the strain 23. trispora CMB2 (-) was sown in 500 ml flasks with 100 ml of medium at the rate of
  • the inoculums of the (+) and (-) strains were mixed in a 1/10 (v / v) ratio, and with the mixture 250 ml flasks were inoculated with 20 ml of fermentation medium to 4 ml ratio of the strain mixture per flask. These flasks were incubated at 25 ° C and 250 rpm for 5-6 days.
  • the fermentation medium used has the following composition per liter: 44 g of soybean meal, 19 g of cornmeal, 5.5 g of KH 2 P0, 0.002 g of thiamine hydrochloride, 100 ml of vegetable oil and adjusted pH to 7.5.
  • the medium was distributed in 250 ml flasks, which were inoculated with 20% of a mixture of the (+) and (-) strains of B. Trispora
  • a lycopene cyclase enzyme activity inhibitor was added in order to block the biosynthetic pathway at the lycopene level (for example, 0.75 mg / ml imidazole).
  • the flasks were incubated at 25 ° C and 250 rpm for 6 days. Once the fermentation was completed, a mixture of fermentation broth, glass beads and methylene chloride / methanol (1/1) was prepared.
  • the mycelium of B. Trispora was smooth by vortexing, releasing intracellular lycopene.
  • the lycopene extracted with the mixture of methylene chloride: methanol (1: 1 ratio) was diluted in acetone. The concentration and purity of lycopene was determined by the use of reverse phase HPLC liquid chromatography.
  • B strains trispora LMAl (-) and CPAl (+) selected as described in examples 1, 2 and 3 were fermented in a flask in order to determine the level of lycopene production in liquid medium and mixed culture.
  • inoculums of the (+) and (-) strains were prepared and the fermentation was carried out in a flask as indicated in Example 4. The difference is that in this case the chemical compound that inhibited the activity was not added lycopene cyclase.
  • the evaluation of the lycopene produced was carried out as described in example 4.
  • the CPAl (+) and CMB2 (-) strains of B. Trispora selected as described in Examples 2 and 3 were grown in a pre-industrial Krutator in order to determine the level of lycopene production.
  • an inoculum medium was prepared with the following composition per liter: 23 g of soybean meal, 47 g of cornmeal, 0.5 g of KH 2 P0 4 , 0.002 g of thiamine hydrochloride and its adjusted pH to 6.3.
  • Strains (+) and (-) were seeded separately in 2000 ml flasks with 500 ml of medium and incubated at 25 ° C and 250 rpm for 44-48 hours.
  • Each of the strains was transferred to an intermediate growth tank with a culture medium whose composition per liter is: 29 g of Pharmamedia, 47 g of cornmeal, 0.5 g of KH 2 P0 4 ; 0.002 g of thiamine hydrochloride and 1 g of antifoam, and its pH adjusted to 6.0.
  • the (+) and (-) strains were mixed in a 1/10 proportion and with 20% of the mixture, the base fermentation medium was sown, whose composition per liter is as follows: 44 g of soybean meal, 19.25 g of cornmeal, 0.55 g of KH 2 P0 4 , 3.36 g of Na 2 HP0 4 , 0.184 g of NaH 2 P0 4 , 0.0022 g of hydrochloride thiamine, 100 g of vegetable oil and 0.175 g of antifoam, and its initial pH adjusted to 7.5.
  • the fermentation was incubated for 100-140 hours at a temperature of 25-28 ° C with variable agitation between 150 and 250 rpm and aeration of 1-1.5 v / v / m. Between 25 and 35 hours of fermentation sterile imidazole was added to a final concentration of 0.75 g / 1.
  • the CPAl (+) and LMAl (-) strains of B. Trispora selected as described in Examples 2 and 3 were grown in a pre-industrial fermenter in order to determine the level of lycopene production without the addition of inhibitors of lycopene enzymatic activity.
  • an inoculum medium was prepared with the following composition per liter: 23 g of soybean meal, 47 g of cornmeal, 0.5 g of KH 2 P0 4 , 0.002 g of thiamine hydrochloride and its adjusted pH to 6.3. Strains (+) and (-) were seeded separately in 2000 ml flasks with 500 ml of medium and incubated at 25 ° C and 250 rpm for 44-48 hours.
  • Each of the strains was transferred to an intermediate growth tank with a culture medium whose composition per liter is: 29 g of Pharmamedia, 47 g of cornmeal, 0.5 g of KH 2 P0 4 ; 0.002 g of thiamine hydrochloride and 1 g of antifoam, and its pH adjusted to 6.0.
  • the (+) and (-) strains were mixed in a 1/10 proportion and, with 20% of the mixture, the base fermentation medium was sown, whose composition per liter is as follows : 44 g of soybean meal, 19.25 g of cornmeal, 0.55 g of KH 2 P0 4 , 3.36 g of Na 2 HP0 4 , 0.184 g of NaH 2 P0 4 , 0.0022 g of hydrochloride of thiamine, 100 g of vegetable oil and 0.175 g of antifoam, and its initial pH adjusted to 7.5.
  • the fermentation was incubated for 100-140 hours at a temperature of 25-28 ° C with variable stirring between 150 and 250 " rpm and aeration of 1-1.5 v / v / m. - - - - -
  • SU SHEET Broth title was 3 g of lycopene per liter.
  • the biomass of this broth was recovered by filtration by buchner (porcelain filter-funnel that supports a paper or cardboard disk that acts as a filter sheet), obtaining 750 g of wet biomass.
  • the wet biomass was resuspended in 5.2 1 of isopropanol aceotrope 85/15 and stirred for 30 minutes at 45 + 5 ° C.
  • the purified biomass was recovered again by buchner. This biomass was dried in an oven under vacuum at a temperature below 45 ⁇ 5 ° C and in a time of 18 hours, until the content of residual solvents / water was less than 8%.
  • the extraction was carried out by mixing the 150 g of ground biomass with 2500 ml of isobutyl acetate at 70 ⁇ 5 ° C, while stirring for 5 minutes.
  • the spent biomass was separated from the lycopene-rich solvent by filtering through a filter plate.
  • the spent biomass was washed with 300 ml of hot isobutyl acetate on the filter itself, mixing the washing solvent with the filtrate.
  • the total lycopene-rich isobutyl acetate was concentrated under vacuum and the temperature was maintained below 45 ⁇ 5 ° C until the volume was reduced to 300 ml, thereby partially lycopene crystallized.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26 detected the presence of other carotenoids or of lycopene cis.
  • the dried biomass was extruded in a Hutt-Compacktor compactor from BEPEX, obtaining a solid with the same specific richness and conditioning to allow extraction with the solvent.
  • the extraction was carried out by mixing the 85 kg of ground solid with 1650 1 of isobutyl acetate. The mixture was heated in line at 60 + 5 ° C for an approximate average contact time of 2 minutes and the spent biomass was separated from the lycopene-rich solvent by means of a decanter centrifuge. The total lycopene-rich isobutyl acetate was concentrated under vacuum and keeping the temperature below 45 + 5 ° C until the volume was reduced to 100 1, thereby partially lycopene crystallized. To complete the crystallization of lycopene, 300 1 of isopropanol was added. The mixture was kept under stirring for 3 h at 0-5 ° C.
  • SUBSTITUTE SHEET RULE 26 it emulsified for 5 minutes in a stage on the aqueous phase using an IKA Ultraturrax emulsifier, reaching an average micelle size of 1.2 microns, measured with a Coulter LS230 analyzer.
  • the emulsion was transferred to a distillation system under vacuum, adding 600 ml of water, thereby evaporating the 410 ml of isobutyl acetate with approximately 700 ml of water.
  • 203 g of liquid formulation (12.75% dry matter) with a lycopene content of 1.25% (9.8% based on dry mass) were obtained.
  • HPLC a lycopene content of 23.3% was detected, the presence of other carotenoids not being detected.
  • This liquid formulation was atomized in a Büchi 190 laboratory atomizer, using a temperature in the gas at the entrance of 190 ° C and at the exit of 90 ° C, obtaining a deep red powder, with a lycopene content of 8, 4% and a humidity of 6.5%.
  • HPLC a lycopene content of 23% was detected, the presence of other carotenoids not being detected.
  • This liquid formulation was atomized in a Büchi 190 laboratory atomizer, using a temperature in the gas at the entrance of 190 ° C and at the exit of 90 ° C, obtaining a deep red powder, with a lycopene content of 8, 5% and a humidity of 6.0%. A lycopene content of 24.5% was detected by HPLC, and the presence of other carotenoids was not detected.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26 HPLC detected a lycopene cis content of 6.5%, and the presence of other carotenoids was not detected.
  • This liquid formulation was atomized in a Büchi 190 laboratory atomizer, using a temperature in the gas at the entrance of 190 ° C and at the exit of 90 ° C, obtaining a deep red powder, with a lycopene content of 10, 6% and with a humidity of 5.3%.
  • a lycopene cis content of 6.4% was detected by HPLC, the presence of other carotenoids not being detected.
  • FIG. 1 Lycopene production by mixed fermentation in flask of strain B. trispora CPAl (+) with each of the following strains of B. trispora (-): L25, CMAl, CMA2, CMA3, CMA4, CMB1, CMB2 and LMAl. Except in the mixed fermentation CPAl (+) / LMA1 (-), in the rest imidazole was added as an inhibitor of the lycopene cyclase enzyme activity. Axis of ordinates:% on production strain control L25 (-) (VKPM F-744).
  • FIG. 1 Production of lycopene by mixed fermentation in fermentor of strain B. trispora CPAl (+) with each of the following strains of B. trispora (-): L25, CMAl, CMA2, CMA3, CMBl, CMB2 and LMAl. Except in the mixed fermentation CPAl (+) / LMAl (-), in the rest imidazole was added as an inhibitor of the lycopene cyclase enzyme activity. Axis of ordinates:% on production strain control L25 (-) (VKPM F-744).

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Abstract

El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. Trispora expuesto en la presente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.

Description

PROCEDIMIENTO MEJORADO DE PRODUCCIÓN DE LICOPENO MEDIANTE LA FERMENTACIÓN DE CEPAS SELECCIONADAS DE Blakeslea trispora , FORMULACIONES Y USOS DEL LICOPENO OBTENIDO.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El procedimiento de fermentación con cepas seleccionadas de B. trispora expuesto en la présente invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento, purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos mucorales de los géneros Blakeslea , Choanephora , Phycomyces o Mucor. El procedimiento de extracción permite una simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y farmacéutico.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los carotenoides están ampliamente distribuidos en la naturaleza, confiriendo su característico color, desde amarillo hasta rojo profundo, a numerosas sustancias naturales como zanahorias, pimientos, tomates, flores o determinados microorganismos entre los que se encuentran ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Los carotenoides pueden clasificarse en dos tipos: (i) hidrocarburos puros denominados carotenos,' entre los que se encuentran ' compuestos como β-caroteno, α-caroteno, γ- caroteno- - o . licopeno y (ii) moléculas denominadas xantofilas, las cuales contienen oxigeno en diferentes
HOJA DE SUSTITUCIÓN formas (grupos hidroxi, epoxi, etc. ) , entre las que se encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteina, etc. Ambos grupos de compuestos presentan un comportamiento diferente en cuanto a sus propiedades fisico-quimicas y solubilidad en disolventes orgánicos. Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana habiéndose estudiado ampliamente sus propiedades como antioxidantes para la prevención del cáncer y otras enfermedades humanas y como precursores de la vitamina A. Recientemente se ha demostrado en ratas que el licopeno inhibe el efecto dañino del nitriloacetato férrico sobre el ADN y previene la necrosis del hígado [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem.
Biophys. vol. 396]. Adicionalmente, debido a sus coloraciones desde amarilla hasta roja, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ. , Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529- 544].
El licopeno (C0H56) es un intermediario de la ruta biosintética de β-caroteno y las xantofilas. Posee un peso molecular de 536,85 y la siguiente fórmula molecular:
Figure imgf000004_0001
Licopeno
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26) El licopeno, además de actuar como antioxidante, previene enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer y actúa en el control del crecimiento [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cáncer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. y Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys . 336: 1-9; Clinton, SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Esto ha dado lugar a un incremento de la demanda por parte de los consumidores. La obtención de licopeno como compuesto de alta pureza ha estado ligada en el pasado a la síntesis química [US 5208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599]. No obstante, actualmente existen vias alternativas basadas en fuentes de licopeno de origen natural y procesos de extracción específicos.
La producción de carotenoides por biosintesis micro- biana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Las preparaciones de licopeno de origen biológico se obtienen a partir de tomate
[PCT WO 97/48287, EP 608027] o mediante la fermentación de hongos mucorales de los géneros Phycomyces, Blakeslea y Choanephora [GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416, WO 00/77234]. Para conseguir una máxima producción de carotenoides con B. trispora es preciso fermentar conjuntamente las cepas (+) y (-) [Ciegler, A. (1965) Advances in Applied Microbiology 7: 1- 34; Plempel, M. (1965) Planta 65: 225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME. (1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. El incremento de producción de carotenoides en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor β o ácidos trispóricos [WO 00/77234, Caglioti L. et al . (1966) Tetrahedron Supplement 7: 175-187]. Para biosintetizar ácidos trispóricos, el β-caroteno producido por las cepas (+) y (-) es metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4-
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) dihidrotrisporol . La cepa (+) utiliza el 4-dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4- dihidrotrisporato) . Por su parte, la cepa(-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol. Finalmente, el metil-4-dihidrotrisporato es convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+) . Esta descripción de la biosintesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-) , pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos son variables en función de las cepas.
La ruta biosintética de β-caroteno (ver esquema 1) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados con
B . trispora como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloid.es [Arrach N. et al . (2001) Proceedings of the
National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al . (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509- 5519]. Para dicha biosintesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas: (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato para formar fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de β- caroteno. El análisis de mutantes de B . trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de β-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B.J. y Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Para la producción de licopeno es preciso disponer de cepas de B. trispora carentes de actividad licopeno ciclasa o alternativamente adicionar al medio de fermentación compuestos químicos inhibidores de la citada actividad enzimática.
Mevalonato
4 Isopentenil-PP • OPP
"OPP α. "OPP
Geranilgeranil-PP
1 1 Fitoeno sintasa (carRP) Fitoeno •
Figure imgf000007_0001
ESQUEMA 1 En las patentes GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 y WO 00/77234 se describe la obtención de licopeno mediante la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora . Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen métodos de fermentación de B . trispora basados en el control del pH entre valores de 7,0 y 9,5, obteniendo producciones de 99,7
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGL mg/1 de licopeno tras 7 dias de fermentación. Las patentes JP 73016189 Y JP 73016190 describen métodos de producción de licopeno con hongos mucorales basados en la adición aminas terciarias. La patente RU 2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las sustancias descritas en dichas patentes, se ha publicado el uso de otras bases nitrogenadas heterociclicas para bloquear la síntesis de carotenoides a nivel de licopeno: nicotina [JP 09313167], imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados sustituidos [US 3369974 ; Ninet L., Renaut J. (1979) En: Peppler HJ, Perlman D (eds) . Microbial Technology, 2nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-
544]. Asimismo, se han descrito mutantes de B . trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de adicionar aminas terciarias [Mehta B.J. y Cerda-Olmedo E. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 : 836-838].
Además de los hongos mucorales anteriormente mencionados, se ha descrito la producción de licopeno con algas [JP 09313167 y JP 2000152778], mediante la fermentación de Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens [US 3467579] y modificando la ruta biosintética de carotenoides de Flavobacterium sp. R1534 [US 6124113].
El licopeno puede ser obtenido a partir de productos vegetales tales como: tomate, zanahoria, pimiento, aceites vegetales, etc. Asi, en la patente WO 97/48287 se describe un procedimiento para la preparación de oleorresinas ricas en licopeno a partir de tomates mediante el estrujado del tomate hasta la obtención de la pulpa, extracción del licopeno de la pulpa con disolventes orgánicos y posterior eliminación del solvente por evaporación, dando lugar a una oleorresina con un contenido en licopeno entre el 2-10%. Procedimientos similares de obtención de oleorresinas ricas en carotenoides en general y licopeno en particular a
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 partir de vegetales y aceites se describen en diferentes patentes, como en la US 5245095 y la EP 580745, mediante la precipitación con sales de calcio, la US 5019668, utilizando un procedimiento de transesterificación con aceites y posterior destilación, la WO 95/16363, que describe el fraccionamiento del tomate en diferentes fracciones que incluyen una oleorresina rica en carotenoides, y la PCT WO 90/08584, que describe la extracción de licopeno mediante la utilización de fluidos en estado supercritico, aunque el extracto obtenido es una mezcla de diferentes carotenoides y los rendimientos de extracción son muy bajos debido a su baja solubilidad.
En todos estos casos, debido a la baja concentración de licopeno en estos productos naturales y la disposición intracelular de este compuesto en determinados orgánulos como cloroplastos o cromoplastos, los rendimientos de extracción y la pureza del producto obtenido son bajos, obteniéndose oleorresinas ricas en licopeno o productos crudos deshidratados junto a cantidades variables de otros compuestos, carotenoides o no. En la mayoría de los casos los procedimientos de extracción descritos requieren la preparación del fruto mediante molienda o extrusión para facilitar la extracción del disolvente y asi liberar el contenido intracelular rico en licopeno. Por último en la mayoría de los procesos descritos en estas patentes se requiere el uso de disolventes orgánicos que aparecen como trazas en la oleorresina obtenida. Asimismo en la patente IL 107999 se describe la preparación de oleorresinas muy ricas en licopeno a partir de pulpas de tomates, aunque al igual que en los casos anteriores no se obtienen cristales de licopeno de alta pureza sino concentrados lipidicos ricos en licopeno.
Por otro lado, en la patente WO 97/15554 se describe la extracción de carotenoides de origen vegetal a partir de zanahorias y tomates, entre los que se incluyen el
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 licopeno, mediante el aislamiento de cloroplastos y cromoplastos, para proceder a continuación a la digestión de dichos orgánulos con enzimas hidroliticas de proteínas como pectinas y/o proteasas que permiten la liberación del licopeno unido a diferentes proteínas estructurales. Mediante un tratamiento alcalino posterior y una extracción con mezclas alcohólicas de bajo peso molecular es posible obtener extractos de licopeno con una riqueza y pureza superior a las oleorresinas, aunque sin obtenerse cristales purificados de licopeno sino extractos crudos ricos en licopeno. Igualmente en la patente EP 608027 A2 se obtienen extractos concentrados de licopeno mediante el aislamiento de cromoplastos de tomates en los cuales se encuentra el licopeno en forma cristalina. Dichos extractos de cromo- plastos de tomate ricos en licopeno son utilizados directamente como colorantes sin extracción posterior de los cristales de licopeno, evitando el cambio de coloración del licopeno durante la extracción y obviando el uso de solventes orgánicos. De acuerdo al procedimiento descrito en esta patente no es posible obtener licopeno puro en forma cristalina apto para uso en composiciones alimenticias o farmacéuticas, sino únicamente como colorante alimentario en forma deshidratada, liofilizada o congelada.
Otra fuente importante de licopeno son determinadas microalgas ricas en carotenoides del tipo Dunaliella . Existen diferentes procedimientos de extracción de carotenoides, y en particular de licopeno, a partir de estos organismos, tal como se refleja en las patentes US 5378369, US 4713398 y US 4680314, mediante la extracción con disol- ventes orgánicos (clorocarbonados, hidrocarburos, etc.) o aceites comestibles (DE 4342798) . Un proceso diferente aparece descrito en la PCT WO 98/08584 donde la obtención de un extracto de licopeno se realiza utilizando C02 en estado supercritico, aunque el extracto asi obtenido presenta una baja pureza en licopeno.
USTITUCIÓN REGLA 26 El licopeno también puede ser obtenido a partir de determinados hongos mucorales como Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o Mucor por fermentación en medio liquido, presentando como ventaja frente a la obtención de licopeno a partir de productos vegetales o algas la elevada concentración de este compuesto, en algunos casos superior al 5% en peso respecto a la cantidad de biomasa seca, concentraciones superiores a las obtenidas de las mejores variedades vegetales, asi como la posibilidad del desarrollo biotecnológico de cepas superproductoras de estos microorganismos, ya sea mediante técnicas de mutagénesis clásica o bien mediante la aplicación de las nuevas tecnologías de biología molecular que permiten la manipulación genética de estos microorganismos, incrementando la concentración y producción de licopeno, y eliminando la producción de otros carotenoides estructuralmente relacionados.
La preparación de licopeno cristalino de elevada pureza a partir de fuentes naturales exige por lo general, como ya se ha comentado, una etapa de extracción con disolventes orgánicos o fluidos en estado supercritico y posteriormente diversas etapas de purificación adicionales como cromatografía, procesos de adsorción y elución y etapas de precipitación o cristalización, como por ejemplo se describe en las patentes US 3369974, EP 818255 y EP 242148. En la mayoría de los casos en los que no se utilizan estas etapas de purificación posterior y la cristalización se realiza directamente a partir de extracto por evaporación del disolvente hasta superar la solubilidad, la pureza del producto obtenido es muy baja y es preciso proceder posteriormente a procesos de recristalización del licopeno obtenido, con el agravante de que la baja solubilidad del producto implica el uso de una gran cantidad de disolvente para llevar a cabo la etapa de recristalización, lo que además conduce a un bajo rendimiento (NL 6411184, US 4439629) .
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 En la solicitud de patente WO 96/13178 se describe la preparación de concentrados de licopeno cristalino estabilizado en un medio liquido compatible alimentario en el cual el licopeno es insoluble, como etilenglicol, etanol o glicerol, obteniendo por molienda cristales pequeños (1-3 mieras) de licopeno en suspensión en un medio liquido. Asimismo en la solicitud de patente WO 98/43620 se describe un procedimiento de aislamiento de cristales de licopeno a partir de una oleorresina mediante saponificación de dife- rentes triglicéridos y fosfonatos a alta temperatura y posterior dilución con agua, obteniendo cristales de licopeno entre el 75 y el 95% de pureza. Un procedimiento similar ha sido descrito recientemente para la preparación de cristales de β-caroteno de elevada pureza en la PCT WO 98/03480 por lavado con agua, alcoholes de bajo peso molecular o acetona, aunque no ha sido descrita su aplicación para la obtención de cristales de licopeno de alta pureza.
Es bien conocida la inestabilidad de los carotenoides en forma cristalina, siendo un procedimiento de estabi- lización de los mismos la preparación de dispersiones oleosas. Además, se cree que los carotenoides en dispersión de aceite son absorbidos más fácilmente por el organismo. Un procedimiento alternativo para la estabilización de compuestos inestables es la microencapsulación de los mis- mos en matrices de almidón. Asi en las patentes US 2876160, US 2827452, US 4276312, US 5976575 se describe un aumento considerable en la estabilidad de diversos compuestos, entre ellos los carotenoides, mediante encapsulación de los mismos en matriz de almidón. Uno de los inconvenientes principales para la utilización de los carotenoides en el campo de los colorantes es su nula solubilidad en agua, ya que muchas de las aplicaciones de los mismos tienen lugar en medios acuosos. Este problema de solubilidad se menciona en el documento US 3998753, y se resolvió preparando disoluciones de caro
HOJA DE SUSTIT tenoides en disolventes orgánicos volátiles, tales como hidrocarburos halogenados, y emulsionándolas con una solución acuosa de lauril sulfato sódico.
La patente US 5364563 describe un procedimiento para producir una preparación de carotenoides en polvo, que implica formar una suspensión de un carotenoide en aceite de alto punto de ebullición. La suspensión se sobrecalienta con vapor de agua durante un periodo máximo de 30 segundos para formar una solución de carotenoide en aceite. A conti- nuación esta solución se emulsiona sobre una solución acuosa de un coloide y seguidamente la emulsión se seca por pulverización.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una serie de procedimientos para la obtención de producciones elevadas de licopeno con el hongo JB. trispora, asi como procedimientos para su recuperación y formulación. La invención consiste en (i) el diseño de métodos para la obtención y selección de mutantes de B . trispora superproductores de licopeno, (ii) el desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación,
(iii) el establecimiento de procesos de recuperación de licopeno a partir del micelio y (iv) la consecución de formulaciones que superen los problemas de estabilidad y solubilidad en diferentes medios, presentes en el Estado de la Técnica. B . trispora es un hongo que posee una gran importancia industrial para la producción biotecnológica de licopeno. De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el procedimiento sintético utilizado industrialmente en la actualidad.
Con la finalidad de obtener cepas superproductoras de licopeno, en primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B . trispora con los agentes mutagénicos etil metano sulfonato (EMS) y N-metil-
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26) N' -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 mi de una solución de Tritón X-100 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de filtro de nylon de 20 μm de poro. La concentración de esporas en la suspensión se ajustó a 106 esporas / mi. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 106 esporas / mi en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 106 esporas / mi en una solución que contenia 250 μg/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos. Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Tritón X-100 al 0,1% y se incubaron a 25°C durante 4 dias para obtener colonias aisladas. Las estrategias utilizadas para la selección de cepas de B . trispora (-) superproductoras de licopeno fueron las siguientes: (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. La selección de mutantes productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos consistió en colocar filtros impregnados en ácidos trispóricos sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron a partir de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B . trispora . Las colonias con los filtros se incubaron a 25°C, observándose que los mutantes productores de licopeno
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los productores de β-caroteno cuyo color era naranja. Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó el mutante LMAl (-) (Esquema 2) . La selección de mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMAl (-) (productora de β-caroteno; ver Esquema 2) y las esporas mutadas se crecieron en placas de medio sólido YEPDA. Seguidamente se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMAl (-) . De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y CMB2 (-) ) .
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 VKPM F-208 (-)
UV SN
M6 (~)
NTG SN
VKPM F-551 (-)
Acido nitroso SN
VKPM F-727 (-)
NTG SN
VKPM F-736 (-)
NTG SN
L 25 (-) VKPM F-744 (-)
Figure imgf000016_0001
CMA1 (-) CMA2 (-) CMA3 (-) CMA4 (-)
NTG NTG SN SN
CMB1 (-) LMA1 (-) CMB2 (-)
ESQUEMA 2
Filogenia de las cepas de B . trispora (-) obtenidas a partir de B . trispora VKPM F—208 (-) utilizando procedimientos de mutación y selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato.
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 La selección de mutantes superproductores de licopeno de B . trispora (+) se realizó creciendo esporas mutadas en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1%. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se habla sembrado B . trispora (-) . El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estimó en función de la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-) . De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora CPA1 (+) (Esquema 3) , la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-) . El nivel de producción de la cepa
B . trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio liquido.
El sistema de siglas empleado para la denominación de las cepas seleccionadas es el siguiente:
CM: Caroteno minus (-) .
LM: Licopeno minus (-) . CP: Caroteno plus (+) .
LP: Licopeno plus (+) .
La relación entre generaciones parentales sigue el orden del alfabeto: A es parental de B, B es parental de C, etc. El número situado tras las letras se corresponde con el número del mutante. Asi por ejemplo, la denominación CMAl(-) significa que se trata de una cepa productora de caroteno (C) , menos (M) , parental de CMB y mutante número 1. Del mismo modo, CMAl(-), CMA2 (-) , CMA3(-) y CMA4(-) se corresponden con los mutantes 1, 2, 3 y 4 de una misma generación.
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 VKPM F-117 (+)
UV SN
P202 (+)
NTG SN
VKPM F-674 (+)
UV SN
VKPM F-726 (+)
NTG SN
VKPM F-741 (+)
UV SN
VKPM F-816 (+)
EMS SN
CPA1 (+)
ESQUEMA 3 Filogenia de las cepas de B. trispora ( + ) obtenidas a partir de B . trispora VKPM F-117 (+ ) utilizando procedimientos de mutación y selección . UV ultravioleta, SN selección natural, NTG N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina, EMS etilmetanosulfonato .
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 Las cepas (+) y (-) de B . trispora seleccionadas en medio sólido se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio liquido y cultivo mixto. Para ello, se sembraron matraces de inoculo independientes con las cepas B. trispora CPAl (+) y B . trispora CMB2 (-) y posteriormente se realizó una fermentación mixta de ambas cepas en matraz. Al inicio de la fermentación (0-50 horas) se añadió un inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo imidazol en una concentración de 0.7-0.8 g/1) . Una vez concluida la fermentación (alrededor de 6 días) , el micelio de B . trispora se liso mediante agitación en vortex, se extrajo el licopeno con solventes orgánicos (por ejemplo acetona) y se determinó su concentración y pureza mediante HPLC. Los niveles de producción obtenidos fueron de 3,0 g/1. El mismo tipo de fermentación se realizó con las cepas B . trispora CPAl (+) y B. trispora LMA1 (-) , con la diferencia de que en este caso no fue necesario adicionar un inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Los niveles de producción obtenidos con estas cepas en cultivo mixto fueron de 1,2 g/1.
Las cepas CPAl (+) y CMB2 (-) se cultivaron en termentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se crecieron separadamente en matraces, se transfirieron separadamente a tanques intermedios de crecimiento y por último se fermentaron conjuntamente. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se incubó durante 100-140 horas. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPAl (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/1.
Las cepas CPAl (+) y LMA1 (-) se cultivaron en termentador pre-industrial con la finalidad de determinar
ITUCIÓN REGLA 26 el nivel de producción de licopeno sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La fermentación se realizó tal y como se ha indicado anteriormente para las cepas CPAl (+) y CMB2 (-) , pero sin adicionar imidazol. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPAl (+) y LMA1 (-) fue de 1,6 g/1.
Un mayor rendimiento en esta fase de fermentación se obtiene mediante el control de la edad de las fases vegeta- tivas de crecimiento de las cepas de B. trispora . Asi los cultivos utilizados como inóculos tienen una edad de 30-60 horas, preferentemente de 48 horas, tanto para las cepas
(+) como las (-) , pero variando el número de esporas a sembrar: 800-1.000 esporas/ml y 40.000-60.000 esporas/ml, respectivamente. La incubación se realiza a unos 25°C con un 0.1% v/v de cada inoculo se siembra en la fase de cultivo primario. La edad de dichos cultivos primarios oscila entre las 30-60 horas, preferentemente 36-48 horas, a temperaturas que oscilan entre 26-28°C. Posteriormente se mezclan en proporción 1/10 v/v las fases primarias (+)/(-) y se siembran los termentadores 10-20% v/v con la mezcla de dichas fases.
Dada la característica intracelular del componente carotenoide biosintetizado en la fermentación, el proce- dimiento de recuperación a partir del caldo de cultivo, preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica como primera etapa la separación de la biomasa del caldo. Esta separación puede hacerse por los procedimientos establecidos de filtración, empleando las tecnologías al uso de filtros, bien sean de bandas, rotatorios, prensa, etc., en los que una barrera constituida por la tela filtrante separa la biomasa y permite pasar la fase liquida sin biomasa, o de centrifugación, en la que haciendo uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa (normalmente mayor) se emplea una máquina del tipo de un
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) separador centrifugo, decanter o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la fase liquida con la menor cantidad posible de biomasa. Uno de los objetivos de esta etapa consiste en reducir pérdidas y optimizar las características de cada fase consiguiendo la mayor cantidad de biomasa con el' mayor contenido de residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentación, con la menor cantidad de materia activa.
El micelio húmedo resultante contiene más del 95% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 97% y más preferiblemente más del 99%. El contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5%, preferiblemente inferior al 3% y más preferiblemente inferior al 1%. Este micelio húmedo estarla en disposición de permitir, mediante las etapas ulteriores, la separación de licopeno. Sin embargo se ha comprobado que, relacionado con la fermentación, este micelio mantiene un porcentaje relativamente elevado de componentes lipofilicos, entre 15 y 20% (ácidos grasos y aceites) que en etapas ulteriores plantean problemas de purificación, lo que conduce a introducir, en este punto, una etapa de purificación de la biomasa. Esta etapa de purificación implica una resuspensión de la biomasa en alcohol: metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, en proporción adecuada para conseguir la máxima purificación de los componentes lipidicos. Asi, el micelio húmedo se resuspende con una cantidad de alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La temperatura de resuspensión oscila entre 0°C y la de ebullición del alcohol, preferiblemente entre 10 y 50°C. El tiempo de contacto oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica asi preparada se filtra o centrifuga, de modo que el contenido en sólidos en el filtrado o clarificado sea prácticamente nulo. El micelio húmedo resultante, que
HOJA DE SU contendrá alcohol más agua en diversa proporción, contiene más del 93% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 95% y más preferiblemente más del 97%. En la fase sobrenadante o filtrada que contiene restos de caldo y alcohol, el contenido en carotenoides es inferior al 2%, preferiblemente inferior al 1%, referido al caldo inicial. Mediante este tratamiento con alcohol se consigue eliminar una serie de sustancias lipofilicas solubles en alcohol, en cantidad variable en función de las características del caldo utilizado, efectuando una purificación previa que nos va a permitir obtener un producto final cristalino de elevada pureza. Además, al eliminar una proporción variable de agua del micelio húmedo inicial, se facilita considerablemente el posterior proceso de secado. Mezclando directamente el caldo de cosecha con el alcohol y manteniendo un tiempo mínimo de contacto se consigue un efecto de purificación equivalente al descrito anteriormente, con lo que se simplifica el proceso al eliminar una operación de separación sólido liquido. La proporción caldo/alcohol puede oscilar entre 1/0,5 hasta 1/5, preferiblemente entre 1/1 y 1/3. La temperatura de la mezcla oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición de la mezcla, preferiblemente entre la temperatura ambiente y 60°C.
El micelio deshidratado/purificado se seca. El secado puede hacerse por los procedimientos habituales en batch o en continuo. La temperatura de secado oscila entre la temperatura ambiente y 150 °C, preferiblemente no debe sobrepasar los 60°C y más preferiblemente estar por debajo de 50 °C. El tiempo de secado es función de la temperatura empleada, oscilando entre 1 hora y 72 horas. Debido a la posible descomposición de estos carotenoides por oxidación con el oxigeno atmosférico, es conveniente efectuar esta operación de secado en ausencia de oxigeno, bien bajo
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 atmósfera de nitrógeno o al menos a vacio. El hecho de que el producto carotenoide sea intracelular implica un acondicionamiento de la biomasa purificada, bien mediante secado más molienda, secado más disgregación o disgregación de la biomasa, que favorezca la mezcla con disolventes y facilite la extracción a estos. Para conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a extractar es necesaria una operación de ruptura previa del micelio, de modo que la superficie de contacto sea máxima. El tamaño de partícula óptimo del micelio seco y roto debe ser inferior a 3 mm, preferiblemente inferior de 1 mm y más preferiblemente inferior a 0,5 mm.
La molienda puede hacerse sobre el producto seco, mediante sistemas mecánicos con partes giratorias o fijas: mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilindros giratorios presionando uno sobre el otro (compactación o extrusión) . También es posible efectuar el secado y molienda en una única etapa mediante un sistema de secado tipo flash (instantáneo) en un equipo jet mili (molino de chorro) donde el producto húmedo se alimenta a una corriente de un gas en recirculación y a temperatura elevada, de manera que el tiempo de residencia sea el minimo para conseguir vaporizar el contenido de componentes líquidos, y el producto sea transportado, al variar las densidades, hasta un ciclón donde se recupera. Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lugar asimismo un efecto de homogeneización al chocar las partículas con las paredes .
Para la extracción del licopeno a partir de un micelio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear diversos disolventes orgánicos. Esta invención se referirá al uso de disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los esteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, que conjugan la solubilidad razonablemente
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel nacional como comunitario, en los ámbitos tanto farmacéu- tico como alimentario (RDL12/04/90 y RDL16/10/96) El contenido de disolventes residuales debe ser, según el ICH, inferior a 5000 pp , preferentemente inferior a 1000 ppm y más preferentemente inferior a 100 ppm, siempre referido a la materia seca de la mezcla liquida. La temperatura de extracción oscila entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 50°C y 80°C. El tiempo de extracción será el minimo necesario para conseguir la solubilización, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre 1 minuto y 15 minutos. La cantidad de disolvente empleada depende de la temperatura y de la riqueza del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 30 ml/g de biomasa. El número de extracciones varia desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides extractados es superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y más preferiblemente superior al 95%.
Una vez obtenido el extracto rico en carotenoides es necesario concentrarlo hasta un determinado volumen. La concentración final de carotenoides en el disolvente tras concentrar oscila preferentemente entre 10 y 50 g/1. La temperatura de concentración debe ser inferior a 80°C, preferiblemente inferior a 70°C y más preferiblemente inferior a 50°C. Una vez concentrado el extracto al volumen requerido se hace necesario adicionar un insolubilizante de los carotenoides, concretamente un alcohol y más concre- tamente metanol, etanol, propanol, isopropanol o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, con lo cual el rendimiento en licopeno cristalino aumenta considerablemente. La adición del alcohol ejerce también un efecto purificante. El tiempo de cristalización oscila entre 15 in y 24 horas, preferiblemente entre 1 h y
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 12 h y más preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización debe ser inferior a 25°C, preferiblemente inferior a 5°C.
La separación de los cristales de las aguas de cristalización se puede efectuar por filtración o centrifugación, desplazando las aguas de cristalización que bañan los cristales mediante un lavado con el mismo alcohol empleado para insolubilizar . Los cristales obtenidos se secan a vacio y temperatura ambiente durante al menos 1 h hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones establecidas por la legislación anteriormente mencionada y que, en el caso del licopeno, se establece una pérdida por secado inferior al 0,5%.
La pureza de los cristales obtenidos corresponde a un titulo superior a 95%, determinado por espectrofotometria mediante lectura de la absorción a 472 nm de una disolución de los cristales en n-hexano (El% lcm = 3450) , con un contenido en otros carotenoides inferior al 3%. El contenido en cis licopeno es inferior al 3%. El método de esta invención es especialmente aplicable para la recuperación de licopeno cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, más preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y más preferiblemente B . trispora . La extrema pureza conseguida en los cristales obtenidos por la presente metodología y el empleo de disolventes considerados como naturales hace que estos cristales sean aplicables en la industria alimentaria, farmacéutica o de cosméticos.
El producto cristalino obtenido mediante la metodo- logia descrita en esta invención se puede envasar en recipientes opacos que impidan la fotodegradación del producto, en ausencia de oxigeno (atmósfera inerte o vacio) para evitar la oxidación y a temperaturas entre 0 y 5°C. El producto adecuadamente envasado puede manejarse y comercia-
HOJA DE SUSTITUCIÓN lizarse como tal. No obstante es conveniente incrementar la estabilidad del mismo mediante etapas ulteriores de formulación o acabado, que implican adición de antioxidantes que permiten obtener un producto acabado con una estabilidad superior a 6 meses en condiciones adecuadas de envasado.
Objeto fundamental también de esta invención es un procedimiento de preparación de licopeno que incluye su formulación en diferentes presentaciones en función de las características de la aplicación para la cual se desee emplear el licopeno. Una primera aplicación, denominada suspensión microcristalina de licopeno en aceite vegetal, consiste en la premezcla del licopeno cristalino anterior con una cantidad variable de aceite vegetal. El tipo de aceite vegetal puede ser muy variado, siendo los más habituales, aunque no los únicos, aceites de girasol, de oliva, de maíz, de soja, de algodón, etc. La dosificación del licopeno será función de la riqueza final que se desee alcanzar, siendo los valores más habituales suspensiones con un contenido en licopeno entre el 5 y el 60%, preferiblemente entre el 10 y el 30%. Para incrementar la estabilidad de la mezcla se adicionan antioxidantes liposolubles al uso, como los tocoferoles naturales, y preferentemente el D,L-alfa-tocoferol . La proporción de este compuesto oscila entre el 0,2 y el 15% respecto al peso del licopeno, preferiblemente entre el 0,5 y el 5%. Para que las formulaciones que contienen licopeno presenten una actividad fisiológica satisfactoria es necesario reducir el tamaño del cristal de licopeno. Esto se consigue con los sistemas habituales de molienda aplicables a mez- cías liquidas. Objeto preferente de esta invención son los molinos de bolas que permiten una reducción del tamaño del cristal por debajo de 10 mieras, preferiblemente por debajo de 5 mieras, y aún preferiblemente por debajo de 2 mieras, empleando microesferas de diámetro comprendido 0,5 y 0,75 mm. No obstante el tamaño de cristal puede variar en fun-
HOJA DE SUSTIT ción de la aplicación particular de la suspensión, empleando en cada caso las esferas y las condiciones de molienda adecuadas. Este tamaño de cristal también condicionará las propiedades reológicas de la mezcla, en especial la viscosidad de la misma, que también se podrá adaptar en función de los requerimientos. Estas suspensiones micro- cristalinas de licopeno en aceite son adecuadas para aplicaciones del licopeno en entornos lipofilicos: margarinas, mantequillas, cremas, etc. Una segunda aplicación, denominada formulación de licopeno dispersable en agua fría (CWD) , se basa en la disolución del licopeno en un disolvente orgánico y su posterior microencapsulación en almidones modificados. Los disolventes más adecuados para efectuar esta disolución, por presentar esta molécula una elevada solubilidad, son cloroformo, benceno, tolueno, etc. Especialmente adecuado es el cloruro de metileno. No obstante debido al carácter halogenado de este último se pueden utilizar disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales como los esteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, etc. que conjugan la solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase III de ICH. La concentración de licopeno en el disolvente orgánico puede oscilar ente 1 y 50 g/1, preferiblemente entre 10 y 30 g/1. La temperatura de disolución puede oscilar entre la temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 20 y 130°C. El hecho de que el porcentaje de cis licopeno sea función de la relación temperatura/tiempo en la operación de disolución del licopeno en el disolvente orgánico implica que si se pretende obtener un producto con un bajo contenido en este isómero, o bien se emplea una temperatura de disolución baja o en caso contrario un tiempo de disolución muy corto. Asi, para conseguir bajos niveles de
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 cis, si el disolvente empleado es cloruro de metileno, la disolución se puede efectuar a 20-35°C durante un tiempo comprendido entre 1 y 15 minutos. Por el contrario si el disolvente es acetato de isobutilo la disolución se efec- tuará preferentemente entre 70 y 130°C durante unos segundos. Por el contrario, si los niveles de isómero cis no son relevantes la disolución se puede llevar a cabo sin restricción en las condiciones de la misma más que la consecución de la solubilidad total a nivel molecular del lico- peno en el disolvente empleado. Para incrementar la estabilidad de la formulación final se disuelve conjuntamente con el licopeno en el disolvente orgánico uno o una mezcla de varios antioxidantes, preferiblemente de tipo tocoferol, palmitato de ascorbilo, etc., cada uno de ellos en pro- porción entre 1 y el 30%, preferiblemente entre el 10 y el 20%, respecto al peso del licopeno. También es posible incorporar en la mezcla aceite vegetal, bien de girasol, oliva, maiz, soja, algodón, etc. con objeto de favorecer la disolución del licopeno, y aportar una estabilidad adicio- nal a la preparación. La relación licopeno/aceite puede oscilar entre 10/1 y 1/10.
La disolución de licopeno asi obtenida se mezcla y emulsiona con una disolución acuosa que contiene un agente emulsionante, como por ejemplo almidón modificado, más con- cretamente esteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato derivados de almidón de diversos pesos moleculares, siendo de especial interés, aunque no exclusi- vamente, el Puπty Gum 2000 de National Starch o el
Cleargum CO 01 de Roquette, y un agente microencapsulante, formado por ejemplo por almidón modificado, más concretamente esteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato derivados de almidón de diversos pesos moleculares, siendo de especial interés, aunque no exclusi- vamente, el Hi Cap 100® o el Capsul® de National Starch. La
HOJA DE SUSTIT proporción en la que se mezclan el agente emulsionante y el agente microencapsulante puede oscilar entre 5/95 y 95/5, preferiblemente entre 25/75 y 75/25, más preferiblemente entre 40/60 y 60/40. La concentración en agua de cada uno de los componentes de la mezcla de agente emulsionante y agente microencapsulante es variable, pudiendo ser entre el 1 y el 30%, preferentemente entre el 5 y el 20%, y más preferentemente del 10%. La mezcla de fases acuosa y orgánica se emulsiona y la emulsión obtenida se homogeneiza empleando sistemas de homogenización por diferencial de presión tipo Mantón Gaulin o Microfluidizer, habituales al uso, y preferiblemente mediante homogenización por fricción tangencial, como por ejemplo con un emulsionador tipo Ultraturrax durante un tiempo variable en función de la energía proporcionada por el equipo y el volumen de mezcla a emulsionar, con objeto de obtener un tamaño medio de micela inferior a 10 mieras, preferiblemente inferior a 2 mieras y más preferiblemente entre 0,1 y 1 miera.
Una vez formada la emulsión se efectúa la evaporación del disolvente orgánico, preferentemente por destilación a vacio a temperatura inferior a 50°C. A medida que tiene lugar la evaporación del disolvente se produce la micro- cristalización del licopeno en la matriz de almidones. Una vez evaporado el disolvente se continúa la evaporación, con adiciones sucesivas de agua hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones de concentración máxima establecidas por la legislación y un residuo seco idóneo para el tipo de secado que se vaya a aplicar a esta mezcla liquida. Valores adecuados de materia seca de la suspensión de licopeno microencapsulado están comprendidos entre el 1 y el 30%, preferentemente entre el 10 y el 20%.
De acuerdo con la presente invención se encuentra que para secar la suspensión acuosa de licopeno obtenida son adecuados tanto el método de secado por pulverización a
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) alta temperatura (atomización) como el método de pulverización sobre lecho fluidizado (granulación) . Otra alternativa seria el secado por liofilización. De acuerdo con el método de secado por atomización, temperaturas adecuadas de entrada del aire de secado estarían comprendidas entre 100 y 200°C mientras que las de salida entre 60 y 120°C. El producto atomizado tiene un tamaño de partícula comprendido entre ente 10 y 100 mieras. Con objeto de aumentar el tamaño de partícula y con ello disminuir la superficie disponible, y de esta forma aumentar la estabilidad del producto frente a la oxidación, el producto atomizado puede ser aglomerado mediante pulverización de una disolución de uno de los almidones modificados utilizados en la formulación, o la propia suspensión de licopeno microencap- sulado en el seno de un lecho fluidizado del propio producto atomizado, permitiendo alcanzar tamaños de partícula que oscilan entre 50 y 500 mieras, preferiblemente entre 200 y 300 mieras.
El método de granulación implica el uso de un granulador de lecho fluidizado en el que se pone material de siembra, que puede ser material inerte tipleo, tal como partículas de azúcar," o - polvo fino del mismo material a secar obtenido en procedimientos de granulación previos o en un procedimiento de secado por pulverización. Las partículas se mantienen en movimiento por medio de aire, y la temperatura del lecho se mantiene entre 30 y 90°C, preferiblemente entre 50 y 80°C. La suspensión de licopeno microencapsulado se pulveriza mediante aire precalentado a una temperatura entre 20 y 140°C en el seno del lecho fluido, a una velocidad que asegure que las partículas que se van a revestir no se mojan demasiado ni se aglomeran. El producto granulado tiene un tamaño de partícula comprendido entre 100 y 2000 mieras, preferiblemente entre 100 y 800 mieras y aún preferiblemente entre 100 y 300 mieras. Una vez terminada la pulverización por uno u otro método las
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGL partículas se pueden revestir. Este revestimiento se puede efectuar con aproximadamente 0,5-10% en peso seco de soluciones acuosas de diversos azúcares o incluso de alguno o una mezcla de los almidones que constituyen la fórmula objeto de la presente invención.
DEPOSITO DE MICROORGANISMOS DE ACUERDO CON EL TRATADO DE BUDAPEST .
Las cepas de Blakeslea trispora han sido depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) , GNU Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscú 113545, (Rusia), con los siguientes números y fechas: VKPM F-117 el 21-12- 1979, VKPM F-208 el 20-12-1979, VKPM F-551 el 19-11-1992, VKPM F-674 el 19-11-1992, VKPM F-726 el 21-01-1997, VKPM F- 727 el 21-01-1997, VKPM F-736 el 07-10-1997, VKPM F-741 el 28-01-1998, VKPM F-744 el 28-01-1998 y VKPM F-816 el 13-12- 2000. Los siguientes ejemplos describen en detalle y sin limitación la presente invención.
EJEMPLO 1
Estrategias de mutación de las cepas (+) y (-) de B. trispora.
En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B . trispora, para lo cual se analizaron: (i) diferentes tipos de agentes mutagé- nicos, (ii) concentración del mutágeno, (iii) concentra- ción de esporas, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N' -nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) .
Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de slants con medio YpSs, cuya composición es la
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) siguiente: extracto de levadura 4 g/1, almidón soluble 15 g/1, K2HP04 1 g/1, MgS04-7H20 0,5 g/1 y agar 15 g/1, a un pH final de 5,8. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10 mi de una solución de Tritón X-100 al 0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de nylon de 20 μm de poro. La concentración de esporas en la suspensión fue alrededor de 106 esporas/ml .
El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de 106 esporas/ml en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos.
El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de 10δ esporas/ml en una solución que contenia
250 μg/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15°C durante 2 minutos.
Con las esporas mutadas se sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Tritón X100 al 0,1%. La composición por litro del medio Sutter IV es la siguiente: 40 g de glucosa, 4 g de L-asparragina, 10 g de KH2P0 , 40 mi de solución de microelementos 50x, y 30 g de Agar. La solución de microelementos 50x está compuesta por: 25 g/1 de MgS04.7H20, 1,82 g/1 de CaCl2.2H20, 0,05 g/1 de tiamina, 0,1 g/1 de ácido cítrico, 0,075 g/1 de Fe(N03)3.9H20, 0,05 g/1 de ZnS04.7H20, 0,17 g/1 de MnSO4.H20, 0,025g/l de CuS04.5H20 y 0,025 g/1 de NaMo0.2H20. Las placas sembradas se incubaron a 25°C durante 4 dias para obtener colonias aisladas. EJEMPLO 2
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 Estrategias de selección de mutantes de B. trispora. (-) superproductores de licopeno
En este ejemplo se describen estrategias de selección de cepas de B . trispora (-) superproductoras de licopeno basadas en (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la intensidad de color de la colonia. En la Figura 1 se muestra la filogenia de las cepas de B. trispora (-) utilizadas en la presente invención.
La selección de mutantes productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos se realizó colocando filtros estériles de unos 0,6 mm de diámetro, impregnados en ácidos trispóricos, sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron mediante la extracción del sobrenadante de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B . trispora con un volumen de cloroformo después de acidificar la muestra a pH 2. La fracción orgánica se extrajo con un volumen de una solución de bicarbonato sódico al 4% y se recogió la fase acuosa, la cual se acidificó para extraerla nuevamente con cloroformo. Posteriormente el cloroformo se evaporó hasta sequedad y el residuo enriquecido en ácidos trispóricos se disolvió en etanol. Los ácidos trispóricos se cuantificaron midiendo la absorbancia a 325 nm y asumiendo un coeficiente de absortividad de 70 mi x mg-1 x cm-1 (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114:1074- 1082) .
Los filtros estériles se incubaron en una solución de 1,2 mg/ml de ácidos trispóricos en etanol y seguidamente se dejaron secar a temperatura ambiente en condiciones estériles. Posteriormente, los filtros se colocaron sobre las colonias mutantes previamente crecidas durante 4 dias a 25°C. Las placas se incubaron a 25°C durante 3 dias adicionales, observándose que los mutantes productores de
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGL licopeno adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los productores de β-caroteno cuyo color era naranja.
Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó el mutante LMA1 (-) (Figura 1) , el cual podría presentar alguna mutación en el gen caRP, el cual codifica para la actividad enzimática licopeno ciclasa y, por tanto, en lugar de producir β-caroteno, acumularla el intermediario licopeno durante el proceso de fermentación de carotenoides. Por lo tanto, la cepa LMA1 es capaz de producir licopeno sin necesidad de adicionar inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (Ejemplo 5) .
La selección de mutantes productores de licopeno en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMAl (productora de β-caroteno; ver Figura 1) tal y como se indica en el ejemplo 1. Las esporas mutadas se sembraron en placas de medio sólido YEPDA (bacto-peptona 20 g/1, extracto de levadura 10 g/1, glucosa 20 g/1 y agar 20 g/1, a un pH final de 6,0), se incubaron a 25°C durante 24 horas y seguidamente a 20°C durante 48-72 horas. Por último, se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color amarillo-naranja más intenso que la cepa parental CMAl (-) . De esta forma se aislaron 2 colonias con color amarillo-naranja intenso (denominadas CMBl (-) y CMB2 (-) ) . Las cepas CMBl y CMB2 podrían ser superproductoras de licopeno en fermentaciones mixtas con adición de inhibidores específicos de la actividad licopeno ciclasa (por ejemplo, imidazol; ejemplo 4) .
EJEMPLO 3
Estrategias de selección de mutantes de B. trispora (+) superproductores de licopeno
La selección de mutantes superproductores de licopeno de B . trispora (+) se realizó a partir de esporas mutadas tal y como se indica en el ejemplo 1. Dichas esporas se
HOJ sembraron en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con imidazol al 0,1% y se incubaron a 25°C durante 7 dias para obtener colonias aisladas. Seguidamente, una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que previamente se habla sembrado B . trispora (-) . La distancia entre los puntos de siembra de las cepas (+) y (-) debe ser de aproximadamente 2 cm. El nivel de producción de licopeno en medio sólido se estima por la intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-) . De esta forma se seleccionó la cepa B . trispora CPAl (+) , la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-) . El nivel de producción de la cepa B . trispora CPAl (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en medio liquido tal y como se describe en los ejemplos 4 y 5. En el Esquema 3 se muestra la filogenia de las cepas de B . trispora (+) utilizadas en la presente invención.
EJEMPLO 4
Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante el cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa Las cepas (+) y (-) de B . trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio liquido y cultivo mixto. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2P04, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y pH ajustado a 6,3. La cepa B . trispora CPAl (+) se sembró en matraces de 500 mi con 67 mi de medio a razón de 103 esporas por mi. La cepa 23. trispora CMB2 (-) se sembró en matraces de 500 mi con 100 mi de medio a razón de
HOJA DE SUSTIT 104 esporas por mi. Ambos tipos de inóculos se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44 horas.
Una vez finalizada la incubación, se mezclaron los inóculos de las cepas (+) y (-) en una relación 1/10 (v/v) , y con la mezcla se inocularon matraces de 250 mi con 20 mi de medio de fermentación a razón de 4 mi de la mezcla de cepas por matraz. Estos matraces se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 5-6 dias. El medio de fermentación utilizado posee la siguiente composición por litro: 44 g de harina de soja, 19 g de harina de maíz, 5,5 g de KH2P0 , 0,002 g de clorhidrato de tiamina, 100 mi de aceite vegetal y pH ajustado a 7,5. El medio se repartió en matraces de 250 mi, los cuales se inocularon con el 20% de una mezcla de las cepas (+) y (-) de B . trispora . Entre las 0 y las 36 horas de fermentación se añadió un inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo, 0,75 mg/ml de imidazol) . Los matraces se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 6 dias. Una vez concluida la fermentación, se preparó una mezcla de caldo de fermentación, perlas de vidrio y cloruro de metileno/metanol (1/1) . El micelio de B . trispora se liso mediante agitación en vortex, liberando el licopeno intracelular. El licopeno extraído con la mezcla de cloruro de metileno: metanol (proporción 1:1) fue diluido en acetona. La concentración y pureza del licopeno se determinó mediante el uso de cromatografía liquida HPLC en fase reversa.
El nivel de producción obtenido en fermentaciones mixtas de las cepas B. trispora CPAl (+) y B. trispora CMB2 (-) fue de 3 g/1 de licopeno en presencia de imidazol (figura 1) .
EJEMPLO 5
Procedimiento de producción de licopeno en matraz mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPAl (+) y B.
HOJA DE SU trispora LMAl (-) sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas de B . trispora LMAl (-) y CPAl (+) seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio liquido y cultivo mixto. Para ello, se prepararon inóculos de las cepas (+) y (-) y se realizó la fermentación en matraz tal y como se indica en el ejemplo 4. La diferencia es que en este caso no se adicionó el compuesto químico inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Una vez concluida la fermentación se realizó la valoración del licopeno producido tal y como se describe en el ejemplo 4.
Los niveles de producción obtenidos mediante fermen- tación mixta de las cepas B . trispora CPAl (+) y B . trispora LMAl (-) fueron de 1,2 g/1 de licopeno en ausencia de imidazol (figura 2) .
EJEMPLO 6 Procedimiento de producción de licopeno en fenríentador pre- industrial mediante cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de B. trispora adicionando inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas CPAl (+) y CMB2 (-) de B . trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en termentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maiz, 0,5 g de KH2P04, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. Las cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 mi con 500 mi de medio y se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44-48 horas.
HOJ Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de KH2P04; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una proporción 1/10 y con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de KH2P04, 3,36 g de Na2HP04, 0,184 g de NaH2P04, 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas a una temperatura de 25-28°C con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó imidazol estéril a una concentración final del 0,75 g/1.
La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPAl (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/1 (figura 2) .
EJEMPLO 7
Procedimiento de producción de licopeno en fermentador pre- industrial mediante cultivo mixto de las cepas B. trispora CPAl (+) y B. trispora LMAl (-) sin adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa
Las cepas CPAl (+) y LMAl (-) de B . trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2 y 3 se cultivaron en fermentador pre-industrial con la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno sin adi- ción de inhibidores de la actividad enzimática licopeno
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGL ciclasa. Para ello, se preparó un medio de inoculo con la siguiente composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maiz, 0,5 g de KH2P04, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado a 6,3. La cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces de 2000 mi con 500 mi de medio y se incubaron a 25°C y 250 rpm durante 44-48 horas .
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya com- posición por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maiz, 0,5 g de KH2P04; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante 36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una proporción 1/10 y, con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g de harina de soja, 19,25 g harina de maiz, 0,55 g de KH2P04, 3,36 g de Na2HP04, 0,184 g de NaH2P04, 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a 7,5. La fermentación se incubó durante 100-140 horas a una temperatura de 25-28 °C con agitación variable entre 150 y 250 "rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. - - - -
La valoración de la concentración y pureza del licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno obtenido sin adición de imidazol en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas CPAl (+) y LMAl (-) fue de 1,6 g/1 (figura 2).
EJEMPLO 8
Procedimiento de recuperación de licopeno por resuspensión de la biomasa en alcohol
Se cosecharon 3 litros de caldo fermentación correspondiente a un proceso de biosintesis en el cual la ruta biosintética estaba interrumpida a nivel de licopeno. El
HOJA DE SU titulo del caldo fue de 3 g de licopeno por litro. La biomasa de este caldo se recuperó mediante filtración por buchner (filtro-embudo de porcelana que soporta un disco de papel o cartulina que ejerce de lámina filtrante) , obte- niendo 750 g de biomasa húmeda. La biomasa húmeda se resuspendió en 5,2 1 de isopropanol aceótropo 85/15 y se agitó durante 30 minutos a 45+5°C. La biomasa purificada se volvió a recuperar mediante buchner. Esta biomasa se secó en estufa bajo vacio a temperatura inferior a 45±5° C y en un tiempo de 18 horas, hasta que el contenido en disolventes residuales/agua fue inferior al 8%. Se obtuvieron 150 g de biomasa seca y purificada con un contenido de licopeno equivalente a una riqueza del 5,5%. La biomasa seca se molió en molino de martillos y tamiz de 1 mm obte- niéndose un sólido con la misma riqueza especifica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 150 g de biomasa molida con 2500 mi de acetato de isobutilo a 70±5° C, manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno filtrando por placa filtrante. La biomasa agotada se lavó con 300 mi de acetato de isobutilo caliente sobre el propio filtro, mezclando el disolvente de lavado con el filtrado. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se con- centró bajo vacio y manteniéndose la temperatura por debajo de 45±5°C hasta reducir el volumen a 300 mi, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización y obtener un licopeno más puro, se añadieron 900 mi de isopropanol. La mezcla se mantuvo en agitación entre 0-5°C y bajo nitrógeno durante 3 horas. Se filtró por buchner, lavando los cristales con 25 mi de isopropanol sobre el buchner. Se recogieron los cristales y se secaron a vacio, obteniéndose 6,5 g de cristales de licopeno con una pureza espectrofotométrica del 95%. Por HPLC no se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 detectó la presencia de otros carotenoides ni de cis licopeno.
EJEMPLO 9 Procedimiento de formulación de licopeno en suspensión oleosa
En un molino de bolas de laboratorio tipo Minizeta 003 de Netzsch se cargaron, por este orden, microesferas de 0,5-0,75 mm de diámetro, 23,5 g de aceite de girasol (Koipe) , 0,065 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck) y los 6,5 g de licopeno cristalino obtenidos según se describe en el ejemplo 8. La mezcla se molió a 3000 rpm durante 5 minutos, obteniendo 25 g un liquido viscoso de color rojo púrpura intenso. El análisis epectrofotométrico de la suspensión oleosa puso de manifiesto un contenido en licopeno del 21%. Por HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis de licopeno. El tamaño del cristal fue inferior a 10 mieras.
EJEMPLO 10
Procedimiento de recuperación de licopeno por tratamiento directo con alcohol del caldo de fermentación
Se mezclaron directamente 1500 1 de caldo de fermentación de licopeno (potencia en licopeno 2,3 g/1) con 4500 litros de aceótropo isopropanol/agua 85/15. Después de mantener en agitación durante 30 min a 45±5°C se procedió a separar la biomasa del liquido empleando un decanter centrifugo. Se recogieron del orden de 250 Kg de biomasa húmeda purificada. Esta biomasa empapada de agua e isopropanol se secó en secadero rotativo bajo vacio hasta un contenido en disolventes residuales/agua inferior al 8%. La temperatura de secado fue 45±5°C, y el tiempo medio de residencia en el secadero de 14 horas. Se obtuvieron 85 Kg de biomasa seca
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 con un contenido en licopeno equivalente a una riqueza especifica del 3,75%.
La biomasa seca se extrusionó en un compactador Hutt- Compacktor de BEPEX, obteniendo un sólido con la misma riqueza especifica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 85 Kg de sólido molido con 1650 1 de acetato de isobutilo. La mezcla se calentó en linea a 60+5°C durante un tiempo medio aproxi- mado de contacto de 2 minutos y se separó la biomasa agotada del disolvente rico en licopeno mediante un decanter centrifugo. El total de acetato de isobutilo rico en licopeno se concentró bajo vacio y manteniendo la temperatura por debajo de 45+5°C hasta reducir el volumen a 100 1, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización del licopeno se añadieron 300 1 de isopropanol. Se mantuvo la mezcla en agitación durante 3 h a 0-5°C. Se filtró por un Buchner, recogiendo los cristales de licopeno, que se secaron a vacio y temperatura ambiente. Se obtuvieron 2 Kg de producto con una pureza de 96% por espectrometría-- Por HPLC- no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis.
EJEMPLO 11 Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 mi de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck) . La mezcla se calentó a ebullición (114°C) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se disolvieron 12 g de Hi-Cap 100 (National
Starch) y 12 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 mi de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,2 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacio, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 410 mi de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 mi de agua. Se obtuvieron 203 g de formulación liquida (12,75% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,25% (9,8% referido a masa seca) . Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 23,3%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación liquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190°C y a la salida de 90°C, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,4% y una humedad del 6,5%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 23%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
EJEMPLO 12
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando acetato de isobutilo como disolvente
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 mi de acetato de isobutilo y se adicionaron 0,35 g de D,L-alfa-tocoferol (Merck), 0,7 g de palmitato de ascorbilo (Merck) y 3,5 g de aceite de girasol (Koipe) . La mezcla se calentó a ebullición (114°C) durante 5 minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se disolvie- ron 10 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 10 g de Purity
Gum 2000® (National Starch) en 325 mi de agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,4 mieras, medido con un analizador Coulter
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacio, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 410 mi de acetato de isobutilo con aproximadamente 700 mi de agua. Se obtuvieron 195 g de formulación liquida (13,25% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,3% (9,8% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 25%, no detectándose la presencia de otros carotenoides . Esta formulación liquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190°C y a la salida de 90°C, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,5% y una humedad del 6,0%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 24,5%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
EJEMPLO 13
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente 7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 mi de diclorometano, adicionando 0,75 g de D,L-alfa-Tocoferol
(Merck), calentando la mezcla a 35°C durante 5 minutos. Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 mi de agua destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 15 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,4 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacio, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 500 mi de diclorometano con aproximadamente 600 mi de agua. Se obtuvieron 400 g de formulación liquida (13,1% de materia seca) con un conte- nido en licopeno del 1,5% (11,5% referido a masa seca). Por
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,5%, no detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación liquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190°C y a la salida de 90°C, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,6% y con una humedad del 5,3%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 6,4%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
EJEMPLO 14
Procedimiento de formulación de licopeno dispersable en agua utilizando diclorometano como disolvente
7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 mi de diclorometano, adicionando 0,75 g de D,L-alfa-Tocoferol
(Merck) , calentando la mezcla a 35°C durante 5 minutos Al mismo tiempo se disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National
Starch) y 27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 mi de agua destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 60 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,23 mieras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un sistema de destila- ción bajo vacio, adicionando 600 mi de agua, con lo que se evaporaron los 500 mi de diclorometano con aproximadamente 650 mi de agua. Se obtuvieron 350 g de formulación liquida (14,4% de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,6% (11,4% referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 20%, no detectándose la presencia de otros carotenoides . Esta formulación liquida se liofilizó en un equipo de laboratorio durante 24 horas, obteniendo un polvo esponjoso de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,7% y con una humedad del 7,4%.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 15%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
Descripción detallada de las figuras
Figura 1. Producción de licopeno mediante fermentación mixta en matraz de la cepa B. trispora CPAl (+) con cada una de las siguientes cepas de B . trispora (-) : L25, CMAl, CMA2, CMA3, CMA4, CMB1, CMB2 y LMAl. Salvo en la fermentación mixta CPAl (+) / LMA1 (-) , en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas : % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F-744) .
Figura 2. Producción de licopeno mediante fermentación mixta en fermentador de la cepa B . trispora CPAl (+) con cada una de las siguientes cepas de B . trispora (-) : L25, CMAl, CMA2, CMA3, CMBl, CMB2 y LMAl. Salvo en la fermentación mixta CPAl (+) / LMAl (-) , en el resto se adicionó imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de ordenadas : % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM F-744) .
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la obtención de licopeno a partir de fuentes biosintéticas, caracterizado por comprender secuencialmente las siguient s etapas:
a. Realizar opcionalmente una fermentación mixta de cepas de Blakeslea trispora (+) y (-) en condiciones apropiadas para producir licopeno. b. Tratamiento con alcohol directamente de la fuente natural de biosintesis, particularmente del caldo de fermentación y separación de una biomasa húmeda purificada. c. Acondicionamiento de la biomasa húmeda purificada mediante secado más disgregación o ruptura de la misma. d. Extracción sólido-liquido del licopeno contenido en la biomasa purificada con un disolvente orgánico. e. Concentración del extracto de licopeno enriquecido. f. Precipitación/cristalización del licopeno a partir del extracto concentrado por adición de alcohol. g. Filtración y secado. h. Formulación.
2. Procedimiento para la obtención de licopeno según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente natural de biosintesis no es un caldo de fermentación, sino un tejido vegetal que contenga licopeno que se somete, una vez homogeneizado, directamente a la etapa b.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque se obtiene un producto cristalino, cuyo contenido en licopeno, establecido por absorción espectrofotométrica de los cristales en n-hexano a 472 nm, (El% lcm=3450) es superior al '95%, siendo el
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 contenido en otros carotenoides inferior al 3% y en cis licopeno también inferior al 3%.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa opcional a. junto con las cepas (+) se utilizan cepas de Blakeslea trispora (-) , mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, preferentemente las descritas en el esquema 2.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa opcional a. junto con las cepas (-) se utilizan cepas de Blakeslea trispora (+) , mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, preferentemente las descritas en el esquema 3.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa opcional a. utiliza cultivos mixtos de cepas de Blakeslea trispora (-) y (+) o mutantes o transformantes derivados de las mismas, que produzcan licopeno, en ausencia de compuestos inhibidores de la actividad licopeno ciclasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracteri- zado porque la etapa opcional a. utiliza cultivos mixtos de cepas de Blakeslea trispora (-) y (+) o mutantes o transformantes derivados de las' mismas, que produzcan" licopeno, en presencia de compuestos inhibidores de la actividad licopeno ciclasa.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por adicionar imidazol durante el proceso de fermentación, como compuesto inhibidor de la actividad licopeno ciclasa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracteri- zado porque el imidazol se adiciona entre las 0 y 50 horas de fermentación, preferentemente entre las 25 y 35 horas.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque la concentración de imidazol se mantiene entre 0,7 y 0,8 g/1, preferentemente 0,75 g/1.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
11. Procedimiento según las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por producir al menos 3,4 g/1 de licopeno a los 5-6 dias, en fermentador pre-industrial o piloto.
12. Procedimiento según la reivindicación 6, caracte- rizado por producir al menos 1,6 g/1 de licopeno a los 5-6 dias, en fermentador pre-industrial o piloto.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, caracterizado por controlar la edad de las fases vegetativas de crecimiento de las cepas de B . trispora .
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la edad de los cultivos utilizados como inoculo se encuentra entre las 30 y 60 horas, preferentemente 48 horas.
15. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la edad de los cultivos vegetativos primarios se encuentra entre las 30 y 60 horas, preferentemente entre las 36 y 48 horas.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindi- caciones 13 a 15, caracterizado por: i) Sembrar inóculos de la cepa (+) de B . trispora en un rango de 800-1.000 esporas/ml. ii) Sembrar inóculos de las cepa (-) de B . trispora en un rango de 10.000-60.000 esporas/ml. iii) Cultivar los inóculos de las cepas (+) y (-) de B . trispora durante al menos 48 horas a
25°C. iv) Sembrar fases de cultivo primario de la cepa (+) de B . trispora con al menos un 0,1% (v/v) de la fase de inoculo, v) Sembrar fases de cultivo primario de la cepa (-) de B . trispora con al menos un 0,1% (v/v) de la fase de inoculo.
HOJA DE SUSTITUCIÓN vi) Cultivar las fases primarias de la cepa (+) de B . trispora durante 36-48 horas a 26°C. vii) Cultivar las fases primarias de la cepa (-) de B. trispora durante 36-48 horas a 28 °C. viii) Mezclar las fases primarias de las cepas (+) y (-) de B . trispora en una proporción 1 (+) / 10 (-) (v/v) . ix) Sembrar cada fermentador con el 10-20% (v/v) de la mezcla de las cepas (+) y (-) de B . trispora descrita en el apartado viii. x) Incubar el cultivo mixto durante 5-6 dias a 26°C.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado por producir al menos 3,6 g/1 de licopeno a los 5-6 dias.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por producir al menos 30 mg de licopeno por gramo de peso seco de micelio a los 5-6 dias.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindi- caciones 1 a 18, caracterizado por realizar en la etapa b. una purificación por resuspensión de la biomasa en alcohol con una proporción alcohol/biomasa del orden 1 ml/g a 10 ml/g.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindi- caciones 1 a 19, caracterizado por utilizar en la etapa b. alcohol a temperatura comprendida entre 0°C y la correspondiente a su temperatura de ebullición, preferiblemente entre 10° y 50°C.
21. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 4 a 18, caracterizado por efectuar en la etapa b. una purificación directamente por mezcla del caldo de fermentación con alcohol en proporción caldo/alcohol entre 1/0,5 y 1/5, preferiblemente en 1/1 y 1/3 a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la de ebullición de la
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 mezcla, preferentemente entre la temperatura ambiente y 60°C.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado por utilizar en la etapa d. de extracción sólido-liquido un disolvente tipo éster, preferentemente acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo, acetato de n-butilo o acetato de isobutilo
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado por utilizar una cantidad de disolvente del orden de 5 a 30 mi por g de biomasa.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, caracterizado por utilizar el disolvente a temperaturas próximas a las de ebullición del mismo, preferiblemente entre 50 y 80°C.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, caracterizado por utilizar el disolvente de manera que el tiempo de contacto con el licopeno sea inferior a 15 minutos.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindica- ciones 1 a 25, caracterizado porque en la etapa f. la precipitación del producto concentrado después de la extracción se consigue mediante adición de un disolvente en el que el licopeno tenga baja solubilidad, tipo metanol, etanol, propanol, isopropanol, y que mantenga disueltas las sustancias de carácter lipofilico que acompañan al licopeno.
27. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, según el cual el producto obtenido es estable y puede manejarse y comercializarse como tal, en forma cristalina.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en que la etapa h. de formulación consiste en la formación de una suspensión microcristalina de licopeno mediante premezcla del licopeno, antioxidantes y
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 aceites en proporciones adecuadas, seguida de una molienda posterior.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el cual el aceite utilizado es de origen vegetal, preferen- temente de girasol, oliva, maiz, algodón o soja.
30. Procedimiento según las reivindicaciones 28 y 29, caracterizado por efectuar la molienda en un molino de bolas .
31. Procedimiento según las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado por utilizar antioxidantes liposolubles, preferentemente tocoferóles naturales, en proporción 0,2 a 15%, preferiblemente 0,5-5% respecto al peso del licopeno en la mezcla.
32. Procedimiento según cualquiera de las reivindi- caciones 28 a 31, caracterizado por obtener una suspensión microcristalina de licopeno en aceite con un tamaño de cristal inferior a 10 mieras, preferiblemente inferior a 5 mieras y más preferiblemente por debajo de 2 mieras.
33. Procedimiento según cualquiera de las reivindi- caciones 1 a 27, en que la etapa h. de formulación consiste la preparación de licopeno dispersable en agua fría (CWD) , mediante un proceso que engloba las siguientes fases:
I. Disolución del licopeno cristal acompañado de compuestos antioxidantes en un disolvente orgánico II. Emulsión o microencapsulación de la fase orgánica anterior en una disolución acuosa de almidones modificados III. Eliminación del disolvente y parte del agua por evaporación, obteniendo la formulación liquida. IV. Secado y acabado final.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado por utilizar cloruro de metileno como disolvente en la fase I. de disolución del licopeno.
35. Procedimiento según la reivindicación 33, caracte- rizado por utilizar esteres de acilo como disolvente en la
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) fase I. de disolución del licopeno, especialmente acetatos de etilo, propilo, isopropilo, n-butilo o isobutilo.
36. Procedimiento según las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado por utilizar en la fase I. de disolución del licopeno uno o una mezcla de antioxidantes, preferiblemente de tipo tocoferol o palmitato de ascorbilo, en proporción entre 1-30%, preferiblemente 10-20%, respecto al peso de licopeno.
37. Procedimiento según las reivindicaciones 33 a 36, caracterizado por utilizar además un aceite vegetal en la fase I. de disolución del licopeno en el solvente orgánico.
38. Procedimiento según las reivindicaciones 33 a 37, caracterizado por emplear en la fase II. como agente emulsionante o microencapsulante almidones modificados, preferentemente en forma de esteres, más preferentemente octenilsuccinato .
39. Procedimiento según la reivindicación 33 a 38, caracterizado por obtener una emulsión con un tamaño medio de micela inferior a 10 mieras, preferiblemente inferior a 2 mieras y más preferiblemente entre 0,1 y 1 miera.
40. Procedimiento según las reivindicaciones 33 a 39, caracterizado por efectuar la fase IV. de secado de la formulación liquida mediante un proceso a seleccionar entre: pulverización a alta temperatura (atomización), pulverización sobre lecho fluidizado a relativamente baja temperatura (granulación) o liofilización.
41. Procedimiento según las reivindicaciones 33 a 40, caracterizado porque en la fase IV. el acabado final consiste en efectuar un revestimiento de las partículas con disoluciones acuosas de azúcares o almidones modificadas en proporción 0,5-10%.
42. Formulación obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizada por consistir en una suspensión microcristalina en aceite de licopeno con un tamaño de cristal inferior a 10 mieras,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 preferiblemente inferior a 5 mieras y más preferiblemente inferior a 2 mieras.
43. Formulación obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizada por consistir en un granulado de microcristales de licopeno con un tamaño medio de partícula comprendido entre 100-2000 mieras, preferiblemente entre 100-800 mieras y más preferi- lemente entre 100-300 mieras.
44. Formulación obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizada por consistir en un atomizado de microcristales de licopeno con un tamaño medio de partícula comprendido entre 10-100 mieras .
45. Formulación obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizada por consistir en un aglomerado de un atomizado de micro- cristales de licopeno con un tamaño medio de partícula comprendido entre 50-500 mieras, preferiblemente entre 200- 300 mieras.
46. Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, caracterizada por estar revestida con 0.5- 10% en peso seco de disoluciones acuosas de azúcares o almidón modificado.
47. Uso de la formulación de la reivindicación 42 como colorante, particularmente en los sectores alimentario, farmacéutico y de cosmética.
48. Uso de la formulación de la reivindicación 42 como suplemento nutricional.
49. Uso de cualquiera de las formulaciones de las rei- vindicaciones 43 a 46 como colorante, particularmente en los sectores alimentario, farmacéutico y de cosmética.
50. Uso de cualquiera de las formulaciones de las reivindicaciones 43 a 46 como suplemento nutricional.
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26
PCT/ES2002/000610 2001-12-31 2002-12-20 Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora, formulaciones y usos del licopeno obtenido WO2003056028A1 (es)

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