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Procedimiento mejorado de produccion de licopeno mediante la fermentacion de cepas seleccionadas de blakeslea trispora.
ES2333944T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Ana Teresa Marcos Rodriguez Antonio Estrella De Castro Javier Costa Perez Manuel Antonio Oliver Ruiz Nieves Fraile Yecora Juan Luis De La Fuente Moreno Marta Rodriguez Saiz Bruno Diez Garcia Enrique Peiro Cezon Angel MUÑOZ RUIZ Walter Cabri Juan Francisco Lopez Ortiz Jose Luis Barredo Fuente - Current Assignee
- Vitatene SA
Description
translated from
Procedimiento mejorado de producción de licopeno
mediante la fermentación de cepas seleccionadas de Blakeslea
trispora.
El procedimiento de fermentación con cepas
seleccionadas de B. trispora expuesto en la presente
invención permite alcanzar unos niveles de producción de licopeno
superiores a los actualmente descritos. Los métodos de aislamiento,
purificación y formulación son aplicables a cualquier fuente natural
de licopeno, especialmente a cultivos sumergidos de hongos
mucorales de los géneros Blakeslea, Choanephora, Phycomyces o
Mucor. El procedimiento de extracción permite una
simplificación en el proceso de recuperación y un incremento de
pureza del producto con respecto a los procedimientos anteriormente
descritos. Los procedimientos de formulación proporcionan un alto
valor añadido, ya que permiten obtener preparaciones estabilizadas
de licopeno de aplicación directa en los campos alimentario y
farmacéutico.
Los carotenoides están ampliamente distribuidos
en la naturaleza, confiriendo su característico color, desde
amarillo hasta rojo profundo, a numerosas sustancias naturales como
zanahorias, pimientos, tomates, flores o determinados
microorganismos entre los que se encuentran ciertas bacterias,
hongos y organismos fotosintéticos. Los carotenoides pueden
clasificarse en dos tipos: (i) hidrocarburos puros denominados
carotenos, entre los que se encuentran compuestos como
\beta-caroteno, \alpha-caroteno,
\gamma-caroteno o licopeno y (ii) moléculas
denominadas xantofilas, las cuales contienen oxígeno en
diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc.), entre las que se
encuentran astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina,
luteína, etc. Ambos grupos de compuestos presentan un
comportamiento diferente en cuanto a sus propiedades
físico-químicas y solubilidad en disolventes
orgánicos. Todos estos compuestos juegan un papel importante en la
dieta humana habiéndose estudiado ampliamente sus propiedades como
antioxidantes para la prevención del cáncer y otras enfermedades
humanas y como precursores de la vitamina A. Recientemente se ha
demostrado en ratas que el licopeno inhibe el efecto dañino del
nitriloacetato férrico sobre el ADN y previene la necrosis del
hígado [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys.
vol. 396]. Adicionalmente, debido a sus coloraciones desde amarilla
hasta roja, los carotenoides poseen una gran importancia comercial
como colorantes y aditivos alimentarios debido a sus efectos
beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores [Ninet L. y
Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial
Technology, 2^{nd}. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp.
529-544].
El licopeno (C_{40}H_{56}) es un
intermediario de la ruta biosintética de
\beta-caroteno y las xantofilas. Posee un peso
molecular de 536,85 y la siguiente fórmula molecular:
El licopeno, además de actuar como antioxidante,
previene enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer y
actúa en el control del crecimiento [Giovannucci et al (1995)
J Nat. Cancer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. y Sies,
H. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336: 1-9; Clinton,
SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Esto ha dado
lugar a un incremento de la demanda por parte de los consumidores.
La obtención de licopeno como compuesto de alta pureza ha estado
ligada en el pasado a la síntesis química [US 5208381; US 5166445;
US 4105855; US 2842599]. No obstante, actualmente existen vías
alternativas basadas en fuentes de licopeno de origen natural y
procesos de extracción específicos.
La producción de carotenoides mediante
biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre
los procesos químicos y los biológicos. Las preparaciones de
licopeno de origen biológico se obtienen a partir de tomate [PCT WO
97/48287, EP 608027] o mediante la fermentación de hongos mucorales
de los géneros Phycomyces, Blakeslea y Choanephora
[GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU
2102416, WO 00/77234]. Para conseguir una máxima producción de
carotenoides con B. trispora es preciso fermentar
conjuntamente las cepas (+) y (-) [Ciegler, A. (1965) Advances in
Applied Microbiology 7: 1-34; Plempel, M. (1965)
Planta 65: 225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME.
(1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. El incremento
de producción de carotenoides en cultivos mixtos está
correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos
denominados factor \beta o ácidos trispóricos [WO 00/77234,
Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7:
175-187]. Para biosintetizar ácidos trispóricos, el
\beta-caroteno producido por las cepas (+) y (-)
es metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a
4-dihidrotrisporol. La cepa (+) utiliza el
4-dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido
dihidrotrispórico y su éster metílico
(metil-4-dihidrotrisporato). Por su
parte, la cepa(-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a
trisporol. Finalmente, el
metil-4-dihidrotrisporato es
convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es
convertido en ácido trispórico por la cepa (+). Esta descripción de
la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya
que durante el proceso se generan muchos
co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a
ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas.
Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos
varían en función de las cepas.
La ruta biosintética de
\beta-caroteno (ver esquema 1) ha sido descrita en
hongos filogenéticamente relacionados con B. trispora como
Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides
[Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National
Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A.
et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267:
5509-5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al
menos tres actividades enzimáticas: (i) fitoeno sintasa, la cual
une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato para formar fitoeno,
(ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles
enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii)
licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se
encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la
molécula de \beta-caroteno. El análisis de
mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta
biosintética de \beta-caroteno en este hongo es
similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B.J. y
Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42:
836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el
color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante
mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco
o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan
licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de
carotenoides o acumulan fitoeno. Para la producción de licopeno es
preciso disponer de cepas de B. trispora carentes de
actividad licopeno ciclasa o alternativamente adicionar al medio de
fermentación compuestos químicos inhibidores de la citada actividad
enzimática.
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Esquema
1
En las patentes GB 1008469, US 3097146, US
3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 y WO 00/77234 se
describe la obtención de licopeno mediante la fermentación de hongos
mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora.
Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen métodos de
fermentación de B. trispora basados en el control del pH
entre valores de 7,0 y 9,5, obteniendo producciones de 99,7 mg/l de
licopeno tras 7 días de fermentación. Las patentes JP 73016189 Y JP
73016190 describen métodos de producción de licopeno con hongos
mucorales basados en la adición aminas terciarias. La patente RU
2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de
tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las
sustancias descritas en dichas patentes, se ha publicado el uso de
otras bases nitrogenadas heterocíclicas para bloquear la síntesis
de carotenoides a nivel de licopeno: nicotina [JP 09313167],
imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados
sustituidos [US 3369974; Ninet L., Renaut J. (1979) En: Peppler HJ,
Perlman D (eds). Microbial Technology, 2^{nd}. Edn, vol. 1
Academic Press, NY, pp. 529-544]. Asimismo, se han
descrito mutantes de B. trispora que acumulan licopeno sin
la necesidad de adicionar aminas terciarias [Mehta B.J. y
Cerdá-Olmedo E. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol.
42:836-838].
Además de los hongos mucorales anteriormente
mencionados, se ha descrito la producción de licopeno con algas [JP
09313167 y JP 2000152778], mediante la fermentación de
Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens [US
3467579] y modificando la ruta biosintética de carotenoides de
Flavobacterium sp. R1534 [US 6124113].
El licopeno puede ser obtenido a partir de
productos vegetales tales como: tomate, zanahoria, pimiento, aceites
vegetales, etc. Así, en la patente WO 97/48287 se describe un
procedimiento para la preparación de oleorresinas ricas en licopeno
a partir de tomates mediante el estrujado del tomate hasta la
obtención de la pulpa, extracción del licopeno de la pulpa con
disolventes orgánicos y posterior eliminación del solvente mediante
evaporación, dando lugar a una oleorresina con un contenido en
licopeno entre el 2-10%. Procedimientos similares de
obtención de oleorresinas ricas en carotenoides en general y
licopeno en particular a partir de vegetales y aceites se
describen en diferentes patentes, como en la US 5245095 y la EP
580745, mediante la precipitación con sales de calcio, la US
5019668, utilizando un procedimiento de transesterificación con
aceites y posterior destilación, la WO 95/16363, que describe el
fraccionamiento del tomate en diferentes fracciones que incluyen una
oleorresina rica en carotenoides, y la PCT WO 90/08584, que
describe la extracción de licopeno mediante la utilización de
fluidos en estado supercrítico, aunque el extracto obtenido es una
mezcla de diferentes carotenoides y los rendimientos de extracción
son muy bajos debido a su baja solubilidad.
En todos estos casos, debido a la baja
concentración de licopeno en estos productos naturales y la
disposición intracelular de este compuesto en determinados
orgánulos como cloroplastos o cromoplastos, los rendimientos de
extracción y la pureza del producto obtenido son bajos, obteniéndose
oleorresinas ricas en licopeno o productos crudos deshidratados
junto a cantidades variables de otros compuestos, carotenoides o no.
En la mayoría de los casos los procedimientos de extracción
descritos requieren la preparación del fruto mediante molienda o
extrusión para facilitar la extracción del disolvente y así liberar
el contenido intracelular rico en licopeno. Por último en la
mayoría de los procesos descritos en estas patentes se requiere el
uso de disolventes orgánicos que aparecen como trazas en la
oleorresina obtenida. Asimismo en la patente IL 107999 se describe
la preparación de oleorresinas muy ricas en licopeno a partir de
pulpas de tomates, aunque al igual que en los casos anteriores no
se obtienen cristales de licopeno de alta pureza sino concentrados
lipídicos ricos en licopeno.
Por otro lado, en la patente WO 97/15554 se
describe la extracción de carotenoides de origen vegetal a partir
de zanahorias y tomates, entre los que se incluyen el
licopeno, mediante el aislamiento de cloroplastos y cromoplastos,
para proceder a continuación a la digestión de dichos orgánulos con
enzimas hidrolíticas de proteínas como pectinas y/o proteasas que
permiten la liberación del licopeno unido a diferentes proteínas
estructurales. Mediante un tratamiento alcalino posterior y una
extracción con mezclas alcohólicas de bajo peso molecular es
posible obtener extractos de licopeno con una riqueza y pureza
superior a las oleorresinas, aunque sin obtenerse cristales
purificados de licopeno sino extractos crudos ricos en licopeno.
Igualmente en la patente EP 608027 A2 se obtienen extractos
concentrados de licopeno mediante el aislamiento de cromoplastos de
tomates en los cuales se encuentra el licopeno en forma cristalina.
Dichos extractos de cromoplastos de tomate ricos en licopeno son
utilizados directamente como colorantes sin extracción posterior de
los cristales de licopeno, evitando el cambio de coloración del
licopeno durante la extracción y obviando el uso de solventes
orgánicos. De acuerdo al procedimiento descrito en esta patente no
es posible obtener licopeno puro en forma cristalina apto para uso
en composiciones alimenticias o farmacéuticas, sino únicamente como
colorante alimentario en forma deshidratada, liofilizada o
congelada.
Otra fuente importante de licopeno son
determinadas microalgas ricas en carotenoides del tipo
Dunaliella. Existen diferentes procedimientos de extracción
de carotenoides, y en particular de licopeno, a partir de estos
organismos, tal como se refleja en las patentes US 5378369, US
4713398 y US 4680314, mediante la extracción con disolventes
orgánicos (clorocarbonados, hidrocarburos, etc.) o aceites
comestibles (DE 4342798). Un proceso diferente aparece descrito en
la PCT WO 98/08584 donde la obtención de un extracto de licopeno se
realiza utilizando CO_{2} en estado supercrítico, aunque el
extracto así obtenido presenta una baja pureza en licopeno.
El licopeno también puede ser obtenido a partir
de determinados hongos mucorales como Blakeslea,
Choanephora, Phycomyces o Mucor por
fermentación en medio líquido, presentando como ventaja frente a la
obtención de licopeno a partir de productos vegetales o algas la
elevada concentración de este compuesto, en algunos casos superior
al 5% en peso respecto a la cantidad de biomasa seca,
concentraciones superiores a las obtenidas de las mejores
variedades vegetales, así como la posibilidad del desarrollo
biotecnológico de cepas superproductoras de estos microorganismos,
ya sea mediante técnicas de mutagénesis clásica o bien mediante la
aplicación de las nuevas tecnologías de biología molecular que
permiten la manipulación genética de estos microorganismos,
incrementando la concentración y producción de licopeno, y
eliminando la producción de otros carotenoides estructuralmente
relacionados.
Como ya se ha comentado, la preparación de
licopeno cristalino de elevada pureza a partir de fuentes naturales
requiere por lo general una etapa de extracción con disolventes
orgánicos o fluidos en estado supercrítico y posteriormente
diversas etapas de purificación adicionales como cromatografía,
procesos de adsorción y elución y etapas de precipitación o
cristalización, como por ejemplo se describe en las patentes US
3369974, EP 818255 y EP 242148. En la mayoría de los casos en los
que no se utilizan estas etapas de purificación posterior y la
cristalización se realiza directamente a partir de extracto mediante
evaporación del disolvente hasta superar la solubilidad, la pureza
del producto obtenido es muy baja y es preciso proceder
posteriormente a procesos de recristalización del licopeno
obtenido, con el agravante de que la baja solubilidad del producto
implica el uso de una gran cantidad de disolvente para llevar a
cabo la etapa de recristalización, lo que además conduce a un bajo
rendimiento (NL 6411184, US 4439629). En ES 2157166 se describe un
procedimiento para la obtención de licopeno a partir de fuentes
naturales de biosíntesis, tales como Blakeslea.
En la solicitud de patente WO 96/13178 se
describe la preparación de concentrados de licopeno cristalino
estabilizado en un medio líquido compatible alimentario en el cual
el licopeno es insoluble, como etilenglicol, etanol o glicerol,
obteniendo mediante molienda cristales pequeños (1-3
micras) de licopeno en suspensión en un medio líquido. Asimismo en
la solicitud de patente WO 98/43620 se describe un procedimiento de
aislamiento de cristales de licopeno a partir de una oleorresina
mediante saponificación de diferentes triglicéridos y fosfonatos a
alta temperatura y posterior dilución con agua, obteniendo cristales
de licopeno entre el 75 y el 95% de pureza. Un procedimiento
similar ha sido descrito recientemente para la preparación de
cristales de \beta-caroteno de elevada pureza en
la PCT WO 98/03480 por lavado con agua, alcoholes de bajo peso
molecular o acetona, aunque no ha sido descrita su aplicación para
la obtención de cristales de licopeno de alta pureza.
Es bien conocida la inestabilidad de los
carotenoides en forma cristalina, siendo un procedimiento de
estabilización de los mismos la preparación de dispersiones
oleosas. Además, se cree que los carotenoides dispersados en aceite
son absorbidos más fácilmente por el organismo. Un procedimiento
alternativo para la estabilización de compuestos inestables es la
microencapsulación de los mismos en matrices de almidón. Así en las
patentes US 2876160, US 2827452, US 4276312, US 5976575 se describe
un aumento considerable en la estabilidad de diversos compuestos,
entre ellos los carotenoides, mediante encapsulación de los mismos
en matriz de almidón.
Una de las principales dificultades para la
utilización de los carotenoides en el campo de los colorantes es su
nula solubilidad en agua, ya que muchas de las aplicaciones de los
mismos tienen lugar en medios acuosos. Este problema de solubilidad
se menciona en el documento US 3998753, y se resolvió preparando
disoluciones de carotenoides en disolventes orgánicos volátiles,
tales como hidrocarburos halogenados, y emulsionándolas con una
solución acuosa de lauril sulfato sódico.
La patente US 5364563 describe un procedimiento
para producir una preparación de carotenoides en polvo, que implica
formar una suspensión de un carotenoide en aceite de alto punto de
ebullición. La suspensión se sobrecalienta con vapor de agua
durante un período máximo de 30 segundos para formar una solución de
carotenoide en aceite. A continuación esta solución se emulsiona
sobre una solución acuosa de un coloide y seguidamente la emulsión
se seca mediante pulverización.
La presente invención describe una serie de
procedimientos para la obtención de producciones elevadas de
licopeno con el hongo B. trispora, así como procedimientos
para su recuperación y formulación. La invención consiste en (i) el
diseño de métodos para la obtención y selección de mutantes de B.
trispora superproductores de licopeno, (ii) el desarrollo de
condiciones mejoradas de fermentación, (iii) el establecimiento de
procesos de recuperación de licopeno a partir del micelio y (iv) la
consecución de formulaciones que superen los problemas de
estabilidad y solubilidad en diferentes medios, presentes en el
estado de la técnica. B. trispora es un hongo que posee una
gran importancia industrial para la producción biotecnológica de
licopeno. De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el
procedimiento sintético utilizado industrialmente en la actualidad.
Particularmente, la invención se lleva a cabo de acuerdo con la
reivindicación 1.
Con la finalidad de obtener cepas
superproductoras de licopeno, en primer lugar se desarrolló un
procedimiento mutagénico de las cepas (+) y (-) de B.
trispora con los agentes mutagénicos etilmetano sulfonato (EMS)
y
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG). Las suspensiones de esporas a mutar se obtuvieron a partir de
slants con medio YpSs. Las esporas se resuspendieron añadiendo 10
ml de una solución de Triton X-100 al 0,1% a cada
slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante filtración a
través de filtro de nylon de 20 \mum de tamaño de poro. La
concentración de esporas en la suspensión se ajustó a 10^{6}
esporas/ml. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la
incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución de EMS al 3% en
tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante
60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%.
Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton
X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC
durante 2 minutos. El procedimiento de mutación con NTG consistió en
la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución que contenía
250 \mug/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a
temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de
mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron
tres veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a
3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos. Con las esporas mutadas se
sembraron placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV
suplementado con Triton X-100 al 0,1% y se
incubaron a 25ºC durante 4 días para obtener colonias aisladas.
Las estrategias utilizadas para la selección de
cepas de B. trispora (-) superproductoras de licopeno fueron
las siguientes: (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii) la
intensidad de color de la colonia. La selección de mutantes
productores de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos
consistió en colocar filtros impregnados en ácidos trispóricos
sobre las colonias obtenidas a partir de esporas mutadas. Los ácidos
trispóricos se obtuvieron a partir de un cultivo mixto de las cepas
(+) y (-) de B. trispora. Las colonias con los filtros se
incubaron a 25ºC, observándose que los mutantes productores de
licopeno adquirían un color rojo intenso, a diferencia de los
productores de \beta-caroteno cuyo color era
naranja. Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se seleccionó
el mutante LMA1 (-) (Esquema 2). La selección de mutantes
productores de licopeno en función de la intensidad de color de la
colonia se realizó de la siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (-)
(productora de \beta-caroteno; ver Esquema 2) y
las esporas mutadas se crecieron en placas de medio sólido YEPDA.
Seguidamente se seleccionaron aquellas colonias que poseían un color
amarillo-naranja más intenso que la cepa parental
CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color
amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y
CMB2 (-)).
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Esquema
2
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Filogenia de las cepas de B. trispora (-)
obtenidas a partir de B. trispora VKPM
F-208 (-) utilizando procedimientos de mutación y
selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
EMS etilmetanosulfonato.
La selección de mutantes superproductores de
licopeno de B. trispora (+) se realizó creciendo esporas
mutadas en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV
suplementado con imidazol al 0,1%. Seguidamente, una porción de
cada una de las colonias se transfirió a una placa de PDA en la que
previamente se había sembrado B. trispora (-). El nivel de
producción de licopeno en medio sólido se estimó en función de la
intensidad de coloración en la zona de intersección de la colonia
de la cepa (+) con la de la cepa (-). De esta forma se seleccionó
la cepa B. trispora CPA1 (+) (Esquema 3), la cual daba lugar
a una mayor producción de licopeno en cultivos mixtos sólidos con
una serie de cepas (-). El nivel de producción de la cepa B.
trispora CPA1 (+) se analizó posteriormente en cultivo mixto en
medio líquido.
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El sistema de siglas empleado para la
denominación de las cepas seleccionadas es el siguiente:
CM: Caroteno minus (-).
LM: Licopeno minus (-).
CP: Caroteno plus (+).
LP: Licopeno plus (+).
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La relación entre generaciones parentales sigue
el orden del alfabeto: A es parental de B, B es parental de C, etc.
El número situado tras las letras se corresponde con el número del
mutante. Así por ejemplo, la denominación CMA1(-) significa que se
trata de una cepa productora de caroteno (C), menos (M), parental de
CMB y mutante número 1. Del mismo modo, CMA1(-), CMA2(-), CMA3(-) y
CMA4(-) se corresponden con los mutantes 1, 2, 3 y 4 de una misma
generación.
Esquema
3
Filogenia de las cepas de B. trispora (+)
obtenidas a partir de B. trispora VKPM
F-117(+) utilizando procedimientos de mutación y
selección. UV ultravioleta, SN selección natural, NTG
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
EMS etilmetanosulfonato.
Las cepas (+) y (-) de B. trispora
seleccionadas en medio sólido se fermentaron en matraz con la
finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno en medio
líquido y cultivo mixto. Para ello, se sembraron matraces de
inóculo independientes con las cepas B. trispora CPA1 (+) y
B. trispora CMB2 (-) y posteriormente se realizó una
fermentación mixta de ambas cepas en matraz. Al inicio de la
fermentación (0-50 horas) se añadió un inhibidor de
la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de
bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo
imidazol en una concentración de 0.7-0.8 g/l). Una
vez concluida la fermentación (alrededor de 6 días), el micelio de
B. trispora se lisó mediante agitación en vortex, se extrajo
el licopeno con solventes orgánicos (por ejemplo acetona) y se
determinó su concentración y pureza mediante HPLC. Los niveles de
producción obtenidos fueron de 3,0 g/l. El mismo tipo de
fermentación se realizó con las cepas B. trispora CPA1 (+) y
B. trispora LMA1 (-), con la diferencia de que en este caso
no fue necesario adicionar un inhibidor de la actividad licopeno
ciclasa. Los niveles de producción obtenidos con estas cepas en
cultivo mixto fueron de 1,2 g/l.
Las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) se cultivaron en
fermentador pre-industrial con la finalidad de
determinar el nivel de producción de licopeno. Para ello, se
crecieron separadamente en matraces, se transfirieron separadamente
a tanques intermedios de crecimiento y por último se fermentaron
conjuntamente. Entre las 25 y 35 horas de fermentación se adicionó
imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa.
La fermentación se incubó durante 100-140 horas. El
valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de
fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de
3,4 g/l.
Las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) se cultivaron en
fermentador pre-industrial con la finalidad de
determinar el nivel de producción de licopeno sin adición de
inhibidores de la actividad enzimática licopeno ciclasa. La
fermentación se realizó tal y como se ha indicado anteriormente para
las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-), pero sin adicionar imidazol. El
valor medio de producción de licopeno obtenido en una serie de
fermentaciones diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) fue de
1,6 g/l.
Un mayor rendimiento en esta fase de
fermentación se obtiene mediante el control de la edad de las fases
vegetativas de crecimiento de las cepas de B. trispora. Así
los cultivos utilizados como inóculos tienen una edad de
30-60 horas, preferentemente de 48 horas, tanto para
las cepas (+) como las (-), pero variando el número de esporas a
sembrar: 800-1.000 esporas/ml y
40.000-60.000 esporas/ml, respectivamente. La
incubación se realiza a unos 25ºC con un 0.1% v/v de cada inóculo
se siembra en la fase de cultivo primario. La edad de dichos
cultivos primarios oscila entre las 30-60 horas,
preferentemente 36-48 horas, a temperaturas que
oscilan entre 26-28ºC. Posteriormente se mezclan en
proporción 1/10 v/v las fases primarias (+)/(-) y se siembran los
fermentadores 10-20% v/v con la mezcla de dichas
fases.
Dada la característica intracelular del
componente carotenoide biosintetizado en la fermentación, el
procedimiento de recuperación a partir del medio de cultivo,
preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica como
primera etapa la separación de la biomasa del medio de cultivo. Esta
separación puede hacerse por los procedimientos establecidos de
filtración, empleando las tecnologías al uso de filtros, bien sean
de bandas, rotatorios, prensa, etc., en los que una barrera
constituida por la tela filtrante separa la biomasa y permite pasar
la fase líquida sin biomasa, o de centrifugación, en la que haciendo
uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa
(normalmente mayor) se emplea una máquina del tipo de un
separador centrifugo, decanter o similar, en el que la fase pesada
se concentra y se separa de la fase líquida con la menor cantidad
posible de biomasa. Uno de los objetivos de esta etapa consiste en
reducir pérdidas y optimizar las características de cada fase
consiguiendo la mayor cantidad de biomasa con el mayor contenido de
residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentación,
con la menor cantidad de materia activa.
El micelio húmedo resultante contiene más del
95% de los carotenoides producidos en la fermentación,
preferiblemente más del 97% y más preferiblemente más del 99%. El
contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior
al 5%, preferiblemente inferior al 3% y más preferiblemente inferior
al 1%. Con este micelio húmedo sería posible, mediante las etapas
ulteriores, la separación de licopeno. Sin embargo se ha comprobado
que, relacionado con la fermentación, este micelio mantiene un
porcentaje relativamente elevado de componentes lipofílicos, entre
15 y 20% (ácidos grasos y aceites) que en etapas ulteriores plantean
problemas de purificación, lo que conduce a introducir, en este
punto, una etapa de purificación de la biomasa. Esta etapa de
purificación implica una resuspensión de la biomasa en alcohol:
metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en
el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, en proporción
adecuada para conseguir la máxima purificación de los componentes
lipídicos. Así, el micelio húmedo se resuspende con una cantidad de
alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La
temperatura de resuspensión oscila entre 0ºC y la de ebullición del
alcohol, preferiblemente entre 10 y 50ºC. El tiempo de contacto
oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica así
preparada se filtra o centrifuga, de modo que el contenido en
sólidos en el filtrado o clarificado sea prácticamente nulo. El
micelio húmedo resultante, que contendrá alcohol más agua en
diversa proporción, contiene más del 93% de los carotenoides
producidos en la fermentación, preferiblemente más del 95% y más
preferiblemente más del 97%.
En la fase sobrenadante o filtrada que contiene
restos de medio de cultivo y alcohol, el contenido en carotenoides
es inferior al 2%, preferiblemente inferior al 1%, referido al medio
de cultivo inicial. Este tratamiento con alcohol permite eliminar
una serie de sustancias lipofílicas solubles en alcohol, en cantidad
variable en función de las características del medio de cultivo
utilizado, efectuando una purificación previa que nos va a permitir
obtener un producto final cristalino de elevada pureza. Además, al
eliminar una proporción variable de agua del micelio húmedo
inicial, se facilita considerablemente el posterior proceso de
secado. Mezclando directamente el medio de cultivo con el alcohol y
manteniendo un tiempo mínimo de contacto se consigue un efecto de
purificación equivalente al descrito anteriormente, con lo que se
simplifica el proceso al eliminar una operación de separación
sólido/liquido. La proporción medio de cultivo/alcohol puede oscilar
entre 1/0,5 hasta 1/5, preferiblemente entre 1/1 y 1/3. La
temperatura de la mezcla oscila entre la temperatura ambiente y la
de ebullición de la mezcla, preferiblemente entre la temperatura
ambiente y 60ºC.
El micelio deshidratado/purificado se seca. El
secado puede hacerse por los procedimientos habituales en batch o
en continuo. La temperatura de secado oscila entre la temperatura
ambiente y 150ºC, preferiblemente no debe sobrepasar los 60ºC y más
preferiblemente estar por debajo de 50ºC. El tiempo de secado
depende de la temperatura empleada, oscilando entre 1 hora y 72
horas. Debido a la posible descomposición de estos carotenoides por
oxidación con el oxígeno atmosférico, es conveniente efectuar esta
operación de secado en ausencia de oxígeno, bien bajo
atmósfera de nitrógeno o al menos a vacío. El hecho de que el
producto carotenoide sea intracelular implica un acondicionamiento
de la biomasa purificada, bien mediante secado más molienda, secado
más disgregación o disgregación de la biomasa, que favorezca la
mezcla con disolventes y facilite la extracción a estos. Para
conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a
extractar es necesaria una operación de ruptura previa del micelio,
de modo que la superficie de contacto sea máxima. El tamaño de
partícula óptimo del micelio seco y roto debe ser inferior a 3 mm,
preferiblemente inferior de 1 mm y más preferiblemente inferior a
0,5 mm.
La molienda puede hacerse sobre el producto
seco, mediante sistemas mecánicos con partes giratorias o fijas:
mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilindros giratorios
presionando uno sobre el otro (compactación o extrusión). También
es posible efectuar el secado y molienda en una única etapa mediante
un sistema de secado tipo flash (instantáneo) en un equipo jet mill
(molino de chorro) donde el producto húmedo se alimenta a una
corriente de un gas en recirculación y a temperatura elevada, de
manera que el tiempo de residencia sea el mínimo para conseguir
vaporizar el contenido de componentes líquidos, y el producto sea
transportado, al variar las densidades, hasta un ciclón donde se
recupera. Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lugar
asimismo un efecto de homogeneización al chocar las partículas con
las paredes.
Para la extracción del licopeno a partir de un
micelio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear
diversos disolventes orgánicos. Esta invención se referirá al uso de
disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales
como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, que conjugan la
solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides
con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de
Clase III de ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel
nacional como comunitario, en los ámbitos tanto farmacéutico como
alimentario (RDL12/04/90 y RDL16/10/96) El contenido de disolventes
residuales debe ser, según el ICH, inferior a 5000 ppm,
preferentemente inferior a 1000 ppm y más preferentemente inferior
a 100 ppm, siempre referido a la materia seca de la mezcla líquida.
La temperatura de extracción oscila entre la temperatura ambiente y
la de ebullición del disolvente, preferiblemente entre 50ºC y 80ºC.
El tiempo de extracción será el mínimo necesario para conseguir la
solubilización, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre 1
minuto y 15 minutos. La cantidad de disolvente empleada depende de
la temperatura y de la riqueza del micelio en carotenoides,
oscilando entre 5 ml/g y 30 ml/g de biomasa. El número de
extracciones varía desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides
extractados es superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y
más preferiblemente superior al 95%.
Una vez obtenido, el extracto rico en
carotenoides debe ser concentrado hasta un determinado volumen. La
concentración final de carotenoides en el disolvente tras
concentrar oscila preferentemente entre 10 y 50 g/l. La temperatura
de concentración debe ser inferior a 80ºC, preferiblemente inferior
a 70ºC y más preferiblemente inferior a 50ºC. Una vez concentrado
el extracto al volumen requerido se hace necesario añadir un
insolubilizante de los carotenoides, concretamente un alcohol y más
concretamente metanol, etanol, propanol, isopropanol o cualquier
otro alcohol en el que la solubilidad del licopeno sea muy baja, con
lo cual el rendimiento en licopeno cristalino aumenta
considerablemente. La adición del alcohol ejerce también un efecto
purificante. El tiempo de cristalización oscila entre 15 min y 24
horas, preferiblemente entre 1 h y 12 h y 12 h y más preferiblemente
entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización debe ser
inferior a 25ºC, preferiblemente inferior a 5ºC.
La separación de los cristales de las aguas de
cristalización se puede efectuar mediante filtración o
centrifugación, desplazando las aguas de cristalización que bañan
los cristales mediante un lavado con el mismo alcohol empleado para
insolubilizar. Los cristales obtenidos se secan a vacío y
temperatura ambiente durante al menos 1 h hasta obtener un
contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones
establecidas por la legislación anteriormente mencionada y que, en
el caso del licopeno, se establece una pérdida por secado inferior
al 0,5%.
La pureza de los cristales obtenidos corresponde
a un título superior a 95%, determinado mediante espectrofotometría
mediante lectura de la absorción a 472 nm de una disolución de los
cristales en n-hexano (E1% 1cm = 3450), con un
contenido en otros carotenoides inferior al 3%. El contenido en cis
licopeno es inferior al 3%.
El método de esta invención es especialmente
aplicable para la recuperación de licopeno cristalino de una fuente
microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, más
preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y más
preferiblemente B. trispora. La extrema pureza conseguida en
los cristales obtenidos por la presente metodología y el empleo de
disolventes considerados como naturales hace que estos cristales
sean aplicables en la industria alimentaria, farmacéutica o de
cosméticos.
El producto cristalino obtenido mediante la
metodología descrita en esta invención se puede envasar en
recipientes opacos que impidan la fotodegradación del producto, en
ausencia de oxígeno (atmósfera inerte o vacío) para evitar la
oxidación y a temperaturas entre 0 y 5ºC. El producto adecuadamente
envasado puede manejarse y comercializarse como tal. No obstante es
conveniente incrementar la estabilidad del mismo mediante etapas
ulteriores de formulación o acabado, que implican adición de
antioxidantes que permiten obtener un producto acabado con una
estabilidad superior a 6 meses en condiciones adecuadas de
envasado.
Objeto fundamental también de esta invención es
un procedimiento de preparación de licopeno que incluye su
formulación en diferentes presentaciones en función de las
características de la aplicación para la cual se desee emplear el
licopeno. Una primera aplicación, denominada suspensión
microcristalina de licopeno en aceite vegetal, consiste en la
premezcla del licopeno cristalino anterior con una cantidad variable
de aceite vegetal. El tipo de aceite vegetal puede ser muy variado,
siendo los más habituales, aunque no los únicos, aceites de
girasol, de oliva, de maíz, de soja, de algodón, etc. La
dosificación del licopeno será función de la riqueza final que se
desee alcanzar, siendo los valores más habituales suspensiones con
un contenido en licopeno entre el 5 y el 60%, preferiblemente entre
el 10 y el 30%. Para incrementar la estabilidad de la mezcla se
adicionan antioxidantes liposolubles al uso, como los tocoferoles
naturales, y preferentemente el
D,L-alfa-tocoferol. La proporción
de este compuesto oscila entre el 0,2 y el 15% respecto al peso del
licopeno, preferiblemente entre el 0,5 y el 5%. Para que las
formulaciones que contienen licopeno presenten una actividad
fisiológica satisfactoria es necesario reducir el tamaño del
cristal de licopeno. Esto se consigue con los sistemas habituales
de molienda aplicables a mezclas líquidas. Objeto preferente de esta
invención son los molinos de bolas que permiten una reducción del
tamaño del cristal por debajo de 10 micras, preferiblemente por
debajo de 5 micras, y aún preferiblemente por debajo de 2 micras,
empleando microesferas de diámetro comprendido 0,5 y 0,75 mm. No
obstante el tamaño de cristal puede variar en función de la
aplicación particular de la suspensión, empleando en cada caso las
esferas y las condiciones de molienda adecuadas. Este tamaño de
cristal también condicionará las propiedades reológicas de la
mezcla, en especial la viscosidad de la misma, que también se podrá
adaptar en función de los requerimientos. Estas suspensiones
micro-cristalinas de licopeno en aceite son
adecuadas para aplicaciones del licopeno en entornos lipofílicos:
margarinas, mantequillas, cremas, etc.
Una segunda aplicación, denominada formulación
de licopeno dispersable en agua fría (CWD), se basa en la disolución
del licopeno en un disolvente orgánico y su posterior
microencapsulación en almidones modificados. Los disolventes más
adecuados para efectuar esta disolución, por presentar esta molécula
una elevada solubilidad, son cloroformo, benceno, tolueno, etc.
Especialmente adecuado es el cloruro de metileno. No obstante debido
al carácter halogenado de este último se pueden utilizar
disolventes de grado alimentario considerados como naturales, tales
como los ésteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, etc. que conjugan la
solubilidad razonablemente elevada para los componentes carotenoides
con su compatibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de
Clase III de ICH. La concentración de licopeno en el disolvente
orgánico puede oscilar ente 1 y 50 g/l, preferiblemente entre 10 y
30 g/l. La temperatura de disolución puede oscilar entre la
temperatura ambiente y la de ebullición del disolvente,
preferiblemente entre 20 y 130ºC. El hecho de que el porcentaje de
cis licopeno sea función de la relación temperatura/tiempo en la
operación de disolución del licopeno en el disolvente orgánico
implica que si se pretende obtener un producto con un bajo contenido
en este isómero, o bien se emplea una temperatura de disolución
baja o en caso contrario un tiempo de disolución muy corto. Así,
para conseguir bajos niveles de cis, si el disolvente empleado es
cloruro de metileno, metileno, la disolución se puede efectuar a
20-35ºC durante un tiempo comprendido entre 1 y 15
minutos. Por el contrario si el disolvente es acetato de isobutilo
la disolución se efectuará preferentemente entre 70 y 130ºC durante
unos segundos. Por el contrario, si los niveles de isómero cis no
son relevantes la disolución se puede llevar a cabo sin
res-tricción en las condiciones de la misma más que
la consecución de la solubilidad total a nivel molecular del
licopeno en el disolvente empleado. Para incrementar la estabilidad
de la formulación final se disuelve conjuntamente con el licopeno
en el disolvente orgánico uno o una mezcla de varios antioxidantes,
preferiblemente de tipo tocoferol, palmitato de ascorbilo, etc.,
cada uno de ellos en proporción entre 1 y el 30%, preferiblemente
entre el 10 y el 20%, respecto al peso del licopeno. También es
posible incorporar en la mezcla aceite vegetal, bien de girasol,
oliva, maíz, soja, algodón, etc. con objeto de favorecer la
disolución del licopeno, y aportar una estabilidad adicional a la
preparación. La relación licopeno/aceite puede oscilar entre 10/1 y
1/10.
La disolución de licopeno así obtenida se mezcla
y emulsiona con una disolución acuosa que contiene un agente
emulsionante, como por ejemplo almidón modificado, más concretamente
ésteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinato
derivados de almidón de diversos pesos moleculares, y especialmente,
aunque no exclusivamente, el Purity Gum 2000® de National Starch o
el Cleargum CO 01® de Roquette, y un agente microencapsulante,
consistente por ejemplo en almidón modificado, más concretamente
ésteres derivados de almidón, preferiblemente octenilsuccinatos
derivados de almidón de diversos pesos moleculares, y especialmente,
aunque no exclusivamente, el Hi Cap 100® o el Capsul® de National
Starch. Las proporciones en las que se mezclan el agente
emulsionante y el agente microencapsulante pueden oscilar entre
5/95 y 95/5, preferiblemente entre 25/75 y 75/25, más
preferiblemente entre 40/60 y 60/40. La concentración en agua de
cada uno de los componentes de la mezcla de agente emulsionante y
agente microencapsulante es variable, pudiendo ser entre el 1 y el
30%, preferentemente entre el 5 y el 20%, y más preferentemente del
10%. La mezcla de fases acuosa y orgánica se emulsiona y la emulsión
obtenida se homogeneiza empleando sistemas de homogenización por
diferencial de presión tipo Mantón Gaulin o Microfluidizer,
habituales al uso, y preferiblemente mediante homogenización
mediante fricción tangencial, como por ejemplo con un emulsionador
tipo Ultraturrax durante un tiempo variable en función de la energía
proporcionada por el equipo y el volumen de mezcla a emulsionar,
con objeto de obtener un tamaño medio de micela inferior a 10
micras, preferiblemente inferior a 2 micras y más preferiblemente
entre 0,1 y 1 micra.
Una vez formada la emulsión se efectúa la
evaporación del disolvente orgánico, preferentemente por destilación
a vacío a temperatura inferior a 50ºC. A medida que tiene lugar la
evaporación del disolvente se produce la
micro-cristalización del licopeno en la matriz de
almidones. Una vez evaporado el disolvente se continúa la
evaporación, con adiciones sucesivas de agua hasta obtener un
contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones
de concentración máxima establecidas por la legislación y un residuo
seco idóneo para el tipo de secado que se vaya a aplicar a esta
mezcla líquida. Valores adecuados de materia seca de la suspensión
de licopeno microencapsulado están comprendidos entre el 1 y el 30%,
preferentemente entre el 10 y el 20%.
De acuerdo con la presente invención se
encuentra que para secar la suspensión acuosa de licopeno obtenida
son adecuados tanto el método de secado mediante pulverización a
alta temperatura (atomización) como el método de pulverización
sobre lecho fluidizado (granulación). Otra alternativa sería el
secado mediante liofilización. De acuerdo con el método de secado
mediante atomización, temperaturas adecuadas de entrada del aire de
secado estarían comprendidas entre 100 y 200ºC mientras que las de
salida entre 60 y 120ºC. El producto atomizado tiene un tamaño de
partícula comprendido entre ente 10 y 100 micras. Con objeto de
aumentar el tamaño de partícula y con ello disminuir la superficie
disponible, y de esta forma aumentar la estabilidad del producto
frente a la oxidación, el producto atomizado puede ser aglomerado
mediante pulverización de una disolución de uno de los almidones
modificados utilizados en la formulación, o la propia suspensión de
licopeno microencapsulado en el seno de un lecho fluidizado del
propio producto atomizado, permitiendo alcanzar tamaños de partícula
que oscilan entre 50 y 500 micras, preferiblemente entre 200 y 300
micras.
El método de granulación implica el uso de un
granulador de lecho fluidizado en el que se pone material de
siembra, que puede ser material inerte típico, tal como partículas
de azúcar, o polvo fino del mismo material a secar obtenido en
procedimientos de granulación previos o en un procedimiento de
secado mediante pulverización. Las partículas se mantienen en
movimiento por medio de aire, y la temperatura del lecho se mantiene
entre 30 y 90ºC, preferiblemente entre 50 y 80ºC. La suspensión de
licopeno microencapsulado se pulveriza mediante aire precalentado a
una temperatura entre 20 y 140ºC en el seno del lecho fluido, a una
velocidad que asegure que las partículas que se van a revestir no
se mojan demasiado ni se aglomeran. El producto granulado tiene un
tamaño de partícula comprendido entre 100 y 2000 micras,
preferiblemente entre 100 y 800 micras y aún preferiblemente entre
100 y 300 micras. Una vez terminada la pulverización por uno u
otro método las partículas se pueden revestir. Este revestimiento
se puede efectuar con aproximadamente 0,5-10% en
peso seco de soluciones acuosas de diversos azúcares o incluso de
alguno o una mezcla de los almidones que constituyen la fórmula
objeto de la presente invención.
Las cepas de Blakeslea trispora han sido
depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la
Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM),
GNII Genetika, Dorozhny Proezd 1, Moscú 113545, (Rusia), con los
siguientes números y fechas: VKPM F-117 el
21-12-1979, VKPM
F-208 el 20-12-1979,
VKPM F-551 el
19-11-1992, VKPM
F-674 el 19-11-1992,
VKPM F-726 el
21-01-1997, VKPM
F-727 el 21-01-1997,
VKPM F-736 el
07-10-1997, VKPM
F-741 el 28-01-1998,
VKPM F-744 el
28-01-1998 y VKPM
F-816 el
13-12-2000.
Los siguientes ejemplos describen en detalle y
sin limitación la presente invención.
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Ejemplo
1
En primer lugar se desarrolló un procedimiento
mutagénico de las cepas (+) y (-) de B. trispora, para lo
cual se analizaron: (i) diferentes tipos de agentes mutagénicos,
(ii) concentración del mutágeno, (iii) concentración de esporas,
(iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se
seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG).
Las suspensiones de esporas a mutar se
obtuvieron a partir de slants con medio YpSs, cuya composición
es la siguiente: extracto de levadura 4 g/l, almidón soluble 15 g/l,
K_{2}HPO_{4} 1 g/l, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,5 g/l y agar
15 g/l, a un pH final de 5,8. Las esporas se resuspendieron
añadiendo 10 ml de una solución de Triton X-100 al
0,1% a cada slant. Los restos de micelio se eliminaron mediante
filtración a través de un filtro de nylon de 20 \mum de poro. La
concentración de esporas en la suspensión fue alrededor de 10^{6}
esporas/ml.
El procedimiento de mutación con EMS consistió
en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución de EMS al
3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente
durante 60 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor
del 99%. Las esporas mutadas se lavaron tres veces con Triton
X-100 al 0,1% centrifugando a 3.000 rpm y 15ºC
durante 2 minutos.
El procedimiento de mutación con NTG consistió
en la incubación de 10^{6} esporas/ml en una solución que
contenía 250 \mug/ml de NTG y tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 a
temperatura ambiente durante 30 minutos, consiguiendo tasas de
mortalidad de alrededor del 95%. Las esporas mutadas se lavaron tres
veces con Triton X-100 al 0,1% centrifugando a
3.000 rpm y 15ºC durante 2 minutos.
Con las esporas mutadas se sembraron placas
Petri que contenían medio sólido Sutter IV suplementado con Triton
X100 al 0,1%. La composición por litro del medio Sutter IV es la
siguiente: 40 g de glucosa, 4 g de L-asparragina,
10 g de KH_{2}PO_{4}, 40 ml de solución de microelementos 50x, y
30 g de Agar. La solución de microelementos 50x está compuesta por:
25 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,82 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O,
0,05 g/l de tiamina, 0,1 g/l de ácido cítrico, 0,075 g/l de
Fe(NO_{3})_{3}.9H_{2}O, 0,05 g/l de
ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0,17 g/l de MnSO_{4}.H_{2}O, 0,025g/l de
CuSO_{4}.5H_{2}O y 0,025 g/l de NaMoO_{4}.2H_{2}O. Las
placas sembradas se incubaron a 25ºC durante 4 días para obtener
colonias aisladas.
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Ejemplo
2
En este ejemplo se describen estrategias de
selección de cepas de B. trispora (-) superproductoras de
licopeno basadas en (i) la utilización de ácidos trispóricos y (ii)
la intensidad de color de la colonia. En la Figura 1 se muestra la
filogenia de las cepas de B. trispora (-) utilizadas en la
presente invención.
La selección de mutantes productores de licopeno
mediante la adición de ácidos trispóricos se realizó colocando
filtros estériles de unos 0,6 mm de diámetro, impregnados en ácidos
trispóricos, sobre las colonias obtenidas a partir de esporas
mutadas. Los ácidos trispóricos se obtuvieron mediante la extracción
del sobrenadante de un cultivo mixto de las cepas (+) y (-) de
B. trispora con un volumen de cloroformo después de
acidificar la muestra a pH 2. La fracción orgánica se extrajo con
un volumen de una solución de bicarbonato sódico al 4% y se recogió
la fase acuosa, la cual se acidificó para extraerla nuevamente con
cloroformo. Posteriormente el cloroformo se evaporó hasta sequedad
y el residuo enriquecido en ácidos trispóricos se disolvió en
etanol. Los ácidos trispóricos se cuantificaron midiendo la
absorbancia a 325 nm y asumiendo un coeficiente de absortividad de
70 ml x mg^{-1} x cm^{-1} (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL.,
Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114:1074-1082).
Los filtros estériles se incubaron en una
solución de 1,2 mg/ml de ácidos trispóricos en etanol y seguidamente
se dejaron secar a temperatura ambiente en condiciones estériles.
Posteriormente, los filtros se colocaron sobre las colonias
mutantes previamente crecidas durante 4 días a 25ºC. Las placas se
incubaron a 25ºC durante 3 días adicionales, observándose que los
mutantes productores de licopeno adquirían un color rojo intenso, a
diferencia de los productores de \beta-caroteno
cuyo color era naranja.
Aplicando este método con la cepa CMA3 (-) se
obtuvo el mutante LMA1 (-) (Figura 1), el cual podría presentar
alguna mutación en el gen caRP, el cual codifica para la
actividad enzimática licopeno ciclasa y, por tanto, en lugar de
producir \beta-caroteno, acumularía el licopeno
intermediario durante el proceso de fermentación de carotenoides.
Por lo tanto, la cepa LMA1 es capaz de producir licopeno sin
necesidad de adicionar inhibidores específicos de la actividad
licopeno ciclasa (Ejemplo 5).
La selección de mutantes productores de licopeno
en función de la intensidad de color de la colonia se realizó de la
siguiente forma: Se mutó la cepa CMA1 (productora de
\beta-caroteno; ver Figura 1) tal y como se indica
en el ejemplo 1. Las esporas mutadas se sembraron en placas de
medio sólido YEPDA (bacto-peptona 20 g/l, extracto
de levadura 10 g/l, glucosa 20 g/l y agar 20 g/l, a un pH final de
6,0), se incubaron a 25ºC durante 24 horas y seguidamente a 20ºC
durante 48-72 horas. Por último, se seleccionaron
aquellas colonias que poseían un color
amarillo-naranja más intenso que la cepa parental
CMA1 (-). De esta forma se aislaron 2 colonias con color
amarillo-naranja intenso (denominadas CMB1 (-) y
CMB2 (-)). Las cepas CMB1 y CMB2 podrían ser superproductoras de
licopeno en fermentaciones mixtas con adición de inhibidores
específicos de la actividad licopeno ciclasa (por ejemplo,
imidazol; ejemplo 4).
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Ejemplo
3
La selección de mutantes superproductores de
licopeno de B. trispora (+) se realizó a partir de esporas
mutadas tal y como se indica en el ejemplo 1. Dichas esporas se
sembraron en placas Petri que contenían medio sólido Sutter IV
suplementado con imidazol al 0,1% y se incubaron a 25ºC durante 7
días para obtener colonias aisladas. Seguida-mente,
una porción de cada una de las colonias se transfirió a una placa de
PDA en la que previamente se había sembrado B. trispora (-).
La distancia entre los puntos de siembra de las cepas (+) y (-)
debe ser de aproximadamente 2 cm. El nivel de producción de licopeno
en medio sólido se estima mediante la intensidad de coloración en
la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la
cepa (-). De esta forma se seleccionó la cepa B. trispora
CPA1 (+), la cual daba lugar a una mayor producción de licopeno en
cultivos mixtos sólidos con una serie de cepas (-). El nivel de
producción de la cepa B. trispora CPA1 (+) se analizó
posteriormente en cultivo mixto en medio líquido tal y como se
describe en los ejemplos 4 y 5. En el Esquema 3 se muestra la
filogenia de las cepas de B. trispora (+) utilizadas en la
presente invención.
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Ejemplo
4
Las cepas (+) y (-) de B. trispora
seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3 se
fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de
producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello,
se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición por
litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y pH ajustado a
6,3. La cepa B. trispora CPA1 (+) se sembró en matraces de
500 ml con 67 ml de medio a razón de 10^{3} esporas por ml. La
cepa B. trispora CMB2 (-) se sembró en matraces de 500 ml con
100 ml de medio a razón de 10^{4} esporas por ml. Ambos tipos de
inóculos se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 44 horas.
Una vez finalizada la incubación, se mezclaron
los inóculos de las cepas (+) y (-) en una relación 1/10 (v/v), y
con la mezcla se inocularon matraces de 250 ml con 20 ml de medio de
fermentación a razón de 4 ml de la mezcla de cepas por matraz.
Estos matraces se incubaron a 25ºC y 250 rpm durante
5-6 días. El medio de fermentación utilizado posee
la siguiente composición por litro: 44 g de harina de soja, 19 g de
harina de maíz, 5,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato
de tiamina, 100 ml de aceite vegetal y pH ajustado a 7,5. El medio
se repartió en matraces de 250 ml, los cuales se inocularon con el
20% de una mezcla de las cepas (+) y (-) de B. trispora.
Entre las 0 y las 36 horas de fermentación se añadió un inhibidor de
la actividad enzimática licopeno ciclasa con la finalidad de
bloquear la ruta biosintética a nivel de licopeno (por ejemplo, 0,75
mg/ml de imidazol). Los matraces se incubaron a 25ºC y 250 rpm
durante 6 días. Una vez concluida la fermentación, se preparó una
mezcla de caldo de fermentación, perlas de vidrio y cloruro de
metileno/metanol (1/1). El micelio de B. trispora se lisó
mediante agitación en vortex, liberando el licopeno intracelular. El
licopeno extraído con la mezcla de cloruro de metileno: metanol
(proporción 1:1) fue diluido en acetona. La concentración y pureza
del licopeno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida
HPLC en fase reversa.
El nivel de producción obtenido en
fermentaciones mixtas de las cepas B. trispora CPA1 (+) y
B. trispora CMB2 (-) fue de 3 g/l de licopeno en presencia
de imidazol (figura 1).
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Ejemplo
5
Las cepas de B. trispora LMA1 (-) y CPA1
(+) seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 1, 2 y 3
se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de
producción de licopeno en medio líquido y cultivo mixto. Para ello,
se prepararon inóculos de las cepas (+) y (-) y se realizó la
fermentación en matraz tal y como se indica en el ejemplo 4. La
diferencia es que en este caso no se adicionó el compuesto químico
inhibidor de la actividad licopeno ciclasa. Una vez concluida la
fermentación se realizó la valoración del licopeno producido tal y
como se describe en el ejemplo 4.
Los niveles de producción obtenidos mediante
fermentación mixta de las cepas B. trispora CPA1 (+) y B.
trispora LMA1 (-) fueron de 1,2 g/l de licopeno en ausencia de
imidazol (figura 2).
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Ejemplo
6
Las cepas CPA1 (+) y CMB2 (-) de B.
trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2
y 3 se cultivaron en fermentador pre-industrial con
la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno. Para
ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente composición
por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina y su pH ajustado
a 6,3. Las cepas (+) y (-) se sembraron separadamente en matraces
de 2000 ml con 500 ml de medio y se incubaron a 25ºC y 250 rpm
durante 44-48 horas.
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque
intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición
por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de
KH_{2}PO_{4}; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de
antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante
36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una
proporción 1/10 y con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base
de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g
de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de
KH_{2}PO_{4}, 3,36 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,184 g de
NaH_{2}PO_{4,} 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de
aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a
7,5. La fermentación se incubó durante 100-140
horas a una temperatura de 25-28ºC con agitación
variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de
1-1,5 v/v/m. Entre las 25 y 35 horas de
fermentación se adicionó imidazol estéril a una concentración final
del 0,75 g/l.
La valoración de la concentración y pureza del
licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se
describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno
obtenido en una serie de fermentaciones diferentes de las cepas
CPA1 (+) y CMB2 (-) fue de 3,4 g/l (figura 2).
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Ejemplo
7
Las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) de B.
trispora seleccionadas tal y como se describe en los ejemplos 2
y 3 se cultivaron en fermentador pre-industrial con
la finalidad de determinar el nivel de producción de licopeno sin
adición de inhibidores de la actividad enzimática licopeno
ciclasa. Para ello, se preparó un medio de inóculo con la siguiente
composición por litro: 23 g de harina de soja, 47 g de harina de
maíz, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,002 g de clorhidrato de tiamina
y su pH ajustado a 6,3. La cepas (+) y (-) se sembraron
separadamente en matraces de 2000 ml con 500 ml de medio y se
incubaron a 25ºC y 250 rpm durante 44-48 horas.
Cada una de las cepas se transfirió a un tanque
intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición
por litro es: 29 g de Pharmamedia, 47 g de harina de maíz, 0,5 g de
KH_{2}PO_{4}; 0,002 g de clorhidrato de tiamina y 1 g de
antiespuma, y su pH ajustado a 6,0. Tras incubar durante
36-48 h, se mezclaron las cepas (+) y (-) en una
proporción 1/10 y, con un 20% de la mezcla, se sembró el medio base
de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente: 44 g
de harina de soja, 19,25 g harina de maíz, 0,55 g de
KH_{2}PO_{4}, 3,36 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,184 g de
NaH_{2}PO_{4,} 0,0022 g de clorhidrato de tiamina, 100 g de
aceite vegetal y 0,175 g de antiespuma, y su pH inicial ajustado a
7,5. La fermentación se incubó durante 100-140
horas a una temperatura de 25-28ºC con agitación
variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de
1-1,5 v/v/m.
La valoración de la concentración y pureza del
licopeno al final de la fermentación se realizó tal y como se
describe en el ejemplo 4. El valor medio de producción de licopeno
obtenido sin adición de imidazol en una serie de fermentaciones
diferentes de las cepas CPA1 (+) y LMA1 (-) fue de 1,6 g/l (figura
2).
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Ejemplo
8
Se cosecharon 3 litros de caldo fermentación
correspondiente a un proceso de biosíntesis en el cual la ruta
biosintética estaba interrumpida a nivel de licopeno. La
concentración del caldo fue de 3 g de licopeno por litro. La
biomasa de este caldo se recuperó mediante filtración por buchner
(filtro-embudo de porcelana que soporta un disco de
papel o cartulina que ejerce de lámina filtrante), obteniendo 750 g
de biomasa húmeda. La biomasa húmeda se resuspendió en 5,2 l de
isopropanol aceótropo 85/15 y se agitó durante 30 minutos a 45+5ºC.
La biomasa purificada se volvió a recuperar mediante buchner. Esta
biomasa se secó en estufa bajo vacío a temperatura inferior a
45\pm5ºC y en un tiempo de 18 horas, hasta que el contenido en
disolventes residuales/agua fue inferior al 8%. Se obtuvieron 150 g
de biomasa seca y purificada con un contenido de licopeno
equivalente a una riqueza del 5,5%. La biomasa seca se molió en
molino de martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la
misma riqueza específica y acondicionado para permitir la extracción
con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 150 g de
biomasa molida con 2500 ml de acetato de isobutilo a 70\pm5ºC,
manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separó la biomasa
agotada del disolvente rico en licopeno filtrando por placa
filtrante. La biomasa agotada se lavó con 300 ml de acetato de
isobutilo caliente sobre el propio filtro, mezclando el disolvente
de lavado con el filtrado. El total de acetato de isobutilo rico en
licopeno se concentró bajo vacío y manteniéndose la temperatura por
debajo de 45\pm5ºC hasta reducir el volumen a 300 ml, con lo que
cristalizó en parte el licopeno. Para completar la cristalización y
obtener un licopeno más puro, se añadieron 900 ml de isopropanol.
La mezcla se mantuvo en agitación entre 0-5ºC y
bajo nitrógeno durante 3 horas. Se filtró por buchner, lavando los
cristales con 25 ml de isopropanol sobre el buchner. Se recogieron
los cristales y se secaron a vacío, obteniéndose 6,5 g de cristales
de licopeno con una pureza espectrofotométrica del 95%. Por
HPLC no se detectó la presencia de otros carotenoides ni de cis
licopeno.
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Ejemplo
9
(No forma parte de la
invención)
En un molino de bolas de laboratorio tipo
Minizeta 003 de Netzsch se cargaron, por este orden, microesferas
de 0,5-0,75 mm de diámetro, 23,5 g de aceite de
girasol (Koipe), 0,065 g de
D,L-alfa-tocoferol (Merck) y los
6,5 g de licopeno cristalino obtenidos según se describe en el
ejemplo 8. La mezcla se molió a 3000 rpm durante 5 minutos,
obteniendo 25 g un líquido viscoso de color rojo púrpura intenso. El
análisis espectrofotométrico de la suspensión oleosa puso de
manifiesto un contenido en licopeno del 21%. Por HPLC no se detectó
la presencia de otros carotenoides ni de isómeros cis de licopeno.
El tamaño del cristal fue inferior a 10 micras.
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Ejemplo
10
(No forma parte de la
invención)
Se mezclaron directamente 1500 l de caldo de
fermentación de licopeno (potencia en licopeno 2,3 g/l) con 4500
litros de aceótropo isopropanol/agua 85/15. Después de mantener en
agitación durante 30 min a 45\pm5ºC se procedió a separar la
biomasa del líquido empleando un decanter centrífugo. Se recogieron
del orden de 250 Kg de biomasa húmeda purificada.
Esta biomasa empapada de agua e isopropanol se
secó en secadero rotativo bajo vacío hasta un contenido en
disolventes residuales/agua inferior al 8%. La temperatura de secado
fue 45\pm5ºC, y el tiempo medio de residencia en el secadero de
14 horas. Se obtuvieron 85 Kg de biomasa seca con un contenido en
licopeno equivalente a una riqueza específica del 3,75%.
La biomasa seca se extrusionó en un compactador
Hutt-Compacktor de BEPEX, obteniendo un sólido con
la misma riqueza específica y acondicionado para permitir la
extracción con el disolvente.
La extracción se efectuó mezclando los 85 Kg de
sólido molido con 1650 l de acetato de isobutilo. La mezcla se
calentó en línea a 60\pm5ºC durante un tiempo medio aproximado de
contacto de 2 minutos y se separó la biomasa agotada del disolvente
rico en licopeno mediante un decanter centrífugo. El total de
acetato de isobutilo rico en licopeno se concentró bajo vacío y
manteniendo la temperatura por debajo de 45\pm5ºC hasta reducir
el volumen a 100 l, con lo que cristalizó en parte el licopeno. Para
completar la cristalización del licopeno se añadieron 300 l de
isopropanol. Se mantuvo la mezcla en agitación durante 3 h a
0-5ºC. Se filtró por un Buchner, recogiendo los
cristales de licopeno, que se secaron a vacío y temperatura
ambiente. Se obtuvieron 2 Kg de producto con una pureza de 96% por
espectrometría. Por HPLC no se detectó la presencia de otros
carotenoides ni de isómeros cis.
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Ejemplo
11
(No forma parte de la
invención)
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se
describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 ml de acetato de
isobutilo y se adicionaron 0,35 g de
D,L-alfa-tocoferol (Merck). La
mezcla se calentó a ebullición (114ºC) durante 5 minutos,
comprobando la disolución global del licopeno. Paralelamente se
disolvieron 12 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y
12 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 ml de agua
desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó durante 5
minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador
Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 1,2
micras, medido con un analizador Coulter LS230. La emulsión se
transfirió a un sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600
ml de agua, con lo que se evaporaron los 410 ml de acetato de
isobutilo con aproximadamente 700 ml de agua. Se obtuvieron 203 g de
formulación líquida (12,75% de materia seca) con un contenido en
licopeno del 1,25% (9,8% referido a masa seca). Por HPLC se detectó
un contenido en cis licopeno del 23,3%, no detectándose la presencia
de otros carotenoides. Esta formulación líquida se atomizó en un
atomizador de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el
gas a la entrada de 190ºC y a la salida de 90ºC, obteniendo un
polvo de color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 8,4%
y una humedad del 6,5%. Por HPLC se detectó un contenido en cis
licopeno del 23%, no detectándose la presencia de otros
carotenoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
(No forma parte de la
invención)
3,5 gramos de licopeno obtenido tal y como se
describe en el ejemplo 10 se resuspendieron en 410 ml de acetato de
isobutilo y se adicionaron 0,35 g de
D,L-alfa-tocoferol (Merck), 0,7 g de
palmitato de ascorbilo (Merck) y 3,5 g de aceite de girasol
(Koipe). La mezcla se calentó a ebullición (114ºC) durante 5
minutos, comprobando la disolución global del licopeno. Al mismo
tiempo se disolvieron 10 g de Hi-Cap 100 (National
Starch) y 10 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 325 ml de
agua desmineralizada. La fase orgánica caliente se emulsionó
durante 5 minutos en una etapa sobre la fase acuosa utilizando un
emulsionador Ultraturrax de IKA, alcanzando un tamaño medio de
micela de 1,4 micras, medido con un analizador Coulter LS230. La
emulsión se transfirió a un sistema de destilación bajo vacío,
adicionando 600 ml de agua, con lo que se evaporaron los 410 ml de
acetato de isobutilo con aproximadamente 700 ml de agua. Se
obtuvieron 195 g de formulación líquida (13,25% de materia seca)
con un contenido en licopeno del 1,3% (9,8% referido a masa seca).
Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno del 25%, no
detectándose la presencia de otros carotenoides. Esta formulación
líquida se atomizó en un atomizador de laboratorio Büchi 190,
empleando una temperatura en el gas a la entrada de 190ºC y a la
salida de 90ºC, obteniendo un polvo de color rojo intenso, con un
contenido en licopeno del 8,5% y una humedad del 6,0%. Por HPLC se
detectó un contenido en cis licopeno del 24,5%, no detectándose la
presencia de otros carotenoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
(No forma parte de la
invención)
7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se
describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 ml de
diclorometano, adicionando 0,75 g de
D,L-alfa-Tocoferol (Merck),
calentando la mezcla a 35ºC durante 5 minutos. Al mismo tiempo se
disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y
27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 ml de agua
destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 15 minutos en una
etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax
de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,4 micras, medido
con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un
sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con
lo que se evaporaron los 500 ml de diclorometano con aproximadamente
600 ml de agua. Se obtuvieron 400 g de formulación líquida (13,1%
de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,5% (11,5%
referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis
licopeno del 6,5%, no detectándose la presencia de otros
carotenoides. Esta formulación líquida se atomizó en un atomizador
de laboratorio Büchi 190, empleando una temperatura en el gas a la
entrada de 190ºC y a la salida de 90ºC, obteniendo un polvo de color
rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,6% y con una
humedad del 5,3%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno
del 6,4%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
(No forma parte de la
invención)
7,5 g de licopeno cristalino obtenido según se
describe en el ejemplo 10, se resuspendieron en 500 ml de
diclorometano, adicionando 0,75 g de
D,L-alfa-Tocoferol (Merck),
calentando la mezcla a 35ºC durante 5 minutos Al mismo tiempo se
disolvieron 27 g de Hi-Cap 100 (National Starch) y
27 g de Purity Gum 2000® (National Starch) en 400 ml de agua
destilada. La fase orgánica se emulsionó durante 60 minutos en una
etapa sobre la fase acuosa utilizando un emulsionador Ultraturrax
de IKA, alcanzando un tamaño medio de micela de 0,23 micras, medido
con un analizador Coulter LS230. La emulsión se transfirió a un
sistema de destilación bajo vacío, adicionando 600 ml de agua, con
lo que se evaporaron los 500 ml de diclorometano con aproximadamente
650 ml de agua. Se obtuvieron 350 g de formulación líquida (14,4%
de materia seca) con un contenido en licopeno del 1,6% (11,4%
referido a masa seca). Por HPLC se detectó un contenido en cis
licopeno del 20%, no detectándose la presencia de otros
carotenoides. Esta formulación líquida se liofilizó en un equipo de
laboratorio durante 24 horas, obteniendo un polvo esponjoso de
color rojo intenso, con un contenido en licopeno del 10,7% y con una
humedad del 7,4%. Por HPLC se detectó un contenido en cis licopeno
del 15%, no detectándose la presencia de otros carotenoides.
Figura 1. Producción de licopeno mediante
fermentación mixta en matraz de la cepa B. trispora CPA1(+)
con cada una de las siguientes cepas de B. trispora (-): L25,
CMA1, CMA2, CMA3, CMA4, CMB1, CMB2 y LMA1. Salvo en la fermentación
mixta CPA1 (+)/LMA1 (-), en el resto se adicionó imidazol como
inhibidor de la actividad enzimática licopeno ciclasa. Eje de
ordenadas: % sobre producción cepa control L25 (-) (VKPM
F-744).
Figura 2. Producción de licopeno mediante
fermentación mixta en fermentador de la cepa B. trispora
CPA1(+) con cada una de las siguientes cepas de B. trispora
(-): L25, CMA1, CMA2, CMA3, CMB1, CMB2 y LMA1. Salvo en la
fermentación mixta CPA1 (+)/LMA1 (-), en el resto se adicionó
imidazol como inhibidor de la actividad enzimática licopeno
ciclasa. Eje de ordenadas: % sobre producción cepa control L25 (-)
(VKPM F-744).
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La lista de referencias citadas por el
solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran
cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
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1. Proceso de producción de formulaciones de
licopeno a partir de fuentes biosintéticas, que comprende las
siguientes etapas en sucesión:
- a.
- Mezclar, en un medio de cultivo para la producción de licopeno, cepas de superproducción de licopeno (+) y (-) de Blakeslea trispora que consisten, en cepas CPA 1(+) y LMA 1(-) respectivamente, donde LMA 1 (-) se obtiene por mutación de la cepa VKPM F-744 (-) con etilmetano sulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) en sucesión, además de la adición de ácidos trispóricos a los mutantes obtenidos y selección de las colonias de color rojo; y CPA 1 (+) se obtiene por mutación de VKPM F-816 (+) con etilmetano sulfonato (EMS) y selección de mutantes cultivándolos en medio sólido complementado con imidazol, transferencia a una placa en la que se ha sembrado previamente B. trispora (-) y selección mediante la intensidad de la coloración de la colonia en la zona de intersección de la colonia de la cepa (+) con la de la cepa (-).
- b.
- Tratamiento de la biomasa del medio de cultivo de la etapa a) con un alcohol seleccionado entre: metanol, etanol, propanol o isopropanol y separación de una biomasa húmeda purificada.
- c.
- Acondicionamiento de biomasa húmeda purificada mediante secado y disgregación o ruptura.
- d.
- Extracción en sólido-líquido del licopeno contenido en la biomasa purificada con un disolvente orgánico de calidad alimentaria.
- e.
- Concentración del extracto de licopeno enriquecido.
- f.
- Precipitación/cristalización del licopeno a partir del extracto concentrado mediante la adición de un alcohol, seleccionado entre: metanol, etanol, propanol o isopropanol.
- g.
- Filtración de los cristales de las aguas de cristalización y secado, dando lugar a cristales de licopeno.
- h.
- Formulación de licopeno.
2. Proceso, según la reivindicación 1,
caracterizado por que la etapa b) se realiza separando
previamente la biomasa del medio de cultivo y resuspendiendo de
nuevo dicha biomasa en el alcohol, con una proporción de
alcohol/biomasa de 1 ml/g a 10 ml/g.
3. Proceso, según la reivindicación 1,
caracterizado por que el alcohol utilizado en la etapa b. se
usa a una temperatura entre 0ºC y la correspondiente a su punto de
ebullición respectivo en dicha etapa b.
4. Proceso, según la reivindicación 3,
caracterizado por que el alcohol se usa a una temperatura
entre 10ºC y 50ºC.
5. Proceso, según la reivindicación 1,
caracterizado por que la etapa b) se realiza directamente
mezclando el medio de cultivo de fermentación que contiene la
biomasa sin separar previamente, en el alcohol, con una proporción
de medio de cultivo/alcohol entre 1/0,5 y 1/5 y a una temperatura
entre la temperatura ambiente y el punto de ebullición
correspondiente de la mezcla.
6. Proceso, según la reivindicación 5,
caracterizado por que la proporción entre medio de
cultivo/alcohol está entre 1/1 y 1/3.
7. Proceso, según la reivindicación 5,
caracterizado por que la temperatura está entre la
temperatura ambiente y 60ºC.
8. Proceso, según la reivindicación 1,
caracterizado por que el disolvente usado en la etapa d) es
un éster.
9. Proceso, según la reivindicación 8,
caracterizado por que el disolvente de tipo éster se
selecciona entre: acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de
isopropilo, acetato de butilo o acetato de isobutilo.
10. Proceso, según la reivindicación 9,
caracterizado por que la cantidad de disolvente añadida en la
etapa d) varía de 5 a 30 ml por g de la biomasa resultante en la
etapa c.
11. Proceso, según la reivindicación 1,
caracterizado por que la precipitación/cristalización del
licopeno se realiza añadiendo un alcohol en el que la solubilidad
del licopeno es muy baja, y que garantiza que las sustancias de
carácter lipófilo adjuntas al licopeno permanezcan disueltas, tal
como metanol, etanol, propanol o isopropanol.
12. Proceso, según la reivindicación 1, en el
que la etapa de formulación h) comprende la preparación de licopeno
dispersable en agua fría (CWD), por medio de un proceso que
comprende las siguientes etapas:
- i)
- Se disuelven cristales de licopeno de la etapa g) en disolventes orgánicos, junto con un antioxidante, ajustando la relación temperatura/tiempo con el fin de controlar el porcentaje de licopeno cis en la formulación de licopeno CWD final.
- ii)
- La disolución del licopeno de la etapa i) se emulsiona o micro-encapsula en una solución acuosa de almidones modificados.
- iii)
- Los disolventes y parte del agua se eliminan por evaporación, obteniendo la formulación líquida.
- iv)
- Secado y terminación.
13. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que cuando el disolvente empleado en la
etapa i) es cloruro de metileno, la temperatura varía entre
20-35ºC durante un tiempo comprendido entre 1 y 15
minutos.
14. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que cuando el disolvente empleado en la
etapa i) es acetato de isobutilo, la temperatura utilizada es de
114ºC durante un tiempo de 5 minutos.
15. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que uno o una mezcla de antioxidantes son
usados en la etapa i), en una proporción entre el
1-30% con respecto al peso del licopeno.
16. Proceso, según la reivindicación 15,
caracterizado por que el antioxidante usado es de tipo
tocoferol o palmitato de ascorbilo.
17. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que un aceite vegetal puede ser también
añadido en la etapa i).
18. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que los almidones modificados usados en la
etapa ii) están en forma de ésteres.
19. Proceso, según la reivindicación 18,
caracterizado por que los almidones modificados usados en la
etapa ii) están en forma de ésteres de octenil succinato.
20. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que el secado de la formulación líquida
realizado en la etapa iv) se somete a un proceso seleccionado
entre: atomización mediante pulverización a alta temperatura,
granulación mediante pulverización sobre un lecho fluidizado a
temperatura relativamente baja o secado mediante congelación.
21. Proceso, según la reivindicación 20,
caracterizado por que el proceso de atomización mediante
pulverización a alta temperatura comprende además una etapa de
aglomeración mediante pulverización de una solución de uno de los
almidones modificados usados en la formulación, o la propia
suspensión de licopeno microencapsulado, dentro de un lecho
fluidizado de dicho producto atomizado con el fin de aumentar el
tamaño de las partículas, reducir el área disponible y aumentar la
resistencia a oxidación del producto.
22. Proceso, según la reivindicación 20,
caracterizado por que el proceso de granulación mediante
pulverización sobre un lecho fluidizado comprende pulverizar una
suspensión de licopeno microencapsulado sobre un material de
siembra.
23. Proceso, según la reivindicación 22,
caracterizado por que el material de siembra es un material
inerte.
24. Proceso, según la reivindicación 22,
caracterizado por que el material de siembra son partículas
de azúcar o polvo fino de material granulado previamente.
25. Proceso, según la reivindicación 12,
caracterizado por que la terminación realizada en la etapa
iv) consiste en revestir las partículas con soluciones acuosas de
azúcares o almidones modificados en una proporción del
0,5-10%.
26. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que la etapa de formulación h.
consiste en la formación de una suspensión
micro-cristalina de licopeno premezclando cristales
de licopeno obtenidos en la etapa g. con antioxidantes y aceites
vegetales en proporciones adecuadas, seguido de molienda.
27. Proceso según la reivindicación 26, en el
que el aceite usado es de origen vegetal, preferiblemente
seleccionado entre aceite de girasol, oliva, maíz, semilla de
algodón o soja.
28. Proceso según las reivindicaciones 26 a 27,
caracterizado por que se usan antioxidantes liposolubles,
preferiblemente tocoferoles naturales, en una proporción del 0,2 al
15%, preferiblemente del 0,5-5% con respecto al
peso del licopeno en la mezcla.