MX2014012015A - Vacuna de combinacion contra circovirus porcino/mycoplasma hyopneumoniae. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente que incluye una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) lgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina.

Description

VACUNA DE COMBINACIÓN CONTRA CIRCOVIRUS PORCmOIMYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al circovirus porcino y Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae o M.hyo). Más particularmente, la invención se refiere a una composición inmunogénica multivalente que incluye una porción soluble de una preparación de células enteras de M.hyo, un antígeno de PCV2 y a su uso en una vacuna para proteger a los cerdos contra al menos la neumonía enzoótica y el síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La neumonía enzoótica en cerdos, también denominada neumonía por micoplasma, está producida por M.hyo. La enfermedad es una enfermedad crónica no mortal que afecta a cerdos de todas las edades. Los cerdos infectados solo muestran síntomas leves de tos y fiebre, pero la enfermedad tiene un impacto económico significativo debido a la menor eficiencia del alimento y a la reducción de la ganancia de peso. La neumonía enzoótica se transmite entre cerdos a través de las vías nasales mediante organismos de transmisión aérea expelidos por los pulmones de cerdos infectados. Tras la infección primaria mediante M.hyo se puede producir una infección secundaria por otras especie de micoplasma {Mycoplasma hyorhinis y Mycoplasma flocculare), así como por otros patógenos bacterianos.

M.hyo es un pequeño microbio procariota capaz de tener una existencia viva libre, aunque a menudo se encuentra asociado con células eucariotas porque tiene requisitos absolutos de esteróles exógenos y ácidos grasos. Estos requisitos generalmente requieren crecimiento en medio con suero. M.hyo está rodeada por una membrana celular, pero no por una pared celular.

La asociación física de micoplasmas con la superficie de la célula huésped es la base del desarrollo y la persistencia de la neumonía enzoótica. M.hyo infecta las vías respiratorias de los cerdos, colonizando la tráquea, los bronquios y los bronquiolos. El micoplasma produce un factor ciliostático que los cilios que revisten las vías respiratorias dejen de moverse. En última instancia, los cilios degeneran, dejando al cerdo susceptible a la infección por patógenos secundarios. En los animales infectados se observan lesiones características de áreas de consolidación de color morado a gris. Las necropsias de animales sacrificados relevaron lesiones en 30-80% de los cerdos. Los resultados de 37 piaras en 13 estados indicaron que el 99% de las piaras tenían cerdos con lesiones por neumonía típicas de la neumonía enzoótica. Por tanto, la necesidad de disponer de medidas preventivas y terapéuticas eficaces es grande.

Los antibióticos tales como tiamulina, trimetoprima, tetraciclinas y lincomicina tienen algún beneficio pero son caros y requieren un uso prolongado. Adicionalmente, no se ha demostrado que los antibióticos eliminen con eficacia la diseminación o reinfección de M.hyo. A veces es posible prevenir manteniendo las piaras libres de patógenos pero a menudo se produce reintroducción de M.hyo. Debido a las serias consecuencias económicas de la neumonía porcina se han buscado vacunas contra M.hyo. Se han comercializado vacunas que contienen preparaciones de organismos de micoplasma cultivados en medio que contiene suero,, pero plantean problemas con respecto a reacciones adversas inducidas por los componentes del suero (tales como inmunocomplejos o proteínas específicas no inmunogénicas) presentes en el material inmunizante. Otros intentos para proporcionar vacunas frente a M. hyo han tenido éxito, pero la enfermedad sigue estando extendida.

M.hyo y el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) son los dos patógenos más prevalentes que se encuentran en la industria porcina. Los cerdos infectados con PCV2 exhiben un síndrome habitualmente denominado síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS). El PMWS se caracteriza clínicamente por emaciación, palidez de la piel, mal estado, dificultad respiratoria, diarrea, subictericia e ictericia. Además del PMWS, el PCV2 se ha asociado con otras varias infecciones, incluidas seudorrabia, síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS), enfermedad de Glasser, meningitis estreptocócica, salmonelosis, colibacilosis posdestete, hepatosis dietética y bronconeumonía supurativa. M. hyo está asociada con neumonía enzoótica y también se ha implicado cono uno de los principales cofactores en el desarrollo de la enfermedad porcina asociada con circovirus (PCVAD).

El síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS) está producido por un arterivirus, que tiene afinidad particular pos los macrófagos, particularmente los que se encuentran en los pulmones (macrófagos alveolares). Estos macrófagos ingieren y eliminan las bacterias y virus invasores, pero no en el caso del virus del PRRS (VSRRP). En el caso del virus del PRRS, éste se multiplica dentro de los macrófagos y produce más virus y mata los macrófagos. Una vez que el PRRSV ha entrado en una piara, tiende a quedarse y estar activo de forma indefinida. Destruye hasta el 40% de los macrófagos, lo que permite que las bacterias y otros virus proliferen y produzcan daños. Un ejemplo habitual de esto es el marcado incremento de la gravedad de la neumonía enzoótica en unidades en crecimiento/finalización cuando se infectan con el virus del PRRS. Más de la mitad de los cerdos negativos para el PRRS en edad de destete se infectan antes de llegar al mercado.

Lo que se necesita es una vacuna de combinación de PCV2/M.hyocontra la infección por PCV2 y mycoplasma en cerdos. Preferentemente, esta vacuna multivalente será compatible con otros antígenos porcinos, tales como el antígeno del virus del SRRP. Sería muy deseable proporcionar una vacuna combinada de M.hyo/PCV2 en un frasco una sola dosis lista para usar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente que incluye una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina. En un aspecto, la porción soluble de la preparación de células enteras de M.hyo se ha tratado con proteína A o con proteína G antes de ser añadida a la composición inmunogénica. En un aspecto adicional, la composición está en forma de una composición líquida lista para usar.

En una realización, la porción soluble de la preparación de M.hyo incluye al menos un antígeno proteico de M. hyo. En otra realización, la porción soluble de la preparación de M.hyo incluye dos o más antígenos proteicos de M. hyo.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención produce una respuesta inmunitaria protectora contra M. hyo y PCV2. En una realización, el antígeno del PCV2 está en forma de un circovirus quimérico de tipo 1 y de tipo 2, en el que el virus quimérico incluye un circovirus porcino de tipo 1 recombinante inactivado que expresa la proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2. En otra realización, el antígeno del PCV2 está en forma de una proteína ORF2 recombinante. En otra realización más, la proteína 0RF2 recombinante se expresa en un vector baculovirus.

En algunas realizaciones, la composición PCV2/M.hyo de la presente invención incluye además al menos un antígeno adicional. En una realización, el al menos un antígeno adicional es protector contra un microorganismo que puede producir la enfermedad en cerdos.

En una realización, el microorganismo incluye bacterias, virus o protozoos. En otra realización, el microorganismo se selecciona de, entre otros, los siguientes: virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), parvovirus porcino (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, ActinobacilHus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bacterias leptospira, Lawsonia intracellularis, virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), rotavirus, virus Torque teño (VTT), citomegalovirus porcino, enterovirus porcinos, virus de la encefalomiocarditis, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, fiebre porcina clásica (FPC) y un patógeno causante de la gastroenteritis transmisible porcina o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención incluye además adyuvante. En una realización, el adyuvante se selecciona de, entre otros, los siguientes: un adyuvante de aceite en agua, un adyuvante de polímero y agua, un adyuvante de agua en aceite, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un adyuvante de vitamina E y combinaciones de los mismos. En otra realización, la composición de la presente invención incluye además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, la composición de la presente invención produce una respuesta inmunitaria protectora contra M. hyo y PCV2 cuando se administra como una administración de una sola dosis. En realizaciones adicionales, la composición produce una respuesta inmunitaria protectora contra M. hyo, PCV2 y al menos un microorganismo adicional que puede producir enfermedad en cerdos cuando se administra como una administración de una sola dosis. En otras realizaciones más, una composición de la presente invención produce una respuesta protectora contra M. hyo y PCV2 cuando se administra como una administración de dos dosis.

La presente invención también proporciona un procedimiento de inmunizar un cerdo contra . hyo y PCV2. Este procedimiento incluye administrar al cerdo una composición inmunogénica que incluye una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) y un antígeno del virus del SRRP, en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina. En una realización, la porción soluble de la preparación de M. hyo de la composición administrada incluye al menos un antígeno proteico de M. hyo.

En una realización del procedimiento de la presente invención, la composición se administra por vía intramuscular, intradérmica, transdérmica o subcutánea. En otra realización del procedimiento de la presente invención, la composición se administra en una sola dosis. En otra realización más del procedimiento de la presente invención, la composición se administra en dos dosis.

En una realización adicional del procedimiento de la presente invención, la composición de PCV2/M.hyo se administra junto con al menos un antígeno adicional que es protector contra un microorganismo que puede producir enfermedad en cerdos, tal como uno o más de los microorganismos descritos anteriormente. Dichos otros antígenos se pueden administrar de forma concurrente con la composición de PCV2/M.hyo (es decir, como vacunas únicas separadas) o combinados en una vacuna lista para usar.

En una realización adicional, la composición se administra a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra al menos uno de M. hyo y PCV2. En otra realización adicional, la composición se administra a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra M. hyo y PCV2.

En una realización, la composición se administra a cerdos de 3 semanas de edad o mayores.

La presente invención también proporciona un kit. Este kit contene un frasco que incluyee una composición inmunogénica. La composición inmunogénica incluye un antígeno de PCV2 Y la porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), en la que la porción soluble de la preparación de .hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmuncomplejos antígeno / inmunoglobulina. En una realización, este kit incluye además un manual de instrucciones que contiene la información para administrar la composición inmunogénica. En otra realización, la composición inmunogénica del frasco se proporciona como una composición líquida lista para usar.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica. Este procedimiento incluye: i) cultivar M. hyo en un medio adecuado durante periodos que varían de 18 a 144 horas; ii) inactivar después el cultivo de M. hyo; iii) recoger el fluido del cultivo ¡nactivado, en el que el fluido del cultivo inactivado comprende una preparación de células enteras de M. hyo que comprende una fracción líquida soluble y material celular insoluble; iv) separar la fracción líquida soluble del material celular insoluble; y v) eliminar sustancialmente la IgG y los inmunocomplejos antígeno / inmunoglobulina de la fracción de líquido soluble separada para formar una porción soluble de la preparación de células enteras de M. hyo, y vi) combinar después la porción soluble de la preparación de células enteras de M. hyo con un antígeno del PCV2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un gráfico que muestra la eficacia de las vacunas monovalentes contra M. hyo preparadas con antígenos de M. hyo de diferentes tratamientos (T02-T10 descritos en el Ejemplo 3) frente a un placebo (T01). Los resultados se presentan como el% de los valores medios por mínimos cuadrados de la lesión pulmonar.

La Figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de potencia del antígeno del PCV2 (ELISA del antígeno del PCV2) de las vacunas contra M. hyo en combinación con virus quiméricos de PCV de tipo 1 -tipo 2 muertos. El virus quimérico se incluyó en las composiciones a un nivel inicial de aproximadamente 1.6 = RP. El estado de cada muestra se expresa como potencia relativa (PR).

La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de viremia del PCV2 (PCR cuantitativa del PCV2) observados con las formulaciones de la vacuna contra PCV/M hyo que usa diferentes plataformas adyuvantes.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados serológicos del ELISA (S/P) de anticuerpos frente al PCV2 observados con las formulaciones de la vacuna contra PCV/M hyo que usan diferentes plataformas adyuvantes los días 1 , 20 y 42 de la exposición..

La Figura 5 es un gráfico que muestra la diseminación en heces del PCV2 obtenida con los tratamientos T02-T10 descritos en el Ejemplo 7 frente a un placebo (T01 ). Los resultados se expresan como copias de ADN del PCV2/ml.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la eliminación nasal del PCV2 obtenida con los tratamientos T02-T10 descritos en el Ejemplo 7 frente al placebo (T01). Los resultados se expresan como copias de ADN del PCV2/ml.

Las Figuras 7A y 7B son gráficos que muestran los resultados de una prueba con interferón gamma (IFN-?) que mide las respuestas inmunitarias celulares (IMC) específicas del PCV2. Los resultados posteriores a la vacunación / previos a la exposición se presentan en la Figura 7A, y los resultados posteriores a la vacunación / posteriores a la exposición se presentan en la Figura 7B. La estimulación de 5 x 06 células se consideró significativa.

La Figura 8 y la Tabla A representan la eficacia de M. hyo de las formulaciones para la vacuna experimental contra PCV2/M. hyo en SP-aceite. Las puntuaciones en los pulmones de las formulaciones que usan los tratamientos de M. hyo T02-T08 se representan gráficamente en la Figura 8.

La Figura 9 es un diagrama de flujo que muestra una realización de un procedimiento de fabricación usado para preparar una proteína A compatible con PCV2 tratada con el antígeno del M. hyo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es una realización de una secuencia nucleotídica que codifica p46 de la cepa P-5722 de M.hyo; La SEQ ID NO: 2 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente a p46 de la cepa P-5722 de M.hyo; La SEQ ID NO: 3 es una realización de una secuencia nucleotídica que codifica p97 de la cepa P-5722 de M.hyo; La SEQ ID NO: 4 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente a p97 de la cepa P-5722 de M. hyo; La SEQ ID NO: 5 es una realización de una secuencia genómica que codifica un virus PCV1-2 quimérico.

La SEQ ID NO: 6 es una realización de una secuencia nucleotídica correspondiente a ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 7 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido de ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 8 es una realización de una secuencia genómica que codifica un virus PCV1-2 quimérico.

La SEQ ID NO: 9 es una realización de una secuencia nucleotídica correspondiente a ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 10 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido de ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 11 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido de ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 12 es una realización de una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 ; La SEQ ID NO: 13 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido de ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 14 es una realización de una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; La SEQ ID NO: 15 es una realización de una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido de ORF2 de un circovirus porcino; La SEQ ID NO: 16 es una realización de una secuencia genómica de una forma no virulenta del aislado del virus del SRRP de Norteamérica designado P129; y La SEQ ID NO: 17 es una realización de una secuencia nucleotídica correspondiente a ORF2 - ORF5 del aislado del virus del SRRP designado ISU-55.

La SEQ ID NO: 18 es una realización de una secuencia nucleotídica correspondiente a ORF6 y ORF7 del aislado del virus del SRRP designado ISU-55.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente que incluye una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina. En una realización, la composición produce una respuesta inmunitaria protectora en un cerdo contra PCV2 y M.hyo.

Los solicitantes han descubierto, sorprendentemente, que la fracción insoluble de la preparación de células enteras de M. hyo es no inmunogénica. Por el contrario, la preparación soluble de M. hyo sin IgG es inmunogénica y pueden combinarse con eficacia con antígenos de otros patógenos, tales como PCV2, sin interferencias analíticas o inmunológicas entre los antígenos. Esto hace que la preparación soluble de M. hyo sea una plataforma eficaz para vacunas multivalentes, incluidas las formulaciones listas para usar en un frasco. Los solicitantes también han descubierto sorprendentemente que eliminando la inmunoglobulina y los residuos celulares insolubles de la preparación de M.hyo se potencia la seguridad de la composición inmunogénica.

Como se usa en la presente memoria descriptiva reivindicaciones, las formas en singular "uno", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "antígeno proteico" incluye una pluralidad de antígenos proteicos, incluidas mezclas de las mismas.

Como se usa en el presente documento, con el término "que comprende" se pretende decir que las composiciones y procedimientos incluyen los elementos citados pero no excluyen los demás elementos.

Como se usa en el presente documento, una porción soluble de una preparación de células enteras de M. hyo se refiere a una fracción líquida soluble de una preparación de células enteras de M. hyo tras la separación del material insoluble y la sustancial eliminación de IgG e inmunocomplejos unidos a antígeno. La porción soluble de M. hyo puede, como alternativa, denominarse en el presente documento la fracción sobrenadante, sobrenadante del cultivo y similares. Incluye proteínas solubles expresadas en M. hyo (antígenos proteicos de M. hyo) que se han separado o aislado de proteínas insolubles, bacterias enteras y otro material celular de M. hyo insoluble por medios convencionales, tales como centrifugación, filtración o precipitación. Además de incluir proteínas solubles específicas de M. hyo, la porción soluble de la preparación de células enteras de M. hyo también incluye proteínas heterólogas, tales como las contenidas en el medio de cultivo usado para la fermentación de M. hyo.

El término "antígeno" hace referencia a un compuesto, composición o sustancia inmunogénica que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T, o ambos, en un animal, incluidas composiciones que se inyectan en un animal o que son absorbidas por él. La respuesta inmunitaria se puede generar a la molécula completa o a una porción de la molécula (p. ej., un epítopo o hapteno).

Como se define en el presente documento, una "composición inmunogénica o inmunológica" hace referencia a una composición de materia que comprende al menos un antígeno que produce una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmunitaria celular o de anticuerpos a la composición o vacuna de interés.

La expresión "respuesta inmunitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta producida en un animal. Una respuesta inmunitaria puede hacer referencia a la inmunidad celular (IMC), inmunidad humoral o puede implicar ambas. La presente invención también contempla una respuesta limitada a una parte del sistema inmunitario. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, entre otros, uno o más de los efectos siguientes: La producción o activación de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T colaboradores, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos y/o linfocitos T, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de un modo tal que se potenciará la resistencia a una infección nueva y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o falta de síntomas que habitualmente muestra un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un menor título viral en el huésped infectado.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunogenicidad" significa capaz de producir una respuesta inmunitaria en un huésped animal contra un antígeno o antígenos. Esta respuesta inmunitaria sienta la base de la inmunidad protectora provocada por una vacuna contra un organismo infeccioso específico.

Un "adyuvante", como se usa en el presente documento, significa una composición compuesta por una o más sustancias que potencia la respuesta inmunitaria a uno o más antígenos. El mecanismo de cómo funciona un adyuvante no se conoce completamente. Se cree que algunos adyuvantes potencian la respuesta inmunitaria mediante lenta liberación del antígeno, mientras que otros adyuvantes son fuertemente inmunogénicos por sí mismos y se cree que funcionan de forma sinérgica.

Como se usa en el presente documento, el término "multivalente" significa una vacuna que contiene más de un antígeno ya sea de la misma especie (es decir, aislados diferentes de Mycoplasma hyopneumoniae), de una especie diferente (es decir, aislados de Pasteurella hemolytica y Pasteurella multocida), o una vacuna que contiene una combinación de antígenos de géneros diferentes (por ejemplo, una vacuna que comprende antígenos de Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus y Clostridium).

El término "cerdo" o "lechón", como se usa en el presente documento, significa un animal de origen porcino, mientras que "cerda" se refiere a una hembra en edad y capacidad reproductiva. Una "lechona" es una cerda hembra que no ha estado nunca preñada.

Como se usa en el presente documento, el término "virulento" significa un aislado que conserva su capacidad para ser infeccioso en un huésped animal.

"Vacuna inactivada" significa una composición de vacuna que contiene un organismo infeccioso o patógeno que ya no se puede replicar ni crecer. El patógeno puede ser de origen bacteriano, vírico, protozoico o fúngico. La inactivación se puede conseguir mediante varios procedimientos, incluidos congelación-descongelación, tratamiento químico (por ejemplo, tratamiento con timerosal o formalina), ultrasonidos, radiación, calor u otro medio convencional suficiente para evitar la replicación o el crecimiento del organismo al tiempo que conserva su inmunogenicidad.

El término "variante", como se usa en el presente documento, se refiera a un polipéptido o secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservadoras de aminoácidos u otras modificaciones minoritarias de un modo tal que el correspondiente polipéptido tenga una función sustancialmente equivalente cuando se compara con el polipéptido silvestre.

"Variación conservadora" indica la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de un modo tal que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofóbico o la sustitución de un residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina y similares. La expresión "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido proporcionó que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionan con el polipéptido no sustituido.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "excipiente farmacéuticamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" son intercambiables y hacen referencia a un vehículo líquido para contener antígenos de vacuna que se pueden inyectar en un huésped sin producir efectos adversos. Excipientes farmacéuticamente adecuados conocidos en la técnica incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina, glucosa, dextrosa o soluciones tamponadas. Los excipientes pueden incluir agentes auxiliares incluidos, entre otros, diluyentes, estabilizantes (es decir, azúcares y aminoácidos), conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes tampón del pH, aditivos para potenciar la viscosidad, colores y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición de vacuna" incluye al menos un antígeno o inmunógeno en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped. Las composiciones de vacuna se pueden administrar en dosis y mediante técnicas bien conocidas para los expertos en las materias médica o veterinaria, teniendo en cuenta factores tales como la edad, el sexo, el peso, la especie y el estado del animal receptor, y la vía de administración. La vía de administración puede ser percutánea, mediante administración mucosa (p. ej., oral, nasal, anal, vaginal) o por vía parenteral (intradérmica, transdérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal). Las composiciones de vacuna se pueden administrar solas o se pueden co-administrar o administrar secuencialmente con otros tratamientos o terapias. Las formas de administración pueden contener suspensiones, jarabes o elixires y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., administración inyectable) tales como suspensiones o emulsiones estériles. Las composiciones de vacuna se pueden administrar como pulverización o mezcladas con alimentos y/o agua o liberarse en una mezcla con un excipiente, diluyente o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tampón del pH, adyuvantes, aditivitos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colores y similares, en función de la vía de administración y la preparación deseadas. Se pueden consultar textos farmacéuticos estándar, como "Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990, para preparar preparaciones adecuadas sin experimentación indebida.

"Virus del SRRP de norteamérica" significa cualquier VRRS que tiene características genéticas asociadas con un aislado del virus del SRRP de norteamérica, tales como, entre otros, el virus del SRRP que se aisló primero en E.U.A. aproximadamente a principios de la década de 1990 (véase, p. ej., Collins, J. E., y col., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); el aislado del virus del SRRP de norteamérica MN-1 b (Kwang, J. y col., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6.293-296); la cepa Quebec LAF-exp91 del virus del SRRP (Mardassi, H. y col., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); y el el aislado del virus del SRRP de norteamérica VR 2385 (Meng, X.-J y col+., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Ejemplos adicionales de las cepas del virus del SRRP de norteamérica se describen en el presente documento. Las características genéticas hacen referencia a la similitud de la secuencia de nucleótidos genómica y a la similitud de la secuencia de aminoácidos compartida por las cepas del virus del SRRP de Norteamérica. Generalmente, las cepas chinas del virus del SRRP muestran una similitud de la secuencia de nucleótidos de aproximadamente 80 - 93% con las cepas de norteamérica.

"Virus europeo del SRRP" se refiere a cualquier cepa del virus del SRRP que tiene las características genéticas asociadas con el virus del SRRP aislado por primera vez en Europa aproximadamente en 1991 (véase, por ejemplo, Wensvoort, G., y col., 1991 , Vet. Q. 13:121-130). El "virus europeo del SRRP" en ocasiones también se denomina en la materia "virus Lelystad". Ejemplos adicionales de las cepas del virus del SRRP europeo se describen en el presente documento.

Un virus genéticamente modificado está "atenuado" si es menos virulento que su cepa parental sin modificar. Una cepa es "menos virulenta" si muestra una disminución estadísticamente significativa en uno o más parámetros que determinan la gravedad de la enfermedad. Dichos parámetros pueden incluir el nivel de viremia, fiebre, gravedad de la dificultad respiratoria, gravedad de los síntomas reproductivos o el número o la gravedad de las lesiones pulmonares etc.

Un "clon infeccioso" es un genoma aislado o clonado del agente de enfermedad (p. ej., virus) que se pueden modificar específicamente y a propósito en el laboratorio y usar después para recrear el organismo genéticamente modificado vivo. En una vacuna de virus vivos se puede usar un virus vivo modificado genéticamente del clon infeccioso. Como alternativa, las vacunas de virus inactivados se pueden preparar tratando el virus vivo derivado del clon infeccioso con agentes de inactivación tales como formalina o disolventes hidrofóbicos, ácidos, etc., mediante irradiación con luz ultravioleta o rayos X, calor etc.

Todas las vacunas de combinación contra . hyo y de M.hyo disponibles actualmente están compuestas por preparaciones de células enteras muertas de micoplasma (bacterinas). Por el contrario, la presente invención usa una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) para combinar con el antígeno del PCV2, en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina.

M. hyo tiene requisitos absolutos de esteróles exógenos y ácidos grasos. Estos requisitos generalmente requieren crecimiento de M.hyo medio con suero, tal como suero porcino. La separación del material insoluble de la porción soluble de la preparación de células enteras de M. Hyo (p. ej., mediante centrifugación, filtración o precipitación) no elimina la IgG porcina o los inmunocomplejos. En una realización de la presente invención, la porción soluble de M. hyo se trata con proteína A o proteína G con el fin de eliminar sustancialmente la IgG y los inmunocomplejos contenidos en el sobrenadante del cultivo. En esta realización se entiende que el tratamiento con proteína A se produce después de la fermentación de M. hyo. En el presente documento, este se denomina, como alternativa, tratamiento con proteína A cadena abajo. En otra realización se puede usar tratamiento del medio de crecimiento con proteína A cadena arriba (es decir, antes de la fermentación de M. hyo). La proteína A se une a la porción Fe de la IgG. La proteína G se une preferentemente a la porción Fe de la IgG, pero también se puede unir a la región Fab. En la técnica se conocen los procedimientos para purificar/eliminar la IgG total de las mezclas de proteínas brutas, tal como sobrenadante de cultivo tisular, suero y líquido ascítico.

En algunas realizaciones, la porción soluble de la preparación de M. hyo incluye al menos un antígeno proteico de M. hyo. En otras realizaciones, la porción soluble de la preparación de M. hyo incluye dos o más antígenos proteicos de M. hyo.

En una realización, la fracción sobrenadante de M. hyo incluye uno o más de los siguientes antígenos proteicos específicos de M. hyo. Proteínas de M. hyo de aproximadamente 46kD (p46), 64kD (p64) y 97kD (p97) de peso molecular. En otra realización, la fracción sobrenadante incluye al menos los antígenos proteicos específicos de . hyo p46, p64 y p97. La proteína M. hyo de aproximadamente 64kD (p64) puede denominarse, como alternativa, en el presente documento antígeno de superficie p65 de M.hyo descrito por Kim y col., [Infect. Immun. 58(8):2637-2643 (1990)], así como en la patente de E.U.A. n° 5,788,962.

Futo y col. describieron la clonación y caracterización de una proteína de superficie de 46kD de M.hyo, que se puede usar en las composiciones de la presente invención [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. En una realización, el sobrenadante del cultivo de M. hyo incluye la p46 cuyas correspondientes secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la cepa P-5722 se indican en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. También se contempla que se pueden usar variantes de estas secuencias de p46 en las composiciones de la presente invención, como se describe más adelante.

Zhang y col. describieron y caracterizaron una proteína adhesina p97 de M.hyo [Infect. Immun. 63: 1013-1019, 1995]. Adicionalmente, King y col. describieron una proteína de 124 kDa denominada Mhp1 de la cepa P-5722 de M.hyo y presentaron datos que sugerían que Mhp1 y p97 son la misma proteína [Vaccine 5:25-35 (1997)]. Dichas proteínas p97 se pueden usar en las composiciones de la presente invención. En una realización, el sobrenadante del cultivo de M. hyo incluye la p97 cuyas correspondientes secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la cepa P-5722 se indican en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. También se contempla que se pueden usar variantes de estas secuencias de p97 en las composiciones de la presente invención, como se describe más adelante.

El sobrenadante del cultivo de M. hyo puede incluir otros antígenos proteicos específicos de M. hyo tales como, entre otros, proteínas de aproximadamente 41kDa (p41), 42kDa (p42), 89kDa (p89) y 65kDa (p65). Véase, Okada y col., 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533 y Kim y col., 1990, Infecí. Immun. 58(8):2637-2643. Además, el sobrenadante del cultivo de M. hyo puede incluir antígenos proteicos específicos de M.hyo de aproximadamente 102 kDa (p102) y 216 kDa (p216). Véanse las patentes de E.U.A. números 6,162,435 y 7,419,806 de Minnion y col.

Como material de partida para producir la porción soluble de la preparación de M.hyo de las composiciones la presente invención se puede usar cualquier cepa de M. hyo. Se pueden obtener cepas adecuadas de M.hyo de fuentes comerciales o académicas, incluidos depósitos tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, Va.) y la Colección de Cultivos NRRL (Agricultural Research Service, Departamento de Agricultura de E.U.A., Peoría, III.) La ATCC sola enumera las siguientes seis cepas de M. hyo para la venta: M. hyo ATCC 25095, M. hyo ATCC 25617, M. hyo ATCC 25934, M. hyo ATCC 27714, M. hyo ATCC 27715 y M. hyo ATCC 25934D. Una cepa preferida de . hyo para uso en las realizaciones de la presente invención se identifica como la cepa P-5722-3, ATCC #55052, depositada el 30 de mayo de 1990 conforme a las normas de accesibilidad requeridas por la Oficina de Marcas y Patentes de E.U.A. En vista de la extendida diseminación de la enfermedad, las cepas también se pueden obtener recuperando M. hyo de secreciones pulmonares o de tejido de cerdos infectados por cepas conocidas causantes de la neumonía por micoplasma en cerdos.

Los expertos en la técnica entienden que se pueden usar variantes de las secuencias de M. hyo en las composiciones de la presente invención. Dichas variantes podrían variar tanto como un 10-20% en la identidad de secuencia y seguir conservando las características antigénicas que las hacen útiles en las composiciones inmunogénicas. Preferentemente, las variantes de M. hyo tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente al menos 95% con la secuencia genómica de longitud completa de la cepa de M. hyo silvestre. Las características antigénicas de una composición inmunológica pueden estimarse mediante, por ejemplo, el experimento de exposición como se proporciona en los Ejemplos. Además, las características antigénicas de un antígeno de M. hyo modificado todavía se conservan cuando el antígeno modificado confiere a menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% de la inmunidad protectora en comparación con la proteína de M. hyo silvestre.

En una realización, el antígeno p46 soluble de M. hyo está incluido en las composiciones de la invención a una concentración final de aproximadamente 1.5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, preferentemente de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml. Cabe destacar que p46 es la proteína usada para la prueba de potencia de M. hyo (véase la sección de ejemplos más adelante). En otra realización, el antígeno de M. hyo se puede incluir en las composiciones a una cantidad final de aproximadamente 5.5% a aproximadamente 35% del sobrenadante tratado con proteína A del cultivo de células enteras de M. hyo.

La preparación soluble de M.hyo de la presente invención es tanto segura como eficaz contra M.hyo y es adecuada para la administración en una sola dosis. Además, los solicitantes han descubierto sorprendentemente que la preparación soluble de M. hyo se puede combinarse con eficacia con antígenos de otros patógenos, incluido de PCV2, sin que se interferencias ¡nmunológicas entre los antígenos. Esto hace que la preparación soluble de M. hyo sea una plataforma eficaz para vacunas multivalentes, incluida la vacuna de combinación PCV2/M.hyo de la presente invención. El antígeno de PCV2 se puede administrar de forma concurrente con la composición de M. hyo (es decir, como vacunas únicas separadas), pero preferentemente se combina en una vacuna lista para usar en un frasco.

En una realización, las composiciones inmunogénicas de PCV2/ .hyo de la presente invención incluyen al menos un antígeno adicional. En una realización, el al menos un antígeno adicional es protector contra un microorganismo que puede producir la enfermedad en cerdos.

En algunas realizaciones, el al menos un componente antigénico adicional es protector contra bacterias, virus o protozoos que se sabe que infectan a los cerdos. Ejemplos de dichos microorganismos incluyen, entre otros, los siguientes: virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), parvovirus porcino (PPV), Haemophüus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bacterias leptospira, Lawsonia intracellularís, virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), rotavirus, virus Torque teño (VTT), citomegalovirus porcino, enterovirus porcinos, virus de la encefalomiocarditis, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, fiebre porcina clásica (FPC) y un patógeno causante de la gastroenteritis transmsible porcina o combinaciones de los mismos.

En una realización se proporciona una vacuna de combinación frente a PCV2/M.hyo de acuerdo con la presente invención como una vacuna en un frasco lista para usar en una sola dosis. Dicha vacuna de combinación lista para usar no requiere mezclar vacunas distintas, de modo que no hay riesgo de contaminación o trabajo adicional asociado con la mezcla y no se requiere usar la mezcla en pocas horas. Asimismo, una vacuna frente a PCV2/M.hyo en un frasco reduce a la mitad el espacio de almacenamiento en refrigerador y los residuos. Además, la administración en una dosis elimina el trabajo asociado con la administración de una segunda dosis al animal. Cabe destacar que aunque actualmente existen vacunas de combinación frente a PCV2/M.hyo se proporcionan como una vacuna lista para usar en dos dosis (Circumvent®PCVM) o como una vacuna de una sola dosis en 2 frascos que requiere la administración simultánea de vacunas separadas (p. ej., Ingelvac CircoFLEX® e Ingelvac MycoFLEX®). Preferentemente, la combinación PCV2/ .hyo de acuerdo con la presente invención sería compatible con otros antígenos, tales como el antígeno del virus del SRRP, de modo que se puedan administrar todos los antígenos en una sola dosis.

En algunas realizaciones, el componente antigénico de PCV2 de una vacuna de combinación frente a PCV2/M.hyo está en forma de un circovirus quimérico de tipo -tipo 2. El virus quimérico incluye un circovirus porcino de tipo 1 recombinante inactivado que expresa la proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2. Los circovirus porcinos quiméricos y procedimientos para su preparación se describen en el documento WO 03/049703 A2 y también en las patentes de E.U.A. N° 7,279,166 y 7,575,752, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

En una realización, la secuencia de ADN de longitud completa del genoma del virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 5. o variantes de la misma, como se describe más adelante. En otra realización, el gen de la cápsida de ORF2 inmunogénica del virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 6. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF2 inmunogénica expresada por el virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 7.

En otra realización más, la secuencia de ADN de longitud completa del genoma del virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 8. En una realización, el gen de la cápsida de ORF2 inmunogénica del virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 9. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF2 inmunogénica expresada por el virus PCV1-2 quimérico corresponde a la SEQ ID NO: 10.

No obstante, el ADN de la ORF2 del PCV2 y la proteína del virus PCV1-2 quimérico no están limitados a las secuencias descritas anteriormente ya que el ADN de la ORF2 del PCV2 y la proteína es un dominio altamente conservado dentro de los aislados de PCV2.

En algunas realizaciones, el componente antigénico de PCV2 de una vacuna de combinación frente a M.hyo/PCV2 está en forma de una proteína ORF2 recombinante. En una realización, la proteína ORF2 recombinante se expresa en un vector baculovirus. Como alternativa, se pueden usar otros vectores de expresión tales como, incluidos, entre otros, los vectores de parapox.

En una realización, la proteína ORF2 recombinante del PCV2 es la de la SEQ ID NO: 1 1 , que está codificada por la SEQ ID NO: 12 (n° de acceso en GenBank AF086834). En otra realización, la proteína ORF2 recombinante es la de la SEQ ID NO: 13, que está codificada por la SEQ ID NO: 14. En otra realización más, la proteína ORF2 recombinante corresponde a la SEQ ID NO: 15. En todavía otra realización, la proteína ORF2 recombinante de PCV2 corresponde a la SEQ ID NO: 7. En otra realización adicional, la proteína ORF2 recombinante de PCV2 corresponde a la SEQ ID NO: 10.

No obstante, la presente invención no está limitada al ADN de ORF2 concreto y las secuencias proteicas descritas en lo que antecede. Dado que el ADN de la ORF2 del PCV2 y la proteína es un dominio altamente conservado en los aislados de PCV2, es muy probable que cualquier ORF2 del PCV2 sea eficaz como fuente del ADN de la ORF2 del PCV2 y/o el polipéptido como se usa en el virus PCV1-2 quimérico o en la proteína PCV2 recombinante.

Un ejemplo de un aislado del PCV2 adecuado del que se pueden obtener las secuencias del ADN de ORF2 del PCV2 y de la proteína es el número de aislado de PCV2 40895 (depositado en la ATCC el 7 de diciembre de 2001 y con una designación del depósito de patentes de la ATCC asignada PTA-3914). La secuencia genómica (de nucleótídos) del número de aislado de PCV2 40895 está disponible con el número de acceso en GenBank AF264042. Otros ejemplos de aislados adecuados de PCV2 de los que se pueden obtener las secuencias de ADN de la ORF2 del PCV2 y de la proteína incluyen, entre otros, los siguientes: lmp.999, lmp.1010-Stoon, lmp.1011-48121 e Imp.1011-48285. Los números de acceso en GenBank de las secuencias genómicas correspondientes a estos aislados de PCV2 son AF055391 , AF055392, AF055393 y AF055394, respectivamente.

En algunas formas, las porciones inmunogénicas de la proteína ORF2 del PCV2 se usan como componente antigénico en la composición. Por ejemplo, las formas truncadas y/o sustituidas o fragmentos de la proteína ORF2 del PCV2 se pueden usar en la composición de la presente invención.

Los expertos en la técnica entienden que se pueden usar variantes de las secuencias de PCV2 en las composiciones de la presente invención. Dichas variantes podrían variar tanto como un 10-20% en la identidad de secuencia y seguir conservando las características antigénicas que las hacen útiles en las composiciones inmunogénicas. Preferentemente, las variantes de PCV2 tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente al menos 95% con la secuencia genómica de longitud completa del aislado de PCV2 silvestre. Las características antigénicas de una composición inmunológica pueden estimarse mediante, por ejemplo, el experimento de exposición como se proporciona en los Ejemplos. Además, las características antigénicas de un antígeno de PCV2 modificado todavía se conservan cuando el antígeno modificado confiere a menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% de la inmunidad protectora en comparación con la proteína ORF2 de PCV2 silvestre.

El componente antigénico del PCV2 se proporciona en la composición inmunogénica a un nivel de inclusión del antígeno eficaz para inducir la respuesta inmunitaria deseada, es decir reduciendo la incidencia o disminuyendo la gravedad de los signos clínicos debidos a la infección por PCV2.

En una realización, en las composiciones de la invención se incluye un virus quimérico de PCV1-2 a un nivel de al menos 1.0= PR= 5.0, en la que PR es la unidad de potencia relativa determinada mediante ELISA de cuantificación antigénica (ensayo de potencia in vitro) en comparación con una vacuna de referencia. En otra realización, en la composición de la invención se incluye un virus quimérico de PCV1-2 a una concentración final de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 5% de 20 veces (20X) el volumen del antígeno de PCV1-2 concentrado.

En otra realización, la proteína recombinante ORF2 de PCV2 se incluye en las composiciones de la invención a un nivel de al menos 0.2 pg de antígeno/ml de la composición inmunogénica final (pg/ml). En una realización adicional, el nivel de inclusión de la proteína recombinante ORF2 de PCV2 es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 400 pg/ml. En otra realización más, el nivel de inclusión de la proteína recombinante ORF2 de PCV2 es de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 200 pg/ml. En otra realización adicional, el nivel de inclusión de la proteína recombinante ORF2 de PCV2 es de aproximadamente 0.35 a aproximadamente 100 pg/ml. En otra realización más, el nivel de inclusión de la proteína recombinante ORF2 de PCV2 es de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 50 g/ml.

En una realización, una composición inmunogénica de la presente invención incluye la combinación de la invención de al menos un antígeno soluble de M. hyo (p. ej., dos o más), un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV3), así como un antígeno del virus del SRRP. En otra realización, la composición produce una respuesta inmunitaria protectora en un cerdo contra M. hyo y PCV2 y el virus del SRRP.

En una realización se proporciona una vacuna de combinación frente a PCV2/M.hyo/SRRP como una vacuna en dos frascos en una sola dosis. Por ejemplo, en algunas realizaciones se proporciona una combinación de M.hyo/PCV2 como composición líquida estable en un primer frasco y se proporciona un virus del SRRP en estado liofilizado en un segundo frasco. En algunas realizaciones, al primero o al segundo frasco se pueden añadir antígenos porcinos adicionales.

En una realización, el componente del virus del SRRP se proporciona como un virus vivo genéticamente modificado liofilizado. Antes de la administración, el líquido de PCV2/M.hyo de un primer frasco se puede usar para rehidratar el virus del SRRP en un segundo frasco, de modo que los tres antígenos se puedan administrar al animal en una sola dosis. Cabe destacar que aunque actualmente existen vacunas de combinación frente a PCV2/M.hyo/SRRP se proporcionan como una vacuna en 3 frascos de una sola dosis que requiere la administración simultánea de tres vacunas separadas (p. ej., Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® y lngelvac®PRRS MLV).

El agente etiológico del SRRP se aisló por primera vez en los Países Bajos y se denominó virus Lelystad. Este virus se describió en el documento WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Un aislado del virus europeo del SRRP se depositó en el Instituto Pasteur de París, número 1-1 102. El tipo norteamericano se aisló casi a la vez que el virus de tipo europeo y se describe en el documento WO-93/03760 (Collins y col.). Un aislado del virus norteamericano se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), número VR-2332.

Se han aislado diferentes cepas de los virus de tipo europeo y norteamericano. El documento WO 93/07898 (Akzo) describe una cepa europea y vacunas derivadas de la misma, depositada en el CNCM (Instituto Pasteur), número 1-1140. Asimismo, el documento WO 93/14196 (Rhone-Merieux) describe una cepa nueva aislada en Francia, depositada en el CNCM (Instituto Pasteur), número 1-1153. Además, el documento EP0595436 B1 (Solvay) describe una nueva cepa de tipo norteamericana más virulenta que la descrita [nicialmente, y vacunas de la misma. Esta cepa se ha depositado en la ATCC, pero el número de depósito no se detalla en la solicitud de patente. Además, el documento ES2074950 BA (Cyanamid Ibérica) y su homólogo GB2282811 B2 describen la denominada "cepa española", que es diferente de las otras cepas europeas y norteamericanas.

La "cepa española" se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (EACCC), número V93070108.

Los antígenos del virus del SRRP adecuados para uso en las composiciones de PCV2/M.hyo/SRRP de la presente invención incluyen aislados del virus norteamericanos del SRRP, las cepas del virus chino del SRRP y las cepas del virus europeo del SRRP, así como versiones modificadas genéticamente de dichos aislados/cepas. En una realización, el componente antigénico del virus del SRRP empleado en las composiciones de acuerdo con la presente invención es un virus norteamericano del SRRP.

En algunas realizaciones, el componente antigénico del virus del SRRP empleado en las composiciones de la presente invención es el aislado del virus norteamericano del SRRP designado P 29 o una versión viva modificada genéticamente del mismo. Preferentemente, el virus del SRRP modificado genéticamente es incapaz de producir una infección patogénica, aunque sí puede producir una respuesta inmunoprotectora eficaz contra la infección por el virus del SRRP silvestre.

Un virus del SRRP modificado genéticamente para uso en las composiciones de la invención se puede producir a partir de un clon infeccioso. La preparación de un clon de ADNc infeccioso del aislado del virus norteamericano del SRRP designado P129 se describe en la patente de E.U.A. n° 6,500,662, que se incorpora completamente en el presente documento por referencia. La secuencia del ADNc del P129 se divulga en GenBank con el número de acceso AF494042 y en la patente de E.U.A. n° 6,500,662.

En una realización, la secuencia de nucleótidos de una forma no virulenta de P129 para uso en las composiciones de la presente invención está representada por la SEQ ID NO: 16. No obstante, la presente invención no está limitada a esta secuencia. Esta secuencia y las secuencias de otras formas no virulentas de P129 se describen en la solicitud internacional n° PCT/IB2011/055003, presentada el 9 de noviembre de 2011 , cuyos contenidos (incluidas todas las presentaciones en el US National Stage en base a esta solicitud internacional) se incorporan en su totalidad en el presente documento por referencia. Preferentemente, el virus del SRRP se modifica para prevenir la regulación por disminución de la función mediada por interferón.

En otras realizaciones, el componente antigénico del virus del SRRP empleado en las composiciones de la invención es el aislado del virus del SRRP designado ISU-55. El aislado ISU-55 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), con el número de acceso VR2430. La secuencia de nucleótidos de los genes de ORF2 a ORF5 del aislado ISU-55 está representada por la SEQ ID NO: 17. La secuencia de nucleótidos de los genes de ORF6 y ORF7 del aislado ISU-55 está representado por la SEQ ID NO: 18.

Otro aislado adecuado del virus norteamericano del SRRP que se puede usar en las composiciones es ISU-12, que se depositó en la ATCC con los números de acceso VR2385 [3 x purificado en placa] y VR2386 [no purificado en placa]. Otros aislados adecuados del virus norteamericano del SRRP que se pueden usar en las composiciones de la presente invención son los siguientes: ISU-51 , ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 y ISU-79, que se depositaron en la ATCC con los números de acceso VR2498, VR2431 , VR2475, VR2429 y VR2474, respectivamente. Las versiones genéticamente modificadas de cualquiera de estos aislados ISU se pueden usar en las composiciones de la presente invención. Estos aislados ISU y el aislado ISU-55 se describen con detalle en las siguientes patentes de E.U.A. de Paul y col. US 5,695,766, 6,110,467, 6,251 ,397, 6,251 ,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 y 7,517,976, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia.

En otras realizaciones más, el componente antigénico del virus del SRRP empleado en las composiciones de acuerdo con la presente invención es el aislado del virus norteamericano del SRRP depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), número VR-2332 o una versión modificada genéticamente del mismo. Por ejemplo, el virus del SRRP puede ser un virus vivo modificado en base al aislado identificado como VR2332 en a ATCC, que se usa en INGELVAC® PRRS ATP e INGELVAC® PRRS MLV de Boehn'nger Ingelheim Vetmedica, Inc.

En otras realizaciones más, el componente antigénico del virus del SRRP empleado en las composiciones de la presente invención es un aislado del virus europeo del SRRP o virus Lelystad o una versión modificada genéticamente del mismo. Un ejemplo de una cepa del virus del SRRP adecuado se identifica como el depósito N° 1-1 102 descrito anteriormente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes al depósito N° 1-1 102 se describen en la patente de E.U.A. n° 5.620.691 de Wensvoort y col., que se incorpora completamente en el presente documento por referencia. La preparación de un clon infeccioso del aislado del virus europeo del SRRP o virus Lelystad se describe en la patente de E.U.A. n° 6,268, 199, que se incorpora completamente en el presente documento por referencia.

Otros ejemplos de aislados adecuados del virus del SRRP incluyen, entre otros, los descritos anteriormente. Asimismo, se pueden usar versiones genéticamente modificadas de los aislados del virus del SRRP en las composiciones de la presente invención. Se puede usar un clon infeccioso para recrear dichos organismos vivos genéticamente modificados.

Los expertos en la técnica entienden que se pueden usar variantes de las secuencias del virus del SRRP en las composiciones de la presente invención. Dichas variantes podrían variar tanto como un 10-20% en la identidad de secuencia y seguir conservando las características antigénicas que las hacen útiles en las composiciones inmunogénicas. Preferentemente, las variantes del virus del SRRP tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente al menos 95% con la secuencia genómica de longitud completa del aislado del virus del SRRP silvestre. Las características antigénicas de una composición inmunológica pueden estimarse mediante, por ejemplo, experimentos de exposición. Además, las características antigénicas de un antígeno del virus del SRRP modificado todavía se conservan cuando el antígeno modificado confiere a menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% de la inmunidad protectora en comparación con el antígeno del virus del SRRP silvestre.

En una realización, el componente antigénico del virus del SRRP es un virus vivo genéricamente modificado que se incluye en las composiciones de la invención a un nivel de al menos 2.1 < DICT50= 5.2, en la que DICT50 es la dosis que infecta el 50% del cultivo tisular determinada por cuantificación antigénica (ensayo de potencia in vitro).

El componente antigénico del PCV2 de las composiciones de PCV2/M.hyo/SRRP de la invención pueden estar en forma de un circovirus quimérico de tipo 1 y de tipo 2, en el que el virus quimérico incluye un circovirus porcino de tipo 1 recombinante inactivado que expresa la proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2. En otra realización, el componente antigénico de PCV2 de las composiciones de PCV2/M.hyo/SRRP de la invención está en forma de una proteína ORF2 recombinante.

Los antígenos de PCV2 adecuados para usar en las composiciones de PCV2/M.hyo/SRRP se pueden obtener de cualquiera de los aislados de PCV2 descritos anteriormente, así como otros aislados de PCV2. Antígenos de PCV2 adecuados para usar en las composiciones de la invención incluyen, entre otros, las secuencias del PCV2 descritas anteriormente y variantes de las mismas.

Las vacunas de la presente invención se pueden formular siguiendo el consenso aceptado para incluir vehículos adecuados para animales, incluidos seres humanos (si procede), tales como tampones estándar, estabilizantes, diluyentes, conservantes y/o solubilizantes, y también se pueden formular para facilitar la liberación sostenida. Los diluyentes incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Aditivos para isotonicidad incluyen cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros. Los expertos en la técnica conocen otros vehículos y aditivos para vacunas adecuados, incluidos los que son particularmente útiles en la formulación de vacunas vivas modificadas, o estos serán evidentes para ellos. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las vacunas de la presente invención pueden comprender además uno o más componentes inmunomoduladores tales como, por ejemplo, un adyuvante o citocina, entre otros. Tipos de adyuvantes adecuados para usar en las composiciones de la presente invención incluyen los siguientes: un adyuvante de aceite en agua, un adyuvante de polímero y agua, un adyuvante de agua en aceite, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un adyuvante de vitamina E y combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, entre otros, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Corynebacterium parvum, bacilo de Calmette Guerin, gel de hidróxido de aluminio, glucano, dextrano sulfato, óxido de hierro, alginato sódico, bacto-adyuvante, determinados polímeros sintéticos tales como poliaminoácidos y copolímeros de aminoácidos, copolímero de bloque (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, nomofosforilo lípido A y adyuvante de avridina lípido-amina (N,N-dioctadecil-?',?'- bis(2-hidroxietil)-propanodiamina), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), aceite de parafina, sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mon ), dipéptido de muramilo y similares.

Ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua útiles en la vacuna de la invención incluyen formulaciones de SEAM62 y SEAM 1/2 modificadas. SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua que contiene 5% (v/v) de escualeno (Sigma), 1% (v/v) de detergente SPAN® 85 (tensioactivos ICI), 0.7% (v/v) de detergente TWEEN® 80 (tensioactivos ICI), 2.5% (v/v) de etanol, 200 g/ml de Quil A, 100 pg/ml de colesterol y 0.5% (v/v) de lecitina. SSEAM 1/2 modificada es una emulsión de aceite en agua que contiene 5% (v/v) de escualeno, 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85, 0.7% (v/v) de detergente TWEEN® 80, 2.5% (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A y 50 pg/ml de colesterol.

Otro ejemplo de un adyuvante útil en las composiciones de la invención es SP-aceite. Como se usa en la memoria y las reivindicaciones, el término "aceite SP" designa una emulsión de aceite que comprende un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, escualeno, monooleato de polioxietileno sorbitano y una solución de sal tamponada. Los copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno son tensioactivos que ayudan a suspender los componentes sólidos y líquidos. Estos tensioactivos están comercialmente disponibles como polímeros con el nombre comercial Pluronic®. El tensioactivo preferido es poloxámero 401 que está disponible comercialmente con el nombre comercial Pluronic® L-121. En general, la emulsión de aceite SP es una mezcla de adyuvante inmunoestimulante que comprenderá de aproximadamente 1 a 3% vol/vol de copolímero de bloque, de aproximadamente 2 a 6% vol/vol de escualeno, más particularmente de aproximadamente 3 a 6% de escualeno y de aproximadamente 0.1 a 0.5% vol/vol de monooleato de polioxietileno sorbitano, siendo el resto una solución salina tamponada. En una realización, la emulsión de aceite SP está presente en la composición final en cantidades en v/v/ de aproximadamente 1 % a 25%, preferentemente de aproximadamente 2% a 15%, más preferentemente de aproximadamente 5% a 12% v/v.

Otro ejemplo más de un adyuvante adecuado para usar en las composiciones de la invención es el adyuvante AMPHIGEN™ que consiste en lecitina desaceitada disuelta en un aceite, normalmente parafina líquida ligera.

Otros ejemplos de adyuvantes útiles en las composiciones de la invención son los siguientes adyuvantes patentados:, sistema adyuvante de emulsión doble Microsol Diluvac Forte®, adyuvante Emunade y adyuvante Xsolve. Los adyuvantes Emunade y Xsolve son emulsiones de aceite mineral ligero en agua, pero Emunade también contiene alhidrogel y acetato de d,l-o tocoferilo es parte del adyuvante XSolve. Un ejemplo adicional más de un adyuvante adecuado para usar en las composiciones de la invención es el adyuvante ImpranFLEX™ (un adyuvante de agua en aceite). Otro ejemplo más de un adyuvante adecuado es un adyuvante a base de carbómero (Carbopol®). Adyuvantes Carbopol® preferidos incluyen el polímero Carbopol® 934 y el polímero Carbopol®941.

En una realización, el adyuvante o mezcla de adyuvantes se añade en una cantidad de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 10 mg por dosis. En otra realización, el adyuvante / mezcla de adyuvantes se añade en una cantidad de aproximadamente 200 pg a aproximadamente 5 mg por dosis. En otra realización más, el adyuvante / mezcla de adyuvantes se añade en una cantidad de aproximadamente 300 pg a aproximadamente 1 mg / dosis.

El adyuvante o mezcla de adyuvantes normalmente está presente en la composición de vacuna de la invención en cantidades en v/v/ de aproximadamente 1 % a 25%, preferentemente de aproximadamente 2% a 15%, más preferentemente de aproximadamente 5% a 12% v/v.

Otros "inmunomoduladores" que se pueden incluir en la vacuna incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones u otras citocinas conocidas. En una realización, el adyuvante puede ser un derivado de ciclodextrina o un polímero polianionico, tales como los descritos en las patentes de E.UA n° 6,165,995 y 6,610,310, respectivamente.

Un aspecto adicional se refiere a un procedimiento para preparar una composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención. Este procedimiento comprende i) cultivar M. hyo en un medio adecuado durante periodos que varían de 18 a 144 horas; ii) inactivar después el cultivo de M. hyo; iii) recoger el fluido del cultivo inactivado, en el que el fluido del cultivo inactivado comprende una preparación de células enteras de M. hyo que comprende una fracción líquida soluble y material celular insoluble; ¡v) separar la fracción líquida soluble del material celular insoluble; y v) eliminar sustancialmente la IgG y los inmunocomplejos antígeno / inmunoglobulina de la fracción de líquido soluble separada para formar una porción soluble de la preparación de células enteras de M. hyo, y vi) combinar después la porción soluble de la preparación de células enteras de M. hyo con un antígeno del PCV2.

Un ejemplo de un medio adecuado para cultivar M. hyo es caldo PPLO (base de caldo para Mycoplasma), que cuando se suplementa con enriquecimientos nutritivos se usa para aislar y cultivar Mycoplasma..

En algunas realizaciones, el cultivo de M. hyo crece hasta el crecimiento en fase log tardío, tras lo cual se inactiva el cultivo. En algunas otras realizaciones, el cultivo se inactiva elevando el pH (p. ej., hasta aproximadamente 7.8). Esto se produce exponiendo el cultivo de producción a un agente de inactivación, tal como etilenimina binaria (BEI). La BEI se genera ¡n situ durante la incubación de bromhidruro de L-bromoetilamina (BEA) en el cultivo de producción. Posteriormente, el pH del cultivo inactivado se neutraliza, por ejemplo añadiendo una cantidad equivalente de un agente que neutraliza el agente de inactivación dentro de la solución. En algunas realizaciones, el agente de inactivación es BEI y el agente de neutralización es tiosulfato sódico. En una realización, el pH del cultivo inactivado se ajusta hasta aproximadamente 7.4 añadiendo tiosulfato sódico.

En algunas realizaciones, la fracción líquida soluble de la preparación de células enteras de M. hyo se separa del material celular insoluble usando procedimientos convencionales. En una realización, esta separación se realiza mediante una etapa de filtración. En otra realización, esta separación se realiza mediante una etapa de centrifugación. En otra realización más, la separación se realiza mediante una etapa de precipitación.

En una realización, la fracción liquida soluble de una preparación de células enteras de M. hyo neutralizadas se trata con la resina de proteína A para eliminar sustancialmente tanto la IgG como los inmunocomplejos antígeno/inmunoglobulina de la misma. En otras realizaciones, la resina de proteína G se puede usar para eliminar sustancialmente tanto la IgG como los inmunocomplejos antígeno/inmunoglobulina contenidos en la fracción líquida soluble. En la técnica se conocen bien los procedimientos para eliminar tanto la IgG como los inmunocomplejos antígeno/inmunoglobulina con resinas de proteína A o de proteína G.

De acuerdo con un aspecto adicional, el procedimiento para preparar una composición inmunogénica multivalente de acuerdo con la invención comprende preparar el antígeno de M. hyo soluble como se ha descrito anteriormente y mezclarlo con un antígeno del PCV2, un adyuvante adecuado y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Este procedimiento incluye opcionalmente añadir al menos un antígeno porcino adicional, tal como, entre otros, un antígeno del virus del SRRP como se ha descrito anteriormente.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un kit. Un "kit" se refiere a una pluralidad de componentes que se agrupan. En una realización, un kit de acuerdo con la presente invención incluye un frasco (u otro contenedor adecuado) que comprende una composición inmunogénica. Esta composición inmunogénica incluye un antígeno de PCV2 Y la porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmuncomplejos antígeno / inmunoglobulina. Opcionalmente, el kit puede incluir además un manual de instrucciones. El manual de instrucciones incluye la información para administrar la composición inmunogénica.

En algunas realizaciones, la combinación PCV2/M.hyo en el frasco del kit se proporciona como composición líquida lista para usar. En otras realizaciones, el kit incluye un segundo frasco que comprende el antígeno del virus del SRRP. En algunas realizaciones, el antígeno del virus del SRRP está en forma de un virus vivo modificado genéticamente que se proporciona en estado liofilizado. En estos casos, el manual de instrucciones incluirá las instrucciones para rehidratar el componente del virus del SRRP con los contenidos líquidos de un frasco que contiene la combinación PCV2/ .hyo. El manual de instrucciones también incluirá la información para administrar la(s) formulación(es) trivalentes de PCV2/M.hyo/SRRP.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención se administra a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra M. hyo. En otras realizaciones, una composición inmunogénica de la presente invención se administra a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra M. hyo y contra PCV2.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica multivalente de la presente invención se administra a un lechón de 3 semanas de edad o mayor. No obstante, se contempla que una composición de vacuna multivalente de acuerdo con la invención se puede usar para volver a vacunar lechonas antes de criar. Como se conoce en la técnica, una lechona es un cerdo hembra que nunca ha estado preñada. Las lechonas vacunadas pasan los anticuerpos maternos a sus neonatos lactantes a través del calostro.

También se contempla que una vacuna multivalente de acuerdo con la invención se puede usar para volver a vacunar a las piaras de cría. Preferentemente, una vacuna multivalente de acuerdo con la presente invención se administra a los cerdos (p. ej., a lechones o lechonas) en una dosis. En una realización, una vacuna multivalente de acuerdo con la presente invención no requiere mezclar vacunas monovalentes por separado antes de la administración, es decir se proporciona como una formulación de PCV2/M.hyo contenida en un frasco lista para usar. En otra realización, una formulación multivalente requiere mezclar una vacuna divalente de acuerdo con la presente invención contenida en un primer frasco con una vacuna monovalente contenida en un segundo frasco. En una realización, la vacuna monovalente contenida en el segundo frasco incluye un antígeno del virus del SRRP. Opcionalmente, se pueden añadir antígenos adicionales a cualquiera de estos frascos.

En algunas realizaciones, el inicio de la inmunidad es de 2-3 semanas después de la vacunación con una composición de vacuna multivalente de acuerdo con la presente invención. En otras realizaciones, la duración de la inmunidad es de aproximadamente 17-23 semanas después de la vacunación con una composición de vacuna multivalente de acuerdo con la presente invención.

Los ejemplos siguientes indican materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente invención. No obstante, debe entenderse que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración únicamente y nada en ellos se estimará que es una limitación del alcance global de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Procedimientos de producción de Mvcoplasma hvopneumoniae para antíqeno de M. hvo combinable con PCV2 Fermentación e inactivación de M. hvo El medio para la producción de antígenos y escala de semillas se preparó del siguiente modo. El caldo del organismo de tipo pleuroneumonía derivado de corazón porcino (PPLO) (BD Biosciencesm n° de catálogo) se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante (es decir, 21g/l) y la solución de extracto de levaduras se preparó a 21 g/l en USP. Después, al PPLO se añadió solución de extracto de levaduras a 6.25% y la mezcla se esterilizó calentando hasta 121 °C durante > 30 minutos. Se preparó clorhidrato de cisteína a 90 g/l y se esterilizó mediante filtración. La solución de dextrosa se preparó añadiendo 450 g de dextrosa por litro de agua USP seguido de esterilización con calor. Para preparar el medio final se añadió al medio base suero porcino al 10%, seguido de cisteína al 0.01 % y dextrosa al 1.0%. En el medio se inoculó un 10% v/v de un cultivo en fase log de M. hyopeumoniae (cepa P-5722-3). El cultivo se mantuvo a 37 °C y el pH y la dO se mantuvieron a 7.0 y 25% respectivamente. En el crecimiento en fase log tardía, el cultivo se inactivo mediante etilenimina binaria (BEI) y compuesto de aziridina, producido a partir de bromhidrato de 2-bromoetilamina. Específicamente, la inactivación se produjo elevando el pH a 7.8 añadiendo bromhidrato de 2-bromoetilamina (BEA) hasta una concentración final de 4 mM e incubando durante 24 horas. La BEI se neutralizó mediante la adición de tiosulfato sódico a una proporción molar de 1 :1 , seguido de una incubación adicional de 24 horas. El fluido de cultivo inactivado se mantuvo a 2-8°C hasta su posterior procesamiento.

EJEMPLO 2: Procedimientos de producción de circovirus porcino quimérico (cPCV)1- 2 El cPCVI-2 se construyó clonando el gen de la cápsida inmunogénica del circovirus porcino patogénico de tipo 2 (PCV2) en la estructura genómica del circovirus porcino no patogénico de tipo 1 (PCV1). El procedimiento para la construcción del clon de ADN quimérico se describe en, por ejemplo, la patente de E.U.A. N° 7,279,166, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Una reserva infecciosa del virus quimérico se adquirió del Dr. X. J. Meng, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, y se usó para infectar células 15 de riñon porcino (PK) cultivadas en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con hidrolizado de lactoalbúmina (LAH) al 0.05%, 30 pg/ml de sulfato de gentamicina y 5% de suero bovino fetal. Las células PK-15 infectadas con cPCV1-2 resultantes se expandieron adicionalmente mediante pases en serie cuatro veces más usando el mismo medio de crecimiento a excepción de 2-3% de suero bovino fetal. El quinto pase se congeló, se descongeló y se filtró, y los lisados resultantes se usaron para preparar una semilla pre-maestro y las semillas maestro posteriores.

El medio que se usó para producir semillas de virus fue el mismo que el usado para producir reserva de virus. Para el medio de crecimiento, MEM, OptiMEM o equivalente es el medio basal que se puede usar para sembrar la línea celular PK-15 para sobrecrecimiento. El medio de crecimiento se puede suplementar con hasta 10% de suero bovino, hasta 0.5% de hidrolizado de lactoalbúmina, hasta 0.5% de seroalbúmina bovina y hasta 30 pg/ml de gentamicina. Para el medio de propagación del virus se usa MEM, OptiMEM o equivalente. El medio de propagación del virus se puede suplementar con hasta 0.5% de hidrolizado de lactoalbúmina, hasta 2% de suero bovino, hasta 0.5% de seroalbúmina bovina y hasta 30 pg/ml de gentamicina. Al medio de crecimiento y/o al medio de propagación del virus se pueden añadir hasta 5 g/l de glucosa y hasta 5 mmol/l de L-glutamina según se requiera para mantener las células.

Semillas maestras del virus cPCV1-2 se añaden a una suspensión celular de células PK-15 y se adsorben durante hasta 3 horas. El virus de la semilla se diluye en medio basal de crecimiento para proporcionar una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 - 0.0001.

En los cultivos de células PK-15 se inoculan inicialmente virus de semillas de trabajo en el momento de la siembra de células o cuando las células alcanzan una confluencia de aproximadamente el 20% al 50%. Este pase inicial se puede denominar "Procedimiento de infección de una etapa" para la producción de la reserva antigénica o se puede usar después para pases en serie. Para los pases en serie, las células PK-15 de cPCV1-2 se expande después hasta el pase 7 mediante divisiones en serie a la proporción de 1 :5-20 para la propagación del virus. El medio de cultivo que contiene una suspensión de células infectadas desde el pase previo sirve como material para semilla para el siguiente pase. Las células infectadas por cPCV1-2 se incuban durante de tres (3) a 14 días para cada pase a 36 + 2°C cuando las células alcanzan una confluencia > 90%. El virus cPCV1-2 produce cambios citopáticos observables durante la replicación viral. En la recolección se observa redondeo de células y considerables residuos en flotación. Asimismo, se observan los cultivos para detectar signos visuales de contaminación bacteriana o fúngica. El tiempo de incubación entre las recolecciones para el antígeno de cPCV se proporciona en la Tabla 1 siguiente: TABLA 1 Tiempos mínimos y máximos para la recolección del antígeno de cPCV Los fluidos del cultivo de cPCV1-2 se recolectan en vasos estériles y se obtienen muestras para analizar especies de mycoplasma usando procedimientos conocidos. Se pueden realizar múltiples recolecciones de frascos rotatorios, biorreactores y vasos de perfusión.

Antes de la inactivación del virus cPCV1-2 recogido, se pueden concentrar uno o más lotes de antígenos (p. ej., hasta 60X) mediante ultrafiltración. Los concentrados se pueden lavar con solución salina equilibrada para reducir las proteínas séricas.

A continuación se describirá el procedimiento de inactivación, atenuación o destoxificación del virus cPCV1-2. Después de la concentración del antígeno del cPCV se añade beta-propiolactona (BPL) al material viral de cPCVI-2 agrupado para obtener una concentración aproximada de 0.2% v/v. Después, los fluidos virales agrupados se agitan durante un mínimo de 15 minutos y, después, el volumen de los fluidos antigénicos de inactivación se transfieren a un segundo vaso estéril. Los fluidos antigénicos transferidos se mantienen a 2 - 7°C con agitación constante durante un mínimo de 24 horas. Tras un mínimo de 24 horas, a la suspensión agrupada se añade una segunda adición de 0.2% v/v de BPL. Los contenidos se agitan después, se transfieren a un tercer vaso y se mantienen a 2 - 7°C con agitación constante durante un tiempo adicional no inferior a 84 horas. En general, el tiempo de inactivación total no es inferior a 108 horas y no superior a 120 horas. El procedimiento de inactivación se resume en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2 Procedimiento de inactivación La inactivación se detiene mediante la adición de una concentración final de la solución de tiosulfato sódico no superior a 0.1 M. El pH de la reserva de antígeno inactivado se ajusta hasta aproximadamente 6.8 usando NaOH o HC1. Tras la inactivación se toma una muestra representativa del grupo y se analiza la finalización de la inactivación. El producto antigénico cPCV1-2 inactivado se normaliza para cumplir una diana de más de 1.0 PR medida mediante el ELISA de potencia.

EJEMPLO 3: Procesamiento cadena abajo de antígenos de M. hvo y pruebas analíticas de estos antígenos procesados Procesamiento cadena abajo de antígenos de M. hyo: El fluido de fermentación inactivado (preparado como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 ) se trató para cada grupo indicado del siguiente modo. Estos antígenos de M.hyo procesados se usaron en el Ejemplo 4 más adelante.

T02: (volumen completo) No procesado.

T03: (10X UF concentrado) Concentrado mediante filtración en flujo tangencial mediante una membrana de peso molecular de corte de 100 KDa (fibra hueca). La reducción del volumen fina fue igual a 10X.

T04 y T05: (10X UF concentrado y centrifugado) células de micoplasma concentrados (de T03) se recogieron y lavaron una vez con PBS mediante centrifugación a ~20.000xg (Sorvall modelo RC5B).

T06 y T07: (10X centrifugado) El fluido de fermentación inactivado se centrifugó a ~20.000xg (Sorvall RC5B) y se lavó una vez resuspendiendo las células en PBS, seguido de una centrifugación adicional. La reducción del volumen fina fue igual a 10X.

T08: (10X centrifugado y calentado) Las células de mycoplasma se concentraron y lavaron según T06 y se calentaron hasta 65°C durante 10 minutos.

T09: (Sobrenadante sin células) El sobrenadante recogido de la primera centrifugación como se describe para T06 se esterilizó mediante filtración a través de un filtro de 0.2 micrómetros (Nalgene).

T10: (Sobrenadante sin células tratado con proteína A) El sobrenadante estéril (preparado según T09) se mezcló con la resina de proteína A (Proteína A Sefarosa, Pharmacia Inc) en una proporción en volumen 10:1 durante 4 horas. La resina se eliminó mediante filtración estéril y el fluido filtrado se almacenó a 2-8°C. Este procedimiento usa tratamiento con proteína A "cadena abajo" después de la fermentación para eliminar los anticuerpos y los inmunocomplejos. Aunque la presente invención no dificulta el tratamiento con proteína A cadena arriba, los presentes inventores han encontrado que, en el caso de M. hyo, el tratamiento con proteína A cadena arriba del medio de crecimiento dio resultados de p46 que eran inferiores e inconsistentes en comparación con el medio sin tratar (datos no mostrados).

Pruebas analíticas de antíqenos de M. hvo procesados cadena abajo En las preparaciones de antígenos de M. hyo procesados cadena abajo (preparadas como se ha descrito anteriormente) se analizó la recuperación del antígeno p46 específico de M. hyo y la presencia del anticuerpo de PCV2. Además, en estas preparaciones antigénicas de M. hyo se analizó la presencia del virus Torque Teño (TTV), incluidos el genotipo 1 (g TTV) y el genotipo 2 (g2TTV). Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 3.

TABLA 3 Caracterización de los antígenos de M. hyo procesados cadena abajo En referencia a la Tabla 2 anterior, la recuperación del antígeno p46 específico de M. hyo se demostró para cada una de las preparaciones antigénicas de . hyo procesadas cadena abajo. Además, los tratamientos siguientes eliminaron con éxito los anticuerpos frente a PCV2. 10X UF concentrado y centrifugad, 10x concentrado, 10x centrifugado y calentado y sobrenadante sin células (tratado con proteína A). Con respecto al TTV, los tratamientos siguientes eliminaron con éxito el gI TTV:. 0X UF concentrado y centrifugad, 10x centrifugado y calentado y sobrenadante sin células (tratado con proteína A). Solo el tratamiento designado 10X UF concentrado y centrifugado eliminó el g2TTV. Los aislados del virus Torque teño, incluidos los genotipos 1 y 2, se describen en el documento US201 10150913, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Dado que en la técnica se sabe que la proteína A se une a la IgG, los expertos en la técnica entienden que no solo los anticuerpos frente a PCV2, sino que también otros anticuerpos de cerdo, incluidos los anticuerpos frente a SRRP, los anticuerpos frente a HPS y los anticuerpos frente al SIV, serán eliminados con eficacia mediante el tratamiento con proteína A. Esto hace que el sobrenadante de M. hyo sin células tratado con proteína A de la presente invención sea compatible no solo con el antígeno de PCV2 sino también con otros antígenos porcinos debido a la falta de interferencia inmunológica entre los antígenos. Adicionalmente, es razonable esperar que la eliminación de los residuos celulares no protectores y la eliminación de la inmunoglobulina y los complejos antígeno / inmunoglobulina haga una vacuna más segura.

EJEMPLO 4: Preparación de formulaciones de vacuna experimentales de M. hyo Todas las vacunas experimentales de M. hyo se formularon con una concentración final del 5% de adyuvante Amphigen. Además, todas las vacunas se normalizaron con un ELISA de p46 y se conservaron con timerosol. Las formulaciones de vacunas experimentales se prepararon con antígenos de M. hyo procesados de acuerdo con los tratamientos T02-T10 anteriores. Además, el tratamiento T01 correspondía a un placebo (sin antígeno de M. hyo, solo 5% de adyuvante Amphigen), mientras que el tratamiento T11 es un control positivo correspondiente a una vacuna de M. hyo basada en bacterina caducada (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health). Estas formulaciones se describen en la Tabla 4 que se expone a continuación.

TABLA 4 Formulaciones de vacunas experimentales de M. hyo •Serie del producto veterinario en investigación (PVI) EJEMPLO 5: Evaluación de la eficacia in vivo de las vacunas frente a M. hyo con antíqenos de M. hyo de diferentes procesos cadena abajo Este estudio se realizó para evaluar la eficacia in vivo de las vacunas frente a Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo) con antígenos de M. hyo procedentes de diferentes procesos cadena abajo (PCA). En cerdos de 3 semanas de edad se inoculó por vía intramuscular una única dosis de las diferentes formulaciones de vacuna descritas en la Tabla 4 anterior. Dieciséis animales se incluyeron en cada uno de los grupos de tratamiento. Los animales fueron expuestos 21 días después de la vacunación a un aislado de campo de M. hyo virulento. La necropsia de los animales se realizó 28 días después de la exposición y se extirparon los pulmones y se puntuó la consolidación consistente con infección por M. hyo. El criterio principal para la protección contra la exposición a M. hyo fue la puntuación de la consolidación de los pulmones. Generalmente se acepta que existe una relación entre el tamaño de las lesiones pulmonares causadas por la neumonía enzoótica y un efecto adverso sobre la tasa de crecimiento. La Tabla 5 siguiente contiene las puntuación de la las lesiones pulmones para los respectivos grupos de tratamiento. La significación estadística se determinó mediante un análisis de modelos mixtos de las puntuaciones pulmonares para cada grupo.

TABLA 5 Resultados de las lesiones pulmonares Con referencia a la Tabla 5 anterior, los resultados con los antígenos de M. hyo de diferentes procesos cadena abajo indicaron que todas las vacunas experimentales a excepción de T04 diferían significativamente del placebo. Estos resultados de lesiones por M. hyo se representan gráficamente en la Figura 1. Como se muestra en la Figura 1 , T04 dio resultados inaceptables. Todos los demás tratamientos diferían significativamente del placebo (T01 ). Las puntuaciones de consolidación pulmonar indicaron que T02, T03 y T09-T1 1 proporcionaban la protección más eficaz contra la exposición a M. hyo.

La potencia relativa de p46 de las vacunas experimentales se evaluó usando un ensayo de tipo sándwich inmunsorción ligada a enzimas con dos anticuerpos (DAS-ELISA). Los resultados del DAS-ELISA de p46 presentados en la Tabla 5 anterior indican que todas las vacunas experimentales superaban la potencia diana. Además, la potencia relativa de p46 se mantuvo o aumentó durante el almacenamiento de las vacunas durante un periodo de un mes (datos no mostrados). Un incremento percibido de la potencia con el tiempo se observó en los antígenos centrifugados con la excepción de los antígenos sometidos a calor. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, es probable que las "carcasas" celulares se rompan con el tiempo y liberen más del antígeno p46 unido a la membrana en el caso de los antígenos centrifugados.

EJEMPLO 6: Evaluación de la compatibilidad de las vacunas experimentales frente a M. hyo con el antígeno de PCV2 Este estudio se realizó para evaluar la compatibilidad de las vacunas experimentales frente a M. hyo con antígenos de M. hyo procedentes de diferentes procesos cadena abajo con el antígeno de PCV2. Las formulaciones para vacuna experimentales de M. hyo se describen en las Tablas 4 y 5 anteriores. Las potencias relativas observadas de p46 para estas vacunas se describen en la Tabla 5 anterior. Estas vacunas experimentales frente a M. hyo se combinaron cada una con el antígeno del PCV2. En este ejemplo, el antígeno del PCV2 era un virus muerto quimérico de PCV de tipo 1-tipo 2 (Fostera PCV) preparado como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. El virus quimérico se incluyó en las composiciones a un nivel inicial de aproximadamente 1.6 < PR, en la que PR es la unidad de potencia relativa determinada mediante ELISA de cuantificación del antígeno de PCV2 (prueba de la potencia in vitro) en comparación con una vacuna de referencia eficaz.

Las formulaciones de combinación de M.hyo/PCV2 experimentales se evaluaron mediante ELISA de PCV2. Los resultados se presentan en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 2, solo las preparaciones del antígeno de M. Hyo de los siguientes procesos cadena abajo eran compatibles con el antígeno de PCV2. Ultrafiltración y Centrifugación (T04 y T05), Centrifugación (T06 y T07), Centrifugación más calor (T08) y sobrenadante tratado con proteína A (T10). De estos, el sobrenadante tratado con proteína A de M. hyo era el más compatible con el antígeno de PCV2 en comparación con el placebo control, que incluía el virus quimérico y el adyuvante Amphigen pero no antígeno de M. hyo. El nivel de virus PCV quimérico en el sobrenadante tratado con proteína A fue de 1.5 PR en comparación con 1 m69 PR para el placebo. Por tanto, se concluyó que no había interferencias inmunológicas, o estas eran mínimas, entre la preparación de antígeno soluble de M. hyo tratada con proteína A y el antígeno de PCV2 de virus quimérico.

La eficacia in vivo del sobrenadante de M.hyo tratado con proteína A demostrada en el Ejemplo 5 anterior junto con los resultados descritos en el presente ejemplo indicó que el sobrenadante tratada con proteína A era una plataforma potencialmente eficaz para las combinaciones de M.hyo-PCV2.

EJEMPLO 7: Evaluación de la eficacia de PCV2 de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en diferentes formulaciones de adyuvante Este estudio se diseñó para evaluar la eficacia de PCV2 de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en diferentes formulaciones de adyuvante. En este ejemplo, el antígeno de PCV2 era un virus quimérico de tipo 1 -tipo 2 de PCV muerto (Fostera PCV). El virus quimérico se combinó con una preparación de antígeno soluble de M. hyo sustancialmente libre de IgG (es decir, sobrenadante tratado con proteína A).

Procesamiento de fluidos: El fluido de fermentación inactivado (descrito anteriormente en el Ejemplo 1 ) se trató para cada grupo indicado del siguiente modo.

T02-T04: Todo el fluido de fermentación que contiene células vivas de M. hyopneumoniae (descritas anteriormente) se centrifugó a ~20.000 x g (Sorvall RC5B) y el sobrenadante se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 µ?. La rProteína A Sefarosa (número de parte 17-5199-03, GE Healthcare) se empaquetó en una columna de cromatografía 1 L. Tras la eliminación del tampón de almacenamiento y el tratamiento con 2 volúmenes de columna de ácido acético 1 M, la resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón NaPO4 50 mM /NaCI 1 M, a pH 7.04. Aproximadamente 2 litros de los fluidos que contienen el antígeno de M. hyopneumoniae aclarado/filtrado se pasaron a través de la resina de proteína A a un caudal de 100 cm/h. El flujo se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 µ?.

T05: Este es un control positivo correspondiente a una formulación de tipo Fostera PCV (sin antígeno de M. hyo). El nivel de virus quimérico en esta formulación de tipo Fostera PCV fue aproximadamente a los niveles de formulación de dosis mínimas inmunizantes (DMI). El virus quimérico se incluyó en las vacunas experimentales de PCV2/M. hyo a niveles de formulación similares.

Todas las vacunas de PCV2/M. hyo experimentales se formularon con diferentes formulaciones adyuvantes. Las formulaciones de vacunas experimentales se prepararon con antígenos de M. hyo procesados de acuerdo con los tratamientos T02-T04 anteriores. Además, el tratamiento T01 correspondía a un placebo (solución salina estéril).

Todas las vacunas se normalizaron con un ELISA de p46 y se conservaron con timerosol.

Estas formulaciones experimentales se describen en la Tabla 6 siguiente, en la que el símbolo * indica el antígeno de . hyo de la semilla global de M.hyo, el sobrenadante tratado con proteína A y el símbolo ** indica la serie de producto veterinario en investigación (PVI).

TABLA 6 Formulaciones de vacuna de PCV2 / M. hyo experimentales usadas para el estudio de eficacia de PCV2 En cerdos de 3 semanas de edad se inoculó por vía intramuscular una única dosis de las diferentes formulaciones de vacuna descritas en la Tabla 6 anterior. Dieciséis animales se incluyeron en cada uno de los grupos de tratamiento. Los animales fueron expuestos 21 días después de la vacunación a un aislado de campo de PCV2 virulento.

La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de viremia del PCV2 (PCR cuantitativa del PCV2) observados con las diferentes plataformas adyuvantes. Se observa que la viremia de PCV2 se usó como la variable principal de eficacia. Los resultados de la viremia de PCV2 se presentan como copias de ADN/ml. Como se muestra en la Figura 3, todos los tratamientos tenían una viremia significativamente menor en comparación con el placebo los días 28, 35 y 42 (la exposición se realizó el día 21). El adyuvante 10% de aceite SP presentó una viremia significativamente menor en comparación con 5% de Amphigen los días 28 y 35. El adyuvante 5% de Amphigen más 5% de SLCD presentó una viremia significativamente menor en comparación con 5% de Amphigen los días 28 y 35. La plataforma del adyuvante 20% de SLCD presentó una viremia significativamente menor en comparación con 5% de Amphigen los días 28, 35 y 42.

La serología del PCV2, la eliminación en heces de PCV2, la eliminación nasal del PCV2, las respuestas inmunitarias celulares (IMC), la depleción linfoide y la inmunohistoquímica (IHQ) también se controlaron como variables secundarias de eficacia. Ahora, estos resultados se describirán a continuación.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de ELISA del PCV2 los días 1 , 20 y 42 del estudio (la exposición se realizó el día 21 ). El estado de cada muestra se expresó como una proporción entre la muestra y el positivo (S/P). Como se muestra en la Figura 4, 20% de SLCD fue el único tratamiento que era significativamente diferente del placebo (T01) tanto el día 20 como el día 42. Asimismo, 5% de Amphigen era el único tratamiento que no era significativamente diferente del placebo el día 20.

La Figura 5 es un gráfico que muestra la eliminación en heces del PCV2 obtenida con los tratamientos T02-T04 frente al placebo (??1). Estos resultados se expresan como copias de ADN del PCV2 /mi. Los resultados en la Figura 5 indican que todos los tratamientos tenían una eliminación en heces significativamente menor en comparación con el placebo el día 42. Además, 5% de Amphigen y 5% de SLCD (T04) tenían una eliminación en heces significativamente menor en comparación con 5% de Amphigen (T03) el día 42. No se observaron otras diferencias en los tratamientos.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la eliminación nasal del PCV2 obtenida con los tratamientos T02-T04 frente al placebo (T01 ). Estos resultados se expresan como copias de ADN del PCV2 /mi. Los resultados en la Figura 6 indican que todos los tratamientos tenían una eliminación nasal significativamente menor en comparación con el placebo el día 42. Además, 20% de SLCD (T05) tenían una eliminación nasal significativamente menor en comparación con 5% de Amphigen (T03) el día 42. No se observaron otras diferencias en los tratamientos.

Las Figuras 7A y 7B son de dos gráficos que muestran los resultados de una prueba con interferon gamma (IFN-?) que mide las respuestas inmunitarias celulares (IMC) especvficas del PCV2. Los resultados de la IMC se muestran posteriores a la vacunación / previos a la exposición (Figura 7A) y posteriores a la vacunación / posteriores a la exposición (Figura 7B). En estos gráficos, la estimulación de 5 x 106 células se consideró significativa (...). Todas las vacunas experimentales de PCV2/M.hyo proporcionaron una respuesta detectable de IFN- ? posterior a la vacunación. El 10% de aceite SP ((T02) produjo la respuesta de IFN- ? más fuerte posterior a la vacunación. El 20% SLCD (T05) indujo una respuesta temprana, pero mostró la respuesta más baja el día 20. Se produjo una respuesta grande posterior a la exposición, especialmente en el grupo de placebo. Adicionalmente, la respuesta posterior a la exposición fue menor en los grupos de tratamiento de cerdos vacunados en comparación con el grupo de placebo.

La Tabla 7 a continuación muestra la depleción linfoide obtenida con los tratamientos experimentales en contraste con el placebo.

TABLA 7 Histopatoloqía del PCV2 (Depleción linfoide) Los resultados presentados en la Tabla 7 anterior muestran que todas las vacunas proporcionaban una protección fuerte contra la depleción linfoide. Asimismo, no se observaron contrastes de tratamiento con la vacuna estadísticamente significativos.

La Tabla 8 a continuación muestra la inmunohistoquímica obtenida con los tratamientos experimentales en contraste con el placebo.

TABLA 8 Histopatología del PCV2 (Inmunohistoquímica) Los resultados presentados en la Tabla 8 anterior muestran que todas las vacunas proporcionaban una protección fuerte contra la colonización del PCV2 como pone de manifiesto la inmumohistoquímica. Asimismo, no se observaron contrastes de tratamiento con la vacuna estadísticamente significativos.

En conclusión, los resultados presentados en este ejemplo demuestran que la preparación del antígeno soluble de M. hyo no interfiere en la eficacia del PCV2. Los resultados también muestran que todas las formulaciones de vacuna experimentales de PCV/M.hyo proporcionan eficacia contra la exposición a PCV2. Adicionalmente, los resultados indican que hay algunas diferencias estadísticas y numéricas obtenidas con las diferentes formulaciones de adyuvante, dando el 10% de aceite SP la eficacia más fuerte.

EJEMPLO 8: Evaluación de la eficacia de M. hyo de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en diferentes formulaciones de adyuvante Este estudio se diseñó para evaluar la eficacia de M. hyo de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en diferentes formulaciones de adyuvante. El antígeno de M. hyo se combinó con el circovirus porcino (quimera de tipo 1-tipo 2 o virus muertos de PCV1-2) en un frasco.

Procesamiento de fluidos: El fluido de fermentación inactivado (descrito anteriormente en el Ejemplo 1) se trató para cada grupo indicado del siguiente modo.

T02-T04: Estos tratamientos fueron los mismos que se han descrito para los grupos de tratamiento T02-T04 en el Ejemplo 7 anterior.

T05: Esto se formuló con células de M. hyo inactivadas (bacterina de M.hyo) como se describe en el Ejemplo 1 anterior bajo el encabezado "Fermentación e Inactivación".

Todas las vacunas de PCV2/M. hyo experimentales se formularon con diferentes formulaciones adyuvantes. Las formulaciones de vacunas experimentales se prepararon con antígenos de M. hyo procesados de acuerdo con los tratamientos T02-T04. Además, el tratamiento T01 correspondía a un placebo (solución salina estéril). El tratamiento T05 es un control positivo correspondiente a una vacuna de RespiSure® caducada, que es una vacuna basada en bacterina de M. hyo (Pfizer Animal Health).

Estas formulaciones experimentales se describen en la Tabla 9 siguiente, en la que el símbolo * indica el antígeno de M. hyo de la semilla global de M.hyo, el sobrenadante tratado con proteína A y el símbolo ** indica la serie de producto veterinario en investigación (PVI).

TABLA 9 Formulaciones de vacuna de PCV2 / M. hyo experimentales usadas para el estudio de eficacia de M. hyo en diferentes formulaciones de adyuvante En cerdos de 3 semanas de edad se inoculó por vía intramuscular una única dosis de las diferentes formulaciones de vacuna descritas en la Tabla 9 anterior. Catorce animales se incluyeron en los grupos de placebo y de 10% de aceite SP, trece animales se incluyeron en el grupo de control positivo y dieciséis animales se incluyeron en los grupos de 5% de Amphigen y 5% de Amphigen + 5% de SÑCD- Los animales fueron expuestos 21 días después de la vacunación a un aislado de campo de M. hyo virulento. La necropsia de los animales se realizó 28 días después de la exposición y se extirparon los pulmones y se puntuó la consolidación consistente con infección por M. hyo. La Tabla 10 siguiente contiene las puntuación de la las lesiones pulmones para los respectivos grupos de tratamiento. La significación estadística se determinó mediante un análisis de modelos mixtos de las puntuaciones pulmonares para cada grupo.

TABLA 10 Lesiones pulmonares por M. hyo Como se indica en la Tabla 10 anterior, el grupo de placebo tenía una puntuación media de la lesión pulmonar de 13.1 % en comparación con los grupos de tratamiento con 10% de aceite SP y 5% de Amphigen, cuyas puntuaciones medias pulmonares eran de 4.3% y 4.7% respectivamente. Las formulaciones tanto de 10% de aceite SP como de 5% de Amphigen redujeron y/o previnieron las lesiones pulmonares. Por tanto, las vacunas de PCV/M.hyo experimentales formuladas con 10% de aceite SP o 5% de Amphigen se consideraron eficaces. El antígeno de PCV2 no parecía interferir co la eficacia de M. hyo de estas formulaciones.

En contraste con esto, el grupo de 5% de Amphigen + 5% de SLCD tenía una puntuación media de las lesiones pulmonares de 12.0%, que era un resultado inaceptable en cuanto a que no era diferente en comparación con el placebo. En consecuencia, la vacuna de PCV/M.hyo experimental formulada con 5% de Amphigen + 5% de SLCD no se consideró tan eficaz.

Se ha observado que debido al reducido número de animales y a la elevada variabilidad en la puntuación de las lesiones pulmonares, en este estudio no se pudo demostrar de forma concluyente un efecto significativo del tratamiento. Por este motivo, se decidió que se diseñaría otro estudio para analizar la eficacia de M.hyo de las formulaciones experimentales de PCV/M.hyo en 10% de aceite SP. Este estudio de repetición se presenta en el Ejemplo 9 siguiente.

EJEMPLO 9: Evaluación de la eficacia de M. hyo de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en 10% de aceite SP Este estudio es una prueba de concepto diseñada para evaluar la eficacia de la fracción de M.hyo de cuatro vacunas experimentales contra PCV2/M. hyo (Series L071 1 RK1 1 , L071 1 RK12, L071 1 RK13 y L071 1 RK14 en la Tabla 11 siguiente) preparada mediante diferentes procedimientos de fabricación de M. hyo que usan proteína A para la eliminación de la IgG en comparación con las vacunas control preparadas con el procedimiento estándar de fabricación de M. hyo. Cada una de estas cuatro vacunas de PCV2/ . hyo experimentales incluyó 10% de aceite SP como adyuvante.

Procesamiento de fluidos: T02: Antígeno inactivado de M. hyopneumoniae como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" en el Ejemplo 1 anterior.

T03 y T04: Formulado con células inactivadas de M. hyopneumoniae como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" en el Ejemplo 1 anterior.

T05: Tratamiento con proteína A del medio usado para cultivar M. hyopneumoniae. El PPLO (derivado de corazón porcino se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante (es decir, 21 g/l) y la solución de extracto de levaduras se preparó a 21 g/l en USP. Al PPLO se añadió solución de extracto de levaduras a 6.25% y la mezcla se esterilizó calentando hasta 121 °C durante > 30 minutos. Se preparó clorhidrato de cisteína a 90 g/l y se esterilizó mediante filtración. La solución de dextrosa se preparó añadiendo 450 g de dextrosa por litro de agua USP seguido de esterilización con calor. Para preparar el medio final se añadió al medio base suero porcino al 10%, seguido de cisteína al 0.01 % y dextrosa al 1.0%. Los anticuerpos del medio PPLO completo se eliminaron mediante tratamiento con proteína A. Brevemente, un litro de rProteína A Sefarosa (número de parte 17-5199-03 GE Healthcare) se empaquetó en una columna de vidrio (10 X 1 1.5 cm). Después de la eliminación del tampón de almacenamiento, la columna se trató con 2 volúmenes de columna de ácido acético 1 M. La resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de NaPO4 50 mM, NaCI 1 M (pH 7.0). Quince litros del medio PPLO completo se cargaron sobre la resina a una caudal lineal de 140 cm/hora. El flujo de la columna se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 micrómetros (Sartorius). El medio tratado se usó para propagar células de M. hyopneumoniae como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" anteriormente. El cultivo entero inactivado (incluidas las células) se formuló en la vacuna final.

T06: Las células inactivadas de M. hyopneumoniae se prepararon como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" en el Ejemplo 1 anterior. El fluido de fermentación inactivado se centrifugó a ~20.000xg (Sorvall RC5B) durante 30 minutos y el sobrenadante se esterilizó mediante filtración en 0.2 uM. Ciento quince mi de la resina de rProteína A (número de parte 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) se empaquetaron en una columna de cromatografía (5x6 cm). Tras la eliminación del tampón de almacenamiento y el tratamiento con 2 volúmenes de columna de ácido acético 1 M, la resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón NaPO4 50 mM /NaCI M, a pH 7.01. Aproximadamente 1.2 litros de los fluidos que contienen el antígeno de M. hyopneumoniae aclarado/filtrado se pasaron a través de la resina a un caudal de 120 cm/h. El flujo se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 µ?.

T07: Las células inactivadas de M. hyopneumoniae se prepararon como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" en el Ejemplo 1 anterior. El fluido de fermentación inactivado se aclaró mediante filtración del flujo tangencial. Brevemente, un filtro de poliétersulfona (GE HealthCare, número de parte 56-4102-71 ) con un tamaño de poro nominal de 0.2 µ? se limpió con una solución de hidróxido sódico 0.5N, seguido por aclarado extenso con agua estéril USP. EL fluido de cultivo de micoplasma inactivado se introdujo en el aparato a una tasa de recirculación dirigida a 14.6 l/minuto y a una presión transmembrana de 2-3.4 PSI. El aclarado se realizó a temperatura ambiente. El permeado del filtro se recogió y almacenó a 2-8 °C hasta su posterior procesamiento. Ciento quince mi de la resina de rProteína A (número de parte 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) se empaquetaron en una columna de cromatografía (5x6 cm). Tras la eliminación del tampón de almacenamiento y el tratamiento con 2 volúmenes de columna de ácido acético 1 M, la resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón NaPO450 mM /NaCI 1 M, a pH 7.01. Aproximadamente 2.3 litros de los fluidos que contienen el antígeno de M. hyopneumoniae aclarado/filtrado se pasaron a través de la resina a un caudal de 120 cm/h. El flujo se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 µ?.

T08: Las células ¡nactivadas de M. hyopneumoniae se prepararon como se ha descrito en "Fermentación e Inactivación" anteriormente. El fluido de fermentación inactivado se centrifugó a ~20.000xg (Sorvall RC5B) durante 30 minutos y el sobrenadante se esterilizó mediante filtración en 0.2 uM. Ciento quince mi de la resina de rProteína A (número de parte 17-5199-03, GE Healthcare) se empaquetaron en una columna de cromatografía (5x6 cm). Tras la eliminación del tampón de almacenamiento y el tratamiento con 2 volúmenes de columna de ácido acético 1 M, la resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón NaPO450 mM /NaCI 1 M, a pH 7.01. Aproximadamente 1.2 litros de los fluidos que contienen el antígeno de M. hyopneumoniae aclarado/filtrado se pasaron a través de la resina a un caudal de 120 cm/h. El flujo se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 µ?.

Las formulaciones de vacunas experimentales se prepararon con antígenos de M. hyo procesados de acuerdo con los tratamientos T02-T08 anteriores. T02, T03 y T04 correspondían a los controles positivos. Además, el tratamiento T01 correspondía a un placebo (solución salina estéril).

Estas formulaciones experimentales se describen en la Tabla 1 1 que se expone a continuación. El antígeno de M. hyo corresponde al antígeno de M. hyo de la semilla global de M. hyo, sobrenadante tratado con proteína A. La información en la columna "Tratamiento con proteína A" indica si el sobrenadante de M. hyo se trató con proteína A antes o después de la fermentación.

TABLA 11 Formulaciones de vacuna de PCV2 / M. hvo experimentales usadas para el estudio de eficacia de M. hyo en adyuvante de aceite SP En cerdos de 3 semanas de edad se inoculó por vía intramuscular una única dosis de las diferentes formulaciones de vacuna descritas en la Tabla 1 1 anterior. En cada grupo de tratamiento se incluyeron 18 cerdos. Los animales fueron expuestos 21 días después de la vacunación a un aislado de campo de M. hyo virulento. La necropsia de los animales se realizó 28 días después de la exposición y se extirparon los pulmones y se puntuó la consolidación consistente con infección por M. hyo. La Figura 8 y la Tabla A muestran las puntuaciones de la las lesiones pulmones para los respectivos grupos de tratamiento. La significación estadística se determinó mediante un análisis de modelos mixtos de las puntuaciones pulmonares para cada grupo.

TABLA A Contraste de los tratamientos T02-T08 con el placebo Los resultados de la lesión pulmonar representados en la Figura 8 y la Tabla A indican que de todos los tratamientos, solo dos (T07 y T08) tenían un 100% de los cerdos en la categoría de lesión pulmonar < 5%. Cabe destacar que en este estudio se observó una fuerte diferencia estadística.

Los resultados del presente ejemplo demuestran una eficacia significativa de M. hyo en una formulación experimental de PCV2/M. hyo en 1 frasco usando el sobrenadante de M. hyo tratado con proteína A y usando aceite SP como adyuvante. Adicionalmente, en el Ejemplo 7 anterior se demostró la eficacia del PCV2 en una formulación de PCV2/M. hyo en 1 frasco usando el sobrenadante de M. hyo tratado con proteína A y usando aceite SP como adyuvante. En conjunto, se ha demostrado la eficacia tanto de M.hyo como de PCV2 en una formulación de PCV2/M. hyo en 1 frasco usando el sobrenadante de M. hyo tratado con proteína A.

EJEMPLO 10: Seguridad in vivo de vacunas experimentales de PCV2/M. hyo Este estudio se realizó para evaluar la seguridad in vivo de vacunas de PCV2-M.hyo experimentales formuladas a la dosis de antígeno máxima en varias formulaciones de adyuvante en el animal huésped cuando se administra a la edad más joven (3 semanas de edad). Se evaluaron diferentes plataformas de adyuvantes con el fin de determinar cuál de estas plataformas proporcionaba un perfil de seguridad aceptable en base a la temperatura, las reacciones en el punto de inyección y las observaciones clínicas. Se usó una formulación de 20% de SLCD/10% de aceite SP como control positivo ("no seguro") debido a problemas históricos con las reacciones en el punto de inyección observadas por este grupo de investigación y otros.

Procesamiento de fluidos: Todas las vacunas se prepararon con antígeno inactivado de M. hyopneumoniae como se describe en "Fermentación e Inactivación" en el Ejemplo 1. Se usó la masa total del antígeno de M.hyo, ya que se sabía que contenía antígenos de M.hyo tanto solubles como insolubles, además de las inmunoglobulinas y los inmunocomplejos que se eliminarían tras el tratamiento con proteína A. Es razonable concluir que la eliminación de residuos celulares insolubles y de las inmunoglobulinas e inmunocomplejos solo potenciarían más la seguridad de las formulaciones de vacuna. La intención de este estudio era analizar de un modo riguroso la seguridad de varias formulaciones de adyuvante que contenían el antígeno de PCV2 y el antígeno de M.hyo. Los antígenos de PCV2 y M. hyo se formularon a niveles de liberación máximos para evaluar más la seguridad. Estas formulaciones experimentales se describen en la Tabla 12 que se expone a continuación. PVI indica producto veterinario en investigación (PVI).

TABLA 12 Formulaciones de vacuna de PCV2 / M. hyo experimentales usadas para el estudio de seguridad *Antígeno de M hyo = de la semilla global de M hyo (masa total de antígeno) Los parámetros de segundad usados en este estudio eran el perfil de temperatura rectal y las reacciones en el punto de inyección. Los resultados de este estudio indicaron que todas las plataformas de adyuvantes candidatas proporcionaban un perfil de seguridad aceptable en términos del perfil de temperatura rectal y las observaciones clínicas (resultados no mostrados). Solo el 20% de SLCD + 10% de aceite SP (es decir, el control positivo) fue significativamente diferente de la vacuna placebo y produjo una serie de reacciones graves en el punto de inyección (resultados no mostrados).

EJEMPLO 11 : Preparación de antíqeno de M.hvo tratado con proteína A para los estudios centrales La Figura 9 es un diagrama de flujo que muestra una realización de un procedimiento de fabricación usado para preparar una proteína A compatible con PCV2 tratada con el antígeno del M. hyo. Los cultivos enteros inactivados de M.hyo se aclararon de células mediante filtración en flujo tangencial. Brevemente, un filtro de poliétersulfona (GE HealthCare, número de parte 56-4102-49) con un tamaño de poro nominal de 0.45 µ? se limpió con una solución de hidróxido sódico 0.5N, seguido por aclarado extenso con agua estéril USP. El fluido de cultivo de micoplasma inactivado se introdujo en el aparato a una tasa de recirculación dirigida a 1 1.0 l/minuto y a una presión transmembrana de 5~5 PSI. El aclarado se realizó a temperatura ambiente. El permeado del filtro se recogió y almacenó a 2-8°C hasta su posterior procesamiento.

Tras el aclarado, los fluidos que contienen antígeno se trataron con resina de proteína A para reducir los niveles de anticuerpos. Brevemente, la resina de proteína A MAbSelecr (GE Healthcare) se empaquetó en una columna de vidrio hasta una altura de 12 cm. La resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de fosfato sódico 50 m , 250 mM NaCI (pH 7.0). Un fluido que contenía el antígeno, equivalente a 10 volúmenes de columna, se cargó sobre la resina a una caudal lineal de 100 cm/hora. El flujo de la columna se recogió y esterilizó a través de un filtro de 0.2 micrómetros. La regeneración de la columna se alcanzó mediante flujo de 3 volúmenes de columna de solución de acetato 25 mM a pH 3.7, seguido de 4 volúmenes de columna de solución de ácido acético 1 M. Los niveles de anticuerpos anti-PCV2 y de antígeno de M. hyopneumoniae se midieron en el fluido de antígeno final mediante ELISA de anticuerpos específicos de PCV2 y ELISA de cuantificación del antígeno p46, respectivamente.

EJEMPLO 12: Eficacia de la fracción quimérica PCV1-2 tras la administración intramuscular de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en 10% de aceite SP El estudio presentado en este ejemplo se diseñó para evaluar la eficacia de la fracción con virus muerto quimérico de PCV1-2 de una vacuna de combinación experimental de PCV2/M.hyo en 1 frasco administrada una vez a cerdos de 21 ±3 días de edad y expuestos al aislado virulento de PCV2 aproximadamente a las 6 semanas de edad.

Cuatro vacunas bivalentes de PCV1 -2/M.hyo experimentales a diferentes niveles de dosis de antígeno pero equilibradas y una vacuna monovalente experimental de M. hyo (control negativo) se formularon con el antígeno de pase más alto. El lote control antígeno de M. hyo se preparón como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 1. El antígeno de PCV2 era un antígeno de cPCV1-2 muerto preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior. Antes de la inactivación del virus quimérico, el lote del antígeno de PCV2 se concentró 20 X y los concentrados se lavaron con una solución salina equilibrada. Las formulaciones de vacuna experimentales finales se adyuvaron usando 10% de aceite SP. Se proporcionan las formulaciones experimentales se describen más adelante y en la Tabla 13, en la que la dosis de antígeno (% de los lotes de antígeno de PCV2 y M. hyo.

T01 : Preparación experimental (L1211 RK11) del antígeno de .hyo antigen (14.1 %-alto) sin fracción del virus quimérico de PCV de tipo 1-tipo 2 (0%). Esto corresponde a un control negativo (M. hyo monovalente).

T02: Preparación experimental (L121 1 RK09) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (1.375%-alto) y del antígeno de M.hyo (14.1 %-alto).

T03: Preparación experimental (L121 1 RK15) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (0.688%-medio) y del antígeno de M.hyo (9.4%-medio).

T04: Preparación experimental (L0112RK03) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (0.344%-bajo) y del antígeno de M.hyo (4.7%-bajo).

T05: Preparación experimental (L121 1 RK173) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (0.172%-muy bajo) y del antígeno de M.hyo (2.32%-muy bajo).

TABLA 13 Diseño experimental 1 PVI = Circovirus porcino de tipo 1 -vacuna con el virus muerto quimérico de tipo 2 (PCV2), - Extracto de la bacteria ycoplasma Hyopneumoniae (M hyo) PC= Extracto de la bacteria Mycoplasma Hyopneumoniae adyuvada con 10 % de aceite SP (sin fracción quimérica del circovirus porcino de tipo 1 -tipo 2) IM = vía intramuscular El día 0 (3 semanas de edad) se administró una única dosis de 2 mi de la vacuna asignada mediante inyección IM en la parte derecha del cuello de cada cerdo incluido en el estudio. No se observaron acontecimientos adversos tras la vacunación. Se recogió una muestra de suero de todos los cerdos semanalmente antes de la exposición. Todos los cerdos en los que se detectó viremia del PCV2 antes de la exposición se eliminaron del estudio. El día antes de la exposición se obtuvieron muestras fecales y de suero. Después, se expuso a los cerdos al virus de exposición PCV2a. La exposición se llevó a cabo aproximadamente 3 semanas después de la vacunación (día 21 ). En cada cerdo se inoculó un total de 3 mi del virus de exposición del PCV2a (Aislado 40895, prediluido a 5.10 log DIFA50/ml) con 2 mi por vía intranasal y 1 mi por vía intramuscular en la parte izquierda del cuello. Un alícuota reservado del virus de exposición se tituló tras la exposición para confirmar la dosis de exposición real. La masa sin diluir se prediluyó 2 veces y loa resultados de retrotitulación alcanzaron un nivel de exposición de DIFA50 5.10 log-io /ml. Antes de la necropsia se obtuvieron muestras de suero y fecales semanalmente durante la fase de exposición de tres semanas. A las tres semanas de la exposición se sacrificó a todos los cerdos y se realizó la necropsia. Las muestras de suero y de heces se recigieron junto con 4 tejidos linfoides diferentes. Durante la necropsia se obtuvieron secciones de tres ganglios linfáticos (traqueobronquiales, mesentéricos, inguinales) y de amígdala para cada cerdo y se identificaron individualmente y se fijaron en 10% de solución de formalina tamponada. Los resultados de los ensayos se proporcionan más adelante.

Pruebas de potencia de la vacuna La serie de vacuna de L121 1 RK15 PCV/M.hyo descrita con anterioridas se consideró el candidate de referencia. En consecuencia, se determinó la potencia relativa para la fracción de M.hyo y la fracción de PCV2 frente a este candidate de referencia. Estos resultados se presentan en la Tabla 14 que se expone a continuación. La serie L1211 RK1 1 corresponde al placebo (sin fracción de PCV2).

TABLA 14 Resultados de potencia Referencia L1211 RK15 N° de serie Potencia de M. hyo Potencia de PCV L1211RK12 1.57 L1211RK09 L1211RK15 1.05 L0112RK03 0.56 L1211RK17 0.27 Los resultados mostrados para cada serie son las medias para todos los duplicados analizados.

Viremia del PCV2 Tras la exposición, en comparación con el grupo placebo, todos los grupos vacunados tenían una reducción significativa del porcentaje de cerdos virémicos [P<0.05], y durante el studio al menos el 47% de los credos d elos grupos tratados (T02-T05) permanecieron negativos para la viremia del PCV2 (Tabla 15 más adelante. De un modo similar, todos los grupos de vacunas tenían un número de copias de ADN del PCV2 (P=0.0001 ) significativamente menor que el grupo placebo tras la exposición (datos no mostrados).

TABLA 15 qPCR Cualtitativa de la viremia en suero- Porcentaje de positivos y estimación de la fracción prevenida Eliminación en heces de PCV2 Las muestras de heces tras la exposición revelaron un 83.3% de los cerdos del grupo de placebo (T01 ) positivos para la eliminación en heces de PCV2. En contraste con ello, todos los grupos de vacunas (T02-T05) tenían una reducción significativa del porcentaje de credos que eliminan AND de PCV2 detectable por PCR (P<0.0061 ). Estos resultados se presentan en la Tabla 16 que se expone a continuación. De un modo similar, todos los grupos de vacunas tenían un número de copias de ADN del PCV2 significativamente menor que el grupo placebo tras la exposición (datos no mostrados).

TABLA 16 Eliminación en heces siempre presente tras la exposición (Día >21) Respuesta de anticuerpos en suero Todos los cerdos eran seronegativos para PCV2 antes de la vacunación. Los cerdos en el grupo de placebo permanecieron seronegativos antes de la exposición. En contraste con ello, los cerdos de los grupos de vacunas a excepción del grupo T05 mostraron incrementos significativos (P<0.0287) del título de anticuerpos frente a PCV2 el día 20 después de la vacunación en comparación con el placebo, lo que indica la respuesta inmunitaria active frente al PCV2 tras la vacunación. Los títulos del ELISA de PCV2 se resumen en la Tabla 17 que se expone a continuación. Los títulos previos a la exposición indicaron una diferencia significativa (P= 0.0393) en los grupos T02 y T03 con respecto al grupo T01 los días 7-20 y entre los grupos T01 y T04 el día 20 (P < 0.0287). Los días 28 a 42 todos los grupos de vacuna tenían títulos significativamente mayores que T01 (P= 0.0129; Tabla 17 a continuación).

TABLA 17 ELISA DE PCV2, títulos S/P Comparación del tratamiento por día de estudio 'Cuando el contraste es significativo (<0.05) se indica un valor p, los valores P > 0.05 se designan como ns (no significativos) Lesiones linfoides y colonización En el momento de la necropsia, cuando se comparó con el grupo de placebo, todos los grupos vacunados tenían una reducción significativa de la cantidad total de antígeno de PCV2 detectado en los tejidos. Los datos sobre la infección por PCV2 en tejidos linfoides (countuacion IHQ) se resumen en la Tabla 18 que se expone a continuación. Como se muestra en la Tabla 18, todos los grupos de vacuna tenían puntuaciones IHQ significativamente menores que el grupo de placebo T01.

TABLA 18 Puntuaciones IHQ del PCV2: Si tejidos linfoides o amígdalas eran anómalos * El animal se consideró anormal si la puntuación era > 0 en algún tejido linfoide o muestra de amígdala.

Todos los grupos vacunados también presentaron una reducción de la deplecion linfoide del PCV2 como se muestra en la Tabla 19 a continuación.

TABLA 19 Deplecion linfoide de PCV2: Si tejidos linfoides o amígdalas eran anómalos * El animal se consideró anormal si la puntuación era > 0 en algún tejido linfoide o muestra de amígdala.

Además, todos los grupos vacunados también presentaron una reducción significativa de la sustitución histiocítica como se muestra en la Tabla 20 a continuación.

TABLA 20 Sustitución histiocítica de PCV2: Si tejidos linfoides o amígdalas eran anómalos El animal se consideró anormal si la puntuación era > 0 en algún tejido linfoide o muestra de amígdala. ** se usó la prueba exacta de Fisher debido a la falta de convergencia, por tanto no se determinaron las medias de mínimos cuadrados (ND) Los datos presentados en este ejemplo indican que los grupos de vacuna: Protegían significativamente y ayudaban a la prevención de la viremia del PCV2 tras la exposición; Ayudaban significativamente a la prevención de la eliminación en heces del PCV2 tras la exposición en todos los animales vacunados.

Producían una respuesta serológica estadísticamente significativa 28 días después de la vacunación en los grupos T02-T05. Además, T02 y T03 mostraron una respuesta estadísticamente significativa ya a los 7 días de la vacunación en comparación con T01 ; Reducían significativamente las lesiones microscópicas (depleción linfoide y sustitución histiocítica) en todos los animales vacunados; y Todas las vacunas demostraron ser eficaces y la vacuna de serie L121 1 RK15 se seleccionó como una candidata de referencia.

EJEMPLO 13: Eficacia de la fracción quimérica M.hvo tras la administración intramuscular de una vacuna de combinación de PCV2 / M. hyo en 1 frasco en 10% de aceite SP El objetivo del estudio presentado en este ejemlo era evaluar la eficacia de la fracción de Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) en una vacuna experimental con virus muerto quimérico de circovirus porcino (PCV) de tipo 1 -tipo 2, extracto de bacteria Mycoplasma Hyopneumoniae (M hyo), adminisrerada por vía intramuscular una vez a credos de 21 ± 3 días de edad y expuestos a un homogeneizado pulmonary virulento de M. hyopneumoniae a Ias7 semanas de la vacunación.

Cuatro vacunas bivalentes de PCV1-2/M.hyo experimentales a diferentes niveles de dosis de antígeno pero equilibradas y una vacuna monovalente experimental de PCV2 (control negativo) se formularon. El lote control antígeno de M. hyo se preparó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 1. El antígeno de PCV2 era un antígeno de cPCV1-2 muerto preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.. Antes de la inactivación del virus quimérico, el lote del antígeno de PCV2 se concentró 20 X y los concentrados se lavaron con una solución salina equilibrada. Las formulaciones de vacuna experimentales finales se adyuvaron usando 10% de aceite SP. Se proporcionan las formulaciones experimentales se describen más adelante y en la Tabla 21 , en la que la dosis de antígeno (% de los lotes de antígeno de PCV2 y M. hyo.

T01 : Preparación experimental (L121 1 RK10) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (1.375%-alto) sin fracción de M.hyo (0%). Esto corresponde a un control negativo (PCV2 monovalente).

T02: Preparación experimental (L121 1 RK09) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (1.375%-alto) y del antígeno de M.hyo (14.1 %-alto).

T03: Preparación experimental (L121 1 RK15) del virus quimérico muerto de PCV de tipo 1-tipo 2 (0.688%-medio) y del antígeno de M.hyo (9.4%-medio).

TABLA 21 Diseño experimental 1 PVI = Producto veterinario en investigación= Circovirus porcino de tipo 1 -vacuna con el virus muerto quimérico de tipo 2 (PCV2), - Extracto de la bacteria ycoplasma Hyopneumoniae (M hyo) PC = Producto control = fracción quimérica de virus PCV1-2 muerto adyuvado con 10 % de aceite SP-oil 10 % (sin fracción de M. hyopneumoniae) IM = via intramuscular El día 9, 123 cerdos clínicamente sanos susceptibles se incluyeron en este estudio a las tres semanas de edad. Los cerdos se bloquearon por carnada y se les asignó al azar a un grupo centinela (NTX) o uno d elos tres grupos de tratamiento (T01-T03); se les administró por vía IM 2 mi de una vacuna experimental PCV1-2/ . hyopneumoniae a la dosis mínima inmunizante (DMI), una vacuna experimental de PCV1-2/M. hyopneumoniae a una dosis ligeramente mayor que la DMO o un placebo que contenía PCV1-2 solo a la DMI. Siete semanas después de la vacunación se sacrificó a los cerdos y se realizó la necropsia para confirmar ausencia de M. hyopneumoniae y todos los cerdos tratados fueron expuestos dos veces (dos días seguidos) a un homogeneizado pulmonar/ virulento de M. hyopneumoniae. A las cuatro semanas de la exposición se sacrificó a todos los cerdos restantes y se realizó la necropsia. En la necrospia se puntuaron las lesiones pulmonares típicas de M. hyopneumoniae. Las lesiones pulmonares precias a la exposición son la variable principal del resultado. La vacunación se considera eficaz si el intervalo de confianza del 95% menor de la fracción mitigada es >0- Pruebas de potencia de la vacuna La serie de vacuna de L121 1 RK15 PCV/M.hyo descrita con anterioridad se consideró el candidato de referencia. En consecuencia, se determinó la potencia relativa para la fracción de M.hyo y la fracción de PCV2 usadas en este estudio de eficacia de M. hyo frente a este candidato de referencia. Estos resultados se presentan en la Tabla 22 que se expone a continuación. La serie L1211 RK10 corresponde al placebo (sin fracción de M.hyo).

TABLA 22 Resultados de potencia Los resultados mostrados para cada serie son las medias para todos los duplicados analizados. 1 Potencia de M. hyopneumoniae analizada en cinco duplicados. 2 Potencia de PCV potency analizada en un duplicado (L1211 RK10), o cinco duplicados (L1211 RK09, L1211 RK15).

Seroloqía Los títulos de los anticuerpos frente a M- hyo indicaron que todos los cerdos eran serológicamente negativos para M. hyopneumoniae el día 0 y permanecieron negativos antes de la exposición. En todos los puntos de tiempo después de la vacunación (Días 21 , 47 and 75) T02 y T03 tenían medias geométricas de mínimos cuadrados de los títulos de anticuerpos frente a M. hyopneumoniae significativamente mayores (P<0.0004) que T01 (datos serológicos no mostrados).

Porcentaje del total de lesiones pulmonares Las distribuciones de la frecuencia de las puntuaciones de lesiones pulmonares para cada lóbulo se calcularon por tratamiento. El porcentaje del pulmón total con lesiones se calculó usando la fórmula: Porcentaje del pulmón total con lesiones = {(0.10 x craneal izquierdo) + (0.10 x medio izquierdo) + (0.25 x caudal izquierdo) + (0.10 x craneal derecho) + (0.10 x medio derecho) + (0.25 x caudal derecho) + (0.10 x accesorio)}. Se aplicó transformación de raíces cuadradas al porcentaje de pulmón total con lesiones antes del análisis. El porcentaje del pulmón total con lesiones se analizó usando un modelo lineal mixto. Se realizaron comparaciones pareadas entre los grupos de tratamiento si el efecto del tratamiento era significativo. Las medias de mínimos cuadrados retrotransformadas del porcentaje del pulmón total con lesiones y sus intervalos de confianza del 95% se calcularon, además de los mínimos y los máximos. Las lesiones pulmonares se resumieron con la fracción mitigada estratificada y los límites de confianza del 95%. Los resultados de lesiones pulmonares se muestran en la Tabla 23 que se expone a continuación.

TABLA 23 Análisis del porcentaje de pulmón total con lesiones Medias de mínimos cuadrados retrotransformadas Los grupos de tratamiento con la misma letra no son significativamente diferentes al valor P 0.05 En los pulmones de los cerdos del grupo NTX se observó un pequeño porcentaje de lesiones pulmonares, que se atribuyó a una incidencia conocida de Bordetella en esta piara. Los cultivos bacterianos de muestras de tejido pulmonar confirmaron que varios cerdos eran positivos para . bronchiseptica y el cultivo de M. hyopneumoniae confirmó que todos los cerdos de NTX eran negativos para M. hyopneumoniae antes de la administración de la exposición.

El protocolo cumplió con el criterio de validez en donde las medias LS para las lesiones pulmonares para T01 fueron >4%. Las medias LS para las lesiones pulmonares para T02 y T03 eran significativamente menores (P<0.05) que en T01 y ambas cumplieron los criterios de la fracción mitigada de que el intervalo de confianza del 95 5 menor era > 0. Los requisitos de validez de este estudio se cumplieron en cuanto a que no había signos de exposición previa a M. hyopneumoniae. La exposición era válida en cuanto a que las medias retrotransformadas de las puntuaciones de lesiones pulmonares en los cerdos tratados con placebo (T01) era > 4%.

En comparación con el grupo de control negativo (T01 ), los grupos de tratamiento T02 y T03 demostró una reducción significativa (P < 0.05) en el porcentaje de pulmón con lesión en comparación con T01 Las fracciones mitigadas para T02 y T03 en comparación con T01 cumplieron los criterios de eficacia del protocolo.

En las condiciones de este estudio, ambas vacunas (T02 y T03) ayudaron a mitigar las lesiones pulmonares, la variable principal de eficacia. Los resultados del presente ejemplo demuestran una eficacia significativa de M. Hyi en una formulación experimental de PCV2/M.hyo en 1 frasco.

EJEMPLO 14: Evaluación de la actividad virucida contra el virus del SRRP Los estudios presentados en este ejemplo se diseñaron para evaluar las diversas plataformas de adyuvantes para la actividad virucida contra el virus del SRRP. Los experimentos iniciales se centraron en el adyuvante solo (es decir, las formulaciones no contenían antígenos de PCV ni de M.hyo) La evaluación del adyuvante de la actividad virucida del SRRP se presenta en la Tabla B. La evaluación virucida preliminar indicó que 10% de aceite SP, 0.2% de Carbopol y 2.5% de Amphigen no eran virucidas para el virus del SRRP. En contraste con ello, el adyuvante 20% de SLCD parecía ser virucida para el virus del SRRP.

TABLA B Evaluación del adyuvante para determinar la actividad virucida contra el virus del SRRP Se realizaron otros estudios para evaluar si las formulaciones de PCV/M.hyo adyuvadas con las diferentes plataformas de adyuvante eran no virucidas para el virus del SRRP. Estos resultados se presentan en la Tabla 24 a continuación, en la que el símbolo * indica las series de vacunas que eran virucidas para el virus del SRRP.

TABLA 24 Resultados del ensayo de actividad virucida para el virus del SRRP con diferentes formulaciones "Indica actividad virucida (pérdida > 0.7 log) A - Control del ensayo virucida G T ~5.53 log/ml A - Control del ensayo virucida GMT ~6.42 log/ml Los resultados presentados en la Tabla 24 anterior indican que 10% de aceite SP no es virucida para el virus del SRRP.

Además se prepararon series de vacuna PCV/M.hyo usando 10% de aceite SP como adyuvante (Tabla 25). La potencia antigéncia de estas series de vacunas se comparó con una vacuna de referencia de PCV/M.hyo (L1211 RK15) descrita anteriormente. Los resultados presentados en la Tabla 25 a continuación indican que 10% de aceite SP no es virucida para el virus del SRRP. Los valores de la muestra de ensayo en la Tabla 25 fueron cada uno superior (signo +) que el control del ensayo virucida, que tenía un título medio geométrico (GMT) de aproximadamente 5.9±0.5 log/ml.

TABLA 25 Resultados del ensayo virucida con diferentes formulaciones de PCV/M.hyo advuvadas con 10% de aceite SP Control del ensayo virucida GMT ~5.9 + 0.5 log/ml Los resultados presentados en este ejemplo demuestran que 10% de aceite SP no es virucida para el virus del SRRP. Los resultados presentados en este ejemplo también demuestran que la formulación de PCV/M.hyo adyuvada con 10% de aceite de SP estaba entre las series de vacunas que se consideraron no virucidas para el virus del SRRP (Tabla 24 y Tabla 25). En conclusión, la formulación de PCV/M.hyo adyuvada con 10% de aceite de SP se consideró una plataforma eficaz sobre la cual basar una combinación trivalente incluyendo PCV, M.hyo y el virus del SRRP.

EJEMPLO 15: Preparación de una vacuna de combinación de PCV/M.hvo/SRRP Una formulación de PCV/M.hyo adyuvada con una plataforma de adyuvante que no es virucida para el virus del SRRP (véanse las Tablas 24 y 25 anteriores) se proporciona como una composición líquida lista para usar en un frasco. Esta formulación de PCV/M.hyo en un frasco usa sobrenadante de M.hyo tratado con proteína A. Se ha demostrado la eficacia tanto de M.hyo como de PCV2 en estas formulaciones de PCV2/M. hyo usando el sobrenadante de M. hyo tratado con proteína A (véanse los Ejemplos 7-9). En el presente ejemplo, esta formulación divalente de PCV2/M.hyo se combina con un antígeno monovalente del virus del SRRP.

En una realización se proporciona una combinación de PCV/M.hyo en 10% de aceite SP y correspondiente a una de las series de vacuna L071 1 RK11 , L071 1 RK12, L071 1 RK13 y L071 1 RK14 en la Tabla 11 anterior o L121 1 RK09, L1211 RK15, L01 12RK03 y L121 1 RK17 en la Tabla 13 anterior en forma de una composición líquida lista para usar en un frasco. Los resultados presentados en el Ejemplo 14 anterior demostraron que 10% de aceite SP no es virucida para el virus del SRRP. El Ejemplo 14 también demostró que las formulaciones de PCV2/M.hyo adyuvadas con 10% de aceite SP no estaban entre las series de vacuna que se consideraron no virucidas para el virus del SRRP. En el presente ejemplo dicha composición líquida de PCV2/M.hyo de 1 frasco se usa para rehidratar una composición del virus vivo del SRRP modificado genéticamente liofilizado contenido en un segundo frasco, de modo que todos los antígenos estén contenidos en un solo frasco antes de administrarse a un cerdo de una edad adecuada (p. ej., a las 3 semanas de edad o mayores).

En una realización, el virus del SRRP tiene la secuencia genómica correspondiente a la SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma. En otra realización, el virus del SRRP usado en la composición trivalente es el aislado del virus del SRRP designado ISU-55, que se depositó en la ATCC con el número de acceso VR 2430. Las cantidades adecuadas de los respectivos antígenos se describen en el presente documento. Es deseable que todos los antígenos se administren al cerdo en una sola dosis.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica multivalente que comprende una porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), y un antígeno del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmunocomplejos compuestos por antígeno unido a inmunoglobulina.

2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la porción soluble de la preparación de M.hyo se ha tratado con proteína A o con proteína G antes de ser añadida a la composición inmunogénica.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada además porque la composición está en forma de una composición líquida lista para usar.

4. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque la porción soluble de la preparación de M. hyo comprende al menos un antígeno proteico de M. hyo.

5. - La composición de conformidad con la reivindicación 4 caracterizada además porque la porción soluble de la preparación de M. hyo comprende dos o más antígenos proteicos de M. hyo.

6. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque la composición produce una respuesta inmunitaria protectora en un cerdo contra M.hyo y PCV2.

7. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque el antígeno del PCV2 está en forma de un circovirus quimérico de tipo 1 y de tipo 2, en el que el virus quimérico comprende un circovirus porcino de tipo 1 recombinante inactivado que expresa la proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2.

8. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque el antígeno del PCV2 está en forma de una proteína ORF2 recombinante.

9. - La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la proteína ORF2 recombinante se expresa en un vector baculovirus.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque también comprende al menos un antígeno adicional.

1 1. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el al menos un antígeno adicional es protector contra un microorganismo que puede causar enfermedad en cerdos.

12. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el microorganismo comprende bacterias, virus o protozoos.

13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), parvovirus porcino (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enterítidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bacterias leptospira, Lawsonia intracellularis, virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), rotavirus, virus Torque teño (VTT), citomegalovirus porcino, enterovirus porcinos, virus de la encefalomiocarditis, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, fiebre porcina clásica (FPC) y un patógeno causante de la gastroenteritis transmisible porcina o combinaciones de los mismos.

14. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque la composición comprende además un adyuvante.

15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en adyuvante de aceite en agua, un adyuvante de polímero y agua, un adyuvante de agua en aceite, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un adyuvante de vitamina E y combinaciones de los mismos.

16. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada además porque la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. - La composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada además porque la composición produce una respuesta inmunitaria protectora contra M. hyo y PCV2 cuando se administra como una sola dosis.

18. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque la composición produce una respuesta inmunitaria protectora contra M. hyo y PCV2 y al menos un microorganismo adicional que se sabe que infecta a los cerdos cuando se administra como una sola dosis.

19. - El uso de la composición de la reivindicación 1 , en la preparación de una vacuna para inmunizar a un cerdo contra Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) y PCV2.

20. - El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable por vía intramuscular, intradérmica, transdérmica o subcutánea.

21. - El uso como se reclama en la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable en una sola dosis.

22. - El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , en donde la porción soluble de la preparación de M. hyo comprende al menos un antígeno proteico de M. hyo.

23. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable junto con al menos un antígeno adicional que es protector contra un microorganismo que se sabe que infecta a los cerdos.

24. - El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), parvovirus porcino (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bacterias leptospira, Lawsonia intracellularis, virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), rotavirus, virus Torque teño (VTT), citomegalovirus porcino, enterovirus porcinos, virus de la encefalomiocarditis, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, fiebre porcina clásica (FPC) y un patógeno causante de la gastroenteritis transmisible porcina o combinaciones de los mismos.

25. - El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra al menos uno de M.hyo y PCV2.

26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra M. hyo y PCV2.

27. - El uso como se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable a cerdos a las 3 semanas de edad o mayores.

28 - Un kit que comprende: un frasco que comprende una composición inmunogénica que incluye un antígeno de PCV2 y la porción soluble de una preparación de células enteras de Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), en la que la porción soluble de la preparación de M.hyo está sustancialmente libre de (i) IgG y (ii) inmuncomplejos antígeno / inmunoglobulina.

29.- El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque también incluye un manual de instrucciones que contiene información para administrar la composición inmunogénica.

30. - El kit de conformidad con la reivindicación 28 o la reivindicación 29, caracterizado además porque la composición inmunogénica del frasco se proporciona como composición líquida lista para usar.

31. - Un procedimiento para preparar una composición inmunogénica, en el que el procedimiento comprende: i) cultivar M.hyo en un medio adecuado durante periodos que varían de 18 a 144 horas; ii) inactivar después el cultivo de M. hyo; iii) recoger el fluido de cultivo inactivado, en el que el fluido de cultivo inactivadocomprende una preparación de células enteras de M. hyo que comprende una fracción líquida soluble y material celular insoluble; iv) separar la fracción líquida soluble del material celular insoluble; v) eliminar sustancialmente la IgG y los inmunocomplejos de antígeno/inmunoglobulina de la fracción líquida soluble separada para formar una porción soluble de la preparación de células enteras de M.hyo; y vi) combinar después la porción soluble de la preparación de células enteras de M.hyo con un antígeno del PCV2.

32.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , para usarse en la inmunización de un cerdo contra Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) y PCV2.

33. - La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable por vía intramuscular, intradérmica, transdérmica o subcutánea.

34. - La composición de conformidad con la reivindicación 32 o 33, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable en una sola dosis.

35. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizada además porque la porción soluble de la preparación de M. hyo comprende al menos un antígeno proteico de M. hyo.

36.- La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable junto con al menos un antígeno adicional que es protector contra un microorganismo que se sabe que infecta a los cerdos.

37.- La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), parvovirus porcino (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enterítidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bacterias leptospira, Lawsonia intracellularis, virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, coronavirus respiratorio porcino, virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), rotavirus, virus Torque teño (VTT), citomegalovirus porcino, enterovirus porcinos, virus de la encefalomiocarditis, un patógeno causante de la enfermedad de Aujesky, fiebre porcina clásica (FPC) y un patógeno causante de la gastroenteritis transmisible porcina o combinaciones de los mismos.

38.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra al menos uno de M.hyo y PCV2.

39. - La composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable a cerdos que tienen anticuerpos maternos contra M.hyo y PCV2.

40. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 39, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable a cerdos con 3 semanas de edad o mayores.