MX2014001832A - Nuevo derivado de 1,2,3,4 - tetrahidroquinolina util para el tratamiento de diabetes. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula siguiente o una sal farmacéutica del mismo, métodos para tratar diabetes usando el compuesto y un proceso para preparar el compuesto. (ver Fórmula).

Description

N U EVO DERIVADO DE 1 .2.3.4-TETRAH I D OQUI NOLI N A ÚTI L PARA EL TRATAM I ENTO DE DIABETES La diabetes es un problema de cuidado de salud grave q ue encara el mundo desarrollado. Podría ser deseable proporcionar un tratamiento oral y efectivo para diabetes. Algunos tratamientos orales exitosos comercialmente disponi bles para la diabetes tipo 2 (T2D) se cree actúan a través de la modulación del receptor gam ma del receptor activado del proliferador de peroxisoma (PPAR) . La administración de estas medicinas se ha asociado con efectos adversos indeseados que alg unas veces incluyen hipog licemia , daño al hígado, enfermedad gastrointestinal, ganancia de peso, u otros efectos indeseados que pueden estar asociados con la actividad de gama PPAR. Se desean nuevas opciones de tratamiento que ofrecen un perfil de seg uridad más deseable para manejar la TD2 para tratar efectivamente o prevenir diabetes en m uchos pacientes . En particular, nuevos métodos de tratamiento a base de mecanismo que puedan m in imizar o evitar efectos que han sido asociados con la activación de gama PPAR son especialmente deseados.

El receptor 40 acoplado a la proteína G (G PR-40) , también conocido como Receptor 1 Libre de Ácido Graso (FFA1 o FFAR 1 ) , se reporta como expresado predomi nantemente a altos niveles en células beta pancreáticas de roedor, líneas de células de i nsu linoma e isletas humanas. Este receptor se activa por ácidos grasos de cadena larga y media. La dependencia de la gl ucosa de la secreción de insulina es una característica importante de la activación de G PR-40, haciendo a este receptor un objetivo excelente para desarrollar terapias eficaces con un perfil de seguridad deseado para uso en el tratamiento de T2D. Los compuestos que ofrecen eficacia y un perfil de seguridad más deseable comparado con terapias existentes tales como insulina y sulfonilureas pueden ser especialmente deseables.

Dos solicitudes de patente recientemente publicadas, US201 1 0092531 y WO201 1 0661 83 describen compuestos que poseen un grupo espiro-bicíclico el cual presenta actividad GPR-40.

Esta invención proporciona un com puesto para el tratam iento de diabetes particularmente T2D. El compuesto para esta invención es un activador potente de GPR-40. Esta invención proporciona una nueva opción de tratamiento deseado q ue actúa a través de un mecanismo farmacológico que es ú nico comparado con tratamientos comercialmente disponibles y además proporciona un compuesto que activa selectivamente G PR-40 com parado con gama PPAR. El perfil farmacológ ico del compuesto de esta invención , como un activador de GPR-40 selectivo, puede ser particu larmente deseable para uso en el tratam iento de T2D. Adicionalmente, la modu lación GPR-40 selectiva puede proporcionar un perfi l de seguridad particularmente deseable para uso en el tratamiento de T2D evitando efectos asociados con la modulación gama-PPAR.

La presente invención proporciona u n compuesto de la Fórmula I a continuación : I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

El compuesto de la presente invención puede tener un carbono quiral identificado en la estructura anterior con un asterisco (*). El compuesto preferido tiene la configuración mostrada anteriormente, el cual por convención es conocido como la configuración S.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I como se describe anteriormente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable junto con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I como se describe anteriormente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable junto con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos.

La presente invención también proporciona un método para tratar diabetes en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero en necesidad de tratamiento un compuesto como se describe anteriormente por la Fórmula I , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Más preferiblemente la presente invención proporciona un método para tratar diabetes tipo dos en un mamífero en necesidad de tratamiento administrando al mamífero un compuesto como se describe anteriormente por la Fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el mamífero es un humano.

La presente invención también proporciona un método para tratar diabetes en un mamífero administrando al mamífero en necesidad de tratamiento una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se describe anteriormente por la Fórmula I , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Más preferiblemente la presente invención proporciona un método para tratar diabetes tipo dos en un mamífero en necesidad de tratamiento administrando al mamífero una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se describe anteriormente por la Fórmula I , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el mamífero es un humano.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con la Fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable como se describe anteriormente para uso en terapia.

En aún otra forma, la presente invención proporciona un compuesto como se describe anteriormente de conformidad con la Fórmula I, una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o composición farmacéutica para uso en el tratamiento de diabetes en un mamífero en necesidad del mismo. Preferiblemente el uso es para el tratamiento de diabetes tipo dos y el mamífero es un humano.

La presente invención proporciona el uso de un compuesto de conformidad con la Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes. Preferiblemente el medicamento es para el tratamiento de diabetes tipo dos y para tratar mamíferos particularmente humanos.

En aún otra forma, la presente invención proporciona un compuesto intermediario de la Fórmula II en donde R se selecciona de un alquilo C1-4, haloalquilo -Ci- , cicloalquilo C3-6, alquilo Ci- - cicloalquilo C3-6, fenilo, y alquilfenilo C1-5 para proporcionar un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Grupos R preferidos incluyen alquilo C1-2, haloalquilo C1-2, fenilo, y alquilfenilo d-2. Grupos R particularmente preferidos incluyen metilo, etilo, fenilo, y bencilo.

La presente invención también proporciona un proceso para preparar ácido (3S)-3-[4-[[5-[(8-Metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1 -il)metil]-2-tienil]metoxi]fenil]hex-4-inoico descrito anteriormente por la Fórmula I. El método comprende desproteger o desesterificar el compuesto intermediario de conformidad con la Fórmula II para preparar el compuesto de Fórmula 1 o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Un experto en la técnica podrá entender fácilmente y ser capaz de implementar reacciones de desprotección sin experimentación indebida. Se reconocerá por aquellos expertos en la técnica que además del ácido carboxílico y ácido carboxílico protegido, otros grupos funcionales que pueden ser fácilmente convertidos a un ácido carboxílico pueden ser usados en lugar del ácido carboxílico o ácido protegido. Tales grupos funcionales, preparaciones y transformaciones de estos grupos a ácidos carboxílicos se puede encontrar en "Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" por Larock. R.C, Wiley VCH, 1999 y en "March's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms and Structure" Smith, M.B., y March, J., Wiley-lnterscience, 6a Ed. 2007.

El compuesto de la presente invención, ácido (3S)-3-[4-[[5-[(8-Metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]-2-tienil]metoxi]fenil]hex-4-inoico, se puede proporcionar como una sal farmacéuticamente aceptable. "Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales del compuesto de la invención consideradas por ser aceptables para uso clínico y/o veterinario. Sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlos son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl , et al. , Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH , 2002) ; S . M. Berge, et al. , "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1 , January 1 977.

El término, "portador, diluyente o excipientes farmacéuticamente aceptables" sign ifica que el portador, diluyente y excipientes son farmacéuticamente compatibles con los otros ingredientes de la com posición.

Ciertos sustituyentes han sido eliminados en los siguientes Esquemas de Reacción por motivos de claridad y no están propuestos para limitar las enseñanzas de los Esquemas de reacción en alguna forma. Además, isómeros, enantiómeros o diastereómeros individ uales pueden ser separados en cualquier pu nto conveniente en a síntesis del compuesto de Fórm ula I por métodos tales como cromatog rafía quiral . Adicionalmente, los intermediarios descritos en los siguientes Esquemas de reacción y preparaciones contienen un número de grupos de nitrógeno, hidroxi y protectores de ácido tales como ésteres. El grupo protector variable puede ser el mismo o diferente en cada caso dependiendo de las condiciones de reacción particu lares y las transformaciones particu lares a ser real izadas. Las condiciones de protección y desprotección son bien conocidas por el experto en la técnica y se descri ben en la literatura. Véase, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene y P. Wuts, eds., 2a ed. 1991).

Las abreviaturas usadas en la presente se definen de conformidad con Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984. Otras abreviaturas se definen como sigue: "ADDP" se refiere a 1-(azodicarbonil)dipiperidina ; "BSA" se refiere a Albúmina de Suero Bovino; "DIBAL-H" se refiere a hidruro de diisobutilaluminio; "DIPEA" se refiere a diisopropiletil amina; "DMEM" se refiere a Medio Eagle Modificado de Dulbecco; "DTT" se refiere a ditiotreitol; "ESI" se refiere a ionización por electrorrocío; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "EtOH" se refiere a alcohol etílico o etanol; "F12" se refiere a medio Ham F12; "FBS" se refiere a Suero Bovino Fetal; "HEK" se refiere a riñon embriónico humano; "IC50" se refiere a la concentración del agente que produce 50% de la respuesta máxima inhibidora posible para tal agente; "MeOH" se refiere a alcohol metílico o metanol; "NBS" se refiere a N-bromosuccinimida; "PPAR" se refiere a receptor activado del proliferador de peroxisoma; "PPRE" se refiere a elemento de respuesta del proliferador de peroxisoma; "RFU" se refiere a unidad de fluorescencia relativa; "RPMI" se refiere a Instituto Roswell Park Memorial"; "RT" se refiere a temperatura de sala ambiental; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; y "TK" se refiere a timidina cinasa.

El término alquilo como se usa en la presente es una cadena alquilo recta tal como etilo o n-propilo, o una cadena alquilo ramificada tal como isopropilo o rer-butilo. El término haloalquilo C1-4 se refiere a un grupo aquilo que tiene 1, 2, 3 o más grupos halo unidos a los carbonos de la cadena alquilo. Existen dos o más halógenos, los halógenos no necesitan estar unidos al mismo carbono. Este término también incluye perhaloalquilos donde todos los átomos de nitrógeno del grupo alquilo son reemplazados con un halógeno.

En los esquemas de reacción siguientes, todos los sustituyentes a menos que se indique de otro modo, son como se definen previamente. Los reactivos y materiales de partida son en general fácilmente disponibles para uno de habilidad ordinaria en la técnica. Otros pueden ser elaborados por técnicas estándares de química orgánica y heterocíclica, los cuales son análogos a las síntesis de compuestos conocidos estructuralmente similares, y los siguientes procedimientos descritos en las Preparaciones y Ejemplos incluyen cualesquiera nuevos procedimientos.

?? Preparaciones y Ejemplos Las siguientes Preparaciones y Ejemplos ilustran además la invención y representan la síntesis típica el compuesto de Fórmula (I). Los compuestos son nombrados por lUPACNAME ACDLABS o Symyx Draw 3.2.

Preparación 1 8-Metoxiquinolina Se agregó hidróxido de potasio (435 g, 7.76 mol) a una solución de 8-hidroxi quinolina (250 g, 1.724 mol) en THF (10 L) a temperatura ambiente y agitó. Se agregó yoduro de metilo (435 g, 2.58 mol) por goteo y agitó durante la noche. Se filtró la mezcla de reacción y lavó el sólido con THF (2 L). Se concentró la solución a sequedad; se agregó agua; se extrajo con diclorometano (2 x 3 L); se combinaron las capas orgánicas; y lavaron con salmuera. Se recolectaron las capas orgánicas y secaron sobre sulfato de sodio. Se removieron los sólidos por filtración. Se recolectó lo filtrado y concentró bajo presión reducida para dar un aceite rojo, el cual solidifica en reposo, para dar el compuesto del título (281 g, 102%), el cual puede ser usado sin purificación adicional. ESI (m/z) 160(M+H).

Preparación 2 8-Metoxi-1 ,2,3,4-tetrahidroquinolina Se agregó cianoborohidruro de sodio (505 g, 8.11 mol) en EtOH (1 L) a una solución de 8-metoxi quinolina (425 g, 2.673 mol) en EtOH (9 L), y agitó. Se enfrió la mezcla de reacción a una temperatura interna de 0 °C y se agregó HCI (35%, 1.12 L, 10.962 mol) por goteo durante 60 min de manera que la temperatura interna no se eleva arriba de 20 °C. Permitiendo a la mezcla de reacción calentarse a temperatura ambiente y después calentarse a reflujo por 2.5 horas. Se enfrió a temperatura ambiente y agitó durante la noche. Se agregó hidróxido de amonio (25%, 1 L); se diluyó con agua (15 L); y se extrajo la mezcla con diclorometano (3 x 10 L). Se combinaron las capas orgánicas y secaron sobre sulfato de sodio. Se removieron los sólidos por filtración. Se recolectó lo filtrado y concentró bajo presión reducida para dar un residuo. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano (1:10) para dar el compuesto del título (357 g, 82%). ESI (m/z) 164(M+H).

Preparación 3 Metil-5-metiltiofen-2-carboxilato Se agregó cloruro de tionilo (153 mi, 2.1 mol) por goteo durante 20 min a una solución de ácido 5-metiltiofen-2-carboxílico (100 g, 0.703 mol) en MeOH (1 L) a 0 °C y agitó. Después que la adición se completó, se calentó la mezcla de reacción a reflujo por 3.5 horas. Se enfrió y concentró in vacuo para dar un aceite espeso. Se diluyó el aceite con EtOAc (500 mi) y secuencialmente se lavó con agua (300 mi) después salmuera (300 mi). Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio. Se removieron los sólidos por filtración. Se recolectó lo filtrado y concentró bajo presión reducida para dar el compuesto del título (106 g, 97%), el cual se usó sin purificación adicional. ESI (m/z) 156(M+H).

Preparación 4 5-(bromometil)tiofen-2-carboxilato de metilo Se agregó NBS recientemente recristalizado (323.8 g, 1.81 mol) a una solución de metil-5-metiltiofen-2-carboxilato (258 g, 1.65 mol) en cloroformo (2.6 L) a temperatura ambiente, y agitó. Se agregó peróxido de benzoilo (3.99 g, 0.016 mol) y se calentó la mezcla de reacción a reflujo por 7 horas. Se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y filtró a través de tierra diatomácea. Se lavó la torta de filtro con cloroformo (250 mi). Se recolectaron las capas orgánicas y removió el solvente para dar el compuesto del título (388 g, 100%), el cual se usó sin purificación adicional. ESI (m/z) 236(M+H).

Preparación 5 Metil-5-[(8-metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]tiofen-2-carboxilato Se agregó metil-5-(bromoetil)tiofen-2-carboxilato (432.5 g, 1.84 mol) en EtOH (500 mi) a una solución de 8-metox¡-1 ,2,3,4-tetrahidroquinolina (300 g 1.84 mol) en EtOH (1 L) y agitó. Se agregó DIPEA (641 mi, 3.67 mol) por goteo y agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de la terminación de la reacción, se removió el EtOH ¡n vacuo, y se agregó agua (5 L). Se extrajo lo acuoso con EtOAc (3 x 3 L); se combinaron las capas orgánicas; y secaron sobre sulfato de sodio. Se filtró la solución y concentró bajo presión reducida para dar un residuo. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con acetato de etilo: hexano (6:94) para dar el compuesto del título (325 g, 56%). ESI (m/z) 318(M + H).

Preparación 6 [5-[(8-Metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]-2-tienil]metanol Se agregó DIBAL-H (1 M en tolueno 2.7 L, 2.66 mol) lentamente vía una cánula durante un periodo de 1.5 h a una solución agitada de metil-5-(8-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1 (2H)-il)metil)tiofen-2-carboxilato (281 g, 0.886 mol) en THF (4 L) a -70 °C. Se monitoreó la reacción vía cromatografía de capa delgada (TLC) para terminación. Después de la terminación de la reacción, se permitió a la mezcla de reacción calentarse a 20 °C y se agregó una solución agitada de cloruro de amonio. Se agregó una solución de tartrato de potasio sódico (1.3 Kg en 5 L e agua), y agitó durante la noche. Se separó la capa orgánica; se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 x 5 L); después se combinaron las capas orgánicas; y secaron las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio. Se removieron los sólidos por filtración. Se removió el solvente de lo filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco (252 g, 98%). ESI (m/z) 290(M+H).

Preparación 7 (3S)-3-[4-[[5-[(8-metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]-2-tienil]metoxi]fenil]hex-4-ionato de etilo Se agregó tri butilfosf ina (50% solución en EtOAc, 543ml, 1.34 mol) a una solución de ADDP (282.5 g, 1.5 eq) en THF (3 L) y se enfrió la mezcla a una temperatura interna de O °C, después se agitó por 15 minutos. Se agregó 3-(4-hidroxifenil)hex-4-ionato de (S)-etilo (173.5g, 0.747 mol) en THF (3 L) por goteo durante 15 min; después se agregó 5-((8-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1 (2H)-il)metil)tiofen-2-il)metanol (216 g, 0747 mol) en THF (5 L) por goteo. Permitiendo a la mezcla de reacción calentarse a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se filtró la mezcla de reacción a través de tierra diatomácea y se lavó la torta de filtro con acetato de etilo (2 L). Se concentró lo filtrado orgánico a sequedad. Se agregó agua (4 L); se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 L); se combinaron las capas orgánicas; y secaron las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio. Se removieron los sólidos por filtración y concentró bajo presión reducida para dar un aceite. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con acetato de etilo: hexano (6:94) para dar el compuesto del título (167 g, 44%). ESI (m/z) 504(M+H).

Ejemplo 1 Ácido (3S)-3-[4-[[5-[(8-Metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]-2-tienil]metoxi]fenil]hex-4-inoico Se agregó una solución de hidróxido de potasio (49.76 g, 0.88 mol) en agua (372 mi) a una solución de (S)-etil-3-(4-((5-8-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1 (2H)-il)metil)tiofen-2-il)metoxi)fenil)hex-4-ionato (149 g, 0.296 mol) en EtOH (1.49 L) a temperatura ambiente y agitó durante la noche. Se concentró la mezcla de reacción a sequedad y se agregó agua (1.3 L). Se extrajo la solución resultante con EtOAc (2 x 300 mi) y se separó. Se ajustó el pH de la capa acuosa a pH = 6 con HCI 2 N. Se recolectaron los sólidos resultantes. Se recristalizaron los sólidos de MeOH caliente (298 mi, 2 vol) para dar el compuesto del título (91 g, 65%). ESI (m/z) 476(M+H).

GPR40: Información Resultados de estudios usando ratones transgénicos que sobre expresan el gene GPR40 humano bajo control del promotor de la insulina II recientemente reportado por Nagasumi apoyan además que el GPR40 juega un papel importante en la regulación de niveles de glucosa en plasma in vivo y GDSI, especialmente en modelos de roedores de resistencia a la insulina. Nagasumi K, et. al., Overexpression of GPR40 in pancreatic ß-cells augments glucose-stimulated insulin secretion and improves glucose tolerance in normal and diabetic mice, Diabetes 58: 1067-1076, 2009. Véase también, Briscoe CP et al., The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by médium and long chain fatty acids, Journal Biological Chemistry 278: 11303 - 11311, 2003. Estos hallazgos apoyan además el desarrollo de que nuevos compuestos moduladores del GPR40 pueden ser particularmente deseados para uso en el tratamiento de T2D.

Ensayo Primario de Flujo de Calcio El compuesto de Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describe abajo y presenta un valor EC50 para el ensayo Primario del Flujo de Calcio inferior de 1 µ .

Este ensayo se usó para seleccionar compuestos midiendo el incremento en niveles de calcio intracelular que resultan cuando un ligando se une y activa GPR40, de este modo demostrando la potencia y eficacia de agonistas del GPR40. Células HEK293 que sobre expresan el cDNA del GPR40 humano mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco con medio F12 en una relación 3:1 suplementadas con 10% de FBS y 800 pg/ml de geneticina a 37 °C y 5% de C02 son empleadas para el estudio. Los ensayos agonistas son realizados usando un kit de ensayo de Tinte de Calcio 4 (Molecular Devices) en la presencia de 0.1% de BSA libre de ácido graso en el amortiguador de ensayo (1x HBSS (Solución de Sal Balanceada de Hank) y 20 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetansulfónico). La activación del receptor se mide como un incremento en el calcio intracelular usando el Lector de Placa de Imagen Fluorométrica (FLIPR). Se usa el máximo cambio en fluorescencia sobre la línea base para determinar la respuesta agonista. Un valor EC50 (concentración efectiva a la mitad de la respuesta máxima) del compuesto se calcula usando el software de Ajuste Excel (versión 4; IDBS) por concentración de representación de la concentración contra unidades de fluorescencia relativa (RFUs). El porcentaje de eficacia se calcula con base en la máxima respuesta presentada por el compuesto comparada con el ligando natural, ácido linoleico. El compuesto de prueba del Ejemplo 1 tiene un EC50 de 152 +/- 52 nM con 84 +/- 24% de eficacia cuando se examina en este ensayo. Estos resultados demuestran además la potencia y eficacia deseada de este compuesto como un agonista del GPR40.

Ensayos de Secreción de Insulina Dependiente de la Glucosa (GDIS) Debido a que la activación del GPR40 se conoce por resultar en secreción de insulina, la cual es dependiente de altas concentraciones de glucosa, se desarrollaron dos sistemas de ensayo separados (una línea de células de insulinoma e isletas de roedor primarias) para además caracterizar compuestos que se conocen por incrementar el calcio intracelular en el ensayo primario de GPR40 discutido anteriormente.

Se realizaron ensayos de GDIS usando la línea de células de insulinoma de ratón Min6. Las células Min6 se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene aminoácidos no esenciales, 10% de FBS, 50 mM de 2-mercaptoetanol y 1% de penicilina y estreptomicina a 37 °C más 5% de C02 Al día del experimento, las células se lavaron dos veces con 200 µ? de amortiguador de enjuague Krebs pre-calentado sin glucosa. La adición de 200 µ?_ de amortiguador de enjuague Krebs pre-calentado que contiene 2.5 mM de glucosa se usó para someter a inanición las células seguidas por la adición de compuestos en la presencia de una alta concentración de glucosa (25 mM). La placa se incubó a 37 °C por 2 horas. Al final de las 2h de incubación, el sobrenadante es suavemente transferido en una placa de filtro Millipore y centrifugado a 200 g (fuerza gravitacional) por 3 minutos. La insulina se somete a ensayo usando un kit de estimación de Insulina Mercodia. La adición del Ejemplo 1 a 0.01, 0.1, 1.0, y 10.0 µ? más 25 mM de glucosa a las células Min6 resultó en un incremento dependiente de la dosis en la secreción de insulina con un incremento estadísticamente significante (P < 0.01) (2.68 veces sobre aquella lograda con 25 mM de glucosa) a la dosis de 1.0 µ?.

También se usaron ensayos de GDIS usando isletas de Langerhans pancreáticas de roedor primario para caracterizar el compuesto ejemplificado. Se aislaron isletas pancreáticas de ratas SD macho (Sprague Dawley) por digestión de colagenasa y separación de gradiente de densidad Histopaque. Las isletas se cultivaron durante la noche en medio RPMI-1640 con GlutaMAXn (forma dipeptídica estabilizada de L-glutamina (catálogo Invitrogen # 61870-010)) para facilitar la recuperación del proceso de aislamiento. La secreción de insulina se determina por una incubación de 90 minutos en amortiguador EBSS (Solución de Sal Balanceada Earle) en una placa de 48 cavidades. Brevemente, las isletas son primero preincubadas en EBSS con 2.8 mM de glucosa por 30 min, y son después transferidas a una placa de 48 cavidades (cuatro isletas/cavidad) que contiene 150 µ? de EBSS con 2.8 ó 11.2 mM de glucosa en la presencia o ausencia del compuesto de prueba por 90 minutos. El amortiguador se remueve de las cavidades al final de la incubación, y se somete a ensayo para determinar niveles de insulina usando el kit ELISA de Insulina de Rata (Mercodia). En este sistema de ensayo, la incubación del Ejemplo 1 a 1, 3, y 10 µ? con isletas de rata y 11.2 mM de glucosa resulta en un incremento estadísticamente significante (P <0.05) en insulina a 3.0 uM (2.1 veces) comparado con aquel logrado con 11.2 mM de glucosa. De este modo, el compuesto de Ejemplo 1 induce producción de insulina bajo las condiciones de este ensayo.

Ensayos de selectividad: Ensayos Funcionales y de Enlace al Receptor a, d, y ? (PPAR) Activado por el Proliferador de Peroxisoma: Debido a que el GPR40 se conoce por ser activado por ligandos a PPARy el compuesto ejemplificado es examinado en ensayos funcionales y de enlace a PPARa, PPAR5 y PPARy, para determinar la selectividad del compuesto del Ejemplo 1 para GPR40. El compuesto del Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describe abajo para enlace a PPAR y presenta valores de enlace mayores de 1000 nM con concentraciones de 1 0 µ ? del compuesto de prueba, y de este modo se considera negativo para la actividad PPAR.

Las afinidades de enlace del compuesto para los receptores a , d, e ?, se valoran usando tecnolog ía de Ensayo de Proximidad de Escintilación (SPA) . Se usó Repetición 2 Directa de oligonucleótido biotini lado (DR2) para enlazar los receptores a perl illas de SPA revestidas de estreptavidina de si licato de Itrio. Los receptores de PPAR a, d, y retinoide X (RXR) a son sobre expresados en células H EK293, y los Usados celulares que contienen los receptores específicos se usan en los ensayos i nd ividuales. El DR2 se une a las perlillas de SPA durante un periodo de 30 minutos en un amortiguador de enlace q ue contiene 1 0 m M de H EPES a pH 7.8, 80 m de KCI , 0.5 m M de MgCI2, 1 m M de DTT, 0.5% de ácido 3[(3-colam¡dopropil)dimet¡lamon¡o]-propansu lfónico (CHAPS), y 4.4% de suero bovino. Los Usados celulares son incubados en cada cavidad con una de 1 1 concentraciones del compuesto en la presencia de u n com puesto de referencia de agon ista dual de PPAR a/d radio-etiquetado (-0.033.8 iC\ 3H) (ácido butanoico, 2-[4-[2-[[[(2 ,4-difluorofenil)am ino]carbonil] heptilami no]etil]fenox¡]-2-metilo, véase Burris T. P. et al . , Molecular Pharmacology 2005, 67, (3) 948-954) para los ensayos del receptor alfa y delta y un compuesto de referencia agonista de PPARy radio-etiquetado (-0.037.3 µ?? 3H)(ácído propanoico, 2-metil-2-[4-[3-[propil[[5-(2-piridinil)-2-tíenil]sulfonil]amino]propil]fenoxi] véase Burris T. P. et al . , Molecular Pharmacology 2005, 67, (3) 948-954) para los ensayos del receptor gama , 1 10.3 g de perlillas revestidas de Estreptavidina de SPA de Itrio , 0.126 nM de HD Oligo DR2, y ya sea 0.3 de PPARa con 0.5 g de RXRa, 0.5 µg PPAR5 con 0.5 pg RXRa, ó 1 .25 pg de PPARy con 3.03 µg de RXRa en el amortiguador de enlace anterior más 14% de glicerol y 5 µg de DNA de esperma de salmón cortado. Se determinó el enlace no específico en la presencia de 1 0,000 nM del compuesto de referencia agonista dual PPAR a/d dual no etiquetado para los ensayos del receptor alfa y delta y el compuesto de referencia del agonista PPARy para el ensayo del receptor gama. La reacción de enlace (100 µ? por cavidad en una placa de 96 cavidades [Costar 3632]) se incubó por 10h y contó la desintegración por minutos (dpm) en un Wallac Microbeta. La afinidad de enlace al receptor ( I C50) para el compuesto se determina ajustando una curva de respuesta de concentración de 1 1 puntos en una ecuación logística de 4 parámetros. Se determina el K¡ a partir de I C50 usando la ecuación de Cheng-Prussoff y se determina el Kd por enlace de saturación. Para el compuesto del Ejemplo 1 , no se detectó enlace en cualquiera de los tres ensayos de enlace a PPAR con concentraciones hasta 10 µ?. De este modo, los ensayos expuestos en la presente apoyan que el compuesto de Ejemplo 1 activa selectivamente GPR40 mientras evita la actividad PPAR indeseada. Los I Csos relativos para el compuesto ejemplificado cuando se prueban hasta con 30 µ? son mayores que 10 µ? para las isoformas de PPAR, apoyando que el compuesto ejemplificado evita la actividad de PPAR mientras proporciona la activación de GPR40 deseada.

Los ensayos funcionales del reportero Gal4 PPARa, Gal4 PPARÓ, and PPARy también se usan para monitorear la selectividad del compuesto ejemplificados. Células CV1 , las cuales se derivan del tejido renal de mono verde Africano, son transfectadas con varios plásmidos del receptor y reportero usando Fugene. Para los ensayos de Gal4 PPARa y PPARó, un plásm ido reportero que contiene cinco copias aleatorias del elemento de respuesta Gal4 de la proteína de transcripción de levadura , clonada corriente arriba de un gen de luciferasa de libél u la accionado por el promotor tard ío principal de adenovirus, se transfectó j unto con un Virus de Sim io 40 (SV40) accionando constitutivamente el plásmido que expresa una proteína híbrida que contiene el domin io de enlace al DNA Gal4 (DBD) , y ya sea el en lace del ligando PPARa o PPARó. Para el ensayo PPARy, los plásmidos que codifican a PPARy y RXRa , am bos accionados por u n promotor de citomegalovirus (CMV) son transfectados junto con un plásm ido que contiene el cDNA reportero de luciferasa accionado por el promotor TK y un elemento de respuesta del receptor (2X PPRE) . Las células son transfectadas en matraces de cultivo celu lar de T225 cm2 en medio DM EM con FBS reticulado de carbono activado al 5% . Después durante la noche de incubación , las células transfectadas son tripsinizadas; plaqueada en discos opacos de 96 cavidades ( 1 5, 000 células/cavidad) en medio DMEM que contiene FBS retirado de carbón activado al 5%, incubado por 4 horas; y expuesto a 0. 17 ? ? a 1 0 µ? de compuesto de prueba o referencia en diluciones de semi-log . Después de 24 horas de i ncu bación con el compuesto, las célu las son sometidas a lisis y se determ ina la actividad de luciferasa como una medida de la activación del receptor por luminiscencia. Los datos son ajustados a un modelo logístico de aj uste de cuatro parámetros para determinar los valores E C 50. Se determinó el porcentaje máximo de estimulación contra la estim ulación obtenida con 10 µ ? de un compuesto de referencia de agonista PPAR apropiado. No se detectó activación funcional de PPARa, PPAR , o PPARy con el com puesto de Ejemplo 1 cuando se exam inó hasta 1 0 µ en los ensayos funcionales/co-transfección de PPAR específicos (CTF) descritos anteriormente. De este modo el ensayo apoya que el compuesto ejem plificado evita la actividad agonista de PPAR, como se desee.

Eficacia i n vivo: Prueba de Tolerancia a la Gl ucosa Intraperitoneal (I PGTT) Para examinar la capacidad del compuesto ejemplificado para activar GPR40 in vivo que resulta en eficacia anti-d iabética, es decir, reducción en niveles de g lucosa en plasma , se completó un estudio de prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal de 4 d ías (ipGTT) , y los datos se m uestran para el compuesto probado abajo.

Ratones macho Balb/c (ratones Albino) (8-9 semanas de edad) son alojados i ndividualmente, y alimentados con dieta de comida normal de roedor y agua ad libitum. Los animales son pesados; aleatorizados por peso corporal ; y sus pesos corporales diarios son registrados. Los animales son dosificados una vez por día oralmente por tres días usando una form ulación q ue lleva meti lcel ulosa y tween-80. En la noche antes del Día 4, los animales son ayunados durante la noche. En la mañana del Día 4 , los animales son dosificados oralmente con el compuesto o vehículo solo 60 minutos previo a la prueba de tolerancia a la glucosa (glucosa 2 g/kg, i.p.). Se determinan los niveles de glucosa en sangre de sangrados de la cola tomados a 0, 3, 7, 15, 30, y 60 min después de la estimulación con glucosa. El perfil de excursión de glucosa en sangre de t=0 a t=60 min se usa para integrar un área bajo la curva (AUC) para cada tratamiento. El porcentaje de reducción en glucosa se calcula de los datos de AUC del compuesto con respecto al AUC del grupo de vehículo. El compuesto de prueba es oralmente administrado a 0.3, 1.0, 3.0, 10, ó 30 mg/kg, y se administra un control positivo de ácido (3-[4-(2-metil-benciloxi)-fenil]-hex-4-inoico, véase WO2005086661.) a 10 mg/kg. Los niveles de glucosa son significantemente reducidos comparados con aquellos logrados con el control de vehículo a los puntos de tiempo de 15 minutos con las dosis de 3, 10 y 30 mg/kg y a los puntos de tiempo de 30 y 60 minutos con las dosis de 1.0, 3.0, 10, y 30 mg/kg del Ejemplo 1. Los niveles de glucosa son reducidos a los puntos de tiempo de 15, 30, y 60 minutos para el control positivo. El ED50 para este compuesto con base en las AUCs para la reducción de glucosa es 1.0 mg/kg. Los resultados de este estudio demuestran que la activación de GPR40 por el Ejemplo 1 conduce a eficacia anti-diabética in vivo.

El compuesto ejemplificado de la presente invención puede ser fácilmente formulado en composiciones farmacéuticas de conformidad con prácticas aceptadas conocidas en la técnica tales como aquellas encontradas en Remington's "Pharmaceutical Sciences", Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa. 1990 tales como tabletas, cápsulas sólidas o llenas de gel, polvos, suspensiones o soluciones. La composición también puede incluir uno o más portadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables. Ejemplos no limitantes de portadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables que son adecuados para tales formulaciones incluyen los siguientes: almidón, azúcares, manitol, y derivados de sílice; agentes enlazantes tales como carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinil-pirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio; agentes para retardar la disolución tales como parafina; aceleradores de la resorpción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes activos de la superficie tales como alcohol cetílico, monoestearato de glicerol, portadores adsorptivos tales como caolín y bentonita; y lubricantes tales como talco, calcio y estearato de magnesio y polietilenglicoles sólidos.

Composiciones farmacéuticas preferidas incluyen Formuladas como una tableta o cápsula para administración oral. La tableta o cápsula puede incluir un compuesto de la presente invención en una cantidad efectiva para tratar diabetes particularmente diabetes tipo dos.

La formulación farmacéutica se administra a un paciente en cantidades efectivas para tratar diabetes, más particularmente, diabetes tipo dos. Una cantidad apropiada o dosis efectiva para tratar un paciente puede ser determinada por un proveedor del cuidado de la salud.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto caracterizado porque es: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y al menos uno de un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales.

4. Un método para tratar diabetes en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al mamífero un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable de conformidad con la reivindicación 1.

5. Un método para tratar diabetes en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2 ó 3.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque tratar diabetes comprende tratar un mamífero para diabetes tipo dos.

7. Un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, de conformidad con la reivindicación 1, para uso en terapia.

8. Un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, de conformidad con la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de diabetes en un mamífero.

9. Uso de un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, de conformidad con la reivindicación 1 en la manufactura de un medicamento para tratar diabetes.

10. Un compuesto de conformidad con la Fórmula II caracterizado porque R se selecciona de: alquilo Ci-4, haloalquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, alquilo Ci-4- cicloalquilo C3-6, fenilo, y alquilfenilo C1-5.

11. Un método para preparar ácido (3S)-3-[4-[[5-[(8- Metoxi-3,4-dihidro-2H-quinolin-1-il)metil]-2-tienil]metoxi]fenil]hex-4- inoico o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque el método comprende desesterificar un compuesto de Fórmula II; II donde R se selecciona de: alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, cicloalquilo C3-6, alquilo C1-4- cicloalquilo C3-6, fenilo, y alquilfenilo C1- 5 para proporcionar un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable