MX2013011689A - Metodos para mejorar inmunogenicidad de vacuna. - Google Patents

Metodos para mejorar inmunogenicidad de vacuna.

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Abstract

La presente invención proporciona un proceso llamado "Banca Inmune" que intensifica la eficacia de vacuna al explotar las respuestas humorales existentes. El proceso involucra etiquetar nuevos antígenos con marcadores moleculares reconocidos por una respuesta de anticuerpo existente. Este reconocimiento de los componentes de vacuna etiquetados intensifica las respuestas inmunes para la nueva vacuna.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR INMUNOGENICIDAP DE VACUNA Prioridad de la Invención La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/471,553, que se presentó el 4 de abril del 2011. El contenido total de la presente solicitud provisional, está incorporado a la presente invención como referencia .
Antecedentes de la Invención El sistema inmune es muy complejo e incluye muchas diferentes trayectorias para un organismo que pelea contra patógenos infecciosos y células de cáncer. En general, el sistema inmune es visto como teniendo la capacidad de montar una respuesta inmune humoral (HIR) y/o respuesta inmune transmitida por célula (CMI). La HIR implica la producción y secreción de anticuerpos producidos en las células del linaje de linfocito B (células B). Los anticuerpos secretados se enlazan a antígenos en las superficies de microbios invasores (tal como viruses o bacterias). Posteriormente los antígenos enlazados por anticuerpos son destruidos a través de varias células en el sistema inmune. La inmunidad humoral también se refiere a producción de anticuerpos y procesos accesorios que la acompañan. También se refiere a las funciones efectoras del anticuerpo, que incluyen neutralización de patógenos y toxinas, activación de complemento clásica y promoción de oxonina de fagocitosis y eliminación de patógeno.
El segundo tipo de respuesta inmune es la inmunidad transmitida por célula (CMI). CMI es una respuesta inmune que no implica anticuerpos o complemento, sino más bien implica la activación de diversas células inmune, tales como macrófagos, células aniquiladoras naturales (NK), linfocitos-T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno. La inmunidad celular puede proteger al cuerpo, activando linfocitos-T específicos de antígeno. Estas células inducen apoptosis en células del cuerpo que muestran epítopes de antígenos extraños en su superficie, tal como células infectadas por virus, células infectadas con una bacteria intracelular y células de cáncer que muestran antígenos de tumor. Las células T activan los macrófagos y células aniquiladoras naturales, habilitándolas para destruir patógenos intracelulares, y estimulando las células para secretar una variedad de citocinas que influencian la función de otras células implicadas en respuestas inmune de adaptación e innatas. La inmunidad transmitida por células se dirige principalmente en microbios que sobreviven en fagocitos y microbios que infectan las células no fagocíticas. Es lo más efectivo para eliminar células infectadas con virus, aunque también participa para defender contra hongos, protozoarios, cánceres y bacterias intracelulares.
Tradicionalmente, tal como lo define la World Health Organization (Organización Mundial de la Salud), una vacuna es cualquier preparación proyectada para producir inmunidad a una enfermedad, estimulando la producción de anticuerpos. Las vacunas incluyen, por ejemplo, suspensiones de microorganismos aniquilados, atenuados, o productos o derivados de microorganismos. El método de administración de vacunas más común, es mediante inoculación, aunque algunas son proporcionadas mediante rocío bucal o nasal.
Las tecnologías de vacuna actuales dependen de grandes dosis de antígeno y/o revacunaciones (dosis de refuerzo) y no confieren protección contra todos los agentes infecciosos. Por consiguiente, existe la necesidad de nuevas vacunas para conferir protección contra agentes infecciosos, para los cuales actualmente no hay vacunas efectivas. También existe la necesidad de nuevas vacunas que sean más seguras de administrar, sean menos caras en su producción, y/o no requieran dosis de refuerzo. La eliminación de las dosis de refuerzo puede incrementar el cumplimiento de la inmunización. Finalmente, algunas poblaciones humanas, tales como personas de edad avanzada, tienen respuestas en general más débiles a la vacunación, y las vacunas más efectivas podrían proteger de mejor manera esta categoría en crecimiento de receptores de vacuna.
Breve Descripción de la Invención En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE, también llamado "elementos de reconocimiento de anticuerpo" o "epítopes reactivos de anticuerpo"). En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un epítope VP-1 de polio de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud, que comprende IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1). En ciertas modalidades, el epítope tiene aproximadamente 18 a 28 aminoácidos de longitud, y comprende IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1). En ciertas modalidades, el epítope consiste esencialmente de, o consiste en, IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1).
En ciertas modalidades el epítope es de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud y comprende ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un epítope VP-1 de polio de aproximadamente 18 a 28 aminoácidos de longitud que comprende ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades el epítope consiste esencialmente de, o consiste en, ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades, el epítope es de 18 a 28 aminoácidos de longitud y comprende, consiste esencialmente de, o consiste en AHSKEIPALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2).
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el ARE es un epítope VP-1 descrito anteriormente. En ciertas modalidades, el antígeno se enlaza al ARE por medio de un enlace alfa-Gal. En ciertas modalidades, el antígeno se enlaza al ARE por medio de la molécula enlazadora. En ciertas modalidades, la molécula enlazadora es formaldehído, glutaraldeh ido, MBS (éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinímida) y/o Sulfo-MBS. En ciertas modalidades, el antígeno es un antígeno de agente infeccioso. En ciertas modalidades, el agente infeccioso es una bacteria, hongo, parásito, virus o agente prion. En ciertas modalidades, el agente infeccioso es un agente bacteriano o un agente viral. En ciertas modalidades, el antígeno es un antígeno de cáncer.
En ciertas modalidades, el antígeno se conjuga en forma adicional para un anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo:antígeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos scFv, humanizados, completamente humanos y quiméricos, los anticuerpos de cadena simple, diacuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab). En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un Fv de cadena simple o fragmento scFv.
En ciertas modalidades, el hapteno está enlazado en forma operable al antígeno para formar un antígeno haptenado.
En ciertas modalidades, el hapteno está enlazado en forma operable a un antígeno adicional.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un complejo que comprende un compuesto que comprende al menos un antígeno conjugado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE) enlazado en forma operable a una molécula de conjugación. En ciertas modalidades, la molécula de conjugación es un péptido, un ácido nucleico, o un polisacárido que no es el antígeno o ARE.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto que comprende al menos un antígeno conjugado para un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE) y un vehículo no tóxico, fisiológicamente aceptable. En ciertas modalidades, la composición, comprende además un adyuvante.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para generar una respuesta inmune en un animal inmunizado previamente, en donde el método comprende introducir en el animal la composición descrito anteriormente. En ciertas modalidades, la introducción de la composición ocurre al menos 15 días después de la inmunización previa. En ciertas modalidades, el método comprende además introducir una segunda composición descrita anteriormente. En ciertas modalidades, el método comprende además introducir una dosis repetida de la composición. En ciertas modalidades, el animal es un humano.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para generar anticuerpos específicos para un antígeno, en donde el método comprende introducir en el animal la composición o complejo descritos anteriormente. En ciertas modalidades, el método comprende además introducir una segunda dosis de la composición o el complejo en el animal.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer, en donde el método comprende administrar a un paciente la composición o el complejo descrito anteriormente.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para prevenir o tratar una infección o enfermedad infecciosa, en donde el método comprende administrar a un paciente la composición o el complejo descrito anteriormente.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende al menos un antígeno conjugado para un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), para utilizarse en el tratamiento profiláctico o terapéutico de un agente infeccioso o cáncer.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende al menos un antígeno conjugado para un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de un agente infeccioso o cáncer en un mamífero.
La presente invención, proporciona un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el antígeno es Proteína de Nucleocapside (NP) de Influenza A H5N1 (A/lndonesia/5/2005(H5N1 )) número de acceso de proteína Genebank #ABI36003 y el ARE es el epítope VP-1 de polio de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud que comprende IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1), y en donde el ARE está enlazado directamente en forma covalente al NP.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el epítope VP-1 descrito anteriormente, enlazado en forma operable al ácido nucleico que codifica un antígeno.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un cartucho de expresión que comprende un promotor enlazado en forma contigua a un ácido nucleico que codifica el epítope VP-1 descrito anteriormente, enlazado en forma operable al ácido nucleico que codifica un antígeno. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor específico de tejido. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor inducible. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor CMV, RSV, EFa-1 , o T7.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un vector que comprende el cartucho de expresión descrito anteriormente. En ciertas modalidades, el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, propone mecanismos de respuesta inmune celular incrementados para Ags conjugado con elemento de reconocimiento-Ab (ARE). Los grupos de ratón I y II, tienen respuesta humoral para AgA. Posteriormente el Grupo I se inmuniza con AgB conjugado para AREs derivados de AgA. En contraste, el Grupo II es inmunizado contra un AgB no conjugado. La respuesta humoral específica de AgA reconoce el AgB conjugado por ARE que incrementa la respuesta inmune de adaptación específica-B del Grupo I con respecto al Grupo II.
La figura 2, muestra respuestas de célula T de memoria CD8.
La figura 3, muestra una línea de tiempo para cuando los ratones son inyectados con antígeno, y los días en los cuales se recolecta la sangre para probar anticuerpos específicos de Ag1 y hapteno.
La figura 4, muestra el diseño de experimento in vitro para probar el rol de Ig secretado, y el diseño experimental in vivo para el rol de Ig soluble en respuestas inmune incrementadas.
La figura 5, muestra líneas de tiempo para las vacunaciones de conjugación ARE en sucesión, y para vacunaciones de conjugado ARE concurrentes.
La figura 6, muestra la Banca Inmune, que es la explotación de la respuesta Ab existente previamente para un hapteno ARE, 2,4,6, Trinitrofenilo (TNP), proporciona protección contra la muerte inducida con influenza.
La figura 7, muestra el rol de la inmunoglobulina específica de Ag soluble en respuestas incrementadas. El suero de ratones inmunizados con KLH o KLH-TNP se incubó con ovalbúmina conjugada con TNP. Las mezclas resultantes que contienen ovalbúmina-TNP más suero de ratón o complejos de ovalbúmina-TNP:anticuerpo, se inyectaron en ratones naive (3 por grupo). Varios días después de la inyección de ovalbúmina, se determinó el porcentaje de células T CD8 esplénicas específicas de ova, mediante manchado de citocina intracelular. Se debe observar que la inyección de los complejos inmune utilizando TNP como un ARE, incrementa la respuesta celular a la vacuna.
La figura 8, muestra la determinación de la eficacia de las vacunas de péptido modificadas con ARE. Los ratones con anticuerpos específicos de ARE mostraron menos morbididad después de la vacunación y estímulo con Influenza. Los ratones fueron ya sea vacunados (alum w/ PBS) o inmunizados contra Hepatitis B utilizando la vacuna humana (HBsAg - en alum). Al momento de la seroconversion a HBsAg en el grupo de prueba, ambos grupos de ratones recibieron una vacuna de nucleoproteína de influenza etiquetada con ARE de Hepatitis (HepPep-enlazada en forma covalente a la nucleoproteína-NP de influenza). Ambos grupos fueron estimulados posteriormente con influenza virulenta y la morbididad fue determinada mediante pérdida de peso. El grupo de vacuna etiquetada con HepPep-ARE muestra menos morbididad que el grupo de control .
La figura 9, muestra los resultados de VP-1 ARE enlazado químicamente a los HBsAg y determinados como un complejo inmune.
Descripción Detallada de la Invención El desarrollo de tecnologías para incrementar la inmunogenicidad de la vacunas de subunidad, es de mayor interés para los profesionales de la salud, personal militar y público en general. La capacidad de incrementar una inmunogenicidad de antígeno, mejora las vacunas actuales, e incrementa el desarrollo de nuevas vacunas, para reducir la morbididad y mortalidad relacionada con la infección. Además de combatir enfermedades infecciosas, los avances en el desarrollo de vacunas, benefician a pacientes con cáncer y que padecen de dependencia de químicos (por ejemplo, vacunación contra químicos activos tales como cocaína) a través de inmunoterapéuticos e intervención inmunológíca, respectivamente.
La inmunización exitosa da como resultado la activación de células inmune de adaptación, incluyendo linfocitos B (también llamados "células B"). La activación de célula B induce la expansión clonal y la diferenciación en células que producen Ab vida larga células de plasma) y en células de memoria B. Los individuos inmunizados de esta forma que expresan Abs solubles y mantienen las células de memoria B, cada uno tienen la capacidad de reconocer Ags particulares contenidos dentro de la vacuna original.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un proceso llamado "Banca Inmune" que incrementa la eficacia de vacuna, mediante la explotación de respuestas humorales existentes. El proceso de Banca Inmune, implica etiquetar nuevos antígenos con marcadores moleculares que ya son reconocidos por una respuesta de anticuerpo existente en un individuo. Este reconocimiento de los componentes de vacuna etiquetados, incrementan las respuestas inmune de adaptación a las nuevas vacunas. Las tecnologías de vacuna previas dependen de grandes dosis de antígeno y/o revacunaciones (dosis de refuerzo) y no confirieron protección contra todos los agentes infecciosos. Debido a que el proceso de Banca Inmune también tiene la capacidad de incrementar la eficacia de las vacunas, se puede utilizar para disminuir los requerimientos de dosis de las vacunas actuales, reduciendo el costo de fabricación, y reduce la necesidad de dosis de refuerzo (que puede incrementar el cumplimiento de la inmunización). El proceso de Banca Inmune, también permite la creación de nuevas vacunas, para combatir agentes infecciosos emergentes y cáncer, para los cuales aún no existen vacunas. Este proceso también incrementa la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales para usos de investigación o tratamientos clínicos. La tecnología de Banca Inmune, por consiguiente es de mayor interés para productores de vacuna, tanto para humanos como animales, compañías de biotecnología que producen anticuerpos policlonales y monoclonales para investigación experimental, y compañías farmacéuticas que producen anticuerpos monoclonales para el tratamiento de la enfermedad.
En ciertas modalidades, la presente invención expande la eficacia de la respuesta de vacuna y de esta forma el número de personas que responden a una vacuna en particular. También incrementa la efectividad de las vacunas en recién nacidos. El uso de este proceso supera múltiples problemas en usos actuales de vacunas, incluyendo el requerimiento de múltiples vacunaciones o "dosis de refuerzo", que se necesitan para dosis grandes de componentes de vacuna, incapacidad de vacunar a recién nacidos, dificultad en la producción de vacunas efectivas que protejan contra agentes infecciosos particulares, y desafíos en preparar vacunas que protejan contra cáncer. Los estudios múltiples han sugerido que al incrementar la eficacia de las vacunas a través de dirección o antígenos dirigidos (Ag) a células inmune, podría ayudar a resolver estos problemas. La dirección de antígenos a células inmune se ha logrado en instalaciones de laboratorio, mediante la configuración de Ag con ligandos específicos de célula o anticuerpos específicos de ligando, aunque la producción a gran escala y el desarrollo de dichas vacunas, es preventivo en costos, y enfrenta considerables obstáculos tecnológicos. Por consiguiente, es un gran reto una forma eficiente en costo, efectiva, y simple para dirigir antígenos de vacuna a células que presentan antígeno (APCs). El proceso de Banca Inmune logra esta meta utilizando la respuesta inmune humoral preexistente para dirigir antígenos de vacuna a células inmune, incrementando de esta forma la respuesta inmune para la vacuna .
En ciertas modalidades de la presente invención, un animal (por ejemplo, humano) se inmuniza previamente contra un antígeno conocido para generar una respuesta inmune inicial (por ejemplo, se administra una vacuna), y el sistema inmune del animal monta una respuesta inmune. El animal inmunizado previamente posteriormente se le administra un compuesto que comprende al menos un antígeno conjugado para un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE). La Banca Inmune se construye sobre el hecho de que tanto animales como humanos son sometidos en forma de rutina a vacunaciones con antígenos conocidos. En ciertas modalidades, las vacunas de Banca Inmune son modificadas con antígenos haptenados, y en ciertas situaciones, las vacunas de Banca Inmune tienen antígenos adicionales conjugados para los mismos. En ciertas modalidades, el ARE es un epítope VP-1 de polio de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud que comprende I PALTAVETGA (SEQ ID NO: 1). En ciertas modalidades, el ARE se conjuga para el antígeno por medio de un enlace alfa-Gal .
Mejoría de inmunogenicidad de vacuna, mediante explotación de respuestas humorales preexistentes El incremento de inmunogenicidad de vacuna, mejora las vacunas actualmente disponibles y mejora el desarrollo de nuevas vacunas para reducir la morbididad y mortalidad relacionada con la infección. Las vacunas dirigidas a células que representan antígenos (APCs) mediante conjugado de Ag con ligandos específicos de APC o Abs muestran, inmunogenicidad incrementada.
Sin embargo, la producción y desarrolló a gran escala de dichas vacunas, enfrenta obstáculos de costo y tecnológicos. Se carece de una forma eficiente en costo, efectiva, y simple para dirigir Ags de vacuna a las APCs. La inmunización exitosa da como resultado la activación de célula B, que induce la expansión y diferenciación clonal en el plasma que produce el Ab de vida larga y en células de memoria B. Por lo tanto, los individuos inmunizados tienen Abs solubles y células de memoria B, cada uno con la capacidad de reconocer Ags de la vacuna original. Los inventores de la presente invención utilizan AREs de una inmunización para modificar nuevos Ags, dirigiéndolos de esta forma a las APCs explotando las respuestas de memoria B existentes. El Ag específico que se dirige a APCs, utiliza una respuesta inmune humoral existente, y mejora la inmunogenicidad de una vacuna. Esto da como resultado tanto una eficacia de vacuna incrementada como una reducción en la necesidad de inmunizaciones repetidas.
Regulación de nuevas respuestas Ab mediante Abs preexistentes, un fenómeno conocido como regulación de retro-alimentación Ab, fue descrita originalmente en el año de 1892 por Emil von Berhing (Hjelm, F., et al. 2006. Scand J Immunol 64:177-184). Dependiendo del modelo experimental, la regulación de las nuevas respuestas Ab puede ser positiva (incremento) o negativa (supresión) (Heyman, B. 2000. Annu Rev Immunol 18:709-737). Aunque no se comprende en su totalidad, los mecanismos de incremento se considera que dependen de la captación transmitida por FcR de los complejos Ab:Ag seguido de la presentación de Ag a células T CD4 mediante APCs. Estas células T posteriormente pueden dar "ayuda" a nuevas células B específicas de Ag, incrementando de esta forma las respuestas Ab (Heyman, B. 2000. Annu Rev Immunol 18:709-737; Getahun, A., y B. Heyman. 2006. Immunol Lett 104:38-45). En forma interesante, aunque se escribió desde hace 100 años y se considera que implica a los linfocitos T, el efecto de la regulación de retroalimentacion Ab en respuestas de célula T CD4 y CD8, no ha sido determinada. Los experimentos aquí descritos evalúan los efectos de las respuestas humorales preexistentes en la generación de respuestas de células T a nuevos Ag, y la utilidad potencial como una nueva estrategia de incremento de inmunización.
La figura 1, proporciona el mecanismo(s) propuesto de la respuesta inmune celular incrementada a Ags conjugados con ARE. Los grupos I y II de ratón tienen respuestas humorales para AgA. El Grupo I es inmunizado con AgB conjugado para AREs derivados de Ag-A. El Grupo II se inmuniza contra Ag-B no conjugado. Las respuestas humorales específicas de Ag-A que reconocen AgB conjugado con ARE, incrementan la respuesta inmune de adaptación específica de linfocito del Grupo I, con respeto al Grupo II.
La Tabla 1 y la figura 2, muestran que las respuestas humorales preexistentes para AREs, incrementaron respuestas de célula T de CD8 para los inmunogenes novedosos, conjugados con ARE.
Tabla 1 Inmunización primaria Rol de respuestas Ab preexistentes en el incremento de respuesta inmune de adaptación a Ags novedosos.
Primero, se miden las cinéticas de la respuesta de célula T y B incrementadas por inmunidad humoral. El Ab específico de Ag durable, una medida de eficacia de vacuna, resulta de la activación de célula B, que conduce a la generación de productores Ab de vida. Abs proporciona protección inmune en parte a través de la opsonización de Ag que facilita su fagocitosis mediante células inmune que expresan FcRs. El Ag internado se procesa para la presentación a linfocitos T. Para cuantificar la respuesta primaria de células B naive a vacunación, se inyectaron grupos de 5 ratones C57B1/6 con TNP-KLH o Ags de control (KLH, KLH-NP, BSA-TNP). En el día 0 el suero se recolectó, seguido de inmunizaciones i.p. de Ags conjugados y no haptenados - KLH, KLH-NP, KLH-TNP, BSA-TNP o PBS solos, y una inmunización de refuerzo el día 14. Se recolectó el suero cada tres días comenzando el día 14 y se probó, junto con los sueros pre-inmunes, para Ig y IgG específicos de hapteno y transportador (ver la sección de "Métodos Generales" que se encuentra más adelante). Si los Abs específicos de Ag no fueron producidos después de la segunda inmunización, se proporciona una tercera inyección, el día 28, nuevamente seguido de medida Ab específica de Ag en suero cada tres días (ver figura 3).
La figura 2, indica que las respuestas de célula T en nuevos Ags se incrementan cuando son reconocidos por una respuesta Ab preexistente (modelo de figura 1). Las cinéticas y el fenotipo de respuestas inmune incrementadas se comparan con las de ratones que reciben inmunizaciones de control. Para comparar tanto los niveles altos de una respuesta específica de Ag como las cinéticas de las respuestas incrementadas-versus no incrementadas-humoral, los ratones inmunizados previamente con KLH-TNP o Ags de control reciben ova-TNP i.p. Se recolectaron sueros cada segundo día después de la ovainmunización para evaluar los Abs específicos de ova (ELISA) y monitorear las citocinas en suero (múltiplex de citocina). Debido a que el nivel de células T específicas de Ag en la circulación es relativamente bajo después de la inmunización i.p., se aisla el drenaje traqueobronquial (TB) LN de 3 ratones/grupo/tiempo y se utilizan para evaluar las respuestas de linfocito T. Las células LN se cultivan con o sin péptidos inmunodominantes CD4 y CD8 (tabla 2, ver la sección de "Métodos Generales" que se encuentra más adelante) durante 6 y 24 horas. Las células incubadas durante 6 horas se analizaron mediante citometría de flujo, para marcadores específicos de linaje (CD4 y CD8) y IFN-? intracelular, que indica respuestas de linfocito T. Los sobrenadantes de muestras de 24 horas, fueron analizados para múltiples citocinas utilizando el múltiplex Luminex®.
Se determina el tiempo mínimo necesario entre las inmunizaciones ARE únicas y la exposición a Ag novedoso para inducir respuestas humorales incrementadas. Utilizando el modelo anterior, se encuentran inmunizaciones con Ova-TNP comenzando el día 1 después de los Abs específicos de TNP, en suero de ratones inmunizados KLH-TNP. Los ratones preinmune se dividen en grupos basados en el tiempo de inyecciones Ova-TNP, cada 3 días comenzando el día 15, hasta las respuestas Ab anti-TNP pico. Al determinar el tiempo mínimo entre el refuerzo de hapteno y la segunda inyección de Ag necesaria para observar la respuesta incrementada, se desarrollan estrategias de vacunación óptimas.
Rol de inmunoglobulina específica de Ag soluble en respuestas incrementadas La contribución de la respuesta inmune a una respuesta de célula T no está claramente entendida. Una respuesta humoral activa para un Ag, incrementa una respuesta CTL para un nuevo Ag conjugado para el inmunogen original (figura 2). Es probable que está respuesta de célula T se deba a la captación Ag incrementada a través de los mecanismos dependientes de: 1) captación de complejo lg:Ag mediante FcR en APCs (DCs y mcp) y 2) captación Ag mediante células de memoria B específicas para el Ag original.
Para probar el rol del Ig secretado in vitro, se incubó suero preinmune o específico de hapteno con el fluorocromo modificado PE (ficoeritrina) y los controles (TNP-PE, PE, o DP- PE; un hapteno no específico) (figura 4). BMDC (DC derivado de médula ósea) de WT y FcyR-/- ratones (Takai, T., et al. 1994. Cell 76:519-529) se trataron con moléculas PE. El Ag fluorescente asociado con BMDCs, se cuantificó utilizando citometría de flujo. Se determina la presentación cruzada ova manchando BMDCs para expresión de MHC:ova-péptido utilizando Abs específicos de MHC:SIINFEKL (SEQ ID NO:3). El rol de Ig soluble en respuestas inmune incrementadas in vivo, se determina inyectando en ratones i.p. ova absorbido en suero y monitoreando las respuestas de linfocito. El suero y TB-LN se aislan y prueban para Abs específicos de ova, citocinas, y marcadores específicos de linaje, tal como se describió anteriormente. El rol de Ig soluble se determina mediante inmunización en FcyR-/- ratones, en donde FcyRI y III son no funcionales (Takai, T., et al. 1994. Cell 76:519-529), lo cual daña severamente la fagocitosis APC del conjugado de hapteno o Ag opsonizado-Ab (Wernersson , S., et al. 1999. J Immunol 163:618-622). En forma inversa, el ratón CB-17 transgénico IgM (tg), mantiene una cadena tg IgM H que no puede ser secretada (Hannum, L. et al. 2000. J Exp Med 192:931-942). Ya que CB-17 es Ig-tg de cadena-H, el repertorio de Ab se disminuye. Sin embargo, la expresión de mlgM de cadena-H con la cadena ? L, confiere reconocimiento del hapteno NP, dando como resultado de 2 al 4% de células B especificas NP (Hannum, L. et al. 2000. J Exp Med 192:931-942; Levine, M. et al. 2000. Proc Nati Acad Sci USA 97:2743-2748). Se utilizó CB-17 para determinar el rol de las células B específicas de Ag, tal como APCs de inmunización incrementada humoral. En cada caso, a los ratones mutantes y a los controles se les administraron inmunizaciones de KLH-NP iniciales seguido de Ova-NP, y se analizaron las respuestas específicas de Ova. Los ratones CB-17 no se probaron para Ig en suero, ya que no secretan Ab. Tanto CB-17 como FcyR-/- ratones están comercialmente disponibles.
Determinación de efectos inmune de inmunización repetida con nuevos Ags modificados con ARE.
La producción continua de Abs ARE puede ser perjudicial debido a la diferenciación/expansión de célula B reguladora, la interacción con FcyRIIb de inhibición, o las respuestas de encubrimiento a nuevos Ags conjugados con ARE mediante el despejo de complejo inmune. Estos experimentos identifican limitaciones potenciales a las respuestas incrementadas humorales a nuevos Ags conjugados con ARE, ya sea en forma concurrente o en sucesión (figura 5). Los ratones se inmunizaron primero contra KLH-TNP (tal como se describió anteriormente) y posteriormente Ova-TNP en los tiempos determinados para las respuestas máximas de célula T. Posteriormente, BSA-TNP es el inmunogen, seguido de HEL-TNP. Después de cada nuevo Ag, las respuestas de célula T a todos los inmunogenes recibidos se monitorean y compara con ratones naive e inmunizados con control en intervalos de 3 días. Aunque las respuestas de célula T específicas de Ag a ova se determina mediante manchado intracelular (ICS) utilizando péptidos MHC clase I y II definidos, los péptidos inmunodominantes para PCC y HEL para ratones B6 son desconocidos, de modo que la enumeración de células T específicas de PCC y HEL utiliza BMDCs que presentan Ag. Las vacunas multivalentes confieren protección contra patógenos múltiples en una dosis. Se determina si se observa inmunidad de adaptación incrementada a todos los Ags modificados con ARE, si se proporciona simultáneamente Ags conjugados con ARE, múltiples. Al momento de la inmunización con KLH-TNP, los ratones reciben una vacuna multivalente que contiene Ova-TNP, HEL-TNP, y PCC-TNP. Los controles reciben vacunas para Ova, HEL, y PCC no conjugados. Como un control adicional para la amplificación de respuestas independientes de ARE, un grupo de ratones inmunizados con KLH-TNP recibe una vacuna multivalente que contiene Ova-TNP, PCC-TNP, y HEL no conjugado. Comparando las respuestas inmune específicas de HEL de este grupo, con otros dos grupos, se muestra si existe incremento inmune de adaptación independiente de ARE, cuando se proporcionan vacunas conjugadas con ARE multivalentes.
Los experimentos anteriores comparan las respuestas inmune de adaptación entre ratones Ags conjugado con ARE y los que no. La figura 2 indica que las respuestas Ab preexistentes incrementan las respuestas de célula T CD8 para nuevos AREs conjugados con Ag.
Determinación de la eficacia de vacunas de péptido modificadas con ARE La estrategia ARE requiere ya sea inmunización con los conjugados de hapteno: transportador, o el uso de epítopes reconocidos de las inmunizaciones previas. Los epítopes inmunodominantes-lg de muchas vacunas infantiles, son conocidos y tienen potencial como Ags conjugados para nuevos AREs. El siguiente experimento prueba los niveles de protección de las vacunas conjugadas con ARE versus vacunas sin ARE, y la utilidad de AREs humanos versus haptenos.
La inmunogenicidad de ARE modificó los péptidos relacionados con Influenza. Utilizando el modelo descrito anteriormente, los ratones se inmunizan con KLH, KLH-TNP, toxoide de tétanos-KLH (TT), o TT solo. Cada grupo se divide posteriormente y se inmuniza con TNP o proteína A de influenza conjugada con TT. Posteriormente se miden las respuestas inmune relativas mediante titulador Ab específico de (ELISA), y las respuestas de célula T específicas de Ag).
Protección inducida por vacuna contra infección de influenza. Se revisa la vacunación modificada por ARE en comparación con la vacunación tradicional para la protección contra infección de influenza intranasal letal. A 1.0X LD50 de HIN1/ratón se administra en forma intranasal. En intervalos de 2 días, se monitorean las células T de TB-LN mediante ICS después de la interacción con péptidos inmunodominantes procedentes de NP Ag de influenza (Métodos). El titulador viral de pulmón se enumera/g tejido (Legge, K. L., y T. J. Braciale. 2005. Immunity 23:649-659). Se espera una respuesta inmune de adaptación incrementada, medida mediante actividad de célula T específica de NP y Abs, en ratones inmunizados con LH conjugado con TNP o TT.
Determinación de efectividad de estrategia ARE para reducir la necesidad de inmunizaciones repetidas.
La inmunidad incrementada por modificación de ARE, puede reducir la necesidad de dosis de refuerzo, y de esta forma producir un mayor cumplimiento de inmunización. Esto es de particular importancia en el mundo en desarrollo en donde los individuos con frecuencia viajan grandes distancias para vacunación. El experimento que se encuentra a continuación compara la respuesta inmune generada mediante inmunizaciones de refuerzo tradicionales, con la generada a través de una sola inmunización utilizando una vacuna modificada con ARE. Se utiliza Ag de superficie de Hepatitis B (HBsAg) como un inmunogen. La inmunización con la vacuna Hep B (que contiene HBsAg) requiere 3 inyecciones (dO, 30, y 180). El cumplimiento con el régimen de inyección es del ~ 68% (Trevisan, A., et al. 2006. Am J Infect Control 34:465-466), debido en parte, el tiempo entre las vacunaciones.
Los ratones inmunizados con KLH-TNP, tal como se describió anteriormente. Después de la seroconversión , los ratones reciben ya sea cantidades haptenadas o iguales de vacuna HBsAg no haptenada. Los ratones son monitoreados para respuestas de célula B y T a HBsAg, cada 5 días posteriores a la inmunización. Se monitorean las respuestas de célula T mediante ICS en respuesta a BMDCs pulsadas con Ag-completas. Las respuestas de célula T CD8, se miden en forma específica utilizando péptidos específicos de MHC clase I.
Aunque es importante la información con respecto a los efectos de la vacuna Hep B modificada con ARE en las respuestas de célula T, los tituladores Ab se correlacionan con la protección contra infección Hep B, de modo que el énfasis está en la producción Ab específica de Ag.
Se esperan respuestas celulares y humorales específicas de Hep B medibles, después de una sola vacuna conjugada con ARE en contraste con tres inmunizaciones necesarias con las inmunizaciones de Hep B tradicionales. El nivel de inmunidad de adaptación después de una a dos vacunaciones Hep B conjugadas con 1-2 ARE, se compara con las respuestas generadas mediante cada una de las tres vacunaciones con la estrategia tradicional.
Rol de la inmunoglobulina específica de Ag soluble en respuestas incrementadas En síntesis, el suero de ratones inmunizados con LH o KLH-TNP se incubó con ovalbúmina conjugada con TNP (figura 7). Las mezclas resultantes que contienen ovalbúmina-TNP más suero de ratón o complejos de ovalbúmina-TNP:anticuerpo se inyectaron en ratones naive (3 por grupo). Siete días posteriores a la inyección con ovalbúmina, el porcentaje de células T CD8 esplénicas específicas de ova, se determinó mediante manchado de citocina intracelular. Se debe observar que la inyección de los complejos inmune utilizando TNP como un ARE, incrementa la respuesta celular a la vacuna.
Determinación de la eficacia de vacunas de péptido modificadas con ARE.
Los ratones con anticuerpos específicos de ARE muestran menos morbididad después de la vacunación y estímulo con Influenza (figura 8). Los ratones fueron ya sea vacunados (alum el PBS) o inmunizados contra Hepatitis B utilizando la vacuna inmune (HBsAg - en alum). Al momento de la seroconversión a HBsAg en este grupo de prueba, ambos grupos de ratones recibieron una vacuna de nucleoproteína de influenza etiquetada con ARE de Hepatitis (HepPep-enlazada en forma covalente a la nucleoproteína-NP de influenza). Posteriormente ambos grupos fueron estimulados con influenza virulenta y se determinó la morbididad mediante la pérdida de peso. Los grupos de vacuna etiquetada HepPep-ARE, muestra menos morbididad con el grupo de control.
Compuestos conjugados con ARE-Ag La presente invención proporciona compuestos que son conjugados de AREs y antígenos, que son enlazados opcionalmente en forma operable por medio de una porción enlazadora.
A. Elemento de Reconocimiento de Anticuerpo (ARE) Un ARE (elemento de reconocimiento de anticuerpo) es un epítope de célula B de cualquier inmunogen. Para ser utilizado comercialmente, es importante que ARE sea reconocido por un gran conjunto de receptores potenciales. Por consiguiente, son mejores los AREs derivados de elementos de reconocimiento utilizados comúnmente derivados de vacunaciones previas o de infecciones de origen natural de cada grupo de receptores.
Los AREs de la presente invención son péptidos. En una modalidad, el ARE es el epítope VP-1 de polio de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud que comprende I PALTAVETGA (SEQ ID NO: 1). En otra modalidad, el ARE es una variante de este epítope HBsAg que contiene la adición N-terminal de RAGG (SEQ ID NO: 10) en la secuencia de aminoácido. En otra modalidad, el ARE es una variante del epítope HBsAg ya que contiene otros aminoácidos que son utilizados como espaciadores o grupos reactivos.
B. Antígenos Los antígenos que son enlazados a los AREs incluyen componentes proteináceos de agentes infecciosos humanos y animales infecciosos, tales como bacterias, hongos, parásitos, priones y viruses, o antígenos de cáncer. Los ejemplos de antígenos que pueden estar enlazados AREs, son antígenos de diversas enfermedades infecciosas que afectan a humanos, incluyendo las siguientes: Enfermedad infecciosa bacteriana Ántrax Meningitis bacteriana Botulismo Brucelosis Campilobacteriosis Enfermedad de rasguño de gato Cólera Difteria Tifo epidémico Gonorrea Impétigo Legionelosis Lepra (enfermedad de Hansen) Leptoespirosis Listeriosis Enfermedad de Lyme Melioidosis Infección MRSA Nocardiosis (Nocardia asteroides o Nocardia brasiliensis) Pertussis (tosferina Whooping) Plaga Neumonía neumococal Psittacosis Fiebre Q Fiebre con Mancha de Montaña Salmonelosis Fiebre escarlata Shigelosis Sífilis Tétano Tracoma Tuberculosis Tularemia Fiebre de tifoidea Tifo Infecciones de tracto urinario: cistitis o pielonef ritis Enfermedades fúngicas infecciosas Aspergilosis: aspergilosis broncopulmonar alérg aspergiloma pulmonar o aspergilosis invasiva.
Blastomicosis Candidiasis Coccidioidomicosis Criptococcosis Histoplasmosis Pie de atleta Enfermedades de infecciones por parásitos Tripanosomiasis Africana Amebiasis Ascariasis Babesiosis Enfermedad de Chagas Clonorquiasis Criptosporidiosis Cisticercosis Difilobotriasis Dracunculiasis Equinococcosis Enterobiasis Fascioliasis Fasciolopsiasis Filariasis Infección de amibas vivas libres (originadas por Naegleria fowleri y Acantamoeba) Giardiasis Gnatostomiasis Himenolepiasis (Hymenolepis nana o Hymenolepis diminuta) Isosporiasis Malaria Metagonimiasis M I iasis Oncocerciasis Pediculosis Sarna Teniasis Toxocariasis Toxoplasmosis Triquinelosis Tricuriasis Tricomoniasis Tripanosomiasis Enfermedad de infección prionales Síndrome de Alpers Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Insomnio familiar letal Kuru Encefalopatía espongiforma transmisibles Enfermedades de infecciones virales SIDA Chickenpox (Varicela) Resfriado común (nasofaringitis viral aguda) Infección de citomegalovirus Fiebre por garrapata de colorado Fiebre de dengue Fiebre hemorrágica de Ebola Enfermedad de manos, pies y boca (virus de Coxsackie A) Hepatitis Herpes simple Herpes zoster VHP Influenza (Flu) Fiebre de Lassa Sarampión Fiebre hemorrágica de Marburg Mononucleosis Infecciosa Paperas Poliomielitis Leucoencefalopatia multifocal progresiva Rabia Rubéola SARS Viruela (Varióla): originada por Varióla mayor y Varióla menor.
Encefalitis viral Gastroenteritis viral Meningitis viral Neumonía viral Enfermedad del Nilo Occidental Fiebre Amarilla Los antígenos de la presente invención también pueden ser de origen veterinario. Ver por ejemplo la Publicación de Veterinary Microbiology 2o Edición; Hirsh, DC; MacLachlan, NJ; y Walker, RL.; Blackwell Publishing.
En ciertas modalidades la Proteína de Nucleocapside (NP) de Influenza A H5N1 (A/lndonesia/5/2005(H5N1 )) número de acceso de proteína Genbank #ABI36003, se utiliza como el antígeno.
C. Acopladores/Enlazadores El acoplamiento de antígeno ARE se realiza ya sea directamente o utilizando enlazadores químicos de acuerdo con la práctica convencional.
En ciertas modalidades, el ARE y las moléculas de antígeno se enlazan covalentemente utilizando un agente de reticulación química. Se pueden utilizar muchos diferentes agentes de reticulación. En ciertas modalidades el agente de rerticulación tiene de aproximadamente 400 a 1000 daltons o aproximadamente 3 a 12 angstroms de longitud. Los reticuladores útiles en la presente invención, deben ser al menos bivalentes, para que puedan unir en forma covalente dos moléculas, el ARE a la molécula de antígeno. En ciertas modalidades, el reticulador puede ser aminotriacetato de tris-succinimidilo (TSAT); suberato de bis(sulfosuccinimidil) (BS3); suberato de disuccinimidilo (DSS); bis (2-[sulfosuccinimidiooxicarbonloxij etilsulfona) (BOSCOES); bis(2- [succinimidiooxicarbonloxi] etilsulfona) (Sulfo-BOSCOES); bis-(succinimidilsuccinato) de etilenglicol (EGS); bis-(sulfosuccinimidilsuccinato) de etilenglicol (Sulfo-EBS); o 3,3'-ditiobis-propionimidato de dimetilo (DTBP). En ciertas modalidades, el reticulador es bivalente, tal como BS3, Sulfo-Boscoes, EGS, Sulfo-EBS, o DTBP.
Los métodos para adherir reticuladores son bien conocidos en la técnica (c.f. Hermanson, 1995 Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc. Nueva York, páginas 728; Wong, 1991 Chemistry de Protein Conjugation y Cross-linking . CRC Press, páginas 340; Brinkley, 1992 A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens and cross-linking reagents (Estudio breve de los métodos para preparar conjugados de proteína con tintas, haptenos y reactivos de reticulación) Bioconjugate Chem. 3:2-13).
Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen formaldehído, glutaraldehído, MBS (éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) y/o Sulfo-MBS (el análogo soluble en agua de MBS), etc. Los ejemplos de acopladores/reticuladores se describen con detalle en el sitio web world-wide-web at solulink.com/white_papers/peptide y en el sitio web piercenet.com y en el sitio web piercenet.com/products/browse.cfm?fldlD = 020306.
Métodos y procedimientos generales Conjugación Ag. KLH-TNP y ova-TNP están comercialmente disponibles (Biosearch Technologies). Los conjugados adicionales se elaboran mediante reducción utilizando TNP-e-Aminocaproil-O-Su (Biosearch) en la presencia de Ags de vacuna. La actividad de célula T se monitorea mediante ICS. Se recolecta TB-LN de drenaje peritoneal tal como se describió anteriormente. Se homogeniza LN y se enumera el número de célula/LN. Las suspensiones celulares se tratan con y sin péptidos restringidos por MHC clase I o clase II específicos de Ag (tabla 2) en la presencia de brefeldina A y se incuban durante 6 horas.
Tabla 2 Las muestras se manchan para marcadores de expresión de superficie de los subconjuntos de célula T, se fijan y permeabiliza, y se manchan para IFN-? intracelular. La citometría de flujo determina el % de IFN- ?+ (que responde a Ag) células T CD4+ y CD8+ (Kraus, Z. J., et al. 2008. J Immunol 181:7800-7809). Si no se conocen los péptidos inmunodominantes MHC clase I y clase II (tabla 2), se generan BMDCs singeneicas y se utilizan como APCs (Breckpot, K., et al. 2004. J Gene Med 6:1175-1188; Sudowe, S., et al. 2003. Mol Ther 8:567-575; Bros, M., et al. 2009. J Immunol Metods 343:13-20). Para estimular las células T CD4 específicas de Ag, se pulsaron BMDCs con Ag durante 24 horas, permitiendo que las células se procesen y se presenten mediante MHC clase II. Debido a que las Ags de célula T CD8+ son generadas en forma más eficiente a partir de fuentes intracelulares, la carga de MHC clase I se logra transfectando BMDCs con ADN que codifica el Ag deseado. Después de la transfección , las BMDCs se dejan producir, procesar y presentar Ag durante 36 horas, Estas BMDCs, junto con las BMDCs no pulsadas, posteriormente son utilizadas como APCs para estimulación de células T derivadas de TB-LN.
Se llevó a cabo el análisis de respuesta humoral midiendo los Abs de suero específicos de Ag. Los ELISAs específicos de Ag son tal como se describió anteriormente (Xie, P., et al. 2007. Immunity 27:253-267; Stunz, L. et al. 2004. Immunity 21:255-266). Se utilizaron 20 Abs para IgM y IgG de ratón, para detectar Abs en suero específico de Ag. Las lecturas OD > 2 veces arriba del trasfondo, se consideran positivas (Xie, P., et al. 2007. Immunity 27:253-267; Stunz, L. et al. 2004. Immunity 21:255-266). Las citocinas se miden en suero y los cultivos celulares utilizando Luminex. Las muestras de suero se recolectan durante la recolección de LN. Las células aisladas de TB-LN, son estimuladas con péptidos, tal como se describe. Los sobrenadantes se recolectan después de 24 horas y se someten a ensayos de citocina múltiples.
Banca Inmune Los sistemas de adyuvante actuales inducen la actividad inmune no específica, global que pueda dar como resultado inflamación, daño de tejido e incluso síndromes tipo enfermedad autoinmune. Una de las ventajas novedosas del proceso de Banca Inmune, es el uso de anticuerpos preexistentes como adyuvantes endógenos, con la capacidad de inducir una respuesta inmune robusta. En contraste con los adyuvantes actuales, sin embargo, esta respuesta es altamente específica para el antígeno de inmunización, y no da como resultado una activación inmune no específica, global. Debido a que se crea el aprovechamiento de la Banca Inmune de la respuesta inmune preexistente, y a que es sostenido por el receptor como una defensa natural contra biomoléculas extrañas, esta tecnología reduce los efectos secundarios adyuvantes, y es mejor tolerada por los receptores.
En un ejemplo, la Banca Inmune aprovechó la respuesta Ab preexistente a un hapteno ARE, TNP, y proporcionó protección contra muerte inducida por influenza. Los ratones vacunados con alum solo, KLH en alum, o KLH-TNP en alum fueron inmunizados contra influenza utilizando la proteína de nucleocapside recombinante haptenada-TNP (NP) de influenza (figura 6). Posteriormente los ratones fueron infectados con una dosis letal de influenza y monitoreados con respecto a la enfermedad. Los ratones inmunizados con KLH-TNP mostraron un rango de supervivencia del 66% en comparación con los grupos de control con una supervivencia del 0%.
Enlace de ARE a Antígenos En ciertas modalidades, los VP-1 ARE se enlazan químicamente a HBsAg y se administran como un complejo inmune. En otras palabras, el HBsAg se enlazó químicamente al VP-1 ARE y posteriormente se mezcló con un anticuerpo que reconoce el ARE. El complejo del HBsAg + Anticuerpo etiquetado con ARE, se inyectó posteriormente como una vacuna y se comparó con HBsAg sin anticuerpo. El resultado fue una respuesta inmune robusta a HBsAg tal como se mide mediante la generación de anticuerpos específicos de HBsAg.
En ciertas modalidades, el ARE se enlazó al antígeno a través de tecnología de ADN recombinante, es decir, se realizó la construcción como una proteína de fusión que funciona efectivamente como un ARE.
Vacunas de la Invención En ciertas modalidades, la presente invención proporciona vacunas para utilizarse para proteger mamíferos contra la colonización y/o infección de agentes infecciosos o para tratar cáncer.
El término "hapteno" se refiere a un compuesto orgánico de bajo peso molecular que no tiene la capacidad de generar una respuesta inmune por sí mismo, pero que generará una respuesta inmune una vez que se una a una molécula transportadora. Los haptenos de ejemplo utilizados en compuestos conjugados, composiciones y métodos de la presente invención, incluyen fármacos, hormonas y toxinas, pero no se limitan a estos haptenos específicos.
El término "epítope" se refiere a un elemento básico o a la unidad más pequeña de reconocimiento por parte de un receptor de anticuerpo o célula T individual, y por lo tanto, el dominio, región o estructura molecular particular a la cual enlaza el receptor de anticuerpo o de célula T. Un antígeno puede consistir en numerosos epítopes aunque el hapteno normalmente, puede poseer algunos epítopes. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "corresponde esencialmente a" se refiere a un epítope que generará una respuesta inmunológica sustancialmente equivalente generara por el epítope nativo. Una respuesta inmunológica a una composición o vacuna, es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o transmitida por anticuerpo al polipéptido o vacuna de interés. Normalmente, dicha respuesta consiste en que el sujeto produzca anticuerpos, célula B, células T auxiliares, células T supresoras, y/o células citotóxicas dirigidas en forma específica a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Las vacunas de la presente invención también pueden incluir cantidades efectivas de adyuvantes inmunológicos, conocidos por incrementar una respuesta inmune. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para materializar un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de la composición, puede ser la cantidad de lograr este resultado seleccionado, y dicha cantidad puede ser determinada como una cuestión de rutina para un experto en la técnica. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar una deficiencia del sistema inmune, puede ser la cantidad necesaria que origine la actividad del sistema inmune, que da como resultado el desarrollo de una respuesta inmune especifica de antígeno al momento de la exposición al antígeno. El término también es sinónimo con "cantidad suficiente". La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o condición que está siendo tratada, la composición particular que está siendo administrada, el tamaño del sujeto y/o la severidad de la enfermedad o condición. Un experto en la técnica puede tener en forma empírica la cantidad efectiva de una composición particular de la presente invención sin necesitar experimentación indebida.
El término "adyuvante" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped, que cuando se combina con la vacuna y composición farmacéutica, respectivamente de la presente invención, puede proporcionar una respuesta inmune incluso incrementada. Se puede utilizar una variedad de adyuvantes. Los ejemplos incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de aluminio, y dipéptido de muralimo modificado. Los adyuvantes adicionales son geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de penetración magnética, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacillo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes también son conocidos en la técnica. Los adyuvantes adicionales que se pueden administrar con las composiciones de la presente invención, incluyen pero no se limitan a, inmunomodulador de lípido de monofosforilo, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de Aluminio (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294, y tecnología de adyuvante Virosomal. Los adyuvantes también pueden comprender una mezcla de estas sustancias.
Para inmunizar a un sujeto, la composición se administra en forma parenteral, usualmente mediante inyección intramuscular o subcutánea en un vehículo adecuado. Sin embargo, también son aceptables otros modos de administración, tales como administración oral, intranasal o intradérmica.
Las formulaciones de vacuna contendrán una cantidad efectiva del ingrediente activo en un vehículo, siendo determinada fácilmente la cantidad efectiva por un experto en la técnica. El ingrediente activo normalmente puede fluctuar de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95% (p/p) de la composición, o incluso más o menos, si es adecuado. La cantidad que será administrada depende de factores tales como la edad, peso y condición física del animal o el sujeto humano considerado para vacunación. La cantidad también depende de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las dosificaciones efectivas pueden ser establecidas fácilmente por un experto en la técnica a través de pruebas de rutina que establecen las curvas de respuesta de dosis. El sujeto se inmuniza mediante la administración del péptido de biopelícula o fragmento del mismo en una o más dosis. Se pueden administrar múltiples dosis según se requiera, para mantener un estado de inmunidad para la bacteria de interés.
Las formulaciones intranasales pueden incluir vehículos, que ni originan irritación a la mucosa nasal, ni perturban en forma significativa la función ciliar. Se pueden emplear con la presente invención, diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservadores tales como, pero sin limitarse a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un tensoactivo para incrementar la absorción de las proteínas en cuestión mediante la mucosa nasal.
Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma, por ejemplo, de suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elíxires acuosos o aceitosos, o se pueden presentar en seco en forma de tabletas o un producto para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de utilizarse. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes de suspensión, vehículos acuosos, (que pueden incluir aceites comestibles, o conservadores).
Para preparar una vacuna, la composición purificada puede ser aislada, liofilizada y estabilizada. La composición posteriormente se puede ajustar a una concentración adecuada, combinada opcionalmente con un adyuvante de vacuna adecuado, y empacarse para uso. Los adyuvantes adecuados incluyen pero no se limitan a tensoactivos, por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2-hidroxietil-propano di-amina), metoxihexadecil-gllcerol, y polioles plurónicos; polaniones, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo, aimetilglicina, tuftsina, emulsiones de aceite, alum, y mezclas de los mismos. Otros adyuvantes potenciales incluyen subunidades de péptido B péptido de toxina lábil al calor E. coli o de la toxina de cólera. McGhee, J.R., et al., "On vaccine development", (En el desarrollo de vacunas) Sem. Hematol, 30:3-15 (1993). Finalmente, el producto inmunogénico puede ser incorporado en liposomas para utilizarse en una formulación de vacuna, o puede conjugarse para proteger proteínas tales como hemocianina de penetración magnética (KLH) o albúmina de suero humano (HSA) u otros polímeros.
Definiciones El término "enlazado" se refiere al enlace o unión que puede ser covalente, por ejemplo, mediante acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, mediante interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno. Los enlaces covalentes pueden ser por ejemplo, enlaces de éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, imida, enlaces carbono-azufre, enlaces de carbono-fósforo y similares. El término "enlazado" es más amplio e incluye términos tales como "conjugado, "acoplado", "fusionado", y "unido".
Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención. La presente invención comprende composiciones de proteína aislada y sustancialmente purificada. Dentro del contexto de la presente invención, un polipéptido "aislado" o "purificado" es un polipéptido que existe separado de su ambiente nativo, y por consiguiente no es un producto de la naturaleza. Puede existir un polipéptido en una forma purificada o puede existir en una ambiente no nativo, tal como por ejemplo, una célula huésped transgénica. Por ejemplo, una proteína "aislada" o "purificada", o una parte biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo, cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros cuando se sintetiza químicamente. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular, incluye preparaciones de proteína o polipéptido que tiene menos del 30%, 20%, 10%, 5%, (en peso en seco) de la proteína contaminante. Cuando la proteína de la presente invención, o la parte biológicamente activa de la misma, es producida en forma recombinante, preferentemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de los precursores químicos o los químicos sin proteína de interés. Los fragmentos y variantes de las proteínas descritas o las proteínas de longitud parcial codificadas de esta forma, están contemplados por la presente invención. Por los términos "fragmento" o "porción", se entiende una longitud total o menos de la longitud total de la secuencia de aminoácido, de un polipéptido o proteína.
El término "de origen natural" se utiliza para describir un objeto que puede encontrarse en la naturaleza, en forma distinta a ser producido artificialmente. Por ejemplo, una secuencia de proteína o nucleótido presente en una organismo (incluyendo un virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada en forma intencional por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.
Una "variante de una molécula" es una secuencia es que sustancialmente similar a la secuencia de la molécula nativa.
El término "tipo natural" se refiere al gen normal, u organismo encontrado en la naturaleza sin cualquier mutación conocida.
El término "enlazado en forma operable" se refiere a la asociación de moléculas de modo que la función de una, es afectada, por la otra.
El término "identidad sustancial" dentro del contexto de un péptido, indica que un péptido comprende una secuencia con al menos el 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, o 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, o 89%, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, o 94%, o 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, en una ventana de comparación específica. Se lleva a cabo la alineación óptima utilizando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Una indicación de que dos secuencias de péptido son sustancialmente idénticas, es que un péptido es inmunológicamente reactivo con los anticuerpos surgidos contra el segundo péptido. Por lo tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren únicamente por una sustitución conservadora.
Para comparación de secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se ingresan a una computadora, se diseñan, si es necesario, coordenadas de subsecuencia y se diseñan parámetros de programa del algoritmo de secuencia. Este algoritmo de comparación de secuencia, posteriormente calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia(s) de prueba relativa a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa diseñado.
Por el término polipéptido "variante" se entiende un polipéptido derivado de una proteína nativa mediante eliminación (llamada truncación) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; eliminación o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa. Dichas variantes pueden resultar, por ejemplo, de polimorfismo genético o de manipulación humana. Los métodos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica.
Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención se pueden alterar en diversas formas, incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncaciones e inserciones de aminoácidos. Los métodos para estas manipulaciones generalmente son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácido son los polipéptidos se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos de mutagénesis y alteraciones de secuencia de nucleótido son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo las Publicaciones de Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Kunkel et al., Met. Enzymol., 154:367 (1987); Patente Norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra, Techniques in Mol. Biol. (MacMillan Publishing Co. (1983), y las referencias ahí mencionadas. Se puede encontrar una guía para las sustituciones de aminoácido adecuadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés, en el modelo de Dayhoff et al., Atlas de Protein Sequence y Structure (Nati. Biomed. Res. Found. 1978). Se prefieren sustituciones conservadoras, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares.
Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención comprenden proteínas de origen natural, así como variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continuarán obteniendo la actividad deseada. Las eliminaciones, inserciones y sustituciones de la secuencia de polipéptido aquí comprendidas, no se espera que produzcan cambios radicales en las características del polipéptido. Sin embargo, cuando es difícil anticipar el efecto exacto de la sustitución, eliminación, o inserción en forma anticipada a llevarlas a cabo, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante ensayos de clasificación de rutina .
Las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácido (normalmente menos del 5%, más normalmente menos del 1%) en una secuencia codificada, son "variaciones modificadas en forma conservadora", en donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácido funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes cinco grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras para el otro: Alifático: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W); que contienen Azufre: Metionina (M), Cisteína (C); Básicos: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Ácido: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q). Además, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada, también son "variaciones modificadas en forma conservadora".
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente o material que tiene un efecto benéfico en el receptor mamífero. Por lo tanto, el "agente terapéutico", abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que tienen componentes de ácido nucleico o proteína.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a disminuir al menos un síntoma, curar y lo prevenir el desarrollo de una enfermedad o condición determinada.
El término "antígeno" se refiere a una molécula con la capacidad de ser enlazada por un anticuerpo. Un antígeno tiene adicionalmente la capacidad de ser reconocido por el sistema inmune y/o tener la capacidad de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T. Un antígeno puede tener uno o más epítopes (epítopes de célula B y/o T). Los antígenos, tal como se utiliza en la presente invención, también pueden ser mezclas de diversos antígenos individuales. El término "determinante antigénica" se refiere a la parte de un antígeno que es reconocida específicamente ya sea por linfocitos B o T. Los linfocitos B que responden a determinantes antigénicas producen anticuerpos, mientras que los linfocitos T responden a determinantes antigénicas mediante proliferación y establecimiento de funciones efectoras críticas para la transmisión de inmunidad celular y/o humoral.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas con la capacidad de enlazar un epítope o determinante antigénico. Este término incluye anticuerpos completos y fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, incluyendo anticuerpos de cadena simple. En ciertas modalidades, los anticuerpos son fragmentos de enlace de antígeno humanos e incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal (incluyendo aves (por ejemplo, pollo) y mamíferos (por ejemplo, humano, múrido, conejo, cabra, cerdo de guinea, camello, caballo y similares). Tal como se utiliza en la presente invención, anticuerpos "humano" incluyen anticuerpos que tienen secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas, y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5,939,598.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de un grupo de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto eso, un grupo de anticuerpos en donde los anticuerpos que constituyen el grupo, son homogéneos excepto para los mutantes de origen natural que existen en una pequeña cantidad. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos e interactúan con un sitio antigénico simple. Además, cada anticuerpo monoclonal dirige una determinante antigénica simple (epítope) o un antígeno, en comparación con preparaciones de anticuerpo policlonal comunes que normalmente contienen varios anticuerpos contra diversas determinantes antigénicas. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son convenientes ya que son producidos de cultivos de hibridoma no contaminados con otras inmunoglobulinas.
El adjetivo "monoclonal" indica una característica de los anticuerpos obtenida de un grupo de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no especifican anticuerpos producidos por un método particular. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que será utilizado en la presente invención puede ser producida por ejemplo, mediante métodos de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975) o métodos de recombinación (Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales utilizados en la presente invención pueden ser aislados de una biblioteca de anticuerpo de fago (Clackson et al, Nature 352:624-628, 1991; Marks et al., J Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Los anticuerpos monoclonales de la presente invención comprenden particularmente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulina) en donde una parte de la cadena pesada (H) y/o cadena ligera (L) se deriva de una especie específica, o una clase o subclase de anticuerpo específico, y la parte restante de la cadena se deriva de otras especies, u otra clase o subclase de anticuerpo. Además, los anticuerpos mutantes o los anticuerpos fragmentos de los mismos también están comprendidos en la presente invención (Patente Norteamericana No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo muíante" se refiere a un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácido variante en donde uno o más residuos de aminoácido han sido alterados. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo puede ser modificada para mejorar sus propiedades biológicas, tal como enlace de antígeno. Dichas modificaciones pueden lograrse mediante mutagénesis dirigida al sitio (ver la Publicación de Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)), mutagénesis basadas en PCR, mutagénesis de cartucho y similares. Dichos mutantes comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo, más preferentemente al menos el 75%, incluso más preferentemente al menos 80%, incluso más preferentemente al menos el 85%, aún más preferentemente al menos el 90%, y lo más preferentemente al menos el 95% idéntica. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "identidad de secuencia" se define como el porcentaje de residuos idénticos a los que se encuentran en la secuencia de aminoácido original del anticuerpo, determinados después de que las secuencias son alineadas, y se introducen en forma adecuada saltos para maximizar la identidad de secuencia, según sea necesario.
Específicamente, la identidad de secuencia de un nucleótido o una secuencia de aminoácido con otra, se puede determinar utilizando el algoritmo BLAST, de Karlin y Altschul (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Se desarrollaron programas tales como BLASTN y BLASTX con base en este algoritmo (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Para analizar las secuencias de nucleótidos de acuerdo con BLASTN basado en BLAST, los parámetros se establecen, por ejemplo, como calificación = 100 y longitud de palaba =T2. Por otra parte, los parámetros utilizados para el análisis de secuencias de aminoácidos, mediante BLASTX basado en BLAST incluyen, por ejemplo, calificación =50 y longitud de palabra =3. Se utilizan parámetros por omisión para cada programa, cuando se utilizan dos programas BLAST y Gapped BLAST. Las técnicas específicas para dichos análisis son conocidas en la técnica (ver el sitio web del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información de Biotecnología) (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Se pueden preparar anticuerpos policlonales y monoclonales a través de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar a través de los métodos que se describen a continuación: Un antígeno preparado tal como se describió anteriormente, se proporciona un mamífero, tal como un ratón, rata, hámster, cerdo de guinea, caballo, mono, conejo, cabra y oveja. Esta inmunización se puede llevar a cabo a través de cualquier método existente, incluyendo inyecciones intravenosas, inyecciones subcutáneas e inyecciones intraperitoneales normalmente utilizadas. No existen restricciones para los intervalos de inmunización. La inmunización puede llevarse a cabo en intervalos de varios días, varias semanas, preferentemente 4 a 21 días. Un ratón puede ser inmunizado, por ejemplo, en una dosis simple de 10 a 100 g (por ejemplo, 20 a 40 pg) de la proteína de antígeno, aunque la dosis no se limita a estos valores.
Antes de la primera inmunización, y de tres a siete días después de la segunda y subsecuentes inmunizaciones, se recoleta sangre de los animales, y los sueros son analizados para titulador de anticuerpo. Para promover una respuesta inmune, se utiliza preferentemente un agente de agregación tal como alum. En general, los anticuerpos de mamíferos seleccionados tienen afinidad de enlace de antígeno suficientemente alta. La afinidad de anticuerpo se puede determinar utilizando un ensayo de enlace de saturación, como un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA), o un ensayo de competición (por ejemplo, radioinmunoensayo).
Los anticuerpos policlonales se pueden clasificar a través de análisis de reticulación convencional, tales como los descritos en la Publicación de "Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Harlow y David Lañe edit. (1988))". Un método alternativo es por ejemplo, mapeo de epítope (Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 388-1394 (1995)). Un método preferido para determinar el polipéptido o los tituladores de anticuerpo comprende cuantificar la afinidad de enlace de anticuerpo. En otras modalidades, también se utilizan métodos para evaluar una o más propiedades biológicas de un anticuerpo, además de o en lugar de los métodos para determinar la afinidad de enlace de anticuerpo. Dichos métodos analíticos son particularmente útiles debido a que demuestran la efectividad terapéutica de los anticuerpos. Cuando un anticuerpo exhibe una propiedad mejorada en dicho análisis, su afinidad de enlace es generalmente, aunque no siempre incrementada.
Los hibridomas que son utilizados para preparar anticuerpos monoclonales, pueden ser obtenidos, por ejemplo, a través del método de Milstein et al. (Kohler, G., y Milstein, C, Metods Enzymol. 1981, 73, 3-46). Las células de mieloma que serán fusionadas con las células que producen anticuerpos, pueden ser líneas celulares derivadas de cualquiera de los diversos animales, tales como ratones, ratas y humanos, los cuales generalmente están disponibles para los expertos en la técnica. Las líneas celulares que serán utilizadas son resistentes a fármacos, y no pueden sobrevivir en un medio selectivo (por ejemplo, medio de HAT) en un estado no fusionado, pero pueden sobrevivir en un estado fusionado. Las líneas celulares resistentes a 8-azaguanina generalmente son utilizadas, las cuales tienen deficiencia en hipoxantina-guanina-transferasa de fosforibosilo y no pueden crecer en un medio de hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT). Las células de mieloma incluyen una variedad de líneas celulares, conocidas, por ejemplo P3x63Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology y Immunology (1978) 81:1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C, Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276: 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133), y P3U1 (J. Exp. Med. 1979, 150:580; Curr Top Microbiol. Immunol. 1978, 81:1). También se pueden utilizar líneas de célula de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humanas para producir anticuerpos monoclonales humanos (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Se recolectan las células que producen anticuerpo, por ejemplo, de animales sacrificados de dos a tres días después de la inmunización final. Las células que producen anticuerpos incluyen células de bazo, células de nodo linfático y células de sangre periférica. Las células de bazo son las generalmente utilizadas. Específicamente, los tejidos tales como bazos o nodos linfáticos son cortados o recolectados de los diversos animales descritos anteriormente. Posteriormente, los tejidos son triturados, y el material resultante es suspendido en un medio o amortiguador, tal como PBS, DMEM o RPMI1640, seguido de filtración con una malla de acero inoxidable o similar. Esto posteriormente se centrifuga para obtener células de interés que producen anticuerpos.
Las células de mieloma y las células que producen anticuerpos antes descritas, posteriormente son fusionadas. Se logra la fusión celular contactando las células de mieloma con las células que producen anticuerpo como una proporción de 1:1 a 1:20 en un medio para el cultivo de células animales, tal como MEM, DMEM y RPMI-1640, a una temperatura de 30 a 37°C durante unos 15 minutos en la presencia de un agente que promueve la fusión. Para promover la fusión celular, las células que producen anticuerpo y las células de mieloma pueden ser fusionadas utilizando un dispositivo de fusión celular comercialmente disponible, utilizando un agente de promoción de fusión, tal como un polietilenglicol (peso molecular promedio de 1,000 a 6,000 (Da)) o alcohol polivinílico o un virus para fusión tal como virus de Sendai.
Los hibridomas de interés se seleccionan de las células después de la fusión celular. Los métodos de selección incluyen métodos que utilizan propagación selectiva de células en un medio selectivo. Específicamente, se diluye una suspensión celular con un medio adecuado, y posteriormente las células se revisten sobre las placas de microtitulación. Se agrega a cada depósito una alícuota del medio de selección (por ejemplo, medio HAT) y posteriormente las células son cultivadas, en tanto que el medio de selección es intercambiado en forma adecuada. Las células crecidas como resultado, pueden ser guardadas como hibridomas.
En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de una biblioteca de fago de anticuerpo, producirse mediante el uso de las técnicas reportadas por McCafferty et al. (Nature 348:552-554 (1990)).
Clackson et al. (Nature 352:624-628 (1991)) y Marks et al. (J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)) reportadas en el aislamiento respectivo de anticuerpos de ratón y humano de las bibliotecas de fago. También existen reportes que describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) con base en la revoltura de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), e infección de combinación y recombinación in vivo, los cuales son métodos para construir bibliotecas de fago a gran escala (Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 21:2265-2266 (1993)). Estas tecnologías también se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales, en lugar de utilizar tecnología de hibridoma convencional para producción de anticuerpo monoclonal.
Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales de los hibridomas obtenidos incluyen métodos de cultivo celular y métodos que comprenden producción de ascitos estándares. En métodos de cultivo celular, los hibridomas son cultivados durante dos a 14 días bajo condiciones de cultivo estándar (por ejemplo, a una temperatura de 37°C en una atmósfera de 5% C02), en un medio de cultivo para células de animal, tal como RPMI-1640 o MEM que contiene del 10 al 20% de suero de becerro fetal o medio libre de suero, y los anticuerpos posteriormente se preparan a partir del sobrenadante del cultivo. En el método que comprende la producción de ascitos, los hibridomas se administran a las cavidades perifonéales de los individuos mamíferos de la misma especie de la cual se derivan las células de mieloma, y los hibridomas proliferan en grandes cantidades. Posteriormente los ascitos o el suero se recolectan después de una a cuatro semanas. Para incrementar la producción de ascitos, por ejemplo, se puede administrar previamente pristano (2,6, 10, 14-tetrametilpentadecano) a la cavidad peritoneal. Los anticuerpos que serán utilizados en la presente invención, pueden ser purificados a través de un método seleccionado en forma adecuada de métodos conocidos, tales como método de proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, método de eliminación de sal con sulfato, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía por afinidad, o a través del uso combinado de las mismas.
La presente invención puede utilizar anticuerpos recombinantes, producidos mediante ingeniería genética. Los genes que codifican los anticuerpos obtenidos a través de un método descrito anteriormente, son aislados de los hibridomas. Los genes son insertados en un vector adecuado, y posteriormente introducidos en un huésped (ver por ejemplo la publicación de Cari, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, Publicada en el Reino Unido por Macmillan Publishers Ltd, 1990). La presente invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la presente invención, y los vectores que comprenden estos ácidos nucleicos. Específicamente, utilizan una tra nscriptasa inversa, los cADNs que codifican las regiones variables (regiones V) de los anticuerpos, se sintetizan de los mARNs de hibridomas. Después de obtener los ADNs que codifican las regiones variables de los anticuerpos de interés, se ligan con ADNs que codifican regiones constantes deseadas (regiones C) de los anticuerpos, y las construcciones de ADN resultantes se insertan en vectores de expresión. Alternativamente, los ADNs que codifican las regiones variables de los anticuerpos se pueden insertar en vectores de expresión que comprenden los ADNs de las regiones de anticuerpo C. Estas se insertan en vectores de expresión de modo que los genes se expresan bajo la regulación de una región reguladora de expresión, por ejemplo, un aumentador o promotor. Posteriormente, las células huésped se transforman con los vectores de expresión para expresar los anticuerpos. La presente invención proporciona células que expresan anticuerpos de la presente invención. Las células que expresan anticuerpos de la presente invención, incluyen células e hibridomas transferidos con un gen de dicho anticuerpo.
En la presente invención, se pueden utilizar anticuerpos recombinantes modificados artificialmente para reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos. Los ejemplos incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados pueden producirse utilizando métodos conocidos. Un anticuerpo quimérico incluye un anticuerpo que comprende regiones variables y constantes de las especies que son diferentes entre si, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón, y las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo de un humano. Dicho anticuerpo se puede obtener mediante (1) ligar un ADN que codifica una región variable de un anticuerpo de ratón a un ADN que codifica una región constante de un anticuerpo humano; (2) incorporar esto en un vector de expresión; y (3) introducir el vector en un huésped para producción del anticuerpo. Un anticuerpo humanizado, el cual también es llamado un anticuerpo humano reformado, se obtiene sustituyendo una región de determinación de complementariedad de cadena H o L (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón, con la CDR de un anticuerpo humano. Las técnicas de recombinación genética convencional para la preparación de dichos anticuerpos son conocidas (ver por ejemplo las Publicaciones de Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)). Específicamente, una secuencia de ADN diseñada para ligar una CDR de un anticuerpo de ratón con las regiones de estructura (FRs) de un anticuerpo humano, se sintetiza mediante PCR, utilizando diversos oligonucleótidos construidos para comprender partes de traslape en sus extremos. Un anticuerpo humanizado puede ser obtenido mediante (1) ligar el ADN resultante a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano; (2) incorporar esto en un vector de expresión; y (3) transfectar el vector en un huésped para producir el anticuerpo (ver la Solicitud de Patente Europea No. EP 239,400, y la Solicitud de Patente Internacional No. WO 96/02576). Las FRs de anticuerpo humano que se ligan mediante CDR, son seleccionadas cuando la CDR forma un sitio de enlace de antígeno favorable. El anticuerpo humanizado puede comprender un residuo(s) de aminoácido adicional, que no está incluido en las CDRs introducidas en el anticuerpo del receptor, ni en las secuencias de estructura. Dichos residuos de aminoácido normalmente son introducidos para optimizar en forma más precisa la capacidad que tiene el anticuerpo de reconocer y enlazar a un antígeno. Por ejemplo, según sea necesario, los aminoácidos en la región de estructura de una región variable de anticuerpo, se pueden sustituir de modo que la CDR de un anticuerpo humano reformado, forme un sitio de enlace de antígeno adecuado (Sato, K. et al., Cáncer Res. (1993) 53, 851-856).
Los métodos para obtener anticuerpos humanos también son conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados con actividad de enlace de antígeno se pueden obtener mediante (1) sensibilizar linfocitos humanos con antígenos de interés o células que expresan antígenos de interés in vitro; y (2) fusionar los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano, tal como U266 (ver la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Revisada No. (JP-B) Hei 1-59878). Como alternativa, el anticuerpo humano deseado también se puede obtener utilizando un antígeno para inmunizar un animal transgénico (Tg) que comprende un repertorio parcial o total de genes de anticuerpo humano (ver las Publicaciones de Nature Genetics 7: 13-21 (1994); Nature Genetics 15: 146-156 (1997); Nature 368:856-859 (1994); Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Específicamente, dichos animales Tg son creados como se indica a continuación: se obtiene un mamífero no humano en donde se han interrumpido los loci de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina endógena, y más bien, se han introducido los loci de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina humana, mediante vectores de cromosoma artificial de levadura (YAC) y similares, mediante la creación de animales de eliminación o animales Tg, o apareando dichos animales. Los loci de cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser desactivados funcionalmente, por ejemplo, introduciendo un defecto en un cierto sitio en la región J o región C (por ejemplo, región Cp). Las cadenas ligeras de inmunoglobulina (por ejemplo, la cadena K) pueden ser desactivadas funcionalmente, por ejemplo, introduciendo un defecto en un cierto sitio de una región J o región C, o una región que comprende las regiones J y C.
Dicho anticuerpo humanizado también se puede obtener de sobrenadante de cultivo, utilizando tecnología de ingeniería genética para transformar células eucarióticas con cADNs que codifican cada una de las cadenas pesada y ligeras del anticuerpo, o preferentemente vectores que comprenden estos cADNs y posteriormente cultivando las células transformadas que producen el anticuerpo monoclonal humano recombinante. Los huéspedes son, por ejemplo, células eucarióticas deseadas, preferentemente células de mamífero, tales como células CHO, linfocitos y mieloma.
Además, se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante cribación con una biblioteca de anticuerpo humano. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena simple (scFv) en la superficie de un fago, utilizando un método de despliegue de fago, y los fagos que enlazan al antígeno pueden ser seleccionados. Mediante el análisis de los genes de fago seleccionados, las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que enlazan antígenos pueden ser determinadas. Si las secuencias de ADN de scFvs que enlazan al antígeno son identificadas, se pueden construir vectores de expresión adecuados que comprendan estas secuencias, y posteriormente introducirse en huéspedes adecuados y expresarse para obtener anticuerpos humanos.
Dichos métodos ya son conocidos (ver las Publicaciones Internacionales WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388).
Cuando los genes de anticuerpo han sido aislados e introducidos en un huésped adecuado, se pueden utilizar huéspedes y vectores de expresión en combinación adecuada para producir los anticuerpos. Como células huésped eucarióticas, se pueden utilizar células animales, células de plantas y células fúngicas. Las células de animales incluyen: (1) células de mamífero tales como CHO, COS, mieloma, riñón de hámster bebé (BHK), células HeLa y Vero; (2) células de anfibio tales como oocitos de Xenopus; o (3) células de insecto tales como sf9, sf21 y Tn5, o de gusanos de seda. Las células de plantas conocidas incluyen células derivadas de género Nicotiana tal como Nicotiana, que pueden ser cultivadas mediante callo. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales como las del género Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger. Las células procarióticas también se puede utilizar en sistemas de producción que utilizan células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Los anticuerpos se pueden obtener transfiriendo los genes de anticuerpo de interés en estas células utilizando transformación, y posteriormente cultivando las células transformadas in vitro.
Los isotipos de los anticuerpos de la presente invención no están limitados. Los isotipos incluyen, por ejemplo, IgG (lgG1, lgG2, lgG3 y lgG4), IgM, IgA (lgA1 y lgA2), IgD, y IgE. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser fragmentos de anticuerpo que comprenden una parte responsable del enlace de antígeno, o un fragmento modificado de la misma. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte del anticuerpo de longitud total, y generalmente un fragmento que comprende un dominio de enlace de antígeno o una región variable. Dichos fragmentos de anticuerpo incluyen por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, Fv (scFv) de cadena simple que comprende un Fv de cadena pesada y un Fv de cadena ligera acoplados juntos con un enlazador adecuado, diacuerpo (diacuerpos), anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos preparados de fragmentos de anticuerpo.
Anteriormente, se produjeron fragmentos de anticuerpo digiriendo anticuerpos naturales con una proteasa; actualmente, también son conocidos métodos para expresarlos como anticuerpos recombinantes utilizando técnicas de ingeniería genética (ver las Publicaciones de Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science 229:81 (1985); Co, M. S. et al., J. Immunol, 1994, 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669; Bird, R. E. et al, TIBTECH, 1991 , 9, 132-137).
Un fragmento "Fv", es el fragmento de anticuerpo más pequeño y contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y un sitio de enlace completos. Esta región es un dímero (dímero VH-VL) en donde las regiones variables de cada una de la cadena pesada y la cadena ligera se conectan fuertemente mediante un enlace no covalente. Las tres CDRs de cada una de las regiones variables interactúan entre sí para formar un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En otras palabras, un total de seis CDRs de las cadenas pesadas y ligeras funcionan juntas como un sitio de enlace de antígeno de anticuerpo. Sin embargo, una región variable (o un medio Fv, que contiene únicamente tres CDRS específicas de antígeno) sola, es conocida como con la capacidad de reconocer y enlazar un antígeno, aunque su afinidad es menor que la afinidad de todo el sitio de enlace. Por lo tanto, un fragmento de anticuerpo preferido de la presente invención es un fragmento de Fv, aunque no se limita a esto. Dicho fragmento de anticuerpo puede ser un polipéptido que comprende un fragmento de anticuerpo de las CDRs de cadena pesada y ligera que son conservadas, y que pueden reconocer y enlazar su antígeno.
Un fragmento Fab (también referido como F(ab)) también contiene una región constante de cadena ligera y una región constante de cadena pesada (CH1). Por ejemplo, la digestión con papaína de un anticuerpo produce dos tipos de fragmentos: un fragmento de enlace de antígeno llamado un fragmento Fab, que contiene las regiones variables de una cadena pesada y cadena ligera, que sirven como un dominio de enlace de antígeno simple; y la parte restante, la cual es llamada un "Fe", debido a que se cristaliza fácilmente. Un fragmento Fab' es diferente de un fragmento Fab, en cuanto a que el fragmento Fab' también tiene diversos residuos derivados del término carboxilo de una región CH1 de cadena pesada, que contiene uno o más residuos de cisteína de la región de articulación de un anticuerpo. Sin embargo, un fragmento Fab' es estructuralmente equivalente a Fab ya que son fragmentos de enlace de antígeno que comprenden las regiones variables de una cadena pesada y cadena ligera, que sirven como un dominio de enlace de antígeno simple. Aquí, un fragmento de enlace de antígeno que comprende las regiones variables de una cadena pesada y ligera que sirven como un dominio de enlace de antígeno simple, y que es equivalente al obtenido mediante digestión con papaína, es referido como un "anticuerpo tipo Fab" incluso cuando no es idéntico a un fragmento de anticuerpo producido mediante digestión de proteasa. Fab'-SH es Fab' con uno o más residuos de cisteína que tienen tres grupos tiol en su región constante. Se produce un fragmento F(ab') disociando el enlace de disulfuro entre los residuos de cisteína que se encuentran en la región de articulación de F(ab')2. También son conocidos para los expertos en la técnica otros fragmentos de anticuerpo reticulados en forma química. La digestión mediante papaína de un anticuerpo produce dos fragmentos; uno es un fragmento F(ab')2 que comprende dos dominios de enlace de antígeno y que pueden reaccionar en forma cruzada con antígenos, y el otro es el fragmento restante (referido como pFc'). Aquí, un fragmento de anticuerpo equivalente al obtenido mediante digestión con pepsina, es referido como un "anticuerpo tipo F(ab')2", cuando comprende dos dominios de enlace de antígeno y puede reaccionar en forma cruzada con los antígenos. Dichos fragmentos de anticuerpo también pueden ser producidos, por ejemplo, mediante ingeniería genética. Dichos fragmentos de anticuerpo también pueden ser aislados, por ejemplo, de la biblioteca de fago de anticuerpo descrita anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos F(ab')2-SH directamente de los huéspedes, tal como E. coli, y posteriormente se dejan formar fragmentos F(ab')2 mediante reticulación química (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En un método alternativo, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de un cultivo de huéspedes recombinantes.
El término "diacuerpo (Db)" se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido mediante fusión genética (ver por ejemplo las Publicaciones de P. Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), Publicaciones de Patente EP 404,097, WO 93/11161). En general, un diacuerpo de un dímero de dos cadenas de polipéptido. En cada una de las cadenas de polipéptido, se conectan mediante un enlazador corto una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH), por ejemplo, un enlazador de aproximadamente cinco residuos, de modo que no puedan enlazar juntas. Debido a que el enlazador entre las dos es demasiado corto, el VL y VH en la misma cadena de polipéptido, no pueden formar un fragmento de región de cadena V simple, sino más bien forman un dímero. Por lo tanto, un diacuerpo tiene dos dominios de enlace de antígeno. Cuando las regiones VL y VH contra los dos tipos de antígenos (a y b) se combinan para formar VLa-VHb y Lb-VHa mediante un enlazador de aproximadamente cinco residuos, y posteriormente se expresan en conjunto, son secretadas como Dbs biespecíficos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser dichos Dbs.
Un anticuerpo de cadena simple (también referido como "scFv") se puede preparar enlazando una región de cadena V pesada y una región de cadena V ligera de un anticuerpo (para la revisión de scFv ver la Publicación de Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" (Farmacología de Anticuerpos Monoclonales) Vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, Springer Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)). Los métodos para preparar anticuerpos de cadena simple son conocidos en la técnica (ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778; 5,260,203; 5,091,513; y 5,455,030). En dichas scFvs, la región de cadena V pesada y la región de cadena V ligera se enlazan juntas mediante un enlazador, preferentemente, un enlazador de polipéptido (Huston, J. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A, 1988, 85, 5879-5883). La región de cadena V pesada y la región de V de cadena ligera en un scFv se pueden derivar del mismo anticuerpo, o de diferentes anticuerpos. El enlazador de péptido utilizado para ligar las regiones V puede ser cualquier péptido de cadena simple que consista en 12 a 19 residuos. Un ADN que codifica un scFv se puede amplificar mediante PCR utilizando, como una plantilla, ya sea todo el ADN, o un ADN parcial que codifica una secuencia de aminoácido deseada, seleccionada de un ADN que codifica una cadena pesada o la región V de la cadena pesada del anticuerpo anterior, y un ADN que codifica la cadena ligera o la región V de la cadena ligera del anticuerpo anterior; y utilizando un par de cebadores que definen dos extremos. Se puede llevar a cabo en forma subsecuente amplificación adicional, utilizando una combinación de ADN que codifica la parte enlazadora de péptido, y el par de cebadores que definen ambos extremos del ADN que serán ligados a la cadena pesada y ligera, respectivamente. Después de construir los ADNs que codifican scFvs, se pueden utilizar métodos convencionales para obtener vectores de expresión que comprenden estos ADNs, y los huéspedes transformados a través de estos vectores de expresión. Además, los scFvs se pueden obtener de acuerdo con métodos convencionales utilizando los huéspedes resultantes. Estos fragmentos de anticuerpo se pueden producir en huéspedes, obteniendo genes que codifican los fragmentos específicos y que expresan éstos tal como se definió anteriormente. Los anticuerpos enlazados a diversos tipos de moléculas, tales como polietilenglicoles (PEGs), se pueden utilizar como anticuerpos modificados. Los métodos para modificar anticuerpos están ya establecidos en la técnica. El término "anticuerpo" en la presente invención, también comprende los anticuerpos descritos anteriormente.
Los anticuerpos obtenidos se pueden purificar para la homogeneidad. Los anticuerpos pueden ser aislados y purificados a través de un método utilizado en forma de rutina para aislar y purificar proteínas. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante el uso combinación de uno o más métodos seleccionados en forma adecuada de, cromatografía de columna, filtración, ultrafiltración, extracción de sal, diálisis, electroforesis de gel de poliacrilamida de preparación y electroenfoque, por ejemplo (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual (Estrategias para Purificación y Caracterización de Proteína: Manual de Laboratorio), Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Manual de Laboratorio). Ed Harlow and David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Dichos métodos no se limitan a los descritos anteriormente. Los métodos de cromatografía incluyen cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, filtración de gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de absorción. Estos métodos cromatográficos se pueden practicar utilizando cromatografía de fase líquida, tal como HPLC y FPLC. Las columnas que serán utilizadas en cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Por ejemplo, las columnas de proteína A incluyen Hyper D, POROS, y Sefarosa F. F. (Pharmacia). Los anticuerpos también pueden ser purificados utilizando enlace de antígeno, utilizando transportadores en los cuales se han inmovilizado los antígenos.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos estándar (ver ejemplo la Publicación de Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, U.S. A), y pueden comprender transportadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. La presente invención se refiere a composiciones (incluyendo reactivos y farmacéuticos) que comprenden los anticuerpos de la presente invención, y transportadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables.
Los transportadores de ejemplo incluyen tensoactivos (por ejemplo, PEG y Tween), excipientes, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes de coloración, agentes de saborización, conservadores, estabilizadores, agentes de amortiguación (por ejemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos), agentes de quelación (por ejemplo, EDTA), agentes de suspensión, agentes de isotonización, enlazadores, desintegradores, lubricantes, promotores de fluidez y correctores. Sin embargo, los transportadores que pueden ser empleados en la presente invención, no se limitan a esta lista. De hecho, se pueden emplear en forma adecuada otros transportadores utilizados comúnmente: ácido salicílico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, calcio de carmelosa, sodio de carmelosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, polivinilacetaldietilaminoacetato, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena media, aceite de castor hidrogenado con polioxietileno 60, sacarosa, carboximetilcelulosa , almidón de maíz, sal inorgánica, etc. La composición también puede comprender otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina de suero, gelatina e inmunoglubulina y aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y Usina. Cuando la composición se prepara como una solución acuosa para inyección, puede comprender una solución isotónica que comprende, por ejemplo, solución salina fisiológica, dextrosa y otros adyuvantes incluyendo por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio, que pueden contener también un agente de solubilización adecuado, por ejemplo, alcohol (por ejemplo, etanol), polialcohol (por ejemplo, propilen glicol y PEG), y un detergente no iónico (polisorbato 80 y HCO-50).
Si es necesario, los anticuerpos de la presente invención se pueden encapsular en microcápsulas (microcápsulas elaboradas de hidroxicelulosa, gelatina, polimetilmetacrilato, y similares) y elaborarse en componentes de sistemas de suministro de fármaco coloidal (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) (por ejemplo, ver la Publicación de "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition" (Ciencia Farmacéutica de Remington 16° edición), Oslo Ed. (1980)). Además, se conocen métodos para elaborar fármacos de liberación sostenida, y éstos se pueden aplicar para los anticuerpos de la presente invención (Langer et al., J Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982); Patente Norteamericana. No. 3,773,919; Solicitud de Patente Europea No. 58,481; Sidman et al., Biopolimers 22: 547-556 (1983); Patente Europea No. 133,988).
Una "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activación o proliferación de linfocitos B- y/o T y/o células que presentan antígeno. Sin embargo, en algunos casos, las respuestas inmune pueden ser de baja intensidad y volverse a detectar únicamente cuando se utiliza al menos una sustancia de acuerdo con la presente invención. El término "inmunogénico" se refiere a un agente utilizado para estimular el sistema inmune de un organismo vivo, de modo que se incrementen una o más funciones del sistema inmune, y se dirijan hacia el agente inmunogénico. Un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que genera una respuesta inmune celular y/o humoral, ya sea solo o enlazado a un transportador en la presencia o ausencia de un adyuvante. Preferentemente, la célula que presenta antígenos puede ser activada.
Una sustancia que "incrementa" una respuesta inmune se refiere a una sustancia en la cual se observa una respuesta inmune que es mayor o se intensifica o desvía en cualquier forma con la adición de la sustancia cuando se compara con la misma respuesta inmune medida sin la adición de la sustancia. Por ejemplo, la actividad lítica de las células T citotóxicas puede medirse, utilizando, un ensayo de liberación 51Cr, en muestras obtenidas con y sin el uso de las sustancias durante inmunización. La cantidad de sustancia en la cual se incrementa la actividad lítica CTL en comparación con la actividad lítica CTL sin la sustancia, se dice que es una cantidad suficiente para incrementar la respuesta inmune del animal al antígeno.
En ciertas modalidades, la respuesta inmune se incrementa en un factor de al menos aproximadamente 2, tal como en un factor de aproximadamente 3 o más. La cantidad o tipo de citocinas secretadas también puede alterarse. Alternativamente, la cantidad de anticuerpo es inducida o sus subclases pueden ser alteradas.
Los términos "inmunizar" o "inmunización" o términos relacionados se refieren a conferir la capacidad de montar una respuesta inmune sustancial (que comprende anticuerpos y/o inmunidad celular tal como CTL efectora) contra un antígeno o epítope objetivo. Estos términos no requieren que se cree una inmunidad total, sino más bien que se produzca una respuesta inmune que sea sustancialmente mayor a la línea de base. Por ejemplo, un mamífero puede ser considerado como inmunizado contra un antígeno objetivo, si la respuesta inmune celular y/o humoral al antígeno objetivo, ocurre después de la aplicación de los métodos de la presente invención.
El término "inmunoterapéutico" se refiere a una composición para el tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones. Más específicamente, el término se utiliza para referirse a un método de tratamiento, en donde se genera una respuesta inmune benéfica mediante vacuna o mediante transferencia de moléculas inmune. Un "cantidad inmunológicamente efectiva" se refiere a una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmune en un individuo, cuando se introduce en dicho individuo. Dentro del contexto de inmunización activa, el término es sinónimo con "cantidad inmunológicamente efectiva". La cantidad de composición necesaria para que sea inmunológicamente efectiva varía de acuerdo con muchos factores incluyendo la composición, la presencia de otros componentes en la composición (por ejemplo, adyuvantes), el antígeno, la ruta de inmunización, el individuo, el estado fisiológico o inmune previo etc.
Moléculas de Ácido Nucleico, Cartuchos de Expresión y Vectores de Expresión Los AREs y compuestos conjugados se pueden codificar a través de una secuencia de ácido nucleico, y la secuencia de ácido nucleico también puede incluir un promotor. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una señal de poliadenilación. En algunas modalidades, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación mínima sintética o una secuencia de seis Ts.
El término "ácido nucleico" se refiere al ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y polímeros de los mismos en forma de hebra simple o doble, compuesto de monómeros (nucleótidos) que contienen azúcar, fosfato y una base que es ya sea purina o pirimidina. A menos que se limite en forma específica, el término comprende ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares, como el ácido nucleico de referencia, y son metabolizados en una forma similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también comprende variantes modificadas en forma conservadora de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codón de degeneración) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada en forma explícita. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codón de degeneración generando secuencias en las cuales la tercera parte de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituya con la base mezclada y/o residuos de desoxiinosina. Un "fragmento de ácido nucleico" es una parte de una molécula de ácido nucleico determinada.
Una "secuencia de nucleótido" es un polímero de ADN o ARN que puede ser de hebra simple o hebra doble, que contiene opcionalmente bases de nucleótido sintético, no natural y alterada con la capacidad de incorporación en polímeros de ADN o ARN.
Los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico", "secuencia o segmento de ácido nucleico" o "polinucleótido" se utilizan de manera intercambiable, y también se pueden utilizar de manera intercambiable con gen, cADN, ADN y ARN codifica por un gen.
La presente invención comprende moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas o aisladas, y composiciones que contienen dichas moléculas. Dentro del contexto de la presente invención, una molécula de ADN o molécula de ARN "aislada" o "purificada", es una molécula de ADN o molécula de ARN que existe separada de su ambiente nativo, y por consiguiente no es un producto natural. Una molécula de ADN o molécula de ARN aislada puede existir en una forma purificada o puede existir en un ambiente no nativo, tal como, por ejemplo, una célula huésped transgénica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o parte biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza en forma química. En una modalidad, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (por ejemplo, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de las secuencias de nucleotido que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótido descritas también están comprendidas en la presente invención. Por el término "fragmento" o "porción" se entiende una longitud total o menos de una longitud total de la secuencia de nucleótido.
El término "de origen natural", "nativo" o "tipo natural" se utiliza para describir un objeto que puede encontrarse en la naturaleza, en forma diferente a ser producido artificialmente. Por ejemplo, un secuencia de proteína o nucleótido presente en un organismo (que incluye un virus), que puede ser aislada de una fuente natural y que no ha sido modificada intencionalmente por una persona en el laboratorio, es de origen natural.
Una "variante de una molécula, es una secuencia que es sustancialmente similar a la secuencia de la molécula nativa. Para secuencias de nucleótido, las variantes incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácido idéntica de la proteína nativa. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente tal como éstas pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular, como por ejemplo, con reacción de cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación. Las secuencias de nucleótido variantes, también incluyen secuencias de nucleótido derivadas en forma sintética, tal como las generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida a sitio, que codifican la proteína nativa, así como las que codifican un polipéptido que tienen sustituciones de aminoácido. Generalmente, las variantes de secuencia de nucleótido de la presente invención tendrán al menos del 40%, 50%, 60% al 70%, por ejemplo, del 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% al 79%, generalmente al menos el 80%, por ejemplo, del 81% al 84%, al menos el 85%, por ejemplo, del 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% al 98%, de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótido nativa (endógena).
Un "transgen" se refiere a un gen que ha sido introducido en el genoma mediante transformación. Los transgenes incluyen, por ejemplo, ADN que es ya sea heterólogo u homólogo al ADN de una célula particular que será transformada. Además, los transgenes pueden incluir genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos.
El término "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo.
Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención.
El término "tipo natural" se refiere a un gen normal u organismo encontrado en la naturaleza.
El término "genoma" se refiere al material genético total de un organismo.
Un "vector" se define como que incluye, entre otros, cualquier vector viral, así como cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario en forma lineal o circular de hebra doble o simple que puede o no ser autotransmisible o movilizable, y que puede transformar un huésped procariótico o eucariótico ya sea mediante integración en el genoma celular o existir en forma extracromosomal (por ejemplo, plásmido de réplica autónoma con un origen de réplica).
El término "cartucho de expresión", tal como se utiliza en la presente invención, significa una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótido particular en una célula huésped adecuada, que puede incluir un promotor enlazado en forma operable a la secuencia de nucleótido de interés que puede ser enlazada en forma operable a las señales de terminación. La región de codificación normalmente codifica un ARN funcional de interés, por ejemplo, un ARN que codifica un epítope o compuesto conjugado. El cartucho de expresión que incluye la secuencia de nucleótido de interés puede ser quimérico. El cartucho de expresión también puede ser uno que sea de origen natural, pero que haya sido obtenido de una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. La expresión de la secuencia de nucleótido en el cartucho de expresión pueden ser bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor regulable que inicie la transcripción únicamente cuando la célula huésped está expuesta a un estímulo en particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor puede ser también específico para un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.
Dichos cartuchos de expresión pueden incluir una región de inicio de transcripción enlazada a una secuencia de nucleótido de interés. Dicho cartucho de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gen de interés que estará bajo la regulación de transcripción de las regiones reguladoras.
Las "secuencias reguladoras" son secuencias de nucleótido localizadas en la corriente ascendente (secuencias sin codificación 5') dentro, o en la corriente descendente (secuencias sin codificación 3') de una secuencia de codificación, y que influencian la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras incluyen aumentadores, promotores, secuencias líder de traducción, intrones y secuencias de señal de poliadenilación. Incluyen secuencias naturales y sintéticas, así como secuencias que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Tal como aquí se observa, el término "secuencias reguladoras adecuadas" no se limita a promotores. Sin embargo, se incluirán algunas secuencias reguladoras adecuadas útiles en la presente invención, pero no se limitan a los promotores constitutivos, promotores específicos de tejido, promotores específicos de desarrollo, promotores regulables y promotores virales.
"Promotor" se refiere a una secuencia de nucleótido, normalmente la corriente ascendente (5') para su secuencia de codificación, que dirige y/o controla la expresión de la secuencia de codificación, proporcionando el reconocimiento para polimerasa de ARN y otros factores requeridos para transcripción adecuada. El término "promotor" incluye un promotor mínimo que es una secuencia de ADN corta comprendida de una caja-TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de inicio de transcripción, a los cuales se agregan los elementos reguladores para el control de expresión. El término "promotor" también se refiere a una secuencia de nucleótido que incluye un promotor mínimo más elementos reguladores que tienen la capacidad de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consiste en elementos de corriente ascendente próximos o más distantes, siendo referidos frecuentemente los últimos elementos como aumentadores. Por consiguiente, un "aumentador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad de promotor, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para incrementar el nivel o especificidad de tejido de un promotor. Tiene la capacidad de operar en ambas orientaciones (normal y volteada), y tiene la capacidad de funcionar incluso cuando se mueve hacia la corriente ascendente o corriente descendente del promotor. Ambos aumentadores y otros elementos promotores de corriente ascendente enlazan a proteínas de enlace de ADN específicas de la secuencia que transmiten sus efectos. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso estar comprendidos de segmentos de ADN sintético. Un promotor también puede contener secuencias de ADN que están implicadas en el enlace de factores de proteína que controlan la efectividad del inicio de transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo. Los ejemplos de promotores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen los promotores de ARN de ratón U6, promotores de H1RNA humanos sintéticos, SV40, CMV, RSV, promotores de polimerasa de ARN II y de polimerasa de ARN III.
El "sitio de inicio" es la posición que rodea el primer nucleótido que es parte de la secuencia transcrita, que también se define como la posición +1. Con respecto a este sitio, todas las otras secuencias del gen y sus regiones de control son enumeradas. Las secuencias de corriente descendente (es decir, las secuencias de codificación de proteína adicionales en la dirección 3') son denominadas positivas, en tanto que las secuencias de corriente ascendente (en su mayor parte las regiones de control en la dirección 5') son denominadas negativas .
Los elementos promotores, particularmente un elemento TATA, que son inactivos o que tienen actividad promotora reducida en gran parte en la ausencia de la activación de corriente ascendente, son referidos como "promotores de centro o mínimos". En la presencia de un factor de transcripción adecuado, el promotor mínimo funciona para permitir la transcripción. Por lo tanto, un "promotor mínimo o de centro" consiste únicamente en todos los elementos básales necesarios para el inicio de transcripción, por ejemplo, una caja TATA y/o un iniciador.
El término "expresión constitutiva" se refiere a la expresión utilizando un promotor constitutivo o regulado. La "expresión condicional" y "expresión regulada" se refieren a la expresión controlada por un promotor regulado.
El término "enlazado en forma operable" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en el fragmento de ácido nucleico simple, de modo que la función de una de las secuencias se ve afectada por la otra. Por ejemplo, una secuencia de ADN reguladora se dice que está "enlazada en forma operable a" o "asociada con" una secuencia de ADN que codifica para un ARN o un polipéptido, si las dos secuencias se sitúan de modo que la secuencia de ADN reguladora afecte la expresión de la secuencia de ADN de codificación (es decir, que la secuencia de codificación o ARN funcional esté bajo el control de transcripción de promotor). Las secuencias de codificación pueden estar enlazadas en forma operable a secuencias reguladoras en la orientación de sentido o antisentido.
El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno, gen heterólogo o segmento de ácido nucleico, o un transgen en las células. Por ejemplo, en el caso de construcciones de epítope, la expresión se puede referir a la transcripción únicamente del epítope. Además, la expresión se refiere a la transcripción y acumulación estable del ARN de sentido (mARN) o funcional. La expresión también puede referirse a la producción de proteína.
El término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de una célula huésped, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o tiene capacidad de transformación, a través de una molécula de ácido nucleico exógena. Las células huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como "células transgénicas".
Los términos "transformado", "transducido", "transgénico" y "recombinante" se refieren a una célula huésped en la cual se ha introducido la molécula de ácido nucleico heteróloga. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "transfección" se refiere al suministro de ADN en células eucarióticas (por ejemplo, de mamíferos). El término "transformación" se utiliza en la presente invención para referirse al suministro de ADN en células procarióticas (por ejemplo, E. coli). El término "transducción" se utiliza en la presente invención para referirse a células de infección con partículas virales. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada en forma estable en el genoma generalmente conocido en la técnica. Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no se limitan a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos simples, cebadores de degeneración, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desacoplados y similares. Por ejemplo, las células "transformadas", "transformantes" y "transgénicas" han pasado por el proceso de transformación y contienen un gen extraño integrado en su cromosoma. El término "no transformado" se refiere a células normales que no han pasado por el proceso de transformación.
Las "células genéticamente alteradas" indican células que han sido modificadas por la introducción de ácidos nucleicos recombinantes o heterólogos (por ejemplo, una o más construcciones de ADN o sus contrapartes de ARN) e incluye además, la progenie de dichas células que retiene parte o toda la modificación genética.
Moléculas de Ácido Nucleico de la Invención Los términos "aislado y/o purificado" se refiere al aislamiento in vitro de un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN de su ambiente celular natural, y de la asociación con otros componentes de la célula, tal como el ácido nucleico o polipéptido, de modo que se pueda secuenciar, replicar y/o expresar. El ARN o ADN está "aislado", en el sentido de que está libre de al menos un ácido nucleico contaminante, con el cual normalmente se asocia en la fuente natural del ARN o ADN y preferentemente está sustancialmente libre de cualquier otro ARN o ADN de mamífero. La frase "libre de al menos un ácido nucleico de fuente contaminante con el cual se asocia normalmente" incluye el caso en donde el ácido nucleico se vuelve a introducir en la fuente o célula natural, pero está en una diferente ubicación cromosomal, o de otra forma está flanqueada por las secuencias de ácido nucleico que normalmente no se encuentran en la célula fuente, por ejemplo, en un vector o plásmido.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "acido nucleico recombinante", por ejemplo, "secuencia o segmento de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, a ADN, que ha sido derivado o aislado de cualquier fuente celular adecuada, que puede ser alterado subsecuentemente in vitro, de modo que su secuencia no es de origen natural, o corresponde a secuencias de origen natural que no están posicionadas como podrían estar posicionadas en un genoma el cual no ha sido transformado con el ADN exógeno. Un ejemplo de un ADN preseleccionado "derivado" de una fuente, podría ser una secuencia de ADN que es identificada como un fragmento útil dentro de un organismo determinado, y que posteriormente se sintetiza en forma química en forma esencialmente pura. Un ejemplo de dicho ADN "aislado" de una fuente, podría ser una secuencia de ADN útil que se corta o elimina de una fuente mediante medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, modo que pueda ser manipulada, por ejemplo, amplificada, para utilizar en la invención, a través de la metodología de ingeniería genética. El "ADN recombinante" incluye secuencias de ADN completamente sintéticas, secuencias de ADN semi sintéticas, secuencias de ADN aisladas de fuentes biológicas, y secuencias de ADN derivadas de ARN, así como mezclas de las mismas.
Cartuchos de Expresión de la Invención Para preparar cartuchos de expresión, la secuencia o segmento de ADN recombinante puede ser circular o lineal, de hebra doble o hebra simple. Generalmente, la secuencia o segmento de ADN está en la forma de ADN quimérico, tal como un ADN de plásmido o un vector que también puede contener regiones de codificación flanqueadas por secuencias de control que promueven la expresión del ADN recombinante presente en la célula transformada resultante.
Un vector "quimérico" o cartucho de expresión, tal como se utiliza en la presente invención, significa un vector o cartucho que incluye secuencias de ácido nucleico de al menos dos diferentes especies, o tiene una secuencia de ácido nucleico de las mismas especies, esto es enlazada o asociada en una forma que no ocurre en la "naturaleza" o tipo natural de las especies.
Además de las secuencias de ADN recombinante que sirven como unidades de transcripción para la transcripción de ARN, o parte de la misma, una parte del ADN recombinante puede no ser transcrito, sirviendo para una función reguladora o estructural. Por ejemplo, el ADN recombinante puede tener un promotor que es activo en células de mamífero.
Otros elementos funcionales en las células huésped, tales como intrones, aumentadores, secuencias de poliadenilación y similares, también puede ser parte del ADN recombinante. Dichos elementos pueden o no ser necesarios para la función del ADN, aunque pueden proporcionar la expresión mejorada del ADN afectando la transcripción, o similares. Dichos elementos pueden estar incluidos en el ADN según se desee para obtener el desempeño óptimo del ARN en la célula.
Las secuencias de control son secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada en forma operable en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para células procarióticas, por ejemplo, incluyen un promotor y opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y aumentadores.
Los ácidos nucleicos enlazados en forma operable, son ácidos nucleicos colocados en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o aumentador está enlazado en forma operable a una secuencia de codificación, si afecta la transcripción de la secuencia; un sitio de enlace de ribosoma está enlazado en forma operable a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la traducción. Generalmente, las secuencias de ADN enlazadas en forma operable son secuencias de ADN que están enlazadas y contiguas. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra mediante ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótido sintético son utilizados de acuerdo con la práctica convencional.
El ADN recombinante que será introducido en las células puede contener ya sea un gen marcador seleccionable o un gen reportero, o ambos para facilitar la identificación y selección de células de expresión de la población de células consideradas como transfectadas o infectadas a través de vectores virales. En otras modalidades, el marcador seleccionable puede ser llevado en una pieza separada de ADN y utilizarse en un procedimiento de cotransfección. Ambos marcadores seleccionables y genes reporteros pueden estar flanqueados con secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tal como neo y similares.
Los genes reporteros se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. Los genes reporteros que codifican para proteínas fácilmente ensayables, son conocidos en la técnica. En general, un gen reportero es un gen que no está presente en, o no es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica una proteína cuya expresión es manifestada por cierta propiedad detectable fácilmente, por ejemplo, actividad enzimática. Por ejemplo, los genes reporteros incluyen el gen de transferasa de acetil de cloranfenicol (cat) de Tn9 de E. coli, y el gen de luciferasa de Photinus pyralis de luciérnaga. La expresión del gen reportero se ensaya en un momento adecuado después de que el ADN ha sido introducido en las células receptoras.
Los métodos generales para construir el ADN recombinante que puede transfectar células objetivo son conocidos para los expertos en la técnica, y se pueden utilizar las mismas composiciones y métodos de construcción para producir el ADN útil en la presente invención.
El ADN recombinante puede ser introducido fácilmente en las células huésped, por ejemplo, células de mamífero, bacterianas, de levadura o insectos mediante transfección con un vector de expresión compuesto de ADN que codifica el epítope o compuesto conjugado a través de cualquier procedimiento útil para la introducción en una célula particular, por ejemplo, métodos físicos o biológicos, para producir una célula que tiene ADN recombinante integrado en forma estable en su genoma o que existe como un elemento episomal, de modo que las moléculas de ADN, o las secuencias de la presente invención, sean expresadas por la célula huésped. Preferentemente, el ADN se introduce en células huésped mediante un vector. La célula huésped es preferentemente de origen eucariótico, por ejemplo, fuentes de plantas, mamíferos, insectos, levadura o fúngicas, aunque las células huésped de origen no eucariótico también pueden ser empleadas.
Los métodos físicos para introducir un ADN preseleccionado en una célula huésped, incluyen precipitación de fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección , electroporación , y similares. Los métodos biológicos para introducir el ADN de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores virales de ADN y ARN. Para terapia genética de mamíferos, tal como se describe más adelante, es conveniente utilizar un medio eficiente para insertar un gen de copia en el genoma huésped. Los vectores virales y especialmente los vectores retrovirales, se han vuelto el método más ampliamente utilizado para insertar genes en células de mamífero, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden ser derivados de virus pox, virus de herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,350,674 y 5,585,362.
Tal como aquí se describe, una célula huésped o línea de célula "transfectada" o "transducida" es una en la que el genoma ha sido alterado o aumentado por la presencia de al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga recombinante. Las células huésped de la presente invención normalmente se producen mediante transfección con una secuencia de ADN en un vector de expresión de plásmido, un vector de expresión viral, o como una secuencia de ADN lineal aislada. El ADN transfectado puede volverse una secuencia de ADN recombinante integrada en forma cromosomal, la cual está compuesta de una secuencia que codifica el epítope o compuesto conjugado.
Para confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula huésped, se puede llevar a cabo una variedad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos para los expertos en la técnica, tal como manchado Southern y Northern, RT-PCR y PCR; los ensayos "bioquímicos", tal como detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, a través de medios inmunológicos (ELISAs y manchados Western) o mediante ensayos aquí descritos para identificar agentes que están dentro del alcance de la presente invención.
Para detectar y cuantificar el ARN producido de segmentos de ADN recombínante introducido, se puede emplear RT-PCR. En esta aplicación de PCR, es necesario primero invertir el ARN transcrito en ADN, utilizando enzimas tales como transcriptasa inversa, y posteriormente a través del uso de técnicas de PCR convencionales para amplificar el ADN. En la mayoría de los casos las técnicas PCR, aunque útiles, no demostrarán integridad del producto de ARN. Se puede obtener mediante manchado Northern información adicional con respecto a la naturaleza del producto de ARN. Esta técnica demuestra la presencia de una especie de ARN y proporciona información con respecto a la integridad de dicho ARN. La presencia o ausencia de las especies de ARN también se puede determinar utilizando hibridaciones Northern de manchado de punto o ranura. Estas técnicas son modificaciones del manchado Northern, y demuestran únicamente la presencia o ausencia de una especie de ARN.
Aunque se puede utilizar manchado Southern y PCR para detectar el segmento de ADN recombinante en cuestión, no proporcionan información con respecto a si está siendo expresado el segmento de ADN preseleccionado. La expresión puede ser evaluada identificando específicamente los productos de péptido de las secuencias de ADN recombinantes introducidas, o evaluando los cambios fenotípicos alrededor de la expresión del segmento de ADN recombinante introducido en la célula huésped.
Métodos para Introducir los Cartuchos de Expresión de la Presente Invención en las Células El material de ácido nucleico (por ejemplo, un cartucho de expresión que codifica el epítope o compuesto conjugado) se pueden introducir en la célula ex vivo o in vivo mediante métodos de transferencia genética, tal como transfección o traducción, para proporcionar una célula genéticamente modificada. Los expertos en la técnica conocen diversos vectores de expresión (por ejemplo, vehículos que facilitan el suministro de un ácido nucleico exógeno en una célula objetivo).
Tal como se utiliza en la presente invención, la "transfección de células" se refiere a la adquisición por parte de una célula del nuevo material de ácido nucleico mediante la incorporación del ADN agregado. Por lo tanto, la transfección se refiere a la inserción del ácido nucleico en una célula utilizando métodos físicos o químicos. Los expertos en la técnica conocen diversas técnicas de transfección, incluyendo coprecipitación de ADN de fosfato de calcio, DEAE-dextran, electroporación , transfección transmitida por liposoma catiónico, bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno y coprecipitación de ADN de fosfato de estrontio.
En contraste, la "transducción de células" se refiere a procesos para transferir ácido nucleico en una célula utilizando virus de ADN o ARN. Un virus de ARN (por ejemplo, un retrovirus) para transferir un ácido nucleico en una célula, aquí es referido como un retrovirus quimérico de transducción. El material de ácido nucleico exógeno contenido dentro del retrovirus se incorpora en el genoma de la célula transducida. Una célula que ha sido transducida con un virus de ADN quimérico (por ejemplo, un adenovirus que lleva un cADN que codifica un agente terapéutico) no tendrá el material de ácido nucleico exógeno incorporado en su genoma, pero tendrá la capacidad de expresar el material de ácido nucleico exógeno que es retenido en forma extracromosomal dentro de la célula.
El material de ácido nucleico exógeno puede incluir el ácido nucleico que codifica el epítope o compuesto conjugado junto con un promotor para controlar la transcripción. El promotor tiene característicamente una secuencia de nucleótido específica necesaria para iniciar la transcripción. El material de ácido nucleico exógeno puede incluir además secuencias adicionales (por ejemplo, aumentadores) requeridas para obtener la actividad de transcripción de gen deseada. Para el propósito de la descripción de un "aumentador", se indica simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que opere con la secuencia de codificación (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. El material de ácido nucleico exógeno puede introducirse en el genoma celular inmediatamente en la corriente descendente del promotor, de modo que el promotor y la secuencia de codificación sean enlazados en forma operativa para permitir de esta forma la transcripción de la secuencia de codificación. Un vector de expresión puede incluir un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Dichos promotores exógenos incluyen promotores tanto constitutivos como regulables.
Los promotores constitutivos de origen natural controlan la expresión de funciones celulares esenciales. Como resultado, una secuencia de ácido nucleico bajo el control de un promotor constitutivo, se expresa bajo todas las condiciones de crecimiento. Los promotores constitutivos incluyen los promotores para los siguientes genes, que codifican ciertas funciones constitutivas o de "mantenimiento": transferasa de fosforribosil de hipoxantina (HPRT), reductasa de dihidrofolato (DHFR), deaminasa de adenosina, cinasa de fosfoglicerol (PGK), cinasa de piruvato, mutasa de fosfoglicerol, el promotor de beta D-actina, y otros promotores constitutivos conocidos para los expertos en la técnica. Además, muchos promotores virales funcionan en forma constitutiva en células eucarióticas. Estos incluyen: los promotores tempranos y tardíos de SV40; las repeticiones de terminal larga (LTRs) de Virus de Leucemia de Moloney y otros retroviruses; y el promotor de cinasa de timidina del Virus de Herpes Simple, entre muchos otros.
Las secuencias de ácido nucleico que están bajo el control de promotores regulables se expresan únicamente o hasta un mayor o menor grado en la presencia de un agente de inducción o represión (por ejemplo, transcripción bajo el control del promotor de metalotioneína incrementado en gran medida en la presencia de ciertos iones de metal). Los promotores regulables incluyen elementos de respuesta (REs) que estimulan la transcripción cuando sus factores de inducción están enlazados. Por ejemplo, existen REs para factores de suero, hormonas esferoides, ácido retinoico, AMP cíclico y tetraciclina y doxiciclina. Los promotores que contienen un RE particular se pueden elegir con el objeto de obtener una respuesta regulable, y en algunos casos, el propio RE puede unirse a un diferente promotor, para conferir de esta forma capacidad de regulación a la secuencia de ácido nucleico codificada. Por lo tanto, mediante la selección del promotor adecuado (constitutivo versus regulable; fuerte versus débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de una secuencia de ácido nucleico en la célula genéticamente modificada. Si la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor regulable, el suministro del agente terapéutico in situ se activa mediante la exposición de la célula genéticamente modificada in situ a condiciones que permiten la transcripción de las secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de inductores específicos de los promotores regulables que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresión in situ de una secuencia de ácido nucleico bajo el control del promotor de metalotioneína en células genéticamente modificadas, se incrementa contactando las células genéticamente modificadas con una solución que contiene los iones de metal adecuados (por ejemplo inducción) in situ.
Por consiguiente, la cantidad de ARN generada in situ es regulada por el control de dichos factores como la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido (es decir, si el promotor es constitutivo o regulable, fuerte o débil) y el número de copias de la secuencia de ácido nucleico exógena que codifica el epítope o secuencia de compuesto conjugado que están en la célula.
Además de al menos una secuencia promotora y al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica el epítope o secuencia de compuesto conjugada, el vector de expresión puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de células que han sido transfectadas o transducidas con el vector de expresión.
Las células también pueden ser transfectadas con dos o más vectores de expresión, al menos un vector conteniendo la secuencia(s) de ácido nucleico que codifica el epítope o la secuencia de compuesto conjugada, el otro vector que contiene un gen de selección. La selección de un promotor, aumentador, gen de selección y/o secuencia de señal adecuada, se determinada para estar dentro del alcance de un experto en la técnica, sin experimentación indebida.
La descripción que se encuentra a continuación se dirige a diversas utilidades de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención tiene utilidad como un sistema de expresión adecuado para silenciar la expresión del gen(s) de interés.
La presente invención también proporciona métodos para modificar genéticamente células de un receptor mamífero in vivo. De acuerdo con una modalidad, el método comprende introducir un vector de expresión para expresar el epítope o secuencia de compuesto conjugada en células del receptor mamífero in situ, por ejemplo, inyectando el vector en el receptor.
Formulaciones y Métodos de Administración Las vacunas y composiciones de la presente invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano, en una variedad de formas adaptadas para la ruta de administración elegida, es decir, rutas orales, intranasales, intradérmicas o pa renterales, mediante rutas intravenosas, intramusculares, tópicas o subcutáneas.
Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma sistémica, por ejemplo, en forma oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un transportador comestible, asimilable. Pueden estar contenidos en cápsulas de gelatina de cubierta dura y blanda, o pueden comprimirse en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser combinado con uno o más excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, grajeas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0.1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, puede variar y puede ser convenientemente de entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente el 60% del peso de una forma de dosificación unitaria determinada. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles, es tal que se obtendrá un nivel de dosificación efectivo.
Las tabletas, grageas, pildoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: enlazadores tales como tragacanto de goma, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartame, o un agente de saborización tal como hierbabuena, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo antes descrito, un transportador líquido tal como un aceite vegetal o un polietilénglicol. Pueden estar presentes otros diversos materiales como recubrimientos, o para modificar de otra forma la forma física de la forma de dosificación unitaria, sólida. Por ejemplo, las tabletas, grageas o cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, laca o azúcar, y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa, como un agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservadores, una tinta y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar la forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable, y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida .
El compuesto activo también puede ser administrado en forma intravenosa o intraperitoneal mediante infusión o inyección. Las soluciones del compuesto activo o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezclada con un tensoactivo no tóxico. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas de dosificación farmacéutica adecuadas para inyección o infusión, pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles, o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que están adaptadas para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables o infusibles estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosificación final debe ser estéril, fluida y estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. El transportador o vehículo líquido, puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, o mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede proporcionar a través de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, amortiguadores o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse a través del uso en las composiciones, de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio, y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan utilizando un compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente adecuado, con varios de los otros ingredientes descritos anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización mediante filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas con secado con vacío y secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones filtradas estériles previamente.
Para administración tópica, los compuestos de la presente invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será conveniente administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un transportador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.
Los transportadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los transportadores líquidos útiles incluyen agua, alcoholes, o gliceroles o combinaciones de alcohol/glicerol agua, en donde los compuestos presentes pueden ser disueltos o dispersos en niveles efectivos, especialmente con la ayuda de tensoactivos no tóxicos. Los adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales pueden agregarse para optimizar las propiedades de un uso determinado. Las composiciones líquidas resultantes se pueden aplicar de almohadillas absorbentes, utilizarse para impregnar vendajes y otras preparaciones, o rociarse en el área afectada utilizando rociadores de aerosol o tipo bomba.
También se pueden emplear engrosadores tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales de ácido graso y ésteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con transportadores líquidos para formar pastas dispersables, geles, jabones o ungüentos y similares, para la aplicación directamente a la piel del usuario.
Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que se pueden utilizar para suministrar los compuestos de la presente invención a la piel, son conocidos en la técnica, por ejemplo, ver la Publicación de Jacquet et al. (Patente Norteamericana No. 4,608,392), Geria (Patente Norteamericana No.4, 992, 478), Smit et al. (Patente Norteamericana No. 4,559,157) y Wortzman (Patente Norteamericana No. 4,820,508).
Las dosificaciones útiles de los compuestos de la presente invención, se pueden determinar comparando su actividad in vitro, y su actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosificaciones efectivas en ratones y otros animales, a humanos son conocidos en la técnica; por ejemplo ver la Patente Norteamericana No. 4,938,949.
Generalmente, la concentración del compuesto(s) de la presente invención en una composición líquida, tal como una loción, estará en la forma de aproximadamente 0.1 a 25 % en peso, preferentemente de aproximadamente 0.5 a 10% en peso. La concentración en la composición semisólida o sólida, tal como un gel o polvo, será de aproximadamente 0.1 a 5 % en peso, preferentemente de aproximadamente 0.5 a 2.5% en peso.
La cantidad del compuesto, o una sal o derivado del mismo, requerida para utilizarse en el tratamiento variará no únicamente con la sal particular seleccionada si no también con la ruta de administración, la naturaleza de la condición que está siendo tratada y la edad y condición del paciente, y estará finalmente a la discreción del médico tratante.
Sin embargo, en general, una dosis adecuada está dentro del rango de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal al día, tal como de 3 hasta aproximadamente 50 mg por kilogramo del peso corporal del receptor al día, preferentemente dentro del rango de 6 a 90 mg/kg/día, más preferentemente dentro del rango de 15 a 60 mg/kg/día.
El compuesto se administra convencionalmente en una forma de dosificación; por ejemplo, conteniendo 5 a 1000 mg, convenientemente 10 a 750 mg, lo más conveniente, 50 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.
Idealmente, el ingrediente activo debe administrarse para lograr concentraciones en plasma pico del compuesto activo de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 75 µ?, preferentemente de aproximadamente 1 a 50 µ , más preferentemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 µ?. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa del 0.05 al 5% de la solución al ingrediente activo opcionalmente en solución salina, o administrarse oralmente como un bolo que contiene de aproximadamente 1 a 100 mg del ingrediente activo. Se pueden mantener los niveles en sangre deseables mediante infusión continua para proporcionar de aproximadamente 0.01 hasta 5.0 mg/kg/hr aproximadamente o mediante infusiones intermitentes que contienen de aproximadamente 0.4 a 15 mg/kg del ingrediente(s) activo.
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis simple o como dosis divididas administradas en intervalos adecuados, por ejemplo, en dos, tres o cuatro o más subdosis por día. La propia subdosis puede ser dividida en forma adicional, por ejemplo, en un número de administraciones separadas sueltas, independientes; tal como inhalaciones múltiples de in insuflador o mediante aplicación de una prioridad de gotas en los ojos.
Aunque la especificación y los ejemplos anteriores describen completamente, y habilitan la presente invención, no pretenden limitar el alcance de la misma, el cual está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente están incorporadas a la presente invención como referencia. Aunque la especificación anterior de la presente invención, ha sido descrita en relación con ciertas modalidades de la misma, y se han establecido muchos detalles con propósitos de ilustración, los expertos en la técnica podrán apreciar que la presente invención es susceptible a modalidades adicionales, y que ciertos de los detalles ahí descritos pueden variarse considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la presente invención.
El uso de los términos "uno", y "un, uno", y "el, la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la presente invención, estarán construidos para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera, o se contraindique claramente en el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" también serán construidos como términos de extremo abierto (es decir, significando "incluyendo pero sin limitarse a") a menos que se indique lo contrario. La mención de los rangos de valores aquí descritos, están proyectados meramente para servir como un método a la mano para referirse en forma individual a cada valor separado que esté dentro del rango, a menos que se indique de otra manera, y cada valor separado está incorporado en la especificación como si estuviera mencionado en forma individual en la presente invención. Los métodos aquí descritos se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique de otra manera en la presente descripción, o sea contraindicado claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje de ejemplo (por ejemplo "tal como") aquí proporcionado, pretende meramente iluminar de mejor manera a la presente invención, y no posee limitación en el alcance de la misma, a menos que se reivindique de otra manera. El lenguaje en la especificación no deberá construirse como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la presente invención .
Las modalidades de la presente invención se describen, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores para llevar a cabo la presente invención. Las variaciones de las modalidades pueden ser apreciadas por los expertos en la técnica al momento de leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la técnica empleen dichas variaciones, según sea adecuado, y los inventores pretenden que la presente invención sea practicada de una forma distinta a la descrita en forma específica en el presente documento. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del asunto o materia mencionado en las reivindicaciones adjuntas, tal como lo permite la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos en todas las posibles variaciones de los mismos, están comprendidos por la presente invención a menos que se indique de otra forma en el presente documento, o se contraindique claramente de otra forma en el contexto.

Claims (54)

REIVINDICACIONES
1. Un epítope de polio VP-1 de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud, que comprende IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1).
2. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el epítope tiene aproximadamente 18 a 28 aminoácidos de longitud y comprende IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1).
3. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el epítope consiste esencialmente en IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1).
4. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el epítope consiste en IPALTAVETGA (SEQ ID NO: 1).
5. El epítope de polio VP-1 de aproximadamente 11 a 28 aminoácidos de longitud que comprende ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3).
6. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope tiene aproximadamente 18 a 28 aminoácidos de longitud y comprende ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3).
7. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope consiste esencialmente en ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3).
8. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope consiste en ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3).
9. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope tiene 18 a 28 aminoácidos de longitud y comprende AHSKEIP ALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2).
10. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope consiste esencialmente en AHSKEIP ALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2).
11. El epítope VP-1 tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el epítope consiste en AHSKEIP ALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2).
12. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el ARE es un epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.
13. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el antígeno está enlazado a ARE por medio de un enlace alfa-Gal.
14. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque el antígeno se enlaza al ARE por medio de una molécula enlazadora.
15. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la molécula enlazadora es formaldehído, glutaraldehído, MBS (éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) y/o Sulfo-MBS.
16. El compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 15, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de agente infeccioso.
17. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque el agente infeccioso es un agente bacteriano, fúngico, parasítico, viral, o de prión.
18. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el agente infeccioso es un agente bacteriano.
19. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el agente infeccioso es un agente viral.
20. El compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 19, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de cáncer.
21. El compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 20, caracterizado porque el antígeno está enlazado en forma adicional a un anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo:antígeno.
22. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.
23. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
24. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo completamente humanizado.
25. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo es un Fv de cadena simple o un fragmento scFv.
26. El compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 25, caracterizado porque un . hapteno está enlazado en forma operable al antígeno para formar un antígeno haptenado.
27. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque el hapteno está enlazado en forma operable a un antígeno adicional.
28. Un complejo que comprende el compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 27, enlazado en forma operable a una molécula de conjugación.
29. El complejo tal como se describe en la reivindicación 28, caracterizado porque la molécula de conjugación es un péptido, un ácido nucleico, o un polisacárido que no es el antígeno o ARE.
30. Una composición que comprende el compuesto tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 27 o el complejo tal como se describe en la reivindicación 28 o 29 y un vehículo no tóxico, fisiológicamente aceptable.
31. La composición tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
32. Un método para generar una respuesta inmune en un animal inmunizado previamente, en donde el método comprende introducir en el animal la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
33. El método tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque la introducción de la composición ocurre al menos 15 días después de la pre-inmunización.
34. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 32 o 33, caracterizado porque comprende además introducir una segunda composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
35. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 34, caracterizado porque comprende además introducir una dosis de repetición de la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
36. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 35, caracterizado porque el animal es un humano.
37. Un método para generar anticuerpos específicos para un antígeno en un animal inmunizado previamente, en donde el método comprende introducir a un animal la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
38. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 37, caracterizado porque comprende además introducir una segunda dosis de la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31 en el animal.
39. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
40. Un método para prevenir o tratar una infección o enfermedad infecciosa, en donde el método comprende administrar a un paciente la composición tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 30 o 31.
41. Un compuesto que comprende al menos un antígeno purificado enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el ARE es el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, para utilizarse en el tratamiento profiláctico o terapéutico de un agente infeccioso o cáncer.
42. Un compuesto caracterizado porque comprende al menos un antígeno purificado enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el ARE es el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de un agente infeccioso o cáncer en un mamífero.
43. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el antígeno es una Proteína de Nucleocapside (NP) de Influenza A H5N1 (A/lndonesia/5/2005(H5N1 )) con número de acceso de proteína Genbank #ABI36003 y el ARE es el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, y en donde el ARE se enlaza en forma covalente, directamente a la NP.
44. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el antígeno es una Proteína de Nucleocapside (NP) de Influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8-V24/1934 (H1N1)) con número de acceso Genbank ADY00024.1 y el ARE es un epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, y en donde el ARE está enlazado covalentemente en forma directa a la NP.
45. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el antígeno es antígeno es Proteína de Hemaglutinina (HA) de Influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8-V24/1934(H1 N1 )) con número de acceso Genbank ADY00020.1 y el ARE es un epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 la 11, y en donde el ARE está enlazado covalentemente en forma directa a NP.
46. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), en donde el antígeno es un antígeno de la superficie de Hepatitis B (HBsAg) del virus de Hepatitis B, y el ARE es el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, y en donde el ARE está enlazado covalentemente en forma directa a NP.
47. Un compuesto que comprende al menos un antígeno enlazado en forma covalente a un epítope de reconocimiento de anticuerpo (ARE), caracterizado porque el antígeno es una Proteína de Nucleocapside (NP) de Influenza A H5N1 (A/lndonesia/5/2005(H5N 1 )) con número de acceso de proteína Genbank #ABI36003 y el ARE, es el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, y en donde el ARE está enlazado covalentemente en forma directa a la TNP.
48. Un ácido nucleico que codifica el epítope VP-1 tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, enlazado en forma operable a un ácido nucleico que codifica un antígeno.
49. Un cartucho de expresión que comprende un promotor enlazado en forma contigua al ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 48.
50. El cartucho de expresión tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el promotor es un promotor específico de tejido.
51. El cartucho de expresión tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible.
52. El cartucho de expresión tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el promotor es un promotor de CMV, RSV, EFa-1 , o 11.
53. Un vector que comprende el cartucho de expresión tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 48 a la 52.
54. El vector tal como se describe en la reivindicación 53, caracterizado porque el vector es un vector de virus adeno-asociado (AAV).
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