MX2013011246A

MX2013011246A - Formulaciones estables de anticuerpos para el receptor humano pd-1 de meurte programada y tratamientos relacionados.

Info

Publication number: MX2013011246A
Application number: MX2013011246A
Authority: MX
Inventors: Manoj K Sharma; Chakravarthy Nachu Narasimhan; Kevin James Gergich; Soonma Peter Kang
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-10-17
Also published as: EP2691112B1; EP2691112A4; CY1120359T1; KR20190116563A; RU2633509C2; TR201810298T4; LT2691112T; KR20210008149A; RU2563346C2; DK2691112T3; KR102031020B1; CA2830806C; EP3398612A1; KR102289394B1; CN103429264A; KR102614259B1; US9220776B2; US20140234296A1; RS57492B1; PL2691112T3

Abstract

La presente invención se relaciona a formulaciones estables de anticuerpos contra el receptor humano PD-1 de muerte programada, o el antígeno que se une a fragmentos del mismo; la presente invención proporciona además métodos para tratar varios cánceres e infecciones crónicas con formulaciones estables de anticuerpos contra el receptor de muerte programada PD-1, o el antígeno que se une a fragmentos del mismo.

Description

FORMULACIONES ESTABLES DE ANTICUERPOS PARA EL RECEPTOR HUMANO PD-1 DE MUERTE PROGRAMADA Y TRATAMIENTOS RELACIONADOS REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de patente provisional de EEUU No. 61/470,121 , presentada el 31 de Marzo de 201 1 , que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a formulaciones estables de anticuerpos contra el receptor humano PD-1 de muerte programada, o el antígeno que se une a fragmentos del mismo. La presente invención proporciona además los métodos para tratar varios cánceres e infecciones crónicas con formulaciones estables de anticuerpos contra PD-1 humano, o el antígeno que se une a fragmentos del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muerte programada 1 (PD-1 ), un miembro de la familia de genes CD28 coestimulantes, se expresa moderadamente en linfocitos T, B y NKT sin modificar y son sobre-regulados por la señalización del receptor de linfocito T/B en los linfocitos, monocitos y células mieloides (1). El PD-1 tiene dos ligandos conocidos con perfiles de expresión distintos, PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC). La expresión de PD-L2 está relativamente restringida y se encuentra en células dendríticas activadas, macrófagos y monocitos y en células endoteliales vasculares (1-3). En contraste, el PD-L1 se expresa más ampliamente incluyendo en linfocitos sin modificar, y su expresión se induce en linfocitos B y T activados, monocitos y células dendríticas. Además, mediante el ARNm, se expresa por los tejidos no linfoides incluyendo las células endoteliales vasculares, las células epiteliales y las células del músculo.

El PD-1 es reconocido como un jugador importante en la regulación inmune y el mantenimiento de la tolerancia periférica. En el ratón, esto demostró requerir la expresión de PD-L1 en tejidos periféricos y el enlace del PD-1 en linfocitos T potencialmente autoreactivos para modular negativamente la activación de los linfocitos T implicando una secuencia de ITIM en el dominio citoplásmico del PD-1 (1 , 4).

Dependiendo del antecedente genético específico, ratones pcfcoT desarrollaron espontáneamente un fenómeno del tipo lupus o cardiomiopatia dilatada (5, 6). Además, el bloqueo inducido por anticuerpos del PD-1 /trayectoria de PD-L1 demostró acelerar el comienzo de la insulitis autoinmune y diabetes en ratones NOD (7).

Se encontró que los cánceres humanos que surgen en varios tejidos sobre-expresan el PD-L1 o PD-L2. En grandes conjuntos de muestras de por ejemplo, cánceres de ovario, renal, colorectal, pancreático, de hígado y melanoma se demostró que la expresión del PD-L1 se correlaciona con un pronóstico deficiente y se reduce la supervivencia total independientemente del tratamiento subsiguiente (15-26). Asimismo, se encontró que la expresión de PD-1 en los linfocitos que se infiltran en el tumor marcan linfocitos T disfuncionales en el cáncer de mama y el melanoma (27-28) y que se correlacionan con un pronóstico deficiente en el cáncer renal (29). Utilizando muestras primarias de paciente, se mostró que el bloqueo de PD-1 o PD-L1 in vitro tiene como resultado una mejora en la activación del linfocito T específico de tumor humano y la producción de citocina (30). Por consiguiente, en muchos modelos de tumor sinérgico de murino, el bloqueo de cualquiera de PD-1 o PD-L1 inhibió significativamente el crecimiento del tumor o indujo el retroceso completo.

Se descubrió un mAb que bloquea el PD-1 (h409A1 1) y se desarrolló para el uso para tratar enfermos humanos de cáncer y a pacientes crónicos infectados con virus (descritos en la solicitud co-pendiente WO2008/156712).

La disfunción del linfocito T específico de antígeno o la tolerancia se ejemplifican por la pérdida acumulada del potencial para producir Interleucina 2 (IL-2), Factor de Necrosis de Tumor (TNF) a, perforina, interferón (IFN) ? (8) y la incapacidad de montar una respuesta proliferativa a la activación del receptor de linfocitos (1 ). La trayectoria del PD-1 controla la tolerancia del linfocito T específico de antígeno y se encontró siendo explotado en la infección viral y desarrollo del tumor para controlar y evadir la inmunidad efectiva del linfocito T.

En la infección crónica con LCMV (ratón), VIH, HBV o HCV (humano), se encontró que los linfocitos T específicos de antígeno expresan niveles aberrantemente altos de PD-1 que se correlacionan con su estado de anergia o disfunción (9). Al bloquear la interacción de PD-1 - PD-L1 in vivo (LCMV) o in vitro (VIH, HCV, HBV) se demostró revivir la actividad anti-vírica del linfocito T (10-12). El boqueo de PD-1 en macacos recientemente infectados con el virus de Inmunodeficiencia de simios tuvo como resultado una reducción fuerte de la carga vírica y aumento en la supervivencia (13). Asimismo, se confirmó la reducción en la carga viral en un segundo estudio usando macacos rhesus infectados con SIV por un tiempo largo (14).

En términos generales, la trayectoria de PD-1/PD-LI es una diana bien validada para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de cáncer. Los anticuerpos Anti-PD-1 son también útiles para tratar la infección vírica crónica. La memoria de las células CD8+T generada después de una infección viral aguda son altamente funcionales y constituyen un componente importante de la inmunidad protectora. En contraste, las infecciones crónicas se caracterizan con frecuencia por grados variables de deterioro (agotamiento) funcional de las respuestas de los linfocitos T específicos de virus, y este defecto es una razón principal de la incapacidad del hospedero para eliminar al patógeno persistente. Aunque células T efectoras funcionales se generan inicialmente durante las primeras etapas de la infección, gradualmente pierden su función debido al curso de una infección crónica. Barber et al. (Barber et al., Nature 439: 682-687 (2006)) mostró que ratones infectados con una cepa de laboratorio de LCMV desarrollaron infección crónica teniendo como resultado niveles altos de virus en la sangre y en otros tejidos. Estos ratones desarrollaron inicialmente una respuesta vigorosa de linfocitos T, pero finalmente sucumbieron a la infección tras el agotamiento de los linfocitos T. Los autores encontraron que el descenso en el número y la función de los linfocitos T efectores en ratones crónicamente infectados podría ser invertido inyectando un anticuerpo que bloquee la interacción entre PD-1 y PD-LI.

El PD-1 también ha demostrado ser sumamente expresado en linfocitos T de individuos infectados con VIH y que la expresión del receptor se correlaciona con la función dañada del linfocito T y la progresión de enfermedad (Day et al., Nature 443:350-4 (2006); Trautmann L. et al,. Nat. Med. 12: 1 198-202 (2006)). En ambos estudios, el bloqueo de la trayectoria de PD-1 utilizando anticuerpos contra el ligando PD-LI aumentó apreciablemente la expansión de las células que producen IFN-gama, específicas de VIH, in vitro.

Otros estudios implican también la importancia de la vía de PD-1 en el control de la infección viral. Los ratones knockout PD-1 exhiben mejor control de la infección de adenovirus que los ratones de tipo silvestre (Iwai et al., Exp. Med. 198:39-50 (2003)). También, la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de HBV en animales transgénicos HBV iniciaron hepatitis (Isogawa M. et al., Immunity 23:53-63 (2005)). El estado de enfermedad de estos animales oscila como una consecuencia del reconocimiento del antígeno en el hígado y la sobrerregulación de PD-1 por células del hígado.

Los anticuerpos terapéuticos pueden ser utilizados para bloquear la actividad de la citocina. Una limitación significativa en el uso de anticuerpos como un agente terapéutico in vivo es la inmunogenicidad de los anticuerpos. Ya que la mayoría de los anticuerpos monoclonales se derivan de especies no humanas, el uso repetido en humanos tiene como resultado la generación de una respuesta inmunológica contra el anticuerpo terapéutico. Tal respuesta inmunológica tiene como resultado una pérdida de eficacia terapéutica a un mínimo, y potencialmente una respuesta anafiláctica fatal. Por consiguiente, los anticuerpos de inmunogenicidad reducida en humanos, tales como anticuerpos humanizados o completamente humanos, se prefieren para el tratamiento de sujetos humanos. Anticuerpos terapéuticos ejemplares para PD-1 humano se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de EEUU cedida en común No. US2010/0266617, y la Publicación de patente internacional No. WO2008/156712, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades.

Los anticuerpos para el uso en sujetos humanos deben ser almacenados antes del uso y transportados al punto de administración. Lograr de manera reproducible un nivel deseado de fármaco de anticuerpo en un sujeto requiere que el fármaco sea almacenado en una formulación que mantenga la bioactividad del fármaco. Existe necesidad para formulaciones estables de anticuerpos anti PD-1 humano para el uso farmacéutico, por ejemplo,, para tratar varios cánceres y enfermedades contagiosas. Preferiblemente, tales formulaciones exhibirán una larga vida de anaquel, serán estables cuando se almacenen y transporten, y serán capaces de administrarse a concentraciones altas, por ejemplo, para el uso en la administración subcutánea, así como a concentraciones bajas, por ejemplo. para la administración intravenosa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a formulaciones estables de anticuerpos contra el receptor humano PD-1 de muerte programada, o el antígeno que se une a fragmentos del mismo. La presente invención proporciona además métodos para tratar varios cánceres e infecciones crónicas con formulaciones estables de anticuerpos contra el receptor de muerte programada PD-1 , o el antígeno que se une a fragmentos del mismo.

En ciertas modalidades, la invención se relaciona a una formulación liofilizada de un anticuerpo anti PD-1 humano, o antígeno que se une a un fragmento del mismo, que comprende: a) dicho anticuerpo anti PD-1 humano, o el antígeno que se une a un fragmento del mismo; b) amortiguador de histidina; c) polisorbato 80; y d) sacarosa.

En ciertas modalidades, la formulación tiene un pH entre 5.0 y 6.0 cuando se reconstituye.

En ciertas modalidades, la formulación liofilizada permite la reconstitución del anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, a una concentración de entre aproximadamente 25 mg/mL y 100 mg/mL.

En ciertas modalidades, el polisorbato 80 está presente en una proporción en peso de aproximadamente 0.02% (p/v) En ciertas modalidades, la sacarosa está presente en una proporción de peso de aproximadamente 7% (p/v) En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a una formulación farmacéutica liofilizada de un anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, hecho por liofilización de una solución acuosa que comprende: a) 25-100 mg/mL de anti anticuerpo, o el fragmento de unión a antigeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a pH 5.0-6.0.

En ciertas modalidades, el anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está presente a aproximadamente 25 mg/mL en la solución acuosa. En ciertas modalidades, la solución acuosa tiene un pH de aproximadamente 5.5.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a una formulación farmacéutica liofilizada de un anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que cuando se reconstituye comprende: a) 25-100 mg/mL de anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a aproximadamente pH 5.0- pH 6.0.

En ciertas modalidades, el anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está presente a aproximadamente 25 mg/mL en la solución reconstituida. En ciertas modalidades, la solución reconstituida tiene un pH de aproximadamente 5.5.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a una formulación farmacéutica líquida de un anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) 25-100 mg/mL de anti anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa ; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a pH 5.0-6.0.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a una formulación farmacéutica de un anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) dicho anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo; b) amortiguador de histidina; c) polisorbato 80; y d) sacarosa. En ciertas modalidades, la formulación tiene un pH entre 5.0 y 6.0 cuando se reconstituye. En ciertas modalidades, el polisorbato 80 está presente en una proporción en peso de aproximadamente 0.02% (p/v) En ciertas modalidades, la sacarosa está presente en una proporción en peso de aproximadamente 7% (p/v) En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 9, 10, 1 1 , 15, 16, y 17.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 18, 19, y 20.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; y ii) una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 8, 19, y 20.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende residuos de aminoácido 20 a 130 de SEQ ID NO: 32.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 31.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende residuos de aminoácido 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y ii) una cadena pesada que comprende residuos de aminoácido 20 a 466 de SEQ ID NO: 31.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a cualquiera de las formulaciones descritas en la presente, en donde el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste en h409A1 1 , h409A16, y h409A17.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a un método de tratamiento de infección crónica en un sujeto mamífero necesitado del mismo que comprende: administrar una cantidad efectiva de cualquiera de las formulaciones descritas en la presente.

En incluso modalidades adicionales, la invención se relaciona a un método de tratamiento de cáncer en un sujeto mamífero necesitado del mismo, el método comprende administrar una cantidad efectiva de cualquiera de las formulaciones descritas en la presente. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva comprende una dosis de anticuerpo anti PD-1 humano seleccionado del grupo que consiste en 1.0, 3.0, y 10 mg/kg.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona formulaciones de anticuerpos anti-PD-1 y usos de las mismas para tratar varios cánceres y enfermedades contagiosas.

El anticuerpo anti-PD-1 h409A11 es un anticuerpo ejemplar en las formulaciones estables descritas en la presente. Tres anticuerpos monoclonales humanizados anti-PD-1 (es decir, h409A1 1 , h409A16, y h509A17) adecuados para las formulaciones presentes se describen en la publicación de la patente co-pendiente WO2008/156712. Adicionalmente, las formulaciones descritas en la presente son útiles para tratar ciertos cánceres así como infecciones crónicas. El Cuadro 2 proporciona una lista de las correspondientes secuencias de CDR para h409A1 1. El Cuadro 6 proporciona una lista de secuencias de anticuerpos anti-PD-1 ejemplares.

De acuerdo con la presente invención es posible que se empleen técnicas de la biología molecular convencional, microbiología, expresión y purificación de proteínas, anticuerpos, y ADN recombinante dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Vea, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacíno et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; and Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.; Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins eds. (1985); Transcription And Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); y Harlow and Lañe. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988).

L Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que exhibe la actividad biológica deseada. Así, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, etc. siempre que ellos exhiban la actividad biológica deseada.

Adyuvante Como se utiliza en la presente, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que aumenta la respuesta inmunológica a un antígeno. Un adyuvante puede servir como un depósito de tejido que libera lentamente el antigeno y también como un activador del sistema linfoide que mejora no específicamente la respuesta inmunológica (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: enlo Park, California, p. 384). A menudo, un desafío primario con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, fallará en producir una respuesta inmunológica celular o humoral. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, hemocianinas de lapa californiana, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina, BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

Citocina El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, quimiocinas, y hormonas de polipéptido tradicionales. Las citocinas de ejemplo incluyen: IL-2, IFN-?, IL-6, TNFa, IL-17, y IL-5, humanos.

Agente citotóxico El término "agente citotóxico" como es utilizado en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.

Usos y Métodos terapéuticos Los agentes de bloqueo de PD-1 incluyen ésos que se unen específicamente al PD-1 humano, pueden utilizarse para aumentar, mejorar, estimular o sobre-regular una respuesta inmunológica. Los sujetos deseables incluyen a pacientes humanos necesitados de mejora de una respuesta inmunológica incluyendo pacientes con cáncer y/o una infección vírica crónica.

Cáncer Los términos "cáncer", "canceroso", o "maligno" se refieren a, o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma, y sarcoma. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen carcinoma de células escamosas, mieloma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, linfoma de hodgkin, linfoma no de hodgkin, cáncer (tracto) gastrointestinal, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer de hígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, cáncer colorectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, melanoma, condrosarcoma, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon, y cáncer de cabeza y cuello.

Los agentes de bloqueo de PD-1 incluyen ésos usados para tratar cáncer (es decir, para inhibir el crecimiento o la supervivencia de las células de tumor). Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando anticuerpos anti-PD-1 tales como el anticuerpo anti-PD-1 h409A1 1 humanizado e incluyen cánceres típicamente sensibles a la inmunoterapia, pero también cánceres que no han sido asociados hasta ahora con inmunoterapia. Ejemplos no limitativos de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), adenocarcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer esofágico, carcinoma de células escamosas de la cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma, y otras malignidades neoplásicas. Las malignidades que demuestran una supervivencia mejorada libre de enfermedad y general en relación a la presencia de linfocitos que se infiltran al tumor en material de biopsia o quirúrgico, por ejemplo, melanoma, cáncer colorectal, de hígado, de riñon, de estómago/esofágico, de mama, de páncreas, y de ovario están comprendidos en los métodos de tratamiento descritos en la presente. Se sabe que tales subtipos de cáncer son susceptibles al control inmune por los linfocitos T. Adicionalmente, se incluyen las malignidades refractarias o recurrentes cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando los anticuerpos descritos en la presente. Los cánceres especialmente preferidos incluyen esos caracterizado por una expresión elevada de PD-1 y/o sus ligandos PD-L1 y/o PD-L2 en muestras de tejido probadas, incluyendo: cáncer ovárico, renal, colorectal, pancreático, de mama, de hígado, gástrico, esofágico y melanoma. Cánceres adicionales que pueden beneficiarse del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 tales como el anticuerpo anti-PD-1 h409A1 1 humanizado incluyen esos asociados con la infección persistente con virus tales como el virus de inmunodeficiencia humana, virus de hepatitis clase A, B y C, virus de Epstein Barr, virus del papiloma humano que se conocen por estar relacionados causalmente, por ejemplo sarcoma de Kaposi, cáncer de hígado, cáncer nasofaríngeo, linfoma, cánceres cervicales, vulvares, anales, del pene y orales.

Agente quimioterapéutico Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los anticuerpos anti-PD-1 pueden ser utilizados con cualquiera uno o más agentes quimioterapéuticos más adecuados. Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tal como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análosogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2 89 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; spongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato del óxido de mecloretamina, melphalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina intervalol l y calicheamicina phil 1 , vea, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos de antibiótico de enediina de cromoproteína relacionada con cromómoforos), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrin, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, cytarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tal como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilico; 2-etilhidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, veracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel y doxetaxel; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tal como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-11 ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinóico; capecitabina; y sales, ácidos, derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en los tumores tal como anti-estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifen, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY1 17018, onapristona, y toremifeno (Fareston); inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las gándulas adrenales, tal como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestano, fadrozol, vorozol, letrozol, y anastrozol; y anti-andrógenos tal como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Agente Inhibidor de crecimiento Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente célula de cáncer que se sobre-expresa en cualquiera de los genes identificados en la presente, ya sea in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor de crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobre-expresan tales genes en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto a la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Bloqueadores clásicos de la fase M incluyen los taxanos vincas (vincristina y vinblastina), y los inhibidores topo II tal como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, y etoposido. Esos agentes que detienen a G1 también se derraman a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes de alquilación de ADN tal como dacarbazina, mecloretamina, y cisplatina. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1 , titulado "Regulación del ciclo celular, oncogenes, y fármacos antineoplásicos" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995).

Anticuerpo o fragmentos de anticuerpo en combinación con agentes adicionales El anticuerpo anti-PD-1 o fragmentos de anticuerpo pueden usarse solos o en combinación con: otros agentes antineoplásicos o agentes inmunogénicos (por ejemplo, células cancerosas atenuadas, antigenos de tumor (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos, y moléculas de carbohidrato), células que presentan antígenos tales como células dendríticas pulsadas con antígeno o ácidos nucleicos derivados de tumor, citocinas inmuno estimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF), y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmuno estimulantes tales como, pero no limtadas a, GM-CSF); tratamientos estándar de cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia o cirugía); u otros anticuerpos (incluyendo pero no limitado a anticuerpos para VEGF, EGFR, Her2/neu, receptores de VEGF, otros receptores del factor de crecimiento, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1 BB, y ICOS).

Enfermedades infecciosas Los anticuerpos anti-PD-1 antagonistas o fragmentos de anticuerpo también pueden utilizarse para prevenir o tratar infecciones y enfermedades contagiosas. Estos agentes pueden ser utilizados solos, o en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunológica a patógenos, a las toxinas, y a los auto-antígenos. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden utilizarse para estimular la respuesta inmunológica a virus contagiosos a humanos, incluyendo pero no limitado a: virus de la inmunodeficiencia humana, virus de hepatitis clase A, B y C, virus de Epstein Barr, citomegalovirus humano, virus del papiloma humanos, y virus del herpes. Los anticuerpos del anti-PD-1 antagonista o fragmentos de anticuerpo pueden utilizarse para estimular la respuesta inmunológica a la infección con parásitos bacterianos o micóticos, y otros patógenos. Las infecciones víricas con hepatitis B y C y VIH están entre ésas consideradas como infecciones víricas crónicas.

Como se usa en la presente, los términos "fragmento de unión a PD- ", "fragmento de unión a antígeno del mismo", "fragmento de unión del mismo" o "fragmento del mismo" abarca un fragmento o un derivado de un anticuerpo que aún retiene sustancialmente su actividad biológica de unión a antígeno (PD-1 humano) e inhibe su actividad (por ejemplo, bloqueando la unión de PD-1 a PDL1 y PDL2). Por lo tanto, el término "fragmento de anticuerpo" o fragmento de unión de PD-1 se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el antígeno de unión o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple, por ejemplo sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. Típicamente, un fragmento de unión o derivado retiene por lo menos 10% de su actividad inhibidora de PD-1. Preferiblemente, un fragmento de unión o derivado retiene por lo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (o más) de su actividad inhibidora de PD-1 , aunque será útil cualquier fragmento de unión con suficiente afinidad para ejercer el efecto biológico deseado. También se piensa que un fragmento de unión a PD-1 puede incluir variantes que tienen sustituciones conservadoras de aminoácido que no alteran substancialmente su actividad biológica.

Un "dominio de anticuerpo" es un fragmento inmunológicamente funcional de inmunoglobulina que contiene sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH están covalentemente unidas con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden apuntar a los mismos o diferentes antígenos.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades del antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo bispecífico" se refiere a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para por lo menos dos diferentes epítopes antigénicos. En una modalidad, los epítopes son del mismo antígeno. En otra modalidad, los epítopes son de dos antígenos diferentes. Los métodos para formar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuepos biespecíficos pueden producirse de manera recombinante utilizando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Vea, por ejemplo Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando el enlace químico. Vea, por ejemplo Brennan et al. (1985) Science 229:81. Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespecífico. Vea, por ejemplo Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368.

Como se usa en la presente, el término anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde esos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH y VL que permiten al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión del sFv, vea Pluckthun (1994) THE PHAR ACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

Los anticuerpos monoclonales en la presente también incluyen anticuerpos de dominio simple camelizados. Vea, por ejemplo Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231 :25; WO 94/04678; WO 94/25591 ; U.S. Pat. No. 6,005,079). Los anticuerpos de dominio simple que comprenden dos dominios de VH con modificaciones de manera que se forman anticuerpos de dominio simple, también se incluyen.

Como se usa en la presente, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL o VL-VH). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir un apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/1 1 161 ; y Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revisión de variantes de anticuerpos diseñados en general vea Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1 126-1136.

Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente esa de una inmunoglobulina humana. Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor comprenderán generalmente las mismas secuencias de CDR de los anticuerpos progenitores de roedor, aunque pueden incluirse ciertas sustituciones de aminoácido para aumentar la afinidad, aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado, o por otras razones.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con regiones Fe modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véase por ejemplo la patente de EEUU No. 5,624,821 ; WO2003/086310; WO2005/120571 ; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tal modificación puede ser utilizada para aumentar o suprimir varias reacciones del sistema inmunológico, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región FC inlcuyen cambios de aminoácidos (sustituiciones, deleciones e inserciones) glucosilación o desglucosilación y agregar múltiples Fe, Los cambios al Fe también pueden alterar la vida media de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos, y una media vida más larga tendría como resultado una dosificación menos frecuente, con el aumento de conveniencia concomitante y disminución del uso de material. See Presta (2005) J. AHergy Clin. Immunol.116:731 at 734-35.

El término "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que comprende sólo secuencias de proteína inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de carbohidrato de murino si se produce en un ratón, en una célula de ratón, o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. Asimismo, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo que comprende sólo secuencias de inmunoglobulina de ratón. Un anticuerpo completamente humano puede ser generado en un ser de humano, en un animal transgénico que tiene secuencias de línea germinal de inmunoglobulina humana, por presentación de fago u otros métodos biológicos moleculares.

Como se utiliza en la presente, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" {por ejemplo, los residuos 24-34 (CDRL1 ), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena ligera y los residuos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada (Kabat et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) y/o esos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (L1 ), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Como se utiliza en la presente, el término "marco" o los residuos "FR" se refieren a esos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable definidos en la presente como residuos de CDR. La anterior numeración de los residuos se refiere al sistema de numeración de Kabat y no necesariamente corresponde en detalle a la numeración de la secuencia en el Listado de Secuencia adjunto.

"Variantes conservadormente modificadas" o "sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos, son conocidas por los expertos en la técnica y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante, aún en las regiones esenciales del polipéptido. Tales sustituciones ejemplares se realizan preferiblemente de acuerdo con esas establecidas en el Cuadro 1 como sigue: CUADRO 1 Ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos Además, los expertos en esta técnica reconocerán que, en general, las sustituciones únicas de aminoácido en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran substancialmente la actividad biológica. Vea, por ejemplo Watson et al. (1987) Molecular Blology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition).

La frase "consiste esencialmente de", o variaciones tales como "consiste esencialmente en" o "que consiste esencialmente en," como se usa a través de la especificación y cláusulas, indica la inclusión de cualquier elemento o grupo de elementos recitado, y la inclusión opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente que los elementos recitados, que no cambian materialmente las propiedades básicas o novedosas del régimen de dosificación, método o composición especificado. Como un ejemplo no limitante, un compuesto de unión que consiste en esencia de una secuencia de aminoácido recitada también puede incluir uno o más aminoácidos, incluyendo sustituciones de uno o más residuos de aminoácido, que no afectan sustancialmente las propiedades del compuesto de unión.

La "condición inmune" o el "trastorno inmune" abarca, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio, y un trastorno o enfermedad autoinmune. La "condición inmune" también se refiere a infecciones, infecciones persistentes, y condiciones proliferativas, tal como cáncer, tumores, y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores, y cánceres que resisten la erradicación por el sistema inmunológico. "Condición cancerosa" incluye, por ejemplo cáncer, células de cáncer, tumores, angiogénesis, y condiciones precancerosas tal como displasia.

El anticuerpo, o composición de unión derivada del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, de la formulación o el método contemplados se unen a su antígeno con una afinidad que es por lo menos dos veces más grande, preferiblemente por lo menos diez veces más grande, más preferiblemente por lo menos 20 veces más grande, y más preferiblemente por lo menos 100 veces más grande que la afinidad con antigenos no relacionados. En una modalidad preferida el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor que aproximadamente 109 litros/mol, según se determinada, por ejemplo, por el análisis de Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

Definiciones de Composición Farmacéutica El término " agentes de espesamiento" comprende a agentes que proporcionan la estructura del producto liofilizado. Ejemplos comunes utilizados para agentes de espesamiento incluyen manitol, glicina, lactosa y sacarosa. Además de proporcionar una torta farmacéuticamente elegante, los agentes de espesamiento también pueden impartir calidades útiles con respecto a modificar la temperatura de desplome, proporcionando protección en la congelación-descongelación, y aumentando la estabilidad de la proteína con el almacenamiento a largo plazo. Estos agentes también pueden servir como modificantes de tonicidad.

El término "amortiguador" abarca a esos agentes que mantienen el pH de la solución en un intervalo aceptable antes de la liofilización y pueden incluir succinato (de sodio o de potasio), histidina, fosfato (de sodio o de potasio), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietanolamina, citrato (de sodio) y similares. El amortiguador de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0; y tiene preferiblemente un pH de aproximadamente 5.5. Ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH en este intervalo incluyen succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros amortiguadores de ácidos orgánicos. Para llegar a la formulación ejemplar, se exploraron histidina, amortiguadores de acetato y citrato en el intervalo de pH de 5.0-6.0 para conveniencia. Los sistemas de histina y amortiguador de acetato de desempeñaron mejor que el sistema de citrato. El amortiguador de histidina es un sistema de amortiguador preferido, porque los sistemas de amortiguador de acetato no son compatibles con el procedimiento de liofilización.

El término "crioprotectores" incluye generalmente a agentes que proporcionan estabilidad a la proteína contra el estrés inducido por la congelación, presumiblemente al ser excluidos de manera preferencial de la superficie de la proteína. Estos también pueden ofrecer protección durante el secado primario y secundario, y almacenamiento del producto de largo plazo. Ejemplos son polímeros tales como dextrano y polietileglicol; azúcares tales como sacarosa, glucosa, trehalosa, y lactosa; surfactantes tales como polisorbatos; y aminoácidos tales como glicina, arginina, y serina.

Los términos "liofilización", "liofilizado", y "secado por congelación" se refieren a un procedimiento por el cual el material a ser secado es congelado primero y entonces el hielo o solvente congelado son removidos por sublimación en un ambiente de vacío. Un excipiente puede ser incluido en formulaciones de pre-liofilizado para aumentar la estabilidad del producto liofilizado con el almacenamiento.

El término "Noprotector" incluye a agentes que proporcionan estabilidad a la proteína durante el procedimiento de secado o 'deshidratacíón' (ciclos de secado primario y secundario), proporcionando presumiblemente una matriz vitrea amorfa y por unión con la proteína a través de enlace de hidrógeno, reemplazando las moléculas de agua que son removidas durante el procedimiento de secado. Esto ayuda a mantener la conformación de la proteína, minimiza la degradación de la proteína durante el ciclo de liofilización y mejora la estabilidad del producto a largo plazo. Ejemplos incluyen polioles o azúcares tales como sacarosa y trehalosa.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que están en tal forma como para permitir que los ingredientes activos sean efectivos, y que no contiene componentes adicionales que son tóxicos a los sujetos a los que la formulación sería administrada.

Los excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son los que se pueden administrar razonablemente a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis eficaz del principio activo usado.

"Tiempo de reconstitución" es el tiempo que se requiere para rehidratar la formulación liofilizada con una solución hasta una solución clarificada libre de partículas.

Una formulación "estable" es una en la que la proteina en la misma retiene en esencia su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica con el almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteína están disponibles en la técnica y son revisadas en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991 ) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada para un periodo de tiempo seleccionado.

Una formulación de anticuerpo liofilizado "estable" es una formulación de anticuerpo liofilizado sin ningún cambio significativo observado a una temperatura de refrigeración (2-8° C) por lo menos por 12 meses, preferiblemente 2 años, y más preferiblemente 3 años; o a temperatura ambiente (23-27° C) por lo menos por 3 meses, preferiblemente 6 meses, y más preferiblemente 1 año. Los criterios aceptables típicos para la estabilidad son como siguen. No más de 10%, preferiblemente 5%, de monómero de anticuerpo es degradado según se mide por SEC-HPLC. La solución rehidratada es típicamente incolora, o de transparente a ligeramente opalescente por análisis visual. La concentración, el pH y la osmolalidad de la formulación no tienen más de +/ 10% de cambio. La potencia está típicamente dentro de un intervalo de 50-150% de la referencia. No se observa más de 10%, preferiblemente 5% de rebaje. No se forma más de 10%, preferiblemente 5% de agregación.

Una formulación farmacéutica de anticuerpo "estable" (incluyendo una formulación liofilizada, un líquido reconstituido, así como una formulación líquida que es una formulación "final" (es decir, no ha sido anteriormente liofilizada)) es una formulación farmacéutica de anticuerpo sin cambios significativos observados a una temperatura de refrigeración (2-8° C) por lo menos por 3 meses, preferiblemente 6 meses, y más preferiblemente 1 año, y aún más preferiblemente por más de 2 años. Adicionalmente, una formulación líquida "estable" incluye una que exhibe características deseadas a temperaturas incluyendo a 25°C y 40°C por períodos que incluyen 1 mes, 3 meses, 6 meses, 12 meses, y/o 24 meses. Los criterios aceptables típicos para la estabilidad de la estabilidad son como siguen. Típicamente, no más que aproximadamente 10%, preferiblemente aproximadamente 5%, de monómero de anticuerpo se degrada según se mide por SEC-HPLC. La formulación farmacéutica de anticuerpo es incolora, o de transparente a ligeramente opalescente por análisis visual. La concentración, el pH y la osmolalidad de la formulación no tienen más de +/'10% de cambio. La potencia está típicamente dentro de 50-150 de la referencia. Típicamente, no se observa más que aproximadamente 10%, preferiblemente aproximadamente 5% de rebaje. Típicamente, no se forma más que aproximadamente 10%, preferiblemente aproximadamente 5% de agregación.

Un anticuerpo " retiene su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra aumento significativo de agregación, precipitación y/o desnaturalización con el examen visual de color y/o transparencia, o como se mide por difracción de luz UV, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y difracción de luz dinámica. Los cambios de conformación de la proteína pueden evaluarse por espectroscopia de fluorescencia, que determina la estructura terciaria de la proteína, y por espectroscopia de FTIR, que determina la estructura secundaria de la proteína.

Un anticuerpo " retiene su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si no muestra modificación química significativa. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas de la proteína químicamente alteradas. Los procedimientos de degradación que a menudo alteran la estructura química de la proteína incluyen hidrólisis o rebaje (evaluado por métodos tal como la cromatografía de exclusión de tamaño y SDS-PAGE) oxidación (evaluado por métodos tal como mapeo de péptido en conjunción con espectroscopia de masa o MALDI TOF/MS), desamidación (evaluado por métodos tales como cromatografía de intercambio iónico, enfoque capilar isoeléctrico, mapeo de péptido, medición de ácido isoaspártico), e isomerización (evaluado midiendo el contenido de ácido isoaspártico, mapeo de péptido, etc.).

Un anticuerpo " retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un tiempo dado está dentro de un intervalo predeterminado de la actividad biológica exhibida en el momento de preparar la formulación farmacéutica. La actividad biológica de un anticuerpo puede ser determinada, por ejemplo, por un ensayo de unión de antígeno.

El término "isotónico" significa que la formulación de interés tiene en esencia la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de aproximadamente 270-328 mOsm. La presión ligeramente hipotónica es 250-269 y la presión ligeramente hipertónica es 328-350 mOsm. La presión osmótica puede ser medida, por ejemplo, utilizando una presión de vapor u osmómetro del tipo hielo-congelación.

Modificadores de tonicidad: Las sales (NaCI, KCI, MgCI2, CaCI2, etc.) se usan como modificadores de tonicidad para controlar la presión osmótica. Además, los agentes crioportectores/lioprotectores y/o agentes espesantes tales como sacarosa, manitol, glicina, etc., puede servir como modificadores de tonicidad.

Métodos analíticos Los métodos analíticos adecuados para evaluar la estabilidad del producto incluyen cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), prueba de difracción de luz dinámica (DLS), calorimetría de exploración diferencial (DSC), cuantificación iso-asp, potencia, UV a 340 nm, espectroscopia de UV, y FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83: 1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11 :485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14: 1 133-1 40 (1986)) mide el porcentaje de monómero en el producto y da información de la cantidad de agregados solubles. DSC (Pharm. Res., 15:200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982)) gives information of protein denaturation temperature and glass transition temperature. DLS (American Lab., November (1991)) mide el coeficiente de difusión media, y da información de la cantidad de agregados solubles e insolubles. El UV a 340 nm mide la intensidad de la luz difractada a 340 nm y da información de las cantidades de agregados solubles e insolubles. La espectroscopia UV mide la absorbancia a 278 nm y da información de la concentración de las proteínas. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45:231 (1998); Pharm. Res., 12:1250 (1995); J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996); J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998)) mide el espectro de IR en la región uno de amida, y da información de la estructura secundaria de la proteína.

El contenido de iso-asp en las muestras se mide usando el Isoquant Isoaspartate Detection System (Promega). El kit usa la enzima Proteína Isoaspartil Metiltransferasa (PIMT) para detectar específicamente la presencia de residuos de ácido isoaspártico en una proteína diana. El PIMT cataliza la transferencia de un grupo metilo de S-adenosil-L-metionina a ácido isoaspártico en la posición .alfa.-carboxilo, generando S-adenosil-L-homocisteína (SAH) en el procedimiento. Esta es una molécula relativamente pequeña, y puede ser aislado y cuantificada generalmente por HPLC de fase inversa utilizando los estándares de SAH HPLC proporcionados en el kit.

La potencia o bioidentidad de un anticuerpo pueden medirse por su capacidad de unirse a su antígeno. La unión específica de un anticuerpo a su antígeno puede cuantificarse por cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, un inmunoensayo, tal como ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima).

Una formulación "reconstituida" es una que ha sido preparada disolviéndo una formulación de proteína liofilizada en un diluyente de manera que la proteína sea dispersada en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para la administración, por ejemplo, administración parenteral), y puede ser opcionalmente adecuada para la administración subcutánea.

Anticuerpos Anti-PD-1 humanizados Los constructos de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos humanizados h409A11 , h409A16 y h409A17 se describen en WO2008/156712.

Se considera que la especificación escrita anterior es suficiente para permitir que el experto en la técnica ponga en práctica la presente invención. La presente invención no será limitada en alcance por el cultivo depositado, puesto que se pretende que la modalidad depositada sea una ilustración individual de un aspecto de la invención, y cualquier cultivo que sea funcionalmente equivalente, esté dentro del alcance de esta invención. El depósito de material no constituye en la presente una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente es adecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se considerará que limita el alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que representa. Por supuesto, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, llegarán a ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior, y están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Las secuencias se proporcionan para anticuerpos anti-PD-1 humanos; un cuadro de resumen de las secuencias se proporciona en el Cuadro 6. Los CDR se proporcionan bajo identificadores de secuencia separados, tal como se indica en el Cuadro 2 para h409A1 1.

Comúnmente, las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo anti-PD-1 humanizado tendrán una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia de aminoácido con las secuencias de aminoácido de anticuerpo humanizado original de cualquiera de la cadena pesada o la ligera preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, y más preferiblemente por lo menos 95, 98, o 99%. La identidad o la homología con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos anti-PD-1 humanizados, después de alinear las secuencias e introducir vacíos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Ninguno del N-terminal, C-terminal, o extensiones internas, deleciones, o inserciones dentro de la secuencia del anticuerpo deberán considerarse como afectando la identidad o la homología de la secuencia.

El anticuerpo humanizado puede ser seleccionado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA, y IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Cualquier isotipo de IgG puede ser utilizado, incluyendo IgGi, lgG2, lgG3, y lgG4. Diferentes dominios constantes pueden ser unidos a las regiones VL y VH humanizadas proporcionadas en la presente. Por ejemplo, si un uso pretendido particular de un anticuerpo (o fragmento) de la presente invención se escogieran para funciones de efector alteradas, podría usarse un dominio constante de cadena pesada diferente a lgG1. Aunque los anticuerpos lgG1 proporcionen una larga vida media y funciones de efector, tal como la activación de complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, tales actividades pueden no ser deseables para todos los usos del anticuerpo. En tales casos un dominio constante de lgG4, por ejemplo, puede utilizarse.

Igualmente, cualquier clase de cadena ligera puede utilizarse en las composiciones y métodos en la presente. Específicamente, la kapa, lambda, o variantes del mismo son útiles en las composiciones y métodos presentes.

Los residuos de CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición de la secuencia estándar de Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md.

Las secuencias de señal, o secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de señal, pueden ser unidas al N-terminal de las respectivas cadenas de anticuerpo para crear una proteína precursora para la secreción desde una célula hospedera. También pueden usarse secuencias de señal alternativas, y muchas pueden encontrarse en "SPdb: a Signal Peptide Datábase." Choo et al. (2005) BMC Bioinformatics 6:249.

CUADRO 2 Secuencias de H409A11 CDR Actividad biológica de anti -PD-1 humanizado Las formulaciones de la presente invención incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos que son biológicamente activos cuando se reconstituyen o en la forma líquida. Como se utiliza en la presente, el término "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento del anticuerpo que es capaz de unirse al epitope antigénico deseado y que ejerce indirectamente o directamente un efecto biológico. Típicamente, estos efectos resultan de la falla del PD-1 de unirse a sus ligandos. Como se utiliza en la presente, el término "específico" se refiere a la unión selectiva del anticuerpo al epitope del antígeno diana. Los anticuerpos pueden ser probados para la especificidad de unión comparando la unión a PD-1 con la unión a un antígeno o mezcla de antígeno no relevante bajo un conjunto dado de condiciones.

Composiciones Farmacéuticas Liofilizadas Las formulaciones liofilizadas de proteínas terapéuticas proporcionan varias ventajas. Las formulaciones liofilizadas en general ofrecen mejor estabilidad química que las formulaciones en solución, y así aumentan la vida media. Una formulación liofilizada también puede ser reconstituida a concentraciones diferentes que dependen de factores clínicos, tales como la ruta de administración o la dosificación. Por ejemplo, una formulación liofilizada puede ser reconstituida a una alta concentración (es decir en un pequeño volumen) si es necesario para la administración subcutánea, o a una concentración más baja si se administra intravenosamente. Las concentraciones altas también pueden ser necesarias si se requiere una alta dosificación para un sujeto particular, especialmente si se administra subcutáneamente donde un volumen de inyección debe ser minimizado. Una de tales formulaciones de anticuerpo liofilizado se revela en la Pat. de EEUU No. 6,267,958, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las formulaciones liofilizadas de otra proteína terapéutica se revelan en la Pat. de EEUU No. 7,247,707, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Típicamente, la formulación liofilizada se prepara en anticipación de la reconstitución a una alta concentración del producto de fármaco (DP, en una modalidad de ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 humanizado h409A11 , o fragmento del mismo que se une a antígeno), es decir en anticipación de la reconstitución en un bajo volumen de agua. La dilución subsiguiente con agua o amortiguador isotónico entonces puede utilizarse fácilmente para diluir el DP a una concentración más baja. Típicamente, se incluyen excipientes en una formulación liofilizada de la presente invención a niveles que tendrán como resultado una formulación aproximadamente isotónica cuando se reconstituya a una alta concentración de DP, por ejemplo para administración subcutánea. La reconstitución con un volumen de agua mayor para dar una menor concentración de DP necesariamente reducirá la tonicidad de la solución reconstituida, pero tal reducción puede tener poca significancia en una administración no subcutánea, por ejemplo, administración intravenosa. Si se desea la isotonía a una concentración más baja de DP, el polvo liofilizado puede ser reconstituido en el volumen bajo estándar de agua y entonces además diluido con diluyente isotónico, tal como 0.9% de cloruro de sodio.

En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado (o el fragmento de unión a antígeno del mismo) se formula como un polvo liofilizado para reconstitución y se utiliza para administración intravenosa. Las formulaciones ejemplares se describen en los Cuadros 3-4, y en los cuadros A-R. En ciertas modalidades, el anticuerpo (o el fragmento de unión a antígeno del mismo) se proporciona en aproximadamente 50 mg/frasco, y se reconstituye con agua estéril para la inyección antes del uso. Si se deseado, el anticuerpo reconstituido puede ser diluido ascépticamente con Inyección de Cloruro de Sodio USP al 0.9% en un contenedor estéril de IV. El pH objetivo de la formulación reconstituida es 5.5±0.5. En varias modalidades, la formulación liofilizada de la presente invención permite la reconstitución del anticuerpo anti-PD-1 a concentraciones altas, tales como aproximadamente 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100 o más mg/mL.

La presente invención proporciona en ciertas modalidades, una formulación liofilizada que comprende el anticuerpo anti-PD-1 humanizado, un amortiguador de histidina a aproximadamente pH 5.5, o a aproximadamente pH 5.0, por ejemplo a aproximadamente 5.1 , 5.2, 5.3, 5.4, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, o 6.0.

Cuando se recita un intervalo de valores de pH, tal como "un pH entre pH 5.5 y 6.0," el intervalo pretende incluir los valores recitados. A menos que se indique de otro modo, el pH se refiere al pH después de la reconstitución de las formulaciones liofilizadas de la presente invención. El pH se mide típicamente a 25°C usando un medidor de pH estándar de bulbo de vidrio. Como se utiliza en la presente, una solución que comprende "amortiguador de histidina a pH X" se refiere a una solución a pH X y comprende el amortiguador de histidina, es decir, el pH pretende referirse al pH de la solución.

La formulación en el Cuadro 3 refleja el peso de los componentes en una formulación por lotes, como liofilizada en frascos, y como reconstituida. Las formulaciones liofilizadas son por definición esencialmente secas, y así el concepto de concentración no es útil para describirlas. Describir una formulación liofilizada en términos del peso de los componentes en un frasco de dosis unitaria es más útil, pero es problemático porque varía para tamaños diferentes de dosis o de frasco. A describir las formulaciones liofilizadas de la presente invención, es útil expresar la cantidad de un componente como la proporción del peso del componente comparada al peso de la sustancia de fármaco (D) en la misma muestra (por ejemplo un frasco). Esta proporción puede ser expresada como un porcentaje. Tales proporciones reflejan una propiedad intrínseca de las formulaciones liofilizadas de la presente invención, independientemente del tamaño del frasco, de la dosificación, y del protocolo de reconstitución.

En otras modalidades, la formulación liofilizada del anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno, se define en términos de la solución de pre-liofilización utilizada para hacer la formulación liofilizada, tal como la solución de pre-liofilización. En una modalidad la solución de pre- liofilización comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, a una concentración de aproximadamente 25mg/ml_. Tales soluciones de pre-liofilización pueden estar a pH 4.4 - 5.2 (incluyendo aproximadamente 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1. y 5.2), por ejemplo preferiblemente aproximadamente pH 4.8, o aproximadamente pH 5.5.

En incluso otras modalidades, la formulación de liofilizado de anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno, se define en términos de la solución reconstituida generada de la formulación liofilizada, tal como la solución reconstituida descrita en el Cuadro 4.

Las soluciones reconstituidas pueden comprender el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo a concentraciones de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 o 100 mg/mL o concentraciones mayores tales como 150mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, o hasta aproximadamente 300 mg/mL. Tales soluciones reconstituidas pueden estar a aproximadamente pH 5.5, o variar de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente 6.0 Las formulaciones liofilizadas de la presente invención se forman por liofilización (secado por congelación) de una solución pre-liofilización. El secado por congelación se lograda congelando la formulación y sublimando subsiguientemente el agua a una temperatura adecuada para el secado primario. Bajo esta condición, la temperatura del producto está debajo del punto eutéctico o la temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura de anaquel para el secado primario variará de aproximadamente -30 a 25°C (con la condición de que el producto permanezca congelado durante el secado primario) a una presión adecuada, variando típicamente de aproximadamente 50 a 250 mTorr. La formulación, el tamaño y el tipo del contenedor que contiene la muestra (por ejemplo, frasco de vidrio) y el volumen de líquido dictarán el tiempo necesario para el secado, que puede variar de unas horas a varios días (por ejemplo 40-60 hrs). Una etapa de secado secundario puede ser llevada a cabo a aproximadamente 0-40° C, dependiendo principalmente en el tipo y tamaño de contenedor y el tipo de proteína empleado. El tiempo de secado secundario es dictado por el nivel residual deseado de humedad en el producto y toma típicamente por lo menos aproximadamente 5 horas. Típicamente, el contenido de humedad de una formulación liofilizada es menor que aproximadamente 5%, y preferiblemente menor que aproximadamente 3%. La presión puede ser igual que esa empleada durante el paso de secado primario. Las condiciones del secado por congelación pueden variar dependiendo del tamaño de la formulación y del frasco.

En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteína en el contenedor en el que la reconstitución de la proteína será llevada a cabo para evitar un paso de transferencia. El contenedor en este caso puede, por ejemplo, ser un frasco de 3, 5, 10, 20, 50 o 100 ce.

Las formulaciones liofilizadas de la presente invención son reconstituidas antes de la administración. La proteína puede ser reconstituida a una concentración de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 o 100 mg/mL o concentraciones más altas tales como 150mg/ml_, 200 mg/mL, 250 mg/mL, o 300 mg/mL hasta aproximadamente 500 mg/mL. Las concentraciones altas de proteína son especialmente útiles donde se pretende el suministro subcutáneo de la formulación reconstituida. Sin embargo, para las otras rutas de administración, tales como la administración intravenosa, pueden desearse concentraciones más bajas de la proteína {por ejemplo de aproximadamente 5-50 mg/mL) La reconstitución sucede generalmente a una temperatura de aproximadamente 25°C para asegurar la hidratación completa, aunque puede emplearse otras temperaturas según se desee. El tiempo necesario para la reconstitución dependerá, por ejemplo,, en el tipo de diluyente, la cantidad de excipiente(s) y de la proteína. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada de pH (por ejemplo salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Se espera que las formulaciones liofilizadas de la presente invención sean estables por lo menos por aproximadamente 36 meses (con base en los datos de estabilidad de los cuadros A-R). Además, se espera que la formulación líquida exhiba estabilidad por lo menos por 24 meses, con base en 24 meses de datos de estabilidad de formulación reconstituida de h409A1 1 en tubos de polipropileno a 2-8° C.

De acuerdo con los resultados mostrados en los cuadros A-R se ha observado estabilidad por 2 años para una formulación reconstituida refrigerada de h409A11. Muestras de 2 mL en tubos de polipropileno fueron almacenadas a 5° C, y a condiciones de 25H y RH4 se probaron en periodos iniciales, 1 , 3, 6, 9, 12, 18, y 24 meses. Esta formulación de h409A11 reconstituida tiene los mismos sustituyentes a la misma concentración que una formulación líquida de h409A1 1 (es decir, una formulación que no fue liofilizada) y se espera que la estabilidad sea la misma.

Composiciones Farmacéuticas líquidas Se puede formar una formulación líquida de anticuerpo tomando la sustancia de fármaco (por ejemplo, anti-PD-1 humanizado) que está en forma líquida (por ejemplo, h409A11 en una.formulación farmacéutica acuosa) e intercambiando el amortiguador en el amortiguador deseado como el último paso del procedimiento de purificación. No hay paso de liofilización en esta modalidad. Se concentra la sustancia de fármaco en el amortiguador final a una concentración deseada. Se agregan excipientes tales como sacarosa y polisorbato 80 a la sustancia de fármaco y se diluyen utilizando el amortiguador apropiado a la concentración final de la proteína. La sustancia de fármaco formulada final se filtra usando filtros de 0.22pm y se vacía en un contenedor final (por ejemplo, frascos de vidrio). Tal formulación líquida se ejemplifica por una formulación líquida final que comprende histidina 10 mM pH 5.5, sacarosa al 7%, polisorbato 80 al 0.02%, y 25 mg/mL de h409A11.

Varias referencias de la literatura están disponibles para facilitar la selección de portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Vea, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984); Hardman et al. (2001 ) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

La toxicidad es una consideración para seleccionar la dosificación apropiada de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo anti-PD-1 humanizado (o el fragmento de unión a antígeno del mismo). La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpo pueden ser determinados por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis mortal a 50% de la población) y el ED5o (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la proporción de LD50 a ED50. Se prefieren los anticuerpos que exhiben índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de los cultivos celulares y estudios en animales pueden utilizarse paraa formular un intervalo de dosis para el uso en humanos. La dosis de tales compuestos cae preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada.

Las rutas convenientes de administración pueden, por ejemplo, incluir suministro parenteral, incluyendo intramuscular, intradermal, subcutáneo, inyecciones intramedulares, así como intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal. Los fármacos pueden ser administrados en una variedad de maneras convencionales, tal como inyección intraperitoneal, parenteral, intraarterial o intravenosa. Los modos de administración en los que el volumen de la solución debe ser limitado {por ejemplo, administración subcutánea) requiere una formulación liofilizada para permitir la reconstitución a concentración alta.

Alternativamente, uno puede administrar el anticuerpo en una manera local más que sistémica, por ejemplo, a través de inyección del anticuerpo directamente en una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatologia, a menudo en un depósito o formulación de liberación sostenida. Además, uno puede administrar el anticuerpo en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma revestido con un anticuerpo específico de tejido, dirigido a, por ejemplo, lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatologia. Los liposomas serán apuntados y tomados selectivamente por el tejido afligido.

Seleccionar un régimen de administración para un agente terapéutico depende de varios factores, incluyendo el índice de cambio del suero o de tejido de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferiblemente, un régimen de administración lleva al máximo la cantidad de sgente terapéutico entregado al paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de biológico suministrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la condición a ser tratada. Están disponibles guías para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citocinas, y pequeñas moléculas. Vea, por ejemplo Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601 -608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341 :1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343.1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 563634457; 57th edition (November 2002).

La determinación de la dosis apropiada se realiza por el médico, por ejemplo,, utilizando parámetros o factores conocidos o sospechados en la técnica que afectan el tratamiento o predichos que afectan el tratamiento. La dosis apropiada ("cantidad terapéuticamente efectiva") de la proteína dependerá, por ejemplo, en la condición a ser tratada, la gravedad y el curso de la condición, si la proteína es administrada para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta a la proteína, el tipo de proteína utilizada, y de la discreción del médico al cargo. Generalmente, la dosis empieza con una cantidad algo menos que la dosis óptima y aumenta por pequeños incrementos después hasta que el efecto deseado u óptimo sea logrado con respecto a algún efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen ésas de los síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. El anticuerpo es administrado convenientemente al paciente en una vez o repetidas veces. El anticuerpo puede ser administrado solo o en conjunción con otros fármacos o terapias.

Una formulación farmacéutica del anticuerpo puede ser administrada por infusión continua, o por dosis en intervalos de, por ejemplo,. un día, 1-7 veces a la semana, una semana, dos semanas, tres semanas, mensual, bimestral, etc. Un protocolo preferido de la dosis es uno que implica la dosis máxima o la frecuencia de la dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis total semanal es generalmente por lo menos 0.05 pg/kg, 0.2 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corporal o más. Vea, por ejemplo Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al. (20003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:133-144. La dosis deseada de una pequeña molécula terapéutica, por ejemplo,, un péptido mimético, producto natural, o sustancia química orgánica, es aproximadamente igual como para un anticuerpo o polipéptido, en una base de moles/kg.

En ciertas modalidades, la dosificación comprenderá administrar a un sujeto dosis escaladas de 1.0, 3.0, y 10 mg/kg de la formulación farmacéutica, es decir, una formulación que comprende h409A1 1 , con el curso del tratamiento. La formulación que comprende h409A1 1 puede ser una formulación líquida reconstituida, o puede ser una formulación líquida anteriormente no liofilizada. Los cursos del tiempo pueden variar, y pueden continuar siempre que se obtengan los efectos deseados. En ciertas modalidades, la escalación de la dosis continuará a una dosis de aproximadamente 10mg/kg. En ciertas modalidades, el sujeto tendrá un diagnóstico histológico o citológico de melanoma, o de otra forma de tumor sólido, y en ciertos casos, un sujeto puede tener una enfermedad no medible. En ciertas modalidades, el sujeto habrá sido tratado con otros quimioterapéuticos, mientras en otras modalidades, el sujeto no tendrá tratamiento.

En incluso modalidades adicionales, el régimen de dosificación comprenderá administrar una dosis de 1 , 3, o 10 mg/kg de cualquiera de las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente (es decir, una formulación que comprende h409A1 1), a través del curso de tratamiento. Para tal régimen de dosificación constante, el intervalo entre las dosis será aproximadamente 14 días (± 2 días). En ciertas modalidades, el intervalo entre dosis será aproximadamente 21 días (± 2 días).

En ciertas modalidades, el régimen de dosificación comprenderá administrar una dosis de aproximadamente 0.005mg/kg a aproximadamente 10mg/kg, con escalación de dosis entre pacientes. En ciertas modalidades, una dosis de 5 mg/kg o 10 mg/kg será administrada en intervalos de cada 3 semanas, o cada 2 semanas. En incluso otras modalidades, una dosis de 3mg/kg será administrada en intervalos de tres semanas para pacientes con melanoma o pacientes con otros tumores sólidos. En estas modalidades, los pacientes deben tener una enfermedad no reseccionable; sin embargo, los pacientes pueden haber tenido cirugía anterior.

En ciertas modalidades, un sujeto será administrado con una infusión IV de 30 minutos de cualquiera de las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertas modalidades para la dosis escalada, el intervalo de dosificación será aproximadamente 28 días ((± 1 día) entre la primera y la segunda dosis. En ciertas modalidades, el intervalo entre la segunda y la tercera dosis será aproximadamente 14 días (± 2 días). En ciertas modalidades, el intervalo de dosificación será aproximadamente 14 días (± 2 días), para dosis posteriores a la segunda dosis.

En ciertas modalidades, el uso de marcadores de superficie celular y/o marcadores de citocina, como se describe en las publicaciones de patente cc-pendientes WO2012/018538 o WO2008/156712 serán utilizada en bioensayos para la vigilancia, diagnóstico, selección pacientes, y/o regímenes de tratamiento que implican el bloqueo de la trayectoria de PD-1.

La administración subcutánea puede realizarse inyectando usando una jeringa, o suando dispositivos de inyección (por ejemplo, el dispositivo Inject-ease® device); plumas inyectoras; o dispositivos sin agujas (por ejemplo MediJector y BioJector®).

El alcance amplio de esta invención se comprende mejor con referencia a los ejemplos siguientes, que no pretenden limitar las invenciones a las modalidades específicas. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a manera de ejemplo únicamente, y la invención será limitada por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tales reivindicaciones están remitidas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Producción de anticuerpo El h409A1 1 es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al PD-1 humano y bloquea la interacción entre el PD-1 y sus ligandos PDL1 y PDL2. El anticuerpo es un isotipo lgG4/kappa con una alteración estabilizadora en la secuencia S228P en la región Fe. El Cuadro 2 proporciona una lista de las secuencias de CDR. Los pesos moleculares teóricos de las cadenas pesadas y ligeras derivadas de las secuencias de aminoácido, excluyendo la glucosilación, son 49.3kDa y 23.7 kDa, respectivamente. El anticuerpo progenitor (hPD-1.09A) se produjo inmunizando ratones con hPD-1 ADN. El anticuerpo h409A1 1 se generó por humanización del anticuerpo progenitor anti-PD-1 humano de murino por el Medical Research Council (Cambridge, UK) usando tencologia de injerto de CDR, (por ejemplo la patente de EEUU No. 5,225,539), como se describe en la co-pendiente WO2008/156712.

Se construyó un plásmido de expresión para la expresión de cadenas pesadas y ligeras de h409A11. Las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras, junto con sus respectivos promotores y la secuencia de se{al de poli A, se confirmaron por análisis de secuencia de ADN. El vector de expresión fue utilizado subsiguientemente para transfectar una línea celular de CHO. Se seleccionó un clon que expresa anticuerpos para la generación de un Banco de Semilla Maestra (MSB, por sus siglas en inglés), basado en el crecimiento, en la productividad, y en la estabilidad de la producción. Este MSB entonces fue utilizado para preparar el anticuerpo y para generar el Banco de Célula Maestra (MCB, por sus siglas en inglés).

Las células del MCB fueron expandidas en frascos de agitados, bolsas de cultivo, y un bioreactor de semilla para generar el inoculado para un bioreactor de producción para producir el producto de anticuerpo. El procesamiento adicional incluyó tres pasos de cromatografía (afinidad de proteína A, cromatografía de intercambio de catión y de intercambio de anión), dos pasos de eliminación víricos ortogonales (inactivación vírica a pH bajo y filtración de reducción vírica), ultrafiltración/diafiltración, y un paso de filtración final de 0.2pm.

Estructura y características de h409A 1 El h409A1 1 es un anticuerpo monoclonal humanizado altamente selectivo que bloquea la interacción entre el PD-1 humano y sus ligandos PD-L1 y PD-L2. El h409A1 1 está heterogéneamente glucisolado en la asparagina 297 dentro del dominio Fe de cada cadena pesada, produciendo pesos moleculares que varían típicamente entre 148.9 y 149.5 kDa, dependiendo de las cadenas de glucano unidas. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de h409A1 1 se encuentran en SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:36. La cadena ligera sin las secuencias de líder comprende residuos de aminoácido 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y la cadena pesada sin las secuencias de líder comprenden residuos de aminoácido 20 a 466 de SEQ ID NO: 31.

Formulaciones estables de PD-1 humanizado En ciertas modalidades, el PD-1 estable humanizado, por ejemplo h409A1 1 , es una solución acuosa almacenada bajo condiciones refrigeradas (intervalo de temperatura: típicamente aproximadamente 2-8°C, pero bajo ciertas circunstancias, la formulación acuosa puede exhibir estabilidad a otras temperaturas incluyendo aproximadamente 25°C y aproximadamente 40°C por periodos de hasta aproximadamente 12 meses) a una concentración de > 25mg/mL en amortiguador de histidina 10 mM, pH 5.0-6.0. En ciertas modalidades, el PD-1 humanizado estable por ejemplo h409A1 1 , es una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 25 mg/mL en amortiguador de Histidina 10 mM, pH 5.0-6.0. La formulación estable (es decir, la sustancia de fármaco) es típicamente una solución de transparente a opalescente y puede contener partículas.

En ciertas modalidades, un líquido o solución congelada de h409A11 se formula en amortiguador de histidina (pH 5.5) que contiene sacarosa y polisorbato 80.

Una formulación ejemplar adicional incluye: h409A11 formulado en amortiguador de histidina (pH 5.5) que contiene sacarosa y polisorbato 80 en una forma liofilizada.

En ciertas modalidades, la formulación estable de PD-1 humanizado se proporciona como polvo liofilizado en frascos pretendidos para un solo uso.

En ciertas modalidades, la formulación estable de PD-1 humanizado se reconstituye con agua para inyección (WFI) y se diluye ascépticamente con volúmenes adecuados de cloruro de sodio al 0.9% para inyección en un contenedor de IV estéril para formar una solución mezclada.

Actividad biológica La actividad biológica del anticuerpo anti-PD-1 humanizado se mide por su capacidad de competir con PD-L1 (ligando natural de PD-1 ) en la unión al PD-1 humano, cuantificado en ELISA competitivo con respecto a un material de referencia. Las formulaciones estables descritas en la presente exhiben actividad biológica por periodos de tiempo largos, incluyendo arriba de por lo menos aproximadamente dieciocho meses. La estabilidad de varios lotes de h409A1 1 , bajo varias condiciones de almacenamiento se ilustra en los cuadros A-R.

Formulaciones estables de Anticuerpos anti-PD-1 Humanizados Las formulaciones liofilizadas de anticuerpo anti-PD-1 se preparan como sigue. Una fórmula de lote ejemplar para el anticuerpo h409A11 se proporciona en el Cuadro 3. La concentración final de anticuerpo es 25 mg/mL. Esta formulación de lote puede ser utilizada para preparar las unidades de 50 mg/frasco liofilizadas, como se discutió con referencia al Cuadro 4, infra. Se usa polisorbato 80 de una fuente vegetal. Puede agregarse ácido clorhhídrico o hidróxido de sodio adicional para ajustar el pH al valor deseado de aproximadamente 5.5 (±0.2). Los componentes son llevados a un volumen final de 14 L con agua estéril para inyección (WFI). Lotes correspondientemente más pequeños puede prepararse por la reducción proporcional de las cantidades listadas en el Cuadro 3.

Una formulación líquida ejemplar del anticuerpo se prepara tomando la sustancia de fármaco (por ejemplo, anti-PD-1 humanizado de una fórmula de lote descrita en la presente) que está en la forma líquida (por ejemplo,. h409A11 en una formulación acuosa) e intercambiando el amortiguador por el amortiguador deseado como el último paso del procedimiento de purificación. En este caso, no hay paso anterior de liofilización. La sustancia de el fármaco en el amortiguador final de histidine se concentra a una concentración deseada. Se agregan excipientes tales como sacarosa y polisorbato 80 a la sustancia de fármaco y se diluyen utilizando el amortiguador apropiado a la concentración final de la proteína. La sustancia de fármaco formulada final se filtra usando filtros de 0.22pm y se vacía en un contenedor final (por ejemplo, frascos de vidrio). Tal formulación líquida incluye la formulación del líquido final que comprende histidina 10 mM pH 5.5, sacarosa al 7%, polisorbato 80 al 0.02%, y 25 mg/mL de h409A1 1.

CUADRO 3 Fórmula de lote de 14.0 L de solución representativa de pre-liofilización para polvo de h409A11 para inyección, 50 mg/frasco Acido clorhídrico e hidróxido de sodio agregados si fue necesario para ajusfar el pH a 5.5 El agua se removió por sublimación y desorción durante la liofilización La composición unitaria de una formulación liofilizada final ejemplar de anti-PD-1 humanizado se proporciona en el Cuadro 4.

CUADRO 4 Composición unitaria de la formulación liofilizada en polvo para invección, 50 mg/frasco * Un llenada en exceso de 0.4 mL se proporciona para asegurar la recuperación de 50 mg h409A11 por frasco. Reconstitución siguiente con 2.3 mL de agua estéril para inyección. c Acido clorhídrico e hidróxido de sodio agregados si fue necesario para ajusfar el pH a 5.5 "Agua removida por sublimación y desorción durante la liofilización La formulación unitaria del Cuadro 4 comprende 1/20,000° de la formulación del lote del Cuadro 3 después de la liofilización para remover el agua. Los 50 mg de DS se agregan como 2.0 mL de los 25 mg/mL de la formulación de lote del Cuadro 3. Cada frasco se llena con 2.4 mL y se reconstituye con 2.3 mL sWFI, resultando en aproximadamente 2.4 mL de solución reconstituida debido al volumen de expansión de la torta liofilizada.

El fármaco se empaca en frascos de tubo de vidrio Tipo 1 6R DIN, de 20 mm de cuello, estériles, cerrados con tapones de caucho de butilo gris de 20 mm y sellados con sellos ondulados de aluminio. Los frascos se almacenan a 2 - 8°C, y se refrigeran cuando se embarcan.

La composición implica los pasos siguientes. Cargar la cantidad necesaria de agua para inyección (WFI) en un recipiente alquitranado de formación de composición. Cargar y disolver con mezclado sacarosa, histidina, y polisorbato 80 de una fuente vegetal. Medir el pH y ajusfarlo si es necesario para llevar el pH a aproximadamente 5.4 -5.6. Usar ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio para ajusfar el pH. Equilibrar la sustancia de fármaco a la temperatura ambiente y cargar la sustancia de fármaco lentamente en el recipiente de formación de compuesto. Continar el mezclado suavemente para evitar la formación de espuma. Medir el pH de nuevo y ajusfarlo si es necesario para llevar el pH a aproximadamente 5.5. Cargar WFI al peso final de la solución en volumen con mezclado suave continuo.

La filtración implica los pasos siguientes. Conectar el filtro de clarificación (0.22 pm) y el filtro de esterilización (0.22 pm) al recipiente de formación de compuesto. Recolectar una alícuota de la solución en volumen para probar la biocarga después del paso de filtración para clarificación. Realizar la filtración ascéptica usando un filtro de 0.22 pm en un recipiente estéril. Remover la alícuota de la muestra después de la filtración ascéptica para la prueba de esterilidad del volumen. Realizar la prueba de integridad del filtro después de la filtración del producto.

El llenado implica los pasos siguientes. Utilizar equipo de llenado conveniente, llenar ascépticamente la solución de producto en frascos de tubo de vidrio Tipo 1 esterilizados para lograr un volumen de llenado objetivo de 2.4 ml_. Realizar revisiones de peso de llenado durante el llenado. Parcialmente asentar los tapones de lio-forma esterilizados en los frascos llenos. Cargar los frascos llenos en un congelador-secador adecuado.

La liofilización, taponado y cubierta implican los pasos siguientes. Liofilizar los frascos llenos utilizando un ciclo apropiado de liofilización. Después de que se termine la liofilización, rellenar los frascos con nitrógeno filtrado por 0.22 pm y tapar completamente. Descargar los frascos taponados del liofilizador y sellarlos.

Los frascos resultantes son inspeccionados para defectos visuales y se almacenan a 2-8 °C. Los frascos de unidad de dosis terminados se embarcan bajo condiciones de refrigeración.

EJEMPLO 2 Prueba de estabilidad de las formulaciones liofilizadas de anticuerpos anti-PD-1 humanizados Los cuadros A-R proporcionan datos de pruebas de estabilidad de formulaciones liofilizadas de un anticuerpo anti PD-1 humano humanizado bajo varias condiciones de almacenamiento. Los frascos fueron almacenados en configuraciones verticales. Como se discute en más detalle abajo, las formulaciones de la presente invención muestran estabilidad por lo menos por 24 meses para los anticuerpos liofilizados a pH 5.5 (amortiguador de histidina), así como formulaciones liquidas similares.

La estabilidad fue evaluada como sigue. Las muestras se liofilizaron en frascos de vidrio de Tipo 1 6R DIN, y se sellaron con lio tapones de bromobutilo de 20 mm (Helvoet Rubber & Plástic Technologies BV, Hellevoetsluis, The Netherlands) y sellos de aluminio removibles. Los frascos se colocaron en estaciones de estabilidad bajo las condiciones siguientes de almacenamiento: 5°C (5±3°C), 25H (25, 60% de humedad relativa), o RH4 (40°C, 70% de humedad relativa). Las muestras fueron obtenidas en un punto inicial de tiempo, y para ciertas muestras a una variedad de puntos de tiempo incluyendo 1 , 2, 3, 6, 9, 12, 18, y 24 meses.

La estabilidad de las muestras se ilustra por las varias características presentadas en los cuadros A-R. Las muestras liofilizadas fueron inspeccionadas visualmente, reconstituidas, y la formulación reconstituida fue inspeccionada visualmente. Se midió el pH de las muestras después de la reconstitución, y se determinó la concentración de la proteína determinado por absorbancia de U.V. Se analizaron las muestras por ña técnica de CE-SDS en la que la proteína fue desnaturalizada con dodecil sulfato de sodio (SDS) bajo condiciones reductoras y no reducotras y separadas utilizando electroforesis capilar (CE). Las proteínas se separan con base en su peso molecular aparente. Bajo condiciones no reductoras, todas las especies diferentes del pico principal de IgG se clasifican como impurezas. Bajo condiciones reducotras, el IgG se resuelve en las cadenas pesadas y ligeras. Todas las otras especies se clasifican como impurezas.

La pureza de la muestra fue evaluada después por cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) en la que se determinó el porcentaje de monómero, así como los porcentajes de las especies de alto peso molecular (posiblemente agregados) y picos de elución tardía (posiblemente productos de degradación).

Datos adicionales de caracterización de la muestra se proporcionan en los cuadros A-R. Se utilizó la cromatografía de intercambio iónico de alto rendimiento (HP-IEX) para evaluar la pureza revelando la presencia de variantes acidas o básicas. Los resultados se presentan como un porcentaje del material total observado. Las muestras se caracterizaron además para su función biológica utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para la unión a PD-1 humano. La concentración del anticuerpo necesaria para lograr la unión máxima media se llama EC50. Se evaluó la potencia de la muestra de prueba comparando las curvas de unión de las muestras de prueba a un material de referencia (o control) por la ración de los EC50's. La potencia fue expresada como el por ciento de potencia relativa del material de referencia (o control). El contenido de humedad del polvo liofilizado también se determinó por titulación columétrica. Las mediciones de conteo de la materia particulada se realizaron para contar partículas > 10 pm y > 25 pm. El método utilizado para estas mediciones se basó en USP<788>.

Estos resultados demuestran formulaciones de estabilidad alta de la presente invención por lo menos por 24 meses a aproximadamente pH 5.5. Los datos no revelan la tendencia con el tiempo que pueda reflejar inestabilidad de las muestras a las condiciones de almacenamiento probadas.

EJEMPLO 3 Resultados clínicos iniciales Estudio Fase 1 de h409A1 1 (Anticuerpo monoclonal anti-PD-1 ) en pacientes con tumores sólidos avanzados Un ensayo de fase 1 examinó la seguridad, PK, PD, y actividad antitumor del h409A11. Se realizó un estudio de escalación de dosis, de etiqueta abierta, en pacientes con malignidad avanzada recurrente a la quimioterapia estándar. En el conjunto inicial de pacientes, los pacientes con tumores sólidos avanzados se trataron con una formulación estable de h409A1 1 como se describe en la presente. No hubo limitación/restricción con respecto a cirugías; sin embargo, los pacientes no fueron en ese momento candidatos quirúrgicos. Cohortes de 3-6 se enlistaron (diseño de 3+3) a dosis IV de 1 , 3, o 10 mg/kg. Siguiendo una dosis inicial y el Ciclo 1 de 28 días, se permitió que los pacientes recibieran subsiguientemente múltiples dosis dadas cada 2 semanas. Para la fase 1 parte A, tres pacientes fueron tratados a 1 mg/kg, tres pacientes fueron tratados a 3mg/kg, y nueve pacientes fueron tratados a 10 mg/kg y todos fueron dosificados cada 2 semanas. No hubo escalación de dosis entre pacientes. Se realizó evaluación radiográfica cada 8 semanas utilizando las pautas RECIST 1 ,1.

Nueve pacientes, 3 en cada nivel de dosis, completaron el periodo de toxicidad limitante de dosis (DLT) (28 d). Los pacientes tuvieron cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, n=3), cáncer rectal (n=2), melanoma (MEL, n=2), sarcoma (n=1), o carcinoide (n=1). A la fecha, se administró un total de 63 dosis (mediana 7/pacientes; Max 12) sin DLT. Los eventos adversos relacionados al fármaco (AEs) a través de todas las dosis incluyeron fatiga Grado 1 (n=3), náusea (n=2), diarrea (n=1 ), disguesia (n=1), dolor de mama (n=1 ), y prurito (N=1). Se reportó un prurito Grado 2 AE relacionado con el fármaco. No se observaron AEs > grado 3 relacionados con el fármaco. Los datos de PK se muestran en el Cuadro 5. Con base en RECIST, 1 paciente con MEL en terapia >6 meses tuvo una respuesta parcial, y se observó evidencia preliminar de reducción en el tamaño del tumor (enfermedad estable) en 3 pacientes más con cáncer avanzado. Estos resultados muestran que el h409A11 fue bien tolerado sin DLT a través de 3 niveles de dosis probadas, (es decir, 1 , 3, y 5 mg/kg). Se observó evidencia de actividad antitumor.

CUADRO 5 Valores medios (CV%) del parámetro PK de MK-3475 después de una única dosis IV de 1 , 3, o 10 mq/kq en el ciclo 1 El Cuadro 6 proporcionan una descripción breve de las secuencias en el listado de secuencias.

Identificadores de Secuencia CUADRO A Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a 5°C (24 meses) CUADRO B Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a 5°C (24 meses) Datos de estabilidad para h409A11 anli-PD-1 Polvo para inyección, 50 mg/frasco Condición de 5"C almacenamiento Número de lote Intervalo de rueba de estabilidad Límite de cuantificación (QL) = 0.25%, Limite de detección (DL) = 0.10%, NT = no probado, ND = no detectado # no probado de acuerdo con la solución de ref ?" *Una versión modificada de USP <788> se usó para el lote 1 pre-clfnico CUADRO C Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de 25H (25°C. 60% HR. 12 meses) CUADRO D Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de 25H (25°C. 60% HR, 12 meses) CUADRO E Datos de estabilidad para formulaciones liofilízadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR. 6 meses) CUADRO F Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR, 6 meses) CUADRO G Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 almacenadas a 5°C (24 meses) CUADRO H Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 almacenadas a 5°C (24 meses) CUADRO I Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de 25H (25°C. 60% HR, 6 meses) CUADRO J Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de 25H (25°C, 60% HR, 6 meses) CUADRO K Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR. 6 meses) CUADRO L Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a pH 5.5 almacenadas a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR. 6 meses) CUADRO M Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 almacenadas a 5°C (24 meses) CUADRO N Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 almacenadas a 5°C (24 meses) CUADRO O Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a condiciones de 25H (25°C, 60% HR. 6 meses) CUADRO P Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a condiciones de 25H (25°C, 60% HR. 6 meses) CUADRO Q Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR. 6 meses) CUADRO R Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de h409A11 a condiciones de RH4 (40°C, 75% HR. 6 meses) Como se utiliza en la presente, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singulares de las palabras tales como "un," "una," y "el", incluye sus correspondientes referencias de plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se indique de otro modo, las proteínas y los sujetos mencionados en la presente son proteínas y sujetos humanos, antes que otra especie.

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Todas las referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en el mismo grado como si cada publicación individual, entrada de base de datos (por ejemplo secuencias de Genbank o entradas de GeneID), solicitud de patente, o patente, estuviera específicamente e individualmente indicada como incorporada como referencia. Esta declaración de incorporación como referencia es pretendida por los Solicitantes, con base a 37 C.F.R. §1.57(b)(1), para relacionarse con cada una y todas las publicaciones individuales, entrada de base de datos (por ejemplo, secuencias de Genbank o entradas de GeneID), solicitud de patente, o patente, cada una de las cuales se identifica claramente en cumplimiento con 37 C.F.R. §1.57(b)(2), incluso si dicha cita no está inmediatamente adyacente a una declaración dedicada de incorporación como referencia. La inclusión de declaraciones dedicadas de incorporación como, si la hay, dentro de la especificación no debilita en ninguna manera esta declaración general de incorporación como referencia. La cita de las referencias en la presente no pretende ser una admisión de que la referencia es técnica antecedente pertinente, ni tampoco constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o fecha de estas publicaciones o documentos.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una formulación liofilizada de un anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, hecho por liofilización de una solución acuosa que comprende: a) 25-100 mg/mL del anticuerpo anti-PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a aproximadamente pH 5.0- pH 6.0, y en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; y ii) una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 18, 19, y 20.

2.- La formulación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está presente a aproximadamente 25 mg/mL en la solución acuosa.

3. - La formulación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la solución acuosa tiene un pH de aproximadamente 5.5.

4. - La formulación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 31.

5. - La formulación farmacéutica liofilizada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo es h409A1 1.

6. - Una formulación farmacéutica líquida de un anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) 25-100 mg/mL del anticuerpo anti PD-1 humano, o el fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a pH 5.0-6.0, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; y ¡i) una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 18, 9, y 20.

7. - La formulación farmacéutica líquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 31.

8. - La formulación farmacéutica líquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el anticuerpo es h409A 1.

9 - El uso de una formulación farmacéutica de un anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) 25-100 mg/mL del anticuerpo anti-PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a pH 5.0-6.0, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; y ¡i) una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 18, 19, y 20, en la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un sujeto mamífero.

10. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO:31 y en donde el medicamento comprende una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1.0, 3.0, y 10 mg/kg, y está adaptado para ser administrable a intervalos de aproximadamente 14 días o aproximadamente 21 días a través del curso del tratamiento.

1 1. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO:31 y en donde el medicamento comprende una dosis de 5.0 mg/kg o 10 mg/kg, y está adaptado para ser administrable a intervalos de cada 2 semanas o cada 3 semanas a través del curso del tratamiento.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el sujeto tiene melanoma, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 31 , y el medicamento comprende una dosis de 3.0 mg/kg, y está adaptado para ser administrable a intervalos de cada 3 semanas a través del curso del tratamiento.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el sujeto no ha tenido tratamiento.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una infusión IV de 30 minutos.

15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el sujeto ha sido tratado anteriormente con agentes quimioterapéuticos adicionales.

16.- Una formulación farmacéutica de un anticuerpo anti PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: a) 25-100 mg/mL del anticuerpo anti-PD-1 humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo; b) aproximadamente 70 mg/mL de sacarosa; c) aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 80; y d) amortiguador de histidina aproximadamente 10 mM a pH 5.0-6.0, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: i) una cadena ligera que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; y ii) una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR SEQ ID NOs: 18, 19, y 20, para usarse en el tratamiento de cáncer en un sujeto mamífero.

17.- La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO:31 y en donde la formulación farmacéutica comprende una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1.0, 3.0, y 10 mg/kg, y está adaptada para ser administrable a intervalos de aproximadamente 14 días o aproximadamente 21 días a través del curso del tratamiento.

18. - La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO:31 y en donde la formulación farmacéutica comprende una dosis de 5.0 mg/kg o 10 mg/kg, y está adaptada para ser administrable a intervalos de cada 2 semanas o cada 3 semanas a través del curso del tratamiento.

19. - La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el sujeto tiene melanoma, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 20 a 237 de SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 31 , y en donde la formulación farmacéutica comprende una dosis de 3.0 mg/kg, y está adaptada para ser administrable a intervalos de cada 3 semanas a través del curso del tratamiento.

20. - La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el sujeto no ha tenido tratamiento.

21. - La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la formulación farmacéutica está adaptada para ser administrable en una infusión IV de 30 minutos.

22 - La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el sujeto ha sido tratado anteriormente con agentes quimioterapéuticos adicionales.