MX2012004775A - Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. - Google Patents

Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.

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MX2012004775A
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sec
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binding protein
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Jieyi Wang
Edward B Reilly
Hua Ying
Tariq Ghayur
Randy L Bell
Susan E Morgan-Lappe
Gillian A Kingsbury
Andrew Phillips
Suzanne M Norvell
Yingchun Li
Junjian Liu
Zhihong Liu
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Abbott Lab
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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas por ingeniería, métodos de fabricación, y específicamente a sus usos en la prevención, diagnóstico, y/o tratamiento de enfermedades.

Description

INMUNOGLOBULINAS DE DOMINIO VARIABLE DOBLE Y USOS DE LAS MISMAS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud de E.U.A. Serie No. 12/605,094, presentada el 23 de Octubre del 2009, los contenidos de la cual se incorporan aquí para referencia. Solicitud de E.U.A. Serie No. 12/605,094 es una solicitud de continuación en parte que reclama prioridad de la Solicitud provisional de E.U.A. Serie No. 61/230,191, 31 de Julio del 2009, y Solicitud de E.U.A Serie No. 12/431,460, presentada el 28 de Abril del 2009, la cual es una solicitud no provisional que reclama prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 61/125,834, presentada el 29 de Abril del 2008, Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 61/134,283, presentada el 8 de Julio del 2008, Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 61/197,191, presentada el 23 de Octubre del 2008, y Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 61/199,009, presentada el 12 de Noviembre del 2008, los contenidos de las cuales se incorporan aquí para referencia.
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, métodos de preparación, y específicamente a sus usos en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, cáncer, y otras enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA SNVENCION En la técnica son conocidas las proteínas diseñadas por ingeniería, tales como anticuerpos multiespecíficos capaces de unir dos o más antígenos. Dichas proteínas de unión multiespecíficas pueden ser generadas utilizando fusión celular, conjugación química, o técnicas de ADN recom binante.
Se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando tecnología de cuadroma (ver, Milstein, C. y A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) basándose en la fusión somática de dos diferentes líneas de célula de hibridoma expresando anticuerpos monoclonales de murino (mAbs) con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de dos diferentes cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina (Ig) dentro de la línea de célula de híbrido-hibridoma (o cuadroma) resultante, se generan hasta diez diferentes especies de Ig, de las cuales solo una es el anticuerpo biespecífico funcional. La presencia de subproductos no apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, significa que se requieren de procedimientos sofisticados de purificación.
Los anticuerpos biespecíficos también son producidos a través de conjugación química de dos diferentes mAbs (ver, Staerz, U.D., et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31 ). Este aspecto no produce preparación homogénea. Oros aspectos han utilizado conjugación química de dos diferentes mAbs o fragmentos de anticuerpo más pequeño (ver, Brennan, M . , et al. (1985) Science 229(4708): 81-3).
Otro método utilizado para producir anticuerpos biespecíf icos es el acoplamiento de dos anticuerpos parenterales con un entrelazador hetero-bif uncional , pero los anticuerpos biespecíf icos resultantes presentan heterogeneidad molecular importante ya que la reacción del entrelazador con los anticuerpos parenterales no es dirigida al sitio. Para obtener preparaciones más homogéneas de anticuerpos biespecífícos, dos diferentes fragmentos de Fab han sido químicamente entrelazados en sus residuos de cisteína de gozne en una forma dirigida al sitio (ver, Glennie, MJ., et al. (1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75). Pero este método da como resultado fragmentos Fab'2, no molécula entera de IgG.
Se ha desarrollado una amplia variedad de otros formatos de anticuerpo biespecífico recombinante (ver, Kriangkum, J., et al. (2001 ) Biomol. Eng. 18(2): 31-40). Entre ellos, las moléculas y diacuerpos de Fv de cadena individual en tándem, y varios derivados de los mismos, son los más ampliamente utilizados. Por rutina, la construcción de estas moléculas empieza a partir de dos fragmentos de Fv (scFv) de cadena individual que reconoce diferentes antigenos (ver, Economides, A.N., et al. (2003) Nat. Med. 9(1): 47-52). Las moléculas scFv en tándem (taFv) representan un formato directo que simplemente conecta las dos moléculas scFv con un enlazador peptidico adicional. Los dos fragmentos scFv presentes en estas moléculas scFv en tándem forman entidades de doblez separadas. Se pueden utilizar varios enlazadores para conectar los dos fragmentos y enlazadores scFv con una longitud de hasta 63 residuos (ver, Nakanishi, K., et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 423-74). Aunque los fragmentos scFv parenterales normalmente pueden ser expresados en forma soluble en bacterias, sin embargo, por lo general se observa que las moléculas scFv en tándem forman agregados insolubles en bacterias. Por lo tanto, los protocolos de repliegue o el uso de sistemas de expresión mamíferos por rutina son aplicados para producir moléculas scFv en tándem solubles En un estudio reciente, se reportó la expresión a través de conejos y ganado transgénicos de un agonista dirigido de scFv en tándem, CD28, y un proteoglicano asociado a melanoma (ver, Gracie, J.A., et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401 ). En esta construcción, las dos moléculas scFv se conectaron a través de un enlazador CH1 y se encontraron concentraciones, en suero, de hasta 100 mg/L del anticuerpo biespecífico. Varias estrategias, incluyendo variaciones del orden de dominio o uso de enlazadores medios con longitud o flexibilidad variables, se emplearon para permitir la expresión soluble en bacterias. Ahora pocos estudios han reportado la expresión de moléculas scFv en tándem en bacterias (ver, Leung, B. P., et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; Kami, A., et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40) utilizando ya sea un enlazador Ala3 muy corto o enlazadores ricos en glicina/serina largos. En otro estudio reciente, una presentación de fago de un repertorio de scFv en tándem conteniendo enlazadores medios aleatorizados con una longitud de 3 ó 6 residuos se empleó para enriquecer aquellas moléculas que se produjeron en forma soluble y activa en bacterias. Este aspecto dio como resultado el aislamiento de una molécula scFv en tándem con un enlazador de residuo de aminoácido 6 (ver, Arndt, M. y J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21 ). No está claro si esta secuencia enlazadora representa una solución general a la expresión soluble de moléculas scFv en tándem. Sin embargo, este estudio demostró que la presentación de fago de moléculas scFv en tándem, en combinación con mutagénesis dirigida, es una poderosa herramienta para estas moléculas, que pueden ser expresadas en bacterias en una forma activa.
Los diacuerpos biespecíf icos (Db) utilizan el formato de diacuerpo para expresión. Los diacuerpos son expresados a partir de fragmentos scFv reduciendo la longitud del enlazador que conecta el dominio VH y VL a aproximadamente 5 residuos (ver, Peipp, . y T. Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11). Esta reducción del tamaño de enlazador facilita la dimerización de dos cadenas de polipéptido a través de apareamiento cruzado de los dominios VH y VL. Los diacuerpos biespecificos son producidos a través de la expresión de dos cadenas de polipéptido con, ya sea la estructura VHA-VLB y V HB-VLA (configuración VH-VL), o VLA-VHB y V LB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. En el pasado se ha producido una gran variedad de diferentes diacuerpos biespecíficos y la mayor parte de éstos son expresados en forma soluble en bacterias. Sin embargo, un reciente estudio comparativo demuestra que la orientación de los dominios variables puede influenciar la expresión y formación de sitios de unión activos (ver, Mack, M. et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 92(15): 7021-5). No obstante, la expresión soluble en bacterias representa una importante ventaja sobre las moléculas scFv en tándem. Sin embargo, ya que dos diferentes cadenas de polipéptido son expresadas dentro de una célula inactiva individual, se pueden producir homodímeros junto con heterod ¡meros activos. Esto necesita de la implementación de pasos de purificación adicionales con el fin de obtener preparaciones homogéneas de diacuerpos biespecíficos. Un aspecto para forzar la generación de diacuerpos biespecíficos es la producción de diacuerpos de "perilla en el agujero" (ver, Holliger, P., T. Prospero, y G. Winter (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 90(14): 6444-8.18). Este aspecto se demostró para un diacuerpo biespecifico dirigido contra HER2 y CD3. Se introdujo una gran perilla en el dominio VH intercambiando Val37 con Phe y Leu45 con Trp y se produjo un agujero complementario en el dominio VL mutando Phe98 a Met y Tyr87 a Ala, ya sea en los dominios variables anti-HER2 o ant¡-CD3. Al utilizar este aspecto, la producción de diacuerpos biespecíficos puede ser incrementada de 72% por el diacuerpo parental a más de 90% por el diacuerpo de perilla en el agujero. De manera importante, la producción da como resultado solo una ligera reducción como resultado de estas mutaciones. Sin embargo, se observó una reducción de una actividad de unión a antígeno para varias construcciones. De esta manera, este aspecto de elaborar requiere del análisis de varias construcciones con el fin de identificar aquellas mutaciones que producen una molécula heterodimérica con actividad de unión no alterada. Además, dicho aspecto requiere de modificación mutacional de la secuencia de ¡nmunoglobulina en la región constante, creando así la forma no nativa y no natural de la secuencia de anticuerpo, que puede dar como resultado una inmunogenicidad incrementada, pobre estabilidad in vivo, asi como una farmacocinética no deseable.
Los diacuerpos de cadena individual (scDb) representan una estrategia alternativa para mejorar la formación de moléculas de tipo diacuerpo biespecífico (ver, Holliger, P. y G. Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnology 2(1): p. 21- 36). Los diacuerpos bies pecíf icos de cadena individual son producidos conectando las dos cadenas de polipéptido formadoras de diacuerpo con un enlazador medio adicional con una longitud de aproximadamente 15 residuos de aminoácido. Consecuentemente, todas las moléculas · con un peso molecular que corresponde a diacuerpos de cadena individual monoméricos (50-60 kDa) son biespecíf icas. Varios estudios han demostrado que los diacuerpos biespecificos de cadena individual son expresados en bacterias en forma soluble y activa con la mayoría de las moléculas purificadas presentes como monómeros (ver, Holliger, P. y G. Winter (1997 Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30, Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36; Pluckthun, A. y P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105; Ridgway, J.B., et al. (1996) Protein Engin. 9(7): 617-21). De esta manera, los diacuerpos de cadena individual combinan las ventajas de scFvs en tándem (todos monómeros son biespecíficos) y diacuerpos (expresión soluble en bacterias).
Más recientemente se han fusionado diacuerpos a Fe para generar más moléculas de tipo Ig, denominadas di-diacuerpos (ver, Lu, D., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(4): 2856-65). Además, se ha descrito la construcción de anticuerpo multivaiente comprendiendo dos repeticiones Fab en la cadena pesada de una IgG y capaces de unir cuadro moléculas de antígeno (ver, WO 0177342A1, y Miller, K., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61 ).
Existe la necesidad en la técnica de proteínas de unión multivalentes mejoradas capaces de unir dos o más antígenos. La Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 11/507,050 proporciona una familia novedosa de proteínas de unión capaces de unir dos o más antígenos con alta afinidad, las cuales se denominan inmunoglobulinas de dominio variable doble (DVD-lg™). La presente invención proporciona proteínas de unión novedosas adicionales capaces de unir dos o más antígenos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes capaces de unir dos o más antígenos. La presente invención proporciona una familia novedosa de proteínas de unión capaces de unir dos o más antígenos con alta afinidad.
En una modalidad, la invención proporciona una proteína de unión comprendiendo una cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa una aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 ó 1. En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de cadena pesada. En otra modalidad, el dominio variable de cadena pesada se selecciona del grupo que consiste de un dominio variable de cadena pesada de murino, un dominio variable de cadena pesada humano, un dominio variable de cadena pesada injertado a CDR, y un dominio variable de cad.ena pesada humanizado. En otra modalidad más, VD1 y VD2 son capaces de unir el mismo antígeno. En otra modalidad, VD1 y VD2 son capaces de unir diferentes antígenos. En otra modalidad más, C es un dominio constante de cadena pesada. Por ejemplo, X1 es un enlazador siempre que X1 no sea CH1. Por ejemplo, X1 es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEC ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP (SEC ID NO: 5); RADAAP (SEC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC ID NO: 7); RADAAAAGG PGS (SEC ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC ID NO: 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 10); ADAAP (SEC ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID NO: 26). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región Fe variante.
En una modalidad, la proteina de unión descrita aquí comprende una cadena de polipéptido, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 es una región Fe. En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteina de unión son dominios variables de cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de un dominio variable de cadena ligera de murino, un dominio variable de cadena ligera humano, un dominio variable de cadena ligera injertado en CDR, y un dominio variable de cadena ligera humanizado. En una modalidad, VD1 y VD2 son capaces de unir el mismo antígeno. En otra modalidad, VD1 y VD2 son capaces de unir diferentes antígenos. En una modalidad, C es un dominio constante de cadena ligera. En otra modalidad, X1 es un enlazador siempre que X1 no sea CL1. En una modalidad, X1 es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEC ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP (SEC ID NO: 5); RADAAP (SEC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC ID NO: 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 10); ADAAP (SEC ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID NO: 26). En una modalidad, la proteína de unión no comprende X2.
En una modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden el mismo enlazador. En otra modalidad, la cadena pesada variable y la cadena, ligera variable comprenden diferentes enlazadores. En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador corto (aproximadamente 6 aminoácidos). En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador largo (mayor que 6 aminoácidos). En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador corto y la cadena ligera variable comprende un enlazador largo. En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador largo y la cadena ligera variable comprende un enlazador corto.
En una modalidad, la proteína de unión descrita aquí comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 no comprenda una región Fe.
En otra modalidad, la invención proporciona una proteína de unión que comprende dos cadenas de polipéptido, en donde dicha primera cadena de polipéptido comprende VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 es una región Fe; dicha segunda cadena de polipéptido comprende VD 1 -(X 1 ) n-VD2-C-(X2)n , en donde VD 1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 no comprenda una región Fe. En una modalidad particular, la proteína de unión de Dominio Variable Doble (DVD) comprende cuatro cadenas de polipéptido, en donde las primeras dos cadenas de polipéptido comprenden VD 1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2) n , respectivamente, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 es una región Fe; y las segundas dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, respectivamente, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1, y X2 no comprenda una región Fe. Dicha proteína de Dominio Variable Doble (DVD) tiene cuatro sitios de unión a antígeno.
En otra modalidad, las proteínas de unión descritas aquí son capaces de unir uno o más objetivos. En una modalidad, el objetivo se selecciona del grupo que consiste de citocinas, proteína de superficie celular, enzimas y receptores. En otra modalidad, la proteína de unión es capaz de modular una función biológica de uno o más objetivos. En otra modalidad, la proteína de unión es capaz de neutralizar uno o más objetivos. La proteína de unión de la invención es capaz de unir citocinas seleccionadas del grupo que consiste de linfocinas, monocinas, hormonas peptídicas, receptores, o marcadores de tumor. Por ejemplo, la DVD-lg de la invención es capaz de unir dos o más de los siguientes: CD-20, CD-19, CD-80, CD-22, CD-40, CD-3, receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER-2), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor de crecimiento de tipo insulina 1,2 (IGF1.2), receptor de factor de crecimiento de tipo insulina (IGF1R), tirosina cinasa de receptor de proteína estimulante de macrófago (RON), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), factor de transición mesénquimo-epitelial (c-MET), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), homólogo 4 de Drosophila Delta (DLL4), neuropilina 1 (NRP1), factor de crecimiento de placenta (PLGF), y homólogo 3 viral de leucemia eritroblástico aviar v-erb-b2 (ErbB3) (también ver Cuadro 2). En una modalidad específica, la proteina de unión es capaz de unir pares de objetivos seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF 1 R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e l GF1,2; VEGF y DLL4; VEGF y H GF; VEGF y R ON; VEGF y NRP1; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; HER-2 y HER-2.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 112 y SEC ID NO. 114; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 113 y SEC ID NO. 115. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 112 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 113. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-19 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 114 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO. 115.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 116 y SEC ID NO. 118; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 117 y SEC ID NO. 119. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 116 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 117. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 118 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 119.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-80 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 120 y SEC ID NO. 122; y una secuencia de aminoácido d.e cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 121 y SEC ID NO. 123. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-80 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 120 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 121. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-80 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada' de DVD de SEC I D NO. 122 y u na secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 123.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-22 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 124 y SEC ID NO. 126; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo q ue consiste de SEC I D NO. 125 y SEC ID NO. 127. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-22 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 124 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 125. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-22 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC I D NO. 126 y u na secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 127.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-40 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 128 y SEC ID NO. 130; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 129 y SEC ID NO. 131. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-40 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 128 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 129. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-20 y CD-40 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC I D NO. 130 y u na secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 131.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 1) y HER-2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 132 y SEC ID NO. 134; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 133 y SEC ID NO. 135. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 132 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 133. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 134 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 135.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 ( sec. 1) y CD-19 c omprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 136 y SEC ID NO. 138; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD s eleccionada del grupo que consiste de S EC ID NO. 137 y SEC ID NO. 139. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 1) y CD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 136 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 137. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 1) y CD-19 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 138 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 139.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 140 y SEC ID NO. 142; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 141 y SEC ID NO. 143. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 140 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 141. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 142 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 143.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y CD-3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 144 y SEC ID NO. 146; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 145 y SEC ID NO. 147. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y CD-3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 144 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 145. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y CD-3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 146 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 147.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 148 y SEC ID NO. 150; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 149 y SEC ID NO. 151. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 148 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 149. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1.2 tiene una orientación ¡nversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 150 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 151.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 152 y SEC ID NO. 154; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 153 y SEC ID NO. 155. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 152 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 153. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 154 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 155.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 156 y SEC ID NO. 158; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 157 y SEC ID NO. 159. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 156 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 157. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 158 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 159.
En una tercera m odalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 160 y SEC ID NO. 162; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 161 y SEC ID NO. 163. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 160 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 161. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e EGF1R (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 162 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 163.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 164 y SEC ID NO. 166; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 165 y SEC ID NO. 167. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 164 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 165. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 166 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 167.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 168 y SEC ID NO. 170; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 169 y SEC ID NO. 171. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 168 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 169. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO.170 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 171.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 172 y SEC ID NO. 174; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 173 y SEC ID NO. 175. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 172 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 173. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R.(séc. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 174 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 175.
En una tercera m odalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 176 y SEC ID NO. 178; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 177 y SEC ID NO. 179. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 176 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 177. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGF (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 178 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 179.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 180 y SEC ID NO. 182; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 181 y SEC ID NO. 183. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 18 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 181. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 182 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 183.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 184 y SEC ID NO. 186; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 185 y SEC ID NO. 187. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 184 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 185. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 186 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 187.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 188 y SEC ID NO. 190; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 189 y SEC ID NO. 192. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 188 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 189. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 190 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 191.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 192 y SEC ID NO. 194; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 193 y SEC ID NO. 195. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir IL EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 192 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 193. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 194 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 195.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 196 y SEC ID NO. 198; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 197 y SEC ID NO. 199. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 196 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 197. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 198 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 199.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 200 y SEC ID NO. 202; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD s eleccionada del grupo que consiste de S EC ID NO. 201 y SEC ID NO. 203. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 200 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 201. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 202 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 203.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 204 y SEC ID NO. 206; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 205 y SEC ID NO. 207. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 204 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 205. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 206 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 207.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 208 y SEC ID NO. 210; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 209 y SEC ID NO. 211. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 208 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 209. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de. unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 210 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 211.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) ' comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 212 y SEC ID NO. 214; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 213 y SEC ID NO. 215. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 212 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 213. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 214 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 215.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 216 y SEC ID NO. 218; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD s eleccionada del grupo que consiste de S EC ID NO. 217 y SEC ID NO. 219. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir E GFR (sec. 2) y HGF (sec. 1 )) c omprende u na secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 216 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 217. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 218 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 219.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y c-MET comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 220 y SEC ID NO. 222; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 221 y SEC ID NO. 223. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y c- ET comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 220 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 221. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y c-MET tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 222 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 223.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 224 y SEC ID NO. 226; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 225 y SEC ID NO. 227. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 224 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 225. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 226 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 227.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 228 y SEC ID NO. 230; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC I D NO. 229 y SEC ID NO. 231. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 228 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 229. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) e IGF1.2 tiene una orientación . inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 230 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 231.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO; 232 y SEC ID NO. 234; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD s eleccionada del grupo que consiste de S EC ID NO. 233 y SEC ID NO. 235. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 232 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 233. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 1) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 234 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 235.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y EGFR (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 236 y SEC ID NO. 238; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 237 y SEC ID NO. 239. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y EGFR (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 236 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 237. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y EGFR (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 238 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 239.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) comprende u na cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 240 y SEC ID NO. 242; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 241 y SEC ID NO. 243. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 240 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 241. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) tiene una .orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 242 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 243.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y CD-20 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 244 y SEC ID NO. 246; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 245 y SEC ID NO. 247. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y CD-20 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 244 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 245. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y CD-20 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 246 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 247.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) e IGF1.2 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 248 y SEC ID NO. 250; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 249 y SEC ID NO. 251. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 248 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 249. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y IGF1.2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 250 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 251.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 252 y SEC ID NO. 254; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 253 y SEC ID NO. 255. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 252 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 253. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 254 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 255.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 256 y SEC ID NO. 258; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 257 y SEC ID NO. 259. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 256 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 257. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 258 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 259.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 260 y SEC ID NO. 262; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 261 y SEC ID NO. 263. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 260 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 261. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 262 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 263.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 264 y SEC ID NO. 266; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 265 y SEC ID NO. 267. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 264 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 265. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 266 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 267.
En una cuarta modalidad, la pro teína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y> HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 268 y SEC ID NO. 270; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 269 y SEC ID NO. 271. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 268 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 269. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y HGF (sec 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 270 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 271.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y RON (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 272 y SEC ID NO. 274; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 273 y SEC ID NO. 275. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 272 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 273. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 274 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 275.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y NRP1 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO." 276 y SEC ID NO. 278; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 277 y SEC ID NO. 279. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y NRP1 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 276 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 277. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y NRP1 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 278 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 279.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 280 y SEC ID NO. 282; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 281 y SEC ID NO. 282. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 280 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 281. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 282 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 283.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y EGFR (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 284 y SEC ID NO. 286; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 285 y SEC ID NO. 287. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y EGFR (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 284 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 285. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y EGFR (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 286 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 287.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 288 y SEC ID NO. 290; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 289 y SEC ID NO. 291. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 288 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 289. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir RON (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 290 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 291.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 292 y SEC ID NO. 294; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 293 y SEC ID NO. 295. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 292 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 293. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HER-2 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 294 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 295.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y CD-3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 296 y SEC ID NO. 298; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 297 y SEC ID NO. 299. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y CD-3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 296 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 297. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y CD-3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 298 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 299.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y IGF1 R comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 300 y SEC ID NO. 302; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 301 y SEC ID NO. 303. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) e IGF1R comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 300 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 301. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y IGF1 R tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 302 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 303.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y RON (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 304 y SEC ID NO. 306; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 305 y SEC ID NO. 307. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y RON (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 304 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 305. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y .RON (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 306 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 307.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y RON (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 308 y SEC ID NO. 310; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 309 y SEC ID NO. 311. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y RON (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 308 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 309. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y RON (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 310 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 311.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 312 y SEC ID NO. 314; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 313 y SEC ID NO. 315. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 312 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 313. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y HGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 314 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 315.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y c-MET comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 316 y SEC ID NO. 318; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 317 y SEC ID NO. 319. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y c-MET comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 316 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 317. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1 y c-MET tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 318 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 319.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 320 y SEC ID NO. 322; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 321 y SEC ID NO. 323. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 320 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 321. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 322 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 323.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir NRP1 (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 324 y SEC ID NO. 326; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 325 y SEC ID NO. 327. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir NRP1 (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 324 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 325. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir NRP1 (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 326 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 327.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-20 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 328 y SEC ID NO. 330; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 329 y SEC ID NO. 331. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-20 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD. de SEC ID NO. 328 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 329. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-20 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 330 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 331.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 332 y SEC ID NO: 334; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 333 y SEC ID NO: 335. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 332 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 333. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y HER-2 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO: 334 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 335.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 336 y SEC ID NO. 338; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 337 y SEC ID NO. 339. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 336 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 337. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD- 9 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 338 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 339.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 340 y SEC ID NO. 342; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 341 y SEC ID NO. 343. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 340 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 341. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 342 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 343.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 344 y SEC ID NO. 346; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 345 y SEC ID NO. 347. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 344 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 345. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 346 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 347.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y IGF1.2 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 348 y SEC ID NO. 350; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 349 y SEC ID NO. 351. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) e IGF1.2 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 348 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 349. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y I G F 1 ,2 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 350 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 351.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir DLL-4 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 352 y SEC ID NO. 354; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 353 y SEC ID NO. 355. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir DLL-4 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 352 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 353. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir DLL-4 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 354 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 355.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 356 y SEC ID NO. 358; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 357 y SEC ID NO. 359. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 356 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 357. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 358 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 359.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 360 y SEC ID NO. 362; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 361 y SEC ID NO. 363. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 360 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 361. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 362 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 363.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 364 y SEC ID NO. 366; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 365 y SEC ID NO. 367. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 364 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 365. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 366 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 367.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 368 y SEC ID NO. 370; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 369 y SEC ID NO. 371. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 368 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 369. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 370 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 371.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 372 y SEC ID NO. 374; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 373 y SEC ID NO. 375. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 372 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 373. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 374 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 375.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz ae unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 376 y SEC ID NO. 378; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 377 y SEC ID NO. 379. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1 ) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 376 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 377. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 378 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO. 379.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 380 y SEC ID NO. 382; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 381 y SEC ID NO. 383. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 380 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 381. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 382 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 383.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 384 y SEC ID NO. 386; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 385 y SEC ID NO. 387. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 384 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 385. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 386 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 387.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 388 y SEC ID NO. 390; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 389 y SEC ID NO. 391. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 388 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 389. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 390 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 391.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 392 y SEC ID NO. 394; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 393 y SEC ID NO. 395. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 392 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 393. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 394 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 395.
En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 396 y SEC ID NO. 398; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 397 y SEC ID NO. 399. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 396 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 397. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 398 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 399.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 400 y SEC ID NO. 402; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 401 y SEC ID NO. 403. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 400 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 401. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 402 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 403.
En una tercera modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 404 y SEC ID NO. 406; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 405 y SEC ID NO. 407. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 404 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 405. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD. de SEC ID NO. 406 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 407.
En una cuarta modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 408 y SEC ID NO. 410; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 409 y SEC ID NO. 411. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 408 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 409. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 410 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD.de SEC ID NO: 411.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 412 y SEC ID NO. 414; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 413 y SEC ID NO. 415. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 412 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 413. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 414 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 415.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 416 y SEC ID NO. 418; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 417 y SEC ID NO. 419. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 416 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 417. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 418 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 419.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 420 y SEC ID NO. 422; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 421 y SEC ID NO. 423. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO.420 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 421. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 422 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 423.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 424 y SEC ID NO. 426; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 425 y SEC ID NO. 427. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 424 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 425. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 426 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 427.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 428 y SEC ID NO. 430; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 429 y SEC ID NO. 431. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 428 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 429. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 430 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 431.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 432 y SEC ID NO. 433; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 434 y SEC ID NO. 435. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 432 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 433. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 434 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 435.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 436 y SEC ID NO. 438; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 437 y SEC ID NO. 439. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 436 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 437. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 438 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 439.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 440 y SEC ID NO. 442; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 441 y SEC ID NO. 443. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 440 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 441. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 442 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 443.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 444 y SEC ID NO. 446; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 445 y SEC ID NO. 447. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 444 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 445. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 446 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 447.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 448 y SEC ID NO. 450; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 449 y SEC ID NO. 451. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 448 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 449. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 450 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 451.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 452 y SEC ID NO. 454; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 453 y SEC ID NO. 455. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 452 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 453. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 454 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 455.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 456 y SEC ID NO. 458; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 457 y SEC ID NO. 459. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 456 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 457. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 458 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 459.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 460 y SEC ID NO. 462; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 461 y SEC ID NO. 463. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 460 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 461. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 462 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 463.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 464 y SEC ID NO. 466; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 465 y SEC ID NO. 467. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 464 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 465. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 466 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 467.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 468 y SEC ID NO. 470; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 469 y SEC ID NO. 471. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 468 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 469. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 470 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 471.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 472 y SEC ID NO. 474; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 473 y SEC ID NO. 475. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 472 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 473. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 474 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 475.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 476 y SEC ID NO. 478; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 477 y SEC ID NO. 479. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 476 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 477. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 478 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 479.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 480 y SEC ID NO. 482; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 481 y SEC ID NO. 483. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 480 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 481. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 482 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 483.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 484 y SEC ID NO. 486; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 485 y SEC ID NO. 487. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 484 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 485. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 486 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 487.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 488 y SEC ID NO. 490; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 489 y' SEC ID NO. 491. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 488 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 489. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 490 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 491.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 492 y SEC ID NO. 494; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 493 y SEC ID NO. 495. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 492 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 493. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 494 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 495.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 496 y SEC ID NO. 498; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 497 y SEC ID NO. 499. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 496 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 497. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 498 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 499.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1 ) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 500 y SEC ID NO. 502; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 501 y SEC ID NO. 503. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 500 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 501. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 502 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 503.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 504 y SEC ID NO. 506; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 505 y SEC ID NO. 507. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 504 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 505. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 506 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 507.
En una tercera modalidad, la protetna de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 508 y SEC ID NO. 510; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 509 y SEC ID NO. 511. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 508 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 509. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 510 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 511.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 512 y SEC ID NO. 514; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 513 y SEC ID NO. 515. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 512 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 513. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 514 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 515.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 516 y SEC ID NO. 518; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 517 y SEC ID NO. 519 En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 516 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 517. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 518 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 519.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 520 y SEC ID NO. 522; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 521 y SEC ID NO. 523. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 520 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 521. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 522 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 523.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 524 y SEC ID NO. 526; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 525 y SEC ID NO. 527. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 524 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 525. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 526 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 527.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD' seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 528 y SEC ID NO. 530; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 529 y SEC ID NO. 531. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 528 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 529. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 530 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 531.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 532 y SEC ID NO. 534; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 533 y SEC ID NO. 535. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 532 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 533. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 534 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 535.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 536 y SEC ID NO. 538; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 537 y SEC ID NO. 539. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 536 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 537. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de uni.r VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 538 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 539.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 540 y SEC ID NO. 542; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 541 y SEC ID NO. 543. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 540 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 541. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 542 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 543.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 544 y SEC ID NO. 546; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 545 y SEC ID NO. 547. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 544 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 545. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 546 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 547.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 548 y SEC ID NO. 550; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 549 y SEC ID NO. 552. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 548 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 549. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 550 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 551.
En una tercera modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 552 y SEC ID NO. 554; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 553 y SEC ID NO. 555. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 552 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 553. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 554 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 555.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido . de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 556 y SEC ID NO. 558; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 557 y SEC ID NO. 559. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 556 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 557. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 558 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 559.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 560 y SEC ID NO. 562; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 561 y SEC ID NO. 563. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 560 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 561. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 562 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 563.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 564 y SEC ID NO. 566; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 565 y SEC ID NO. 567. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 564 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 565. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 566 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 567.
En una tercera modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec, 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 568 y SEC ID NO. 570; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 569 y SEC ID NO. 571. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 568 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 569. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 570 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 571.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 572 y SEC ID NO. 574; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 573 y SEC ID NO. 575. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 572 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 573. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 574 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de S-EC ID NO: 575.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 576 y SEC ID NO. 578; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 577 y SEC ID NO. 579. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 576 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 577. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 578 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 579.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 580 y SEC ID NO. 582; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 581 y SEC ID NO. 583. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 580 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 581. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 582 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 583.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 584 y SEC ID NO. 586; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 585 y SEC ID NO. 587. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 584 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 585. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4.) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 586 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 587.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 588 y SEC ID NO. 590; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 589 y SEC ID NO. 591. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 588 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 589. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 590 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 591.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 592 y SEC ID NO. 594; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 593 y SEC ID NO. 595. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 592 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 593. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 594 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 595.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y D.LL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 596 y SEC ID NO. 598; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 597 y SEC ID NO. 599. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 596 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 597. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 598 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 599.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 600 y SEC ID NO. 602; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 601 y SEC ID NO. 603. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y dLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 600 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 601. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 602 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 603.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 604 y SEC ID NO. 606; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 605 y SEC ID NO. 607. En una modalidad, la proteína de unión-capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 604 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 605. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y DLL-4 (sec. 4) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 606 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 607.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 608 y SEC ID NO. 610; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 609 y SEC ID NO. 611. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 608 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 609. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 610 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 611.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 612 y SEC ID NO. 614; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 613 y SEC ID NO. 615. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 612 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 613. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 614 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 615.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 616 y SEC ID NO. 618; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 617 y SEC ID NO. 619. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 616 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 617. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 618 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 619.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 620 y SEC ID NO. 622; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 621 y SEC ID NO. 623. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 620 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 621. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 622 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 623.
En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 624 y SEC ID NO. 626; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 625 y SEC ID NO. 627. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 624 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 625. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 626 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 627.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 628 y SEC ID NO. 630; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 629 y SEC ID NO. 631. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 628 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO. 629. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 630 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 631.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 632 y SEC ID NO. 634; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 633 y SEC ID NO. 635. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 632 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 633. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 634 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 635.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 636 y SEC ID NO. 638; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 637 y SEC ID NO. 639. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 636 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 637. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 638 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 639.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 640 y SEC ID NO. 642; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 641 y SEC ID NO. 643. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 640 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 641. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 642 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 643.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 644 y SEC ID NO. 646; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 645 y SEC ID NO. 647. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 644 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 645. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 646 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 647.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 648 y SEC ID NO. 650; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 649 y SEC ID NO. 651. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 648 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 649. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 650 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 651.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 652 y SEC ID NO. 654; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 653 y SEC ID NO. 655. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 652 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 653. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 654 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 655.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 656 y SEC ID NO. 658; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 657 y SEC ID NO. 659. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 656 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 657. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 658 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 659.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 660 y SEC ID NO. 662; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 661 y SEC ID NO. 663. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 660 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 661. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 662 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 663.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 664 y SEC ID NO. 666; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 665 y SEC ID NO. 667. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 664 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 665. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 666 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 667.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 668 y SEC ID NO. 670; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 669 y SEC ID NO. 671. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 668 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 669. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 670 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 671.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 672 y SEC ID NO. 674; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 673 y SEC ID NO. 675. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 672 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 673. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 674 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 675.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 676 y SEC ID NO. 678; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 677 y SEC ID NO. 679. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 676 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 677. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 678 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 679.
En una tercera modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 680 y SEC ID NO. 682; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 681 y SEC ID NO. 683. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 680 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 681. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 682 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 683.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 684 y SEC ID NO. 686; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 685 y SEC ID NO. 687. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 684 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 685. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 686 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 687. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 688 y SEC ID NO. 690; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 689 y SEC ID NO. 691. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 688 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 689. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 690 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 691.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 692 y SEC ID NO. 694; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 693 y SEC ID NO. 695. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 692 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 693. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 694 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 695.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 696 y SEC ID NO. 698; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 697 y SEC ID NO. 699. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 696 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 697. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 698 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 699.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 700 y SEC ID NO. 702, y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 701 y SEC ID NO. 703. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 700 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 701. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 702 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 703.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 704 y SEC ID NO. 706; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 705 y SEC ID NO. 707. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 704 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 705. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 706 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 707.
En una segunda modalidad, la proteina de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 708 y SEC ID NO. 710; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 709 y SEC ID NO. 711. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 708 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 709. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 710 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 711.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 712 y SEC ID NO. 714; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 713 y SEC ID NO. 715. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 712 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 713. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 714 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 715.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 716 y SEC ID NO. 718; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 717 y SEC ID NO. 719. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 716 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 717. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 718 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 719.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 720 y SEC ID NO. 722; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 721 y SEC ID NO. 723. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 720 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 721. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 722 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 723.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 724 y SEC ID NO. 726; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 725 y SEC ID NO. 727. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 724 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 725. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 726 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 727.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 728 y SEC ID NO. 730; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 729 y SEC ID NO. 731. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 728 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 729. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 730 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 731.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena . pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 732 y SEC ID NO. 734; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 733 y SEC ID NO. 735. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 732 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 733. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 734 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 735.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 736 y SEC ID NO. 738; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 737 y SEC ID NO. 739. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 736 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 737. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 738 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 739.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 740 y SEC ID NO. 742; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 741 y SEC ID NO. 743. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 740 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 741. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 742 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 743.) En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 744 y SEC ID NO. 746; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 745 y SEC ID NO. 747. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 744 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 745. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 746 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 747.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 748 y SEC ID NO. 750; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 749 y SEC ID NO. 751. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 748 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 749. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 750 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 751.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 752 y SEC ID NO. 754; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 753 y SEC ID NO. 755. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 752 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 753. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 754 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 755.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 756 y SEC ID NO. 758; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 757 y SEC ID NO. 759. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 756 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 757. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 758 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 759.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 760 y SEC ID NO. 762; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 761 y SEC ID NO. 763. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 760 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 761. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 762 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 763.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 764 y SEC ID NO. 766; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 765 y SEC ID NO. 767. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 764 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 765. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 766 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 767.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 768 y SEC ID NO. 770; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 769 y SEC ID NO. 771. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 768 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 769. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 770 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 771.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 772 y SEC ID NO. 774; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 773 y SEC ID NO. 775. En una modalidad, la proteína de unión capaz d.e unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 772 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 773. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 774 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 775.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 776 y SEC ID NO. 778; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 779 y SEC ID NO. 781. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 776 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 777. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 7678 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 779.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 780 y SEC ID NO. 782; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 781 y SEC ID NO. 783. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 780 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 781. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 782 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 783.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 784 y SEC ID NO. 786; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 785 y SEC ID NO. 787. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 784 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 785. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO 786 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 787.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 788 y SEC ID NO. 790; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC !D NO. 789 y SEC ID NO. 791. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 788 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 789. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 790 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 791.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 792 y SEC ID NO. 794; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 793 y SEC ID NO. 795. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 792 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 793. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 794 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 795.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 796 y SEC ID NO. 798; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 797 y SEC ID NO. 799. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 796 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 797. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 798 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 799.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 800 y SEC ID NO. 802; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 801 y SEC ID NO. 803. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 800 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 801. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 802 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 803.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 804 y SEC ID NO. 806; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 805 y SEC ID NO. 807. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 804 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 805. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 806 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 807.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 808 y SEC ID NO. 810; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 809 y SEC ID NO. 811. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 808 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 809. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 810 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 811.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 812 y SEC ID NO. 814; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 813 y SEC ID NO. 815. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 812 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 813. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 814 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 815.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 816 y SEC ID NO. 818; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 817 y SEC ID NO. 819. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 816 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 817. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 818 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 819.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 820 y SEC ID NO. 822; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 821 y SEC ID NO. 823. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 820 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 821. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 822 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 823.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 824 y SEC ID NO. 826; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 825 y SEC ID NO. 827. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 824 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 825. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 826 y una secuencia de aminoá'cido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 827.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 828 y SEC ID NO. 830; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 829 y SEC ID NO. 831. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 828 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 829. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 830 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 831.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 832 y SEC ID NO. 834; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 833 y SEC ID NO. 835. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 832 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 833. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 834 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 835.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 836 y SEC ID NO. 838; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 837 y SEC ID NO. 839. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 836 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 837. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 838 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 839.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 840 y SEC ID NO. 842; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 841 y SEC ID NO. 843. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 840 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 841. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 842 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 843.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 844 y SEC ID NO. 846; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 845 y SEC ID NO. 847. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 844 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 845. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 846 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 847 En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 848 y SEC ID NO. 850; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 849 y SEC ID NO. 851. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 848 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 849. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 850 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 851.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 852 y SEC ID NO. 854; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 853 y SEC ID NO. 855. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 852 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 853. En otra, modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 854 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 855.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 856 y SEC ID NO. 858; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 857 y SEC ID NO. 859. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 856 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 857. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 858 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 859.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 860 y SEC ID NO. 862; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 861 y SEC ID NO. 863. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 860 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 861. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 862 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 863.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 864 y SEC ID NO. 866; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 865 y SEC ID NO. 867. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 864 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 865. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 866 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 867.
En una segunda modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 868 y SEC ID NO. 870; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 869 y SEC ID NO. 871. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 858 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 869. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 870 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 871.
En una tercera modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 872 y SEC ID NO. 874; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 873 y SEC ID NO. 875. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 872 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 873. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 874 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 875.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 876 y SEC ID NO. 878; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 877 y SEC ID NO. 879. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 876 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 877. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir HER-2 (sec. 1) y HER-2 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 878 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 879.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 880 y SEC ID NO. 882; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 881 y SEC ID NO. 883. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 880 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 881. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 882 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 883.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 884 y SEC ID NO. 886; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 885 y SEC ID NO. 887. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 884 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 885. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 886 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 887.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 888 y SEC ID NO. 890; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 889 y SEC ID NO. 891. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 888 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 889. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 890 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 891.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 892 y SEC ID NO. 894; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 893 y SEC ID NO. 895. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 892 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 893. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 894 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 895.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 896 y SEC ID NO. 898; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 897 y SEC ID NO. 899. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 896 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 897. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 898 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 899.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 900 y SEC ID NO. 902; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 901 y SEC ID NO. 903. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 900 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 901. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 9032 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 903.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 904 y SEC ID NO. 906; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 905 y SEC ID NO. 907. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 904 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 905. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 2) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 906 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 907.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 3) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 908 y SEC ID NO. 910; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 909 y SEC ID NO. 911. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD- 9 (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 908 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 909. En otra modalidad, la proteina de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 3) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 910 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 911.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 1) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 912 y SEC ID NO. 914; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 913 y SEC ID NO. 915. En una modalidad, la proteina de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 912 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 913. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 1) tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 914 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 915.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 1) comprende una secuencia, de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 916 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO. 917.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 918 y SEC ID NO. 920; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 91999 y SEC ID NO. 921. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 918 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 919. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir CD-3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) tiene una Orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 920 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 921.
. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir mouse mCD-3 y mouse mCD-19 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 922 y SEC ID NO. 924; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 923 y SEC ID NO. 925. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir mCD-3 y mCD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 922 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 923. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir mCD-3 y mCD-19 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 924 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 925.
En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir mouse mCD-3 y mouse mCD-19 comprende una cadena de aminoácido de cadena pesada DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 926 y SEC ID NO. 928; y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 927 y SEC ID NO. 929. En una modalidad, la proteína de unión capaz de unir mCD-3 y mCD-19 comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 926 y a una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 927. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de unir mCD-3 y mCD-19 tiene una orientación inversa y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada DVD de SEC ID NO. 928 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera DVD de SEC ID NO: 929.
En otra modalidad, la invención proporciona una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde dicho (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente. En una modalidad, la región Fe está ausente de la proteína de unión.
En otra modalidad, la invención proporciona una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente. En una modalidad, (X2)n está ausente de la región de unión.
En otra modalidad, la proteína de unión de la invención comprende primera y segunda cadenas de polipéptido, en donde dicha primer cadena de polipéptido comprende un primer VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; y en donde dicha segunda cadena de polipéptido comprende un segundo VD 1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2) n , en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente. En otra modalidad, la proteína de unión comprende dos primeras cadenas de polipéptido y dos segundas cadenas de polipéptido. En otra modalidad más, (X2)n está ausente del segundo polipéptido. En otra modalidad adicional, la región Fe, si está presente en el primer polipéptido se selecciona del grupo que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia variante. En una modalidad más, la región Fe se selecciona del grupo que consiste de una región Fe de un l g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.
En otra modalidad, la proteína de unión de la invención es un DVD-lg capaz de unir dos antígenos que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, en donde las primera y tercera cadenas de polipéptido comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde dicho (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; y en donde las segunda y cuarta cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente.
La invención proporciona un método para hacer una proteína de unión DVD-lg pre-seleccionando los anticuerpos parentales. En una modalidad, el método para hacer una Inmunoglobulina de dominio Variable Doble capaz de unión dos antígenos, que comprende los pasos de, a) obtener un primer anticuerpo parental o úna porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo parental o una porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir una segundo antígeno; c) construir primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde dicho (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; d) construir segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de manera que se genera una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dicho primer y segundo antígenos.
En otra modalidad más la invención proporciona un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dos antígenos con propiedades deseada, que comprende los pasos de, a) obtener un primer anticuerpo parental o porción de antígeno del mismo, capaz de unir un primer antigeno y poseer al menos una propiedad deseada exhibida por la I nmunoglobulina de Dominio Variable Doble; b) obtener un segundo anticuerpo parental o una porción de unión a antigeno del mismo, capaz de unir un segundo antígeno y poseer por lo menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble; c) construir primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde dicho (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; d) construir segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD 1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente; e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de manera que se genera una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dicho primer y segundo antígenos.
En una modalidad, VD1 de las primera y segunda cadenas de polipéptido descritas aquí se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo. En otra modalidad, VD1 de las primera y segunda cadenas dé polipéptido descritas aquí se obtienen de diferentes anticuerpos parentales o porciones de unión a antígeno de los mismos. En otra modalidad, VD2 de las primera y segunda cadenas de polipéptido descritas aquí se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo. En otra modalidad, VD2 de las primera y segunda cadenas de polipéptido descritas aquí se obtienen de diferentes anticuerpos parentales o porciones de unión de antígeno de los mismos.
En una modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, son el mismo anticuerpo. En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, son anticuerpos diferentes.
En una modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une un primer antígeno, y el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une un segundo antígeno. En una modalidad particular, los primero y segundo antígenos son el mismo antígeno. En otra modalidad, los anticuerpos parentales se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno. En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une el primer antígeno con una potencia diferente a la potencia con la cual el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une el segundo antígeno. En otra modalidad más, el primer anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo, une el primer antígeno con una afinidad diferente a la afinidad con la cual es segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une el segundo antígeno.
En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpo humano, anticuerpo injertado CDR, y anticuerpo humanizado. En una modalidad, las porciones de unión de antígeno se seleccionan del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región de de determinación de complementariedad aislada (CDR), un anticuerpo de cadena individual, y diacuerpos.
En otra modalidad, la proteína de unión posee al menos una propiedad deseada exhibida por el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, o el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo. Alternativamente, el primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo y el segundo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo poseen al menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros . de anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros de anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, f armacocinética , biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión de antígeno ortólogo. En una modalidad, la proteína de unión es multivalente. En otra modalidad, la proteína de unión es multiespecíf ica . Las proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas descritas aquí tienen propiedades deseables, en particular desde un punto de vista terapéutico. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente o una m ultiespecíf ica puede ser (1) internalizada (y/o catabolizada) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno a la cual se unen los anticuerpos; (2) puede ser un anticuerpo agonista; y/o (3) puede inducir muerte celular y/o apoptosis de una célula que expresa un antígeno, en donde el anticuerpo multivalente es capaz de unirse. El "anticuerpo parental" que proporciona por lo menos una especificidad de unión a antígeno de las proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas puede ser uno que es neutralizado (y/o catabolizado) por una célula que expresa un antígeno al se une el anticuerpo; y/o puede ser un agonista, anticuerpo de inducción de muerte, y/o anticuerpo de inducción de apoptosis, y la proteína de unión multivalente o multiespecífica como se describe aquí puede presentar mejoras en una o más de estas propiedades. Además, el anticuerpo parental puede carecer de cualquiera de una o más de estas propiedades, pero puede estar dotado con ellas cuando se construyen como una proteína de unión multivalente como se describe aquí.
En otra modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de acción (Kon) para uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102M'1s'1 ; por lo menos aproximadamente 103M"1s"1; por lo menos aproximadamente 10 M'1s"1; por lo menos aproximadamente 105M'1 S"1 ; y por lo menos aproximadamente 106M4S "1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial. En otra modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de acción (Kon) para uno o más objetivos de entre 102IW S'1 y 103M"1 S"1 ; entre 103M-1S-1 y 104M-1S"1; entre 104M-1S"1 y 105M- S"1 ; o entre 105IW1S"1 y 10eM"1S"\ según medido a través de resonancia de plasmón superficial.
En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de velocidad sin acción (Koff) para uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente lO^s"1; por lo menos aproximadamente 10'4s"1; por lo menos aproximadamente 10'5s"1; y por lo menos aproximadamente 10"6s"1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad sin acción (Koff) para uno o más objetivos de 10'3s"1 a 1CrV1; de 1(rV1 a 10"5s"1; o de ICrV1 a 10'V1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial.
En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: a lo mucho 10"7M; a lo mucho 10'8M; a lo mucho 10"9M; a lo mucho 10"10M; a lo mucho 10"1 M; a lo mucho 10"12M; y a lo mucho 10' 3M. En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para sus objetivos de 10"7 M a 10"8 M; de 10-8 M a 1 O"9 M ; de 1 O"9 M a 10"10 M; de 1CT10 a 10"11 M; de 10"11 M a 10-12 M; o de 1CT12 a M 1(G13 M.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí es un conjugado que además comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de una molécula de inmunoadhesión, un agente formador de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. En una modalidad, el agente formador de imagen se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bio-luminiscente, una etiqueta magnética, y biotina. En otra modalidad, el agente formador de imagen es una radioetiqueta seleccionada del grupo que consiste de: 3H, 4C, 35S, 90Y, "Te, 11 ?, 251, 131l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. En otra modalidad más, el agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un a nt i -metabolito, un agente de alquilación, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí es una proteína de unión cristalizada y existe como un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de vehículo. En otra modalidad más, la proteína de unión cristalizada tiene una vida media mayor, in vivo, que la contraparte soluble de dicha proteína de unión. En otra modalidad adicional, la proteína de unión cristalizada retiene la actividad biológica.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí está glicosilada. Por ejemplo, la glicosilación es un patrón de glicosilación humano.
Un aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las proteínas de unión descritas aquí. Una modalidad más proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado descrito aquí, en donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste de pcADN; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT con sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ. En una modalidad, el vector es un vector descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 61/021,282.
En un aspecto una célula huésped es transformada con el vector descrito aquí. En una modalidad, la célula huésped es una célula procariótica . En otra modalidad, la célula huésped es E. coli. En una modalidad relacionada, la célula huésped es una célula eucariótica. En otra modalidad, la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste de una célula protista, célula animal, célula vegetal, y célula fúngica. En otra modalidad más, la célula huésped es una célula de mamífero que incluye, pero no se limita a, CHO, COS; NSO, SP2, PER.C6 o una célula fúngica tal como Saccahoromyces cerevisiae; o una célula de insecto tal como Sf9.
En una modalidad, dos o más DVD-lgs, por ejemplo, con diferentes especificidades, se producen en una célula huésped recombinante individual. Por ejemplo, la expresión de una mezcla de anticuerpos ha sido denominada Oligoclonics™ (Merus B.V., Holanda) Patentes de E.U.A. Nos. 7,262,028; 7,429,486.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir una proteína de unión descrita aquí, que comprende cultivar cualquiera de las células huésped también descritas aquí en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión. En una modalidad, un 50%-75% de la proteína de unión producida mediante este método es una proteína de unión tetravalente específica doble. En una modalidad particular, un 75%- 90% de la proteína de unión producida mediante este método es una proteína de unión tetravalente específica doble. En una modalidad particular, un 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica doble.
Una modalidad proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión, en donde la composición comprende una formulación que a su vez comprende una proteína de unión cristalizada, como se describe aquí, y un ingrediente, y por lo menos un vehículo polimérico. Por ejemplo, el vehículo polímérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste de: ácido poli (acrilico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anhídridos), poli (depsipéptido), poli (ésteres), ácido poli ( láctico), • ácido poli (láctico-co-glicólico) o PLGA, poli (b-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etilen glicol), poli ( ( i d r o x i p r o p i I ) metacrilamida, poli [(órgano)fosfazeno], poli (orto ésteres), alcohol poli (vinilico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-alquil vinil éter, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicamonoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos, por ejemplo, el ingrediente se selecciona del grupo que consiste de albúmina, sacarosa, trehalosa,' lactitol, gelatina, hidroxipropil-ß- ciclodextrina, metoxipolietilen glicol y polietilen glicol. Otra modalidad proporciona un método para tratar a un mamífero, que comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición descrita aquí.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión, como se describe aquí, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad más, la composición farmacéutica comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno. Por ejemplo, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste de: un agente terapéutico, un agente formador de imagen, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis (incluyendo, pero no limitándose a un anticuerpo anti-VEGF o una VEGF-trampa), un inhibidor de cinasa (incluyendo, pero no limitándose a KDR y un inhibidor de TIE-2), un bloqueador de molécula de co-estimulación (incluyendo, pero no limitándose a anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-lg, anti-CD20), un bloqueador de molécula de adhesión (incluyendo, pero no limitándose a un anticuerpo anti-LFA-1, un anticuerpo anti-E/L selectina, un inhibidor de molécula pequeña), y un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo (incluyendo, pero no limitándose a anticuerpo de receptor anti-IL-18, anti-TNF, y anti-IL-6/citocina), metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, una etiqueta o reportero detectable, un antagonista de TNF, un antireumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-psoriático, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una ¡nmunoglobuMna, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radio-farmacéutico, un antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar a un ser humano que padece de un trastorno en donde el objetivo, u objetivos, capaces de unirse mediante la proteína de unión descrita aquí, es dañino, que comprende administrar al ser humano una proteína de unión descrita aquí de manera que la actividad del objetivo, u objetivos en el ser humano es inhibida y uno de los muchos síntomas es mitigado o el tratamiento es logrado. Por ejemplo, el trastorno se selecciona del grupo que comprende artritis, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloatropatia, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, falla cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poiiglandular esporádica de tipo I y deficiencia poiiglandular de tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria en adultos (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerativa, sinovitis enteropática , clamidia, yersinia y artropatía asociada con salmonella, espondiloartropatia, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgaris, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis mialgica/enfermedad Libre de Royal, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial pos-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con la enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemasiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis de radiación, bronquiolitis obliteran, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar de infiltración linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial pos-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-KLM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órgano, osteoartritis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los sub-tipos), oftalmía sinpatética, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trom bocítopenia idiopática, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixidema primario, uveitis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda, vitíligo, enfermedades crónicas del hígado, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colecistitis, enfermedad del hígado idiosincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococo del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoprotemia, Acrocianosís, procesos por parásitos o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloíde aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, falla renal aguda, adenocarcinoma, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de alfa-1 -anti-tripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración celular de cuerno anterior, terapia anti-cd3, síndrome anti-fosfolípido, reacciones de hipersensibilidad de anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterieesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o paroxismal), trepidación auricular, bloque atrioventricular, línfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloque de ramificación de grupo, linfoma de Burkitt, quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de atrofia cardiaca, tumores cardiacos, cardiomíopatía , respuesta de inflamación de derivación cardiopulmonar, rechazo de( trasplante de cartílago, degeneraciones corticales de cerebelo, trastornos de cerebelo, taquicardia atrial caótica o de foco múltiple, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por s a I i c i I ato , carcinoma colorectal, falla cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonar, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt- Jakob, sepsis negativa de cultivo, fibrosís quística, trastornos asociados con terapia de citocina, demencia pugilística, enfermedades desmielizantes, fiebre hemorrágíca por dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad del cuerpo de Lewy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad media, trastornos del movimiento inducidos por fármacos, que bloquean los receptores de dopamina del sistema nervioso central (CNS), sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus de Epstein-barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena de gas, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis gram negativa, sepsis gram positiva, granulomas debido organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénico trombolítico, hemorragia, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infección por VIH/ neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hipercinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimiento hipocinéticos, evaluación hipotalámica-pituitaria-eje adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema cortiespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfederma, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas, migraña, dolor de cabeza, trastorno de sistema múltiple mitocondrial, enfermedad de tejido conectivo mixta, gamopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, micobacterium aviar intracelular, tuberculosis por micobacteria, síndrome mielodiplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos al miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica , linfoma de no Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos reversibles se vasectomía, órganomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/ hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenial, enfermedad pericardial, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumocitis, neumonía carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatia, órganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonal, y síndrome de cambios de piel), síndrome de pos-perfusión, síndrome de pos-bomba, síndrome de cardiotomía pos-MI, preclampsia, parálisis progresiva de supra-núcleo, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia QRS estrecha regular, hipertensión reno-vascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderm a , corea senil, demencia senil de tipo de cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, apoplejía, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espino-cerebelares, miositis por estreptococo, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante, sub-aguda, sincope, sífilis del sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o FAB, telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemaf agocítico asociado vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff , enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, poliradiculoneuropatía desmielizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still en adultos, alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplástica, arterioesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida del oído autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquioectais, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celiaca, espondilitis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de inicio en niños, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis , dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapsos de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endocarditis, endometriosis , endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por I g E , anemia hemolítica inmune, miositís corporal de oclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, reticulares livedo, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus bechterev, trastornos neuronal motriz, penfigoide de membrana mucosa, falla orgánica múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis de no A y no B, neuritis óptica, osteolisis, cáncer de ovario, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad de arteria periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, poliomiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome de pos-bombeo, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis recurrente óptica, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, safo (sinovitis, acné, pus t ulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, ataque pulmonar, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada con silicón, dermatosis de sneddon-wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria, sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrolisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (receptor de factor de necrosis tumoral), reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, curación de heridas, artropatía asociada con yersinia y salmonella.
En una modalidad, las enfermedades pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres primarios y metastáticos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y ductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñon, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cérvix, útero, y ovarios, así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de célula germinal), glándulas endocrinas (incluyendo la tiroides, glándulas adrenales y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellos que surgen de huesos y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y meninges, (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwanomas, y meningiomas), tumores sólidos que surgen de malignidades hematopoyéticas tales como leucemias, y linfomas' (tanto linfomas de Hodgkin como de no Hodgkin).
En una modalidad, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos aquí ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que sufre de un trastorno, que comprende el paso de administrar cualquiera de una de las proteínas de unión descritas aquí antes, concurrente, o después de la administración de un segundo agente, como se discute aquí. En una modalidad particular, el segundo agente se selecciona del grupo que consiste de budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas de receptor de IL-1, mAbs anti-l L- 1 ß, mAbs de receptor anti-IL-6 o IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, ibuprofeno, corticoesteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de enzima de conversión de IL-?ß, inhibidores de enzima de conversión de TNFcc, inhibidores de célula T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles, receptor p55 TNF soluble, receptor p75 TNF soluble, slL-1RI, s I L - 1 R 11 , slL-6R, citocinas anti-inflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11 , IL-13 y TGF3.
En una modalidad particular, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran al paciente a través de por lo menos un modo seleccionado de administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-articu lar, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intra-cerebrovascular, ¡ntra-cólica, ¡ntracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardio, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intra pleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-rectal, intra-renal, intra-retinal, intraespinal, intrasinovial, intratoráxica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmica.
Un aspecto de la invención proporciona por lo menos un anticuerpo anti-idiotípico para por lo menos una proteína de unión de la presente invención. El anticuerpo anti-idiotípico incluye cualquier proteína o péptido conteniendo una molécula que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina tal como, pero no limitándose a, por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando del mismo, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de estructura de trabajo, o cualquier porción del mismo, que se puede incorporar en una proteína de unión de la presente invención.
La invención proporciona un método para mejorar una característica de la proteína de unión, que comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (a) alterar la longitud y/o secuencia de (X1)i de la cadena pesada y/o ligera proporcionando así una cadena pesada y/o ligera alterada; y (b) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas. La invención también proporciona un método para mejorar una característica de la unión, que comprende los pasos de: (a) determinar a característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar las primera y segunda cadenas de polipéptido de manera que VD 1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2) n se cambia a VD2-(X1 )n-VD 1 -C-(X2)n, proporcionando de esta manera cadenas pesada y ligera alteradas; y (c) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar una característica de la proteína de unión, que comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar las primera y/o segunda cadenas de polipéptido de manera que la secuencia solo de uno de VD1 o VD2 de la cadena pesada y/o ligera se cambia; y (c) determinar la característica de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas. En una modalidad, la característica se selecciona del grupo que consiste de unión al antígeno objetivo, producción de expresión de célula huésped, vida media in vitro, vida media en vivo, estabilidad, solubilidad, y función de efector mejorada. En otra modalidad, la longitud de (X1 ) i de la cadena pesada alterada se incrementa. En otra modalidad, la longitud de (X1 ) i de la cadena pesada alterada se reduce. En otra modalidad, la longitud de (X1 ) i de la cadena ligera alterada se incrementa. En otra modalidad, la longitud de (X1 ) i de la cadena ligera alterada se reduce. En otra modalidad, (X1) i de la cadena pesada alterada comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 21 ó 22. En otra modalidad, (X1 ) i de la cadena ligera alterada comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 13 ó 14. En otra modalidad, (X1 ) i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 22 y (X 1 ) 1 de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 14. En otra modalidad, (X1) i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 21 y (?1 )? de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 14. En otra modalidad, (X1 ) i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 22 y (?1 )? de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 13. En otra modalidad, (X1 ) i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 21 y (X1 ) i de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 13.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1A es una representación esquemática de construcciones de Dominio Variable Doble (DVD)-lg y muestra la estrategia para la generación de una DVD-lg de dos anticuerpos parentales; La Figura 1B es una representación de construcciones DVD1-lg, DVD2-lg, y dos anticuerpos mono-específicos quiméricos de clones de hibridoma 2D13.E3 (anti-IL-1a) y 13F5.G5 (anti- IL-?ß).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y/o multiespecíficas capaces de unir dos o más antígenos. Específicamente, la invención se refiere a ¡nmunoglobulinas de dominio variable (DVD-lg), y composiciones farmacéuticas de las mismas, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped tales como DVD-Igs. También esta invención contempla métodos para utilizar las DVD-Igs de la invención para detectar antígenos específicos, ya sea in vitro o in vivo.
A menos que se defina aquí de otra manera, los términos científicos y químicos utilizados con relación a la presente invención deben tener los significados que son comúnmente entendidos por aquellos expertos en la técnica. El significado y alcance de los términos deben ser claros, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones provistas aquí toman precedente sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, a menos que se requiera lo contrario por contexto, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir los singulares. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se establezca otra cosa. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que específicamente se establezca lo contrario.
En general, las nomenclaturas utilizadas con relación a, y técnicas de, cultivo celular u de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología y química de proteína y ácido nucleico e hibridación, descritas aquí, son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en el campo. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a través de la presente especificación a menos que se indique de otra manera. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como comúnmente se logra en la técnica o como se describe aquí. Las nomenclaturas utilizadas con relación a, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas aquí, son aquellas bien conocidas y comúnmente conocidas en la técnica. Se utilizan técnicas estándares para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes.
Para entender la presente invención más fácilmente, los términos seleccionados se definen a continuación.
El término "polipéptido" como se utiliza aquí, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Se entiende que el uso de "polipéptido" aquí abarca polipéptidos y fragmentos y variantes (incluyendo fragmentos y variantes) del mismo, a menos que se indique lo contrario por contexto. Para un polipéptido antigénico, un fragmento de polipéptido opcionalmente incluye por lo menos un epítopo continuo o no lineal de polipéptido. Los límites precisos de por lo menos un fragmento de epítopo pueden ser confirmados utilizando experiencia ordinaria en la técnica. El fragmento comprende por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, tales como aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, por lo menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, o por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una variante de · polipéptido es como se describe aquí.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado nativo; está substancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; se expresa por una célula de una especie diferente; o no ocurre por naturaleza. De esta manera, un polipéptido que está químicamente sintetizado o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula a partir de la cual se origina naturalmente debe ser "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína también puede ser presentada substancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en el campo.
El término "recuperación" como se utiliza aquí, se refiere al procedimiento de presentar una especie química tal como un polipéptido substancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en el campo.
"Actividad biológica" como se utiliza aquí, se refiere a cualquiera de una o más propiedades biológicas inherentes de una molécula (si está naturalmente presente como se encuentra in vivo, o provista o habilitada por medios recombinantes). Las propiedades biológicas incluye, pero no se limitan a, receptor de unión; inducción de proliferación de célula, inhibición de crecimiento de célula, inducciones de otras citocinas, inducción de apoptosis, y actividad enzimática. La actividad biológica también incluye la actividad de una molécula de Ig .
Los términos "unión específica" o "específicamente uniendo", como se utiliza aquí, con referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epitopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para un epitopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epitopo A (o libre, A no marcado), en una reacción conteniendo "A" marcado u el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
El término "anticuerpo", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier molécula de ¡nmunoglobulina (Ig) compuesta de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivado del mismo, que retiene las características de unión esencial del epitopo de una molécula Ig. Dicho mutante, variante, o formatos de anticuerpo derivado son conocidos en la técnica. Más adelante se discuten modalidades no limitantes de esto.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviado aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR o VL) y una reglón constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL además pueden ser subdlvididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura de trabajo (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el término amino hacia el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo de clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), o subclase (por ejemplo, IgG 1, lgG2, IgG 3, lgG4, lgA1 e lgA2).
El término "región Fe" se utiliza para definir la región C-termínal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que puede ser generada a través de digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. La región Fe de una inmunoglobulina en general comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende dominio CH4. Son conocidos los reemplazos de residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora de anticuerpo (Winter, et al, Patentes de E.U.A. Nos. 5,648,260 y 5,624,821). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, la inducción de citocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y vida media/velocidad de eliminación del anticuerpo y complejos de antigeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para anticuerpo terapéutico pero en otros casos pueden ser innecesarias o aún dañinas, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertas isotipos de IgG, particularmente I g G 1 e lgG3, median ADCC y CDC a través de la unión a FCyRs y C1q de complemento, respectivamente. Los receptores de Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media en circulación de I os anticuerpos. En otra modalidad, por lo menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región Fe del anticuerpo, de manera que las funciones efectoras del anticuerpo se alteran. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de los dominios CH3 y se estabiliza a través de enlaces de disulfuro dentro de la región de gozne (Huber, et al. Nature; 264: 415-20; Thies, et al. 1999 J Mol Biol; 293: 67-79). La mutación de residuos de cisteína dentro de las regiones de gozne p ara evitar enlaces de disulfuro de cadena pesada-cadena pesada desestabilizará la dimerización de los dominios CH3. Se han identificado residuos responsables para la dimerización, de CH3 (Dall'Aqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73). Por lo tanto, es posible generar una Ig media monovalente. De manera interesante, estas moléculas de Ig media monovalente se han encontrado por naturaleza paras las subclases de IgG como de I g A (Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70; Biewenga, et al, 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400). La estequiometría de la región Fe de FcRn:lg se ha determinado como 2:1 (West, et al, 2000 Biochemistry 39: 9698-708), y la Fe media es suficiente para mediar la unión de FcRn (Kim, et al, 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548). Las mutaciones para interrumpir la dimerización del dominio CH3 pueden no tener mayor efecto adverso sobre su unión de FcRn ya que los residuos importantes para la dimerización de CH3 están localizados en la superficie colindante interna de la estructura de la lámina de CH3 b, mientras que la región responsable para la unión de FcRn está ubicada en la superficie colindante externa de los dominios CH2-CH3. Sin embargo, la molécula Ig media puede tener cierta ventaja en la penetración de tejido debido a su tamaño más pequeño que el de un anticuerpo regular. En una modalidad, por lo menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante de la proteína de unión de la invención, por ejemplo, la región Fe, de manera que la dimerización de las cadenas pesadas es interrumpida, dando como resultado moléculas de Ig media DVD. La actividad anti-inflamatoria de IgG es completamente dependiente de la sialilación del glicano N- enlazado del fragmento IgG Fe. Los requerimientos precisos del glicano para la actividad anti-inflamatoria han sido determinados, de manera que un fragmento lgG1 Fe apropiado puede ser creado, generando así una I g G 1 Fe completamente recombinante, sialilado con potencia enormemente mejorada (Anthony, R.M. et al. (2008) Science 320:373-376).
El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se utiliza aquí, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la habilidad de unirse e specíf icamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser realizada a través de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos biespecíficos, específicos dobles, o multi-específicos; uniéndose específicamente a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen, (¡) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab enlazados a través de un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward, et al, (1989), Nature 341 : 544-546, Winter, et al, publicación de PCT WO 90/05144 A1, incorporada aquí para referencia), que comprende un dominio individual variable; y (vi) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento de Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, éstos pueden ser unidos utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena de proteína individual en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); ver, Bird, et al, (1988) Science 242: 423-426; Huston, et al, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85.: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena individual también pretenden ser abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se consideran otras formas de anticuerpos de cadena individual, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en donde los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptido individual, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios de complementariedad de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P. et al, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9_0: 6444-6448; Poljak, R.J., et al, (1994) Structure 2: 1121-1123). Dichas porciones de unión a anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Enqineering (2001) S pringer-Verlag , Nueva York, 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). Además, los anticuerpos de cadena individual también incluyen "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos de Fv en tándem (VH-CH1-CH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata, et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062); y Patente de E.U.A. No. 5,641 ,870).
El término "proteína de unión multivalente" se utiliza a través de esta especificación para denotar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión multivalente se diseña por ingeniería para tener los tres o más sitios de unión a antígeno, y en general no es un anticuerpo de existencia natural. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión capaz de unir dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas de unión de dominio variable doble (DVD) de la invención comprenden dos ó más sitios de unión a antígeno y son proteína de unión tetravalentes o multivalentes. Los DVDs pueden ser monoespecíf icos, es decir, capaces de unir un antígeno, o multiespecíficos, es decir, capaces de unir dos o más antígenos. Las proteínas de unión de DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera son denominadas como DVD-lg. Cada mitad de una DVD-lg comprende un polipéptido de DVD de cadena pesada, y un polipéptido de DVD de cadena ligera, y dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDRs involucradas en la unión a antígeno por sitio de unión a antígeno.
El término "anticuerpo biespecífico", como se utiliza aquí, se refiere a anticuerpos de longitud completa que son generados mediante la tecnología de cuadroma (ver, Milstein, C. y A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934); p. 537-40), a través de conjugación química de dos diferentes anticuerpos monoclonales (ver, Staerz, U.D., et al, Nature, 1985. 314(6012), o a través de perilla en el agujero o aspectos similares que introducen mutaciones en la región de Fe (Ver, Holliger, P., T. Prospero, y G. Winter, Proc Nati Acad Sci USA, 1993. 90(14): p. 6444-8.18), dando como resultado múltiples diferentes especies de inmunoglobulina, de las cuales solo una es el anticuerpo biespecífico funcional. A través de función molecular, un anticuerpo biespecífico une un antígeno (o epítopo) en uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC), y une un diferente antigeno (o epítopo) en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). A través de esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos distintos brazos de unión a antígeno (tanto en especificidad como secuencias de CDR), y es monovalente para cada antígeno al que se une.
El término "anticuerpo doble-específico", como se utiliza aquí, se refiere a anticuerpos de longitud completa que pueden unir dos diferentes antígenos (o epítopos) en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (ver, publicación de PCT WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión doble-específica tiene dos brazos de unión a antígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al que se une.
Un "sitio de unión a antígeno funcional" de una proteína de unión es uno que es capaz de unir un antígeno objetivo. La afinidad de unión a antígeno del sitio de unión a antígeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo parental, a partir del cual se deriva el sitio de unión a antígeno, pero la habilidad de unir el antígeno debe ser medióle utilizando cualquiera de uno de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de anticuerpo a un antígeno. Además, la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multivalente aquí no necesita ser cuantitativamente la misma.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de célula, las cuales actúan sobre otra población de célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citocínas son linfocinas, monocinas, y hormonas de polipéptido tradicionales. Entre las citocinas se incluyen la hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana de N-metionilo, y hormona de crecimiento de bovino; hormona de paratiroídes; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante de folículo (FSH), hormona estimulante tiroidea (TSH), y hormona luteinlzante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor- alfa y beta de necrosis tumoral; substancia de inhibición de mulleriano; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervios tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaqueta; factor de crecimiento de placenta, factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor-1 y -11 de crecimiento de tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivo; interferones tales como interferón-alfa, -beta y -gama, factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como macróf ago-CS F (M-CSF); granulocito-macrófago.CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y el ligando kit (KL). Como se utiliza aquí, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de un cultivo de célula recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El término "enlazador" se utiliza para denotar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácido unidos a través de enlaces de péptido y se utilizan para enlazar una o más porciones de unión a antígeno. Dichos polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, RJ., et al. (1994) Structure 2.:1121- 123) Los enlazadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEC ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP (SEC ID NO: 5); RADAAP (SEC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID NO: 8); RADAAAA(G4S) (SEC ID NO: 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 10); ADAAP (SEC ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID NO: 25); G H EAAAVMQ Q YPAS (SEC ID NO: 26).
Un "dominio constante de inmunoglobulina" se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. En la técnica son conocidas las secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG humana.
El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb", como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de existencia natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un antígeno individual. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb es dirigido contra un determinante individual en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe ser construido como requiriendo la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular.
El término "anticuerpo humano", como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención incluyen residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o de sitio específico ¡n vitro o a través de mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDRs, y en particular, CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se utiliza aquí, no pretende incluir anticuerpos en donde secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura de marco humanas.
El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula huésped (descrito además en la Sección II C, más adelante), anticuerpos aislados de una colección de anticuerpo humano de combinación (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. y Green L.L. (2002) Current Opinión in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante otros medios que involucran la división de secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpo recombinantes son secuencias que, mientras se deriven de y estén relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humanas, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germina de anticuerpo humano, in vivo.
Un anticuerpo "maduro de afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de sus CDRs, que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparado con un anticuerpo parental que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos maduros de afinidad ilustrativos tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos maduros de afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks, et al, Bid 1 Technology 10:779-783 (1992) describe maduración de afinidad mediante entremezclado de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura de marco se describe por: Barbas, et al, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147- 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol 226:889-896 (1992) y mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva, posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido de mejora de actividad como se describe en la Patente de E.U.A. US 6914128B1.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias constantes de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de murino enlazadas a regiones constantes humanas.
El término "anticuerpo injertado-CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias variables de cadena pesada y ligera de una especie pero en donde las secuencias de una o más de las regiones de CDR de VH y/o VL son reemplazadas con secuencias de CDR de otra especie, tales como anticuerpos teniendo regiones variables de cadena pesada y ligera de murino en donde una o más de las CDRs de murino (por ejemplo, CDR3) ha sido reemplazada con secuencias de CDR humanas.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón), pero en donde por lo menos una porción de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada a una apariencia "de tipo humano", es decir, más similar a secuencias variables de linea germinal humanas. Un tipo de anticuerpo humanizado en un anticuerpo injertado con CDR, en donde se introducen secuencias de CDR humanas en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias de CDR no humanas correspondientes. También "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno de interés y que comprende una región de estructura de marco (FR) teniendo substancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo humano y una región de determinación de complementariedad (CDR) teniendo substancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo no humano. Como se utiliza áqui, el término "substancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR teniendo una secuencia de aminoácido por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende substancialmente todos de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) en donde todas o substancialmente todas las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o substancialmente todas las regiones de estructura de marco son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también incluye las regiones CH1, de gozne, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.
Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "marcación de Kabat" se utilizan intercambiablemente aquí. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido, los cuales son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de los mismos (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.
Como se utiliza aquí, el término "CDR" se refiere a la región de determinación de com plementa riedad dentro de secuencias variables de anticuerpo. Existen tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las cuales se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "grupo CDR", como se utiliza aquí, se refiere a un grupo de tres CDRs que ocurren en una región variable individual capaz de unir el antígeno. Los límites exactos de estas CDRs han sido definidos en forma diferente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuo no ambiguo aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, pero también proporciona límites precisos de residuo definiendo las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser denominadas como CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) encontraron que ciertas sub-porciones dentro de las CDRs de Kabat adoptan conformaciones de estructura de base de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácido. Estas sub-porciones se designaron como L 1 , L2 y l_3 ó H1, H2 y H3, en donde "L" y "H" designan las regiones de cadena ligera y de cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser denominadas como las CDRs de Chothia, las cuales tienen límites que traslapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen CDRs que traslapan con las CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 ( 1996)) . O tras definiciones más de límite de CDR pueden no estrictamente seguir uno de los sistemas de la presente, pero traslaparán con las CDRs de Kabat, aunque pueden ser acortados o alargados en vista de la predicción o hallazgos experimentales que los residuos o grupos de residuos particulares o aún CDRs completas no impactan significativamente la unión a antígeno. Los métodos utilizados en la presente pueden utilizar CDRs definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilizan las CDRs definidas por Kabat o Chothia.
Como se utiliza aquí, el término "estructura de marco" o "secuencia de estructura de marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDRs. Ya que la exacta definición de una secuencia de CDR puede ser determinada por diferentes sistemas, el significado de una secuencia de estructura de marco es sometido a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1, -L2, y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de estructura de marco en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde la CDR1 está colocada entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de estructura de marco, como las denominadas por otras, representa las FRs combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina de existencia natural, individual. Como se utiliza aquí, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y las FRs representan dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de estructura de marco.
Como se utiliza aquí, el término "gen de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce a re- disposición genética y mutación para la expresión de una ¡nmunoglobulina particular. (Ver, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Una de las ventajas provistas por varias modalidades de la presente invención se basa en el reconocimiento que los genes de anticuerpo de línea germinal son probablemente más que los genes de anticuerpo maduros para conservar estructuras de secuencia de aminoácido esenciales características de individuos en las especies, por lo que menos probablemente serán reconocidas como de una fuente extraña cuando se usan terapéuticamente en esa especie.
Como se utiliza aquí, el término "neutralizar" se refiere a contrarrestar la actividad biológica de un antígeno cuando una proteína de unión específicamente une el antígeno. En una modalidad, la proteína de unión de neutralización une la citocina y reduce su actividad biológica por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ó más.
El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad de unión y la afinidad de una D.VD-lg para dos o más antígenos.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unión específica a una ¡nmunoglobulina o receptor de célula T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupaciones de moléculas de , superficie químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características tridimensionales específicas, y/o características de carga especificas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida a través de un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo une específicamente un antígeno cuando reconoce su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que los anticuerpos "se unen al mismo epítopo" si los anticuerpos compiten de manera cruzada (uno evita la unión o efecto modulador del otro). Además, las definiciones estructurales de epítopos (traslape, similar, idéntico) son informativas, pero las definiciones funcionales por lo general son más relevantes ya que abarcar parámetros estructurales (unión) y funcionales (modulación, competencia).
El término "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza aquí, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real a través de la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de bio-sensor, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore® (BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecía y Piscataway, NJ). Para más descripciones, ver Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
El término "Kon", como se utiliza aquí, se refiere a la constante de velocidad de activación para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno para formar, por ejemplo, el complejo de anticuerpo/antígeno como es conocido en la técnica. El término "Kon" también es conocido por los términos "constante de velocidad de asociación", o "ka", ya que se usa intercambiablemente aquí. Este valor que indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y un antígeno también se muestra por la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag") ?? Ab-Ag.
El término " Koff" , como se utiliza aquí, se refiere a la constante de velocidad sin acción para la disociación, o "constante de velocidad de disociación", de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) del, por ejemplo, complejo de anticuerpo/antígeno como es conocido en la técnica. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo a partir de su antígeno objetivo o separación del complejo Ab-Ag con el tiempo en el anticuerpo libre y el antigeno como se muestra por la siguiente ecuación: Ab + Ag «-«- Ab-Ag.
El término "KD", como se utiliza aquí, se refiere a la "constante de disociación de equilibrio", y se refiere al valor obtenido en una medición de titulación en equilibrio, o dividiendo la constante de velocidad de disociación (koff) entre la constante de velocidad de asociación (kon)- La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación, y la constante de disociación de equilibrio se utilizan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. En la técnica son bien conocidos los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y de disociación. La utilización de técnicas a base de fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la habilidad de examinar muestras en reguladores de pH fisiológicos en equilibrio. Otros aspectos experimentales e instrumentos tales como el ensayo BIAcore® (análisis de interacción bio-molecular) pueden ser utilizados (por ejemplo, el instrumento disponible de BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Además, también se puede utilizar un ensayo KinExA® (Kjnetic Exclusión Assay), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
"Etiqueta" y "etiqueta detectable" significan una porción unida a un patrón de unión específico, tal como un anticuerpo o analito, por ejemplo, para presentar la reacción entre miembros de un par de unión específico, tal como un anticuerpo y un analito, detectable, y el patrón de unión específico, por ejemplo, anticuerpo o analito, así marcado o etiquetado es denominado como "detectablemente etiquetado". De esta manera, el término "proteína de unión etiquetada" como se usa aquí, se refiere a una proteína con una etiqueta incorporada que proporciona la identificación de la proteína de unión. En una modalidad, la etiqueta es una marcador detectable que puede producir una señal que es detectable mediante medios visuales o instrumentales, por ejemplo, la incorporación de una aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que pueden ser detectadas a través de avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada a través de métodos ópticos y colorimétricos). Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 1 ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, o 153Sm); cromógenos, etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos de biotinilo; epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítopo); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. Ejemplos representati os de etiquetas comúnmente empleadas para inmunoensayos incluyen porciones que produce luz, por ejemplo, compuestos de acridinio, y porciones que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. Otras etiquetas se describen aquí. A este respecto, la misma porción puede no se detectablemente marcada o etiquetada, pero puede hacerse detectable después de la reacción con otra porción. El uso de "detectablemente etiquetado" pretende abarcar el último tipo de marcación o etiquetación detectable.
El término "conjugado" se refiere a una proteína de unión, tal como un anticuerpo, químicamente unida a una segunda porción química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. En una modalidad, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, toxina pertussis, taxol, citocalasin B, gramicidina D, etidio, bromuro, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Cuando se emplean en el contexto de un inmunoensayo, el anticuerpo de conjugado puede ser un anticuerpo detectablemente marcado o etiquetado utilizado como el anticuerpo de detección.
Los términos "cristal" y "cristalizado" como se utiliza aquí, se refieren a una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo), o porción de unión a antígeno del mismo, que existe en la forma de cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de materia, la cual es distinta a otras formas tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalina líquido. Los cristales están compuestos de disposiciones de átomos tridimensionales, de repetición, regulares, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos de antígeno/anticuerpo). Estas disposiciones tridimensionales están dispuestas de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que son bien entendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denomina la unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que se conforma a una simetría cristalográfica bien definida proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria por traducciones regulares en todas las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver, Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1- 16, Oxford Uníversity Press, New York, New York, (1999).
El término "polinucleótido" se refiere a una forma poiimérica de dos o más nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de estructura de cadena individual o doble.
El término "polinucleótido aislado" debe referirse a un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, ADNc, o sintético, o alguna combinación de los mismos) que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra por naturaleza; está operablemente enlazado a un polinucleótido que no está enlazado a por naturaleza; o no ocurre por naturaleza como parte de una secuencia más grande.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de estructura de cadena doble circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en donde se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de vectores de replicación y episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de la introducción a la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente enlazados. Dichos vectores son denominados aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombi na ntes están por lo regular en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser utilizados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus asociados con adeno), los cuales sirven para funciones equivalentes.
El término "operablemente enlazado(a)" se refiere a una yuxtaposición, en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcional en su forma pretendida. Una secuencia de control "operablemente enlazada" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "operablemente enlazadas" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan in trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión", como se utiliza aquí, se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y mejoradoras ; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de división y de poliadenilación; .secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de proteína; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de proteína. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen una secuencia promotora, de sitio de unión ribosomal, y de terminación de transcripción; en eucariontes, generalmente, dichas secuencias de control incluyen una secuencia promotora u de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias de patrón de fusión.
"Transformación" se refiere a cualquier procedimiento mediante el cual el ADN exógeno entra a una célula huésped. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando varios métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico extrañas en una célula huésped procariótica o eucariótica. El método se selecciona basándose en la célula huésped siendo transformada y puede incluir, pero no se limita a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Dichas células "transformadas" incluyen células establemente transformadas en donde el ADN insertado es capaz de replicación ya sea como un plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma huésped. También incluyen células que expresan de forma pasajera el ADN o ARN insertado durante períodos limitados de tiempo.
El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula en la cual se ha introducido el ADN exógeno. Se debe entender que dichos términos pretenden referirse no solo a la célula particular, sino que también a la progenie de dicha célula. Ya que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones siguientes debido a sus influencias de mutación o ambientales, dicha progenie, en realidad, no puede ser idéntica a la célula de origen o parental, pero siguen incluyéndose dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza aquí. En una modalidad, las células huésped incluyen células procarióticas y eucarióticas seleccionadas de cualquiera de los Reinos de la vida. En otra modalidad, las células eucarióticas incluyen, células protistas, fúngicas, vegetales y de animal. En otra modalidad, las células huésped incluyen, pero no se limitan a, la línea de célula procariótica E. Coli; líneas de célula de mamífero CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2, y PER.C6; la línea de célula de insecto Sf9¡ y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.
Se pueden utilizar técnicas estándares para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofeccíón). Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se ha logrado en la técnica o como se describe aquí. Las técnicas y procedimientos anteriores en general pueden realizarse de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describió en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a través de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), la cual se incorpora aquí para referencia para cualquier propósito.
"Organismo transgénico" , como es conocido en la técnica, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgen, en donde el transgen introducido en el organismo (o un ancestro del organismo) expresa un polipéptido no naturalmente expresado en el organismo. Un "transgen" es una construcción de ADN, la cual está estable y operablemente integrada en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de célula o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" se utilizan intercambiablemente, y, tal como se utiliza aquí, se refiere a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina). La modulación puede ser un incremento o una reducción en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula de interés. Actividades y funciones ilustrativas de una molécula incluyen, pero no se limitan a, características de unión, actividad enzimática, activación de receptor de célula, y transducción de señal.
Correspondientemente, el término "modulador" es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina). Por ejemplo, un modulador puede ocasionar un incremento o reducción en la magnitud de cierta actividad o función de una molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un modulador es un inhibidor, el cual reduce la magnitud de por lo menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 01/83525.
El término "agonista" se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, ocasiona un incremento en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Los agonistas de interés particulares pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula que se une al a n t í g e n o .
El término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés ocasiona una reducción en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas de interés particulares incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica del antígeno. Los antagonistas e inhibidores de antígenos pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula, la cual se une al antígeno.
Como se utiliza aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia que sea suficiente para reducir o mitigar la severidad y/o duración de un trastorno o uno o más de sus síntomas, evitar el avance de un trastorno, ocasionar una regresión de un trastorno, evitar la recurrencia, desarrollo, inicio o progresión de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o mejorar o aliviar el efecto(s) profiláctico o terapéutico de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).
"Paciente" y "sujeto" pueden ser utilizados intercambiablemente aquí para referirse a un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (por ejemplo, un ser humano, un mono, y un chimpancé), un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón, una ballena), un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), y un tiburón. Preferiblemente, el paciente o sujeto es un ser humano, tal como un ser humano que se esté tratando o se le haya determinado una enfermedad, trastorno o condición, un ser humano en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición, un ser humano que tenga una enfermedad, trastorno o condición, y/o un ser humano que esté siendo tratado por una enfermedad, un trastorno o condición.
El término "muestra", como se utiliza aquí, se usa en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una substancia de una cosa viviente o una cosa anteriormente viviente. Dichas cosas vivientes incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos, y otros animales. Dichas substancias incluyen, pero no se limitan a, sangre (por ejemplo, sangre entera), plasma, suero, orina, fluido amniótico, fluido sinovial, células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órganos, tejidos, médula ósea, nodos linfáticos y bazo.
"Componente", "componentes", y "por lo menos un componente", se refieren generalmente a un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un contenedor, un regulador de pH, un diluyente, una sal, una enzima, un co-factor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un substrato (por ejemplo, como una solución), una solución de detención, y similares que pueden ser incluidos en un equipo para ensayo de una muestra de prueba, tal como la orina de un paciente, muestra de suero o plasma, de acuerdo con los métodos descritos aquí y otros métodos conocidos en la técnica. De esta manera, en el contexto de la presente descripción, "por lo menos un componente", "componente", y "componentes" pueden incluir un polipéptido u otro analito como antes, tal como una composición que comprende un analito tal como un polipéptido, el cual está opcionalmente inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como uniéndose a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti- polipéptido) . Algunos componentes pueden estar en solución o ser liofilizados para reconstitución para usarse en un ensayo.
"Control" se refiere a una composición conocida no un analito ("control negativo") o por contener un analito ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida de analito. "Control", "control positivo", y "calibrador" pueden utilizarse intercambiablemente aquí y se refieren a una composición que comprende una concentración conocida de analito. Un "control positivo" puede utilizarse para establecer características de funcionamiento de ensayo y es un indicador útil de la integridad de reactivos (por ejemplo, analitos).
"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren en general a un valor de corte de ensayo que se utiliza para determinar resultados de diagnóstico/pronóstico/terapéuticos comparando los resultados del ensayo contra el corte/nivel predeterminado, en donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido enlazado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, severidad de la enfermedad, progresión/no progresión/mejora, etc.). Aunque la presente descripción puede proporcionar niveles predeterminados ilustrativos, es bien conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, anticuerpos empleados, etc.). Además, está dentro de la experiencia ordinaria de un experto en la técnica adaptar la descripción de la presente para otros ¡nmunoensayos para obtener valores de corte específicos de inmunoensayo para aquellos otros ¡nmunoensayos basándose en esta descripción. Aunque el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variar entre los ensayos, en general deben ser aplicables las correlaciones como se describe aquí (si hay alguna).
"Reactivo de pre-tratamiento" , por ejemplo, lisis, precipitación y/o reactivo de solubilización, como se utiliza en un ensayo de diagnóstico como se describe aquí es uno que permite la lisis de las células y/o solubiliza cualquier analito que esté/estén presentes en una muestra de prueba. El pre-tratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe aquí. Entre otras cosas, la solubilización del analito (por ejemplo, polipéptido de interés) puede presentar la liberación del analito a partir de cualquier proteína de unión endógena presente en la muestra. Un reactivo de pre-tratamiento puede ser homogéneo (que no requiere de un paso de separación) o heterogéneo (que requiere de un paso de separación). Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogéneo, existe la remoción de cualquier proteína de unión de analito precipitada a partir de la muestra de prueba antes de proseguir al siguiente paso del ensayo.
"Reactivos de control de calidad" en el contexto de inmunoensayos y equipos descritos aquí, incluyen, pero no se limitan a, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "estándar" típicamente se utiliza (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) con el fin de establecer curvas de calibración (estándares) para la interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Alternativamente, se pueden utilizar un calibrador individual, el cual está cerca de un corte positivo/negativo predeterminado. Se pueden utilizar múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibradores) en conjunto para comprender un "panel de sensibilidad".
"Riesgo" se refiere a la posibilidad o probabilidad de un evento particular que ocurre ya sea en la actualidad o en algún punto en el futuro. "Estratificación de riesgo" se refiere a una disposición de factores de riesgo clínicos conocidos que permiten a los médicos clasificar pacientes en un riesgo, bajo, moderado, alto, o altísimo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición particular.
"Específ ico(a)" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre miembros de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un anticuerpo (o fragmento antigénicamente reactivo del mismo)) se refieren a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "específicamente se une a" y frases análogas se refiere a la habilidad de anticuerpos (o fragmentos antigénicamente reactivos de los mismos) a unirse específicamente a un analito (o fragmento del mismo) y no unirse específicamente a otras entidades.
"Patrón de unión específico" es un miembro de un par de unión específico. Un par de unión específico comprende dos diferentes moléculas, las cuales específicamente se unen entre sí a través de medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo de inmunoensayos comunes, otros pares específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lecitinas, secuencias de nucleótido complementarias, moléculas efectoras y de receptor. Co-factores y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, una analito-análogo. Los miembros de unión específicos inmunoreactivos incluye antígenos, fragmentos de antígeno, y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales así como complejos, fragmentos, y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de los mismos, ya sea aislados o recombinantemente producidos.
"Variante", como se utiliza aquí, representa un polipéptido que difiere de un polipéptido dado (por ejemplo, polipéptido de IL-18, BNP, NGAL o VIH o anticuerpo anti-polipéptido) en una secuencia de aminoácido mediante la adición (por ejemplo, inserción), eliminación, o substitución conservadora de aminoácidos, pero que retiene la actividad biológica del polipéptido dado (por ejemplo, una variante IL-18 puede competir con un anticuerpo anti-IL-18 para la unión a IL-18). Una substitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazando un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad y grado y distribución de regiones cargadas), es reconocida en la técnica como involucrando típicamente un cambio menor. Estos cambios menores pueden ser identificados, en parte, considerando el índice hidropático de aminoácidos, como es entendido en la técnica (ver, por ejemplo, Kyte et al , J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su carácter hidrofóbico y carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices similares hidropáticos pueden ser substituidos y seguir reteniendo la función de la proteína: en un aspecto, los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de +_2 son sustituidos. El carácter hidrofílico de los aminoácidos también puede ser utilizado para revelar substituciones que podrían dar como resultado proteínas que retengan la función biológica. Una consideración del carácter hidrofílico de aminoácidos en contexto de un péptido permite el cálculo del carácter hidrofílico promedio local mayor de ese péptido, una medida útil que ha sido reportada para correlacionarse bien con la antigenicidad e inmunogenicidad (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,554,101, la cual se incorpora aquí para referencia). La substitución de aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico similares puede dar como resultado péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo, inmunogenicidad, como es entendido en la técnica. En un aspecto, las substituciones son realizadas con aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico dentro de +2 entre sí. Tanto los índices de carácter hidrofílico como el valor del carácter hidrofílico de aminoácidos se ven influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las substituciones de aminoácido que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y en particular las cadenas laterales de esos aminoácidos, según revelado por el carácter hidrofóbico, el carácter hidrof ílico, carga, tamaño, y otras propiedades. "Variante" también se puede utilizar para describir un polipéptido o fragmento del mismo que ha sido diferencialmente procesado, tal como a través de proteólisis, fosforilación, u otra modificación de pos-traducción, aún retiene su actividad biológica o reactividad antigénica, por ejemplo, la habilidad para unirse a IL-18. El uso de "variante" aquí 'pretende abarcar fragmentos de una variante a menos que se diga otra cosa por el contexto.
I. Generación de proteína de unión DVD La invención se refiere a proteínas de unión de Dominio Variable Doble capaces de unir uno o más objetivos, y métodos para hacer las mismas. En una modalidad, la proteína de unión comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-c(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 ó 1. La proteína de unión de la invención puede ser generada utilizando varias técnicas. La invención proporciona vectores de expresión, células huésped y métodos para generar la proteína de unión.
A. Generación de anticuerpos monoclonales parenterales Los dominios variables de la proteína de unión DVD pueden ser obtenidos a partir de anticuerpo parenterales, incluyendo policlonales y mAbs capaces de unir antígenos de interés. Estos anticuerpos pueden ser de existencia natural o pueden ser generados a través de tecnología recombinante.
Se pueden preparar mAbs utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo incluyendo el uso de hibrídoma, tecnologías recombinantes, y de presentación de fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir mAbs utilizando técnicas de hibridoma, incluyendo aquellas conocidas en el campo y enseñadas en, por ejemplo, Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas referencias se incorporan aquí para referencia en sus totalidades). El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí, no está limitado a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon individual, incluyendo cualquier clon eucariótico, procarionte, o de fago, y no el método a través del cual se produce. Los hibridomas se seleccionan, se clona y además se clasifican para características deseables, incluyendo crecimiento de hibridoma robusto, alta producción de anticuerpo, y características de anticuerpo deseables, como se discute en el Ejemplo 1 más adelante. Los hibridomas pueden ser cultivados y expandidos in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmunológico, por ejemplo, ratones desnudos o pelones, o en cultivo de célula in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad particular, los hibridomas son hibridomas de ratón. En otra modalidad, los hibridomas son producidos en una especie no humana, no de ratón, tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en donde un mieloma de no secreción humano es fusionado a una célula humana expresando un anticuerpo capaz de unión un antígeno específico.
Los mAbs recombinantes también son generados a partir de linfocitos individuales, aislados, utilizando un procedimiento denominado en la técnica como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,627,052, Publicación de PCT WO 92/02551 y Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En este método, se identifican anticuerpos de interés de secreción de células individuales, por ejemplo, linfocitos derivados de un animal inmunizado, y, se rescatan ADNcs de región variables de cadena pesada y ligera de las células a través de transcriptasa inversa-PCR y estas regiones variables después pueden ser expresadas, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células huésped de mamífero, tales como células COS o CHO. Las células huésped transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificada, derivadas de linfocitos seleccionado in vivo, después pueden experimentar otro análisis y selección in vitro, por ejemplo, mediante una técnica de toma panorámica de las células transfectadas para aislar anticuerpos de expresión al antígeno de interés. Las secuencias de inmunoglobulina amplificada además pueden ser manipuladas in vitro, tal como a través de métodos de maduración de afinidad in vitro, tales como aquellos descritos en la Publicación de PCT WO 97/2913 y Publicación de PCT WO 00/56772.
Los anticuerpos monoclonales también se produce a través de la inmunización de un animal no ser humano comprendiendo algunos, o todos, de los sitios de inmunoglobulina humana con un antígeno de interés. En una modalidad, el animal no ser humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón diseñada por ingeniería que comprende grandes fragmentos de sitios de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpo de ratón. Ver, por ejemplo, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y Patentes de E.U.A. Nos. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 Y 6,130,364. Ver también WO 91/10741, publicada el 25 de Julio, 1991, WO 94/02602, publicada el 3 de Febrero, 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambas publicadas el 31 de Octubre, 1996, WO 98/16654, publicada el 23 de Atril, 1998, WO 98/24893, 98/50433, publicada el 12 de Noviembre, 1998, WO 99/45031, publicada el 10 de Septiembre, 1999, WO 99/53049, publicada el 21 de Octubre, 1999, WO 00 09560, publicada el 24 de Febrero, 2000 y WO 00/037504, publicada el 29 de Junio, 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos totalmente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos en antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpo humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal, con un tamaño de megabase de los sitios de cadena pesada humana y x sitios de cadena ligera. Ver, Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), las descripciones de las cuales se incorporan aquí para referencia.
También se pueden utilizar métodos, in vitro para hacer los anticuerpos parenterales, en donde una biblioteca de anticuerpo es clasificada para identificar un anticuerpo que tiene le especificidad de unión deseada. Los métodos para dicha clasificación de bibliotecas de anticuerpo recombinantes son bien conocidos en el campo e incluyen métodos descritos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de E.U.A. No. 5,223,409; Kang et al. Publicación PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT N o. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybrídomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246.1275- 1281 ; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 1_2:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Tech nology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88/7978- 7982, publicación de solicitud de patente de E.U.A. 20030186374, y Publicación PCT No. WO 97/29131, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí para referencia.
Los anticuerpos parentales de la presente invención también pueden ser generados utilizando varios métodos de presentación de fago conocidos en la técnica. En. métodos de presentación de fago, los dominios de anticuerpo funcionales son presentados sobre la superficie de partículas de fago, las cuales llevan las secuencias de polinucleótido que las codifican. En particular, dicho fago puede ser utilizado para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de una biblioteca de anticuerpo de repertorio o de combinación (por ejemplo, humano o murino). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que une el antígeno de interés puede ser seleccionado o identificado con el antígeno, por ejemplo, utilizando un antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. El fago utilizado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso incluyendo dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv, o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro recombinantemente fusionados ya sea al gen III de fago a la proteína del gen IV. Ejemplos de métodos de presentación de fago que pueden ser utilizados para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud de PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones de PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad.
Como se describió en las referencias de la presente, después de la selección del fago, las regiones que codifican el anticuerpo del fago pueden ser aisladas y utilizadas para generar anticuerpos enteros incluyendo anticuerpos humanos o a través de otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresadas en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células de levadura, y bacterias, por ejemplo, como se describe con detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como aquellas descritas en la publicación de PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJPJ 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (dichas referencias se incorporan aquí para referencia en sus totalidades). Ejemplos de técnicas que pueden ser utilizadas para producir Fvs de cadena individual y los anticuerpos incluyen aquellos descritos en las patentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
Como alternativa a la clasificación de bibliotecas de anticuerpo recombinante a través de presentación de fago, se pueden aplicar otras metodologías conocidas en las técnicas para clasificar grandes bibliotecas de combinación para la identificación de anticuerpos parenterales. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en donde la biblioteca de anticuerpo recombinante se exprese como fusiones de ARN-proteína, como se describe en la Publicación de PCT No. WO 98/31700 de Szostak y Roberts, y por Roberts, R. W. y Szostak, J. W. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9_4: 12297- 12302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica a través de traducción in vitro de ARNms sintéticos que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. De esta manera, un ARNm específico puede ser enriquecido a partir de una mezcla de complejo de ARNms (por ejemplo, una biblioteca de combinación) basada en las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, anticuerpo, o una porción del mismo, tal como la unión del anticuerpo, o porción .del mismo, al antígeno de especificidad doble. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas de la clasificación de dichas bibliotecas pueden ser expresadas a través de medios recombinantes como se describe aquí (por ejemplo, en células huésped de mamífero) y, además, pueden ser sometidas a maduración de afinidad adicional a través de rondas adicionales de clasificación de fusiones de ARNm-péptido en donde se han introducido mutaciones en la secuencia(s) originalmente seleccionada, o a través de otros métodos para maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe aquí.
En otro aspecto, los anticuerpos parentales también pueden ser generados utilizando métodos de presentación de levadura conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de levadura, se utilizan métodos genéticos para atar o unir dominios de anticuerpo a la pared de célula de levadura y presentarlos sobre la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura puede ser utilizada para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de una biblioteca de repertorio o de combinación (por ejemplo, de humano o murino). Ejemplos de métodos de presentación de levadura que pueden ser utilizados para hacer los anticuerpos parentales incluyen aquellos descritos por Wittrup, et al, Patente de E.U.A. No. 6,699,658, incorpora aquí para referencia.
Los anticuerpos descritos aquí además pueden ser modificados para generar anticuerpos parentales de CDR injertados y humanizados. Los anticuerpos parentales injertados con CDR comprenden secuencias de región variable de cadena pesada o ligera a partir de un anticuerpo humano, en donde una o más de las regiones CDR de VH y/o VL son reemplazadas con secuencias de CDR de anticuerpos de murino capaces de unir el antígeno de interés. Una secuencia de estructura de marco de cualquier anticuerpo humano puede servir como la plantilla para el injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo de cadena recta en dicha estructura de marco por lo general conduce a cierta pérdida de afinidad de unión al antígeno. Entre más homólogo sea un anticuerpo humano al anticuerpo de murino original, hay menos posibilidad de que la combinación de CDRs de murino con la estructura de marco humano introduzca distorsiones en las CDRs que podrían reducir la afinidad. Por lo tanto, en una modalidad, la estructura de marco variable humana que se selecciona para reemplazar la estructura de marco variable de murino aparte de las CDRs tiene por lo menos un 65% de identidad de secuencia con la estructura de marco de región variable de anticuerpo de murino. En una modalidad, las regiones variables humanas y de murino aparte de las CDRs tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia. En una modalidad particular, aquellas regiones variables humanas y de murino aparte de las CDRs tienen por lo menos 75% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las regiones variables humanas y de murino aparte de las CDRs tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia. En la técnica son conocidos los métodos para producir tales anticuerpos (ver, EP 239,400; publicación de PCT WO 91/09967; Patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101 ; y 5,585,089), anticuerpos de recubrimiento o rejuvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91 :969-973 (1994)), y arrastre de cadena (Pat. E.U.A. No. 5,565,352); y anticuerpos anti-idiotipicos.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de un anticuerpo de especie no humana que une el antígeno deseado teniendo una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y regiones de estructura de marco de una molécula de inmunoglobulina humana. Las secuencias de Ig humana conocidas se describen en, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. p u bl i c.¡ asta te.edu/. a bout. pedro/ re search_tools.html; www. mgen . un i- heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05Zkuby05.htm; www. libra ry.thinkquest.org/ 12429/lmmune/Anti body.html; www.hhmi.org/grants/lectures/l 996/vlab/; www. pat h. ca rn.ac.uk/. a bou t.rriTTA/m- i kei mages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmuno- iogy.html. www. immunology link.com/; pathbox.wustl.edu/. about.hcenter/ índex, -html; www.biotech.ufl. edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www. nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/EI¡sa.html; www. biodesign.com/table.asp; www. icnet. uk/axp/facs/da ies/lin-ks. html; www. biotech. ufl.edu/. about.fccl/protocol. html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl. imt. uni-marburg.de/. about.rek/A EP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/ about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/l NTRO.html; www. ib t. un am .mx/ i r/V_ mice.html ; ¡mgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl. ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/SlideO 1.html; www.cryst. bbk.ac.Uk/.about. ubcg07s/; www. nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg. htm; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP. html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam. ac. uk/.abo-ut.f mol ina/Web-pages/Pept/spottech. html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada una completamente incorporada aquí para referencia. Dichas secuencias importadas pueden ser utilizadas para reducir la inmunogenicidad, o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, velocidad de activación, velocidad de no activación, avidez o afinidad, especificidad, vida media u otra característica adecuada, como es conocido en la técnica.
Los residuos de estructura de marco en las regiones de estructura de marco humana pueden ser substituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión a antígeno. Estas substituciones de estructura de marco se identifican a través de métodos bien conocidos en el campo, por ejemplo, modelando las interacciones de la CDR y residuos de CDR para identificar residuos de estructura de marco importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de estructura de marco no usuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen et al., Patente de E.U.A. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), las cuales se incorporan aquí para referencia en sus totalidades). Están comúnmente disponibles modelos de ¡nmunoglobulina tridimensionales y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y presentan estructuras de conformación tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influencian la habilidad de la ¡nmunoglobulina candidato a unir su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados a partir de las secuencias de consenso y de importación de manera que la característica de anticuerpo deseada, tal como la afinidad incrementada para el antígeno(s) objetivo, se logra. En general, los residuos de CDR están directamente y muy substancialmente involucrados en influenciar la unión a antígeno. Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de técnicas conocidas en el campo, tales como, pero no limitándose a aquellas descritas por Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5) :489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); publicación de PCT WO 91/09967, PCT7: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/ 14424 , WO90/14430, EP 229246, EP 592,106, EP 519,596, EP 239,400, Pat. E.U.A. N os. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567., cada una completamente incorporada aquí para referencia, incluidas las referencias citadas ahí.
B. Criterios para seleccionar anticuerpos monoclonales parentales Una modalidad de la invención se refiere a seleccionar anticuerpos parentales con al menos una o más propiedades deseadas en la molécula de DVD-lg. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros de anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros de anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión a antígeno ortóloga.
B1. Afinidad a antigeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede depender de la naturaleza del antígeno, y el punto final terapéutico deseado. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales tienen afinidades más altas (Kd = 0.01 - 0.05 pM) cuando bloquean una interacción de receptor de citocina-citocina ya que dicha interacción usualmente tiene altas interacciones de afinidad (por ejemplo, escalas de <pM -<nM). En tales casos, la afinidad de mAb para su objetivo debe ser igual a o mejor que la afinidad de la citocina (ligando) para su receptor. Por otro lado, mAb con afinidad menor (escala >nM) puede ser terapéuticamente efectiva, por ejemplo, para eliminar proteínas potencialmente patogénicas en circulación, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen a, secuestran, y eliminan especies de A-ß-amiloide en circulación. En otros casos, se puede utilizar la reducción de la afinidad de un mAb de alta afinidad existente a través de mutagénesis dirigida al sitio o utilizando un mAb con afinidad inferior para su objetivo, para evitar efectos laterales potenciales, por ejemplo, un mAb de alta afinidad puede secuestrar/ neutralizar todo su objetivo pretendido, quitando/eliminando asi por completo la función(es) de la proteína de objetivo. En este escenario, un mAb de baja afinidad puede secuestrar/neutralizar una fracción del objetivo que puede ser responsable de los síntomas de la enfermedad (los niveles patológicos o sobre-producidos), permitiendo de esta manera que una fracción del objetivo continúe realizando su función(es) fisiológica normal. Por lo tanto, puede ser posible reducir el valor de Kd para ajustar la dosis y/o reducir los efectos laterales. La afinidad del mAb parental puede jugar un papel importante en la activación por objetivo apropiada de moléculas de superficie celular para lograr un resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, si un objetivo es expresado en células cancerosas con una alta densidad y en células normales con baja densidad, un mAb de afinidad inferior unirá un número mayor de objetivos en células tumorales que en células normales, dando como resultado la eliminación de la célula tumoral a través de ADCC o CDC, y, por lo tanto, puede tener efectos terapéuticamente deseables. De esta manera, la selección de un mAb con afinidad deseada puede ser relevante para objetivos tanto solubles como de superficie.
La señalización a través de un receptor después de la interacción con su ligando puede depender de la afinidad de la interacción del receptor-ligando. Similarmente, es concebible que la afinidad de un mAb para un receptor de superficie pueda determinar la naturaleza de señalización, intracelular y si el mAb puede suministrar una señal agonista o antagonista. La naturaleza a base de afinidad de señalización mediada por mAb puede tener un impacto en el perfil de efecto lateral. Por lo tanto, la afinidad deseada y las funciones deseadas de anticuerpos monoclonales terapéuticos necesitan ser determinadas cuidadosamente a través de experimentación ¡n vitro e in vivo.
El valor de Kd deseado de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) puede ser determinado experimentalmente dependiendo del resultado terapéutico deseado. En una modalidad, se seleccionan anticuerpos parentales con afinidad (Kd) para un antígeno particular igual a, o mejor que la afinidad deseada de DVD-Ig para el mismo antígeno. La afinidad de unión a antígeno y la cinética se determinan a través de la técnica Biacore u otra similar. En una modalidad, cada anticuerpo parental tiene una constante de disociación (Kd) para su antígeno seleccionado del grupo que consiste de; a lo mucho aproximadamente 10"7M; a lo mucho aproximadamente 10"8M; a lo mucho aproximadamente 10"9 ; a lo mucho aproximadamente 10" 0M; a lo mucho aproximadamente 10" 11M; a lo mucho aproximadamente 10'12M; y a lo mucho aproximadamente 10"13M. El primer anticuerpo parental a partir del cual VD1 se obtiene y el segundo anticuerpo parental a partir del cual VD2 se obtiene y pueden tener una afinidad similar o una diferente (KD) para el antígeno respectivo. Cada anticuerpo parental tiene una constante de velocidad de acción (Kon) al antígeno seleccionada del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102M"1s"1; por lo menos aproximadamente 103M" s"1; por lo menos aproximadamente 104M"1 s"1 ; por lo menos aproximadamente 105M" s"1; y por lo menos aproximadamente 106M'1s"1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo parental a partir del cual VD1 se obtiene y el segundo anticuerpo parental a partir del cual VD2 se obtiene pueden tener una constante de velocidad de acción (Kon) similar o diferente para el antígeno respectivo. En una modalidad, cada anticuerpo parental tiene una constante de velocidad sin acción (Koff) al antígeno seleccionada del grupo que consiste de; a lo mucho 10"3s"1; a lo mucho 10" s"1; a lo mucho 10"5s"1¡ y a lo mucho 10'6s"1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo parental a partir del cual VD1 se obtiene y el segundo anticuerpo parental a partir del cual VD2 se obtiene pueden tener constantes de velocidad s¡n acción (Koff) similares o diferentes para el antígeno respectivo.
B2. Potencia La afinidad/potencia deseada de los anticuerpos monoclonales parentales dependerá del resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para interacciones de receptor-ligando (R-L), la afinidad (kd) es igual o mejor que la kd de R-L (escala pM). Para una simple eliminación de una proteína patogénica en circulación, el valor de kd puede estar en una baja escala de nM, por ejemplo, la eliminación de carias especies de péptido ?-ß en circulación. Además, el valor de kd también dependerá de si el objetivo expresa múltiples copias del mismo epítopo, por ejemplo, un mAb de activación de conformación de objetivo en oligómeros ?ß.
Cuando VD1 y VD2 unen el mismo antígeno, pero distintos epítopos, la DVD-lg contendrá 4 sitios de unión para el mismo antígeno, incrementando así la avidez y de esta manera el valor de kd aparente de la DVD-lg. En una modalidad, se eligen los anticuerpos parentales con un valor de kd igual o más bajo que el deseado en la DVD-lg. Las consideraciones de afinidad de un mAb parental también puede depender de si DVD-lg contiene cuatro o más sitios de unión a antígeno idénticos (es decir, una DVD-lg de un mAb individual). En este caso, el valor de kd aparente puede ser mayor que el mAb debido a la avidez. Dichas DVD-lgs pueden ser empleadas para el entrelazamiento cruzado del receptor de superficie, incrementar potencia de neutralización, mejorar la eliminación de proteínas patológicas, etc.
En una modalidad, se seleccionan los anticuerpos parentales con potencia de neutralización para el antígeno específico igual o mejor que el potencial de neutralización deseado de la DVD-lg para el mismo antígeno. La potencia de neutralización puede ser determinada a través de un bioensayo dependiente de objetivo, en donde las células de un tipo apropiado producen una señal medible (es decir, proliferación o producción de citocina) en respuesta a la estimulación del objetivo, y la neutralización de objetivo a través del mAb pueden reducir la señal en una forma dependiente de dosis.
B3. Funciones Biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden realizar potencialmente varias funciones. Algunas de estas funciones se listan en el Cuadro 1. Estas funciones pueden ser determinadas a través de ensayos tanto in vitro (por ejemplo, ensayos a base de célula o bioquímicos) como in vivo en modelos de animal.
Cuadro 1. Algunas Aplicaciones de Potencial para Anticuerpos Terapéuticos Los mAbs con distintas funciones descritos en los ejemplos del Cuadro 1 pueden ser seleccionados para obtener resultados terapéuticos deseados. Dos o más anticuerpos monoclonales parentales seleccionados después pueden ser utilizados en el formato de DVD-lg para obtener dos funciones . distintas en una molécula de DVD-lg individual. Por ejemplo, una DVD-lg puede ser generada seleccionando un mAb parental que neutralice la función de una citocina específica, y seleccionando un mAb parental que mejora la eliminación de una proteína patológica. Similarmente, se pueden seleccionar dos anticuerpos monoclonales parentales que reconozcan dos diferentes receptores de superficie de célula, un mAb con una función agonista en un receptor y el otro mAb con una función antagonista en un receptor diferente. Estos dos anticuerpos monoclonales seleccionados cada uno con una función distinta pueden ser utilizados para construir una molécula de DVD-lg individual que poseerá las dos funciones distintas (agonista y antagonista) de los anticuerpos monoclonales seleccionados en una molécula individual. Similarmente, se pueden utilizar dos anticuerpos monoclonales antagonísticos para receptores de superficie celular cada uno bloqueando la unión de ligandos de receptor respectivo (por ejemplo, EGF e IGF) en un formato de DVD-lg. En forma inversa, se puede seleccionar un mAb anti-receptor antagonístico (por ejemplo, anti-EGF ) y un mediador anti-soluble neutralizante (por ejemplo anti-IGF1/2) para hacer una DVD-lg.
B4. Reconocimiento de Epítopo Diferentes regiones de proteínas pueden realizar diferentes funciones. Por ejemplo, regiones especificas de una citocina ¡nteractúan con el receptor de citocina para producir activación de receptor, mientras que otras regiones de la proteína pueden ser requeridas para estabilizar la citocina. En este caso, se puede seleccionar un mAb que se une específicamente a la región(es) de interacción de receptor en la citocina y de esta manera bloquea la interacción de citocína-receptor. En algunos casos, por ejemplo, ciertos receptores de quimiocina que unen múltiples lígandos, se puede seleccionar un mAb que se une al epítopo (región en el receptor de quimiocina) que interactúa solo con un ligando. En otros casos, los anticuerpos monoclonales pueden unirse a epítopos en un objetivo que no solo son directamente responsables de las funciones fisiológicas de la proteína, sino que la unión de un mAb a estas regiones puede ya sea interferir con las funciones fisiológicas (impedimento estérico) o alterar la conformación de la proteína de manera que la proteína no puede funcionar (mAb a receptores con ligandos múltiples que alteran la conformación del receptor de manera que ningún ligando puede unirse). También se han identificado anticuerpos monoclonales anti-citocina que no bloquean la unión de la citocina a su receptor, pero bloquean la transducción de señal (por ejemplo, 125-2H, un mAb anti-IL-18).
Ejemplos de funciones de epítopos y mAb incluyen, pero no se limitan a, bloquear la interacción de Receptor-Ligando (R-L) (neutralizando mAb que inhibe el sitio de interacción R); impedimento estérico que da como resultado la unión disminuida o ninguna unión de R. un Ab puede unir el objetivo en un sitio distinto a un sitio de unión de receptor, pero sigue interfiriendo con la unión de receptor y funciones del objetivo induciendo un cambio de conformación y elimina funciones (por ejemplo, Xolair), uniéndose a R pero bloquea la señalización (125-2H).
En una modalidad, el mAb parental necesita tener como objetivo al epítopo apropiado para una eficacia máxima. Dicho epítopo debe ser conservado en la DVD-lg. El epítopo de unión de un mAb puede ser determinado a través de varios aspectos, incluyendo co-cristalograf ía, proteólisis limitada del complejo de mAb-antígeno más mapeo de péptido espectrométrico masivo (Legros V. et al 2000 Protein Sci. 9:1002-10), bibliotecas de péptido presentadas por fago (O'Connor KH et al, 2005 J Immunol Methods. 299:21-35), así como mutagénesis (Wu C. et al, 2003 J Immunol 170:5571-7).
B5. Propiedades físico-químicas y farmacéuticas El tratamiento terapéutico con anticuerpos por lo regular requiere de la administración de altas dosis, por lo general varios mg/kg (debido a una baja potencia en una base masiva como una consecuencia de un peso molecular típicamente grande). Con el fin de adaptarse a la comodidad del paciente y para dirigir adecuadamente terapias de enfermedad crónica y tratamiento de paciente externo, es deseable la administración subcutánea (s.c.) o intramuscular (i.m.) de mAbs terapéuticos. Por ejemplo, el volumen máximo deseable para administración s.c. es de aproximadamente 1.0 mi, y por lo tanto, son deseables concentraciones de >100 mg/ml para limitar el número de inyecciones por dosis. En una modalidad, el anticuerpo terapéutico se administra en una dosis El desarrollo de dicha formulación está restringido, sin embargo, por interacciones de proteína-proteina (por ejemplo, agregación, que potencialmente incrementa los riesgos de inmunogenicidad) y por limitaciones durante el procesamiento y suministro (por ejemplo, viscosidad). Consecuentemente, las grandes cantidades requeridas para eficacia clínica y las restricciones de desarrollo asociadas limitan toda la explotación del potencial de la formulación de anticuerpo y la administración s.c. en regímenes de dosis alta. Es evidente que las propiedades físico-químicas y farmacéuticas de una molécula de proteína y la solución de proteína son de gran importancia, por ejemplo, aspectos de estabilidad, solubilidad y viscosidad.
B5.1 Estabilidad Una formulación de anticuerpo "estable" es una en donde el anticuerpo esencialmente retiene sus estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica después de almacenamiento. La estabilidad puede ser medida a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. En una modalidad, el anticuerpo en la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos 1 año, durante al menos 2 años. Además, en una modalidad, la formulación es estable después de la congelación (a, por ejemplo, -70°C) y descongelación de la formulación, de aquí en adelante denominado como "ciclo de congelación/descongelación". En otro ejemplo, una formulación "estable" puede ser una en donde menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación.
Una DVD-lg estable in vitro a varias temperaturas durante un período extendido de tiempo es deseable. Se puede obtener esto a través de una rápida clasificación de mAbs parentales estables in vitro a temperatura elevada, por ejemplo, a 40°C durante 2-4 semanas, y después determinar la estabilidad. Durante almacenamiento a 2-8°C, la proteína revela estabilidad durante al menos 12 meses, por ejemplo, hasta 24 meses. La estabilidad (% de molécula monomérica, intacta) puede ser determinada utilizando varias técnicas, tales como cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión de tamaño, SDS-PAGE, así como prueba de bioactividad. Para una lista más comprensiva de técnicas de técnicas analíticas que pueden ser empleadas para analizar modificaciones covalentes y de conformación, por favor ver, Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. En: Cleland, J. L.; Langer, R. editores. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1o edición, Washington, ACS, pág. 22-45; y Pearlman, R.; Nguyen, T. H. (1990) Analysis of protein drugs. En: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1° edición, Nueva York, Marcel Dekker, Inc., pág. 247-301.
Heterogeneidad y formación de agregado: la estabilidad del anticuerpo puede ser tal que la formulación puede revelar menos de aproximadamente 10%, en una modalidad, menos de aproximadamente 5%, en otra modalidad, menos de aproximadamente 2%, o, en otra modalidad, dentro de la escala de 0.5% a 1.5% o menos en el material de anticuerpo de GMP que está presente como agregado. La cromatografía de exclusión de tamaño es un método que es sensible, reproducible, y muy robusto en la detección de agregados de proteína.
Además de los bajos niveles de agregado, el anticuerpo, en una modalidad debe ser químicamente estable. La estabilidad química puede ser determinada a través de cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico), cromatografía de interacción hidrofóbica, u otros métodos tales como enfoque isoeléctrico o electrof oresis capilar. Por ejemplo, la estabilidad química del anticuerpo puede ser tal que después de almacenamiento de por lo menos 12 meses a 2-8°C, el pico que representa el anticuerpo no modificado en una cromatografía de intercambio catiónico puede incrementarse a no más de 20%, en una modalidad, no más de 10%, o, en otra modalidad, no más de 5% según comparado von la solución e anticuerpo antes de prueba de almacenamiento.
En una modalidad, los anticuerpos parentales presentan integridad estructural; formación correcta de enlace de disulfuro, y pliegue correcto. La inestabilidad química debido a cambios en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede impactar la actividad de anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad, según indicada por la actividad del anticuerpo, puede ser tal que después de almacenamiento durante al menos 12 meses a 2-8°C, la actividad del anticuerpo puede reducirse a no más del 50%, en una modalidad no más de 30%, o aún no más de 10%, o en una modalidad no más de 5% ó 1% según comparado con la solución de anticuerpo antes de prueba de almacenamiento. Se pueden emplear ensayos de unión a antígeno adecuados para determinar la actividad de anticuerpo.
B5.2 Solubilidad La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la producción de IgG monomérica, correctamente plegada. La solubilidad de la IgG puede, por lo tanto, ser determinada a través de HPLC. Por ejemplo, la IgG soluble (monomérica) dará surgimiento a un pico individual en la cromatografía de HPLC, mientras que la ¡nsoluble (por ejemplo, multimérica y agregada) dará surgimiento a una pluralidad de picos. Un experto en la técnica, por lo tanto, será capaz de detectar un incremento o reducción en la solubilidad de una IgG utilizando técnicas de HPLC de rutina. Para una lista más comprensiva de técnicas analíticas que pueden ser empleadas para analizar la solubilidad (ver, Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(es): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301 ). La solubilidad de un mAb terapéutico para formular a una alta concentración por lo regular requirió de dosificación adecuada. Como se presenta aquí, se pueden requerir de solubilidad de >100 mg/ml para adaptar la dosificación eficiente de anticuerpo. Por ejemplo, la solubilidad de anticuerpo puede ser no menor que aproximadamente 5 mg/ml en la fase temperara de investigación, en una modalidad no menor que aproximadamente 25 mg/ml en etapas avanzadas de ciencia de proceso, o en una modalidad, no menor que aproximadamente 100 mg/ml, o en una modalidad no menor que aproximadamente 150 mg/ml. Es obvio para un experto en la técnica que las propiedades intrínsecas de una molécula de proteína son importantes las propiedades físico-químicas de la solución de proteína, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, viscosidad. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que una amplia variedad de excipientes existen que pueden ser utilizados como aditivos para ¡mpactar benéficamente las características de la formulación de proteína final. Esto excipientes pueden incluir: (i) solventes líquidos, co-solventes (por ejemplo, alcoholes, tales como etanol); (ii) agentes reguladores de pH (por ejemplo, reguladores de pH de fosfato, acetato, citrato, aminoácido); (¡ii) azúcares o alcoholes de azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, rafinosa, manitol, sorbitol, dextranas); (iv) agentes tensoactivos (por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60, 80, poloxámeros); (v) modificadores de isotonicidad (por ejemplo, sales tales como NaCI, azúcares, alcoholes de azúcar); y (vi) otros (por ejemplo conservadores, agentes quelatadores, antioxidantes, substancias quelatadoras (por ejemplo, EDTA), polímeros biodegradables, moléculas portadoras (por ejemplo, HSA, PEGs).
La viscosidad es un parámetro de alta importancia con respecto a la fabricación del anticuerpo y procesamiento del anticuerpo (por ejemplo, diafiltración/ultrafiltración), procedimientos de acabado con relleno, aspectos de filtración) y aspectos de suministro (capacidad de aplicación de jeringa, suministro de dispositivo sofisticado). Las bajas viscosidades permiten la solución líquida del anticuerpo teniendo una concentración más alta. Esto permite que la misma dosis sea administrada en volúmenes más pequeños. Los volúmenes de inyección pequeños son inherentes a la ventaja de dolor inferior o sensaciones de inyección, y las soluciones no necesariamente tienen que ser isotónicas para reducir el dolor en la inyección en el paciente. La viscosidad de la solución de anticuerpo puede ser tal que a velocidades de esfuerzo cortante de 100 (1/s) la viscosidad de solución del anticuerpo está por abajo de 200 mPa s, en una modalidad por abajo de 125 mPa s, en otra modalidad por abajo de 70 mPa s, y en aún otra modalidad por abajo de 25 mPa s, o aún más por abajo de 10 mPa s.
B5.3 Eficiencia de producción La generación de una DVD-lg que es eficientemente expresada en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), en una modalidad, requerirá de dos anticuerpos monoclonales parentales que por sí mismos son expresados eficientemente en células de mamífero. El rendimiento de producción de una línea de mamífero estable (es decir, CHO) debe estar por arriba de aproximadamente 0.5 g/l, en una modalidad, por arriba de aproximadamente 1 g/l, y en otra modalidad en la escala de aproximadamente 2-5 g/l o más (Kipriyanov SM, Little M. 1999 Mol Biotechnol. 12:173-201; Carroll S, A1-Rubeai M. 2004 Expert Opin Biol Ther. 4:1821-9).
La producción de anticuerpos y proteínas de fusión Ig es influenciada por varios factores. El diseño por ingeniería del vector de expresión a través de la incorporación de promotores fuertes, mejoradores y marcadores de selección puede incrementar al máximo la transcripción del gen de interés a partir de una copia de vector integrada. La identificación de sitios de integración de vector que son permisibles para altos niveles de transcripción de gen pueden aumentar la expresión de proteína a partir de un vector (Wurm et al, 2004, Nature Biotechnology, 2004, Vol/Iss/Pág. 22/11 (1393-1398)). Además, los niveles de producción son afectados por la relación de cadenas pesada y ligera del anticuerpo y varios pasos en el procedimiento del ensamble de proteína y secreción (Jiang et al, 2006, Biotechnology Progress, Enero-Febrero 2006, col. 22, no. 1, pág. 313-8).
B6. inmunogenicidad La administración de un mAb terapéutico puede dar como resultado cierta incidencia de una respuesta inmunologica (es decir, la formación de anticuerpos endógenos dirigidos contra el mAb terapéutico). Los elementos potenciales que pueden inducir la inmunogenicidad deben ser analizados durante la selección de los anticuerpos monoclonales parentales, y se pueden tomar pasos para reducir dicho riesgo para optimizar los anticuerpo monoclonales parentales antes de la construcción de la DVD-lg. Se ha encontrado que los anticuerpos derivados de ratón son altamente inmunogénicos en pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos compuestos de regiones constantes variables de ratón y humanas presenta un siguiente paso lógico para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos (Morrison y Schlom, 1990). Alternativamente, la inmunogenicidad puede ser reducida transfiriendo secuencias de CDR de murino a una estructura de marco de anticuerpo humano (reconfiguración/injerto de CDR/humanización), como se describió para un anticuerpo terapéutico por Riechmann et al, 1988. Otro método se denomina como "rejuvenecimiento" o "recubrimiento", empezando con los dominios ligero y pesado variables de roedor, solo los aminoácidos de estructura de marco accesibles por superficie son alterados a los humanos, mientras que la CDR y aminoácidos enterrados permanecen del anticuerpo de roedor parental (Roguska et al, 1996). En otro tipo de humanización, en lugar de injertar todas las CDRs, una técnica injerta solamente las "regiones de determinación de especificidad" (SDRs), definidas como el subgrupo de residuos de CDR que está involucrado en la unión del anticuerpo a su objetivo (Kashmiri et al, 2005). Esto necesita la identificación de las SDRs ya sea a través de análisis de estructuras tridimensionales disponibles de complejos de anticuerpo-objetivo como de análisis mutacional de los residuos de CDR de anticuerpo para determinar cual interactúa con el objetivo. Alternativamente, los anticuerpos totalmente humanos tienen inmunogenicidad reducida comparado con los anticuerpos de murino, quimérico o humanizados.
Otro aspecto para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias específicas que se pronostica que son ¡nmunogénicas. En un aspecto, después de que una primera generación biológica ha sido probada en seres humanos y se encontró que es inaceptablemente ¡nmunológica, los epítopos de célula B pueden ser trazados y después alterados para evitar la detección ¡nmunológica. Otro aspecto utiliza métodos para pronosticar y remover epítopos de célula T potenciales. Se han desarrollado métodos computacionales para explorar o escanear e identificar las secuencias de péptido de terapéuticos biológicos con el potencial para unirse a proteínas HC (Desmet et al, 2005). Alternativamente, se puede utilizar un método a base de célula dendrítica humana para identificar epítopos de célula T CD4+ en alérgenos proteínicos potenciales (Stickler et al, 2005; S.L. Morrison y Schlom, Importan Adv. Oncol. (1990), pág. 3-18; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. y Winter, G. "Reshaping human anticuerpos for therapy". Nature (1988) 332: 323-327; Roguska M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Bláttler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C. A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing. Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, vol. 9, pág. 895-904; Kashmri-Syed-V-S, De-Pascalis- oberto, Gonzalez-Noreen-R, Schlom-Jeffrey , SDR-grafting - a new approach to antibody humanization. Methods (San Diego Calif.), {Methods}, Mayo 2005, vol. 36, no. 1, pág. 25-34; Desmet- Joha n , Meersseman-Greet, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista , Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-lgnace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation. Proteins, 2005, vol. 58, pág. 53-69; Stickler-M-M, Estell-D-A, Hardinq-F-A. CD4 + T-cell epitope determination using unexposed human donor penpheral blood mononuclear cells. Journal of immunotherapy 2000, vol. 23, pag. 654-60).
B7. Eficacia in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con eficacia in vivo deseada, es importante generar y seleccionar mAbs con la misma similitud de eficacia in vivo cuando se da en combinación. Sin embargo, en algunos casos, la DVD-lg puede exhibir eficacia in vivo que no puede ser lograda con la combinación de dos mAbs separados. Por ejemplo, una DVD-lg lleva dos objetivos en cercanía conduciendo a una actividad que no puede ser lograda con la combinación de dos mAbs separados. Aquí en la sección B3 se describen funciones biológicas deseables adicionales. Se pueden seleccionar anticuerpos parentales con características deseables en la molécula de DVD-lg con base en factores tales como farmacocinética V distribución de tejido; objetivos solubles contra superficie celular; y concentración de objetivo-soluble/densidad-superficie.
B.8 Distribución de tejido in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con distribución de tejido in vivo deseada, en una modalidad, se deben seleccionar mAbs parentales con un perfil de distribución de tejido in vivo similar deseado. Alternativamente, basándose en el mecanismo de la estrategia de activación doble especifica, en otros tiempos no se requería seleccionar mAbs parentales con la distribución de tejido in vivo similar deseada cuando se daban en combinación. Por ejemplo, en el caso de una DVD-lg en donde un componente de unión tiene por objetivo la acción de la DVD-lg a una terapia de sitio específico llevando al segundo componente de unión al mismo sitio objetivo. Por ejemplo, una especificidad de unión de una DVD-lg puede tener por objetivo el páncreas (células de isleta) y la otra especificidad puede llevar a GLP1 al páncreas para inducir insulina.
B9. Isotipo Para generar una molécula de DVD-lg con propiedades deseadas incluyendo, pero no limitándose a, Isotipo, funciones efectoras y vida media en circulación, en una modalidad, se seleccionan mAbs parentales con funciones Fc-efectoras apropiadas dependiendo de la utilidad terapéutica y el punto final terapéutico deseado. Existen cinco clases de cadena pesada principales o isotipos, algunos de los cuales tienen varios subtipos y éstos determinan las funciones efectoras de una molécula de anticuerpo. Estas funciones efectoras residen en la región de gozne, dominios CH2 y CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, los residuos en otras partes de una molécula de anticuerpo pueden tener efectos sobre las funciones efectoras también. Las funciones Fc-efectoras de región de gozne incluyen: (i) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, (i¡) unión de complemento (C1q), activación y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), (iii) fagocitosis/ eliminación de complejos de antígeno-anticuerpo, y (iv) liberación de citocina en algunos casos. Estas funciones Fc-efectoras de una molécula de anticuerpo son mediadas a través de la interacción de la región Fe con un grupo de receptores de superficie de célula de clase específica. Los anticuerpos del isotipo de I g G 1 son muy activos mientras que lgG2 e lgG4 tienen funciones efectoras mínimas o ninguna. Las funciones efectoras de los anticuerpos IgG son mediadas a través de interacciones con tres tipos de receptor Fe celulares estructuralmente homólogos (y subtipos) (FcgR1, FcdRIl y FcgRIII). Estas funciones efectoras de una I g G 1 pueden ser eliminadas a través de la mutación de residuos de aminoácido específicos en la región de gozne inferior (por ejemplo, L234A, L235A) que son requeridos para la unión de FcgR y C1q. Los residuos de aminoácido en la región Fe, en particular los dominios CH2-CH3, también determinan la vida media en circulación de la molécula de anticuerpo. Esta función Fe es mediada a través de la unión de la región Fe al receptor Fe neonatal (FcRn) que es responsable de la re-ciclización de moléculas de anticuerpo desde lis liposomas ácidos de regreso a la circulación general.
Si un mAb debe tener un isotipo activo o uno inactivo dependerá del punto final terapéutico deseado para un anticuerpo. Algunos ejemplos de uso de isotipos y resultados terapéuticos deseados se listan a continuación: (a) Si el punto final deseado es neutralización funcional de una citocina soluble entonces se puede utilizar un isotipo inactivo; (b) Si el resultado deseado es la eliminación de una proteína patológica se puede utilizar un isotipo activo; (c) Si el resultado deseado es la eliminación de agregados de proteína se puede utilizar un isótopo activo; (d) Si el resultado deseado es para antagonizar un receptor de superficie se utiliza entonces un isotipo inactivo (Tysabri, lgG4; OKT3, lgG1 mutada); (e) Si el resultado deseado es eliminar células objetivo se utiliza un isotipo activo (Herceptin, I g G 1 (y funciones efectoras mejoradas)); y (f) Si el resultado deseado es eliminar proteínas de la circulación sin entrar al CNS se puede utilizar un isotipo IgM (por ejemplo, eliminar especies de péptido Ab en circulación).
Las funciones efectoras Fe de un mAb parental pueden ser determinadas a través de varios métodos in vitro bien conocidos en la técnica.
Como se discutió, la selección de isotipo, y de esta manera las funciones efectoras dependerán del punto final terapéutico deseado. En casos en donde se desea una simple neutralización de un objetivo en circulación, por ejemplo, bloquear interacciones de de receptor-ligando, las funciones efectoras pueden no ser requeridas. En dichos casos, son deseables isotipos o mutaciones en la región Fe de un anticuerpo que eliminen funciones efectoras. En otros casos en donde la eliminación de células objetivo es el punto final terapéutico, por ejemplo, la eliminación de células tumorales, son deseables isotipos o mutaciones o des-fucosilación en la región Fe que mejoren las funciones efectoras (Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006; Satoh M . , lida S., Shitara K. Expert Opinión Biol, Ther, 6:1161-1173, 2006). Similarmente, dependiendo de la utilidad terapéutica, la vida media en circulación de una molécula de anticuerpo puede ser reducida/prolongada al modular las interacciones de a nticuerpo-Fc-Rn introduciendo mutaciones específicas en la región Fe (Dall'Aqua WF, Kiener PA, Wu H.J. Biol. Chem. 281:23514-23524, 2006; Petkova SB. , Akilesh S., Sproule TJ. Et al, Internat. Immunol. 18:1759-1769, 2006; Vaccaro C, Bawdon R., Wanjie S et al, PNAS 103:18709.18714, 2007).
La información publicada en varios residuos que influencian las diferentes funciones efectoras de un mAb terapéutico normal puede necesitar ser confirmada para DVD-lg. Puede ser posible que en un formato de DVD-lg puedan ser importantes residuos de región Fe adicionales (diferentes), distintos a aquellos identificados para la modulación de funciones efectoras de anticuerpo monoclonal.
En resumen, la decisión de qué funciones efectoras Fe (isotipo) serán críticas en el formato final de DVD-lg dependerá de la indicación de la enfermedad, objetivo terapéutico, punto final terapéutico deseado y consideraciones de seguridad. A continuación se listan regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera, apropiadas, ilustrativas, incluyendo pero no limitándose a: 0 I g G 1 - alotipo: G1 mz IgG 1 muíante - A234, A235 0 lgG2 - alotipo: G2m(n-) 0 Kappa - Km3 0 Lambda Estudios de Receptor Fe y C1q: La posibilidad de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo no deseada (ADCC) y de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) mediante formación de complejo de anticuerpo a cualquier objetivo sobre-expresado en membranas celulares puede ser abrogada por las mutaciones de región de gozne (por ejemplo, L234A, L235A). Se espera que estos aminoácidos substituidos, presentes en la región de gozne de I g G 1 de mAb, den como resultado la unión disminuida de mAb a receptores Fe humanos (pero no FcRn), ya que se cree que la unión de FcgR ocurre dentro de ¡ sitios de traslape en la región de gozne I g G 1. Esta característica de mAb puede conducir a un perfil de seguridad mejorada sobre anticuerpos que contienen una IgG de tipo silvestre. La unión de mAb a receptores Fe humanos puede ser determinada a través de experimentos de citometría de flujo utilizando líneas de célula (por ejemplo, THP-1, K562) y una línea de célula CGO diseñada por ingeniería que expresa FcgRIIb (u otras FcgRs). Comparado con anticuerpos monoclonales de control I g G 1 , mAb muestra una unión reducida a FcgRI y FcgRIIa, mientras que la unión a FcgRIIb se ve sin afección. La unión y activación de C1q a través de complejos ¡nmunológicos de antígeno/lgG activa la cascada de complemento clásica con consecuentes respuestas inflamatorias y/ú inmuno-reguladoras. El sitio de unión a C1q en IgG ha sido localizado para residuos dentro de la región de gozne IgG. La unión a C1q para incrementar las concentraciones de mAb se determinó a través de C1q ELISA. Los resultados demuestran que mAb es incapaz de unirse a C1q, según esperado cuando se comparó con la unión de una I g G 1 de control de tipo silvestre. En resumen, la mutación de región de gozne L234A, L235A abolió la unión de mAb a FcgRI, FcgRIIa y C1q, pero no impacta la interacción de mAb con FcgRIIb. Estos datos sugieren que in vivo, mAb con Fe muíante interactuarán normalmente con FcgRIIb inhibidor pero probablemente fallará para interactuar con los receptores de activación FcgRI y FcgRIIa o C1q.
Unión de FcRn humana: El receptor neonatal (FcRn) es responsable del transporte de IgG a través de la placenta y del control de la vida media catabólica de las moléculas de IgG. Puede ser deseable incrementar la vida media terminal de un anticuerpo para mejorar la eficacia, para reducir la dosis y frecuencia de administración, o para remover la localización al objetivo. Alternativamente, puede ser ventajoso hacer la conversión, es decir, reducir la vida media terminal de un anticuerpo para reducir la exposición de cuerpo entero o para mejorar las relaciones de unión de objetivo a no objetivo. El desarrollo de la interacción entre IgG y su receptor salvaje, FcRn, ofrece una forma de incrementar o reducir la vida media terminal de IgG. Las proteínas en circulación, incluyendo IgG, se toman en la fase de fluido a través de micropinocitosis a través de ciertas células, tales como aquellas del endotelio vascular. La IgG puede unir FcRn en endosomas bajo condiciones ligeramente acidas (pH 6.0-6.5) y pueden reciclar a la superficie celular, en donde es liberada bajo condiciones casi neutras (pH 7.0-7.4). El trazo del sitio de unión de región Fe en FcRn80, 16, 17 mostró que dos residuos de histidina que son especies cruzadas conservadas, His310 y His435, son responsables de la dependencia de pH de su interacción. Al utilizar tecnología de presentación de fago, se identificó una mutación de región Fe de ratón que incrementa la unión a FcRn y extiende la vida media de la IgG de ratón (ver, G. et al.; Nature Biotechnolog (1997), 15(7), 637-640). También se han identificado mutaciones de la región Fe que incrementan la afinidad de unión de IgG humana para FcRn a un pH de 6.0, pero no a un pH de 7.4 (ver, Dall'Acqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). Además, en un caso, también se observó un incremento dependiente de pH similar en la unión (hasta de 27 veces) para FcRn rhesus, y esto dio como resultado un doble incremento en la vida media en suero en monos Rhesus comparado con la IgG parental (ver, Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6216). Estos hallazgos indican que es confiable extender la vida media en plasma de terapéuticos de anticuerpo elaborando la interacción de la región Fe con FcRn. En forma inversa, las mutaciones de la región Fe que atenúan la interacción con FcRn pueden reducir la vida media del anticuerpo.
B.10 Farmacocinética (PK): Para generar una molécula de DVD-lg con un perfil farmacocinético deseado, en una modalidad, se seleccionan mAbs parentales con el perfil farmacocinético similarmente deseado. Una consideración es que la respuesta inmunogénica a anticuerpos monoclonales (es decir, HAHA, respuesta de anticuerpo anti-humano. humano; HACA, respuesta de anticuerpo anti-quimérico humano) además complica la farmacocinética de estos agentes terapéuticos. En una modalidad, se utilizan anticuerpos monoclonales con una inmunogenicidad mínima o ninguna para construir moléculas DVD-lg de manera que las DVD-lgs resultantes también tendrán inmunogenicidad mínima o ninguna. Algunos factores que determinan la PK de un mAb incluyen, pero no se limitan a, propiedades intrínsecas del mAb (secuencia de aminoácido VH); inmunogenicidad; unión FcRn y funciones Fe.
El perfil de PK de anticuerpos monoclonales parentales seleccionado puede ser fácilmente determinado en roedores ya que el perfil de PK en roedores se correlaciona bien con (o estrechamente pronostica) el perfil de PK de anticuerpos monoclonales en monos cinomolgos (macaco cangrejero) y seres humanos. El perfil de PK se determina como se describe en la sección de Ejemplos 1.2.2.3. A.
Después de que se seleccionan los anticuerpos monoclonales parentales con características deseadas de PK (y otras propiedades funcionales deseadas como se discute aquí), la DVD-lg se construye. A medida que las moléculas de DVD-lg contienen dos dominios de unión a antígeno de dos anticuerpos monoclonales parentales, las propiedades de PK de la DVD-lg también se determinan. Por lo tanto, mientras se determinan las propiedades de PK de la DVD-lg, se pueden emplear ensayos de PK que determinen el perfil de PK basándose en la funcionalidad de ambos dominios de unión a antígeno derivados de los 2 anticuerpos monoclonales parentales. El perfil de PK de una DVD-lg puede ser determinado como se describe en el Ejemplo 1.2.2.3. A. los factores adicionales que pueden impactar en el perfil de PK de la DVD-lg incluyen la orientación de dominio de unión a antígeno (CDR); tamaño de enlazador; e interacciones de Fc/FcRn. Las características de PK de anticuerpos parentales pueden ser evaluadas determinando los siguientes parámetros: absorción, distribución, metabolismo y excreción.
Absorción: Hasta la fecha, la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos es a través de rutas parenterales (por ejemplo, intravenosa [IV], subcutánea [SC], o intramuscular [IM]. La absorción de un mAb en la circulación sistémica después de administración ya sea SC o IM desde el espacio intersticial principalmente es a través de la trayectoria linfática. La degradación saturable, pre-sistémica, proteolítica puede dar como resultado una biodisponibilidad absoluta variable después de la administración extravascular. Usualmente, se pueden observar incrementos en la biodisponibilidad absoluta con dosis en incrementos de anticuerpos monoclonales debido a la capacidad proteolítica saturada a dosis más altas. El proceso de absorción para un mAb es usualmente muy lento ya que el fluido de linfa se drena lentamente al sistema vascular, y la duración de la absorción puede ocurrir durante horas a varios días. La biodisponibilidad absoluta de anticuerpos monoclonales después de la administración SC generalmente varía de 50% a 100%.
Distribución: Después de la administración IV, los anticuerpos monoclonales usualmente siguen un perfil de concentración en suero (o plasma) bifásica-tiempo, comenzando con una fase de rápida distribución, seguido por una fase de lenta eliminación. En general, un modelo farmacocinético biexponencia I describe mejor este tipo de perfil farmacocinético. El volumen de distribución en el compartimento central (Ve) para un mAb es usualmente igual a o ligeramente mayor que el volumen en el plasma (2-3 litros). Un patrón bifásico distinto en perfil de concentración en suero (plasma) contra tiempo puede no ser evidente con otras rutas de administración, tales como IM o SC, ya que la fase de distribución de la curva de concentración en suero (plasma)-tiempo se enmascara por la porción de larga absorción. Muchos factores, incluyendo propiedades físico-químicas, consumo mediado por receptor orientado por objetivo y de sitio específico, capacidad de unión de tejido, y dosis de mAb pueden influenciar la biodistribución de un mAb. Algunos de estos factores pueden contribuir a la no linealidad en la biodistribución para un mAb.
Metabolismo y Excreción: Debido al tamaño molecular, los anticuerpos monoclonales intactos no son excretados a la orina a través del riñon. Estos son principalmente inactivados mediante el metabolismo (por ejemplo, catabolismo). Para anticuerpos monoclonales terapéuticos a base de IgG, las vidas medias típicamente varían de horas a 1-2 días a más de 20 días. La eliminación de un mAb puede ser efectuada a través de muchos factores, incluyendo, pero no limitándose a, afinidad para el receptor FcRn, inmunogenicidad del mAb, el grado de glicosilación del mAb, la susceptibilidad del mAb a proteólisis, y eliminación mediada por receptor.
B.11 Patrón de reactividad cruzada de tejido en especies humanas y toxicológicas El patrón de tinción idéntico sugiere que la toxicidad humana potencial puede ser evaluada en especies toxicológicas. Las especies toxicológicas son aquellos animales en donde se estudia la toxicidad no relacionada.
Los anticuerpos individuales se seleccionan para satisfacer dos criterios. (1) Tinción de tejido apropiada para la expresión conocida del anticuerpo objetivo. (2) Patrón de tinción similar entre tejidos humanos y especies toxicológicas del mismo órgano.
Criterio 1: Las inmunizaciones y/o selecciones de anticuerpo típicamente emplean antígenos recombinantes o sintetizados (proteínas, carbohidratos u otras moléculas). La unión a la contraparte natural y contra-clasificación contra antígenos no relacionados por lo regular son parte del embudo de clasificación para anticuerpo terapéuticos. Sin embargo, la clasificación contra una multitud de antígenos es por lo regular impráctica. Por lo tanto, los estudios de reactividad cruzada con tejidos humanos de todos los órganos principales sirven para regular la unión no deseada del anticuerpo a cualquier antígeno no relacionado.
Criterio 2: Los estudios de reactividad cruzada de tejido comparativos con especies tejidos humanos y especies toxicológicas (mono cinomolgo, perro, posiblemente roedores y otros, los mismos 36 ó 37 tejidos han sido probados como en el estudio humano) ayudan a validar la selección de una especie toxicológica. En los estudios típicos de reactividad cruzada en secciones de tejidos congelados se puede demostrar la unión esperada al antígeno conocido y/o, a un grado menor, la unión a tejidos basándose ya sea en interacciones de bajo nivel (unión no específica, unión de bajo nivel a antígenos similares, interacciones a base de carga de bajo nivel, etc.). En cualquier caso, la especie animal toxicológica más relevante es aquella con el grado más alto de coincidencia de unión a tejido humano y animal.
Los estudios de reactividad cruzada siguen líneas de guía reguladoras apropiadas incluyendo EC CPMP Guideline 111/5271/94 "Production and quality control of mAbs" y 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Crio-secciones (5 pm) de tejidos humanos obtenidos de autopsia o" biopsia se fijaron y secaron sobre un objeto de vidrio. Se realizó la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina. FDA's Guidance "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Las referencias relevantes incluyen Clarke J 2004, Boon L. 2002a, Boon L 2002b, Ryan A 1999.
Los estudios de reactividad cruzada de tejido por lo general se realizan en dos etapas, la primera etapa incluyendo crio-secciones de 32 tejidos (típicamente: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga, corazón, músculo esquelético, células sanguíneas, riñon, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, mama, pulmón, bazo, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cerebral, ovario, timo, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uréter, ojo, pituitaria, útero, trompa de Falopio y placenta) de un donador humano. En la segunda fase, se realiza un estudio de reactividad cruzada completo con hasta 38 tejidos (incluyendo adrenal, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cérvíx, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de pecho, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervios periféricos, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uréter, vejiga urinaria, y útero) de 3 adultos no relacionados. Los estudios se realizaron típicamente a niveles mínimos de dos dosis.
El anticuerpo terapéutico (es decir, artículo de prueba) y el anticuerpo de control de isotipo coincidente pueden se biotinilados para detección del complejo de avidina-biotina (ABC); otros métodos de detección pueden incluir detección de anticuerpo terciario para un artículo de prueba marcada FITC (o de otra manera), o pre-formando complejo con una IgG antí-humana marcada para un artículo de prueba no marcado.
Brevemente, crio-secciones (aproximadamente 5 µ?) de tejidos humanos obtenidos en autopsia o biopsia se fijaron y secaron sobre un objeto de vidrio. Se realizó la tinción con peroxidasa de secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina. Primero (en caso de un sistema de detección de pre-formación de complejo), el artículo de prueba se incubó con la . lgG anti-humana biotinilada secundaria y se desarrolló en un complejo inmunológico. El complejo inmunológico a las concentraciones finales de 2 y 10 pg/ml del artículo de prueba se agregó a secciones de tejido sobre el objeto de vidrio y después las secciones de tejidos se hicieron reaccionar durante 30 minutos con un equipo de avidina-biotina-peroxidasa. Subsecuentemente, se aplicó DAB (3,3'-diaminobenzidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para la tinción de tejido. Se utilizaron perlas de antígeno-Sepharose como secciones de tejido de control positivo.
Se juzgó que cualquier tinción específica es ya sea una reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión de antígeno) o inesperada basándose en la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada específica es clasificada para intensidad y frecuencia. Estudios de competencia o bloqueo de antígeno o suero pueden ayudar además para determinar si la tinción observada es especifica o no especifica.
Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionados satisfacen los criterios de selección, tinción apropiada de tejido, tinción coincidente entre tejido específico humano y animal toxicológico, éstos pueden ser seleccionados para la generación de DVD-lg.
El estudio de reactividad cruzada de tejido tiene que ser repetido con la construcción final de DVD-lg, pero aunque estos estudios siguen el mismo protocolo como se presenta aquí, son más complejos para evaluar ya que cualquier unión viene de cualquiera de los dos anticuerpos parentales, y cualquier unión no explicada necesita ser confirmada con estudios de competencia de antígeno de complejo.
Es fácilmente evidente que el complejo que toma estudios de reactividad cruzada de tejido con una molécula multi-específ ica como una DVD-lg es enormemente simplificado si los dos anticuerpos parentales son seleccionados para (1) falta de hallazgos de reactividad cruzada de tejido inesperados y (2) para similitud apropiada de hallazgos de reactividad cruzada de tejido entre los tejidos de especies humanas y toxicológicas correspondientes.
B12. Especificidad y selectividad: Para generar una molécula de DVD-lg con especificidad y selectividad deseadas, se necesita generar y seleccionar mAbs parentales con el perfil de especificidad y selectividad similarmente deseado.
Los estudios de unión para especificidad y selectividad con una DVD-lg pueden formarse en complejo debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada uno para cada antígeno. Brevemente, los estudios de unión utilizando ELISA, BIAcore. KinExA u otros estudios de interacción con una DVD-lg necesitan verificar la unión de uno, dos o más antígenos a la molécula de DVD-lg. Aunque la tecnología de BIAcore puede resolver la unión secuencial, independiente de múltiples antígenos, métodos más tradicionales incluyendo ELISA o técnicas más modernas como KinExA no pueden. Por lo tanto, la caracterización cuidadosa de cada anticuerpo parental es crítica. Después de que cada anticuerpo individual ha sido caracterizado para especificidad, la confirmación de retención de especificidad de los sitios de unión individuales en la molécula de DVD-lg es enormemente simplificada.
Es fácilmente evidente que el complejo que toma la determinación de la especificidad de una DVD-lg es enormemente simplificada si se seleccionan dos anticuerpos parentales para especificidad antes de ser combinados con una DVD-lg.
Los estudios de interacción de antígeno-anticuerpo pueden tomar muchas formas, incluyendo estudios de interacción de proteína-proteína clásicos, incluyendo ELISA (ensayo por ¡nmunoabsorción ligado a 1 enzimas), espectrometría masiva, entrelazamiento químico, SEC con difusión de luz, diálisis de equilibrio, penetración de gel, ultrafiltración , cromatografía de gel, SEC analítica de zona grande, ultracentrifugación de micro-preparación (equilibrio de sedimentación), métodos espectroscópicos, micro-calorimetría de titulación, equilibrio de sedimentación (en ultracentríf uga analítica), velocidad de sedimentación (en centrífuga analítica), resonancia de plasmón superficial (incluyendo BIAcore). Referencias relevantes incluyen "Current Protocols in Protein Science", John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volumen 3, capítulos 19 y 20, publicada por John Wiley & Sons Inc., y referencias citadas ahí y "Current Protocols ¡n Immunology", John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (eds.) publicadas por John Wiley & Sons Inc y referencias relevantes incluidas ahí.
Liberación de citocina en sangre entera: La interacción de mAb con células de sangre humana puede ser investigada a través de un ensayo de liberación de citocina (Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190; "Current Protocols in Pharmacology", SJ. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) publicada por John Wiley & Sons Inc; Madhusudan, S. Clinical Cáncer Research (2004), 10(19), 6528-6534; Cox, J. Methods (2006), 38(4), 274-282; Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1), 94-106). Brevemente, se incubaron varias concentraciones de mAb con sangre entera durante 24 horas. La concentración probada debe cubrir una amplia escala, incluyendo concentraciones finales que imitan niveles de sangre típicos en pacientes (incluyendo, pero no limitándose a, 100 ng/ml - 100 g/ml). Después de la incubación, se analizaron los sobrenadantes y lisados de célula para la presencia de IL-1Ra, TNF-a, 1 L - 1 b , IL-6 e IL-8. Los perfiles de concentración de citocina generados para mAb se compararon con perfiles producidos a través de un control de IgG humano negativo y un control LPS o PHA positivo. El perfil de citocina presentado por mAb a partir tanto de sobrenadantes de célula como lisados de célula se comparó con la IgG humana de control. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal no interactúa con células de sangre humana para liberar espontáneamente citocinas inflamatorias.
Los estudios para la liberación de citocina para una DVD-lg con complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada para cada antígeno. En resumen, los estudios de liberación de citocina, como se describe aquí, miden el efecto de toda la molécula de DVD-lg en sangre entera u otros sistemas de célula, pero pueden resolver qué porción de la molécula ocasiona la liberación de citocina. Una vez que se ha detectado la liberación de citocina, la pureza de la preparación de DVD-lg tiene que ser determinada, ya que algunos componentes celulares de co-pur¡f icación pueden ocasionar la liberación de citocina en ella misma. Si la pureza no es emitida, la fragmentación de DCD-lg (incluyendo, peo no limitándose a la remoción de la porción Fe, separación de sitios de unión, etc.), mutagénesis de sitio de unión u otros métodos necesitan ser empleados para desconvolucionar cualquier observación. Es fácilmente evidente que este complejo que se toma es enormemente simplificado si los dos anticuerpos parentales son seleccionados para la falta de liberación de citocina antes de ser combinados en una DVD-lg.
B.13 Reactividad cruzada a otros especies para estudios toxicológicos En una modalidad, los anticuerpos individuales seleccionados con suficiente reactividad cruzada para especies toxicológicas apropiadas, por ejemplo, mono cinomolgo. Los anticuerpos parentales necesitan unirse a especies objetivo ortólogas (es decir, mono cinomolgo) y producir una respuestas apropiada (modulación, neutralización, activación). En una modalidad, la reactividad cruzada (afinidad/potencia) a especies objetivo ortólogas debe ser 10 más del objetivo humano. En la práctica, los anticuerpos parentales son evaluados para especies múltiples, incluyendo ratón, rata, perro, mono (y otros primates no humanos), así como especies de modelo de enfermedad (es decir, ovejas para modelo de asma). La reactividad cruzada aceptable para especies toxicológicas de los anticuerpos monoclonales parentales permite estudios toxicológicos futuros de DVD-lg-lg en la misma especie. Por esa razón, los dos anticuerpos monoclonales parentales deben tener una reactividad cruzada aceptable para una especie toxicológica común, permitiendo así estudios de DVD-lg en la misma especie.
Se pueden selecciona mAbs parentales de varios mAbs capaces de unir objetivos específicos y bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-TNF (Patente de E.U.A. 6,258,562), anticuerpo anti-IL-12 y/o anti-IL- 2p40 (Patente de E.U.A. No. 6,914,128); anticuerpo anti-IL-18 (US 2005/0147610 Al), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp!20, anti-VLA-4, anti- CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (por ejemplo, ver WO2007124299) anti-ld, anti-ICAM-1. anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-c et, anti DLL-4, anti-NPR1 , anti-PLGF, ant¡-ErbB3, anti-E-selectina, anti-Fact VII, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD111/18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti CD-19, ant¡-CD80 (por ejemplo, ver WO2003039486) , anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti-alpha4beta7 , anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (por ejemplo, ver Patente de E.U.A. NO: 5,789,554), ant¡-CD20, anti-MIF, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, anti-gpllbllia, anti-lgE, ant¡-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGF1,2, anti IGFR, anti-VNRintegrina, anti-IL-1 alfa, anti-IL-lbeta, receptor anti-IL-1 , receptor anti-IL-2, anti-IL-4, receptor anti-IL-4, a nti-l L5 , receptor anti-IL-5, anti-IL-6, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-IL- 13 receptor, anti-IL-17, and anti-IL-23 (ver Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic anticuerpos J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 y http://www. path. cam ac.uk/~mrc7/humanisation/anticuerpos. html) .
También se pueden seleccionar mAbs de varios anticuerpos aprobados para uso, en estudios clínicos, o en el desarrollo para uso clínico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, (Rituxan®, I DEC/Genentech/Roche) (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 5,736,137), un anticuerpo quimérico anti-CD20 aprobado para tratar linfoma de no Hodgkin; HuMa.x-CD20, un anti-CD20 actualmente desarrollado por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Pat; E.U.A. No. 5, 500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (lntracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, intitulada " Variantes de Inmunoglobulina y Sus Usos), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), actualmente siendo desarrollado por Genentech; un anticuerpo ant¡-Her2 descrito en Pat. E.U.A. No. 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (Pat. E.U.A. No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo quimérico anti-EGFR en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (Pat. E.U.A. No. 6,235,883), actualmente siendo desarrollado por Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax- EGFr (U.S. Ser. No. 10/172,317), actualmente siendo desarrollado por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (Pat. E.U.A. No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Aren Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7) : 773-83) ; ICR62 (Institute of Cáncer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá and Centra de Immunologia Molecular, Cuba (Pat. E.U.A. No. 5,891,996; Pat. E.U.A. No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3 ( ) : 71 - 81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MRI-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un mAb humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia crónica de célula B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD33 (p67 proteína) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), una fusión anti-LFA-3 Fe desarrollada por Biogen), abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, ¡nfliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148), un anticuerpo totalmente humano TNF desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión Fe del receptor p75 TNF desarrollada por I mmunex/Amgen, lenercept, una fusión Fe del receptor p55TNF previamente desarrollada por R oche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-l L8 siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 siendo desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFGI), un ant¡-MUC1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 siendo desarrollado por Antisoma, Angio ab (AS 1405), siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1, siendo desarrollado por Antisoma, Thioplatin (AS 1407) siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta- 1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-VLA-1 integrina siendo desarrollado por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo de receptor anti-linfotoxina (LTBR) siendo desarrollado por Biogen beta, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF-32 siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo a n t i - 1 L - 12 p40 siendo desarrollado por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGF 1 siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxin siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1 mAb, un anticuerpo a nti-TRAI L-R1 s iendo desarrollado p or Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences, Inc. , Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo de la familia del receptor anti-HER siendo desarrollado por Genentech, Factor Anti-Tejido (ATF), un anticuerpo del Factor anti-Tejido siendo desarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE siendo desarrollado p or G enentech, Raptiva® (Efalizumab), un anticuerpo anti-CD11a siendo desarrollado por Genentech and Xoma, anticuerpo MLN-02 (antiguamente LDP-02), siendo desarrollado por Genentech and Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por Genmab, HuMax- IL 15, un anticuerpo anti-l L 15 siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-Inflam, siendo desarrollado por Genmab and Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I siendo desarrollado por Genmab and Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-TAC, siendo desarrollado por Genmab, IDEC-131 , y un anticuerpo anti-CD40L siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC- 152, un anti-CD23 siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos de factor de migración anti-macrófago (MIF) siendo desarrollados por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico siendo desarrollado por Imclone, IMC-IC11, un anticuerpo anti-KDR siendo desarrollado por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos anti-VE cadherina siendo desarrollado por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo anti-carcinoembriónico (CEA) siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide, siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-101, un anticuerpo anti-CTLA4 siendo desarrollado por Medarex, MDX- 060, un anticuerpo anti-CD30 siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 siendo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-1), y un anticuerpo anti-Her2 siendo desarrollado por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado por Medarex and Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo a nti - 1 L 5 siendo desarrollado por Medarex and Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa siendo desarrollado por Medarex and Centocor/J&J , CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos de molécula-1 de adhesión anti-intercelular (ICAM-I) (CD54) siendo desarrollados por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo de receptor 3 de factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3) siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo interferón anti-gamma siendo desarrollado por Protein Design Labs, Anti-a 5ß? Integrina, siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-IL-12, siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM siendo desarrollado por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-lgE humanizado desarrollado por Genentech and Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti-Beta2 integrina siendo desarrollado por Xoma, todas las referencias citadas aquí en este párrafo se incorporan expresamente aquí para referencia. En otra modalidad, los terapéuticos incluyen KRN330 (Kirin); anticuerpo h uA33 (A33, Ludwig Institute for Cáncer Research); CNTO 95 (alfa V integrinas, Centocor); MEDI-522 (alfa \ ß3 integrina, Medimmune); volociximab (alfa \ ß1 ¡ntegrina, Biogen/PDL); mAb 216 Humano (epítopo glicosilado de célula B, NCI); BiTE MT103 (CD19 x CD3 biespecíf ico, Medimmune); 4G7xH22 (BcelIxFcgammaRI biespecíf ico, Medarex/Merck KGa); rM28 (CD28 x MAPG biespecífico, Patente de E.U.A. No. EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (CD64 x EGFR biespecífico, Medarex); Catumaxomab (removab) (EpCAM x anti-CD3 biespecífico, Trion/Fres); Ertumaxomab (HER2/CD3 biespecífico, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (anhidrasa carbónica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglin), Tracon); BMS-663513 (agonista CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor fe CD3, PDL Biopharma); HeF¡-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genetics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); h LL 1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágeno dividido, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (agonista DR4 TRAIL-R1, Human Genome Science /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (agonista DR5 TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvlll, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor a de folato, Morphotech); KW-2871 (gangliosida GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (cadena HLA-DR beta, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-IR, Amgen); anti-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R , Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (Receptor de tipo Ig de célula asesina (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cáncer Research); hCBE-11 (LTBR, Biogen); HuHMFGI (MUC1 , Antisoma/NCI); RAV12 (epítopo de carbohidrato N-enlazado, Raven); CAL (proteina relacionada con hormona de paratiroides (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PDI, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PDI, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (inhibidor TGFb (pan) (lgG4), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (receptor de transferrina, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (receptor de transferrina, Salk Institute); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV83.3 (VEGF, Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).
B. Construcción de moléculas de DVD La molécula de inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-lg) se diseña de manera que dos diferentes dominios variables de cadena ligera (VL) de dos diferentes anticuerpos monoclonales parentales se enlazan en tándem directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguido por el dominio constante de cadena ligera. Similarmente, la cadena pesada comprende dos diferentes dominios variables de cadena pesada (VH) enlazados en tándem, seguido por el dominio constante CH1 y la región Fe (Figura 1A).
Los dominios variables pueden ser obtenidos utilizando técnicas; de ADN recombinante de un anticuerpo parental generado por cualquiera de los métodos descritos aquí. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera de murino. En otra modalidad, el dominio variable es una CDR injertada o un dominio variable de cadena pesada o ligera humanizado. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera humano.
En una modalidad, los primero y segundo dominios variables son enlazados directamente entre sí utilizando técnicas de ADN recombinante. En otra modalidad, los dominios variables son enlazados a través de una secuencia enlazadora. En una modalidad, se enlazan dos dominios variables. Tres o más dominios variables también pueden ser enlazados directamente o a través de una secuencia enlazadora. Los dominios variables pueden unir el mismo antígeno o pueden unir diferentes antígenos. Las moléculas de DVD de la invención pueden incluir un dominio variable de inmunoglobulina y un dominio variable de no inmunoglobulina tal como un dominio de unión a ligando de un receptor, dominio activo de una enzima. Las moléculas de DVD también pueden comprender 2 o más dominio no Ig.
La secuencia enlazadora puede ser una secuencia de aminoácido o polipéptido individual. En una modalidad, las secuencias enlazadoras se selecciona del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO: 1); AKTTPKLEEGEF SEARV (SEC ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEC ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP (SEC ID NO: 5); RADAAP (SEC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC ID NO: 9), S AKTTPKLEEGEF SEARV (SEC ID NO: 10); ADAAP (SEC ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC ID NO: 19); AKTT APSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID NO: 25); GH EAAAVMQVQYPAS (SEC ID NO: 26). La elección de las secuencias enlazadoras se basa en el análisis de estructura de cristal de varias moléculas Fab. Existe un enlace flexible natural entre el dominio variable y el dominio constante CH1/CL en una estructura molecular de Fab o de anticuerpo. Este enlace natural comprende aproximadamente 10-12 residuos de aminoácido, contribuidos por 4-6 residuos del término C del dominio V y 4-6 residuos del término N del dominio CL/CH1. Las DVD-lgs de la invención se generaron utilizando 5-6 residuos de aminoácido N-terminales, ó 11-12 residuos de aminoácido, de CL o CH1 como enlazador en la cadena ligera y pesada de DVD-lg, respectivamente. Los residuos N-terminales de los dominios CL o CH1, particularmente los primeros 5-6 residuos de aminoácido, adoptan una conformación de bucle sin estructuras secundarias fuertes, por lo tanto, pueden actuar como enlazadores flexibles entre los dos dominios variables.
Los residuos N-terminales de los dominios CL o CH1 son la extensión natural de los dominios variables, ya que son parte de la secuencias de Ig, por lo tanto reducen al mínimo a una gran grado cualquier inmunogenicidad que potencialmente surja de los enlazadores y uniones.
Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1 , pero no todos los residuos del dominio CL/CH1 ; por ejemplo, los primeros 5-12 residuos de aminoácido de los dominios CL/CH1 ; los enlazadores de cadena ligera pueden ser de'Cic o C ; y los enlazadores de cadena pesada pueden derivarse de CH1 de cualquier isotipo, incluyendo Cy1 , Cy2, Cy3, Cy4, Cal , Ca2, C5, CE, y Cp. Las secuencias enlazadoras también pueden derivarse de otras proteínas tales como proteínas de tipo Ig, (por ejemplo, TCR, FcR, KIR); secuencias a base de G/S (por ejemplo, repeticiones G4S) (SEC ID NO: 27); secuencias derivadas de la región de gozne; y otras secuencias naturales de otras proteínas.
En una modalidad, un dominio constante es enlazado a los dos dominios variables enlazados utilizando técnicas de ADN recombinante. En una modalidad, la secuencia que comprende dominios variables de cadena pesada enlazados está enlazada a un dominio constante de cadena pesada y la secuencia que comprende dominios variables de cadena ligera está enlazada a un dominio constante de cadena ligera. En una modalidad, los dominios constantes son un dominio constante de cadena pesada humano y un dominio constante de cadena ligera humano, respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada de DVD además está enlazada a una región Fe. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa, o una región Fe variante. En otra modalidad, la región Fe es una región Fe humana. En otra modalidad, la región Fe incluye una región Fe de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En otra modalidad, dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera se combinan para formar una molécula de DVD-lg. El Cuadro 2 lista secuencias de aminoácido de regiones VH y VL de anticuerpos ilustrativos para objetivos útiles para tratar una enfermedad, por ejemplo, para tratar cáncer. En una modalidad, la invención proporciona un DVD comprendiendo por lo menos dos de las regiones VH y/o VL listada en el Cuadro 2, en cualquier orientación.
Cuadro 2. Lista de Secuencias de Aminoácido de Regiones VH y VL de Anticuerpos para la Generación de DVD-lgs Una descripción detallada de las moléculas de DVD-lg específicas capaces de unir objetivos específicos, y métodos para hacer las mismas, se proporciona en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante.
C. Producción de proteínas de DVD Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser producidas a través de cualquier número de técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, la expresión a partir de células huésped, en donde los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada de DVD y ligera de DVD son transfectados a una célula huésped a través de técnicas estándares. Se pretenden varias formas del término "transfección" para abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno a una célula huésped procariótica o eucarionte, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrana, y similares. Aunque es posible expresar las proteínas de DVD de la invención en células huésped ya sea procarióticas como eucariontes, las proteína de DVD se expresan en células eucariontes, por ejemplo, células huésped de mamífero, ya que dichas células eucariontes (y en particular células de mamífero) es más probable que se ensamblen y secreten una proteína de DVD apropiadamente doblada e inmunológicamente activa que las células procarióticas.
Células huésped de mamífero ilustrativas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77_:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionado DHFR, por ejemplo, como se describe por RJ. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol.
Biol. 159:601 - 621), células de mieloma NSO, células COS, células SP2 y PER.C6. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican proteínas de DVD a células huésped de mamífero, las proteínas de DVD se producen cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas de DVD en las células huésped o secreción de las proteínas de DVD en el medio de cultivo en donde se desarrollan las células huésped. Las proteínas de DVD pueden ser recuperadas del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándares.
En un sistema ilustrativo para la expresión recombinante de proteínas de DVD de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto el DVD de cadena pesada como el DVD de cadena ligera es introducido en células dhfr-CHO a través de transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de DVD de cadena pesada y ligera cada uno es operativamente enlazado a elementos reguladores de mejorador de CMV/promotor de AdMLP para dirigir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DKFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación mediante metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas son cultivadas para permitir la expresión de DVD de cadena pesada y ligera y la proteína de DVD intacta es recuperada del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular estándares para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar células huésped, seleccionar transformantes, cultivar las células huésped y recuperar la proteína de DVD del medio de cultivo. Aún más, la invención proporciona un método para sintetizar una proteína de DVD de la invención cultivando una célula huésped de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza una proteína de DVD de la invención. El método además puede comprender aislar la proteína de DVD del medio de cultivo.
Una característica importante de una DVD-lg es que puede ser producida y purificada en una forma similar a un anticuerpo convencional. La producción de DVD-lg da como resultado un producto principal, individual, homogéneo con actividad específica doble deseada, sin ninguna modificación de secuencia de la región constante o modificaciones químicas de cualquier tipo. Otros métodos previamente descritos para generar proteínas de unión de longitud completa "biespecífícas", "multiespecíficas", y "multiespecíf ¡cas, multivalentes" no conducen a un producto individual primario, sino que más bien conduce a la producción ¡ntracelular o secretada de una mezcla de proteínas de unión de longitud completa, mono-específica, multiespecífica, multivalente, inactiva, ensamblada, y proteínas de unión de longitud completa multivalentes con la combinación de diferentes sitios de unión. Como un ejemplo, basándose en el diseño descrito por Miller y Presta (publicación de OCT WO 2001/077342 (A1)), existen 16 posibles combinaciones de cadenas pesadas y ligeras. Consecuentemente, solo el 6.25% de la proteína probablemente estará en la forma activa deseada, y no como un producto individual principal o producto individual primario comparado con las otras 15 posibles combinaciones. La separación de las formas totalmente activas, deseada de la proteína a partir de las formar inactivas y parcialmente activas de la proteína utilizando técnicas de cromatografía estándares, típicamente usadas en la fabricación a gran escala, aún se va a demostrar.
Sorprendentemente el diseño de las "proteínas de unión de longitud completa, multivalentes, dobles específicas" de la presente invención conduce a una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble que ensamblan principalmente a las "proteínas de unión de longitud completa, multivalentes, dobles específicas".
Por lo menos el 50%, por lo menos 75% y por lo menos 90% de las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable doble ensambladas, expresadas, son la proteína tetravalente doble específica. Este aspecto de la invención particularmente mejora la utilidad comercial de la invención. Por lo tanto, la presente invención incluye un método para expresar una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble en una célula individual que conduce a un producto individual primario de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente, doble específica".
La presente invención proporciona un método para expresar una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble en una célula individual que conduce a un "producto primario" de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente doble específica", en donde el "producto primario" es más del 50% de toda la proteína ensamblada, comprendiendo una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble.
La presente invención proporciona métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble en una célula individual conduciendo a un "producto primario" individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente doble, específica", en donde el "producto primario" es más del 75% de toda la proteína ensamblada, comprendiendo una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble.
La presente invención proporciona métodos para expresar una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble en una célula individual conduciendo a un "producto primario" individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente doble, específica", en donde el "producto primario" es 'más del 90% de toda la proteína ensamblada, comprendiendo una cadena ligera de dominio variable doble y una cadena pesada de dominio variable doble.
II. Proteínas de unión de DVD deri vatizadas Una modalidad proporcionar una proteína de unión marcada o etiquetada, en donde la proteína de unión de la invención es derivatizada o enlazada a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención puede ser derivada enlazando funcionalmente una proteína de unión de la invención (a través de acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra cosa) a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueden mediar la asociación de la proteína de unión con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de poli-histidina).
Los agentes detectables útiles con los cuales una proteína de unión de la invención puede ser derivatizada incluyen compuestos fluorescentes. Agentes detectables fluorescentes ilustrativos incluyen fluoresceína, ¡sotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, f ¡coeritrina, y similares. Una proteína de unión también puede ser derivatizada con enzimas detectables, tales como fosfatase alcalina, peroxidasa de rábano, oxidasa de glucosa, y similares. Cuando una proteína de unión es derivatizada con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando un agente detectable, tal como peroxidasa de rábano, está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina conduce a un producto de reacción de color, el cual es detectable. Una proteína de unión también puede ser derivatizada con biotina, y detectada a través de medición indirecta de unión de avidina o estreptavidina.
Otra modalidad de la invención proporciona una proteína de unión cristalizada y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una modalidad, la proteína de unión cristalizada tiene una vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra modalidad, la proteína de unión retiene la actividad biológica después de cristalización.
La proteína de unión de cristalización de !a invención puede ser producida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y como se describe en WO 02072636, incorporada aquí para referencia.
Otra modalidad de la invención proporciona una proteína de unión glicosilada, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteína in vivo naciente puede experimentar procesamiento adicional, conocido como modificación de postraducción. En particular, se pueden agregar enzimáticamente residuos de azúcar (glicosilo), un procedimiento conocido como glicosilación. Las proteínas resultantes que llevan cadenas laterales de oligosacárido covalentemente unidas son conocidas como proteínas glicosiladas o glicoproteínas. Los anticuerpos son glicoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fe, así como el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe tienen un efecto importante en la función efectora del dominio Fe, con un efecto mínimo en la unión a antígeno o la vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pág. 11-16). En contraste, la glicosilación del dominio variable puede tener un efecto en la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. La glicosilación en el dominio variable puede tener un efecto negativo en la afinidad de unión de anticuerpo, probablemente debido a la ¡mpedancia estérica (Co, M.S. et al, Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), o dar como resultado una afinidad incrementada para el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
Un aspecto de la presente invención está dirigido a generar mutantes de sitio de glicosilación en los cuales el sitio de glicosilación O- u N-enlazados de la proteína de unión ha sido mutado. Un experto en la técnica puede generar dichos mutantes utilizando tecnologías estándares bien conocidas. Los mutantes de sitio de glicosilación que retienen la actividad biológica pero tienen una actividad de unión incrementada o reducida son otro objeto de la presente invención.
En otra modalidad, la glicosilación del anticuerpo o porción de unión a antígeno de ia invención es modificada. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede ser alterada, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más substituciones de aminoácido que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de región variable para eliminar así la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dicho aspecto se describe con mayor detalle en la Publicación de PCT WP 2003016466A2, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,714,350 y 6,350,861, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad.
Además o alternativamente, se puede hacer una proteína de unión modificada de la invención que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado teniendo cantidades reducidas de residuos de fucosilo (ver, Kanda, Yutaka et al., Journal of Biotechnology (2007), 130(3), 300-310) o un anticuerpo teniendo estructuras incrementadas de GIcNAc de bisección. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterados incrementan la habilidad ADCC de anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden ser logradas, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada y pueden ser utilizadas como células huésped en donde se expresan anticuerpos recombinantes de la invención para producir así un anticuerpo con glicosilacion alterada. Ver, por ejemplo, Shields, . L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como también, Patente Europea No: EP 1,176,195; Publicaciones de PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad.
La glicosilacion de proteína depende de la secuencia de aminoácido de la proteína de interés, así como la célula huésped en donde se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilacion (por ejemplo, glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes substratos (azúcares de nucleótido) disponibles. Debido a dichos factores, el patrón de glicosilacion de proteína y la composición de residuos de glicosilo, pueden diferir dependiendo del sistema huésped en donde la proteína particular es expresada. Los residuos de glicosilacion útiles en la invención pueden incluir, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. En una modalidad, la proteína de unión glicosilada comprende residuos de glicosilo de manera que el patrón de glicosilacion es humano.
Es sabido por aquellos expertos en la técnica que la glicosilacion de proteína de diferenciación puede dar como resultado características de proteína de diferenciación. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo huésped, tal como levadura, y glicosilada utilizando la trayectoria endógena de levadura puede ser reducida comparada con aquella de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea de célula CHO. Dichas glicoproteínas también pueden ser inmunogénicas en seres humanos y muestran vida media reducida in vivo después de administración. Los receptores específicos en seres humanos y otros animales pueden reconocer residuos de glicosilación específicos y promueven la rápida eliminación de la proteína a partir del a corriente sanguínea. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el pliegue de proteína, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, capacidad de formar compartimentos, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad , o alergenicidad. Por consiguiente, un practicante puede elegir una proteína terapéutica con una composición específica y patrón de glicosilación, por ejemplo, composición de glicosilación y patrón idénticos, o por lo menos similares, a aquella producida en células humanas o en las células de especie específica del animal pretendido.
La expresión de proteínas glicosíladas diferente de una célula huésped puede lograrse modificando genéticamente la célula huésped para expresar enzimas de glicosilación heterólogas. Utilizando técnicas conocidas en el campo, un practicante puede generar anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos exhibiendo glicosilación de proteína humana. Por ejemplo, las cepas de levadura han sido genéticamente modificadas para expresar enzimas de glicosilación de existencia no natural de manera que las proteínas glicosíladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levadura exhiben glicosilación de proteina idéntica a aquella de células de animal, especialmente células humanas (solicitudes de patente de E.U.A. 200440018590 y 20020137134 y publicación de PCT WO 2005100584 A2).
Además de las proteínas de unión, la presente invención también está dirigida a anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) específicos para dichas proteínas de unión de la invención. Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo, el cual reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión de antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld puede ser preparado inmunizando un animal con la proteína de unión o una región del mismo conteniendo CDR. El animal inmunizado reconocerá, y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización y producirá un anticuerpo anti-ld. Es fácilmente evidente que puede ser más fácil generar anticuerpos anti-idiotípicos para los dos o más anticuerpos parentales incorporados a una molécula de DVD-lg; y confirmar estudios de unión a través de métodos bien reconocidos en la técnica (por ejemplo, BIAcore, ELISA) para verificar que los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el idiotipo de cada anticuerpo parental también reconocen el idiotipo (por ejemplo, sitio de unión a antígeno) en el contexto de la DVD-lg. Los anticuerpos anti-idiotípicos especificados para cada uno de los dos o más sitios de unión a antígeno de una DVD-lg proporcionan reactivos ideales para medir concentraciones de DVD-lg de una DVD-lg humana en el suero de un paciente; se pueden establecer ensayos de concentración de DVD-lg utilizando un "formato de ELISA de ensayo de emparedado" con un anticuerpo para primeras regiones de unión a antígeno cubiertas en la fase sólida (por ejemplo, oblea de BIAcore, placa de ELISA, etc.), enjuagado con un regulador de pH de enjuague, incubación con la muestra de suero, otro paso de enjuague y finalmente incubación con otro anticuerpo anti-idiotípico para el otro sitio de unión a antígeno, marcado a sí mismo con una enzima para la cuantificación de la reacción de unión. En una modalidad, para una DVD-lg con más de dos sitios de unión diferentes, los anticuerpos anti-idiotípicos para los dos sitios de unión más externos (más lejos y cerca de la región constante) no solo ayudarán a determinar la concentración de DVD-lg en suero humano, sino que también documentarán la integridad de la molécula in vivo. Cada anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "¡nmunógeno" para inducir una respuesta inmune en aún otro animal, produciendo un así llamado anticuerpo anti-anti-ld.
Además, se apreciará por un experto en la técnica que una proteína de interés puede ser expresada utilizando una biblioteca de células huésped genéticamente diseñadas por ingeniería para expresar varias enzimas de glicosilación, de manera que las células huésped de miembro de la biblioteca producen la proteína de interés con patrones de glicosilación variantes. Un practicante entonces puede seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glicosilación novedosa particular. En una modalidad, la proteína que tiene un patrón de glicosilación novedoso particularmente seleccionado exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
III. Usos de DVD-lg Dada su habilidad para unirse a dos o más antígenos, las proteínas de unión de la invención pueden ser utilizadas para detectar los antígenos (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), o inmunohistoquímica de tejido. La DVD-lg es directa o indirectamente marcada con una substancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las substancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-ga lactosidasa , o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamína, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 3?, 1 C 35S, 90Y, "Te, 111ln, 1251, 1311, 177 Lu, 166Ho, o 153Sm.
En una modalidad, las proteínas de unión de la invención son capaces de neutralizar la actividad de los antígenos in vitro e in vivo. Por consiguiente, dichas DVD-lgs pueden ser utilizadas para inhibir la actividad de antígeno, por ejemplo, en un cultivo de célula conteniendo los antígenos, en sujetos seres humanos o en otros sujetos mamíferos teniendo los antígenos con los cuales una proteína de unión de la invención reacciona en forma cruzada. En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir la actividad de antígeno en un sujeto que sufre de una enfermedad o trastorno en donde la actividad de antígeno es dañina. Una proteína de unión de la invención puede ser administrada a un ser humano para propósitos terapéuticos.
Como se utiliza aquí el término "un trastorno en donde la actividad de antígeno es dañina" pretende incluir enfermedades u otros trastornos en donde la presencia del antígeno es un sujeto que sufre del trastorno ha mostrado que es o tiene sospecha de ser ya sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. P or consiguiente, un trastorno en donde la actividad de antígeno es peligrosa es un trastorno en donde se espera que la actividad de antígeno alivie los síntomas y/o la progresjón del trastorno. Dichos trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, a través de un incremento en la concentración del antígeno en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un incremento, en la concentración del antígeno en el suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto). Ejemplos no limitantes de trastornos que pueden ser tratados con las proteínas de unión de la invención incluye aquellos trastornos discutidos más adelante y en la sección que se refiere a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
Las DVD-lgs de la invención pueden unir un antígeno o múltiples antí.genos. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, los objetivos listados en las siguientes bases de datos, dichas bases de datos se incorporan aquí para referencia. Estas bases de datos objetivo incluyen estas listas: Therapeutic targets (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); Cytokines and cytokine receptors (http://www.cytokinewebfacts.com/, http: //www. cope with cytokines. de/cope, cg i , y http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medick umamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html); Chemokines (http: //cytokine. medie. kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/C he mokine.html); Chemokine receptors and GPCRs (http://csp. medie, kumamoto-u.ac.jp/CSP/Rece ptor.html, http: //www. gpcr.org/7tm/); Olfactory Receptors (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/ default.asp); Receptors (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); Cáncer targets (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); Secreted proteins as potential antibody targets (http://spd.cbi.pku.edu.cn/); Protein kinases (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), y Human CD markers (http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/CD_t a ble_f'in a IJocked.pd f) y (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
Las DVD-lgs son útiles como agentes terapéuticos para simultáneamente bloquear dos diferentes objetivos para mejorar la eficacia/seguridad y/o incrementar la cobertura del paciente. Dichos objetivos pueden incluir objetivos solubles (TNF) y objetivos de receptor de superficie de célula (VEGFR y EGFR). También se puede utilizar para inducir citotoxicidad red i r i g i d a entre células tumorales y células T (Her2 y CD3) para terapia de cáncer, o entre la célula auto-reactiva y células efectoras para enfermedad autoinmune o trasplante, o entre cualquier célula objetivo y la célula efectora para eliminar células causantes de enfermedad en cualquier enfermedad dada.
Además, la DVD-lg puede ser utilizada para activar la agrupación y activación de receptor cuando se diseñe para activas dos diferentes epítopos en el mismo receptor. Esto puede tener el beneficio de hacer terapéuticos anti-GPCR agonísticos y antagonísticos. En este caso, la DVD-lg puede ser utilizada para activar dos diferentes epítopos (incluyendo epítopos tanto en las regiones de bucle como el dominio extracelular) en una célula para la agrupación/señalización (dos moléculas de superficie de célula) o señalización (en una molécula). Similarmente, una molécula de DVD- lg puede ser diseñada para activar la ligación de CTLA-4, y una señal negativa activando dos diferentes epítopos (o dos copias del mismo epítopo) del dominio extracelular CTLA-4, conduciendo a la sub-regulación de la respuesta inmunológica. La CTLA-4 es un objetivo clínicamente validado para tratamiento terapéutico de un número de trastornos inmunológicos. Las interacciones de CTLA-4/B7 negativamente regulan la activación de célula T atenuando la progresión del ciclo celular, la producción de IL-2, y la proliferación de células T después de la activación, y el acoplamiento de CTLA-4 (CD152) puede sub-regular la activación de célula T y promover la inducción de tolerancia inmunológica. Sin embargo, la estrategia de atenuar la activación de célula T a través de acoplamiento de CTLA-4 de anticuerpo agonístico no ha tenido éxito ya que la activación de CTL-4 requiere de ligación. La interacción molecular de CTLA-4/B7 está en arreglos de "cierre torcido", como se demuestra por el análisis estructural de cristal (Stamper 2001 Nature 410:608). Sin embargo, ninguno de los reactivos de unión CTLA-4 actualmente disponible tiene propiedades de ligación, incluyendo mAbs anti-CTLA-4. Se han hecho varios intentos para dirigir esta emisión. En un caso, se generó un anticuerpo de cadena individual unido al miembro, y significativamente inhibió el rechazo alogeneico en ratones (Hwang 2002 Jl 169:633). En un caso separado, se generó un anticuerpo de cadena individual enlazado a la superficie APC artificial para CTLA-4 y se demostró que atenúa respuestas de célula T (Griffin 200 Jl 164:4433). En ambos casos, la ligación de CTLA-4 se logró a través de anticuerpos unidos a miembro estrechamente localizados en sistemas artificiales. Aunque estos experimentos proporcionan prueba de concepto para la sub-regulación inmunológica activando la señalización negativa de CTLA-4, los reactivos utilizados en estos reportes no son adecuados para uso terapéutico. Hasta este punto, la ligación de CTLA-4 puede lograrse utilizando una molécula de DVD-lg, que activa dos diferentes epítopos (o dos copias dei mismo epítopo) de dominio extracelular de CTLA-4. La razón fundamental es que la distancia que cubre dos sitios de unión de una IgG, aproximadamente 150-170Á, es demasiado grande para la ligación activa de CTLA-4 (30-40 A entre el homodimero 2 CTLA-4). Sin embargo, la distancia entre los dos sitios de unión en DVD-lg (un brazo) es mucho más corta, también en la escala de 30-50 A, permitiendo la ligación apropiada de CTLA-4.
Similarmente, la DVD-lg puede activar dos diferentes miembros de un complejo de receptor de superficie de célula (por ejemplo, IL-12 alfa y beta). Además, la DVD-lg puede activar la CDR1 y una proteína soluble/patógeno para dirigir una rápida eliminación de la proteína/patógeno soluble objetivo.
Además, las DVD-lgs de la invención pueden ser empleadas para suministro específico en tejido (objetivo de un marcador de tejido y un mediador de enfermedad para PK local mejorado de esta manera eficacia más alta y/o toxicidad más baja), incluyendo suministro intracelular (activando un receptor de internalización y una molécula intracelular), suministrando adentro del cerebro (activando el receptor de transferrina y un mediador de enfermedad del CNS para cruzar la barrero hematoencefálica). La DVD-lg también puede servir como una proteína de vehículo para suministrar un antígeno a una ubicación específica a través de la unión a un epítopo de no neutralización de ese antígeno y también para incrementar la vida media del antígeno. Además, la DVD-lg puede ser diseñada ya sea para enlazarse físicamente a dispositivos médicos implantados en pacientes o activar estos dispositivos médicos (ver, Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N . ; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Drug/device combina.tions for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11 ), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L, Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). En resumen, la dirección de tipos apropiados de célula al sitio de implantes médicos puede promover la curación y restauración de la función normal del tejido. Alternativamente, también se proporciona la inhibición de mediadores (incluyendo, pero no limitándose a, citocinas), liberados en la implantación del dispositivo a través de un DVD acoplado a o que activa un dispositivo. Por ejemplo, se han utilizado stents durante años en cardiología de intervención para limpiar arterias bloqueadas y para mejorar el flujo de sangre hacia ei músculo cardiaco. Sin embargo, se sabe que los stents de metal tradicionales causan restenosis (re- estrechamiento de la arteria en el área tratada) en algunos pacientes y pueden conducir a la formación de coágulos. Recientemente, se ha descrito un stent recubierto con el anticuerpo anti-CD34, el cual reduce restenosis y evita que se formen coágulos capturando células progenitoras endoteliales (EPC) que circulan a través de la sangre. Las células endoteliales son células que alinean vasos sanguíneos, permitiendo que la sangre fluya suavemente. Las EPCs se adhieren a la superficie dura del stent formando una capa suave que no solo promueve la curación sino que también evita la restenosis y coágulos, complicaciones previamente asociadas con el uso de stents (Aoji et al., 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10): 1574-9). Además de mejorar los resultados para pacientes que requieren de stents, también existen complicaciones para pacientes que requieren de cirugía de derivación cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular prostético (arteria artificial) cubierto con anticuerpos anti-EPC podría eliminar la necesidad de utilizar arterias de piernas o brazos de pacientes para injertos de cirugía de derivación. Esto podría reducir los tiempos de cirugía y anestesia, los cuales a su vez reducirán muertes por cirugía coronaria. Las DVD-lg se diseñan de tal manera que se une a un marcador de superficie celular (tal como CD34) así como una proteína (o un epítopo de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a proteínas, lípidos y polisacáridos) que ha sido colocada como cubierta en el dispositivo implantado para facilitar el reclutamiento de células. Dichos aspectos también pueden ser aplicados a otros implantes médicos en general. Alternativamente, las DVD-lgs pueden ser colocadas como cubiertas sobre dispositivos médicos y después de implantación y liberación de todos los DVDs del dispositivo (o cualquier otra necesidad que pueda requerir DVD-lg fresco adicional, incluyendo envejecimiento y desnaturalización de la DVD-lg ya cargada) el dispositivo puede volver a ser cargado a través de administración sistémica de DVD-lg fresca al paciente, en donde la DVD-lg se diseña para unirse a un objetivo de interés (una citocina, un marcador de superficie celular (tal como CD34), etc.) con un grupo de sitios de unión y a un objetivo colocado como cubierta en el dispositivo (incluyendo una proteína, un epítopo de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a, lípidos, polisacáridos y polímeros) con el otro. Esta tecnología tiene la ventaja de extender la utilidad de implantes cubiertos.
A. uso de DVD-lgs en varias enfermedades Las moléculas de DVD-lg de la invención también son útiles como moléculas terapéuticas para tratar varias enfermedades. Dichas moléculas de DVD pueden unir uno o más objetivos involucrados en una enfermedad específica. A continuación de describen ejemplos de dichos objetivos en varias enfermedades. 1. Respuesta Autoinmune e Inflamatoria Humana Muchas proteínas han sido implicadas en respuestas autoinmunes e inflamatorias generales, incluyendo C5, CCL1 (1-309), CCLI11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC- 4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (l-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1 , CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 ( CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina de activación de monocito endotelial), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1 RN , ' IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2 , TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRO, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCLI, 1 CXCL2, CXCL3, CXCL5/ CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451 J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, I L 10 , IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, y RNF110 (ZNF144). En un aspecto, se proporcionan DVD-lgs capaces de unir uno o más de los objetivos listados aquí. 2. Asma El asma alérgica se caracteriza por la presencia de eosinófilos, metaplasia de célula de calciforme, alteraciones de célula epitelial, h íper-reactividad de vías respiratorias (AHR), y expresión de citocina Th2 y Th1, así como niveles elevados de I g E en suero. Ahora es ampliamente aceptado que la inflamación de vías respiratorias es el factor clave que subraya la patogénesis de asma, involucrando una interacción de complejo de células inflamatorias tales como células B, células B, eosinófilos, células cebadas o mastocitos y macrófagos, y de otros mediadores secretados incluyendo citocinas y quimiocinas. Los corticoesteroides son el tratamiento anti-inflamatorio más importante p ara asma en la actualidad, sin embargo, su mecanismo de acción es no específico y existen preocupaciones de seguridad, especialmente en la población de pacientes jóvenes. El desarrollo de terapias más específicas y dirigidas, por lo tanto, está garantizado. Existe una evidencia creciente de que IL-13 en ratones imita muchas de las características del asma, incluyendo AHR, h i pe rsecreció n de moco y fibrosís de vías respiratorias, independientemente de inflamación eosinofílica (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
IL-13 ha sido implicada por tener un papel pivotal en ocasionar respuestas patológicas asociadas con asma. El desarrollo de terapia de mAb anti-IL-13 para reducir los efectos de IL-13 en el pulmón es un nuevo aspecto excitante que ofrece una considerable promesa como un tratamiento novedoso para asma. Sin embargo, otros mediadores de trayectorias inmunológicas diferenciales también han sido involucrados en la patogénesis de asma, y el bloqueo de estos mediadores, además de IL-13, puede ofrecer un beneficio terapéutico adicional. Dichos pares objetivo incluyen, pero no se limitan a, IL-13 y una citocina pro-inflamatoria, tal como factor-a de necrosis tumoral (TNF-a). El TNF-a puede amplificar la respuesta inflamatoria en asma y puede ser enlazado a la severidad de la enfermedad (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31 (New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247- 250.). Esto sugiere que el bloquear tanto IL-13 como TNF-a p uede tener efectos benéficos, particularmente en enfermedad severa de las vías respiratorias. En otra modalidad, la DVD-lg de la invención une los objetivos, IL-13 y TNF-a, y se utiliza para tratar asma.
Modelos de animales tales como el modelo de ratón de asma inducida por OVA, en donde se pueden valorar tanto inflamación como AHR, son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para determinar la habilidad de las varias moléculas de DVD-lg para tratar asma. Los modelos de animales para estudiar asma se describen por Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201 (12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201 (12), 1869-1873; y Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Además de las valoraciones de seguridad de rutina de estas pruebas específicas de pares de objetivo para el grado de inmunosupresión pueden ser garantizadas y útiles para seleccionar los mejores pares de objetivo (ver, Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001 ), 108(2), 250-257).
Basándose en los fundamentos descritos aquí y utilizando el mismo modelo de evaluación p ara eficacia y seguridad, otros pares de objetivos que las moléculas de DVD-lg pueden unir y ser útiles para tratar asma pueden ser determinados. En una modalidad, dichos objetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 e IL- beta, ya que también se implican en la respuesta inflamatoria en asma; IL-13 y citocinas y quimiocinas que están involucradas en inflamación, tales como IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 e TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-ß; IL-13 y agonista LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; e IL-13 y ADAM8. La presente invención también proporciona DVD-lgs capaces de unir uno o más objetivos involucrados en asma, seleccionadas del grupo que consiste de CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, istamina y receptores de histamina, I L 1 A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG , PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, y quitinasa. 3. Artritis reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en la membrana sinovial de articulaciones y está asociada con la degeneración de cartílago y erosión del hueso yuxta-articular. Muchas citocinas pro-inflamatorias, incluyendo TNF, quimiocinas, y factores de crecimiento se expresan en articulaciones enfermas. La administración sistémica de anticuerpo anti-TNF o proteína de fusión sTNFR a modelos de ratón de RA se mostró ser anti-inflamatoria y protectora de articulaciones. Las investigaciones clínicas en donde la actividad de TNF en pacientes con RA se bloqueó con ¡nfliximab administrada intravenosamente (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical triáis in rheumatoid arthritis using ¡nfliximab, an anti-TN Falpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:161-4), un mAb anti-TNF quimérico, ha probado evidencia de que TNF regula la producción, reclutamiento de IL-6, IL-8, MCP-1 y VEGF de células inmunes e inflamatorias en articulaciones, angiogénesis, y reducción de niveles de metaloproteinasas 1 y 3 de matriz en la sangre. Un mejor entendimiento de la trayectoria inflamatoria en artritis reumatoide ha conducido a la identificación de otros objetivos terapéuticos involucrados en artritis reumatoide. Tratamientos prometedores, tales como antagonistas de interleucina-6 (anticuerpo de receptor de IL-6, MRA, desarrollado por Chugai, Roche (ver Nishimoto, Norihiro et al., Arthritis & Rheumatism (2004), 50(6), 1761-1769), CTLA4lg (abatacept, Genovese Me et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition . N Engl J Med. 353:1114-23.), y terapia de célula anti-B (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909) ya han sido probados en ensayos controlados aleatorizados durante el año pasado. Se han identificado otras citocinas y se ha mostrado que son de beneficio en modelos de animal, incluyendo interleucina-15 (anticuerpo terapéutico HuMax- IL_15, A G 714, ver, Baslund, Bo et a I . , Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9), 2686-2692), interleucina-17 e interleucina-18, y ensayos clínicos de estos agentes están actualmente en curso. La terapia de anticuerpo doble específica, combinando anti-TNF y otro mediador, tiene enorme potencial para mejorar la eficacia clínica y/o cobertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo tanto de TNF como de VEGF potencialmente puede erradicar la inflamación y angiogénesis, ambas involucradas en la patof isiolog ía de RA. También se contempla el bloqueo de otros pares de objetivos involucrados en RA incluyendo, pero no limitándose a, TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-23; TNF e IL-1beta; TNF y MI F; TNF e IL-17; TNF e IL-15 con DVD-lgs específicas. Además de las valoraciones de seguridad de rutina de estos pares de objetivo, pruebas específicas para el grado de inmunosupresión pueden ser garantizadas y útiles para seleccionar los mejores pares de objetivo (ver, Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardizaron (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). Si una molécula de DVD-lg será útil para el tratamiento de artritis reumatoide, esto se puede determinar utilizando modelos de RA de animal pre-clínicos tales como un modelo de ratón con artritis inducida por colágeno. En la técnica también son bien conocidos otros útiles modelos (ver, Brand DD., Comp. Med. (2005) 55(2):114- 22). Basándose en la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, reactividad para TNF humano y de ratón, IL-15 humana y de ratón, etc.) se pueden conducir estudios de validación en el modelo de CIA de ratón con un "anticuerpo substituto coincidente" derivado de moléculas de DVD-lg; en resumen, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos objetivo de ratón puede hacerse coincidentes al grado posible a las características de los anticuerpos humanos parentales o humanizados usados para la construcción de DVD-lg humana (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar, etc.). 4. SLE La marca principal inmunopatogénica de SLE es la activación de célula B policlonal, la cual conduce a hiperglobulinemia, producción de auto-anticuerpo y formación de complejo inmunológico. La anormalidad fundamental parece ser la falla de células T para suprimir los clones de célula B prohibidos debido a la desregulación generalizada de células T. Además, la interacción de célula B o T se facilita a través de carias citocinas, tales como IL-10, así como moléculas co-estimulantes, tales como, CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, las cuales inician la segunda señal. Estas interacciones junto con la eliminación fagocítica dañada de complejos inmunes y material apoptótico, perpetuán la respuesta inmunológica con daño de tejido resultante. Los siguientes objetivos pueden ser involucrados en SLE y potencialmente pueden ser utilizados para el aspecto de DVD-lg para intervención terapéutica: terapias activadas por célula B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2 , CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALN AC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, I N HA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, y NT5E.; señales co-estimulantes: CTLA4 o B7.1/B7.2; inhibición de supervivencia de célula B: BlyS, BAFF; inactivación de complemento: C5; modulación de citocina: la clave principal es que la respuesta neta biológica en cualquier tejido es el resultado de un equilibrio entre niveles locales de citocinas pro-inflamatorias o anti-inflamatorias (ver, Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). Se considera que SLE es una enfermedad dirigida por Th-2 con elevaciones documentadas en suero de IL-4, IL-6, IL-10. También se contemplan DVD-lgs capaces de unir uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, y TNF-a. La combinación de objetivos, discutida aquí, mejorará la eficacia terapéutica para SLE que puede ser probada en un número de modelos pre-clínicos de lupus (ver, Peng SL (2004) Methods Mol Med.; 102:227-72). Basándose en la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, reactividad para CD20 humano y de ratón, interferón alfa humano y de ratón, etc.) se pueden conducir estudios de validación en un modelo de ratón con lupus con moléculas de DVD-lg derivadas de "anticuerpo substituto coincidente"; en resumen, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo puede hacerse coincidente al grado posible a las características de los anticuerpos humano o humanizados párenteles usados para la construcción de DVD-lg humana (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar, etc.). 5. Esclerosis múltiple La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad autoinmune humana compleja con una etiología predominantemente desconocida. La destrucción inmunológica de la proteína básica mielina (MBP) a través del sistema nervioso es la principal patología de la esclerosis múltiple. La MS es una enfermedad de patologías complejas, que involucra la infiltración por células T CD4+ y CD8+ y de respuesta dentro del sistema nervioso central. En la MS se han descrito la expresión en el sistema nervioso central de citocínas, las especies de nitrógeno reactivas y moléculas co-estimulantes. Otra consideración principal son los mecanismos inmunológicos que contribuyen al desarrollo de autoinmunidad. En particular, la expresión de antígeno, interacciones de citocina y leucocito, y células T reguladoras, que ayudan a equilibrar/modular otras células T, tales como células Th1 y Th2, son áreas importantes para la identificación terapéutica objetivo.
IL-12 es una citocina pro-inflamatoria que es producida por APC y promueve la diferenciación de células efectoras Th1. IL-12 es producida en las lesiones en desarrollo de pacientes con MS, así como en animales afectados por EAE. Previamente, se mostró que la interferencia en las trayectorias de IL-12 efectivamente evita EAE en roedores, y que la neutralización in vivo de IL-12p40, utilizando mAb anti-IL-12, tiene efectos benéficos en el modelo de EAE inducido por mielina en mono tití comunes.
TWEAK es un miembro de la familia de TNF, constitutivamente expresado en el sistema nervioso central (CNS), con efectos pro-inflamatorios, prolif erativos o apoptóticos dependiendo de los tipos de célula. Su receptor, Fn14, es expresado en el CNS a través de células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. La expresión de TWEAK y Fn14 ARNm se incrementó en la médula espinal durante encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). El tratamiento de . anticuerpo anti-TWEAK en EAE inducida por glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) en ratones C57BL/6 di como resultado una reducción de severidad de enfermedad e infiltración de leucocito cuando los ratones se trataron después de la fase de proceso de inicio de la polimerización.
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de DVD-lg capaces de unir uno o más, por ejemplo dos, objetivos seleccionados del grupo que consiste de IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, INFgama, GM- CSF, FGF, C5, CD52, y CCR2. Una modalidad incluye una DVD-lg a n t ¡ - i 112/TWEAK específico doble como un agente terapéutico benéfico para el tratamiento de MS.
Varios modelos de animal para valorar la utilidad de las moléculas de DVD para tratar MS son conocidos en la técnica (ver, Steinman L, et al, (2005) Trends Immunol. 26 ( 11 ): 565-71 ; Lublin FD, et al, (1985) Springer Semin Immunopathol. 8(3): 197-208; Genain CP, et al, (1997) J Mol Med. 85(3) : 187-97 ; Tuohy VK, et al, (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al, (1995) Neurol Clin 13(1 ):51 -73; y 't Hart BA, et al, (2005) J Immunol 175(7):4761 -8. Basándose en la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para ortólogos humanos y de especies animales (por ejemplo, reactividad para IL-12 humana y de ratón y TWEAK humano y de ratón, etc.) , se pueden conducir estudios de validación en el modelo de EAE de ratón con moléculas de DVD-lg derivadas de "anticuerpo substituto coincidente"; en resumen, una DVD-lg basada en uno (o más) anticuerpos específicos objetivo de ratón puede hacerse coincidente al grado posible a las características de los anticuerpos humano o humanizados parentales usados para la construcción de DVD-lg humana (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar, etc.). El mismo concepto se aplica a modelos de animal en otras especies de no roedor, en donde una DVD-lg derivada de un "anticuerpo substituto coincidente" puede ser seleccionada para la farmacología anticipada y posiblemente estudios de seguridad. Además las valoraciones de seguridad de rutina de estas pruebas específicas de pares objetivo para el grado de inm unosupresión pueden ser garantizadas y útiles para selecciona los mejores pares objetivo (ver, Luster et al, Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al, Developments in biological standarization (1992), 77 99-102; Jones . 2000 Rovelizumab (ICOS Corp): IDrugs.3(4):442-6). 6. Sepsis La patofisiologia de sepsis es iniciada por otros componentes de membrana tanto de organismos gram-negativos (lipopolisacáridos [LPS], lipido A, endotoxina) como de organismos gram-positivos (ácido lipoteicoico, peptidoglicano). Estos componentes de membrana externa son capaces de unirse al receptor CD14 sobre la superficie de monocitos. En virtud de los receptores de tipo toll recientemente descritos, después se transmite una señal a la célula, conduciendo a la producción final de las citocinas pro-inflamatorias, factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-alfa) e interleucina-1 (IL-1). Las principales respuestas inflamatorias e inmunológicas son aspectos esenciales de choque séptico y juegan una parte central en la patogénesis del daño de tejido, falla múltiple de órgano, y muerte inducida por sepsis. Se ha mostrado que las citocinas, especialmente factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina (IL-1) son mediadores críticos de choque séptico. Estas citocinas tienen un efecto tóxico directo en los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos conducen a concentraciones incrementadas de factor de activación de plaqueta, promoción de actividad de sintasa de óxido nítrico, promoción de infiltración de tejido a través de neutrófilos, y promoción de actividad de neutrófilo.
El tratamiento de sepsis y choque séptico permanece como un asunto clínico difícil, y pruebas recientes de prospecto con modificadores de respuesta biológica (es decir, anti-TNF, anti-MIF) dirigidos a la respuesta inflamatoria han mostrado un beneficio clínico solo modesto. Recientemente, el interés se ha desplazado a terapias dirigidas a invertir los períodos, acompañantes de supresión ¡nmunológica. Los estudios en animales experimentales y pacientes críticamente enfermos han demostrado que la apoptosis incrementada de órganos linfoides y algunos tejidos parenquimales contribuyen a esta supresión inmunológica, anergia, y disfunción de sistema de órganos. Durante los síndromes de sepsis, la apoptosis de linfocito puede ser activada por la ausencia de IL-2 o por la liberación de glucocorticoides, granzimas, o las asi llamadas citocinas de "muerte"; factor alfa de necrosis tumoral o ligando Fas. La apoptosis prosigue a través de auto-activación de caspasas citosólicas y/o mitocondriales, las cuales pueden ser influenciadas por los miembros pro- y anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. En animales experimentales, no solo el tratamiento con inhibidores de apoptosis evita la apoptosis de célula linfoide, sino que también mejorar el resultado. Aunque las pruebas clínicas con agentes anti- apoptóticos permanece distante debido en gran parte a dificultades técnicas asociadas con su administración y activación de tejido, la inhibición de apoptosis representa un objetivo terapéutico atractivo para el paciente séptico. Asimismo, un agente doble específico que activa tanto mediadores inflamatorios como un mediador apoptótico, puede tener un beneficio agregado. Un aspecto de la invención se refiere a DVD-lgs capaces de unir uno o más objetivos involucrados en sepsis, en una modalidad dos objetivos, seleccionados del grupo que consiste de TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, receptores de tipo Toll, TLR-4, factor de tejido, IP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, midcina, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, y TREM1. La eficacia de dichas DVD-lgs para sepsis puede ser valorada en modelos de animales pre-clínicos conocidos en la técnica (ver, Buras JA, et al, (2005) Nat Rev Drug Discv. 4(10):854-65 y Calandra T, et al, (2000) Nat Med. 6(2): 164-70). 7. Trastornos Neurológicos 7.1 Enfermedades Neurodegenerativas Las enfermedades neurodegenerativas crónicas usualmente son dependientes de la edad. Las enfermedades se caracterizan por la pérdida progresiva de funciones neuronales (muerte de célula neuronal, desmielinación), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. El conocimiento emergente de los mecanismos que subrayan enfermedades neurodegenerativas crónicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) muestra una compleja etiología y u na se ha reconocido una variedad de factores para contribuir a su desarrollo y progresión, por ejemplo, edad, estado glicémico, producción de amiloide y multimerización, acumulación de productos finales de glicación avanzados (AGE), los cuales se unen a su receptor RAGE (receptor para AGE), estrés incrementado oxidante cerebral, flujo sanguíneo cerebral reducido, neuro-inflamación incluyendo la liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias, disfunción neuronal y activación microglial. De esta manera las enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una compleja interacción entre múltiples tipos de célula y mediadores. Las estrategias de tratamiento para dichas enfermedades son limitadas y en su mayoría constituyen ya sea procesos inflamatorios bloqueadores con agentes anti-inflamatorios no específicos (por ejemplo, corticoesteroides, inhibidores de COX) como agentes para prevenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápticas. Estos tratamientos fallan para detener la progresión de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que terapias con más objetivo, tales como anticuerpos para péptido A-b soluble (incluyendo las formas oligoméricas A-b) no pueden solo detener la progresión de la enfermedad sino que pueden ayudar a mantener la memoria también. Estas observaciones preliminares sugieren que terapias específicas que activan más de un mediador de enfermedad (por ejemplo, A-b y una citocina pro-inflamatoria tal como TNF) pueden proporcionar una eficacia terapéutica aún mejor para enfermedades neurodegenerativas crónicas que la observada con la activación de un mecanismo de enfermedad individual (por ejemplo, A-balone soluble) (ver, CE. Shepherd, et al, Neurobiol Aging, 2005, 24 de Octubre; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005; 11:3335; William L. Klein; Neurochem Int. 2002; 41:345; Michelle C Janelsins, et al, J Neuroinflammation, 2005; 2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149; Igor Klyubin, et al, Nat Med. 2005; 11:556-61; Arancio O, et al, EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al, Am J Pathol. 2001; 158:63; Deane R, et al, Nat Med, 2003; 9:907-13 y Eliezer Masliah, et al, N'euron. 2005; 46:857).
Las moléculas de DVD-lg de la invención pueden unir uno o más objetivos involucrados en enfermedades neurodegenerati as crónicas tales como Alzheimer. Dichos objetivos incluye, pero no se limitan a, cualquier mediador, soluble o superficie de célula, implicado en la patogénesis de AD, por ejemplo, AGE (S100 A, anfoterina), citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL- ), quimiocinas (por ejemplo, MPC1), moléculas que inhiben la regeneración de nervios (por ejemplo, Nogo, RGM A), moléculas que mejoran el crecimiento de neuritas (neurotrofinas). La eficacia de las moléculas de DVD-lg puede ser validad en modelos de animales pre-clinicos tales como los ratones transgénicos que sobre-expresan la proteína precursora amiioide o RAGE y desarrollan síntomas como la enfermedad de Alzheimer. Además, las moléculas de DVD-lg pueden ser construidas y probadas para eficacia en los modelos de animales y la mejor DVD-lg terapéutica puede ser seleccionada para prueba en pacientes seres humanos. Las moléculas de DVD-lg también pueden ser empleadas para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson. La alfa-sinucleina está involucrada en la patología de Parkinson. Una DVD-lg capaz de activar la alfa-sinucleina y mediadores inflamatorios tales como TNF, IL-1, MCP-1 pueden proporcionar terapia efectiva para la enfermedad de Parkinson y se contemplan en la invención. 7.2 Regeneración Neuronal y Daño a Médula Espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, el daño a médula espinal (SCI) es aún una condición devastadora y representa una indicación médica caracterizada por una alta necesidad médica. La mayoría de los daños de médula espinal son contusiones o daños por compresión y el daño primario es usualmente seguido por mecanismos de daño secundarios (mediadores inflamatorios, por ejemplo, citocinas y quimiocinas) que empeoran el daño inicial y dan como resultado un agrandamiento importante del área de lesión, algunas veces de más de 10 veces. Estos mecanismos primarios y secundarios en SCI son muy similares a aquellos en daño de cerebro causado por otros medios, por ejemplo, ataque apopléjico. No existen ningún tratamiento satisfactorio y la única terapia utilizada en una inyección de bolo de dosis alta de metilprednisolona (MP) dentro de un marco de tiempo limitado de 8 horas después del daño. Sin embargo, solo se pretende evitar daño secundario sin ocasionar ninguna recuperación funcional importante. Es altamente crítica la falta de eficacia inequívoca y los efectos adversos severos, como inmunosupresión con subsecuentes infecciones y severas alteraciones musculares histopatológicas. No se han aprobado otros fármacos, biológicos o moléculas pequeñas, que estimulan potenciales regenerativos endógenos, pero principios de tratamiento prometedores y candidatos de fármaco han mostrado eficacia en modelos de animales de SCI en años recientes. A un alto grado, la falta de recuperación funcional en SCI en humanos es causada por factores que inhiben el crecimiento de neurita, en los sitios de lesión, en tejido cicatrizante, en mielina asi como en células asociadas con daño. Tales factores son las proteínas asociadas con mielina, NogoA, OMpg y MAG, RGM A, los CSPG asociados con cicatriz (Proteoglicanos de Sulfato de Condroitina) y factores inhibidores en astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no se encuentran moléculas inhibidoras de crecimiento sino que también factores de estimulación de crecimiento de neurita como neurotrof inas, laminina, L1 y otros. Este ensamble de moléculas inhibidoras de crecimiento de neurita y promotoras de crecimiento puede explicar que el bloqueo de factores individuales, como NogoA o RGM A, dio como resultado la recuperación funcional importante en modelos de SCI de roedor, ya que una reducción de las influencias inhibidoras puede desplazar el equilibrio de inhibición de crecimiento a promoción de crecimiento. Sin embargo, las recuperaciones observadas con el bloqueo de una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita individual no fueron completas. Para lograr recuperaciones más rápidas y más pronunciadas, puede ser deseable bloquear dos moléculas inhibidoras de sobre-crecimiento de neuritas, por ejemplo, Nogo y RGM A, o bloquear una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita y mejorar las funciones de una molécula mejoradora de sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo, Nogo y neutrofinas, o bloquear una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo, Nogo y una molécula pro-inflamatoria, por ejemplo, TNF, (ver, McGee AW et al. Trends Neurosci. 2003; 26:193; Marco Domeniconi, et al. J Neurol Sci. 2005; 233:43; Milán Makwanal, et al. FEBS J. 2005; 272:2628; Barry J. Dickson Science 2002; 298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al. J Neurosci Res. 2005; 79:273; Tara Karnezis, et al. Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al. J. Neurochem. 2004; 91; 1018).
En un aspecto, las DVD-lgs capaces de unir pares objetivo tales como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y RGM A; RGM A y RGM B; CSPGs y RGM A, agrecan, midcina, neurocan, versican, fosfacan, Te38 y TNF-a; se proporcionan anticuerpos específicos de globulómero ?ß combinados con anticuerpos que promueven dendritas y brotes de axón. La patología de dendrita es un signo muy antiguo de AD y se sabe que NOGO A restringe el crecimiento de dendritas. Se puede combinar dicho tipo de ab con cualquiera de los Ab de candidato de SC (proteínas de mielina). Otros objetivos de DVD-lg pueden incluir cualquier combinación de NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. Además, los objetivos también pueden incluir cualquier mediador, soluble o superficie de célula, implicados en la inhibición de neurita, por ejemplo, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforinas, efrinas, A-b soluble, citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1), quimiocinas (por ejemplo, MIP 1a), moléculas que inhiben la regeneración de nervios. La eficacia de anti-nogo/anti-RGM A o moléculas de DVD-lg similares puede ser validada en modelos de animales pre-clínicos de daño de médula espinal. Además, estas moléculas de DVD-lg pueden ser construidas y probadas para eficacia en modelos de animales y la mejora DVD-lg terapéutica puede ser seleccionada para probarse en pacientes seres humanos. Además, las moléculas de DVD-lg pueden ser construidas para que activen dos diferentes sitios de unión de ligando en un receptor individual, por ejemplo, receptor Nogo, el cual une tres ligandos, Nogo, Ompg, y MAG y RAGE que une A-b y S100 A. Además, los inhibidores de sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo, nogo y receptor nogo, también juegan un papel importante en prevenir la regeneración de nervios en enfermedades inmunológicas como esclerosis múltiple. Se ha mostrado que la inhibición de la interacción del receptor nogo-nogo mejora la recuperación de modelos de animal de esclerosis múltiple. Por lo tanto, las moléculas de DVD-lg que pueden bloquear la función de un mediador inmunológico, por ejemplo, una citocina como IL-12 y una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo, nogo o RGM, pueden ofrecer una eficacia más rápida y mayor que el bloqueo de ya sea una molécula inmune o una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita sola. 8. Trastornos Oncológicos La terapia de anticuerpo monoclonal ha surgido como una modalidad terapéutica importante para cáncer (von Mehren M. et al. 2003 Monoclonal antibody therapy for cáncer. Annu Rev. Med. 54:343-69). Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales induciendo apoptosis, citotoxicidad redirigida, interferencia con interacciones de ligando-receptor, o evitar la expresión de proteínas que son críticas al fenotipo neoplástico. Además, los anticuerpos pueden activar componentes del micro-ambiente tumoral, perturbando estructuras vitales tales como la formación de vasculatura asociada con tumor. Los anticuerpos también pueden activar receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, tales como el receptor de factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo de esta manera inhibe ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular a partir de la unión a células tumorales activadas. Alternativamente, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotípica, citotoxicidad mediada por complemento, o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). El uso del anticuerpo específico doble que activa dos mediadores de tumor separados probablemente dará un beneficio adicional comparado con una terapia mono-específica. También se contemplan DVD Igs capaces de unir los siguientes pares de objetivos para tratar la enfermedad; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y HER-2; VEGFR y EGFR; CD20 y CD3; CD138 y CD20; CD38 y CD20; CD38 y CD138; CD40 y CD20; CD138 y CD40; CD38 y CD40; CD-20 y CD-19; CD-20 y EGFR; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1; CD20 y CD3; VEGF y PLGF; DLL4 y PLGF; ErbB3 y EGFR; HGF y ErbB3, HER-2 y ErbB3; c-Met y ErbB3; HER-2 y PLGF; y HER-2 y HER-2.
En otra modalidad, un DVD de la invención es capaz de unir VEGF y fosfatidilserina; VEGF y ErbB3; VEGF y PLGF; VEGF y ROB04; VEGF y BSG2; VEGF y CDCP1; VEGF y ANPEP; VEGF y c-MET; HER-2 y ERB3; HER-2 y BSG2; HER-2 y CDCP1; HER-2 y ANPEP; EGFR y CD64; EGFR y BSG2; EGFR y CDCP1; EGFR y ANPEP; IGF1R y PDGFR; IGF1R y VEGF; IGF1R y CD20; CD20 y CD74; CD20 y CD30; CD20 y DR4; CD20 y VEGFR2; CD20 y CD52; CD20 y CD4; HGF y c-MET; HGF y NRP1; HGF y fosfatidilserina; ErbB3 e IGF1R; ErbB3 y IGF1.2 ; c-Met y Her-2 ; c-Met y NRP1; c-Met e IGF1R; IGF1.2 y PDGFR; IGF1.2 y CD20; IGF1.2 e IGF1R; IGF2 y EGFR; IGF2 y HER2; IGF2 y CD20; IGF2 y VEGF; IGF2 e IGF1R; IGF1 e IGF2; PDGFRa y VEGFR2; PDGFRa y PLGF; PDGFRa y VEGF; PDGFRa y c-Met; PDGFRa y EGFR; PDGFRb y VEGFR2; PDGFRb y c-Met; PDGFRb y EGFR; RON y c-Met; RON y MTSP1, RON y MSP; RON y CDCP1; VGFR1 y PLGF; VGFR1 y RON; VGFR1 y EGFR; VEGFR2 y PLGF; VEGFR2 y NRP1; VEGFR2 y RON; VEGFR2 y DLL4; VEGFR2 y EGFR; VEGFR2 y ROB04; VEGFR2 y CD55; LPA y S1P; EPHB2 y RON; CTLA4 y VEGF; CD3 y EPCAM; CD40 e IL6; CD40 e IGF; CD40 y CD56; CD40 y CD70; CD40 y VEGFR1; CD40 y DR5; CD40 y DR4; CD40 y APRIL; CD40 y BCMA; CD40 y RANKL; CD28 y MAPG; CD80 y CD40, CD80 y CD30, CD80 y CD33; CD80 y CD74; CD80 y CD2; CD80 y CD3; CD80 y CD19; CD80 y CD4; CD80 y CD52; CD80 y VEGF; CD80 y DR5; CD80 y VEGFR2; CD22 y CD20; CD22 y C D80; CD22 y C D40; CD22 y C D23; CD22 y C D33; CD22 y CD74; CD22 y CD19; CD22 y DR5; CD22 y DR4; CD22 y VEGF; CD22 y CD52, CD30 y CD20; CD30 y CD22; CD30 y CD23; CD30 y CD40; CD30 y VEGF; CD30 y CD74; CD30 y CD19; CD30 y DR5; CD30 y DR4; CD30 y VEGFR2; CD30 y CD52; CD30 y CD4; CD138 y RANKL; CD33 y FTL3; CD33 y VEGF; CD33 y VEGFR2; CD33 y CD44; CD33 y DR4; CD33 y DR5; DR4 y CD137; DR4 e IGF1.2; DR4 e IGF1R; DR4 y DR5; DR5 y CD40; DR5 y CD137; DR5 y CD20; DR5 y EGFR; DR5 e IGF1.2; DR5 e IGFR, DR5 y HER-2, EGFR y DLL4. Otras combinaciones objetivo incluyen uno o más miembros de la familia EGF/erb-2/erb-3. Otros objetivos (uno o más) involucrados en enfermedades oncológicas que las DVD-lgs pueden unir incluyen, pero no se limitan a aquellos seleccionados del grupo que consiste de: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNF10SF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF 1 , IGF2, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, 0DZ1, PAWR, PLG, TGFB1M, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, EN01, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, YC, N0X5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NRID1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NROB1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1 , CHGA, CHGB, CLU, COLIA1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF 1 , IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, I HA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, LK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1 , APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CA 1 , CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1 , GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAM , COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PR0K2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1 , EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cader¡na), CDKN1B (p27 Kipl), CDKN2A (pl6INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenia), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1 ), GATA3, GSN (Gelsolin), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glicoproteína 130), ITGA6 (a6 integrina), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), M I67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspin), SERPINE1 (PAI-I), TGFA, THBS1 (tromboespondina-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glicoproteína), BPAGa (plectina), CDKN1A (p21 Wapl/Cipl), CLDN7 (claudin-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrina), ITGB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT 19 (queratina 19), KRTHB6 (queratina de tipo II de cabello específico), MAC ARCKS, MT3 (metalotíonectin-lll), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina T), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidilserina, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, MTSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1 , y CD59.
IV. Composiciones Farmacéuticas La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión de la invención son para usarse en, pero no se limitan a, el diagnóstico, detección, o verificación de un trastorno, en la prevención, tratamiento, manejo o mitigación de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, y/o en investigación. En una modalidad especifica, una composición comprende una o más proteínas de unión de la invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una o más proteínas de unión de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes a las proteínas de unión de la invención para tratar un trastorno. En una modalidad, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para o han sido o se usan actualmente en la prevención, tratamiento, manejo, o mitigación de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas modalidades, la composición además puede comprender un vehículo, diluyente o excipiente.
Las proteínas de unión de la invención pueden ser incorporadas en composiciones farmacéuticas para administrarse a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y anti-f úngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, que con fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, salina, salina regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, en la composición se incluyen agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. Los vehículos farmacéuticamente aceptables además pueden comprender cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsifícantes, conservadores o reguladores de pH, los cuales mejoran la vida en el estante o almacén o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar uno o más anticuerpos de la invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar o mitigar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea), administración epidural, administración intra-tumoral, y administración por la mucosa (por ejemplo, ¡ntranasal y rutas orales). Además, se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente en aerosol. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 98/32572; WO 97/44014; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en sus totalidades. En una modalidad, una proteína de unión de la invención, terapia de combinación, o una composición de la invención se administra utilizando tecnología de suministro pulmonar de fármaco Alkermes AIR® (Alkemes, Inc., Cambridge, Mass.). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran de manera intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden ser administrados a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo, a través de infusión o inyección de bolo, a través de absorción mediante cubiertas epiteliales o mucocutáneas (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad, la unión específica de nanotubos de carbono acoplados a anticuerpo (CNTs) a células tumorales in vitro, seguido por su ablación altamente específica con luz casi infrarroja (NIR) puede ser utilizada para tener como objetivo células tumorales. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos biotinilados para preparar dispersiones de CNT no citotóxico, biocompatible, estable que después se unen a una o dos diferentes DVD-lgs derivatizadas con avidina dirigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty, P. et al, (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105:8697-8702.
En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención localmente al área con la necesidad de tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y sin limitación, a través de infusión local, a través de inyección, o por medio de un implante, dicho implante siendo de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágeno. En una modalidad, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de los antagonistas de la invención se administran localmente al área afectada de un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o mitigar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención se administra oralmente al área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos a una proteína de unión de la invención de un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o mitigar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico puede ser suministrado en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una modalidad, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (ver, Langer, supra, Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al, 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med.321 :574). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (ver, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente de E.U.A. No. 5,679,377; Patente de E.U.A. No. 5, 916,597; Patente de E.U.A. No. 5,912,015; Patente de E.U.A. No. 5,989,463; Patente de E.U.A. No. 5,128,326; Publicación de PCT No. WO 99/15154; y Publicación de PCT No. WO 99/20253. Ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidrosi etil metacrilato), poli(meti I metacrilato), ácido poli(acrílico), acetato de poli(etilen-co-vinilo), ácido poli(metacrílico), poliglicolidas (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), alcohol poli(vinílico), poliacrilamida, p o f i ( et i I e n glicol), polilactidas (PLA), ppli(lactida-co-glicolidas), y poliortoésteres. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixibiables, estable al almacenamiento, estéril, y biodegradable. En otra modalidad más, un sistema de liberación controlada o sostenida puede ser colocado cerca del objetivo profiláctico o terapéutico, requiriendo así solo de una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pág, 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Cualquier técnica conocida por algún experto en la técnica puede ser utilizada para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,526, 938, publicación de PCT WO 91/05548, publicación de PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral adioimmunotheraphy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759- 760, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad.
En una modalidad especifica, en donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de sus agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se vuelve intracelular, por ejemplo, a través del uso de un vector retroviral (ver, patente de E.U.A. No. 4,980.286), o a través de inyección directa, o a través del uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en enlace a un péptido de tipo homeótico ("homeobox") , que es conocido por entrar al núcleo (ver, por ejemplo, Joliot et al, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de célula huésped para la expresión a través de recombinación homologa.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta de administración pretendida. Ejemplos de rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, ¡ntradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa, y rectal. En una modalidad específica, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal, o tópica a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un regulador de pH acuoso isotónico, estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lignocamne para reducir el dolor en el sitio de la. inyección.
Si las composiciones de la invención van a ser administradas tópicamente, las composiciones pueden ser formuladas en la forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, aspersión, aerosol, solución, emulsión, u otra forma bien conocida por algún experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19° ed., Mack Pub. Co. Easton. Pa (1995). En una modalidad, para formas de dosis tópicas que se rocían, se emplean formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y teniendo una viscosidad dinámica mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos y similares, los cuales son, si se desea, esterilizados o mezclados con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, reguladores de pH, o sales) para influenciar varias propiedades, tales como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas de dosis tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol que se pueden rociar, en donde el ingrediente activo, en una modalidad, en combinación con un vehículo inerte sólido o líquido, se empaca en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como freón) o una botella que se puede comprimir. También se pueden agregar humectadores o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosis si se desea. Ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.
Si el método de la invención comprende administración ¡ntranasal de una composición, la composición puede ser formulada en una forma en aerosol, aspersión, bruma o en la forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para usarse de acuerdo con la presente invención pueden ser convenientemente suministrados en la forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina) para usarse en un inhalador o insuflador conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo tal como lactosa o almidón.
Si el método de la invención comprende administración oral, las composiciones pueden ser formuladas oralmente en la forma de tabletas, cápsulas, bolsas pequeñas, cápsulas de gel ("gelcaps"), soluciones, y similares. Se pueden preparar tabletas o cápsulas a través de medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa) llenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o sílice); agentes de desintegración (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Las tabletas pueden ser recubiertas a través de métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero no limitándose a, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Dichas preparaciones líquidas pueden ser preparadas a través de medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas); agentes de emulsificación (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras de pH, agentes saborizantes, colorantes, y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden ser convenientemente formuladas para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de un agente(s) profiláctico o terapéutico.
El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente en aerosol. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad. En una modalidad específica, una proteína de unión de la invención, terapia de combinación, y/o composición de la invención se administra utilizando tecnología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
El método de la invención puede comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral a través de inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en una forma de dosis unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, de estabilización y/o de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógeno, estéril) antes de uso.
Los métodos de la invención además pueden comprender la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de larga acción pueden ser administradas a través de implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o a través de inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, las composiciones pueden ser formuladas con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles (por ejemplo, como una sal escasamente soluble).
Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
Generalmente, los ingredientes de las composiciones se suministran ya sea en forma separada o mezclados conjuntamente en la forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado, tal como una ampolleta o saco pequeño indicando la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administración es infusión, la composición puede ser suministrada con una botella de infusión conteniendo agua o salina de grado farmacéutico estéril. Cuando el modo de administración es a través de inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección, o salina, de manera que los ingredientes pueden ser mezclados antes de administración.
En particular, la invención también proporciona uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención se empacan en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saco pequeño indicando la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizada seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado y pueden ser reconstituidos (por ejemplo, con agua o salina) a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. En una modalidad, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril, seco, en un contenedor herméticamente sellado a una dosis unitaria de por lo menos 5 mg, por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, por lo menos 75 mg, o por lo menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o composiciones farmacéuticas de la invención deben ser almacenados de entre 2°C y 8°C, en su contenedor original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención deben ser administradas en 1 semana, por ejemplo, en 5 días, en 72 horas, en 48 horas, en 24 horas, en 12 horas, en 6 horas, en 5 horas, en 3 horas o en 1 hora después de ser reconstituidas. En una modalidad alternativa, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en forma líquida en un contenedor herméticamente sellado indicando la cantidad y la concentración del agente. En una modalidad, la forma líquida de la composición administrada es suministrada en un contenedor herméticamente sellado de por lo menos 0.25 mg/ml, por lo menos 0.5 mg/ml, por lo menos 1 mg/ml, por lo menos 2.5 mg/ml, por lo menos 5 mg/ml, por lo menos 8 mg/ml, por lo menos 10 mg/ml, por lo menos 15 mg/ml, por lo menos 25 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, o por lo menos 100 mg/ml. La forma líquida debe ser almacenada entre 2°C y 8°C, en su contenedor original.
Las proteínas de unión de la invención pueden ser incorporadas en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En una modalidad, el anticuerpo o porciones de anticuerpo serán preparados como una solución inyectable conteniendo 0.1-250 mg/ml de la proteína de unión. La solución inyectable puede estar compuesta de ya sea de una forma de dosis líquida o liofilizada en un frasco de cristal o ámbar, ampolleta o jeringa pre-llenada. El regulador de pH puede ser L-histidina (1-50 mM), opcionalmente 5-10 mM, al un pH de 5.0 a 7.0 (óptimamente un pH de 6.0). Otros reguladores de pH incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 1 50 mM para una forma de dosis líquida). Se pueden incluir crio-protectores para una forma de dosis liofilizada, principalmente 0-10% sacarosa (óptimamente 0.5-1.0%). Otros crio-protectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes proporcionadores de volumen para una forma de dosis liofilizada, principalmente 1-10% manitol (óptimamente 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores en las formas de dosis tanto líquidas como liofilizadas, principalmente 1-50 mM de L-metionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes proporcionadores de volumen incluyen glicina, arginina, y pueden ser incluidos como 0-0.05% polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01 %). Agentes tensoactivos adicionales incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 20 y agentes tensoactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende las proteínas de unión de la invención preparadas como una solución iny.ectable para administración parenteral, además pueden comprender un agente útil como un auxiliar, tales como aquellos utilizados para incrementar la absorción, o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo). Un auxiliar particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de administración parenteral, en particular administración subcutánea. También permite volúmenes mayores de sitio de inyección (es decir, mayores que 1 mi) con menos dolor e incomodidad, e incidencia mínima de reacciones de sitio de inyección (ver, WO 2004078140 y US2006104968, incorporadas aquí para referencia) .
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosis líquidas, semi-sólidas o sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma elegida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas están en la forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como composiciones similares a aquellas utilizadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración seleccionado es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, ¡ntraperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el anticuerpo es administrado a través de infusión intravenosa o inyección. En otra modalidad, el anticuerpo es administrado a través de inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados aquí, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados aquí. En el caso de polvos estériles, liofilizados para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos para la preparación son secado al vacío y secado por aspersión que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de agentes tensoactivos. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser lograda incluyendo, en la composición, un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser administradas a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, en una modalidad, la ruta/modo de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciado por los expertos en la técnica, la ruta/modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede ser preparado con un vehículo que protegerá al compuesto contra una rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada,- incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilen-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o generalmente son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En ciertas modalidades, una proteína de unión de la invención puede ser oralmente administrada, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible, asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también puede ser encerrado en una cápsula de gelatina de cubierta dura o suave, comprimida a tabletas, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden ser incorporados con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención a través de otro tipo de administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con un material para prevenir su inactivación.
También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, una proteína de unión de la invención es co-formulada con y/o coadministrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos con proteínas de unión de la invención. Por ejemplo, una proteína de unión de la invención puede ser co-formulada y/o co-administrada con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen otras citocinas o que unen moléculas de superficie celular). Además, se pueden utilizar uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación ventajosamente pueden utilizar dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias.
En ciertas modalidades, una proteína de unión está enlazada a un vehículo de extensión de vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fe, polietilen glicol, y dextrana. Dichos vehículos se describen en, por ejemplo, Solicitud de E.U.A. Serie No. 09/428,082 y Solicitud de PCT publicada No. WO 99/25044, las cuales se incorporan aquí para referencia para cualquier propósito.
En una modalidad específica, se administran secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de unión de la invención u otros agente profiláctico o terapéutico de la invención para tratar, prevenir, manejar, o mitigar un trastorno o uno o más síntomas del mismo a través de terapia de gen. La terapia de en se refiere a una terapia realizada a través de la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o capaz de expresión. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos produce su anticuerpo codificado o agente profiláctico o terapéutico de la invención que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Cualquiera de los métodos para terapia de gen disponibles en la técnica puede ser utilizado de acuerdo con la presente invención. Para revisiones generales de los métodos de la terapia de gen, ver, Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo, 1993, TIBTECH 11 (5) : 155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se utilizan se describen por Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Una descripción detallada de varios métodos de terapia de gen se describe en US20050042664 A1, la cual se incorpora aquí para referencia.
Las proteínas de unión de la invención son útiles para tratar varias enfermedades en donde los objetivos que son reconocidos por las proteínas de unión son peligrosos. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria de i ntestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma , enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmunológica agua o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de awasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficíencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheímer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, falla cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poiiglandular esporádica de tipo I y deficiencia poiiglandular de tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria en adultos (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerativa, sinovitís enteropática, clamidia, yersinia y artropatía asociada con salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosís, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgaris, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Libre de Royal, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial pos-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con la enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemasiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis de radiación, bronquiolitis obliteran, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar de infiltración linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial pos-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide clásica), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órgano, osteoartritis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1 , psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los sub-tipos), oftalmía sinpatética, hipertensión pulmonar secundaría a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocítopenia idiopática, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixidema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda, vitíligo, enfermedades crónicas del hígado, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colecistitis, enfermedad del hígado idiosincrática, hepatitis inducida por fármacos, estatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococo del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoprotemia, Acrocianosis, proceso por parásitos o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, falla renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de alfa-1 -anti-tripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración celular de cuero anterior, terapia a nti-cd 3 , síndrome anti-fosfolípido, reacciones de hipersensibilidad de anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión' arterial, arterieesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fíbrilación atrial (sostenida o paroxismal), trepidación auricular, bloque atrioventricular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloque de ramificación de grupo, linfoma de Burkitt, quemaduras, arritmias cardíacas, síndrome de atrofia cardiaca, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación de derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales de cerebelo, trastornos de cerebelo, taquicardia atrial caótica o de foco múltiple, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorectal, falla cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale (enfermedad cardiaca pulmonar), enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa de cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados con terapia de citocina, demencia pugilística, enfermedades de desmielinización, fiebre hemorrágica por dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad del cuerpo de Lewy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad media, trastornos del movimiento inducidos por fármacos, que bloquean los receptores de dopamina del sistema nervioso central (CNS), sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus de Epstein-barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena de gas, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis gram negativa, sepsis gram positiva, granulomas debido organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemol ítico/púrpura trombocitopénico trombolítico, hemorragia, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infección por VIH/ neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hipercinéticos, reacciones de hipersensibilidad , neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimiento hipocinéticos, evaluación hipotalámica-pituitaria-eje adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema cortiespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfederma, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas, migraña, dolor de cabeza, trastorno de sistema múltiple mitocondrial, enfermedad de tejido conectivo mixta, gamopatía monoclonal, mié loma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, micobacterium aviar ¡ntracelular, tuberculosis por micobacteria, síndrome mielodiplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos al miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma de no Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos reversibles se vasectomía, órganomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/ hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenial, enfermedad pericardial, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por pneumocistis carinii, neumonía, síndrome de PÓEMS (polineuropatia, órganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonal, y síndrome de cambios de piel), síndrome de pos-perfusión, síndrome de posbomba, síndrome de cardiotomía pos-MI, preeclampsia, parálisis progresiva de supra-núcleo, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia QRS estrecha regular, hipertensión reno-vascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo de cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, apoplejía, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espino-cerebelares, miositis por estreptococo, lesiones estructurales del cerebelo, panence alitis esclerosante, sub-aguda, sincope, sífilis del sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o FAB, telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff , enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, (ver, Peritt et al. publicación de PCT No. WO2002097048A2, Leonard et al., publicación de PCT No. W09524918 Al, y Salfeld et al., publicación de PCT No. WO00/56772A1).
Las proteínas de unión de la invención pueden ser utilizadas para tratar seres humanos que sufren de enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con inflamación, incluyendo, artritis reumatoide, espondilitis, alergia, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune. En una modalidad, las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de las mismas, se utilizan para tratar artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, escle.rosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina, y psoriasis.
En una modalidad, las enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres primarios y metastáticos , incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y ductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñon, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cérvix, útero y ovarios, así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de célula germinal), glándulas endocrinas (incluyendo la tiroides, glándulas adrenales y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellas surgen de hueso y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retínoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas (neurilemmoma), y meningiomas), tumores sólidos que surgen de malignidades hematopoyéticas tales como leucemias, y linfomas (linfomas tanto de Hodgkin y de no Hodgkin).
En una modalidad, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos aquí ya sea cuando se utilizan solo o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.
Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, pueden ser combinados con agentes que incluyen, pero no se limitan a, agentes antineoplásicos, radioterapia, quimioterapia tales como agentes de alquilación de ADN, cisplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorin, irinotecan, inhibidores de tirosina cinasa de receptor por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celocoxib), inhibidores de cinasa, y siARNs.
Una proteína de unión de la invención también puede ser administrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de varias enfermedades.
Una proteína de unión de la invención puede ser utilizada sola o en combinación para tratar dichas enfermedades. Se debe entender que las proteínas de unión pueden ser utilizadas solas o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, dicho agente adicional seleccionándose por algún experto en la técnica para su uso pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica que es útil para tratar la enfermedad o condición que se está tratando por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición.
Además se debe entender que las combinaciones que se van a incluir dentro de esta invención, son aquellas combinaciones útiles para su propósito pretendido. Los agentes establecidos a continuación son ilustrativos para los propósitos y no pretenden ser limitados. Las combinaciones, que son parte de esta invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional seleccionado de las listas que se presentan más adelante. La combinación también incluye más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada pueda realizar su función pretendida.
Las combinaciones para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias son fármacos anti-inflamatorios no esteroidales también denominados como NSAIDS, los cuales incluyen fármacos como el ibuprofeno. Otras combinaciones son corticoesteroides incluyendo prednisolona; los efectos laterales bien conocidos del uso de esteroides pueden ser reducidos o a ún eliminados uniendo la dosis de esteroide requerida cuando se tratan pacientes en combinación con las DVD-lgs de esta invención. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con el cual un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención puede ser combinado incluyen los siguientes: fármacos anti-inflamatorios supresores de citocina (CSAIDs); anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL- 21, IL-23, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, pueden ser combinadas con anticuerpos para las moléculas de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).
Las combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune e inflamatoria subsecuente; ejemplos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos de TNF quiméricos, humanizados o humanos, ADALIMUMAB, (Publicación de PCT No. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, y receptores de TNF solubles p55 o p75, derivados de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p55TNFRIgG (Lenercept), y también inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE); similarmente, inhibidores de IL-1 (inhibidores de enzima de conversión I nterleuci na- 1 , IL-1RA, etc.) pueden ser efectivas para la misma razón. Otras combinaciones incluyen Interleucina 11. Otra combinación más incluyen jugadores clave de la respuesta autoinmune, los cuales pueden actuar en paralelo a, dependiendo de o de acuerdo con la función de IL-12; especialmente son antagonistas de IL-12 incluyendo anticuerpos IL-18 o receptores de IL-18 solubles, o proteínas de unión de IL-18. Se ha mostrado que IL-12 e IL-18 tienen funciones traslapantes pero distintas y una combinación de antagonistas para ambos puede ser efectiva. Otra combinación más son los inhibidores anti-CD4 no carentes. Otras combinaciones incluyen antagonistas de la trayectoria co-estim ulante CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2), incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonísticos.
Las proteínas de unión de la invención también pueden ser combinadas con agentes, tales como metotrexato, 6-MP, sulfasalazina de azatioprina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, coquicina, corticoesteroides (orales, inhalados e inyección local), agonistas de beta-2-adrenoreceptor (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotifen, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización a través de citocinas pro-inflamatorias tales como TNF-a o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK , p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de enzima de conversión IL-1 ß , inhibidores de enzima de conversión TNFa (TACE), inhibidores de señalización de célula T-tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de ios mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)), slL-1RI, s I L - 1 R 11 , slL-6R), citocinas anti-inflamatorias (e.g.,IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF3), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxen, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato de oro-sodio, aspirina, triamcinolona acetonida, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenac, piroxicam, etodolac, diclofenac, oxaprozina sódica, HCI de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenac sódico/misoprostol, fentanilo, anakinra, recombinante humano, HCI de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamin/fa/piridoxina, acetaminofen, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, glucosamina sulf/condroitina, HCI de amitriptilina, sulfadiazina, HCI de oxicodona/acetaminofen, HCI de olopatadina, misoprostol, naproxen sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, M RA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, Anti-I L15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, y Mesopram. Las combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severa, ciclosporina.
Los agentes adicionales no limitantes que también pueden ser utilizados en combinación con una proteína de unión para tratar artritis reumatoide incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs); fármacos antiinflamatorios supresores de citocina (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticuerpo quimérico anti-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-lgG/etanercept (75 kD proteína de fusión IgG-receptor de TNF; Immunex; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTN F-lgG (55 kD proteína de fusión IgG-receptor TNF; Hoffmann- LaRoche); IDEC -CE9. I/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado no-carente; IDEC/SmithKIine; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión IL-2; Seragen; ver, también, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (anti-l L-2Ra humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-IRA (antagonista de receptor IL-1; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (proteína de unión TNF soluble; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa Tipo IV; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (Inhibidor de COX-2; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); lloprost (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidomida (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida (anti-inflamatorio e inhibidor de citocina; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S 131 ; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexámico (inhibidor de activación de plasminógeno; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284); T-614 (inhibidor de citocina; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (fármaco antiinflamatorio no-esteroidal; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); Naproxen (fármaco antiinflamatorio no-esteroidal; ver, por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (fármaco anti-inflamatorio no-estercidal); Ibuprofen (fármaco anti-inflamatorio no-esteroidal); Piroxicam (fármaco anti-inflamatorio no-esteroidal); Diclofenaco (fármaco anti-inflamatorio no-esteroidal); Indometacina (fármaco anti-inflamatorio no-esteroidal); Sulfasalazina (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); Azatioprina (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); inhibidor de ICE (inhibidor de la enzima de conversión de interleucina-1 ß); zap-70 y/o inhibidor de Ick (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o Ick); inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento de célula endotelial vascular o receptor de factor de crecimiento de célula e n d o te I i a I ; inhibidores de angiogénesis); fármacos anti-inflamatorios corticoesteroides (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; anticuerpos anti-IL- 2; anticuerpos ariti-IL-18; interleucina-11 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S296); interleucina-13 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S308); inhibidores de interleucina-17 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S 120); oro; penicilamina; cloroquina; clorambucil; hidroxicloroquina; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiación linfoide total; globulina anti-timocito; anticuerpos anti-CD4; CD5-toxinas; péptidos oralmente administrados y colágeno; lobenzarit disódico; Agentes Reguladores de Citocina (CRAs) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligo-desoxinucleótidos fosforotioato ICAM-I antisentido (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 de complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona, orgotein; polisulfato de glicosaminoglican; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de pescado y semilla de planta; ver, por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofin; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; azaribina; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectin); cladribina (2-clorodesoxadenosina); metotrexato; inhibidores de bcl-2 (ver, Bruncko, Milán et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662); antivirales y agentes moduladores inmunologicos.
En una modalidad, la proteína de unión o porción de unión a antigeno de la misma, se administra en una combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumatoide: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; leflunomida; naproxen; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofen; meloxicam; acetato de metilprednisolona; tiomalato de oro-sodio; aspirina; azatioprina; triamcinolona acetonida; napsilato de propoxifeno /apap; folato; nabumetona; diclofenac; piroxicam; etodolac; diclofenaco sódico; oxaprozina; HCI de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenaco sódico/misoprostol; fentanilo; ' anakinra, recombinante humano; HCI de tramadol; salsalato; sulindac; cianocobalamin/fa/piridoxina; acetaminofen; alendronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina, HCI de amitriptilina; sulfadiazina; HCI de oxicodona/acetaminofen; HCI de olopatadina; misoprostol; naproxen sódico; omeprazol; micofenolato mofetil; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC- 485; CDC-801; y mesopram.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para enfermedad inflamatoria del intestino con los cuales una proteína de unión de la invención puede ser combinada, incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticoesteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor IL-1; mAbs anti-IL-?ß; mAbs anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos piridinil-imidazol; anticuerpos para o antagonistas de citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antigeno de los mismos, pueden ser combinados con anticuerpos en las molécula de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también pueden ser combinados con agentes, tales como, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización a través de citocinas pro-inflamatorios tales como TNFa o IL-I (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de enzima de conversión IL-1 ß , inhibidores de enzima de conversión TNFa, inhibidores de señalización de célula T, tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores TNF solubles p55 o p75, sIL-IRI, sIL-IRII, slL-6R) y citocinas anti-inflamatorias (e.g.,IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp) e inhibidores de bcl-2.
Ejemplos de agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn en donde una proteína de unión puede ser combinada incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, ADALIMUMAB (Publicación de PCT No. WO 97/29131; HU IRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) e inhibidores de p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención, o una porción de unión a antígeno de los mismos, pueden ser combinados con corticoesteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, también pueden ser combinados con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o acción de citocinas pro- inflamatorias, tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de enzima de conversión de i L - 1 ß e IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o una porción de unión a antígeno de los mismos pueden también ser utilizados con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa, 6-mercaptopurinas. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, pueden ser combinadas con IL-11. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, pueden ser combinadas con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, succinato de metilprednisolona sódica, difenoxilato/ sulfato de atrop, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidázol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofloxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, HCI de oxicodona/acetaminofen, clorhidrato de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofil, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitamínicos, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, HCI de colesevelam, cianocobalamin, ácido fólico, levofloxacina, metilprednisolona, natalizumab y ¡nterferón-gamma.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: corticoesteroides; prednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; ¡nterferón-ß? a (AVONEX; Biogen); ¡nterferón-ß? b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Inferieron Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß 1 A- 1 F (Serono/lnhale Therapeutics) , Peginterferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas con anticuerpos para las moléculas de superficie de célula, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Las proteínas de unión de la invención también pueden ser combinadas con agentes,- tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización a través de citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), I L - 1 ß inhibidores de enzima de conversión, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de célula T, tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF solubles p55 o p75, s I L- 1 R I , s I L- R 11 , SIL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF ) e inhibidores de bcl-2.
Ejemplos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple en donde las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen interferón-ß, por ejemplo, IFN 1a y I F N ß 1 b ; Copaxona, corticoesteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para ligando CD40 y CD80.
Las proteínas de unión de la invención también pueden ser combinadas con agentes tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de xaliproden, fampridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualína, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposoma), THCCBD (agonista canabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo de receptor anti-IL-6, neurovax, pirfenidona allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-RI, talampanel, teriflunomida,TGF-beta2, tiplímotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferón-gamma, agonistas de IL-4.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para angina con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, mononitrato de isosorbida, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol, besilato de amlodipina, clorhidrato de diltiazem, dinitrato de isosorbida, bisulfato de clopidogrel, nifedipina, atorvastatina de calcio, cloruro de potasio, furosemida, simvastatina, HCI de verapamil, digoxina, clorhidrato de propranolol, carvedilol, lisinopril, espironolactona, clorhidrato de tiazida, maleato de enalapril, nadolol, ramipril, enoxaparina sódica, heparina sódica, valsarían, clorhidrato de sotalol, fenofibrato, ezetimiba, bumetanida, losarían poíásico, lisinopril/cloruro de íiazida, felodipina, capíopril, fumaraío de bisoprolol.
Ejemplos no limiíantes de ageníes lerapéuticos para espondilitis anquilosante con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: ibuprofeno, diclofenaco y misoprostol, naproxen, meloxicam, indometaci na , diclofenaco, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina, Metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept, infliximab.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuíicos para asma con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguieníes: albulerol, salmeterol/fluticasona, montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesonida, prednisona, xinafoato de salmeterol, HCI de levalbuterol, sulfato de albuterol/ipratropio, fosfato de prednisolona-sodio, triamcinolona acetonida, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, succinato de metilprednisolona-sodio, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna de virus de influenza, metilprednisolona, trihidrato de amoxicilina, flunisolida, inyección de alergia, cromolin sódico, clorhidrato de fexofenadina, flunisolida/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo auxiliar de inhalación, guaifenesina, fosfato de dexametasona-sodio, HCI de moxifloxacina, hiclato de doxiciclina, guaifenesina/d-metorfan, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, clorhidrato de cetirizina, furoato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, HCI de cetirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozil, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, chlorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona, sulfato de metaproterenol.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para COPD con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: sulfato de a Ibuterol /ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, succinato de metilprednisolona-sodio, montelukast sódico, budesonida, fumarato de formoterol, triamcinolona acetonida, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, HCI de levalbuterol, flunisolida, ceftriaxona sódica, trihidrato de amoxicilina, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisolida/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona, furoato de mometasona , p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R, )-formoterol, TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para HCV con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: I nterferón-alFa-2a, Interferón-alfa-2b, Interferón-alfa con1, I nterferón-alf a-n 1 , interferón-alfa-2a pegilado, ¡nterferón-alfa-2b pegilado, ribavirina, Peginterferón alfa-2b + ribavirina, ácido Ursodesoxicólico, ácido Glicirrízico, Timalfasin, Maxamina, VX-497 y cualesquiera compuestos que se utilizan para tratar HCV a través de la intervención de los siguientes objetivos: HCV polimerasa, HCV proteasa, HCV helicasa, HCV IRES (sitio de entrada de ribosoma interno).
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para fibrosis pulmonar idiopática con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colquicina, sulfato de albuterol, digoxina, gamma-interferón, metilprednisolona sod succ, lorazepam, furosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, HCI de oxicodona, cloruro de potasio, triamcinolona acetonida, tacrolimus anhidro, calcio, interferón-alfa, metotrexato, micofenolato mofetil, lnterferón-gamma-1 ß.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para infarto al miocardio con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, retavasa, losarían potásica, HCI de quinapril/mag carb, bumetanida, alteplasa, enalapril at, clorhidrato de amiodarona, HCI m-hidrato de tirofiban, clorhidrato de diltiazem, captopril, ¡rbesartan, valsarían, clorhidrato de propranolol, fosinopril . sódico, clorhidrato de lidocaína, eptif ¡batida , cefazolin sódico, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, clorhidralo de solalol, cloruro de poíasio, docusato sódico, HCI de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, alorvastatina de calcio, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de meperidina, dinitraío de isosorbida, epinefrina, clorhidrato de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, cariporida.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para psoriasis con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: inhibidor de KDR de molécula pequeña, inhibidor de Tie-2 de molécula pequeña, calcipotrieno, propionato de clobetasol, triamcinolona acetonida, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, betámetasona diprop aumentada, fluocinolona acetonida, acitretin, champú de alquitrán, valerato de betametasona, furoato de mometasona, cetoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolida, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emoll, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula humectante, ácido fólico, desonida, pimecrolimus, alquitrán de hulla, diacetato de diflorasona, folato de etaner'cept, ácido láctico, metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, filtro solar, halcinonida, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de carbón, alquitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicilico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, fluocinonida/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de cacahuate, petróleo/miristato de isopropilo, psoralen, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB, sulfasalazina.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para artritis psoriática con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: metotrexato, etanercept, rofecoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxen, leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, betametasona diprop aumentada, infliximab, metotrexato, folato, triamcinolona acetonida, diclofenac, sulfóxido de dimetilo, piroxicam, diclofenaco sódico, cetoprofen, meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetin sódico, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenaco sódico/misoprostol, fluocinonida, sulfato de glucosamina, tiomalato de oro-sodio, bitartrato de h ¡drocodona/apap, ibuprofen, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alefacept, efalizumab e inhibidores de bcl-2.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para restenosis con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: sirolimus, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, Zotarolimus, acetam inofen.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para ciática con los cuales las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen los siguientes: bitartrato de hidrocodona/apap, rofecoxib, HCI de ciclobenzaprina, metilprednisolona, naproxen, ibuprofen, HCI de oxicodona/acetaminofen, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/apap, HCI de tramadol/acetaminofen, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, clorhidrato de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentina, dexametasona, carisoprodol, cetorolac trometamina, indometacina, acetaminofen, diazepam, nabumetona, HCI de oxicodona, HCI de tizanidina, diclofenaco sódico/misoprostol, napsilato de propoxifen/apap, asa/oxícod/oxicodona ter, ibuprofen/corte de hidrocodona, HCI de tramadol, etodolac, HCI de propoxifeno, HCI de amitriptilina, carisoprodol/codeína fos/asa, sulfato de morfina, multivitamínicos, naproxen sódico, citrato de orfenadrina, temazepam.
Ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (Lupus) en donde las proteínas de unión de la invención pueden ser combinadas incluyen las siguientes: NSAIDS, por ejemplo, diclofenaco, naproxen, ibuprofen, piroxicam, indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-malaria, por ejemplo, hidroxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenosida, dexametasona; citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, micofenolato mofetil, metotrexato; i nhibidores de PDE4 o inhibidor de síntesis de purina, por ejemplo Cellcept. Las proteínas de unión de la invención, también pueden ser combinadas con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, Imuran y agentes que interfieren con la síntesis, producción o acción de citocinas pro-inflamatorias tales, como IL1, por ejemplo, ¡nhibidores de caspasa como inhibidores de enzima de conversión I L - 1 ß e I L- 1 r a . Las proteínas de unión de la invención también pueden ser utilizadas con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa; o moléculas que tienen por objeto moléculas de activación de célula T, por ejemplo, anticuerpos de la familia CTLA-4-lgG o anti-B7, anticuerpos de la familia anti-PD-1. Las proteínas de unión de la invención, que pueden ser combinadas con IL-11 o anticuerpos anti-citocina, por ejemplo, fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos de receptor anti-receptor, por ejemplo, anticuerpo de receptor anti-IL-6 y a nticuerpos p ara moléculas de superficie de célula B . también se pueden utilizar anticuerpos de la invención o una porción de unión a antígeno del mismo con LJP 394 (abetimus), agentes que carecen o inactivan células B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), limfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación de PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de bcl-2, ya que se ha demostrado que la sobre-expresión de bcl-2 en ratones transgénicos ocasiona un fenotipo tipo lupus (ver Marquina, Regina et al., Journal of Immunology (2004), 172(11), 7177-7185), por lo tanto se espera que la inhibición tenga efectos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad- terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de una proteína de unión de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión puede ser determinada por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la habilidad de la proteína de unión para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en donde cualquier efecto tóxico o dañino del anticuerpo, o porción de anticuerpo, es excedido por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de o en la etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosis pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un bolo individual puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas con el tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajosa formular composiciones parenterales en una forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se utiliza aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que serán tratados; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la invención se dictan por y directamente dependen de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que debe ser obtenido, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formulación tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Una escala no limitante, ilustrativa para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una proteína de unión de la invención es de 0.1-20 mg/kg, por ejemplo, 1-10 mg/kg. Se debe observar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y la severidad de la condición que va a ser aliviada. Además se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosis específicos deben ser ajustados con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o está supervisando la administración de la composición, y que las escalas de dosis establecidas aquí son solo ilustrativas y que no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada.
Será evidente para aquellos expertos en la técnica que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos de la invención, aquí descrita, son obvias y se pueden hacer utilizando equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de la invención o las modalidades descritas aquí. Habiendo ahora descrito la presente invención con detalle, la misma se entenderá más claramente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen para propósitos de ilustración solamente y no pretenden ser limitantes de la invención.
V. Diagnóstico La presente descripción también proporciona aplicaciones de diagnóstico. Esto además se discute a continuación.
I. Método de Ensayo La presente descripción también proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba utilizando por lo menos una DVD-lg como se describe aquí. Cualquier ensayo, como es conocido en la técnica, puede ser usado en el método. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayo, tales como inmunoensayo emparedado (por ejemplo, inmunoensayos monoclonales, policlonales y/o de emparedado de DVD-lg o cualquier variación de los mismos (por ejemplo, monoclonal/DVD-lg , DVD-lg/policlonal , etc.), incluyendo detección de radioisótopo (radioinmunoensayo (RIA)) y detección de enzima (inmunoensayo de enzima (EIA) o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (por ejemplo, Quantikine ELISA assays, R&D Systems, Minneapolis, MN))), inmunoensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, anterior y reverso), inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), técnica de inmunoensayo multiplicada de enzima (EMIT), transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), y ensayo quimioluminiscente homogéneo, etc. En un inmunoensayo basado en SELDI, un reactivo de captura que específicamente une un analito (o fragmento del mismo) de interés está unido a la superficie de una sonda de espectrometría masiva, tal como un arreglo de circuito de proteína pre-activado. El analito (o fragmento del mismo) después es específicamente capturado en el bio-circuito, y el analito capturado (o fragmento del mismo) es detectado a través de espectrometría masiva. Alternativamente, el analito (o fragmento del mismo) puede ser extraído del reactivo de captura y detectado a través de MALDI tradicional (desabsorción/ionización por láser asistida por matriz) o a través de SELDI. Un inmunoensayo de micropartícula quimioluminiscente, en particular, uno que emplea el analizador automático ARCHITEC® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmunoensayo preferido.
Los métodos bien conocidos en la técnica para reunir, manejar y procesar orina, sangre, suero y plasma, y otros fluidos del cuerpo, se utilizan en la práctica de la presente descripción, por ejemplo, cuando una DVD-lg, como se describe aquí, se emplea como un reactivo de inmunodiagnóstico y/o en un equipo de inmunoensayo de analito. La muestra de prueba puede comprender otras porciones además del analito de interés, tales como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba, particularmente sangre entera, sea tratada antes de inmunoensayo como se describe aquí, por ejemplo, con un reactivo de pre-tratamiento. Aún en casos en donde el pre-tratamiento no sea necesario (por ejemplo, la mayoría de las pruebas de orina), el pre-tratamiento opcionalrñente puede ser realizado (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial).
El reactivo de pre-tratamiento puede ser cualquier reactivo apropiada para usarse con el inmunoensayo y equipos de la invención. El pre-tratamiento opcionalmente comprende: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y etilen glicol) y opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal, y opcionalmente, detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal. Los reactivos de pre-tratamiento son conocidos en la técnica, y dicho pre-tratamiento puede ser empleado, por ejemplo, como se usa para ensayos en analizadores de Abbott TDx, AxSYM®, y ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), como se describe en la literatura (ver, por ejemplo, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), y Wallemacq et al., Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EM IT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)), y/o como está comercialmente disponible. Además, pre-tratamiento puede ser realizado como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,135,875 de Abbott, Pat. Pub. Europea No. 0 471 293, Sol. Pat. Provisional de E.U.A. 60/878,017, presentada el 29 de Diciembre, 2006, y Sol. Pat. E.U.A. Pub. No. 2008/0020401 (incorporadas aquí en su totalidad para sus enseñanzas con respecto al pre- tratamiento). El reactivo de pre-tratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogéneo, el reactivo de pre-tratamiento precipita la proteína de unión a analito (por ejemplo, proteína que puede unirse a un analito o fragmento del mismo) presente en la muestra. Dicho paso de pre-tratamiento comprende remover cualquier proteína de unión a analito separando de la proteína de unión a analito precipitada el sobrenadante de la mezcla formada por la adición del agente de pre-tratamiento la muestra. En dicho ensayo, el sobrenadante de la mezcla ausente de cualquier proteína de unión se utiliza en el ensayo, prosiguiendo directamente al paso de captura de anticuerpo Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento homogéneo, no existe dicho paso de separación. La mezcla entera de la muestra de prueba y el reactivo de pre-tratamiento se ponen en contacto con un patrón de unión específico marcado para al analito (o fragmento del mismo), tal como un anticuerpo anti-analito marcado (o un fragmento antigénicamente reactivo del mismo). El reactivo de pre-tratamiento empleado para dicho ensayo típicamente se diluye en la mezcla de muestra de prueba pre-tratada, ya sea antes o durante la captura por el primer patrón de unión específico. A pesar de dicha dilución, cierta cantidad del reactivo de pre-tratamiento aún sigue presente (o permanece) en esta mezcla de muestra de prueba durante la captura. De acuerdo con la invención, el patrón de unión específico marcado puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo).
En un formato heterogéneo, después de que se obtiene la muestra de prueba a partir de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba siendo valorada para un analito (o fragmento del mismo) y un primer patrón de unión específico, en donde el primer patrón de unión específico y Cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un complejo de un primer patrón de unión específico-analito. Preferiblemente, el primer patrón de unión específico es un anticuerpo anti-analito de un fragmento del mismo. El primer parón de unión' específico puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) como se describe aquí. El orden en el cual la muestra de prueba y el primer patrón específico se agregan para formar la mezcla no es crítico. Preferiblemente, el primer patrón de unión específico es inmovilizado sobre una fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmunoensayo (para el primer patrón de unión específico y, opcionalmente, el segundo patrón de unión específico) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, pero no limitándose a, una partícula magnética, una perla, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una membrana, una molécula de andamio, una película, un papel filtro, un disco y un circuito.
Después de que se forma ia mezcla que contiene el complejo de primer patrón de unión específico-analito, cualquier analito no unido es removido del complejo utilizando cualquier técnica conocida en el campo. Por ejemplo, el analito no unido puede ser removido mediante lavado. Sin embargo, deseablemente, el primer patrón de unión específico está presente en exceso de cualquier analito presente en la muestra de prueba, de manera que todo el analito presente en la muestra de prueba es unido a través del primer patrón de unión específico.
Después de que se remueve cualquier analito no unido, se agrega un segundo patrón de unión específico a la mezcla para formar un complejo de primer patrón de unión específico-analito-segundo patrón de unión específico. El segundo patrón de unión específico de preferencia es un anticuerpo anti-analito que se une a un epitopo sobre el analito que difiere del epitopo en el analito unido por el primer patrón de unión específico. Además, también de preferencia, el segundo patrón de unión específico es marcado o etiquetado con o contiene una marca detectable como se describió anteriormente. El segundo patrón de unión específico puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) como se describe aquí.
Cualquier marca o etiqueta detectable adecuada, como es conocido en la técnica, puede ser utilizada. Por ejemplo, la marca detectable puede ser una marca radioactiva (tal como 3H, 1251, 35S, 14C, 32P, y 33P), una marca enzimática (tal como peroxidasa de rábano, peroxidasa alcalina, 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa, y similares), una marca quimioluminiscente (tal como esteres de acridinio, tioésteres, o sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio, y similares), una marca fluorescente (tao como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceina, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceina, isotiocianato de f luoresceína, y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, -ficoeritrina, puntos quantum (por ejemplo, sulfuro de zinc-seleniuro de cadmio bloqueado en su extremo, una marca termométrica, o una marca de reacción de cadena de inmuno-polimerasa. Una introducción a marcas o etiquetas, procedimiento de marcación y detección de marcas se encuentra en Polak y Van Noorden, I ntroduction to Immunocytochemistry, 2° ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), el cual es un manual o guia combinada y catálogo publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón. Una marca fluorescente puede ser utilizada en FPIA (ver Patentes de E.U.A. Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, y 5,352,803, las cuales se incorporan aquí para referencia en sus totalidades). Un compuesto de acridinio puede ser utilizado como una marca o etiqueta detectable en un ensayo de quimioluminiscencia homogéneo o heterogéneo (ver, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779- 3782 (2003)).
Un compuesto de acridinio preferido es una 9-carboxamida de acridinio. Los métodos para preparar 9-carboxamidas de acridinio se describen por Mattingly, J. Biolumin. Chemüumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., en Luminescence Biotechnology : Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Ratón, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); y Patentes de E.U.A. Nos. 5,468,646, 5,543,524 y 5,783,699 (cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad para sus enseñanzas con respecto a la misma). Otro compuesto de acridinio preferido es un acridinio-9-carboxilato aril éster. Un ejemplo de un acridinio-9-carboxilato aril éster es fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar acridinio-9-carboxilato aril ésteres se describen por McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); y Patente de E.U.A. No. 5,241,070 (cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad para sus enseñanzas con respecto a lo mismo). Otros detalles sobre elacridinio-9-carboxilato aril éster y su uso se establecen en US 2008-0248493.
Se pueden realizar ensayos quimioluminiscentes (por ejemplo, utilizando acridinio como se describió .anteriormente u otros agentes quimioluminiscentes) de acuerdo con los métodos descritos en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Aunque cualquier formato de ensayo adecuado puede ser utilizado, un quimioluminómetro de microplaca (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S. A., LLC, Oak Ridge, TN) permite el ensayo de múltiples muestras de pequeños volúmenes en forma rápida.
El orden en el cual la muestra de prueba y el patrón(es) de unión específico se agregan- para formar la mezcla para el ensayo de quimioluminiscencia no es crítico. Si el primer patrón de unión específico es detectablemente marcado con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto acridinio, se forman complejos de primer patrón de unión específico-analito detectablemente marcados. De manera alternativa, si se utiliza un segundo patrón de unión específico y el segundo patrón de unión específico es detectablemente marcado con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto acridinio, se forman complejos de primer patrón de unión específico-analito-segundo patrón de unión específico. Cualquier patrón de unión específico no unido, ya sea marcado o no marcado, puede ser removido de la mezcla utilizando cualquier técnica conocida en el campo, tal como lavado.
Se puede generar peróxido de hidrógeno in situ en la mezcla o proporcionarse o suministrarse a la mezcla (por ejemplo, la fuente del peróxido de hidrógeno siendo uno o más reguladores de pH u otras soluciones que son conocidas por contener peróxido de hidrógeno)antes, simultáneamente con, o después de la adición del compuesto acridinio antes descritos. El peróxido de hidrógeno puede ser generado in situ en un número de formas tales como aquellas evidentes para un experto en la técnica.
Después de la adición simultanea o subsecuente de por lo menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, principalmente, una señal quimioluminiscente, indicativa de la presencia del analito. La solución básica contiene por lo menos una base y tiene un valor de pH mayor que o igual a 10, de preferencia, mayor que o igual a 12. Ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica agregada a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Basándose en la concentración de la solución básica usada, un experto en la técnica fácilmente puede determinar la cantidad de solución básica que se agregará a la muestra.
La señal quimioluminiscente que es generado puede ser detectada utilizando técnicas de rutina conocidas por aquellos expertos en el campo. Basándose en la intensidad de la señal generada, la cantidad de analito en la muestra puede ser cuantificada. Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito presente puede ser cuantificada comparando la cantidad de luz generada con una curva estándar, para el analito o comprando con un estándar de referencia. La curva estándar puede ser generada utilizando diluciones en serie o solución de concentraciones conocidas de analito a través de espectroscopia masiva, métodos gravimétricos, y otras técnicas conocidas en el campo. Aunque lo anterior se describe con énfasis en el uso de un compuesto acridinio como el agente quimioluminiscente, un experto en la técnica fácilmente puede adaptar esta descripción para usarse con otros agentes quimioluminiscentes.
Los inmunoensayos de analito generalmente pueden ser conducidos utilizando cualquier formato conocido en la técnica, tal como pero no limitándose a, un formato de emparedado. Específicamente, en un formato de inmunoensayo, por lo menos dos anticuerpos son empleados para separar y cuantificar el analito, tal como un analito humano, o un fragmento del mismo, en una muestra. Más específicamente, por lo menos los dos analitos se unen a diferentes epítopos en un analito (o fragmento del mismo) formando un complejo inmune, el cual es denominado como un "emparedado". En general, en los inmunoensayos, uno o más anticuerpos pueden ser utilizados para capturar el analito (o fragmento de unión del mismo) en la muestra de prueba (estos anticuerpos son frecuentemente denominados como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y uno o más anticuerpos pueden ser utilizados para unir una marca detectable (principalmente, cuantificable) al emparedado (estos anticuerpos son frecuentemente denominados como el "anticuerpo de detección", los "anticuerpos de detección", el "conjugado", o los "conjugados"). De esta manera, en el contexto de un formato de inmunoensayo emparedado, se puede utilizar una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como se describe aquí, como un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección, o ambos. Por ejemplo, una DVD-lg que tiene un dominio que puede unir un primer epítopo en un analito (o fragmento del mismo) puede ser utilizada como un anticuerpo de captura y/u otra DVD-lg teniendo un dominio que puede unir un segundo epítopo en un analito (o fragmento del mismo) puede ser utilizada como un anticuerpo detectable. A este respecto, una DVD-lg teniendo un primer dominio que puede unir un primer epítopo en un analito (o fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede unir un segundo epítopo en un analito (o un fragmento del mismo) puede ser utilizada como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección. Alternativamente, una DVD-lg que tiene un primer dominio que puede unir un epítopo en un primer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede unir un epítopo en un segundo analito (o un fragmento del mismo) puede ser utilizada como un anticuerpo de captura y/o un anticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente cuantificar, dos o más analitos. En el caso de que un analito pueda estar presente en una muestra en más de una forma, tal como una forma monomérica y una forma dimérica/multimérica, que puede ser homomérica o heteromérica, una DVD-lg teniendo un dominio que puede unir un epítopo que solo está expuesto en ia forma monomérica y otra DVD-lg teniendo un dominio que puede unir un epítopo en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica pueden ser utilizadas como anticuerpos de captura y/o anticuerpos de detección, permitiendo así la detección y opcionalmente la cuantif icación , de diferentes formas de un analito dado. Además, el empleo de DVD-lgs con afinidades diferenciales dentro de una DVD-lg individual y/o entre DVD-lgs puede proporcionar una ventaja de avidez. En el contexto de los inmunoensayos como se describe aquí, en general puede ser útil o deseado incorporar uno o más enlazadores dentro de la estructura de una DVD-lg. Cuando está presente, opcionalmente el enlazador debe ser de longitud suficiente y flexibilidad estructural para permitir la unión de un epítopo a través de los dominios internos así como de unir otro epítopo a través de dominios externos. A este respecto, si una DVD-lg puede unir dos diferentes analitos y un analito es más grande que el otro, deseablemente el analito más grande es unido por dominios externos.
Hablando en general, una muestra que es probada para (por ejemplo, con sospecha de contener) analito (o un fragmento del mismo) puede ponerse en contacto con al menos un anticuerpo de captura (o anticuerpos) y al menos un anticuerpo de detección (el cual puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección o aún un anticuerpo sucesivamente enumerado, por ejemplo, como cuando el anticuerpo de captura y/o detección comprende anticuerpos múltiples) ya sea simultánea o secuencialmente y en cualquier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba primero puede ponerse en contacto con al menos un anticuerpo de captura y después (secuencialmente) con al menos un anticuerpo de detección. Alternativamente, la muestra de prueba primero puede ponerse en contacto con al menos un anticuerpo de detección y después (secuencialmente) con al menos un anticuerpo de captura. En otra alternativa adicional, la muestra de prueba puede ponerse en contacto simultáneamente con un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.
En un formato de ensayo de emparedado, una muestra, con sospecha de contener el analito (o un fragmento del mismo) primero se pone en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura bajo condiciones que permitan la formación de un primer complejo de anticuerpo/analito. Si se utiliza más de un anticuerpo de captura, se forma un primer complejo de anticuerpo de ca ptura/a nal ito comprendiendo dos o más anticuerpos de captura. En un ensayo emparedado, los anticuerpos, es decir, preferiblemente, al menos un anticuerpo de captura, son utilizados en cantidades en exceso molar de la cantidad máxima del analito (o un fragmento del mismo) esperada en la muestra de prueba. Por ejemplo, se pueden utilizar de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 1 mg de anticuerpo por mi del regulador de pH (por ejemplo, regulador de pH de recubrimiento de micropartícula).
Los inmunoensayos de inhibición competitivos, los cuales por lo regular se utilizan para medir analitos pequeños ya que la unión mediante solo un anticuerpo es requerida, comprenden formatos secuenciales y clásicos. En un inmunoensayo de inhibición competitivo secuencial, un anticuerpo de captura para un analito de interés es colocado como recubrimiento en una cavidad de una placa de microtitulación u otro soporte sólido. Cuando la muestra que contienen el analito de interés es agregado a la cavidad, el analito de interés se une al anticuerpo de captura. Después de lavar, una cantidad conocida del analito marcado (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano (HRP)) se agrega a la cavidad. Un substrato para una marca enzimática es necesario para generar una señal. Un ejemplo de un substrato adecuado para HRP es 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Después de lavar, la señal generada por el analito marcado se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. En un inmunoensayo de inhibición competitivo clásico, un anticuerpo para un analito de interés es colocado como recubrimiento en un soporte sólido (por ejemplo, una cavidad de una placa de microtitulación). Sin embargo, a diferencia del inmunoensayo de inhibición competitivo secuencial, la muestra y el analito marcado se agregar a la cavidad al mismo tiempo. Cualquier analito en la muestra compite con el analito marcado para unirse al anticuerpo de captura. Después de lavar, la señal generada por el analito marcado es medida y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de muestra con al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), al menos un anticuerpo de captura puede ser unido a un soporte sólido, el cual facilita la separación del complejo de primer anticuerpo/analito (o un fragmento del mismo) desde la muestra de prueba. El substrato al cual el anticuerpo de captura se une puede ser cualquier soporte sólido adecuado o fase sólida que facilita la separación del complejo del anticuerpo de captura-analito a partir de la muestra.
Los ejemplos incluyen una cavidad de una placa, tal como una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa, dextrana, o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), perlas (por ejemplo, perlas de poliestireno o perlas magnéticas), una tira de un filtro/membrana (por ejemplo, nitrocelulosa o nylon), micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas magnetizables (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido férrico u óxido de cromo y recubrimientos homo- o hetero-poliméricos y radios de aproximadamente 1-10 mieras). El substrato puede comprender un material poroso adecuado con una afinidad de superficie adecuada para unir antígenos y suficiente porosidad para permitir el acceso a través de anticuerpos de detección. Generalmente se prefiere un material microporoso, aunque se puede utilizar un material gelatinoso en un estado hidratado. Dichos substratos porosos de preferencia están en la forma de láminas con un espesor de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mm, de preferencia alrededor de 0.1 mm. Aunque el tamaño de poro puede variar como un bit, de preferencia el tamaño de poro es de aproximadamente 0.025 a aproximadamente 15 mieras, muy preferiblemente de alrededor de 0.15 a 15 mieras. La superficie de dichos substratos puede ser activada a través de procedimientos químicos que ocasionan el enlace covalente de un anticuerpo al substrato. Resulta la unión irreversible, generalmente a través de adsorción mediante fuerzas hidrofóbicas, del antígeno o el anticuerpo al substrato; alternativamente, un agente de acoplamiento químico u otros medios pueden ser utilizados para unir covalentemente el anticuerpo al substrato, siempre que dicha unión no interfiera con la habilidad del anticuerpo para unirse a un analito. Alternativamente, e¡ anticuerpo puede ser unido con microparticulas, las cuales han sido previamente cubiertas con estreptavidina (por ejemplo, DYNAL® Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, utilizando microparticulas recubiertas con estreptavidina de Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, Indianapolis, IN)) o anticuerpos monoclonales anti-especies-específicos. Si es necesario, el substrato puede ser derivatizado para permitir la reactividad con varios grupos funcionales en el anticuerpo. Dicha derivatización requiere del uso de ciertos agentes de acoplamiento, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida y etil-1 -3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Si se desea, uno o más reactivos de captura, tales como anticuerpos (o fragmentos de los mismos), cada uno de los cuales es específico para al analito(s) puede ser unido a fases sólidas en diferentes ubicaciones físicas y dirigible, por ejemplo, tal como en una configuración de biochip (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 6,225,047; Sol. Int'l Pat. Pub. No. WO 99/51773; Pat. E.U.A. No. 6,329,209; Sol. Int'l Pat. Pub. No. WO 00/56934, y. Pat. E.U.A. No. 5,242,828). Si el reactivo de captura se une a una sonda de espectrometría masiva como el soporte sólido, la cantidad de analito unido a la sonda puede ser detectada a través de espectrometría masiva de ionización de deasborción por láser. Alternativamente, una columna individual puede ser empacada con diferentes perlas, las cuales se derivatizan con uno o más de los reactivos de captura, capturando así el analito en un lugar individual (ver, tecnologías a base de anticuerpo derivatizado, a base de perla, por ejemplo, tecnología de xMAP de Luminex (Austin, TX).
Después de que la muestra de prueba que es analizada para analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), la mezcla se incuba con el fin de permitir la formación de un complejo de primer anticuerpo (o anticuerpo múltiple)-analito (o un fragmento del mismo). La incubación puede realizarse a un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 10.0, a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, y durante un período de por lo menos aproximadamente un (1) minuto a aproximadamente dieciocho (18) horas, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 minutos, muy preferiblemente de alrededor de 4 a 18 minutos. El inmunoensayo descrito aquí puede ser conducido en un paso (lo que significa que la muestra de prueba, por lo menos un anticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo de detección todos se agreguen secuencial o simultáneamente a un vaso de reacción) o en más de un paso, tal como dos pasos, tres pasos, etc.
Después de la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múlt¡ple)/analito (o un fragmento del mismo), el complejo después se pone en contacto con al menos un anticuerpo de detección bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de un anticuerpo de captura (primero o múltiple)/anaiito (o un fragmento del m¡smo)/segundo anticuerpo de detección. Aunque considerado por claridad como el "segundo" anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo de detección), en realidad, cuando se utilizan múltiples anticuerpos para captura y/o detección, al menos un anticuerpo de detección puede ser el segundo, tercero, cuarto, etc., anticuerpos usados en el inmunoensayo. Si el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (múltiple). Como con el anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), cuando al menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, segundo y cualquiera subsecuente) se pone en contacto con el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo), se requiere de un período de incubación bajo condiciones similares a aquellas descritas anteriormente para la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analíto (o un fragmento del m ¡smo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). Preferiblemente, al menos un anticuerpo de detección contiene una marca o etiqueta detectable. La marca detectable puede ser unida a por lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, el segundo anticuerpo de detección) antes de, simultáneamente con, o después de la formación de.l complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). Cualquier marca detectable conocida en la técnica puede ser utilizada (ver discusión anterior, incluyendo las referencias Polak y Van Noorden (1997) y Haugland (1996)).
La marca detectable puede ser unida a los anticuerpos ya sea directamente o a través de un agente de acoplamiento. Un ejemplo de un agente de acoplamiento que puede ser utilizado es EDAC (clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida), que está comercialmente disponible de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Otros agentes de acoplamiento que pueden ser utilizados son conocidos en la técnica. Los métodos para unir una marca detectable a un anticuerpo son conocidos en la técnica. Además, muchas marcas o etiquetas detectables pueden ser compradas o sintetizadas que ya contienen grupos finales que faciliten el acoplamiento de la marca detectable al anticuerpo, tal como CPSP-Acridinio Ester (es decir, carboxamida de 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3-sulfopropil)-acridinio) o SPSP-Acridinio Ester (es decir, carboxamida de N10-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridin¡o-9).
El complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) puede ser, pero no tiene que ser, separado del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la marca o etiqueta. Por ejemplo, si al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) se une a un soporte sólido, tal como una cavidad o una perla, la separación puede lograrse removiendo el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Alternativamente, si el menos el primer anticuerpo de captura se une a un soporte sólido, puede ponerse simultáneamente en contacto con la muestra que contiene el analito y al menos un segundo anticuerpo de detección para formar un complejo de primer anticuerpo (múltiple)/analito/segundo anticuerpo (múltiple), seguido por la remoción del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si al menos un primer anticuerpo de captura no se une a un soporte sólido, entonces el complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (segundo o múltiple) no tiene que ser removido de la muestra de prueba para cuantificación de la cantidad de la marca o etiqueta.
Después de la formación del complejo de anticuerpo de captura/analito/anticuerpo de detección marcado (por ejemplo, el complejo del primer anticuerpo de captura/analito/segundo anticuerpo de detección), la cantidad de marca en el complejo es cuantificada utilizando técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, si se utiliza una marca enzimática, el complejo marcado se hace reaccionar con un substrato para la marca que da una reacción cuantif ¡cable tal como el desarrollo de color. Si la marca es una marca radioactiva, la marca es cuantificada utilizando medios apropiados, tales como un contador de cintilación. Si la marca es una marca fluorescente, la marca es cuantificada estimulando la marca con una luz de un color (que es conocida como "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (el cual es conocido como la "longitud de onda de emisión") que es emitida por la marca en respuesta a la estimulación. Si la marca o etiqueta es una marca quimioluminiscente, la marca es cuantificada detectando la luz emitida ya sea visualmente o utilizando luminómetros, película de rayos x, película fotográfica de alta velocidad, una cámara CCD, etc. Una vez que la cantidad de la marca en el complejo ha sido cuantificada, la concentración del analito o un fragmento del mismo en la muestra de prueba se determina a través de medios apropiados, tales como a través del uso de una curva estándar que ha sido generada usando diluciones en serie de analito o un fragmento del mismo de concentración conocida. En lugar de utilizar diluciones en serie del analito o un fragmento del mismo, la curva estándar puede ser generada gravimétricamente, a través de espectroscopia masiva y a través de otras técnicas conocidas en el campo.
En un ensayo de micropartícula quimioluminiscente que emplea el analizador ARCHITECT®, el pH del diluyente conjugado debe ser de aproximadamente 6.0 +/- 0.2, el regulador de pH de recubrimiento de micropartícula debe ser mantenido a temperatura ambiente (es decir, de aproximadamente 17 a aproximadamente 27°C), el pH del regulador de pH de recubrimiento de micropartícula debe ser de aproximadamente 6.5 +/- 0.2, y el pH del diluyente de micropartícula debe ser de aproximadamente 7.8 +/- 0.2. Los sólidos de preferencia son de menos de aproximadamente 0.2%, tales como menos de aproximadamente 0.15%, menos de aproximadamente 0.14%, menos de aproximadamente 0.13%, menos de aproximadamente 0.12%, o menos de aproximadamente 0.11%, tal como aproximadamente 0.10%.
Los FPIAs se basan en principios de inmunoensayo de unión competitivo. Un compuesto fluorescentemente marcado, cuando se excita por una luz linealmente polarizada, emitirá fluorescencia teniendo un grado de polarización inversamente proporcional a su velocidad de rotación. Cuando un complejo de rastreador-anticuerpo fluorescentemente marcado es excitado por una luz linealmente polarizada, la luz emitida permanece altamente polarizada ya que el fluoróforo es restringido de la rotación entre el tiempo en el que la luz es absorbida y el tiempo en el que la luz es emitida. Cuando un compuesto rastreador "libre" (es decir, un compuesto que no está unido a un anticuerpo) es excitado mediante luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que el conjugado de rastreador-anticuerpo correspondiente producido en un inmunoensayo de unión competitivo. Los FPIAs son ventajosos sobre los RIAs ya que no hay substancias radioactivas que requieran de manejo y desecho especiales. Además, los FPIAs son ensayos homogéneos que pueden ser fácil y rápidamente realizados.
En vista de lo anterior, se proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El método comprende analizar la muestra de prueba para un analito (o un fragmento del mismo) a través de un ensayo (i) que emplea (i') por lo menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) que puede unirse a un analito, y (?') por lo menos una marca detectable, y (i¡) que comprende comparar una señal generada a través de la marca detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba para una señal generado como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en un control o calibrador. El calibrador es opcionalmente parte de una serie de calibradores, en donde cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores por la concentración de analito.
El método puede comprender (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos un primer patrón de unión específico para el analito (o un fragmento del mismo) seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un o un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un o un fragmento de una variante del mismo) que puede unirse a un analito con el fin de formar un complejo de un primer patrón de unión específico/analito (o un fragmento del mismo), (i¡) poner en contacto el complejo del primer patrón de unión específico/analito (o un fragmento del mismo) con al menos un segundo patrón de unión específico para el analito (o un fragmento del mismo) seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo anti-analito detectablemente marcado, un fragmento detectablemente marcado de un anticuerpo anti-analito que puede unirse al analito, una variante detectablemente marcada de un anticuerpo anti-analito que puede unirse al analito, un fragmento detectablemente marcado de una variante de una anticuerpo anti-analito que puede unirse al analito, y una DVD-lg detectablemente marcada (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) con el fin de formar un complejo de un primer patrón · de unión especifico/analito (o un fragmento del mismo)/segundo patrón de unión específico, y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración de analito en la muestra de prueba detectando la señal generada por la marca detectable en el complejo del primer patrón de unión específico/analito (o un fragmento del mismo)/segundo patrón de unión específico formado en (¡i). Como se describe aquí se puede preferir un método en el cual por lo menos un primer patrón de unión específico (o un fragmento del mismo) y/o por lo menos un segundo patrón de unión específico (o un fragmento del mismo) es una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo).
Alternativamente, el método puede comprender poner en contacto la muestra de prueba con al menos un primer patrón de unión específico para el analito (o un fragmento del mismo) seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) y simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, poner en contacto la muestra de prueba con al menos un segundo patrón de unión específico, que puede competir con I analito (o un fragmento del mismo) para unirse por lo menos a un primer patrón de unión específico y el cual se selecciona del grupo que consiste de un analito detectablemente marcado, un fragmento detectablemente marcado del analito que puede unirse al primer patrón de unión específico, una variante detectablemente marcada del analito que puede unirse al primer patrón de unión específico, y un fragmento detectablemente marcado de una variante del analito que puede unirse al primer patrón de unión especifico. Cualquier analito (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y al menos un segundo patrón de unión específica compiten entre sí para formar un complejo de primer patrón de unión específico/analito (o un fragmento del mismo) u un complejo de un primer patrón de unión específico/segundo patrón de unión específico, respectivamente. El método además comprende determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generado por la marca detectable en el complejo del primer patrón de unión específico/segundo patrón de unión específico formado en (ii), en donde la señal generada por la marca detectable en el complejo del primer patrón de unión específico/segundo patrón de unión específico es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba.
Los métodos anteriores además pueden comprender diagnóstico, pronóstico o valoración de la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente de donde se obtuvo la muestra de prueba. Si el método además comprende valorar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente de donde se obtuvo la muestra, el método opcionalmente además comprende modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia. El método puede ser adaptado para usarse en un sistema automatizado o un sistema semi-automatizado.
Con respecto a los métodos de ensayo (y equipo para los mismos), puede ser posible emplear anticuerpos anti-analito comercialmente disponibles o métodos para la producción de un anti-analito como se describe en la literatura. Los proveedores comerciales de varios anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Gen <Way Biotech, Inc. (San Diego, CA), y &D Systems (RDS; Minneapolis, MN).
Generalmente, se puede emplear un nivel predeterminado como una benchmark contra el cual para valorar resultados obtenidos después de analizar una muestra de prueba para analito o un fragmento del mismo, por ejemplo, para detectar una enfermedad o riesgo de enfermedad. En general, para hacer dicha comparación, se obtiene el nivel predeterminado corriendo un ensayo particular un número de veces y bajo condiciones apropiadas de manera que se puede hacer un enlace o asociación de presencia de analito, cantidad o concentración con una etapa particular o punto final de una enfermedad, trastorno o condición o con indicios clínicos particulares. Típicamente, el nivel predeterminado es obtenido con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos). El analito medido puede incluir fragmentos del mismo, productos de degradación de los mismos, y/o productos de escisión enzimática de los mismos.
En particular, con respecto a un nivel predeterminado como se emplea para verificar la progresión y/o tratamiento de una enfermedad, la cantidad o concentración de analito o un fragmento del mismo puede ser "no cambiada", "favorable" (o "favorablemente alterada"), o "desfavorable" (o "desfavorablemente alterada"). "Elevada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra de prueba que es mayor que el nivel o escala típica o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o es mayor que otro nivel o escala de referencia (por ejemplo, muestra muy temprana o de línea de base). El término "baja" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o escala típica o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o es menor que otro nivel o escala de referencia (por ejemplo, muestra muy temprana o de línea de base). El término "alterada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra que es alterada (incrementada o reducida) sobre un nivel o escala típica o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o sobre otro nivel o escala de referencia (por ejemplo, muestra muy temprana o de línea de base).
El nivel o escala típico o normal para el analito se define de acuerdo con la práctica estándar. Ya que los niveles de analito en algunos casos serán muy bajos, se puede considera que un así llamado nivel o alteración alterada ha ocurrido cuando existe cualquier cambio neto según comparado con el nivel o escala típica o normal, o nivel o escala de referencia, que no puede ser explicado a través de error experimental o variación de muestra. De esta manera, el nivel medido en una muestra particular será comparado con el nivel o escala de niveles determinados en muestras similares a partir de un así llamado sujeto normal. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo sin ninguna enfermedad detectable, por ejemplo, un paciente "normal" (algunas veces denominado "control") o población es uno que no exhibe ninguna enfermedad detectable, respectivamente, por ejemplo. Además, dado que el analito no se encuentra por rutina a un alto nivel en la mayoría de la población humana, un "sujeto normal" puede ser considerado como un individuo sin ninguna cantidad incrementada o elevada detectable substancial o concentración de analito, y un paciente o población "normal" (algunas veces denominado "control") es uno que no exhibe ninguna cantidad o concentración de analito incrementada detectable o elevada substancial. Un "sujeto aparentemente normal" es uno en donde el analito no ha sido o está actualmente siendo valorado. Se dice que el nivel de un analito está "elevado" cuando el analito es normalmente no detectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o dentro de una escala de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 percentiles de poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba, así cuando también el analito está presente en la muestra de prueba a un nivel más alto que lo normal. De esta manera, entre otras cosas, la descripción proporciona un método para clasificar un sujeto que tiene, o que está en riesgo de tener, una enfermedad particular, trastorno o condición. El método de ensayo también puede involucrar el ensayo de otros marcadores y similares.
Por consiguiente, los métodos descritos aquí también pueden ser utilizados para determina si un sujeto tiene o no o está o no en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición dada.
Específicamente, dicho método puede comprender los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba de un sujeto, de un analito (o un fragmento del mismo) (por ejemplo, utilizando los métodos descritos aquí, o los métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad del analito (o un fragmento del mismo) determinada en el paso (a) con un nivel predeterminado, en donde, si la concentración o cantidad del analito determinada en el paso (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto no tiene o no está en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición dada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de un analito determinada en el paso (a) es no favorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o condición dada.
Además, aquí se proporciona un método para verificar la progresión de la enfermedad en un sujeto. Opcionalmente el método comprende los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba de un sujeto; (b) determinar la concentración o cantidad de un analito en una última muestra de prueba del sujeto; y (c) comparar la concentración o cantidad de analito según determinada en el paso (b) con concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), en donde si la concentración o cantidad determinada en el paso (b) no cambio o es desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), entonces la enfermedad en el sujeto se determina que tiene ha continuado, proseguido o empeorado. En comparación, si la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (b), es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (a), entonces la enfermedad en el sujeto se determina que ha terminado, ha regresado o ha mejorado.
Opcionalmente, el método además comprende comparar la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, opcionalmente el método comprende tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un período de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (b), por ejemplo, es desfavorablemente alterada con respecto al nivel predeterminado.
Aún más, los métodos pueden ser utilizados para verificar el tratamiento en un sujeto que recibe el tratamiento con una o más composiciones. Específicamente, dichos métodos involucran proporcionar una primera muestra de un sujeto antes de que se le haya administrado una o más composiciones farmacéuticas. Enseguida, la concentración o cantidad de analito en una primera muestra de prueba de un sujeto se determina (por ejemplo, utilizando los métodos descritos aquí o como es conocido en la técnica).
Después de que se determinó la concentración o cantidad de analito, opcionalmente después se compara la concentración o cantidad de analito con un nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de analito, según determinada en la primera muestra de prueba, es menor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto no es tratado con una o más composiciones. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito, según determinada en la primera muestra de prueba, es mayor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto es tratado con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El período de tiempo durante el cual el sujeto es tratado con una o más de las composiciones farmacéuticas, puede ser determinado por un experto en la técnica (por ejemplo, el período de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días a aproximadamente dos años, de preferencia de aproximadamente catorce (14) días a aproximadamente un (1) año.
Durante el curso del tratamiento con una o más de las composiciones farmacéuticas, después se obtienen segundas y subsecuentes muestras de prueba del sujeto. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual dichas muestras de prueba se obtienen del sujeto no son críticos. Por ejemplo, una segunda muestra de prueba puede ser obtenida siete (7) días después de que al sujeto se le administró por primera vez una o más de las composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba puede ser obtenida dos (2) semanas después de que al sujeto primero se le administró una o más de las composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba puede ser obtenida tres (3) semanas después de que al sujeto se le administró primero una o más de la composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba puede ser obtenida cuatro (4) semanas después de que al sujeto se le administró primero una o más de la composiciones farmacéuticas, etc.
Después de que se obtiene cada segunda o subsecuente muestra de prueba del sujeto, la concentración o cantidad de analito se determina en la segunda o subsecuente muestra de prueba (por ejemplo, utilizando los métodos descritos aquí o como es conocido en la técnica). La concentración o cantidad de analito, según determinada en cada una de la segunda y subsecuente muestras de prueba, después se compara con la concentración o cantidad de analito, según determinada en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que originalmente y en forma opcional se comparó con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (c) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el sujeto ha terminado, ha regresado o ha mejorado, y al sujeto se le debe continuar administrando una o más de las composiciones farmacéuticas del paso (b). Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (c) no cambia o no es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito, según determinada en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el sujeto continua, prosigue o empeora, y el sujeto debe ser tratado con una concentración más alta de una o más de las composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b) o el sujeto debe ser tratado con una o más de las composiciones que son diferentes de una o más de las composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b). Específicamente, el sujeto puede ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que con son diferentes de las composiciones farmacéuticas que el sujeto previamente ha recibido para disminuir o reducir dicho nivel de analito en el sujeto.
En general, para ensayos en donde la prueba de repetición puede ser realizada (por ejemplo, verificación de progresión de la enfermedad y/o respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o subsecuente muestra de prueba a un período de tiempo después de que la primera muestra de prueba ha sido obtenido del sujeto. Específicamente, una segunda muestra de prueba del sujeto puede ser obtenida minutos, horas, días, semanas o años después de que se ha obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba puede ser obtenida del sujeto a un período de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas , aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproxim adámente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente semanas, aproximadamente , 4 semanas, aproximadamente semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 ' semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas , aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas , aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas , aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2 .5 años, aproximadamente 3 .0 años, aproximadamente 3 .5 años, aproximadamente 4 .0 años, aproximadamente 4 .5 años, aproximadamente 5 .0 años, aproximadamente 5. 5. años, aproximadamente 6 .0 años, a proximadamente 6 .5 años, aproximadamente 7 .0 años, aproximadamente 7 .5 años, aproximadamente 8 .0 años, aproximadamente 8 .5 años, aproximadamente 9 .0 años, aproximadamente 9.5 años o aproxi madamente 10.0 años después de que la primera muestra de prueba se obtuvo del sujeto.
Cuando se utiliza para verificar la progresión de la enfermedad, el ensayo anterior puede ser utilizado para verificar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen de condiciones agudas. Las condiciones agudas, también conocidas como condiciones de cuidado críticas, se refieren a enfermedades aguas, que ponen en peligro la vida u otras condiciones médicas críticas que involucran, por ejemplo, el sistema cardiovascular o sistema de excreción. Típicamente, las condiciones de cuidado críticas se refieren a aquellas condiciones que requieren de intervención médica aguda en un hospital (incluyendo, peto no limitándose a, salas de emergencia, unidades de cuidado intensivo, centros de traumatología, u otro establecimiento de cuidado emergente) o la administración a través de un paramédico u otro personal médico a base de campo. Para condiciones de cuidado críticas, generalmente se realiza la verificación repetitiva en un marco de tiempo más corto, principalmente, minutos, horas o días (por ejemplo aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas , aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 dias, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días), y el ensayo inicial asimismo es generalmente realizado en un marco de tiempo más corto, por ejemplo, minutos, horas o días del inicio de la enfermedad o condición.
Los ensayos también pued.en ser utilizados para verificar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen de condiciones crónicas o no agudas. Las condiciones de cuidado no críticas o no agudas se refieren a condiciones diferentes a condiciones agudas, que ponen en peligro la vida u otras condiciones médicas críticas que involucran por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o sistema de excreción. Típicamente, las condiciones no agudas incluyen aquellas de duración a largo plazo mayor o crónicas. Para condiciones no agudas, generalmente se realiza la verificación repetitiva con un marco de tiempo más largo, por ejemplo, horas, días, semanas o años (por ejemplo, 1 hora aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas , aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas , aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas , aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas , aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas , aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas , aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2. 5 años, aproximadamente 3 .0 años, aproximadamente 3. 5 años, aproximadamente 4 .0 años, aproximadamente 4. 5 años, aproximadamente 5 .0 años, aproximadamente 5. 5. años, aproximadamente 6 .0 años, aproximadamente 6. .5 años, aproximadamente 7 .0 años, aproximadamente 7 .5 años, aproximadamente 8 .0 años, aproximadamente 8 .5 años, aproximadamente 9 .0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10 .0 años), y el ensayo inicial asimismo en general se realiza dentro de un marco de tiempo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, d ías, meses o años del inicio de la enfermedad o condición.
Además, los ensayos anteriores pueden ser realizados utilizando una primera muestra de prueba obtenida de un sujeto, en donde la primera muestra de prueba se obtiene de una fuente, tal como orina, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos anteriores después pueden ser repetidos utilizando una segunda muestra de prueba obtenida del sujeto, en donde la segunda muestra de prueba se obtiene de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtuvo de orina, la segunda muestra de prueba puede ser obtenida de suero o plasma. Los resultados obtenidos de los ensayos utilizando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba pueden ser comparados. La comparación puede ser utilizada para determina el estado de una enfermedad o condición en el sujeto.
Más aún, la presente descripción también se refiere a métodos para determinar si un sujeto, predispuestos a o que sufre una enfermedad dada, trastorno o condición se beneficiará a partir del tratamiento. En particular, la descripción se refiere a métodos y productos de diagnóstico de analito compañero. De esta manera, el método de "verificar el tratamiento de la enfermedad en un sujeto" como se describe aquí, además también en forma opcional abarca selecciona o identificar candidatos para terapia.
De esta manera, en modalidades particulares, la descripción también proporciona un método para determinar si un sujeto que tiene, o está en riesgo de una enfermedad dada, trastorno o condición es candidato para terapia. Generalmente, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de una enfermedad, trastorno o condición dada, o quien en realizada ya ha sido diagnosticado por tener, o estar en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o condición dada, y/o quien demuestra una concentración o cantidad desfavorable de analito o un fragmento del mismo, como se describe aquí.
El método opcionalmente comprende un ensayo, como se describe aquí, en donde el analito es analizado antes y después del tratamiento de un sujeto con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, en particular con un farmacéutico relacionado con un mecanismo de acción que involucra al analito), con terapia de inmunosupresión, o a través de terapia de inmunoabsorción, o cuando el analito sea analizado después de dicho tratamiento u la concentración o la cantidad de analito se compare contra un nivel predeterminado. Una concentración desfavorable de cantidad de analito observada después del tratamiento confirma que el sujeto no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuo, mientras que una concentración o cantidad favorable de analito observada después del tratamiento confirma que el sujeto se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuo. Esta confirmación ayuda al manejo de estudios clínico, y provisión de cuidado mejorado al paciente.
No se puede finalizar sin decir que, aunque ciertas modalidades de la presente son ventajosas cuando se emplean para valorar una enfermedad, trastorno o condición dada como se discute aquí, los ensayos y equipos pueden ser empleados para valorar el analito en otras enfermedades, trastornos y condiciones. El método de ensayo también puede involucrar el ensayo de otros marcadores y similares.
El método de ensayo también puede ser utilizado para identificar un compuesto que mitigue o mejore una enfermedad, trastorno o condición dada. Por ejemplo, una célula que expresa el analito puede ponerse en contacto con un compuesto candidato. El nivel de expresión del analito en la célula en contacto con el compuesto, puede ser comparado con aquel de una célula de control utilizando el método de ensayo descrito aquí.
II. Equipo También se proporciona un equipo para analizar una muestra de prueba para la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El equipo comprende por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo) e instrucciones para analizar la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo). Al menos un componente para analizar la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo) puede incluir una composición que comprende una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento. de una variante del mismo), el cual es opcionalmente inmovilizado sobre una fase sólida.
El equipo puede comprender por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba para un analito a través de inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartícula quimioluminiscente, e instrucciones para analizar la muestra de prueba para un analito a través de inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartícula quimioluminiscente. Por ejemplo, el equipo puede comprender por lo menos un patrón de unión específico para un analito, tal como un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que puede unirse al analito, una variante del mismo que puede unirse al analito, o un fragmento de una variante que puede unirse al analito) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo), cualquier de los cuales puede ser detectablemente marcado. De manera alternativa o además, el equipo puede comprender un analito detectablemente marcado (o un fragmento del mismo que puede unirse a un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo)), que puede competir con cualquier analito en una muestra de prueba para unirse a un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que puede unirse al analito, una variante del mismo que puede unirse al analito, o un fragmento de una variante que puede unirse al analito) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo), cualquier de los cuales puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido. El equipo puede comprende un calibrador o control, por ejemplo, analito aislado o purificado. El equipo puede comprender por lo menos un contenedor (por ejemplo, tubo, placas de microtitulación o tiras, que p-ueden ya ser recubiertas con un primer patrón de unión especifico, por ejemplo) para conducir el ensayo, y/o regulador de pH, tal como un regulador de pH de ensayo o un regulador de pH de lavado, cualquier de los cuales puede ser provisto como una solución concentrada, una solución de substrato para la marca detectable (por ejemplo, una marca o etiqueta enzimática), o una solución de tope. De preferencia, el equipo comprende todos los componentes, es decir, reactivos, estándares, reguladores de pH, diluyentes, etc., los cuales son necesarios para realizar el ensayo. Las instrucciones pueden estar en forma de papel o en forma legible por computadora, tal como un disco, CD, DVD, o similares.
Cualquier anticuerpo, tal como una anticuerpo anti-analito o DVD-lg anti-analito, o rastreador, puede incorporar una marca o etiqueta detectable como se describe aquí, tal como un fluoróforo, una porción radioactiva, una enzima, una marca de biotina/avidina, un cromóforo, una marca quimioluminiscente, o similares, o el equipo puede incluir reactivos para realizar la marcación detectable. Los anticuerpos, calibradores y/o controles pueden ser provistos en contenedores por separado o pre-surtidos en un formato de ensayo apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
Opcionalmente, el equipo incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibrados y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en hojas anexas para una variedad de productos de inmunodiagnóstico. Opcionalmente, se utilizan miembros de panel de sensibilidad para establecer características de funcionamiento del ensayo, y además opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos de equipo de inmunoensayo, y la estandarización de los ensayos.
El equipo también opcionalmente puede incluir otros reactivos para conducir un ensayo de diagnóstico o facilitar evaluaciones de control de calidad, tales como reguladores de pH, sales, enzimas, co-factores enzimáticos, substratos enzimáticos, reactivos de detección, y similares. En el equipo también se incluyen otros componentes, tales como reguladores de pH y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pre-tratamiento). El equipo además puede incluir uno más de otros controles. Uno o más de los componentes del esquipo pueden ser liofilizados, en ese caso el equipo además puede comprender reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los varios componentes del equipo opcionalmente se proporcionan en contenedores adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El equipo además puede incluir contenedores para mantener o almacenar una muestra (por ejemplo, un contenedor o cartucho para una muestra de orina). Cuando es apropiado, el equipo opcionalmente también puede contener vasos de reacción, vasos de mezclado, y otros componentes que facilitan la preparación de reactivos o la muestra de prueba. El equipo también puede incluir uno o más instrumentos para asistir a la obtención de una muestra de prueba, tal como una jeringa, pipeta, fórceps, cuchara medidora, o similares.
Si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el equipo puede comprender por lo menos una acridinio-9-carboxamida, por lo menos un acridinio-9-carboxilato aril éster, o cualquier combinación de los mismos, si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el equipo también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un regulador de pH, una solución, y/o al menos una solución básica. Si se desea, el equipo puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, perla, tubo de ensayo, placa dé microtitulación , cubeta, membrana, molécula de andamio, película, papel filtro, disco o chip.
III. Adaptación del Equipo y Método El equipo (o componentes del mismo), así como el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba por un ensayo, tal como un inmunoensayo como se describe aquí, puede ser adaptado para usarse en una variedad de sistemas automáticos o semi-automáticos (incluyendo aquellos en donde la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como se vende comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL), como ARCHITEC®.
Algunas de las diferencias entre el sistema automático o semi-automático, según comparado con un sistema no automático (por ejemplo, ELISA), incluyen el substrato al cual el primer patrón de unión especifico (por ejemplo, un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal) (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) se une; de cualquier forma la formación de emparedado y reactividad del analito pueden ser impactadas), y la longitud y cronometraje de la captura, detección y/o cualquiera de los pasos de lavado opcionales. Aunque un formato no automático, tal como ELISA, puede re uerir un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y el reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automático o semi-automático (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto )por ejemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITEC®). Similarmente, aunque un formato no automático, tal como ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo de conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automático o semi-automático (por ejemplo, ARCHITEC®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para ARCHITEC®).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A No. 5,294,404, la cual se incorpora aquí para referencia en su totalidad), PRISM®, EIA (perla), y Quantum™ II, así como otras plataformas. Además, los ensayos, equipos y componentes de equipo pueden ser empleados en otros formatos, por ejemplo, en electroquímicos u otros sistemas de ensayo independientes o de punto de cuidado. La presente descripción, por ejemplo, es aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímica Abbott Point of Care comercial (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos de tipo emparedado. Los inmunosensores y sus métodos de fabricación y operación en dispositivos de prueba de uso individual se describen en, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,063,081, Sol. Pat. Pub. No. 2003/0170881, Sol. Pat. E.U.A. Pub. No. 2004/0018577, Sol. Pat. E.U.A. P ub. No. 2005/0054078, y Sol. Pat. E.U.A. Pub. No. 2006/0160164, las cuales se incorporan aquí para referencia en sus totalidades para sus enseñanzas con respecto a esto.
En particular, con respecto a la adaptación de un ensayo de analito para el sistema l-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Un chip de silicio micro-fabricado se fabrica con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. En una de los electrodos de trabajo, perlas de poliestireno (diámetro 0.2 mm) con anticuerpo anti- analito inmovilizado, monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo), se adhieren a un recubrimiento de polímero de alcohol polivinílico sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho l-STAT® con un formato de fluido adecuado para inmunoensayo. Una opción de la pared de la cámara de soporte de muestra del cartucho es una capa que comprende un patrón de unión específico para un analito, tal como anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo que pued.e unir el analito) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo que puede unir el analito), cualquier de los cuales puede ser detectablemente marcado. Dentro de la- bolsa de fluido del cartucho está un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
En operación, una muestra con sospecha de contener un analito, es agregada a la cámara de soporte del cartucho de prueba, el cartucho es insertado en el lector l-STAT®. Después de que el patrón de unión específico para un analito se ha disuelto en la muestra, un elemento de bomba dentro del cartucho fuerza a la muestra hacia un conducto conteniendo el chip. Aquí, se hace oscilar para promover la formación del emparedado. En el penúltimo paso del ensayo, el fluido es forzado fuera de la bolsa y hacia el conducto para sacar por lavado la muestra del chip y hacia una cámara de desperdicio. En el paso final del ensayo, la marca o etiqueta de fosfatasas alcalina reacciona con fosfato de p-aminofenol para desdoblar el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado sea electroquímicamente oxidado en el electrodo de trabajo. Basándose en la corriente medida, el lector es capaz de calcular la cantidad de analito en la muestra a través de un algoritmo embebido y curva de calibración determinada por fábrica.
Si no puede terminar sin antes decir, que los métodos y equipos descritos aqui necesariamente abarcan otros reactivos y métodos para realizar el inmunoensayo. Por ejemplo, se abarcan varios reguladores de pH, tales como los conocidos en la técnica y/o los cuales pueden ser fácilmente preparados u optimizados para ser empleados, por ejemplo, para lavado, como un diluyente conjugado, diluyente de micropartícula, y/o como un diluyente de calibrador. Un diluyente de conjugado ilustrativo es el diluyente de conjugado ARCHITEC® empleado en ciertos equipos (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y conteniendo ácido 2-(N-morfolino)-etansulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteína, un agente antimicrobiano, y un detergente. Un diluyente de calibrador ilustrativo es un diluyente de calibrador humano ARCHITEC® empleado en ciertos equipos (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), el cual comprende un regulador de pH conteniendo MES, otra sal, una bloqueador de proteína, y un agente antimicrobiano. Además, como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 61/142,048 presentada el 31 de Diciembre del 2008, se puede obtener la generación de una señal mejorada, por ejemplo, en un formato de cartucho l-Stat, utilizando una secuencia de ácido nucleico enlazada al anticuerpo de señal como un amplificador de señal.
EJEMPLIFICACION Ejemplo 1:Diseño, Construcción y Análisis de una DVD-lg Ejemplo 1.1: Ensayos Utilizados para Identificar y Caracterizar Anticuerpos Parentales y DVD-lg Se utilizaron los siguientes ensayos a través de los Ejemplo, para identificar y caracterizar anticuerpos parentales y DVD-lg, a menos que se establezca otra cosa.
Ejemplo 1.1.1: Ensayos Utilizados para Determinar la Unión y Afinidad de Anticuerpos Parentales y DVD-lg para su Antígeno(s) Objetivo Ejemplo 1.1.1A: ELISA de Unión Directa Los Ensayos por Inmunoabsorción Ligados a Enzimas para clasificar anticuerpos que unen un antígeno objetivo deseado se realizaron como sigue. Placas de ELISA de unión s uperior (Corning Costar #3369, Acton, MA) se recubrieron con 100 µ?/cavidad de 10 µg/ml de antígeno objetivo deseado (R&D Systems, Minneapolis, MN) o dominio extracelular de antígeno objetivo deseado/proteína de fusión FC (R&D Systems, Minneapolis, MN) o anticuerpo anti-polihistidina de ratón monoclonal (R&D Systems #MAB050, Minneapolis, MN) en salina regulada en su pH con fosfato (10X PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep MPS-073, Worcester, MA) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20. Las placas se bloquearon a través de la adición de 300 pL/cavidad de solución de bloqueo (polvo de leche sin grasa, varios proveedores al menudeo, diluido a 2% en PBS) durante ½ hora temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces después e bloquear con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Alternativamente, cien microlitros por cavidad de 10 pg/ml de antígeno objetivo deseado marcado con Histidina (His) (R&D Systems, Minneapolis, MN) se agregaron a placas de ELISA cubiertas con anticuerpo anti-poli-Histidina de ratón monoclonal como se describió anteriormente y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron cuatro veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Cien microlitros de preparaciones de anticuerpo o DVD-lg diluidas en una solución bloqueadora como se describió anteriormente se agregaron a la placa de antígeno objetivo deseado o antígeno objetivo deseado/placa de fusión FC o la placa de anticuerpo anti-poli-Histidina/antígeno objetivo deseado marcado con His preparada como se describió anteriormente y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron cuatro veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Cien microlitros de 10 ng/ml de anticuerpo conjugado con HRP específico de IgG-FC anti-humano de cabra (Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL) se agregaron a cada cavidad de la placa de antígeno objetivo deseado o placa de anticuerpo anti-poli-Histidina/antígeno objetivo deseado marcado con Histidina.
Alternativamente, cien microlitros de 10 ng/ml de anticuerpo conjugado con HRP específico de cadena ligera IgG-kappa antihumano de cabra (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL) se agregaron a cada cavidad de la placa de antígeno objetivo deseado/fusión FC y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Cien microlitros de una solución TMB mejorada (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) se agregaron a cada cavidad y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo a través de la adición de 50 µ? de 1N ácido sulfúrico. Las placas se leyeron espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm.
El Cuadro 3 contiene una lista de los antígenos utilizados en el Ensayo de Unión Directa.
El Cuadro 4 contiene los datos de unión expresados como EC50 para aquellos anticuerpos y construcciones de DVD-lg probados en el ensayo de ELISA de Unión Directa.
En ELISA de Unión Directa, la unión algunas veces no fue observada, ya que el sitio de unión a anticuerpo en el antígeno objetivo tanto se "etiquetó" o el antigeno se "distorsionó" cuando se colocó como cubierta en la superficie de plástico. La incapacidad de una DVD-lg para unir su objetivo también se debe a una limitación estérica impuesta en el DVD-lg a través del formato de ELISA de Unión Directa. Los anticuerpos parentales y las DVD-lgs que no se unieron en el formato de de ELISA de Unión Directa se unieron al antígeno objetivo en otros formatos de ELISA, tales como FACS, Biacore o bioensayo. La no unión de una DVD-lg también se restauró ajustarte la longitud del enlazador entre dos dominios variables de la DVD-lg, como se mostró previamente.
Cuadro 3: Antíqenos Utilizados en ELISA de Unión Directa ECD = Dominio Extracelular Quimera /FC = proteína de fusión de dominio de antígeno/lgG FC Cuadro 4: ELISA de Unión Directa de Anticuerpos Parentales y Construcciones de DVD-lq La unión de todas las construcciones de DVD-lg se mantuvo y fue comparable con aquella de anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales con una alta afinidad similar como el anticuerpo parental así como los dominios variables C-terminales de construcciones de DVD009, DVD016, DVD018, DVD022, DVD024, DVD035, DVD37, DVD043, DVD044, DVD49, DVD257, DVD258 y DVD259.
Los Cuadros 5 y 6 contienen datos de ELISA de Unión Directa de VEGF para tres anticuerpos parentales de VEGF y 96 construcciones de DVD-lg con dominios variables ya sea C-terminal (C-term.) o N-terminal (N-term.) derivados de los dominios variables de los Anticuerpos de Referencia de VEGF parentales, (Ref. Ab.) AB014 - VEGF (sec. 1), AB071 - VEGF (sec. 2) y AB070 - VEGF (sec. 3). Estos dominios variables están en pares con cuatro dominios variables de DLL-4 dericados de cuatro DLL-4 Ref. Ab. (AB015 -DLL-4 (sed), AB069- DLL-4 (sec.2), AB073- DLL-4 (sec.3), y AB072 - DLL-4 (sec.4). los dominios variables de DVD-lg están conectados a través de 2 longitudes de enlazador (Corto y Largo ya sea en la cadena pesada (enlazador HC) y/o cadena ligera (enlazador LC), dando como resultado cuatro posibles combinaciones de enlazador: Corot-Corto; Largo-Largo, Corot-Largo, y Largo-Corto. La combinación de estos 5 factores (3 secuencias de VEGF x 2 orientaciones x 2 Enlazadores HC x2 Enlazadores LC x 4 secuencias DLL-4) da como resultado un completo experimento factorial de 96 DVDs.
Cuadro 5: ELISA de Unión Directa de 96 Construcciones de DVD con Varias Secuencias de VEGF. Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador con VEGF La unión de todas las construcciones de DVD-lg a VEGF se ntuvo y fue comparable con aquella de los anticuerpos parentales.
Todos los dominios N-terminales se unieron con alta afinidad similar como el anticuerpo parental. Algunas combinaciones específicas de la longitud de enlazador en la cadena pesada y cadena ligera mejoraron la afinidad de unión a los dominios C-terminales comparable con el anticuerpo parental. Específicamente, existe una mejora estadísticamente importante (p = 0.019) en la afinidad del dominio C-terminal con un enlazador largo en lugar de un enlazador corto en la cadena ligera.
Cuadro 6: ELISA de Unión Directa de 96 Construcciones de DVD-Ig con Varias Secuencias de DLL4, Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador con DLL La unión de todas las construcciones de DVD-lg a DLL4 se mantuvo y fue comparable con aquella de los anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales se unieron con alta afinidad similar como el anticuerpo parental. Algunas combinaciones específicas de la longitud de enlazador. en la cadena pesada y la cadena ligera mejoraron la afinidad de unión de los dominios C-terminales comparado con el anticuerpo parental. Específicamente se vio una tendencia a la mejora en la afinidad del dominio C-terminal con un enlazador largo en la cadena ligera y/o cadena pesada en lugar de un enlazador corto tanto en la cadena ligera como en la pesada.
Cuadro 7: ELISA de Unión Directa de RON y EGFR de 8 Construcciones de DVD con Varias Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador Ref. ID Ref.
ID EC50 EC50 ID Ab. Ab.EC EnlaEnlaSecuenID Ab. Ab.EC ID de Secuencia (nM) (nM) Ref. N- 50 N- zador zado cia VD Ref. C- 50 C- DVD-lg VD N- VD N- VD C- Term. Term. HC LC I C- Term. Term. Term. Term. m. (nM) Term. Ter (nM) DVD023 EGFR 0.23 AB033 0.66 Corto Corto RON 40.18 AB005 0.26 DVD024 RON 0.54 AB005 0.26 Corto Corto EGFR 1.87 AB033 0.66 DVD535 RON 0.43 AB005 0.69 Largo Largo EGFR 1.7 AB033 1.17 DVD536 EGFR 1 AB033 1.17 Largo Largo RON 10.57 AB005 0.69 DVD537 RON 0.32 AB005 ' 0.69 Largo Corto EGFR 0.94 AB033 1.17 DVD538 EGFR 1.17 AB033 1.17 Largo Corto RON 31.11 AB005 0.69 DVD539 RON 0.4 AB005 0.69 Corto Largo EGFR ' 1.38 AB033 1.17 DVD540 EGFR 1.1 AB033 1.17 Corto Largo RON 12.99 AB005 0.69 Cuadro 8: ELISA de Unión Directa de EGFR, HER2 (ErbB2) y ErbB3 de 44 Construcciones de DVD con Varias Secuencias, Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador ID Ref.
Ref.
SecuenID EC50 ID Ab. EnlaEnlaEC50 ID Ab. Ab.EC ID de Ab.EC50 Secuencia VD (nM) VD Ref. N- zador zador (nM) VD Ref. C- 50 C- DVD-lg N-Term. cia VD N- N-Term. Term. HC LC (nM) C-Term. C-Term. Term. Term. Term. (nM) DVD385 ErbB3 1.72 AB062 0.75 Largo Largo EGFR 2.79 AB033 0.46 DVD386 EGFR 0.56 AB033 0.46 Largo Largo ErbB3 4.01 AB062 0.75 DVD387 ErbB3 1.18 AB062 0.75 Largo Largo HER-2 4.23 AB004 2.37 DVD388 HER-2 1.65 AB004 2.37 Largo Largo ErbB3 3.40 AB062 0.75 DVD389 ErbB3 1.25 AB062 0.75 Largo Corto EGFR 2.3 AB033 0.46 DVD390 EGFR 0.36 AB033 0.45 Largo Corto ErbB3 11.21 AB062 0.75 DVD391 ErbB3 4.06 AB062 0.97 Largo Corto HER-2 25.26 AB004 2.37 DVD392 HER-2 1.85 AB004 2.37 Largo Corto ErbB3 16.26 AB062 0.97 DVD393 ErbB3 1.39 AB062 0.97 Corto Largo EGFR 1.75 AB033 0.46 DVD394 EGFR 0.56 AB033 0.46 Corto Largo ErbB3 21.75 AB062 0.97 DVD395 ErbB3 1.58 AB062 0.97 Corto Largo HER-2 5.98 AB004 2.37 DVD396 HER-2 2.87 AB004 2.37 Corto Largo ErbB3 24.75 AB062 0.97 DVD397 ErbB3 1.05 AB063 0.87 Largo Largo EGFR 1.41 AB033 0.49 DVD398 EGFR 0.43 AB033 0.49 Largo Largo ErbB3 1.39 AB063 0.87 DVD399 ErbB3 599.0 AB063 0.87 Largo Largo HER-2 1102.54 AB004 2.67 DVD400 HER-2 3.57 AB004 2.67 Largo Largo ErbB3 7.74 AB063 0.87 DVD401 ErbB3 0.79 AB063 0.87 Largo Corto EGFR 1.65 AB033 0.49 DVD402 EGFR 0.65 AB033 0.49 Largo Corto ErbB3 0.13 AB063 0.87 DVD403 ErbB3 1.03 AB063 0.92 Largo Corto HER-2 13.82 AB004 2.67 DVD404 HER-2 1.25 AB004 2.67 Largo Corto ErbB3 4.34 AB063 0.92 DVD405 ErbB3 1.08 AB063 0.92 Corto Largo EGFR 1.68 AB033 0.49 DVD406 EGFR 0.60 AB033 0.49 Corto Largo ErbB3 1.11 AB063 0.92 DVD407 ErbB3 2.98 . AB063 0.92 Corto Largo HER-2 28.51 AB004 2.67 DVD408 HER-2 2.61 AB004 2.67 Corto Largo ErbB3 4.37 AB063 0.92 DVD409 ErbB3 3.60 AB067 1.78 Corto Corto EGFR 1.75 AB033 0.48 DVD410 EGFR 0.36 AB033 0.59 Corto Corto ErbB3 55.38 AB067 2.20 DVD411 ErbB3 4.92 AB067 1.78 Corto Corto HER-2 15.4 AB004 1.19 DVD412 HER-2 424 AB004 1.52 Corto Corto ErbB3 205.98 AB067 2.20 DVD413 ErbB3 4.77 AB067 1.12 Largo Largo EGFR 1.1 AB033 0.48 DVD 14 EGFR 0.49 AB033 0.59 Largo Largo ErbB3 21.27 AB067 2.20 DVD415 ErbB3 12.96 AB067 2.20 Largo Largo HER-2 1.56 AB004 1.19 DVD416 HER-2 3.58 AB004 1.52 Largo Largo ErbB3 64.36 AB067 2.20 DVD417 ErbB3 6.56 AB067 1.12 Largo Corto EGFR 1.62 AB033 0.48 DVD418 EGFR 0.46 AB033 0.59 Largo Corto ErbB3 18.20 AB067 2.20 DVD419 ErbB3 32.37 AB067 2.20 Largo Corto HER-2 4.78 AB004 1:19 DVD420 HER-2 3.58 AB004 1.52 Largo Corto ErbB3 143.66 AB067 1.78 DVD421 ErbB3 5.10 AB067 1.12 Corto Largo EGFR 1.1 AB033 0.45 DVD422 EGFR 0.48 AB033 0.59 Corto Largo ErbB3 17.97 AB067 1.78 DVD423 ErbB3 4.69 AB067 1.12 Corto Largo HER-2 1.29 AB004 1.19 DVD424 HER-2 4.47 AB004 1.52 Corto Largo ErbB3 40.69 AB067 1.78 DVD683 ErbB3 0.58 AB062 1.60 Corto Corto HER-2 35.64 AB004 2.22 DVD684 HER-2 0.93 AB004 2.22 Corto Corto ErbB3 215.63 AB062 1.60 DVD685 ErbB3 0.48 AB063 1.10 Corto Corto HER-2 29.02 AB004 2.22 DVD686 HER-2 1.25 AB004 2.22 Corto Corto ErbB3 97.39 AB063 1.10 Cuadro 9: ELISA de Unión Directa de PLGF, HER-2 y VEGF de 62 Construcciones DVD con Varias Secuencias, Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador Ref.
ID Ref.
EC50 IDAb. EnlaEnlaID SecuenEC50 IDAb. Ab.EC ID de SecuenAD.EC50 (nM) VD Ref. N- zador zador cia VD C- (nM) VD Ref. C- 50 C- DVD-lg cia VD N-Term.
N-Term. Term. HC LC Term. C-Term. Term. Term. N-Term. (nM) (nM) DVD541 PIGF 0.08 AB074 0.49 Corto Corto VEGF 64.44 AB014 1.40 DVD542 VEGF 0.80 AB014 1.40 Corto Corto PIGF 13.04 AB074 0.49 DVD543 PIGF 0.14 AB074 0.49 Corto Corto VEGF 1120.78 AB070 2.35 DVD544 VEGF 2.35 AB070 2.35 Corto Corto PIGF 13.76 AB074 0.49 DVD545 PIGF 98.78 AB074 0.49 Corto Corto VEGF >1000 AB071 35.38 DVD546 VEGF 25.8 AB071 35.38 Corto Corto PIGF 7.03 AB074 0.49 DVD547 PIGF 0.14 AB074 0.49 Corto Corto HER-2 167.82 AB004 1.3 DVD548 HER-2 1.26 AB004 1.3 Corto Corto PIGF 7.42 AB074 0.49 DVD549 PIGF 265.03 AB074 0.49 Largo Largo VEGF >1000 AB014 1.40 DVD550 VEGF > 000 AB014 1.40 Largo Largo PIGF 145.70 AB074 0.49 DVD551 PIGF 96.98 AB074 0.49 Largo Largo VEGF 1589.29 AB070 2.35 DVD552 VEGF 313.54 AB070 2.35 Largo Largo PIGF 8.54 AB074 0.49 DVD553 PIGF 66317.52 AB074 0.49 Largo Largo VEGF >1000 AB071 35.38 DVD554 VEGF 15.22 AB071 35.38 Largo Largo PIGF 0.45 AB074 0.49 DVD555 PIGF N/B AB074 0.49 Largo Largo HER-2 963.06 AB004 1.3 DVD556 HER-2 1.03 AB004 1.3 Largo Largo PIGF 0.24 AB074 0.49 DVD557 PIGF 0.17 AB074 0.49 Largo Corto VEGF 24.98 AB014 1.40 DVD558 VEGF 1.96 AB014 1.40 Largo Corto PIGF 3.37 AB074 0.49 DVD559 PIGF 0.13 AB074 049 Largo Corto VEGF 39.2 AB070 2.35 DVD560 VEGF 3.12 AB070 2.35 Largo Corto PIGF 2.53 AB074 0.49 DVD561 PIGF 1.04 AB074 0.49 Largo Corto VEGF 241.04 AB071 35.38 DVD562 VEGF 17.69 AB071 35.38 Largo Corto PIGF 1.12 AB074 0.49 DVD563 PIGF 0.21 AB074 0.49 Largo Corto HER-2 16.8 AB004 1.3 DVD564 HER-2 0.57 AB004 1.3 Largo Corto PIGF 1.37 AB074 0.49 DVD565 PIGF 3.24 AB074 0.49 Corto Largo VEGF 498.31 AB014 1.40 DVD566 VEGF 1.49 AB014 1.40 Corto Largo PIGF 1.42 AB074 0.49 DVD567 PIGF 340.25 AB074 0.49 Corto Largo VEGF >1000 AB070 1.68 DVD568 VEGF 3.14 AB070 1.68 Corto Largo PIGF 2.84 AB074 0.49 DVD569 PIGF 88.47 AB074 0.49 Corto Largo VEGF >1000 AB071 26.56 DVD570 VEGF 17.59 AB071 26.56 Corto Largo PIGF 1.44 AB074 0.49 DVD571 PIGF 33.1 AB074 0.49 Corto Largo HER-2 209.28 AB004 1.89 DVD572 HER-2 1.34 AB004 1.89 Corto Largo PIGF 2.34 AB074 0.49 DVD573 PIGF 0.14 AB047 0.14 Corto Corto VEGF >1000 AB070 1.68 DVD574 VEGF 1 1.72 AB070 1.68 Corto Corto PIGF 7.04 AB047 0.14 DVD575 PIGF 0.14 AB047 0.14 Corto Corto VEGF >1000 AB071 26.56 DVD576 VEGF 16.22 AB071 26.56 Corto Corto PIGF 1.82 AB047 0.14 DVD577 PIGF 0.15 AB047 0.14 Corto Corto HER-2 335.83 AB004 1.89 DVD578 HER-2 1.28 AB004 1.89 Corto Corto PIGF 1.21 AB047 0.14 DVD579 PIGF 1.18 AB047 0.17 Largo Largo VEGF 47.94 AB014 1.40 DVD580 VEGF >1000 AB014 1.40 Largo Largo PIGF 34.14 AB047 0.17 DVD581 PIGF 0.39 AB047 0.17 Largo Largo VEGF 35.9 AB070 1.68 DVD582 VEGF 4.36 AB070 1.68 Largo Largo PIGF 0.37 AB047 0.17 DVD583 PIGF 0.32 AB047 0.17 Largo Largo VEGF 559.56 AB071 26.56 DVD584 VEGF 18.36 AB071 26.56 Largo Largo PIGF 0.32 AB047 0.17 DVD585 PIGF 0.26 AB047 0.13 Largo Largo HER-2 5.44 AB004 1.89 DVD586 HER-2 1.04 AB004 1.89 Largo Largo PIGF 0.18 AB047 0.13 DVD587 PIGF 0.13 AB047 0.13 Largo Corto VEGF 12.71 AB014 1.40 DVD588 VEGF 4.1 AB014 1.40 Largo Corto PIGF 1.84 AB047 0.13 DVD589 PIGF 0.12 AB047 0.13 Largo Corto VEGF 1356.24 AB070 1.9 DVD590 VEGF 21.09 AB070 1.9 Largo Corto PIGF 2.78 AB047 0.13 DVD591 PIGF 0.13 AB047 0.14 Largo Corto VEGF 1 166.31 AB071 20.92 DVD592 VEGF 19.21 AB071 20.92 Largo Corto PIGF 0.31 AB047 0.14 DVD593 PIGF 0.09 AB047 0.14 Largo Corto HER-2 17.53 AB004 1 .78 DVD594 HER-2 1.03 AB004 1 .78 Largo Corto PIGF 0.38 AB047 0.14 DVD595 PIGF 0.21 AB047 0.14 Corto Largo VEGF 4.63 AB014 1.40 DVD596 VEGF 12.73 AB014 1.40 Corto Largo PIGF 14.59 AB047 0.14 DVD597 PIGF 0.17 AB047 0.13 Corto Largo VEGF 31.08 AB070 1.9 DVD598 VEGF 6.66 AB070 1.9 Corto Largo PIGF 0.66 AB047 0.13 DVD599 PIGF 0.23 AB047 0.13 Corto Largo VEGF 664.22 AB071 20.92 DVD600 VEGF 17.04 AB071 20.92 Corto Largo PIGF 0.4 AB047 0.13 DVD601 PIGF 0.24 AB047 0.13 Corto Largo HER-2 10.03 AB004 1 .78 DVD602 HER-2 1.12 AB004 1.78 Corto Largo PIGF 0.31 AB047 0.13 Cuadro 10: ELISA de Unión Directa de HGF y VEGF de 46 Construcciones DVD con Varias Secuencias, Orientaciones y Combinaciones de Enlazador DVD676 VEGF 130.31 AB071 80.43 Largo Corto HGF 35.83 AB079 0.4 DVD677 HGF 0.33 AB079 0.41 Corto Largo VEGF 1.02 AB0 4 1.40 DVD678 VEGF 0.65 AB014 1.40 Corto Largo HGF 4.69 AB079 0.41 DVD679 HGF 0.32 AB079 0.41 Corto Largo VEGF 92.36 AB070 5.62 DVD680 VEGF 12.62 AB070 5.62 Corto Largo HGF 5.17 AB079 0.41 DVD681 HGF 0.27 AB079 0.41 Corto Largo VEGF 2161.65 AB071 79.48 DVD682 VEGF 53.09 AB071 79.48 Corto Largo HGF 6.55 AB079 0.41 DVD709 HGF 0.14 AB012 0.16 Corto Corto VEGF 1366.2 AB070 5.62 DVD710 VEGF 2.43 AB070 5.62 Corto Corto HGF 17.76 AB012 0.16 DVD711 HGF 1.32 AB012 0.16 Corto Corto VEGF 165.93 AB071 79.48 DVD 12 VEGF 64.2 AB071 79.48 Corto Corto HGF 37.18 AB012 0.16 Se utilizaron dos diferentes epitopos con objetivo en mAbs (dominio II y dominio IV) para hacer D.VD-lgs con diferente orientación de dominio mAb y longitudes de enlazador. Estas DVD-Igs se probaron para funciones de unión objetivo en un ensayo de ELISA directo y Biacore.
Cuadro 11. ELISA de Unión Directa de 8 Construcciones DVD con Secuencias HER-2, Orientaciones y Combinaciones de Longitud de Enlazador con HER-2 unión de todas las construcciones DVD-lg a HER-2 mantuvo y fue comparable con aquella de los anticuerpos parentales. Todo el dominio IV HER-2 en los dominios variables N-terminales se unieron con una afinidad alta o similar como el anticuerpo parental. Algunas combinaciones de longitud de enlazador en la cadena pesada y la cadena ligera mejoraron la afinidad de unión mejor que los anticuerpos parentales.
Ejemplo 1.1.1.B: Ensayos de Citotoxicidad Rediri ida (rCTL) Los ensayos de Citotoxicidad redirigida (rCTL) determinan la habilidad de una DVD-lg para unir células T y células tumorales en estrecha cercanía de manera que las células T pueden aniquilar células tumorales.
Ensayo (1) a base de FACS: se aislaron células CD3+ T de PBMC aislado previamente congelado a través de una columna de enriquecimiento de selección negativa (R&D Cat. #HTCC-525). Las células T se estimularon durante 4 días en matraces cubiertos con 100 Mg/ml DE anti-CD3 (OKT-3, BD) y 2 µglm\ de anti-CD28 (CD28.2, Abcam) en un medio completo de RPMI (L-glutamina, 55 mM ß-??, Pen/Strep, FCS al 10%). Las células T se dejaron reposar durante la noche en 30 U/ml de IL-2 (Peprotech) antes de usarse en el ensayo. Las células objetivo DoHH2 o Raji se marcaron con PKH26 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A través de todo el ensayo rCTL se utilizó el medio RPMI 1640 (sin fenol, Invitrogen) conteniendo L-glutamina y FBS al 10% (Hyclone).
Se colocaron en placas células T efectoras (E) y objetivos a 105 y 104 células/cavidad en placas de 96 cavidades (Costar #3799), respectivamente, para dar una relación de E:T de 10:1. Las moléculas de DVD-lg se diluyeron apropiadamente para obtener curvas de titulación dependientes de concentración. Después de incubación durante la noche, las células se formaron a pellas y se lavaron con PBS una vez antes de volver a suspender en PBS conteniendo BSA al 0.1% (Invitrogen) y 0.5 pg/ml de yoduro de propidio (BD). Los datos de FACS se recolectaron en una máquina FACSCanto (BD) y se analizaron en Flowjo (Treestar).
Para determinar el porcentaje de lisis específica se calculó el porcentaje de objetivos vivos en las muestras tratadas con DVD-lg dividido entre el porcentaje de objetivos totales (control, sin tratamiento). Los datos se graficaron y se calcularon las IC50 en Prism (Graphpad).
Impedancia base (2): se prepararon células T como se hizo anteriormente. Las células objetivo que expresan EGFR se dejaron adherir a placas de 96 cavidades ACEA RT-CES (ACEA Bio, San Diego) durante la noche. Después se colocaron célula T efectoras (E) y objetivo (T) a 2x105 y 2x104 células/cavidad para dar una relación de E:T de 10:1. Las moléculas de DVD-lg aproximadamente se diluyeron para obtener curvas de titulación dependientes de concentración. Los índices de célula de los objetivos en las muestras tratadas con DVD-lg se dividieron entre los índices de células de objetivos de control (sin tratamiento) para calcular el porcentaje de lisis específica. Los datos se graficaron y se calcularon las IC50 en Prism (Graphpad). (Dreier, T. (2002) Int J Cáncer 100:690-697; Zhu, J. (2006) J. Immuno. Methods 309:25-33). La secuencia de CD3/CD20 DVD-lg se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. Serie No. 20070071675.
Cuadro 12: Citotoxicidad Celular Redirigida (rCTL) con DVD- La eficacia de DVD-lg ID 857 se demostró en el modelo de tumor de flanco de inicio temprano de linfoma de célula DoHH-2 B. se inyectaron ratones scid en el flanco con células tumorales DoHH2 solas o células tumorales DoHH2 más células DC3+ T de sangre periférica en una relación de 10:1. Se dosificaron 80 ug de rituxan i.v. en el día 1 en ausencia de células T. Se dosificaron 80 ug de DVD-lg 857 i.v. diariamente en los días 1-5 a los ratones dando solamente células DoHH2 o células DoHH2 + células T. En el día 32, los grupos DoHH2 que recibieron células T o DVD-lg 857 solo tuvieron un impacto importante en el crecimiento de DoHH2 con un % TGI de 63 y 55, respectivamente. DoHH2 tratado con rituximab (% TGI = 94) demostró una importante eficacia (p<0.0001) cuando se comparó con el grupo de control de DoHH2. Las [células T + DVD-lg ID 857] demostraron una eficacia igual al grupo de rituximab con un % TGI de 95 y 98, respectivamente (p<0.0001) cuando se comparó con el grupo de control de DoHH2. En el día 52, el grupo de rituximab y [DVD-IG ID 857 + células T] no fue significativamente diferente entre sí. La gráfica de supervivencia de Kaplan-Meier (punto final 1cc), estadísticas de Longrank (Mantel-Cox) demostraron un incremento importante de supervivencia en los grupos tratados con rituximab y [DVD-lg ID 857 + células T] cuando se comparó con el grupo de control DoHH2 (p<0.0001). Los grupos de rituximab y [DVD-lg ID 857 + células T] no fueron significativamente diferentes uno del otro.
La DC3 y CD19 DVD-lg se generaron utilizando los dominios variables de Ab002 y AB006, respectivamente. Se determinaron las IC50s de las DVD-lgs con CD3 humana utilizando el análisis FACS de competencia OKT3-PE (eBioscience, Cat#12-0037) en células Jurkat. El OKT3-PE en EC90 y concentraciones variables de las DVD-lgs se mezclaron conjuntamente y se incubaron durante una hora sobre hielo con 0.5X10e6 células Jurkat en una placa de fondo redondo de 96 cavidades (Corning #3365). Las muestras se adquirieron utilizando FACS Calibur (Becton Dickinson), se analizaron utilizando Fio Jo (Becton Dickinson). Las IC50s de las DVD-lgs para CD19 se determinaron utilizando AB006 etiquetado son sulfo en células 293 establemente transfectadas con CD19 humana utilizando el descubrimiento de escala meso. Las AB006 etiquetadas con sulfo a su EC90 se mezcló con varias concentraciones de DVD-lgs y se agregó a 25,000 células por cavidad de células 293 hCD19 en placas altamente ciegas de 96 cavidades (Meso Scale Disco.very #L11XB-3). Las muestras se leyeron en un aparato Sector Image 6000 (Meso Scale Discovery).
Cuadro 13: Competencia de DVD-lq con Abs de Referencia Marcados Ejemplo 1.1.1.C: ELISA de Captura - VEGF Se incubaron placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) durante la noche a 4°C con anticuerpo Fe anti-humano (5 pg/ml en PBS, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Las placas se lavaron tres veces en regulador de pH de lavado (PBS conteniendo 0.05% Tween 20), y se bloquearon durante 1 hora a 25°C en regulador de pH de bloqueo (PBS conteniendo 1% BSA). Las cavidades de lavaron tres veces, y se agregaron diluciones en serie de cada anticuerpo o DVD-lg en PBS conteniendo 0.1% BSA a las cavidades y se incubaron a 25°C durante 1 hora. Las cavidades se lavaron tres veces, y se agregó VEGF (2nM) biotinilado a las placas y se incubaron durante 1 hora a 25°C. Las cavidades se lavaron tres veces, y después se incubaron durante 1 hora a 25°C con estreptavidina-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD). Las cavidades se lavaron tres veces, y se agregaron, por cavidad, 100 µ? de ULTRA-T B ELISA (Pierce, Rockford, IL). Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo con 1N HCI y se midió la absorbancia a 450 nM. L os datos de ELISA de captura VEGF se muestran en el Cuadro 14.
Ejemplo 1.1.1.D: ELISA de Captura IgG-Fc - RON Se revistieron placas Nunc-lmmuno de 96 cavidades con 2 g/ml de anticuerpo específico IgG Fe de cabra-anti-humano (Jackson Immunoresearch # 109-055-098, West Grove, PA, 50 pL/cavidad) en PBS (Gibco #10010-023 de Invitrogen, Grand Island, NY), y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con regulador de pH de lavado (PBS, 0.05% Tween 20) y subsecuentemente se bloquearon con 100 µ?/cavidad de regulador de pH de bloqueo (PBS, 2% BSA) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con 50 µ?/cavidad de una solución de 1 g/ml del anticuerpo apropiado o DVD-lg durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación de una hora, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con 50 µ?/cavidad de la proteina RON recombinante, etiquetada con his (R&D Systems # 1947-MS, inneapolis, N, 1000nM a OnM escala de dosis final) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces, y se agregaron 50 µ?/cavidad de un anticuerpo de etiqueta HRP de conejo-anti-His (Abcam ab1187, Cambridge, MA, diluido a 1:10,000 en solución de 2% BSA/PBS) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después del lavado final, se agregaron 50 µ?/cavidad del substrato TMB (Pierce #34028, Rockford, IL), y la reacción se terminó después de cinco minutos utilizando 50 µ?/cavidad de 2N H2S04. La absorbancia se leyó a 450 nm (lector de placa Spectra Max Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se calcularon las EC50s en GraphPad Prism 4.03. los datos de ELISA de captura RON se muestran en el Cuadro 14.
Ejemplo 1.1.1.E: ELISA de Captura - IGF1,2 Se revistieron placas Nunc-lmmuno de 96 cavidades con 5 µg/ml de anticuerpo contra IgG humana (Fcy fragmento especifico, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, #109-005-098, 100 µ?/cavidad) en in D-PBS (Gibco #14190, San Diego, CA) y se incubaron durante la noche a 4°C: Las placas de ELISA se lavaron tres veces en regulador de pH de lavado (PBS, 0.05% Tween 20) y después se bloquearon con 200 µ?/cavidad de regulador de pH de bloqueo (D-PBS, 1% BSA) durante 1 hora a 25°C. Las placas después se lavaron y se incubaron con 100 µ?/cavidad de anticuerpos o DVD-lgs (0.0^g/ml -100 µ9/??? en regulador de pH de bloqueo) durante 1 hora a 37°C. Las placas después se lavaron tres veces y se incubaron con IGF1 ó IGF2 humano marcado con biotina (escala de dosis de 0.02 nM -100 nM en regulador de pH de bloqueo, 100 µ?/ cavidad) durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg , MD, dilución 1:10,000 en regulador de pH de bloqueo, 100 µ?/cavidad) durante 1 hora a 25°C. Después del lavado final, las placas se incubaron con 100 µ?/cavidad de substrato de ELISA (1-Step Ultra TMB-ELISA, Pierce #340280, Rockford, IL). La reacción se detuvo después de 5 minutos a 25°C con 100 µ?/cavidad de 2N H2S04 y se leyó la absorbancia a 450 nm. Los datos de ELISA de captura IGF1.2 se muestran en el Cuadro 14.
Ejemplo 1.1.1.F: ELISA de Captura - DLL4 Se revistieron placas Nunc-lmmuno (#439454, Rochester, NY) de 96 cavidades con 5 pg/ml de anticuerpo contra IgG humana (Fcy fragmento específico, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, #109-005-098, 100 µ?/cavidad) en ¡n D-PBS (Gibco #14190, Grand Island, NY) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas de ELISA se lavaron tres veces en regulador de pH de lavado (PBS, 0.05% Tween 20) y después se bloquearon con 200 µ?/cavidad de regulador de pH de bloqueo (D-PBS, 1% BSA, 1% BSA, 1 mM CaCI2, 0.05% Tween 20) durante 1 hora a 25°C. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con 100 µ?/cavidad de anticuerpo DLL4 (0.0001-100 nM, dilución en serie de 10 veces en regulador de pH de bloqueo) durante 1 hora a 25°C, y después se lavó otra vez tres veces. Las placas conteniendo DLL4 Ab capturado se incubaron con dominio extracelular DLL4 humana marcada con biotina (10 nM en regulador de pH de bloqueo, 100 µ?/cavidad) durante 1 hora a 25°C, se lavaron tres veces, y se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP (KPL #474-3000C, se lavaron tres veces, y se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD, dilución de 1:10,000 en regulador de pH de bloqueo, 100 µ?/cavidad) durante 1 hora a 25°C. Después del lavado final, las placas se incubaron con 100 µ?/cavidad de substrato de ELISA (1-Step Ultra TMB-ELISA, Pierce #340280, Rockford, IL). La reacción se detuvo después de 2 minutos a 25°C con 100 µ?/cavidad 2N H2S04 y la absorbancia se leyó a 450 nm. Los datos de ELISA de captura- DLL4 se muestran en el Cuadro 14.
Ejemplo 1.1.1.G: ELISA de Captura - ErbB3 o EGFR Placas de ELISA de 96 cavidades se revistieron con IgG Fe anti-humano de cabra (Jackson Immunoresearch, PA) a una concentración de 33 nM, y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron con PBS conteniendo 0.05% Tween 20, tres veces, y se bloquearon con 200 µ?/cavidad de 1% BSA/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se agregaron 50 pl de 5 nM de DVD-lg o anticuerpo a cada cavidad y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, y después se incubaron con 50 µ?/cavidad de ErbB3 biotinilada o EGFR biotinilado a varias concentraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron otra vez y después se incubaron con 50 µ?/cavidad de HRP conjugada con estreptavidina (KPL #474-3000, Protein Research Products, MD) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron tres veces, y se agregaron, por cavidad, 100 µ? de ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL). Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo con 1N HCI y se midió la absorbancia a 450 nM.
El Cuadro 14 contiene la afinidad, expresada como EC50 en nM, de anticuerpos parentales y construcciones DVD-lg en VEGF, RON, EGFR, IGFR, IGF-1,2, HER-2, DLL4, y ErbB3.
Cuadro 14: ELISA de Captura de Antígeno VEGF, RON, EGFR, ErbB3, IGFR, IGF-1,2, DLL4 y HER-2 de Anticuerpos Párenteles y Construcciones DVD-lg La unión de todas las construcciones DVD-lg a antígeno soluble se mantuvo y fue comparable con anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales se unieron con una alta afinidad similar como el anticuerpo parental así como los dominios variables C-terminales de DVD022, DVD038, DVD043, DVD048, DVD50 y DVD260.
Cuadro 15: ELISA de Captura de Antígeno DLL4 de 7 Construcciones DLL4/VEGF DVD-lg y el Anticuerpo Parental La unión de todas las construcciones DVD-lg al antígeno DLL4 mantuvo y fue comparable con anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales con alta afinidad similar como el anticuerpo parental así como los dominios variables C-terminales de DVD470, DVD476, DVD482, DVD474 y DVD486.
Cuadro 16: ELISA de Captura de Antígeno VEGF de 7 Construcciones DLL4/VEGF DVD-lg y Anticuerpo Parentales La unión de todas las construcciones DVD-lg al antígeno VEGF mantuvo y fue comparable con anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales con alta afinidad similar como el anticuerpo parental así como los dominios variables C-termínales de DVD470, DVD476, DVD482, DVD474 y DVD486.
Ejemplo 1.1.1.H: Inhibición de Fosforilación de ErbB3 y EGFR Independiente de Ligando In Vitro a través del Anticuerpo ErbB3 Parental, Anticuerpo EGFR y Construcciones DVD-lg Se desarrollaron células A431 en una placa de 96 cavidades con 40,000 células/cavidad y se incubaron a 37°C, C02 al 5% durante 18-24 horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 1X D-PBS y se privaron de alimento durante la noche en un medio libre de suero. Al día siguiente, las células se incubaron con 50 µ? del medio libre de suero conteniendo 60 µ? de anticuerpos monoclonales o DVD-lgs durante 4 horas a 37°C. Después de la incubación de anticuerpo, las células después se lavaron dos veces con D-PBS enfriado con hielo y se cosecharon en 110 µ? de Regulador de pH de Extracción de Célula (Biosource International, Carlsbad, CA) conteniendo 10 µ? de un coctel de inhibidor de fosfatasa HALT® (Thermo Scientific, Rockford, IL), una tableta inhibidora de proteasa libre de EDTA Complete® (1 tableta/10 mi, Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania), y PMSF. Los Usados de célula se incubaron en hielo durante 30 minutos con flujo turbulento intermitente, pre-aclarados a través de centrifugación (10 minutos, 14,000 RPM, 4°C), y se procesaron para análisis de ELISA. Se detecto Fósforo-ErbB3 utilizando un equipo de detección Human Phospho-ErbB3 (R&D Systems #DYC1769, Minneapolis, MN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La detección de fósforo-EGFR utilizó el equipo Human Phospho-EGF R DuoSet (R&D Systems #DYC1095, Minneapolis, MN) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Cuadro 16A: Inhibición de Fosforilación de ErbB3 y EGFR en Células A431 a través del Anticuerpo Parental ErbB3 y Construcciones DVD-lg Ejemplo 1.1.1.1 : Efecto Inhibidor de Crecimiento de un Anticuerpo Monoclonal ErbB3 o EGFR o DVD-lgs ln Vitro Los anticuerpos monoclonales ErbB3, EGFR o DVD-lgs diluidos en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%) se agregaron a células A431 en una placa de 96 cavidades a concentraciones finales de 2.4 y 21.6 nM en 180 ul. Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% humedecida, durante 3 días. Se midió la supervivencia/proliferación de célula indirectamente valorando los niveles de ATP utilizando un equipo ATPIite (Perkin Elmer, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron cavidades sin tratamiento de anticuerpo como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición.
Cuadro 16B. Inhibición de Proliferación de A431 a través del Anticuerpo Parental ErbB3 y Construcciones DVD-lq Ejemplo 1.1.1.J: Determinación de Afinidad utilizando tecnología BIACORE Cuadro 17: Reactivo utilizado en Análisis Biacore ECD = Dominio Extracelular /FC = antígeno/proteína de fusión de dominio IgG Fe Métodos BIACORE: El ensayo BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NI) determina la afinidad de anticuerpos o DVD-lg con mediciones cinéticas de constantes de velocidad de acción y velocidad sin acción. La unión de anticuerpos o DVD-lg a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) se determinó a través de mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore® 1000 ó 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP corriendo (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 m NaCI, 3 mM EDTA, y 0.005% agente tensoactivo P20) a 25°C. Todos los químicos se obtuvieron de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de otra manera de una fuente diferente como se describe en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 RU de IgG anti-ratón de cabra (Fcy), anticuerpo policlonal de fragmento específico (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluidos en 10 mM acetato de sodio (pH 4.5) se inmovilizaron directamente a través de un chip de biosensor de grado de investigación CM5 utilizando un equipo de acoplamiento de amina de acuerdo con las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 pg/ml. Las porciones sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. Se utilizó una superficie de carboximetil-dextrana modificada en célula en flujo como una superficie de reacción. Se utilizó carboximetil-dextrana no modificada sin IgG anti-ratón de cabra en célula en flujo 1 y 3 como la superficie de referencia. Para análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión Langmuir 1:1 se ajustaron simultáneamente a fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (utilizando un análisis de ajuste global) con el uso del software Biaevaluation 4.0.1. Los anticuerpos o DVD-lg se diluyeron en salina regulada en su pH-HEPES para captura a través de superficies de reacción específicas de IgG anti-ratón de cabra. Se inyectaron anticuerpos o DVD-lg que se captura como un ligando (25 pg/ml) a través de matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/min. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, kon (M" s'1) y koff (s"1) se determinaron bajo una velocidad de flujo continuo de 25 µ?/minuto. Las constantes de velocidad se derivan haciendo mediciones de unión cinéticas a diferentes concentraciones de antígeno variando de 10 - 200 nM. La constante de disociación de equilibrio (M) de la reacción entre anticuerpos o DVD-lgs y el antígeno objetivo se calculó después a partir de las constantes de velocidad cinéticas mediante la siguiente fórmula: KD = k0ff/kon- La unión se registra como una función de tiempo y se calculan constantes de velocidad cinéticas. En este ensayo, las velocidades de acción tan rápidas como 106M"1s'1 y las velocidades sin acción tan bajas como 10"6s"1 pueden ser medidas.
Cuadro 18: Análisis de BIACORE de Anticuerpos Parentales y Construcciones DVD La unión de todas las construcciones de DVD-lg caracterizada por a tecnología Biacore se mantuvo y fue comparable con aquella de anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N-terminales se unieron con una alta afinidad similar como el anticuerpo parental, así como también los dominios variables C-terminales de las construcciones de DVD-lg DVD022, DVD016, DVD042, DVD044, DVD038, DVD049, DVD0260, DVD299 y DVD305.
Cuadro 19: Análisis BIACORE de Anticuerpos Parentales y Construcciones de DVD La unión de 6 construcciones de DVD-lg caracterizada por tecnología Biacore fue comparable con o mejor que aquella de los anticuerpos parentales. Todo el domino IV HER-2 en los dominios variables N-terminales se unieron de 10 a 40 veces mayor afinidad que aquella de los anticuerpos parentales, y todo el dominio IV HER-2 en los dominios variables C-terminales de construcciones de DVD- Ig exhibieron afinidad comparable con aquella de los anticuerpos parentales.
Cuadro 20: Análisis Bl ACORE de dominio VEGF en Construcciones de VEGF/DLL4 DVD La unión de construcciones VEGF/DLL4 DVD a DLL4 como se caracteriza por la tecnología Biacore fue comparable con aquella de los anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N- o C-terminales se unieron a DLL4 con afinidad comparable con aquella de los anticuerpos parentales.
Cuadro 21: Análisis BIACORE de dominio VEGF Construcciones VEGF/DLL4 DVD La unión de construcciones de VEGF/DLL4 DVD-lg a VEGF según caracterizado por tecnología Biacore fue comparable con aquella de de los anticuerpos parentales. Todos los dominios variables N- y C-terminales unieron VEGF con afinidad comparable con aquella de los anticuerpos parentales.
Ejemplo 1.1.2: Ensayos usados para Determinar la Actividad Funcional de Anticuerpos Parentales y DVD-lg Ejemplo 1.1.2. A: Bioensayo de Citocina La habilidad de una anti-citocina o un anticuerpo parental de factor de anti-crecimiento o DVD-lg conteniendo secuencias de factor anti-citocina o anti-crecimiento para inhibir o neutralizar una bioactividad de citocina o factor de crecimiento se analizó determinando el potencial inhibidor del anticuerpo o DVD-lg. Por ejemplo, la habilidad de un anticuerpo anti-IL-4 para inhibir la producción de IgE mediada por IL-4 puede ser utilizada. Por ejemplo, se aislaron células B naturales humanas a partir de sangre periférica, respectivamente, capas leucocitarias a través de centrifugación Ficoll-paque, seguido por separación magnética con perlas MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) específicas para anticuerpos F(ab)2 de cabra marcados con slgD FITC humano seguido por perlas MACS anti-FITC. Las células B naturales magnéticamente almacenadas se ajustaron a 3 x 105 células por mi en XV15 y se colocaron en lacas de 96 cavidades a 100 µ? por cavidad en una disposición de 6 x 6 en el centro de la placa, rodeado por cavidades llenas de PBS durante los 10 días del cultivo a 37°C y en presencia de C02 al 5%. Se preparó una placa por anticuerpo para la prueba, consistiendo de 3 cavidades, cada una de controles no inducidos e inducidos y repeticiones por cuadruplicado de titulaciones de anticuerpo empezando a 7 pg/ml y corriendo una dilución por triplicado a 29 ng/ml de concentración final agregados en 50 µ? de pre-dilución cuatro veces concentrada. Para inducir la producción de IgE, se agregaron a cada cavidad rhlL-4 a 20 ng/ml más anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Novartis, Basel, Suiza) a concentraciones finales de 0.5 pg/ml, y las concentraciones de IgE se determinaron al final del período de cultivo a través de un método de ELISA de emparedado estándar.
Ejemplo 1.1.2.B: Ensayo de Liberación de Citocina Se analizó la habilidad de un anticuerpo parental o DVD-lg para ocasionar la liberación de citocina. Se sacó sangre periférica de tres donadores saludables a través de una venopunción en tubos Vacutainer. La sangre entera se diluyó 1:5 con un medio de RPMI-1640 y se colocó en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades a 0.5 mi por cavidad. Los anticuerpos anti-citocina (por ejemplo, anti-IL-4) se diluyeron en RPMI- 640 y se colocaron en las placas a 0.5 ml/cavidad para dar concentraciones finales de 200, 100, 50, 10 y 1 pg/ml. La dilución final de sangre entera en las placas de cultivo es de 1:10. Se agregaron LPS y PHA para separar las cavidades a concentraciones finales de 2 pg/ml y 5 pg/ml como un control positivo para la liberación de citocina. Se utilizó IgG humana policlonal como anticuerpo de control negativo. El experimento se realizó por duplicado. Las placas se incubaron a 37°C a C02 al 5%. Después de 24 horas, los contenidos de las cavidades se transfirieron a tubos de ensayo y se hicieron girar durante 5 minutos a 1200 rpm. Los sobrenadantes libres de célula se recogieron y se congelaron para ensayos de citocina. Las células que quedaron sobre las placas y en los tubos se lisaron con 0.5 mi de solución de lisis, y se colocaron a -20°C y se descongelaron. Se agregaron 0.5 mi del medio (para llegar a un volumen al mismo nivel como las muestras de sobrenadante libre de célula) y las preparaciones de célula se recolectaron y se congelaron para ensayos de citocina. Los sobrenadantes libres de célula y los lisatos de célula se analizaron para niveles de citocina a través de ELISA, por ejemplo, para niveles de IL-8, IL-6, I L- 1 ß , IL-1RA, o TNF-o.
Ejemplo 1.1.2.C: Estudio de Reactividad Cruzada de Citocina Se analizó la habilidad de un anticuerpo parental anti-citocina o DVD-lg dirigido a una citocina(s) de interés para reaccionar en forma cruzada con otras citocinas. Los anticuerpos parentales o DVD-lg sé inmovilizaron en una matriz de biosensor Biacore. Un Fe mAb antihumano se unió covalentemente a través de grupos amina a la matriz de dextrana activando primero grupos carboxilo en la matriz con 100 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 400 mM de clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). Alrededor de 50 pL de cada preparación de anticuerpo o DVD-lg a una concentración de 25 pg/ml, diluido en acetato de sodio, pH 4.5, se inyectó a través del biosensor activado y las aminas libres en la proteína se unieron directamente a los grupos carboxilo activados. Típicamente, se inmovilizaron 5000 Unidades de Resonancia (RU's). Los EDC-ésteres de matriz sin reaccionar se desactivaron a través de una inyección de 1 M etanolamina. Se preparó una segunda célula de flujo como un estándar de referencia inmovilizando lgG1/K humana utilizando el equipo de acoplamiento de amina estándar. Se realizaron mediciones de SPR utilizando el chip de biosensor CM.
Todos los antígenos que se analizarán en la superficie de biosensor se diluyeron en regulador de pH de corrida de HBS-EP conteniendo P20 al 0.01 %.
Para examinar la especificidad de unión de citocina, se inyectó un exceso de citocina de interés (100 nM, por ejemplo, humana recombinante soluble) a través del anticuerpo parental anti-citocina o superficie de biosensor inmovilizada con DVD-lg (tiempo de contacto 5 minutos). Antes de la inyección de la citocina de interés e inmediatamente después, el regulador de pH de HBS-EP fluyo a través de cada célula de flujo. La diferencia neta en las señales entre la línea de base y el punto que corresponde a aproximadamente 30 segundos después del término de la inyección de citocina se tomaron para representar el valor de unión final. Otra vez, la respuesta se midió en Unidades de Resonancia. Las matrices del biosensor se regeneraron utilizando 10 mM HCI antes de la inyección de la siguiente muestra en donde se observó un evento de unión, de otra forma se inyectó regulador de pH de corrida sobre las matrices. Simultáneamente, también se inyectaron citocinas humanas (IL-1 a, I L- 1 ß , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1 , IL-12, IL- 3, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-a, TNF-ß, y IFN-?, por ejemplo) sobre la superficie de referencia lgG1/K de ratón inmovilizada para registrar cualquier antecedente de unión específica. Al preparar una superficie de referencia y de reacción, Biacore automáticamente substrae los datos de superficie de referencia de los datos de superficie de reacción con el fin de eliminar la mayoría del cambio de índice de refracción y ruido de inyección. De esta manera, es posible determinar la verdadera respuesta de unión atribuida a una reacción de unión de anticuerpo anti-citocina o DVD-lg.
Cuando una citocina de interés se inyecta a través de un anticuerpo anti-citocina inmovilizado, se observó una unión importante. La regeneración con 10 mM de HCI completamente remueve todas las proteínas no covalentemente asociadas. El examen del sensorgrama muestra que la unión de anticuerpo anti-citocina inmovilizado o DVD-lg a citocina soluble es fuerte y robusta. Después de confirmar el resultado esperado con la citocina de interés, se probó el panel de citocinas humanas recombinantes, para cada anticuerpo o DVD-lg separadamente. Se registró la cantidad de anticuerpo anti-citocina o DVD-lg unidad o citocina no unida para cada inyección. Los resultados de tres experimentos independientes se utilizaron para determinar el perfil de especificidad de cada anticuerpo o DVD-lg. Se seleccionaron anticuerpos o DVD-lg con la unión esperada a la citocina de interés y no unión a cualquier otra citocina.
Ejemplo 1.1.2.D: Reactividad Cruzada de Tejido Se realizaron estudios de reactividad cruzada de tejido en tres etapas, la primera etapa incluyendo crio-secciones de 32 tejidos, la segunda etapa incluyendo hasta 38 tejidos, y la tercera etapa incluyendo tejidos adicionales de 3 adultos no relacionados como se describe más adelante. Los estudios se realizaron típicamente a dos niveles de dosis.
Etapa 1: se fijaron crio-secciones (aproximadamente 5 pm) de tejidos humanos (32 tejidos (típicamente de: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga, corazón, músculo esquelético, células de la sangre o hematocitos, riñon, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, mama, pulmón, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cerebral, ovario, timo, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uréter, ojo, pituitaria, útero, trompas de Falopio y placenta) de un donador humano obtenidos mediante autopsia o biopsia) y se secaron sobre un objeto de vidrio. Se realizó tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
Etapa 2: se fijaron crio-secciones (aproximadamente 5 prn) de 38 tejidos humanos (incluyendo adrenal, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cérvix, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, amígdala, uréter, vejiga urinaria, y útero) de 3 adultos no relacionados obtenidos mediante autopsia o biopsia) y se secaron sobre un objeto de vidrio. Se realizó tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
Etapa 3: se fijaron crio-secciones (aproximadamente 5 pm) de tejidos de mono cinomolgo (38 tejidos (incluyendo adrenal, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cérvix, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, amígdala, uréter, vejiga urinaria, y útero) de 3 monos adultos no relacionados obtenidos mediante autopsia o biopsia) y se secaron sobre un objeto de vidrio. Se realizó tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.
El anticuerpo o DVD-lg se incubó con la IgG anti-humana biotinilada secundaria y se desarrolló en complejo inmune. El complejo inmune a las concentraciones finales de 2 y 10 pg/ml de anticuerpo o DVD-lg se agregó en secciones de tejido sobre un objeto de vidrio y después las secciones de tejido se hicieron reaccionar durante 30minutos con un equipo de avidina-biotina-peroxidasa. Subsecuentemente, se aplicó DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para la tinción de tejido. Se utilizaron perlas de Antígeno-Sepharose como secciones de tejido de control positivo. Los estudios de bloqueo de antígeno objetivo y de suero humano sirvieron como controles adicionales. El complejo inmune a las concentraciones de 2 y 10 µg/ml de anticuerpo o DVD-lg se pre-incubó con antígeno objetivo (concentración final de 100 pg/ml) o suero humano (concentración final 10%) durante 30 minutos, y después se agregaron sobre las secciones de tejido en el objeto de vidrio y después las secciones de tejido se hicieron reaccionar durante 30 minutos con un equipo de avidina-biotina-peroxidasa. Subsecuentemente, se aplicó DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para la tinción de tejido.
Cualquier tinción especifica se juzgó como una reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión del antígeno) o inesperada basada en la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada específica se clasificó para intensidad y frecuencia. La tinción de tejido entre la etapa 2 (tejido humano) y la etapa 3 (tejido de mono cinomolgo) en ambas se juzgó como similar o diferente.
Ejemplo 1.1.2.E: Inhibición de Proliferación/Supervivencia de HUVEC a través de Construcciones de Anticuerpo Parental y DVD-ÜL Antes de la colocación en placas para el ensayo, se mantuvieron células endoteliales vasculares umbilicales humanas normales o HUVEC (pasaje 2-6) en EBM-2 (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD) suplementado con EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, #CC-4176). Las células HUVEC se colocaron en placas a 10,000 células/cavidad sobre placas de 96 cavidades negras cubiertas con colágeno en EMB-2 (100 µ?) con FBS al 0.1% en ausencia de factores de crecimiento. Al día siguiente los medios se reemplazaron con FBS al 0.1% en ausencia de factores de crecimiento. Al día siguiente el medio se reemplazó con 100 µ? de EMB-2 (sin factores de crecimiento o suero) y se incubó durante cuatro horas antes de la adición de VEGF y anticuerpos/DVD-Igs. Los anticuerpos monoclonales anti-VEGF o DVD-lgs (a concentraciones finales de 67 nM, 6.7 nM t 0.67 nM) se diluyeron en EMB-2 con BSA al 0.1% y se pre-incubaron con VEGF 65 (50 ng/ml) durante 1 hora a 25°C en 50 µ?. Después se agregaron mezclas de anticuerpo/DVD-lg y VEGF a las células (50 µ?), y las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera húmeda de C02 al 5% durante 72 horas. Se midió la supervivencia/proliferación de célula indirectamente determinando los niveles de ATP utilizando un equipo ATPIite (Perkin Elmer, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Cuadro 22 proporciona los datos que muestran la inhibición de proliferación/supervivencia de HUVEC.
Cuadro 22: Inhibición de Proliferación/Supervivencia de HUVEC a través de Anticuerpo Parental VEGF y Construcciones de DVD-lg Todas las DVD-lgs que contienen VDs de AB014 inhibieron la proliferación de célula HUVEC causada por VEGF, DVD044, DVD048, DVD050 inhibieron la proliferación de célula HUVEC por >90% a una concentración de 67 nM de DVD-lgs.
Cuadro 23. Inhibición de Proliferación/Supervivencia de HUVEC a través de 7 Construcciones de DLL4/VEFG DVD-lg y Anticuerpos Parentales Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB014 inhibieron la proliferación de célula HUVEC causada por VEGF, DVD044, DVD048, DVD040, DVD050 inhibieron la proliferación de célula HUVEC por > 90% a una concentración de 67 nM de DVD-lgs.
Ejemplo 1.1.2.F: Efector Inhibidor de Crecimiento de Célula Tumoral de Anticuerpos Monoclonales IGF1.2 o DVD-lgs In Vitro Anticuerpos monoclonales, IGF1.2, o DVD-lgs diluidos en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%), 20 µ?, se agregaron a células tumorales humanas a concentraciones finales de 0.01 g/ml - 100 g/m I en 200 µ?. Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%, humedecida durante tres días. El número de células vivas en cada cavidad se cuantificó utilizando reactivos MTS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor. Se utilizaron cavidades sin tratamiento de anticuerpo como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición, mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición.
Cuadro 24: Ensayo de Inhibición de Proliferación de Línea H929, IGFR con Anticuerpos Parentales IGF1R e IGF1.1 y Construcciones DVD-lg Tocias las DVD-lgs conteniendo VDs de AB004, AB 011, o AB010 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron inhibición en el ensayo de proliferación A431.
Ejemplo 1.1.2.G: Efecto Inhibidor de Crecimiento de un Anticuerpo Parental EGFR o DVD-lgs In Vitro Anticuerpos monoclonales, EGFR, o DVD-lgs diluidos en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%), 20 µ?, se agregaron a células tumorales humanas a concentraciones finales de 0.01 g/ml - 100 µg/ml en 180 µ?. Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%, humedecida durante tres días. El número de células vivas en cada cavidad se cuantificó utilizando reactivos MTS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor. Se utilizaron cavidades sin tratamiento de anticuerpo como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición.
Cuadro 25: Ensayo de Inhibición de Proliferación de la Línea de Célula A431, EGFR con Anticuerpos onoclonales EGFR y Construcciones de DVD-lg Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB 033, AB004, AB011, AB010, AB014 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron inhibición de ensayo de proliferación de célula A431.
Cuadro 26: Ensayo de Inhibición de Proliferación de Línea de Célula GEO, EGFR/IGF1R con Anticuerpos Parentales EGFR, IGF1R e IGF1.2 y Construcciones de DVD-lg Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB033, AB004, AB010, AB014 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron inhibición del ensayo de proliferación de célula GEO.
Ejemplo 1.1.2.H: Efecto Inhibidor de Crecimiento de Célula Tumoral de Anticuerpo Parental HER2 o Construcciones de DVD- lg In Vitro Anticuerpos monoclonales, HER2 o DVD-lgs diluidos en D-PBS- BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%), 20 µ?, se agregaron a células tumorales humanas de expresión de HER-2 (BT474) a concentraciones finales de 0.01 pg/ml - 100 pg/ml (180 µ?). Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%, humedecida durante tres días. El número de células vivas en cada cavidad se cuantificó utilizando reactivos MTS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor. Se utilizaron cavidades sin tratamiento de anticuerpo como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición.
Cuadro 27: Ensayo de Inhibición de Proliferación de Línea de Célula BT474, Erb2(Her-2) con Anticuerpo Parentales Anti-Her-2 y Construcciones de DVD-lq Todas las DVD-lgs conteniendo VD de AB004 en la posición ya sea N-terminal o C-terminal mostraron inhibición en el ensayo de proliferación de célula BT474.
Ejemplo 1.1.2.1: Inhibición de Incremento Dependiente de DLL4 Recombinante de Svegfr (SfltP en Células Eahy.926 a través del Anticuerpo Parental DLL4 y Construcciones DVD-lq Se revistieron placas de cultivo de tejido de 96 cavidades con 100 µ?/cavidad de dominio extracelular de DLL4 humano a 5 pg/ml en D-PBS (Gibco #14190, Grand Island, NY) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron una vez con D-PBS y se sembraron 4000 células EA. hy926/cavidad en ausencia presencia de anticuerpos o DVD-Igs. Se midió la proliferación de célula cuatro días después utilizando el equipo de ensayo de proliferación de célula CyQUANT (Invitrogen, #C35007, Eugene, OR). Se detectó la expresión de sVEGFRI en el medio acondicionado a través de un equipo de ELISA siguiendo las recomendaciones del fabricante (R&D Systems #DVR100B, Minneapolis, MA). Los niveles de sVEGFRI se normalizaron a RFU determinado por el ensayo CyQUANT para representar diferencias en la proliferación de célula.
Cuadro 28. Inhibición de Incremento Dependiente de DLL4 de Svegfrl (SfltD en Células Eahy.926 a través de Anticuerpos Parentales DLL4 o Construcciones DVD-lg Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB015 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron inhibición dependiente de dosis de liberación de sFLT inducida por DLL4 a partir de células Eahy.926.
Cuadro 29: Inhibición de Incremento Dependiente de DLL4 (2uq/ml) de sVEGFRI (sFItP en Células EA.hy926 a través de Construcciones DLL4/VEFG DVD-lg y Anticuerpo Parental Las DVD-lgs conteniendo VD de AB015 en la posición ya sea N-terminal o C-terminal mostraron inhibición dependiente de dosis de liberación de sFLT1 inducida por DLL4 a partir de células Eahy.926.
Ejemplo 1.1.2.J: Efecto Tumoricida de un Anticuerpo Parental o DVD-lg In Vitro Los anticuerpos parentales o DVD-lg que se unen a antígenos objetivo en células tumorales pueden ser analizados para actividad tumoricida. En resumen, los anticuerpos parentales o DVD-lg son diluidos en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%) y se agregaron a células tumorales humanas a concentraciones finales de 0.01 pg/ml a 100 µ9 ??? y 200 µ?/???. Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% C02 humedecida durante 3 días. El número de células vivas en cada cavidad es cuantificado utilizando reactivos MTS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor. Las cavidades sin tratamiento de anticuerpo se utilizaron como controles de 0% de inhibición, mientras que las cavidades sin células se consideró que mostraron un 100% de inhibición.
Para la valoración de apoptosis, se determinó la activación de caspasa-3 a través del siguiente protocolo: células tratadas con anticuerpo en placas de 96 cavidades se Usaron en 120 µ? de 1 x regulador de pH de lisis (1.67 mM Hepes, pH 7.4, 7 mM KCI, 0.83 mM MgCI2, 0.11 mM EDTA, 0.11 mM EGTA, 0.57% CHAPS, 1 mM DTT, 1x tableta de coctel de inhibidor de proteasa; libre de EDTA; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) a temperatura ambiente con agitación durante 20 minutos. Después de la lisis de célula, se agregaron 80 µ? de un regulador de pH de reacción de caspasa-3 (48 mM Hepes, pH 7.5, 252 mM sacarosa, 0.1% CHAPS, 4 mM DTT, y 20 µ? del substrato Ac-DEVD-AMC; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) y las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C. Las placas se leyeron en un Contador de Etiquetas Múltiples 1420 VICTOR (Perkin Elmer Life Sciences, Downers, Grove, IL) utilizando los siguientes parámetros: excitación = 360/40, emisión = 460/40. Un incremento de unidades de fluorescencia de células tratadas con anticuerpo con relación a las células tratadas con control de anticuerpo de isótopo es indicativo de apoptosis.
Ejemplo 1.1.2.K: Inhibición de Proliferación de Célula Tumoral U87-MG mediante Anticuerpo Parental HGF y Construcciones DVD-l Se colocaron en placas células tumorales de glioma humano U87-MG a 2,000 células/cavidad en 100 µ? en platos de 96 cavidades en un medio RPMI suplementado con suero de bovino fetal al 5%, y se incubaron a 37°C, 5% C02 durante la noche. Al día siguiente las células se trataron con diluciones en serie de anticuerpo o DVD-lgs (0.013 nM a 133 nM de escala de dosis), y se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% C02, humedecida durante 5 días. Se midió la supervivencia/proliferación de célula indirectamente valorando los niveles de ATP utilizando un equipo ATPIite (Perkin Elmer, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuadro 30: Inhibición de Proliferación Tumoral U87-MG mediante Anticuerpo Parental anti-HGF y Construcciones DVD-lg Las DVD-lgs conteniendo un VD de AB012 en la porción extermina! o N-terminal inhibieron la proliferación de célula tumoral U87-MG.
Ejemplo 1.1.2.L: Inhibición de Interacción de RON con MSP1 mediante el Anticuerpo Parental RON y Construcciones de DVD-lg In Vitro Se revistieron placas de 96 cavidades con 50 µ?/cavidad de un anticuerpo de cadena anti-MSPcc (R&D Systems #MAB352, Minneapolis, MN, 2 µ9/G??), y las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces en regulador de pH de lavado (PBS conteniendo 0.05% Tween 20), y subsecuentemente se bloquearon con 100 ul/cavidad de regulador de pH de bloqueo (PBS conteniendo 2% BSA) durante una hora a 25°C. Las placas después se lavaron tres veces, y se incubaron con 50 µ?/cavidad de una solución de 10 nM de MSP1 humano recombinante (R&D Systems #352-MS, Minneapolis, MN) durante una hora a 25°C. Durante la incubación de la placa, diluciones en serie 10 veces de los anticuerpos que se van a probar (escala de dosis 0 nM a 1000 nM) se pre-incubaron con 10 nM de ECD parcial His-RON recombinante (R&D Systems #1947-MS, Minneapolis, MN) a 25°C durante una hora. Las placas incubadas con MSP1 humano recombinante se lavaron tres veces, y después se agregaron, por triplicado, 50 µ?/cavidad de los complejos de anticuerpo/His-RON. Después de una hora de incubación a 25°C, las placas después se lavaron, y se agregaron 50 µ?/ de un substrato de TMB (Pierce #34028, Rockford, IL) y se incubaron durante cinco minutos a 25°C. La reacción se terminó después de cinco minutos utilizando 50 µ?/cavidad de 2N H2S04. La absorbancia se leyó a 450 nm (placa lectora Spectra Max Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las EC50s se calcularon en GraphPad Prism 4.03.
Ejemplo 1.1.2.M: Anticuerpo Parental VEGF y Construcciones de DVD-lg Evitan la Interacción de V E G F 1 fi fi con VEGFR1 Se incubaron placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) durante la noche a 4°C con 100 µ? de PBS conteniendo proteína de fusión de dominio Fe extracelular de VEGFR1 recombinante (5 Mg/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN). Las placas se lavaron tres veces en regulador de pH de lavado (PBS conteniendo 0.05% Tween 20), y se bloquearon durante 1 hora a 25°C en regulador de pH de bloqueo (PBS conteniendo B SA al 1 %). Se incubaron diluciones en serie de cada anticuerpo/DVD-lg en PBS conteniendo BSA al 0.1% con 50 µ? de 2 nM de VEGF biotinilado durante 1 hora a 25°C. Las mezclas de anticuerpo/VEGF DVD-lg biotinilado (100 µ?) se agregaron después a las cavidades cubiertas con VEGFR1-Fc y se incubaron a 25°C durante 10 minutos. Las cavidades se lavaron tres veces, y después se incubaron durante 1 hora a 25°C con 100 µ? de estreptavidina-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg , MD). Las cavidades se lavaron tres veces, y se agregaron, por cavidad, 100 µ? de ULTRA. TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL). Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo con 1 N HCl y se midió la absorbancia a 450 Los resultados se proporcionan en el Cuadro 31 a continuación.
Cuadro 31 : Inhibición de Interacción de Ligando-Receptor entre VEGF y VEGFR1 para 7 Construcciones de DLL4/VEGF DVD-lg y Anticuerpos Parentales Todas las DVD-lgs conteniendo VD de AB014 y AB071 y AB071 ya sea en las posiciones N-terminal o C-terminal mostraron inhibición de ligando (VEGF) a su receptor (VEGFR1). El dominio N-terminal de DVD-lg bloqueó la interacción de ligando-receptor asi como el anticuerpo parental.
Ejemplo 1.1.2.N: Inhibición de la Interacción de DLL4 con Notch-1 mediante Anticuerpo parental DLL4 y Construcciones de DVD-lg In Vitro Se revistieron placas de Nunc-lmmuno de 96 cavidades (Nunc, #439454, Rochester, NY) con 16 nM de Notch-1 humano (R&D Systems #3647-TK, Minneapolis, MN, 100 µ?/cavidad en D-PBS) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas después se lavaron una vez con regulador de pH de lavado (PBS, 0.05% Tween 20) y se bloquearon con 200 µ?/cavidad de regulador de pH de bloqueo (D-PBS, 1% BSA, 1 mM CaCI2, 0.05% Tween 20) durante 1 hora a 25°C. Mientras se bloquea, se mezclaron 300 µ? de dominio extracelular DLL4 humano marcado con biotina (14 nM) con anticuerpo o DVD-lg (3.4 pM-66 nM, dilución en serie 3 veces en regulador de pH de bloqueo) durante 1 hora a 25°C. Después del bloqueo, las placas de ensayo se lavaron y se incubaron con mezclas de anticuerpo DLL4 o DVD-lg (10 µ?/cavidad, 1 hora a 25°C). Las placas se lavaron de nuevo y se agregaron, durante 1 hora a 25°C, 100 µ?/cavidad de estreptavidina conjugada con HRP (KLP #474-3000, Gaithersburg , MD, diluido 1:10,000 en regulador de pH de bloqueo). Después de un lavado final, las placas se desarrollaron utilizando 100 µ?/cavidad de substrato (1-Step Ultra TMB-ELISA, Pierce #340280, Rockford, IL), y la reacción se detuvo después de una incubación de 10-20 minutos a 25°C utilizando 100 µ?/cavidad 2N H2S04, y la absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se proporcionan en al Cuadro 32 a continuación.
Cuadro 32: Inhibición de Interacción de Ligando-Receptor entre DLL4 y Notchl para 7 Construcciones de DLL4/VEGF DVD-lg y Anticuerpo Parental Todas las DVD-lgs conteniendo VD de AB015 ya sea en las posiciones N-terminal o C-terminal mostraron inhibición de ligando (DLL4) a su receptor (Notchl). El dominio N-terminal de DVD-lg bloqueó la interacción de ligando-receptor así como el anticuerpo parental.
Cuadro 33: Inhibición de Interacción de Ligando-Receptor entre Células DLL4 293G-humanas y Notchl mediante FACS para 7 Construcciones de DLL4/VEGF DVD-lg y Anticuerpo Parental Ejemplo 1.1.2.0: Inhibición de Interacción de HGF con c-Met mediante Anticuerpo Parental HGF y Construcciones de DVD-lg Se revistieron placas de ELISA (Nunc, axiSorp) con 100 µ?/cavidad de HGF humano recombinante (2 pg/ml de HGF en PBS, R&D Systems) durante la noche a 4°C. Las diluciones en serie de cada anticuerpo/DVD-lg y 2 nM de fusión c-Met Fe soluble (R&D Systems) (50 µ?) se co-incubaron y se agregaron a cavidades revestidas con HGF. La unión de c-Met se detectó con anti-c-Met biotinilado (BAF358, R&D Systems) y 100 µ? de estreptavidina-HRP (KLP). Las cavidades se lavaron tres veces en PBST (PBS conteniendo 0.05% Tween 20), y se agregaron 100 µ? de ULTRA-TMB ELISA (Pierce) por cavidad. Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo con 1 N HCI y se midió la absorbancia a 450 nm. Los datos se evaluaron al calcular el porcentaje de inhibición comparado con la señal máxima (anticuerpo de control o sin anticuerpo agregado) y se calcularon los valores de IC50.
El siguiente cuadro contiene los datos de afinidad, expresados como IC50 en nM, de anticuerpo parentales y construcciones de DVD-lg en los ensayos de ELISA de competencia de unión de ligando-receptor para RON, VEGF, DLL4, y HGF, como se. describió anteriormente.
Cuadro 34: Inhibición de Interacción de Ligando-Receptor con Anticuerpo RON, VEGF DLL4, y HGE y Construcciones de DVD-lg In Vitro Todas las DVD-lgs conteniendo VD a partir de AB005, AB015, AB012, ya sea en las posiciones N-terminal y C-terminal mostraron inhibición de ligando a sus receptores respectivos. El domino N-terminal de DVD-lg bloqueó la interacción de ligando-receptor así como el anticuerpo parental.
Cuadro 35: Inhibición de Interacción de Ligando-Receptor, Anticuerpos Parentales y Construcciones de DVD-lg In Vítro Todas las DVD-lgs conteniendo VD a partir de AB047 ya sean en las posiciones N-terminal o C-terminal mostraron inhibición de ligando a su receptor (VEGFR1). El dominio N-terminal de DVD-lg bloqueó la interacción de ligando-receptor así como el anticuerpo parental.
Ejemplo 1.1.2.P: Inhibición de Fosforilación de IGFR Inducida por IGF a través de Anticuerpos Parentales o Construcciones de DVD-lg In Vitro Se colocaron en placas células de carcinoma humano en placas de 96 cavidades a 40,000 células/cavidad en 180 µ? de medio libre de suero (DMEM + BSA al 0.1%), y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% C02. Las placas de Costar EIA (Lowell, MA) se cubrieron con 100 µ?/cavidad de Ab de captura de receptor (R&D Systems cat. #MAB391, 4 pg/ml concentración final), y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente mientras se agitaba. Al día siguiente, las placas de ELISA cubiertas con anticuerpo IGFR se lavaron (tres veces con PBST = 0.05% Tween 20 en PBS, pH 7.2 - 7.4), y se agregaron 200 µ? de solución de bloqueo (1% BSA, 0.0% NaN3 en PBS, pH 7.2 - 7.4) para bloquear durante 2 horas a temperatura ambiente en un oscilador. Las células tumorales humanas se coincubaron con anticuerpos o DVD-lgs y ligando IGF. Anticuerpos monoclonales IGF1 ,2 o DVD-lg diluida en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%) se agregaron a células de carcinoma humano a concentraciones finales de 0.01 pg/ml - 100 µg/ml. Simultáneamente se agregaron factores de crecimiento (IGF1 e IGF2) a las células a concentraciones de 1-100 ng/ml (200 µ?_), y las células se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% C02 humedecida, durante 1 hora. Las células se lisaron en 120 µ?/cavidad de regulador de pH de extracción de célula frío (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM ortovanadato de sodio, 1% Tritón X-100, 10% Glicerol, 0.1% SDS, y coctel de inhibidor de proteasa), y se incubaron a 4°C durante 20 minutos con agitación. Los lisados de célula (100 µ?) se agregaron a la placa de ELISA, y se incubaron durante la noche a 4°C mientras se agitaba con moderación. Al día siguiente, las placas de ELISA se lavaron, y se agregaron 100 µ?/cavídad de Ab de detección pTyr-HRP (equipo p-IGF1R ELISA, R&D System #DYC1770, Minneapolis, MN), y las placas se incubaron durante 2 horas a 25°C en la oscuridad. Las placas se desarrollaron para determinar fosfo-IGF1R de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en los Cuadros 36 y 37.
Cuadro 36: Inhibición de Fosforilación de IGF1R a través de IGF1 con Anticuerpos Parentales Anti-IGF1.2 o Construcciones de DVD-lg Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB010 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron inhibición de fosforilación del receptor IGF1R inducida por IGF-1. El VD de AB010 en la posición N-terminal de DVD-lg bloqueó la fosforilación de receptor asi cmo del anticuerpo parental AB010.
Cuadro 37: Inhibición de Fosforilación de 1GF1R a través de IGF1 con Anticuerpos Parentales Anti-IGF1,2 o Construcciones de DVD-lg Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB010 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron la inhibición de fosforilación de receptor IGF1R inducida por IGF2. El VD de AB010 en la posición N-terminal de DVD-lg bloqueó la fosforilación de receptor así como del anticuerpo parental AB010.
Ejemplo 1.1.2.Q: Inhibición de Fosforilación Mediada por HGF de Akt a través del Anticuerpo Parental HGF y Construcciones de DVD-lg Se colocaron en placas células tumorales de pulmón de célula no pequeña, H1299, a 20,000 células/cavidad (volumen total 100 µ?) en placas de 96 cavidades y se privaron de suero durante 18 horas a 37°C, C02 al 5%. Los anticuerpos monoclonales anti-HGF o DVD-lgs (concentraciones finales de 67 nM, 6.7 nM, y 0.67 nM) se diluyeron en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco conteniendo BSA al 0.1% y se pre-incubaron con HGF humano recombinante (50 ng/ml) en 50 µ? durante 1 hora a 25°C. Estas mezclas de antícuerpo/DVD-lg y HGF (50 µ?) después se agregaron a las células, y las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%, humedecida durante aproximadamente 15 minutos. Las células después de fijaron agregando un volumen igual de formaldehído al 7.6% a cada cavidad y las placas se incubaron durante 15 a 25°C. Después de la fijación, las células se lavaron cinco veces en PBS conteniendo Tritón X-100 al 0.1%. Las células después se trataron con 150 µ? de regulador de pH de bloqueo LI-COR Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) por cavidad, y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación moderada. El regulador de pH de bloqueo se removió y las células se incubaron a 4°C durante la noche con el anticuerpo primario diluido en regulador de pH de bloqueo (dilución de 1:300 Phospho Ser473.Akt, Cell Signaling Technology #4060, Boston, MA). Las cavidades después se lavaron cinco veces con PBS conteniendo 0.1% Tween 20, y después se incubaron con un anticuerpo secundario (dilución de 1:400 de un IRDye™ 680CW LI-COR de anticonejo (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) en 1XPBS con 0.2% Tween 20) durante 1 hora a 25°C. Las células se lavaron cinco veces con PBS conteniendo 0.1% Tween 20, y se formaron imágenes utilizando un sistema Odyssey Infrared Imaging System.
Cuadro 38: Inhibición de Fosforilación Mediada por HGF de Akt mediante Anticuerpo Parental HGF y Construcciones de DVD-[a Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB012 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron una buena inhibición de fosforilación de Akt inducida por HGF. El VD de AB012 en la posición N-terminal de DVD-lg bloqueó la fosforilación de Akt asi como del anticuerpo parental AB012.
Ejemplo 1.1.2.R: Inhibición de Fosforilación de VEGFR2 (KDR) a través de Anticuerpo Parental VEGF y Construcciones DVD-lg Se colocaron en placas células NIH3T3 expresando NEGFR2 humano (KDR) a 20,000 células/cavidad (100 µ?) en placas de 96 cavidades en DMEM suplementado con FBS al 10%. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con DMEM y se privaron de suero durante 3 horas en DMEM sin FBS. El anticuerpo parental anti-VEGF o DVD-lgs (a concentraciones finales de 67 nM, 6.7 nM y 0.67 nM) diluido en DMEM con BSA al 0.1% se pre-incubaron con VEGF165 recombinante (50 ng/ml) durante 1 hora a 25°C. Estas mezclas de anticuerpo/DVD-lg y VEGF después se agregaron a las células, y las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% C02 durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron a través de la adición de 100 µ?/cavidad de Regulador de Lisis de Célula (Cell Signaling, Boston, MA) suplementado con NP40 al 0.1%. Se combinaron muestras por duplicado y 170 µ? se agregaron a las cavidades de placas de ELISA previamente cubiertas con anticuerpo anti-VEGFR2 ( R % D Systems, AF357, Minneapolis, MN) y se incubaron a 25°C con agitación moderada durante dos horas. Las cavidades se lavaron cinco veces con regulador de pH de lavado (PBS conteniendo 0.05% Tween 20), y se incubaron con 50 µ? de una dilución 1:2000 de anticuerpo anti-fosfotirosina biotinilado (4G10; Millipore, Billerica, MA) durante 1 hora a 25°C. Las cavidades se lavaron cinco veces con PBS conteniendo 0.05% Tween 20, y después se incubaron durante 1 hora a 25°C con estreptavid i na-HRP (KPL #474-3000, G a it he rsbu rg , MD). Las cavidades se lavaron tres veces con estreptavidina-HRP (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)). Las cavidades se lavaron tres veces con PBS conteniendo 0.05% Tween 20, y 100 µ? de ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) se agregaron por cavidad. Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo con 1N HCI y se midió la absorbancia a 450 nM. Los resultados se muestran en el Cuadro 39.
Cuadro 39: Inhibición de Fosforilación de VEGF2 (KDR) mediante Anticuerpos Parentales VEGF o Construcciones DVD-lg Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB014 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron una buena inhibición de fosforilación de KDR inducida por VEGF. El VD de AB014 en la posición N-terminal de DVD-lg bloqueó la fosforilación de KDR así como el anticuerpo parental AB014.
Ejemplo 1.1.2.S: Inhibición de Fosforilación de EGFR Inducida por EGF mediante Anticuerpo Parental EGFR o Construcciones de DVD-lg In Vitro Se agregaron anticuerpo monoclonales EGFR o DVD-lgs diluidos en D-PBS-BSA (salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco con BSA al 0.1%) a células de carcinoma humano a concentraciones finales de 0.01 pg/ml - 100 µg/ml (180 µ?). Las placas se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%, humedecida durante 1 hora. Se agregaron, a las células durante 5-15 minutos, factores de crecimiento (EGF) a una concentración final de 1-100 ng/ml (20 µ?) para estimular la auto-fosforilación del receptor (EGFR). Las cavidades sin tratamiento de anticuerpo se usaron como controles de 0% de inhibición, mientras que las cavidades sin estimulación de factor de crecimiento se consideró que mostraron 100% de inhibición. Se hicieron lisados de célula a través de la incubación con regulador de pH de extracción de célula (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM ortovanadato de sodio, Tritón X-100 al 1%, Glicerol al 10%, SDS al 0.1%, y coctel de inhibidor de proteasa). La Fosfo-EGFR en estos lisados de célula se determinó usando el equipo p-EGFR ELISA de R&D Systems (#DYC1095, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en los Cuadros 40 y 41.
Cuadro 40: Inhibición de Fosforilación de EGFR Inducida por EGF mediante Anticuerpos Párenteles Anti-EGFR y Construcciones de DVD-lq Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB033 ya sea en la posición N-terminal y C-terminal mostraron una buena inhibición de fosforilación de EGFR inducida por EGF. El VD de AB033 en la posición N-terminal de DVD-lg (DVD015, DVD021) bloqueó la fosforilación de EGFR así como del anticuerpo parental AB033.
Cuadro 41 : Inhibición de Fosforilación de EGFR Inducida por EGF mediante Anticuerpos Parentales Anti-EGFR y Construcciones de DVD-lq Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB033 ya sea en la posición N-terminal o C-terminal mostraron una buena inhibición de fosforilación de EGFR inducida por EGF. El VD de AB033 en la posición N-terminal de DVD-lg (DVD023) bloqueó la fosforilación de EGFR así como la del anticuerpo parental AB033.
Ejemplo 1.1.2.T: Inhibición de Fosforilación de ERK1/2 y AKT Inducida por MSP1 In Vitro mediante el Anticuerpo Parental RON y Construcciones de DVD-lg Células tumorales de colon DU145 sub-confluentes en un Medio de FBS al 10%/Esencial Mínimo fueron triptinizadas y se sembraron en placas de cultivo de 6 cavidades (0.25 x 106 células/2 mi de volumen final), y se incubaron a 37°C, C02 al 5% durante 18-24 horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 1X D-PBS y se dejaron sin alimento durante la noche en un medio libre de suero. Al día siguiente, las células se incubaron con 900 µ? del medio libre de suero conteniendo 1 µ? de anticuerpos monoclonales o DVD-lgs durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación del anticuerpo, las células se trataron con 13 nM MSP1 (37°C, 30 minutos). Las células se lavaron dos veces con D-PBS enfriado con hielo y se cosecharon en 150 µ? de Regulador de pH de Extracción de Célula (Biosource International, Carlsbad, CA) conteniendo 100 µ? de coctel de inhibidor de fosfatasa HALT® (Thermo Scientific, Rockford, IL), una tableta inhibidora de proteasa libre de EDTA Complete® (1 tableta/10 mi, Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania), y PMSF. Los Usados de célula se incubaron sobre hielo durante 30 minutos con flujo turbulento intermitente, se pre-aclararon a través de centrifugación (10 minutos, 14,000 RPM, 4°C), y se procesaron para análisis de tinción Western. Se resolvió un total de 15 g del lisado de célula a través de SDS-PAGE en un gel NuPage Vis-Tris al 4-12% con 1X MOPS de regulador de pH corriente (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las proteínas fueron transferidas en una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se bloquearon en leche sin grasa al 5% en TBS-T (1X TBS/0.1% Tween 20) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las membranas se incubaron durante la noche a 4°C con una dilución de 1:1000 ya sea de un anticuerpo fosfo-p44/42 MAPK (Thr320/Tyr204) policlonal de conejo (Cell Signaling, Danvers, MA) o un anticuerpo fosfo-AKT (Ser473) monoclonal de conejo (Cell Signaling, Danvers, MA). Las tinciones se lavaron tres veces (1X TBS-T, 15 minutos), y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con una dilución de 1:5000 de un anticuerpo de cabra secundario conjugado con HRP, I g G de anti-conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) en una solución de leche sin grasa al 5%/TBS-T. Las tinciones se lavaron tres veces (1X TBS-T, 15 minutos), y se activó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa a través de incubación de 5 minutos con una solución SuperSignal West Dura Luminol/Enhancer Solution® (Millipore, Temecula, CA), y se detectó la quimioluminiscencia y se cuantificó con un analizador de Imagen Luminiscente LAS-3000 (FUJIFilm, Tokio, Japón). Se determinó la densidad de banda utilizando el software MultiGauge (FUJIFilm, Tokio, Japón) y se cuantificó la señal quimioluminiscente para cada banda. Para determinar los niveles totales de ERK1/2 y AKT, las membranas se dividieron durante 15 minutos con 1X Reblot Plus Strong Solution® (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se volvieron a sondear con una dilución de 1:1000 de ya sea un anticuerpo MAPK p44/42 policlonal de conejo (Cell Signaling, Danvers, MA) o un anticuerpo AKT monoclonal de conejo (Cell Signaling, Danvers, MA), y se procesaron como se describió anteriormente para anticuerpos fosfo. Los niveles de Ph-ERK y ph-Akt se estandarizaron a un total de ERK o un total de Akt, respectivamente.
Cuadro 42: Inhibición de Fosforilación de ERK1/2 Inducida por MSP1 mediante Anticuerpo Parentales RON o Construcciones de DVD-lq Las DVD-lgs conteniendo el VD de AB005 en la posición N-terminal mostraron una excelente inhibición de fosforilación de ERK1/2 inducida por MSP1. El perfil de inhibición de DVD024 y DVD033 fue similar al perfil de inhibición del anticuerpo parental AB005.
Ejemplo 1.1.2.U: Eficacia de una DVD-lq en el Desarrollo de Xenoiniertos de Flanco Subcutáneo de Carcinoma Humano Se desarrollaron células de carcinoma epidermoide humanas A-431 i n vitro a un 99% de viabilidad, 85% de confluencia en matraces de cultivo de tejido. Ratones hembra SCID (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) con un peso de 19-25 gramos se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho con 1 x 1 O6 células tumorales humanas (1:1 matrigel) en el dia 0 del estudio. La administración (IP, QD, 3x/semana) de IgG humana de control o DVD-lg se inició después de que los ratones se hicieron coincidir en grupos de ratones con volúmenes de tumor medios de aproximadamente 200 a 320 mm3. Los tumores se midieron dos veces a la semana, empezando aproximadamente en el dia 10 después de la inyección de las células tumorales.
La reducción en el volumen de tumor se vio en los animales a los que se les administró EGFR + IGF1/2 DVD-lg con relación a tumores en animales que solo recibieron IgG de control. Para dos diferentes construcciones de EGFR + IGF1/2 DVD-lg, los porcentajes de TGI fueron de 69 y 64, según medido cuatro días después del término de la fase de dosificación de 3 semanas.
Ejemplo 1.1.2.V: Unión de Anticuerpos Monoclonales a la Superficie de Líneas de Célula Tumoral Humana según Valorado por Citometría de Flujo Líneas de célula estable sobre-expresando un antígeno de superficie celular de interés o líneas de célula tumoral humanas se cosecharon a partir de matraces de cultivo de tejido y se volvieron a suspender en salina regulada en su pH con fosfato (PBS) conteniendo suero de bovino fetal al 5% (PBS/FBS). Antes de la tinción, se incubaron células tumorales humanas sobre hielo con IgG humana (100 µ?) a 5 Mg/ml en PBS/FCS. Se incubaron 1-5 x 105 células con anticuerpo o DVD-lg (2 pg/ml) en PBS/FBS durante 30-60 minutos sobre hielo. Las células se lavaron dos veces y se agregaron 100 µ? de IgG anti-humana de cabra de F(ab')2, Fcy-fícoeritrína (dilución 1:200 en PBS) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat. #109-116-170). Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se cosecharon dos veces y se volvieron a suspender en PBS/FBS. Se midió la fluorescencia utilizando un aparato Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA).
El Cuadro 43 muestra los datos de FACS para las construcciones de DVD-lg. La media geométrica es la n raíz del producto de multiplicación de n señales fluorescentes (a1 x a2 x a3 .... an). Con los datos de registro transformado, la media geométrica se utilizó para normalizar la carga de la distribución de datos. El siguiente cuadro contiene la media geométrica de FACS de anticuerpos parentales y construcciones de DVD-lg.
Cuadro 43: Clasificación de Célula Activada Fluorescente de Construcciones DVD-lg Todas las DVDs mostraron unión a sus objetivos de superficie celular. Los dominios N-terminales de DVDs unieron sus objetivos sobre la superficie celular así como o mejor que el anticuerpo parental. La unión puede ser restaurada o mejorada ajusfando la longitud de enlazador.
Ejemplo 1.1.2.W: Unión de Anticuerpo EGFR Parental y Construcciones de DVD-lg a la Superficie de Líneas de Célula Tumorai Humanas según Valorado a través de Citometría de Flujo Líneas de célula estable sobre-expresando EGFR de superficie celular o líneas de célula tumorai humanas se cosecharon a partir de matraces de cultivo de tejido y se volvieron a suspender en salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) conteniendo suero de becerro fetal al 1% (DPBS/FCS). Se incubaron 1-5 x 105 células con 100 µ? de anticuerpos o DVD-lgs (10 ug/ml) en DPBS/FCS durante 30-60 minutos sobre hielo. Las células se lavaron dos veces y se agregaron 50 µ? de IgG-ficoeritrina anti-humana (dilución 1:50 en DPBS/BSA) (Southern Biotech Associates, Birmingham, AL, cat#2040-09). Después de 30-45 minutos de incubación en hielo, las células se lavaron dos veces y se volvieron a suspender en 125 µ?/cavidad de form aldehido al 1% en DPBS/FCS. Se midió la fluorescencia utilizando un aparato Becton Dickinson LSRII (Becton Dickinson, San José, CA).
Cuadro 44: Afinidad de Unión de Anticuerpos Parentales anti-EGFR y Construcciones de DVD-lg a la Línea de Célula A431. EGFR mediante FACS Todas las DVDs se unieron a sus objetivos de superficie celular. Los dominios N-terminales de DVDs se unieron a sus objetivos en la superficie celular así como al anticuerpo parental.
Cuadro 45: Afinidad de Unión de Anticuerpos Parentales anti-EGFR y Construcciones de DVD-lg a la Línea de Célula BAFvar3 mediante FACS Todas las DVDs se unieron a sus objetivos de superficie celular. Los dominios N-terminales de DVDs se unieron a sus objetivos en la superficie celular así como al anticuerpo parental.
Cuadro 46: Afinidad de Unión de 7 Construcciones de DLL4/VEGF DVD-lg y el Anticuerpo Parental a la Línea de Célula DLL4 293G-humana mediante FACS Todas las DVDs se unieron a su objetivo de superficie celular (DLL4). Los dominios de unión DLL4 N- y C-terminales de DVDs unieron sus objetivos en la superficie celular así como el anticuerpo parental.
Ejemplo 1.2: Generación de Anticuerpos onoclonales Parentales para un Antígeno Humano de Interés A continuación se presenta como se obtuvieron mAbs de ratón parentales capaces de unión a y neutralizar un antígeno humano de interés y una variante del mismo: Ejemplo 1.2. A: Inmunización de Ratones con un Antígeno Humano de Interés Se inyectaron, subcutáneamente, veinte microgramos de antígeno humano purificado recombinante (por ejemplo, IGF1.2) mezclados con auxiliar completo de Freund o auxiliar Immunoeasy (Qiagen, Valencia, CA) a cinco ratones Balb/C de 6-8 semanas de edad, y cinco ratones AJ, en el Día 1. En los días 24, 38, y 49, se inyectaron, simultáneamente, a los mismos ratones, veinte microgramos de variante de antígeno humano purificado recombinante mezclado con auxiliar incompleto de Freund o auxiliar Immunoeasy. En el día 84 ó día 112 ó día 144, los ratones se inyectaron intravenosamente con 1 µ de antígeno humano purificado recombinante de interés.
Ejemplo 1.2.B: Generación de un Hibridoma Se fusionaron esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados descritos en el Ejemplo 1.2. A con células SP2/0-Ag-14 a una relación de 5:1 de acuerdo con el método descrito por Kohler, G. y Mílstein (1975) Nature, 256:495, para generar hibridomas. Los productos de fusión se colocaron en placas en un medio de selección conteniendo azaserina e hipoxantína en placas de 96 cavidades a una densidad de 2.5 x 106 células de bazo por cavidad. Después de siete a diez días de la fusión, se observaron colonias de hibridoma macroscópicos. El sobrenadante de cada cavidad conteniendo colonias de hibridoma se probó a través de ELISA para la presencia de anticuerpo para el antígeno de interés (como se describe en el Ejemplo 1.1.1. A). Los sobrenadantes que exhiben actividad específica de antígeno, después se probaron para la actividad (como se describe en los ensayos del Ejemplo 1.1.2), por ejemplo, la habilidad de neutralizar el antígeno de interés en un bioensayo tal como aquel descrito en el Ejemplo, 1.1.2.1).
Ejemplo 1.2.C: Identificación y Caracterización de Anticuerpos ivionoclonales Parentales para un Antígeno Objetivo Humano de Interés Ejemplo 1.2.C.1: Análisis de Actividad de Neutralización de Anticuerpo Monoclonal Parental Se analizaron sobrenadantes de hibridoma para la presencia de anticuerpos parentales que unen un antígeno de interés, generados de acuerdo con los Ejemplos 1.2. A y 1.2.B, y también son capaces de unir una variante del antígeno de interés ("variante de antígeno"). Después, los sobrenadantes con anticuerpos positivos en ambos ensayos, se probaron para su potencia de neutralización de antígeno, por ejemplo, en el bioensayo de citocina del Ejemplo 1.1.2.1. Los anticuerpos de producción de hibridomas con valores de IC50 en el bioensayo menores que 1000 pM, en una modalidad, menores que 100 pM se escalaron y se clonaron a través de dilución de limitación. Las células de hibridoma se expandieron en el medio conteniendo suero de bovino fetal al 10% con bajo contenido de I g G (Hyclone #SH30151, Logan, UT). En promedio 250 mi de cada sobrenadante de hibridoma (derivado de una población clonal) se cosecharon, se concentraron y se purificaron a través de cromatografía de afinidad de proteína A, como se describe por Harlow, E. y Lañe, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual". La habilidad de los mAbs purificados para inhibir la actividad de su antígeno objetivo se determinó, por ejemplo, utilizando el bioensayo de citocina como se describe en el Ejemplo 1.1.2.1.
Ejemplo 1.2.C.2: Análisis de Reactividad Cruzada de Anticuerpo Monoclonal Parental para Antígeno de Interés de Cinomolgo Objetivo Para determinar si los mAbs seleccionados, como se describe aquí, reconocen al antígeno de interés de cinomolgo, se condujo el análisis BIACORE como se describe aquí (Ejemplo 1.1.1.G) utilizando un antígeno objetivo de cinomolgo recombinante. Además, las potencias de neutralización de mAbs contra el antígeno de interés de cinomolgo recombinante también se midieron en el bioensayo de citocina (Ejemplo 1.1.2.1). Los mAbs con buena reactividad cruzada "cyno" (en una modalidad, con 5 veces de reactividad para antígeno humano) se seleccionaron para caracterización futura.
Ejemplo 1.2.D: Determinación de la Secuencia de Aminoácido de la región Variable para cada Anticuerpo Monoclonal Anti-humano de Murino El aislamiento de los ADNcs, expresión y caracterización de los mAbs de ratón anti-humanos recombinantes se condujo como sigue. Para cada determinación de secuencia de aminoácido, aproximadamente 1 x 106 células de hibridoma se aislaron mediante centrifugación y se procesaron para aislar el ARN total con Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se sometió a síntesis de ADN de primera estructura de cadena utilizando el sistema Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó oligo(dT) para iniciar la síntesis de primera estructura de cadena para seleccionar poli)A) + ARN. El producto de ADN de primera estructura de cadena después se amplificó a través de PCR con iniciadores diseñados para la amplificación de regiones variables de inmunoglobulina de murino (Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, Wl). Los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa, se extirparon, se purificaron, y después se sub-clonaron con el equipo TOPO Cloning al vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron a E. coli químicamente potente TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realizó la PCR de colonia en los transformantes para identificar clones conteniendo un inserto. El ADN de plásmido se aisló de los clones conteniendo inserto utilizando u n equipo QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Los insertos en los plásmidos se secuenciaron en ambas estructuras de cadena para determinar las secuencias de ADN de cadena pesada variable o de cadena ligera variable utilizando iniciadores de avance M13 y de reversa M13 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Se identificaron secuencias de cadena pesada variable y de cadena ligera variable de los mAbs. En una modalidad, los criterios de selección para un panel de mAbs principales para el siguiente paso de desarrollo (humanización) incluyen los siguientes: ? El anticuerpo no contiene ningún sitio de glicosilación N-enlazado (NXS), excepto de uno de estructura de cadena en CH2 ? El anticuerpo no contiene ninguna cisteína extra además de las cisternas normales en cada anticuerpo ? La secuencia de anticuerpo está alineada con las secuencias de línea germinal humanas más c ercanas para VH y VL y cualquier aminoácido inusual debe ser verificado para ocurrencia en otros anticuerpos humano naturales ? La glutamina N-terminal (Q) se cambia a ácido Glutámico (E) si no afecta la actividad del anticuerpo. Esto reducirá la heterogeneidad debido a la ciclización de Q ? La escisión de secuencia de señal eficiente se confirmó a través de Espectrofotometría Masiva. Esto puede realizarse con material de células COS o de células 293 ? La secuencia de proteína se verificó para riesgo de desamidación de Asn que puede dar como resultado la pérdida de actividad El anticuerpo tiene un bajo nivel de agregación El anticuerpo tiene una solubilidad >5-10 mg/ml (en la fase de investigación); >25 mg/ml El anticuerpo tiene un tamaño normal (5-6 nm) a través de Diseminación de Luz Dinámica (DLS) El anticuerpo tiene una heterogeneidad de carga baja El anticuerpo carece de liberación de citocina (ver Ejemplo 1.1.2.B) El anticuerpo tiene especificidad para la citocina pretendida (ver Ejemplo 1.1.2.C) El anticuerpo carece de reactividad cruzada de tejido inesperada (ver Ejemplo 1.1.2.D) El anticuerpo tiene similitud entre la reactividad cruzada de tejido humano y de cinomolgo (ver Ejemplo 1.1.2.D) Ejemplo 1.2.2: Anticuerpos Parentales Humanizados Recombinados Ejemplo 1.2.2.1: Construcción y Expresión de Anticuerpos Parentales Anti-humanos Quiméricos Recombinantes El ADN que codifica la región constante de cadena pesada de mAbs parentales anti-humanos de murino se reemplazó a través de un fragmento de ADNc que codifica la región constante de I g G 1 humana conteniendo 2 mutaciones de aminoácido de región de gozne a través de recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración EU) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). La región constante de cadena ligera de cada uno de estos anticuerpos se reemplaza por una región kappa humana. Los anticuerpos quiméricos de longitud completa son pasajeramente expresados en células COS a través de co-transfección de ADNcs de cadena pesada y ligera quiméricos ligados al plásmido de expresión pBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pág 5322). Los sobrenadantes de célula conteniendo el anticuerpo quimérico recombinante se purificaron a través de cromatografía de Proteína A Sepharose y el anticuerpo unido se eluyó a través de la adición de regulador de pH ácido. Los anticuerpos se neutralizaron y se dializaron a PBS.
El ADNc de cadena pesada que codifica un mAb quimérico es co-transfectado con su ADNc de cadena ligera quimérico (ambos ligados en el vector pBOS) en células COS. El sobrenadante de célula conteniendo el anticuerpo quimérico recombinante se purificó a través de cromatografía de Proteína A Sepharose y el anticuerpo unido se eluyó a través de la adición de regulador de pH ácido. Los anticuerpos se neutralizaron y se dializaron en PBS.
Los mAbs parentales anti-humanos quiméricos purificados después se probaron para su habilidad para unión (a través de Biacore) y para actividad funcional, por ejemplo, para inhibir la producción de IgE inducida por citocina como se describe en los Ejemplos 1.1.1.G y 1.1.2.B. los mAbs quiméricos que mantienen la actividad de los mAbs de hibridoma parentales se seleccionan para desarrollo futuro.
Ejemplo 1.2.2.2: Construcción y Expresión de Anticuerpos Parentales Anti-humanos Humanizados Ejemplo 1.2.2.2. A: Selección de Estructuras de Marco de Anticuerpo Humano Cada secuencia de gen de cadena pesada variable y cadena ligera variable de murino se alineó separadamente contra 44 secuencias de cadena pesada variable de línea germinal ó 46 secuencias de cadena ligera variable de línea germinal de ¡nmunoglobulina humana (derivadas del sitio web NCBI Ig Blast en ht p://www. ncbi.nlm.noh.gov/retrieveig.html.) utilizando el software Vector NTI.
La humanización se basó en la homología de secuencia de aminoácido, análisis de grupo de CDR, frecuencia de uso entre anticuerpos humanos expresados, e información variable sobre las estructuras de cristal de anticuerpos humanos. Tomando en cuenta los posibles efectos de la unión de anticuerpo, la formación en pares de VH-VL, y otros factores, se mutaron residuos de murino a residuos humanos, en donde los residuos de estructura de marco de murino y humanos son diferentes, con pocas excepciones. Se diseñaron estrategias de humanización adicionales basándose en un análisis de secuencias de anticuerpo de línea germinal humanas, p un subgrupo de las mismas, que poseen un alto grado de homología, es decir, similitud de secuencia, a la secuencia de aminoácido real de las regiones variables de anticuerpo de murino.
La modelación de homología se utiliza para identificar residuos únicos a las secuencias de anticuerpo de murino que se pronostica que son críticos para la estructura del sitio de combinación de anticuerpo, las CDRs. La modelación de homología es un método computacional mediante el cual se generan coordenadas tridimensionales aproximadas para una proteína. La fuente de coordenadas iniciales y guía para su refinación adicional en una segunda proteína, la proteína de referencia, para la cual son conocidas las coordenadas tridimensionales y la secuencia de las cuales se relaciona con la secuencia de la primera proteína. La relación entre las secuencias de las dos proteínas se utiliza para generar una correspondencia entre la proteina de referencia y la proteína para la cual se desean las coordenadas, la proteína objetivo. Las secuencias primarias de las proteínas de referencia y objetivo se alinean con coordenadas de porciones idénticas de las dos proteínas transferidas directamente desde la proteína de referencia a la proteína objetivo. Las coordenadas para porciones no coincidentes de las dos proteínas, por ejemplo, desde mutaciones de residuo, inserciones o eliminaciones, se construyen a partir de plantillas estructurales genéricas y energía refinada para asegurar la consistencia con las coordenadas de modelo ya transferidas. Esta estructura de proteína computacional además puede ser refinada o empleada directamente en estudios de modelación. La calidad de la estructura de modelo se determina a través de la exactitud de la contención con la que las proteínas de referencia y objetivo están relacionadas y la precisión con la cual se construye la alineación de secuencia.
Para mAbs de murino, se utiliza una combinación de búsqueda BLAST e inspección visual para identificar estructuras de referencia adecuadas. La identidad de secuencia de 25% entre las secuencias de aminoácido de referencia y objetivo se considera el mínimo necesario para intentas un ejercicio de modelación de homología. Las alineaciones de secuencia se construyen manualmente y se generan coordenadas de modelo con el programa Jackal (ver, Petrey, D. et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6): 430-435).
Las secuencias primarias de las regiones de estructura de marco de murino y humanas de los anticuerpos seleccionados comparten identidad significante. Las posiciones de residuo que difieren son candidatos para la inclusión del residuo de murino en la secuencia humanizada con el fin de retener la potencia de unión observada del anticuerpo de murino. Una lista de residuos de estructura de marco que difieren entre las secuencias humanas y de murino se construye manualmente. El Cuadro 16 muestra las secuencias de estructura de marco elegidas para este estudio.
Cuadro 47: Secuencia de Dominio Constante de Cadena Pesada y de Dominio Constante de Cadena Ligera de IgG Humana La probabilidad de que un residuo de estructura de marco dado pueda impactar las propiedades de unión del anticuerpo depende de su proximidad a los residuos de CDR. Por lo tanto, al utilizar las estructuras de modelo, los residuos que difieren entre las secuencias de murino y humanas se clasifican de acuerdo con su distancia desde cualquier átomo en las CDRs. Aquellos residuos que caen dentro de 4.5 A de cualquier átomo de CDR se identifican como loas más importantes y son recomendados para ser candidatos para la retención del residuo de murino en el anticuerpo humanizado (es decir, retro-mutación).
Los anticuerpos humanizados construidos ¡n silico se construyen utilizando oligonucleótidos. Para cada ADNc de región variable, se diseñan 6 oligonucleótidos de 60-80 nucleótidos para traslaparse entre sí por 20 nucleótidos en el extremo 5' y/ó 3' de cada oligonucleótido. En una reacción de clasificación, los 6 oligonucleótidos se combinan, hierven y se clasifican en presencia de dNTPs. Se agregó ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) para llenar huecos de aproximadamente 40 bp entre los oligonucleótidos traslapantes. Se realizó la PCR para amplificar el gen de región de variable entera utilizando dos iniciadores muy extremos conteniendo secuencias colgantes complementarias al sitio de clonación múltiple en un vector pBOS modificado (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17). Los productos de PCR derivados de cada ensamble de ADNc se separaron en un gel de agarosa y la banda que corresponde al tamaño del ADNc de región variable pronosticada se extirpó y se purificó. La región de cadena pesada variable se insertó en marco sobre un fragmento de ADNc que codifica la región constante de I g G 1 humana conteniendo dos mutaciones de aminoácido de región de gozne a través de recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones sin una cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración EU) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 1.47:2657). La región de cadena ligera variable se insertó en marco con la región constante kappa humana a través de recombinación homologa. Se aislaron colonias bacterianas y el ADN de plásmido se extrajo. Los insertos de ADNc se secuenciaron en su totalidad. Las cadenas pesadas y ligeras humanizadas correctas que corresponden a cada anticuerpo se co-transfectaron en células COS para producir pasajeramente anticuerpos anti-humanos humanizados de longitud completa. Los sobrenadantes de célula conteniendo un anticuerpo quimérico recombinante se purificaron a través de cromatografía de Proteína A Sepharose y el anticuerpo unido se eluyó a través de la adición de regulador de pH ácido. Los anticuerpos se neutralizaron y se dializaron en PBS.
Ejemplo 1.2.2.3: Caracterización de Anticuerpos Humanos Se determinó la habilidad de los anticuerpos humanizaos purificados para inhibir una activad funcional, por ejemplo, utilizando el bioensayo de citocina como se describe en los Ejemplos 1.1.2.A-Las afinidades de unión de los anticuerpos humanizados al antígeno humano recombinante se determinaron utilizando mediciones de resonancia de plasmón superficial (Biacore®) como se describe en el Ejemplo 1.1.1.B. Los valores de IC50 de los bioensayos y la afinidad de los anticuerpos humanizados se clasificaron. Los mAbs humanizados que totalmente mantuvieron la actividad de los mAbs parentales de hibridoma se seleccionaron como candidatos para desarrollo futuro. Los 2-3 mAbs humanizados más favorables además fueron caracterizados.
Ejemplo 1.2.2.3. A: Análisis Farmacocinético de Anticuerpos Humanizados Se realizaron estudios farmacocinéticos en ratas Sprague-Dawley y monos cinomolgos. Se dosificaron, intravenosa o subcutáneamente, ratas macho y hembra y monos cinomolgos con una sola dosis de 4 mg/kg de mAb y se analizaron las muestras utilizando ELISA de captura de antígeno, y se determinaron los parámetros farmacocinéticos a través de análisis de no compartimento. En resumen, las placas de ELISA se cubrieron con anticuerpo anti-biotina de cabra (5 mg/ml, 4°C, durante la noche), se bloquearon con Superblock (Pierce), y se incubaron con antígeno humano biotinilado a 50 ng/ml en Superblock TTBS al 10% a temperatura ambiente durante 2 horas. Las muestras de suero se diluyeron en serie (0.5% suero, Superblock al 10% en TTBS) y se incubaron sobre la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se realizaron detecciones con anticuerpo anti-humano de cabra marcado con HRP y se determinaron las concentraciones con la ayuda de curvas estándares utilizando el ajuste logística de cuatro parámetros. Se determinaron los valores para los parámetros farmacocinéticos a través del modelo de no compartimento utilizando el software WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Se seleccionaron mAbs humanizados con un buen perfil farmacocinético (T1/2 es 8-14 días o mejor, con baja eliminación y excelente biodisponibilidad 50-100%).
Ejemplo 1.2.2.3.B: Análisis Físico-Químico y Estabilidad In Vitro de Anticuerpos Monoclonales Humanizados Cromatografía de exclusión de tamaño Se diluyeron anticuerpos a 2.5 mg/ml con agua y 20 mi se analizaron en un sistema Shimadzu HPLC utilizando una columna de G3000 SWXL de gel TSK (Toso Bioscience, cat# k5539-05k). Se eluyeron muestras de la comuna con 211 mM de sulfato de sodio, 92 mM de fosfato de sodio, pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 ml/minutos. Las condiciones de operación del sistema HPLC son las siguientes: Fase móvil: 211 mM Na2S04, 92 mM Na2HP04*7H20, pH 7.0 Gradiente: Isocrático Velocidad de flujo: 0.3 mi /minuto Detector de longitud de onda: 280 nm Temp. enfriador de auto-muestreador: 4°C Temp. de horno de columna: ambiente Tiempo de operación: 50 minutos El Cuadro 48 contiene datos de pureza de anticuerpos parentales y construcciones de DVD-lg expresados como porcentaje de monómero (proteína no agregada del peso molecular esperado) según determinado por el protocolo anterior.
Cuadro 48: Pureza de Anticuerpos Parentales y_ Construcciones de DVD-lg según Determinado a través de Cromatografía de Exclusión de Tamaño Las DVD-lgs mostraron un excelente perfil de SEC con la mayoría de las DVD-lg mostrando >90% de monómero. Este perfil de DVD-lg es similar a aquel observado para anticuerpos parentales.
Cuadro 49: Pureza de Construcciones de VEGF/DLL$ DVD-lg según Determinado a través de Cromatografía de Exclusión de Tamaño Las DVD-lgs mostraron un excelente perfil de SEC con la mayor parte de la DVD-lg mostrando >90% de monómero. Este perfil de DVD-lg es similar a aquel observado para anticuerpos parentales.
SDS-PAGE Los anticuerpos se analizaron a través de electroforesis de dodecil sulfato-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones tanto de reducción como de no reducción. Se utilizó adalimumab lote AFP04C como un control. Para condiciones de reducción, las muestras se mezclaron 1:1 con 2X regulador de pH de muestra de SDS-PAGE de tris-glicina (Invitrogen, cat# LC2676, lote # 1323208) con 100 mM DTT, y se calentaron a 60°C durante 30minutos. Para condiciones de no reducción, las muestras se mezclaron 1:1 con regulador de pH de muestra y se calentaron a 100°C durante 5 minutos. Las muestras reducidas (10 mg por carril) se cargaron en un gel de tris-glicina pre-colado al 12% (Invitrogen, cat# EC6005caja, lote # 6111021), y las muestras no reducidas (10 mg por carril) se cargaron en un gel de tris-glicina pre-colado al 8 % - 16 % (Invitrogen, cat# EC6045caja, lote # 6111021). Se utilizó SeeBlue Plus (Invitrogen, cat# LC5925, lote # 1351542) como un marcador de peso molecular. Los geles se corrieron en una caja de gel de mini-célula XCell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y las proteínas se separaron aplicando primero un voltaje de 75 para apilar las muestras en el gel, seguido por un voltaje constante de 125 hasta que el colorante frontal llegó al fondo del gel. El regulador de pH de corrida usado fue regulador de pH 1X tris-glicina SDS, preparado a partir de un regulador de pH 10X tris-glicina SDS (ABC, MPS-79-080106). Los geles se tiñeron durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destiñeron con agua Milli-Q hasta que el fondo se aclaró. Los geles teñidos después se escanearon utilizando un escáner Epson Expression (modelo 1680, S/N DASX003641).
Análisis de Velocidad de Sedimentación Se cargaron anticuerpos en la cámara de muestra de cada una de las tres piezas centrales estándares de carbón epon de dos sectores. Estas piezas centrales tiene una longitud de trayectoria óptica de 1.2 centímetros y se construyen con ventanas de zafiro. Se utilizó PBS para un regulador de pH de referencia y cada cámara contuvo 140 pL. Todas las muestras se examinaron simultáneamente utilizando un rotor de 4 agujeros (??-60??) en una ultracentrífuga analítica Beckman ProteomeLab XL-I (serie # PL106C01).
Las condiciones de operación se programaron y se realizó un control de centrífuga utilizando ProteomeLab (v5.6). Las muestras y el rotor se dejaron equilibrar térmicamente durante una hora para análisis (20.0 + O.TC). Se realizó la confirmación de carga de célula apropiada a 3000 rpm y se registró una escaneada individual para cada célula. Las condiciones de velocidad de sedimentación son como sigue: Volumen de célula de muestra: 420 mi Volumen de célula de referencia: 420 mi Temperatura: 20°C Velocidad de rotor: 35,000 rpm Tiempo: 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nm Tamaño de paso radial: 0.003 cm Colección de datos: un punto de datos por paso sin promedio de señal Número total de escaneadas: 100 Medición de peso molecular LC- S de anticuerpos intactos Se analizaron los pesos moleculares de anticuerpos intactos a través de LC-MS. Cada anticuerpo se diluyó a aproximadamente 1 mg/ml con agua. Se utilizó un sistema 1100 HPLC (Agilent) con una micro-trampa de proteína (Michrom Bioresources, Inc. cat # 004/25109/03) para desalar y se introdujeron 5 mg de la muestra en un espectrómetro masivo API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se utilizó un gradiente corto para eluir las muestras. El gradiente se corrió con una fase móvil A (0.08% FA, 0.02% TFA en agua de HPLC) y una fase móvil B (0.08% FA y 0.02% TFA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro masivo se operó a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con una escala de escaneo de 2000 a 3500, relación de masa a carga.
Medición de peso molecular LC-MS de cadenas ligera y pesada de anticuerpo Se analizaron las mediciones de peso molecular de anticuerpo de cadena ligera (LC), cadena pesada (HC) y HC desglicosilada a través de LC-MS. El anticuerpo se diluyó a 1 mg/ml con agua y ia muestra se redujo a LC y HC con una concentración final de 10 mM DTT durante 30 minutos a 37°C. Para desglicosilar el anticuerpo, 100mg del anticuerpo se incubaron con 2 mi de PNGase F, 5 mi de N-octilglucósido al 10% en un volumen total de 100 mi durante la noche a 37°C. Después de la desglicosilación, la muestra se redujo con una concentración final de 10 mM DTT durante 30 minutos a 37°C. Se utilizó un sistema Agilent 1100 HPLC con una columna C4 (Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) para desalar e introducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro masivo API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se utilizó un gradiente corto para eluir la muestra. El gradiente se operó con una fase móvil A (0.08% FA, 0.02% TFA en agua de HPLC) y una fase móvil B (0.08% FA y 0.02% TFA en acetonitri lo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro masivo se operó a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con una escala de escaneo de 800 a 3500, relación de masa a carga.
Mapeo de péptido El anticuerpo se desnaturalizó durante 15 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de 6M clorhidrato de guanidina en 75 mM bicarbonato de amonio. Las muestras desnaturalizadas se redujeron con una concentración final de 10 m DTT a 37°C durante 60 minutos, seguido por alquilación con 50 mM ácido yodoacético (IAA) en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Después de la alquilación, la muestra se dializó durante la noche contra cuatro litros de 10 mM bicarbonato de amonio a 4°C. La muestra dializada se diluyó a 1 mg/ml con 10 mM bicarbonato de amonio, pH 7.8 y 100 mg de anticuerpo fueron digeridos con tripsina (Promega, cat# V5111) o Lys-C (Roche, cat# 11047 825 001) a una relación de 1:20 (p/p) tripsina/Lys-C:anticuerpo a 37°C durante 4 horas. Las digestiones se extinguieron con 1 mi de 1N HCI. Para el mapeo de péptido con detección de espectrómetro masivo, se separaron 40 mi de las digestiones a través de cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa (RPHPLC) en una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51, S/N NE9606 10.3.4) con un sistema Agilent 1100 HPLC. La separación de péptido se operó con un gradiente utilizando una fase móvil A (0.02% TFA y 0.08% FA en agua de HPLC) y una fase móvil B (0.02% TFA y 0.08% FA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro masivo API QSTAR Pulsar i se operó en un modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y una escala de escaneo de 800 a 2500, relación de masa a carga.
Mapeo de Enlace de Disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo, se mezclaron 100 mi del anticuerpo con 300 mi de 8 M HCI de guanidina en 100 mM bicarbonato de amonio. El pH se verificó para asegurar que está entre 7 y 8 y las muestras se desnaturalizaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en una concentración final de 6 M HCI de guanidina. Una porción de la muestra desnaturalizada (100 mi) se diluyó a 600 mi con agua Milli-Q para dar una concentración final de HCI de guanidina de 1M. La muestra (220 mg) fue digerida con tripsina (Promega, cat# V5111, lote # 22265901 ) o Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lote # 12808000) a relaciones (p/p) de 1:50 tripsina ó 1:50 Lys-C:anticuerpo (4.4 mg enzima: 220 mg muestra) a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Se agregaron 5 mg adicionales de tripsina o Lys-C a las muestras y la digestión se dejó proseguir durante 2 horas más a 37°C. Las digestiones se detuvieron agregando 1 mi de TFA a c ada muestra. Las muestras digeridas se separaron a través de RPHPLC utilizando una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51 S/N N E020630- 1 - 1 A) en un sistema Agilent HPLC. La separación se operó con el mismo gradiente utilizado para el mapeo de péptido utilizando una fase móvil A (0.02% TFA y 0.08% FA en agua de HPLC) y una fase móvil B (0.02% TFA y 0.08% FA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Las condiciones de operación de HPLC fueron iguales a aquellas utilizadas para el mapeo de péptido. El espectrómetro masivo API QSTAR Pulsar i se operó en un modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y a una escala de escaneo de 800 a 2500, relación de masa a carga. Se asignaron enlaces de disulfuro haciendo coincidir los MWs observados de los péptidos con los MWs pronosticados de péptido trípticos o Lys-C unidos a través de enlaces de disulfuro.
Determinación de sulfhidrilo libre El método utilizado para cuantificar cisteínas libres en un anticuerpo se basa en la reacción del reactivo Ellman, ácido 5,5a-ditio-bis-(2-nitrobenzoico), con grupos sulfhidrilo (SH), que da surgimiento a un producto cromofórico característico, ácido 5-tio-(2-nitrobenzoico) (TNB). La reacción se ilustra con la fórmula: DTNB + RSH ® RS-TNB + T B- + H + La absorbancia del TNB- se midió a 412 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 50. Se trazó una curva de absorbancia utilizando diluciones de 2-mercaptoetanol (b-ME) como el estándar de SH libre y se determinaron las concentraciones de los grupos sulfhidrilo libre en la proteína a partir de la absorbancia a 412 nM de la muestra.
Se preparó un abastecimiento del estándar b-ME a través de una dilución en serie de 14.2 M b-ME con agua de grado HPLC a una concentración final de 0.142 mM. Después, se prepararon estándares por triplicad para cada concentración. El anticuerpo se concentró a 10 mg/ml utilizando un filtro de centrífuga amicon ultra 10,000 MXCO (Millipore, cat# UFC801096, lote # L3KN5251) y el regulador de pH se cambió al regulador de pH de formulación utilizado para adalimumab (5.57 mM fosfato de sodio monobásico, 8.69 mM fosfato de sodio dibásico, 106.69 mM NaCI. 1.07 mM citrato de sodio, 6.45 mM ácido cítrico, 66.68 mM manitol, pH 5.2, 0.1% (p/v) Tween). Las muestras se mezclaron en un agitador a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, se agregaron 180 mi de 100 mM regulador de pH Tris, pH 8.1, a cada muestra y estándar seguido por la adición de 300 mi de 2 mM DTNB en 10 mM regulador de pH de fosfato, pH 8.1. Después del mezclado, las muestras y los estándares se midieron para absorción a 412 nm en un espectrofotómetro Cary 50. Se obtuvo una curva estándar graficando la cantidad de SH libre y OD412 n m de los estándares de b-ME. Se calculó el contenido de SH libre basándose en esta curva después de la substracción del manto.
Cromatografía de Intercambio de Catión Débil El anticuerpo se diluyó a 1 mg/ml con 10 mM fosfato de sodio, pH 6.0. Se analizó la heterogeneidad de carga utilizando un sistema Shimadzu HPLC con una columna analítica WCX-10 ProPac (Dionex, cat# 054993, S/N 02722). Las muestras se cargaron en la columna en 80% de fase móvil A (10 mM fosfato de sodio, pH 6.0) y 20% de fase móvil B (10 mM fosfato de sodio, 500 mM NaCI, pH 6.0) y se eluyeron a una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto.
Perfil de Oligosacárido Los oligosacáridos libreados después del tratamiento PNGase F del anticuerpo se derivatizaron con el reactivo de marcación 2-aminobenzamida (2-AB). Los oligosacáridos marcados fluorescentes se separaron a través de cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase normal (NPHPLC) y se caracterizaron las diferentes formas de oligosacáridos basándose en la comparación de tiempo de retención con estándares conocidos.
El anticuerpo primero fue digerido con PNGase para separar los oligosacáridos N-enlazados de la porción Fe de la cadena pesada. El anticuerpo (200 mg) se colocó en un tubo de Eppendorf de 500 mi junto con k2 mi dé PNGase F y 3 mi de N-octilglucósido al 10%. Se agregó salina regulada en su pH con fosfato para dar el volumen final de 60 mi. La muestra se incubó durante la noche a 37°Cen un termo-mezclador Eppendorf fijado a 700 PM. También el adalimumab, lote AFP04C, fue digerido con PNGase F como un control.
Después del tratamiento con PNGase F, las muestras se incubaron a 95°C durante 5 minutos en un termo-mezclador Eppendorf fijado a 750 RPM para precipitar las proteínas, después las muestras se colocaron en una centrífuga de Eppendorf durante 2 minutos a 10,000 RPM para hacer girarlas proteínas precipitadas. El sobrenadante conteniendo los oligosacáridos se transfirió a un tubo de Eppendorf de 500 mi y se secó en un velocidad-vac a 65°C.
Los oligosacáridos se marcaron con 2AB utilizando un equipo de marcación 2AB comprado en Prozyme (cat# GKK-404, lote # 132026). El reactivo de marcación se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agregó ácido acético (150 mi, provisto en el equipo) al frasco de DMSO (provisto en el equipo) y se mezcló mediante una pipeta con la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces. La mezcla de ácido acético/DMSO (100 mi) se transfirió a un frasco de colorante de 2AB (justo antes de uso) y se mezcló hasta que el colorante se disolvió completamente. La solución de colorante después se agregó a un frasco de un reductor (provisto en el equipo) y se mezcló bien (reactivo de marcación). El reactivo de marcación (5 mi) se agregó a cada frasco de muestra de oligosacárido seco, y se mezcló concienzudamente. Los frascos de reacción se colocaron en un termo-mezclador de Eppendorf fijado a 65°C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción.
Después de la reacción de marcación, se removió el exceso de colorante fluorescente utilizando cartuchos GlycoClean S de Prozyme (cat# GKI-4726). Antes de la adición de las muestras, los cartuchos se lavaron con 1 mi de agua Milli-Q seguido por 5 lavados de 1 mi de una solución de ácido acético al 30%. Justo antes de agregar las muestras, se agregó 1 mi de acetonitrilo (Burdick and Jackson, cat# AH015-4) a los cartuchos.
Después de que todo el acetonitrilo se hizo pasar a través del cartucho, la muestra se salpicó sobre el centro del disco recientemente lavado y se dejó absorber en el disco durante 10 minutos. El disco se lavó con 1 mi de acetonitrilo seguido por cinco lavados de 1 mi de acetonitrilo al 96%. Los cartuchos se colocaron sobre un tubo de Eppendorf de 1.5 mi y los oligosacáridos marcados con 2-AB se eluyeron con 3 lavados (400 mi cada lavado) de agua • Milli-Q.
Los oligosacáridos se separaron utilizando una columna Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) conectada a un sistema Shimadzu HPLC. El sistema Shimadzu HPLC consistió de un controlador de sistema, desgasificador, bombas binarias, auto-muestreador con un enfriador de muestra, y un detector fluorescente.
Estabilidad a Temperaturas Elevadas El regulador de pH de anticuerpo es ya sea 5.57 mM fosfato de sodio monobásico, 8.69 mM fosfato de sodio dibásico, 106.69 mM NaCI, 1.07 mM citrato de sodio, 6.45 mM ácido cítrico, 66.68 mM manitol, 0.1% (p/v) Tween, pH 5.2; ó 10 mM histidina, 10 mM metionina, 4% manitol, pH 5.9, utilizando filtros de ultracentrífuga Amicon. La concentración final de los anticuerpos se ajustó a 2 mg/ml con los reguladores de pH apropiados. Las soluciones de anticuerpo después se esterilizaron mediante filtro y se prepararon 0.25 mi de alícuotas bajo condiciones estériles. Las alícuotas se dejaron ya sea a -80°C, 5°C, 25°C, ó 40°C, durante 1, 2, ó 3 semanas. Al final del período de incubación, las muestras se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño y SDS- PAGE.
Las muestras de estabilidad se analizaron a través de SDS- PAGE bajo condiciones tanto de reducción como de no reducción. El procedimiento utilizado fue igual al descrito aquí. Los geles se tiñeron durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destiñeron con agua Milli-Q hasta que el fondo se hizo claro. Los geles teñidos después se escanearon utilizando un escáner Epson Expression (modelo 1680, S/N DASX003641). Para obtener más sensibilidad, los mismos geles son placa teñida utilizando un equipo de tinción de plata (Owl Scientific) y se utilizaron los procedimientos recomendados por el fabricante.
Ejemplo 1.2.2.3.C: Eficacia de un Anticuerpo Monoclonal Humanizado Por Sí Mismo o en Combinación con Quimioterapia sobre el Crecimiento de Xenoinjertos de Carcinoma Humano Se desarrollaron células cancerosas humanas in vitro a un 99% de viabilidad, 85% de confluencia en matraces de cultivo de tejido. Se marcaron en la oreja y se rasuraron ratones SCID hembra y macho (Charles Rivers Labs) a 19-25 gramos. Después los ratones fueron inoculados subcutáneamente en el flanco derecho con 0.2 mi de 2 x 106 células tumorales humanas (1:1 matrigel) en el día 0 del estudio. La administración (IP, Q3D/semana) de vehículo (PBS), anticuerpo humanizado, y/o quimioterapia se inició después de que los ratones se hicieron coincidir por tamaño en jaulas separadas de ratones con volúmenes medios de tumor de aproximadamente 150 a 200 mm3. Los tumores se midieron a través de un par de calibradores dos veces a la semana, empezando aproximadamente el día 10 después de la inoculación y los volúmenes de tumor se calcularon de acuerdo con la fórmula V = L x W2/2 (V: volumen, mm3; L: longitud, mm; W: ancho, mm). La reducción en el volumen del tumor se vio en los animales tratados con mAb solo o en combinación con quimioterapia con relación a tumores en animales que solo recibieron el vehículo o un mAb de control de isotipo.
Ejemplo 1.4: Generación de una DVD-lg Se construyeron moléculas de DVD-lg capaces de unir dos antígenos, utilizando dos anticuerpos monoclonales parentales, uno contra el antígeno A humano, y el otro contra en antígeno B humano, seleccionados como se describe aquí.
Ejemplo 1.4.1: Generación de una DVD-lg Teniendo Dos Longitudes Enlazadoras Se utilizó una región constante conteniendo µ? Fe con nutaciones en 234 y 235 pará eliminar las funciones efectoras ADCC/ CDC. Se generaron cuatro diferentes construcciones DVD-lg anti-A/B: 2 con enlazador corto y 2 con enlazador largo, cada uno en dos diferentes orientaciones de dominio: VA-VB-C y VB-VA-C (ver Cuadro 50). Las secuencias enlazadoras, derivadas de la secuencia N-terminal del dominio Cl/Ck o CH1 humano, son como sigue: Para construcciones DVDAB: Cadena ligera (si anti-A tiene ?): Enlazador corto: QPKAAP (SEC ID NO: 15); Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP Cadena ligera (si anti-A tiene ?): Enlazador corto: TVAAP; Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP Cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP; Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP Para construcciones DVDBA: Cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador corto: QPKAAP; Enlazador largo: QP AAPSVTLFPP Cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador corto: TVAAP; Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP Cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP; Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP Las construcciones de cadena pesada y ligera se subclonaron en el vector de expresión pBOS, y se expresaron en células COS, seguido por la purificación a través de cromatografía de Proteína A. los materiales purificados se sometieron a análisis de SCS-PAGE y SEC.
El Cuadro 50 describe las construcciones de cadena pesada y cadena ligera utilizadas para expresar cada proteína DVD-lg anti-A/B.
Cuadro 50: Construcciones de DVD-lg anti-A/B Ejemplo 1.4.2: Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDABSL y DVDABLL: Para generar construcciones de cadena pesada DVDABHC-LL y DVDABHC-SL, el dominio VH del anticuerpo A se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3' contienen secuencia de forro corta/larga para construcciones SL/LL, respectivamente); mientras que el dominio VH del anticuerpo B se amplificó utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' contienen secuencia de forro corta/larga para construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándares. Los dos productos de PCR se purificaron con gel, y se utilizaron en conjunto como plantilla traslapante para la reacción subsecuente de PCR traslapante. Los productos de PCR traslapantes se subclonaron en un vector de expresión no de mamífero (Abbott) pBOS-hCy1,z digerido doble Srf I y Sal I utilizando un aspecto de recombinación homologa estándar.
Para generar construcciones DVDABLC-LL y DVDABLC-SL de cadena ligera, el dominio VL del anticuerpo A se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras que el dominio VL del anticuerpo B se amplificó utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándares. Los dos productos de PCR se purificaron con gel, y se utilizaron en conjunto como plantilla traslapante para la reacción subsecuente de PCR traslapante utilizando condiciones de PCR estándares. Los productos de PCR traslapantes se subclonaron en un vector de expresión de mamífero (Abbott) pBOS-hCk digerido doble Srf I y Not I utilizando un aspecto de recombinación homologa estándar. Se ha utilizado un aspecto similar para generar DVDBASL y DVDBALL como se describe a continuación: Ejemplo 1.4.3: Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDBASL y DVDBALL Para generar construcciones DVDBAHC-LL y DVDBAHC-SL de cadena pesada, el dominio VH del anticuerpo B se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras que el dominio VH del anticuerpo A se amplificó utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándares. Los dos productos de PCR se purificaron con gel, y se utilizaron en conjunto como plantilla traslapante para la reacción subsecuente de PCR traslapante utilizando condiciones de PCR estándares. Los productos de PCR traslapantes se subclonaron en el vector de expresión de no mamífero pBOS-h-Cy1 ,z digerido doble Srf I y Sal I (Abbott) utilizando un aspecto de recombinación homologa estándar.
Para generar construcciones DVDBALC-LL y DVDBALC-SL de cadena ligera, el dominio VL del anticuerpo B se amplificó mediante PCR utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras que el dominio VL del anticuerpo A se amplificó utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' contienen secuencia de forro corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándares. Los dos productos de PCR se purificaron con gel, y se utilizaron en conjunto como plantilla traslapante para la reacción subsecuente de PCR traslapante utilizando condiciones de PCR estándares. Los productos de PCR traslapantes se subclonaron en un vector de expresión de mamífero (Abbott) pBOS-hCk digerido doble Srf I y Not I utilizando un aspecto de recombinación homologa estándar.
Ejemplo 1.4.4: Construcción y Expresión de DVD-lg Adicional Ejemplo 1.4.4.1: Preparación de Construcciones de Vector DVD-lg Las secuencias de aminoácido de anticuerpo parental para anticuerpos específicos, que reconocen antígenos específicos o epítopos del mismo, para incorporación a una DVD-lg pueden ser obtenidas a través de la preparación de hibridomas como se describió anteriormente o se pueden obtener mediante la secuenciación de proteínas de anticuerpo conocidas o ácidos nucleicos. Además, se pueden obtener secuencias conocidas de la literatura. Las secuencias pueden ser utilizadas para sintetizar ácidos nucleicos utilizando síntesis de ADN o tecnologías de amplificación y ensamblando los fragmentos de anticuerpo deseados en vectores de expresión, usando tecnología de ADN recombinante estándar, para la expresión en células.
Por ejemplo, se determinaron codones de ácido nucleico a partir de secuencias de aminoácidos y el ADN de oligonucleótido se sintetizó a través de Blue Heron Biotechnology , Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, WA USA. Los oligonucleótidos se ensamblaron en fragmentos de ADN de estructura de cadena doble de 2,000 bases de pares, clonados en un vector de plásmido y verificados por secuencia. Los fragmentos clonados se ensamblaron utilizando un proceso enzimático para producir el gen completo y se subclonaron en un vector de expresión. (Ver, 7,306,914; 7 ,297,541 ; 7,279,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194 20070225227; 20070207171 ; 20070150976; 20070135620 20070128190; 20070104722; 20070092484; 20070037196 20070028321 ; 20060172404; 20060162026; 20060153791; 20030215458; 20030157643).
Un grupo de vectores pHybE (Solicitud de Patente de E.U.A.
Serie No. 61/021,282) se utilizó para la clonación del anticuerpo parental y DVD-lg. Se utilizó V1, derivado de pJP183; pHybE-hCgl,z,no-a V2, para la clonación del anticuerpo y cadenas pesadas de DVD con una región constante de tipo silvestre. Se utilizó V2, derivado de pJP191; pHybE-hCk V2, para la clonación del anticuerpo y cadenas ligeras de DVD con una región constante kappa. Se utilizó V3, derivado de pJP192; pHybE-hC1 V2, para la clonación del anticuerpo y cadenas ligeras de DVDs con una región constante lambda. Se utilizó V4, construido con un péptido de señal lambda y una región constante kappa, para la clonación de cadenas ligeras de DVD con un dominio V híbrido lambda-kappa. Se utilizó V5, construido con un péptido de señal kappa y una región constante lambda, para la clonación de cadenas ligeras de DVD con un dominio V híbrido kappa-lambda. Se utilizó V7, derivado de pJP183; pHybE-hCg1,z,no-a V2, para la clonación del anticuerpo y cadenas pesadas de DVD con una región constante muíante (234,235 AA).
Haciendo referencia al Cuadro 51, se utilizó un número de vectores en la clonación de los anticuerpos parentales y cadenas VH y VL de DVD-lg.
Cuadro 51 : Vectores Usados para Clonar Anticuerpos Parentales y DVD-lgs Ejemplo 1.4.4.2: Transfección y Expresión en Células 293 Las construcciones de vector de DVD-lg se transfectaron en células 293 para la producción de proteína DVD-lg. El procedimiento de transfección pasajera de 293 utilizado es una modificación de los métodos publicados por Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2):E9 and Pham et al. (2005) Biotech. Bioengineering 90(3):332-44. Los reactivos que se utilizaron en la transfección incluyeron: Células HEK293-6E (línea de célula de riñon embriónica humana que expresa establemente EBNA1; obtenida de National Research Council Canadá) cultivada en matraces de Erlenmeyer en un aparato de incubadora humedecida a 130 rpm, 37°C y C02 al 5%.
Medio de cultivo: Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen 12338-018) más 25 pg/ml Geneticina (G418) (Invitrogen 10131-027) y 0.1% Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032).
• Medio de transfeccion: Medio de Expresión FreeStyle 293 más 10 mM HEPES (Invitrogen 15630-080).
• Material de abastecimiento de polietilenimina (PEI): 1 mg/ml de solución de abastecimiento estéril, pH 7.0, preparada con enlazador PEI 25 kDa (Polysciences) y se almacenó a menos de -15°C.
• Medio de Alimentación de Triptona: 5% p/v de material de abastecimiento de Triptona N1 (Organotechnie, 19554) en el Medio de Expresión FreeStyle 293.
Preparación de célula para transfeccion: aproximadamente 2-4 horas antes de la transfeccion, se cosecharon células HEK 293-6E a través de centrifugación y se volvieron a suspender en un medio de cultivo a una densidad de célula de aproximadamente 1 millón de células viables por mi. Para cada transfeccion, se transfirieron 40 mi de la suspensión de célula a un matraz de Erlenmeyer de 250 mi desechable y se incubaron durante 2-4 horas.
Transfeccion: el medio de transfeccion y el material de abastecimiento PEI se pre-calentaron a temperatura ambiente (RT). Para cada transfeccion, se combinaron 25 pg del ADN de plásmido y 50 pg de polietilenimina (PEI) en 5 mi de medio de transfeccion y se incubaron durante 15-20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de ADN:PEI. Para la transfeccion de BR3-lg, se utilizaron 25 µg del plásmido BR3-lg por transfeccion. Cada mezcla de complejo de 5 mi de ADN:PEI se agregó a un cultivo de 40 mi preparado previamente y regresada al aparato de incubadora humedecida a 130 rpm, 37°C y C02 al 5%. Después de 20-28 horas, se agregaron 5 mi del Medio de Alimentación de Triptona a cada transfeccion y los cultivos se continuaron durante seis días.
El Cuadro 52 contiene los datos de producción para anticuerpos parentales o construcciones de DVD-lg expresados como miligramos por litro en células 293.
Cuadro 52: Expresión Pasajera en Producciones de Anticuerpos Parentales y Construcciones de DVD-lg en Células 293 Todas las DVDs se expresaron bien en células 293. Las DVDs pudieron ser fácilmente purificadas a través de una columna de proteína A. En la mayoría de los casos, se pudieron obtener fácilmente >5 mg/l de DVD-lg purificada a partir de sobrenadantes de células 293.
Cuadro 53: Expresión Pasajera en Producciones de Construcciones de VEGF/DLL4 DVD-lg en Células 293 Todos los DVDs se expresaron bien en células 293. Los DVDs pueden ser fácilmente purificados sobre una columna de proteína A. En la mayoría de los casos >5 mg/l de DVD-lg purificado puede ser obtenido fácilmente de los sobrenadantes de las células 293.
Ejemplo 1.4.5: Caracterización y selección principal de A/B DVD-lgs Se analizaron las afinidades de unión de DVD-lgs anti-A/B en Biacore contra tanto la proteína A como la proteína B. la propiedad tetravalente de la DVD-lg se examinó a trav.és de múltiples estudios en Biacore. Mientras, la potencia de neutralización de las DVD-lgs para la proteína A y la proteína B se determinó mediante bioensayos, respectivamente, como se describe aquí. Las moléculas de DVD-lg •que mejor retienen la afinidad y potencia de los mAbs parentales originales se seleccionaron para caracterizaciones físico-químicas y bio-analíticas (PK de rata) en profundidad, como se describe aquí para cada mAb. Basándose en la colección de análisis, la DVD-lg principal final se hizo avanzar al desarrollo de la linea de célula estable CHO, y se empleó el material derivado de CHO en estudios de estabilidad, farmacocinética y eficacia en monos cinomolgos, y actividades de pre-formulación.
Ejemplo 2: Generación Caracterización de Inmunoqlobulinas de Dominio Variable Doble (DVD-lg) Se generaron inmunoglobulinas de dominio variable doble (DVD-lg) utilizando anticuerpos con secuencias de aminoácido conocidas, sintetizando fragmentos de polinucleótido que codifica secuencias de cadena pesada variable de DVD-lg y de cadena ligera variable de DVD-lg y clonando los fragmentos a un vector pHybC-D2 de acuerdo con el Ejemplo 1.4.4.1. Las construcciones de DVD-lg se clonaron a y se expresaron en células 293 como se describe en el Ejemplo 1.4.4.2. La proteína de DVD-lg se purificó de acuerdo con métodos estándares. Se determinaron las características funcionales de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1.1.1 y 1.1.2 como se indica. A continuación se proporcionan las cadenas VH y VL de DVD-lg para las DVD-lgs de la invención.
Ejemplo 2.1: Generación de DVD-lgs CD-20 y CD-19 Cuadro 54 Ejemplo 2.2: Generación de DVD-lgs CD-20 y CD-3 (sec. 1) Cuadro 55 Ejemplo 2.3: Generación de DVD-lgs CD-20 y CD-80 Cuadro 56 Ejemplo 2.4: Generación de DVD-lgs CD-20 y CD-22 Cuadro 57 Ejemplo 2.5: Generación de DVD-lgs CD-20 y CD-40 Cuadro 58 Ejemplo 2.6: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec. 1) y HER-2 (sec. 1 ) Cuadro 59 Ejemplo 2.7: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec. 1) y CD-19 Cuadro 60 jemplo 2.8: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) y HER-2 (sec, 1 ) uadro 61 Ejemplo 2.9: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y CD-3 (sec 11 Cuadro 62 Ejemplo 2.10: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1 ,2 Cuadro 63 Ejemplo 2.11 : Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec, 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 64 Ejemplo 2.12: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec, 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 65 jemplo 2.13: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) e IGF1R (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 uadro 66 Ejemplo 2.14: Generación de DVD-lqs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 67 jemplo 2.15: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R sec. 2) con Grupo Enlazador 1 uadro 68 Ejemplo 2.16: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) e IGF1R (sec. 2) con Grupo Entazador 2 Cuadro 69 Ejemplo 2.17: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 70 jemplo 2.18: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) e IGF1R (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 71 Ejemplo 2.19: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e 1GF1R (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 72 Ejemplo 2.20: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 73 Ejemplo 2.21 : Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 74 Ejemplo 2.22: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 75 Ejemplo 2.23: Generación de DVD-lqs EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 76 Ejemplo 2.24: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 77 Ejemplo 2.25: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y RON (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 78 jemplo 2.26: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y RON (sec. ) con Grupo Enlazador 4 uadro 79 emplo 2.27: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y HGF ec. 1) uadro 80 jemplo 2.28: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y c-MET uadro 81 jemplo 2.29: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1.2 uadro 82 jemplo 2.30: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) e IGF1R uadro 83 Ejemplo 2.31: Generación de DVD-lgs RON (sec, 1) y HGF (sec. 1 ) Cuadro 84 Ejemplo 2.32: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 1) y EGFR (sec. 2) Cuadro 85 Ejemplo 2.33: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y HER-2 (sec. 1 ) Cuadro 86 Ejemplo 2.34: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y CD-20 Cuadro 87 Ejemplo 2.35: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) e IGF1.2 Cuadro 88 Ejemplo 2.36: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 1 ) Cuadro 89 jemplo 2.37: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y HGF (sec, ) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 90 Ejemplo 2.38: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 91 jemplo 2.39: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y HGF (sec. ) con Grupo Enlazador 3 uadro 92 Ejemplo 2.40: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y HGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 93 Ejemplo 2.41: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y RO (sec. 1 ) Cuadro 94 Ejemplo 2.42: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y NRP1 (sec. 1 ) Cuadro 95 Ejemplo 2.43: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y RON (sec. 2) Cuadro 96 jemplo 2.44: Generación de DVD-lqs EGFR (sec. 2) y RON (sec. 2) uadro 97 Ejemplo 2.45: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y RON (sec. 2) Cuadro 98 Ejemplo 2.46: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y HER-2 (sec. 1 ) Cuadro 99 jemplo 2.47: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y CD3 (sec. 1 ) uadro 100 Ejemplo 2.48: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) e IGF1R Cuadro 101 Ejemplo 2.49: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y RON (sec. 1 ) Cuadro 102 Ejemplo 2.50: Generación de DVD-lqs EGFR (sec. 1) y RON (sec. 2) Cuadro 103 Ejemplo 2.51 : Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y HGF (sec. 1 ) Cuadro 104 jemplo 2.52: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y c-MET uadro 105 Ejemplo 2.53: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y VEGF (sec, 1 ) Cuadro 106 Ejemplo 2.54: Generación de DVD-lqs NRP1 (sec. 2) y VEGF (sec. 1 ) Cuadro 107 emplo 2.55 Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 2) y CD-20 Cuadro 108 Ejemplo 2.56: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec, 2) y HER-2 (sec. 1 ) Cuadro 109 Ejemplo 2.57: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec. 2) y CD-19 Cuadro 110 Ejemplo 2.58: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 2) Cuadro 111 Ejemplo 2.59: Generación de DVD-lgs CD-3 (sec. 2) y EGFR (sec. 1) Cuadro 112 Ejemplo 2.60: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) e IGF1,2 Cuadro 113 Ejemplo 2.61: Generación de DVD-lgs DLL4 (sec. 1) y PLGF (sec. 1 ) Cuadro 114 Ejemplo 2.62: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 115 Ejemplo 2.63: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y PLGF Isec, 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 116 Ejemplo 2.64: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 117 jemplo 2.65: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 uadro 118 Ejemplo 2.66: Generación de DVD-lqs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 119 Ejemplo 2.67: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 120 jemplo 2.68: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 uadro 121 Ejemplo 2.69: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) y ErbB3 sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 122 jemplo 2.70: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) uadro 123 Ejemplo 2.71 : Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 1 ) Cuadro 124 jemplo 2.72: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 uadro 125 Ejemplo 2.73: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 126 jemplo 2.74: Generación de DVD-lgs EGFR (sec, 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 uadro 127 jemplo 2.75: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 128 Ejemplo 2.76: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) Cuadro 129 Ejemplo 2.77: Generación de DVD-lqs HGF (sec. 1) y ErbB3 (sec. 2) Cuadro 130 Ejemplo 2.78: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 131 Ejemplo 2.79: Generación de DVD-lgs VEGF Isec. 1) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 132 jemplo 2.80: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 uadro 133 jemplo 2.81: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 Isec. 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 134 Ejemplo 2.82: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 135 Ejemplo 2.83: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec, 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 136 Ejemplo 2.84: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 137 Ejemplo 2.85: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 138 Ejemplo 2.86: Generación de DVD-lqs VEGF (sec, 3) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 139 jemplo 2.87: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 3) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 uadro 140 Ejemplo 2.88: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 141 Ejemplo 2.89: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 142 Ejemplo 2.90: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 143 jemplo 2.91 : Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 2) y DLL4 (sec, 1) con Grupo Enlazador 2 uadro 144 Ejemplo 2.92: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 145 Ejemplo 2.93: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cudaro 146 Ejemplo 2.94: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 147 Ejemplo 2.95: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 148 jemplo 2.96: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 3) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 uadro 149 Ejemplo 2.97: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 150 Ejemplo 2.98: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 151 Ejemplo 2.99: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec, 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 152 Ejemplo 2.100: Generación de DVD-lqs VEGF (sec, 1) y DLL4 (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 153 Ejemplo 2.101 : Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 154 Ejemplo 2.102: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 155 Ejemplo 2.103: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec, 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 156 Ejemplo 2.104: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 157 Ejemplo 2.105: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 158 Ejemplo 2.106: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 2) y DLL4 (sec, 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 159 Ejemplo 2.107: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 160 jemplo 2.108: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 uadro 161 Ejemplo 2.109: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 162 jemplo 2.110: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 uadro 163 Ejemplo 2.111 : Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec, 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 164 jemplo 2.112: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 uadro 165 Ejemplo 2.113: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 166 Ejemplo 2.114: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 1) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador.2 Cuadro 167 Ejemplo 2.115: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 168 Ejemplo 2.116: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 169 Ejemplo 2.117: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 170 Ejemplo 2.118: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 2) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 171 Ejemplo 2.119: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 172 Ejemplo 2.120: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 173 Ejemplo 2.121 : Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec, 4) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 174 jemplo 2.122: Generación de DVD-lgs VEGF (sec, 3) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 2 uadro 175 Ejemplo 2.123: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 176 Ejemplo 2.124: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y DLL4 (sec. 4) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 177 jemplo 2.125: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 uadro 178 jemplo 2.126: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 uadro 179 jemplo 2.127: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 uadro 180 Ejemplo 2.128: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 181 Ejemplo 2.129: Generación de DVD-lgs HE 2 (sec, 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 182 Ejemplo 2.130: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec, 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 183 Ejemplo 2.131 : Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 184 Ejemplo 2.132: Generación de DVD-lqs HER2 (sec. 2) y ErbB3 (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 185 Ejemplo 2.133: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 186 Ejemplo 2.134: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 187 jemplo 2.135: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 uadro 188 Ejemplo 2.136: Generación de DVD-lgs EGFR (sec. 2) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 189 jemplo 2.137: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 uadro 190 Ejemplo 2.138: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 191 Ejemplo 2.139: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 192 Ejemplo 2.140: Generación de DVD-lgs HE 2 (sec. 1) y ErbB3 (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 193 Ejemplo 2.141 : Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 194 Ejemplo 2.142: Generación de DVD-lqs VEGF (sec, 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 195 Ejemplo 2.143: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 196 jemplo 2.144: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 197 Ejemplo 2.145: Generación de DVD-lqs VEGF (sec, 2) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 198 jemplo 2.146: Generación de DVD-lgs- VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 uadro 199 Ejemplo 2.147: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 200 jemplo 2.148: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 2) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 201 Ejemplo 2.149: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y PLGF (sec, 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 202 Ejemplo 2.150: Generación de DVD-lqs VEGF (sec. 3) y PLGF (sec, 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 203 Ejemplo 2.151 : Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 204 Ejemplo 2.152: Generación de DVD-lgs VEGF (sec. 3) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 205 jemplo 2.153: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 uadro 206 Ejemplo 2.154: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec, 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 207 Ejemplo 2.155: Generación de DVD-lqs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 208 jemplo 2.156: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec, 2) con Grupo Enlazador 4 uadro 209 Ejemplo 2.157: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 210 jemplo 2.158: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec, 2) con Grupo Enlazador 2 uadro 211 Ejemplo 2.159: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 212 Ejemplo 2.160: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 213 Ejemplo 2.161 : Generación de DVD-lqs PLGF (sec, 1) y VEGF (sec, 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 214 Ejemplo 2.162: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 215 Ejemplo 2.163: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 216 Ejemplo 2.164: Generación de DVD-lgs PLGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 217 Ejemplo 2.165: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 218 Ejemplo 2.166: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 219 Ejemplo 2.167: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 220 Ejemplo 2.168: Generación de DVD-lgs HER2 ísec. 1) y PLGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 221 Ejemplo 2.169: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 222 Ejemplo 2.170: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 223 Ejemplo 2.171 : Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 224 Ejemplo 2.172: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 225 Ejemplo 2.173: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 226 Ejemplo 2.174: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 227 Ejemplo 2.175: Generación de DVD-lqs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 228 Ejemplo 2.176: Generación de DVD-lqs HGF (sec. 1) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 229 jemplo 2.177: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. ) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 230 jemplo 2.178: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. ) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 231 Ejemplo 2.179: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VE6F (sec. 1) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 232 Ejemplo 2.180: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 1) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 233 Ejemplo 2.181 : Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 234 jemplo 2.182: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. ) con Grupo Enlazador 2 uadro 235 Ejemplo 2.183: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 236 Ejemplo 2.184: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 237 Ejemplo 2.185: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 238 jemplo 2.186: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. ) con Grupo Enlazador 2 uadro 239 jemplo 2.187: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec, ) con Grupo Enlazador 3 uadro 240 Ejemplo 2.188: Generación de DVD-lgs HGF (sec. 2) y VEGF (sec. 3) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 241 Ejemplo 2.189: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y HER2 (sec, 2) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 242 Ejemplo 2.190: Generación de DVD-lqs HER2 (sec. 1) y HER2 (sec, 2 con Grupo Enlazador 2 Cuadro 243 Ejemplo 2.191 : Generación de DVD-lgs HER2 (sec, 1) y HER2 (sec. 2) con Grupo Enlazador 3 Cuadro 244 Ejemplo 2.192: Generación de DVD-lgs HER2 (sec. 1) y HER2 (sec. 2) con Grupo Enlazador 4 Cuadro 245 jemplo 2.193: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 2) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 1 uadro 246 jemplo 2.194: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 3) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 1 uadro 247 Ejemplo 2.195: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 248 Ejemplo 2.196: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 3) y CD-19 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 249 Ejemplo 2.197: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 1) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 250 jemplo 2.198: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 3) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 251 jemplo 2.199: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 4) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 1 uadro 252 Ejemplo 2.200: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 4) y CD-19 (sec. 3) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 253 jemplo 2.201: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 4) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 1 Cuadro 254 jemplo 2.202: Generación de DVD-lgs CD3 (sec. 4) y CD-19 (sec. ) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 255 Ejemplo 2.203: Generación de DVD-lqs CD3 (sec. 2) y CD-19 (sec. 2) con Grupo Enlazador 2 Cuadro 256 jemplo 2.204: Generación de DVD-lgs mCD3 y CD-19 con Grupo nlazador 1 uadro 257 Ejemplo 2.205: Generación de DVD-lgs mCD3 y CD-19 con Grupo Enlazador 2 Cuadro 258 Ejemplo 2.206: Secuencias de Vector de Clonación utilizadas para Clonar Anticuerpo Parental y Secuencias de DVP-lq Cuadro 259 GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAG'TAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTAGATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC 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GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC 15 CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT 20 GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGG ACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC 25 TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTAfATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGA GGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA 15 TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC 20 GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC 25 CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC 10 GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 15 20 25 La presente invención incorpora para referencia en su totalidad, técnicas bien conocidas en el campo de biología molecular y suministro de fármaco. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Bioloqy. John Wiley & Sons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Bioloqy (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X).
Controlled Druq Bioavailability. Druq Product Design and Performance. Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999); Goodson, in Medical Applications of Controlled Reléase, vol. 2, pp. 115-138 (1984); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991); Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloqical I nterest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Kontermann and Dubel eds., Antibody Enqineerinq (2001) Springer- Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001 ) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21 -X).
Medical Applications of Controlled Reléase. Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R. W. & S. B. Primrose, Principies of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Enqineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Reléase Druq Delivery Systems, J . R . Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 Winnacker, E. L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (traducido por Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
Incorporación para Referencia Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitios web) que pueden ser citados a través de esta solicitud se incorporan aquí expresamente para referencia en su totalidad, así como las referencias citadas ahí. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y biología celular, las cuales son bien conocidas en la técnica.
Equivalentes La invención puede ser modalizada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o sus características esenciales. Las modalidades anteriores, por lo tanto, deben ser consideradas en todos los respectos ilustrativos en lugar de limita la invención descrita aquí. El alcance de la invención de esta manera está indicado por las reivindicaciones anexas en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que vienen dentro del significado y escala de equivalencia de las reivindicaciones, por lo tanto, pretenden ser abarcadas aquí.

Claims (90)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; en donde la proteina de unión es capaz de unir un par de antígenos seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; y HER-2 y HER-2.
2. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEC ID Nos: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, y 106.
3. Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comprende VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; en donde la proteína de unión es capaz de unir un par de antígenos · seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD- 19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; y HER-2 y HER-2.
4. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 y 107.
5. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en donde n es 0.
6. Una proteína de unión que comprende primera y segunda cadenas de polipéptido, en donde dicha primera cadena de polipéptido comprende un primer VD -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en donde dicha segunda cadena de polipéptido comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; en donde la proteína de unión es capaz de unir un par de antígenos seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; y HER-2 y HER-2.
7. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, y 106, y en donde los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 y 107.
8. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde X1 y X2 es una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs 1-26.
9. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proteína de unión comprende dos primeras cadenas de polipéptido y dos segundas cadenas de polipéptido.
10. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde la región Fe se selecciona del grupo que consiste de la región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia variante.
11. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la región Fe se selecciona del grupo que consiste de una región Fe de una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.
12. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde dicho VD1 de la primera cadena de polipéptido y dicho VD1 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen del mismo primer y segundo anticuerpo parental, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo.
13. La proteina de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde dicho VD1 de la primera cadena de polipéptido y dicho VD1 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen de un primer y segundo anticuerpo parental diferente, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo.
14. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde dicho VD2 de la primera cadena de polipéptido y dicho VD2 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen del mismo primer y segundo anticuerpo parental, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo.
15. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde dicho VD2 de la primera cadena de polipéptido y dicho VD2 de la segunda cadena de polipéptido se obtienen de un primer y segundo anticuerpo parentai diferente, respectivamente, o porción de unión a antígeno del mismo.
16. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dichos primero y segundo anticuerpos parentales unen diferentes epítopos en dicho antígeno.
17. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo parentai o porción de unión del mismo, une dicho primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo parentai o porción de unión de antígeno del mismo une dicho segundo antígeno.
18. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo parentai o porción de unión del mismo, une dicho primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual dicho segundo anticuerpo parentai o porción de unión de antígeno del mismo une dicho segundo antígeno.
19. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo parentai o porción de unión del mismo, y dicho segundo anticuerpo parentai o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo injertado con CDR, y un anticuerpo humanizado.
20. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerpo parentai o porción de unión del mismo, y dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan del grupo que consiste de un fragmento Fab; un fragmento F(ab')2; un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados a través de un puente de disulfuro en una región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; un fragmento dAb; una región de determinación de complementariedad aislada (CDR); un anticuerpo de cadena individual; y un diacuerpo.
21. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, ó 6, en donde dicha proteína de unión posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por dicho primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo, o dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo.
22. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros de anticuerpo.
23. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dichos parámetros se seleccionan del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión de antígeno ortóloga.
24. Una proteína de unión capaz de unir dos antígenos que comprenden cuadro cadenas de polipéptido, en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; en donde los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, y 106, y en donde los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105 y 107.
25. Una proteína de unión capaz de unir dos antígenos que comprenden cuadro cadenas de polipéptido, en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; y en donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1 ; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; en donde las DVD-lg une por lo menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste de CD-20, CD-19, CD-80, CD-22, CD-40, CD-3, receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor 1,2 de crecimiento de tipo insulina (IGF1.2), receptor de factor de crecimiento de tipo insulina (IGF1R), tirosina cinasa de receptor de proteína estimulante de macrófago (RON), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), factor de transición mesénquimal-epitelial (c-MET), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), homólogo 4 de Drosophilia Delta (DLL4), neuropilina 1 (NRP1), factor de crecimiento de placenta (PLGF), y homólogo 3 de oncogén viral de leucemia eritoblástico de ave v-erb-b2 (ErbB3).
26. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de velocidad de acción (Kon) para dicho uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102M'1 S'1 ; por lo menos aproximadamente 103M"1S"1; por lo menos aproximadamente 104M"1S"1; por lo menos aproximadamente 105M'1S"1; y por lo menos aproximadamente 106M" 1S"1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial.
27. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de velocidad sin acción (Koff) para uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 10"3s"1; por lo menos aproximadamente 10"4s'1; por lo menos aproximadamente 10"5s"1; y por lo menos aproximadamente 10"ss"1, según medido a través de resonancia de plasmón superficial.
28. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste de: a lo mucho 10"7M; a lo mucho 10"8M; a lo mucho 10"9M; a lo mucho 10'10M; a lo mucho 10"11M; a lo mucho 10" 2M| y a lo mucho 10"13M.
29. Un conjugado de proteína de unión que comprende una proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 6, 24, ó 25, en donde dicho conjugado de proteína de unión además comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de: una molécula de inmunoadhesión, un agente formador de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico.
30. El conjugado de proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho agente es un agente formador de imagen se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bio-luminiscente, una etiqueta magnética, y biotina.
31. El conjugado de proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho el agente formador de imagen es una radioetiqueta seleccionada del grupo que consiste de: 3H, 4C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 1251, 131l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm.
32. El conjugado de proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un anti-metabolito, un agente de alquilación, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.
33. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión es una proteína de unión cristalizada.
34. La proteina de unión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicho cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de vehículo.
35. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicha proteína de unión tiene una vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de dicha proteína de unión.
36. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicha proteína de unión retiene la actividad biológica.
37. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácido de proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 6, 24, ó 25.
38. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 37.
39. El vector de acuerdo con la reivindicación 38, en donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste de pcADN, pTT, pTT3 , pEFBOS, pB V, pJV, pcADN3.1 TOPO, pEF6 TOPO, y pBJ.
40. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 38.
41. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 40, en donde dicha célula huésped es una célula procariótica.
42. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 41, en donde dicha célula huésped es E. Coli.
43. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 40, en donde dicha célula huésped es una célula eucariótica.
44. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicha célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste de célula protista, célula de animal, célula vegetal y célula fúngica.
45. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicha célula eucariótica es una célula de animal seleccionada del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula de ave, y una célula de insecto.
46. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 45, en donde dicha célula huésped es una célula CHO.
47. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 45, en donde dicha célula huésped es COS.
48. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicha célula huésped es una célula de levadura.
49. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 48, en donde dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae .
50. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 45, en donde dicha célula huésped es una célula de insecto Sf9.
51. Un método para producir una proteína de unión, que comprende cultivar una célula huésped descrita en cualquiera de las reivindicaciones 40-50 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión.
52. El método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el 50%-75% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica doble.
53. El método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el 75%-90% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica doble.
54. El método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica doble.
55. Una proteína producida de acuerdo con el método de la reivindicación 51.
56. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1-36 y 55, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
57. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 56, que además comprende por lo menos un agente terapéutico adicional.
58. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 57, en donde dicho agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: agente terapéutico, agente formador de imagen, agente citotóxico, inhibidores de angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclospori na ; rapamicina; FK506; una etiqueta o reportero detectable; un antagonista de TNF; un anti-reumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-psoriático, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un radio-farmacéutico, un antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina.
59. Un método para tratar a un sujeto para una enfermedad o un trastorno, administrando al sujeto la proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1-36 y 55, de manera que el tratamiento es logrado.
60. El método de acuerdo con la reivindicación 59, en donde dicho trastorno se selecciona del grupo que comprende: artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloatropatia, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma , enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis , coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodef ¡ciencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, falla cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, síndrome de Schmídt, síndrome de dificultad respiratoria en adultos (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegatíva, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerativa, sinovitís enteropática, clamidia, yersinia y artropatía asociada con salmonella, espondiloartropatia, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosís, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgaris, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis mialgica/enfermedad Libre de Royal, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune cri ptogén ica , síndrome de ¡nm unodef ¡ciencia adquirida, enfermedades relacionadas con inmunodef ¡ciencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, ¡nmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar f i brótica , alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial pos-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemasiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis de radiación, bronquiolitis obliteran, neumonía eosinofilica crónica, enfermedad pulmonar de infiltración linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial pos-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-KLM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órgano, osteoartritis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina ¡diopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los sub-tipos), oftalmía sinpatética, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenía idiopática, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotíroidísmo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotíroidísmo autoinmune atrófico, míxidema primario, uveítís facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda, vitíligo, enfermedades crónicas del hígado, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colecistitis, enfermedad del hígado ¡diosincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitís no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococo del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoprotemia, Acrocianosis, procesos parásitos o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, falla renal aguda, adenocarcinoma, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de alfa-1 -anti-tripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración celular de cuero anterior, terapia anti-cd3, síndrome anti-fosfolípido, reacciones de hipersensibilidad de anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fíbrilación atrial (sostenida o paroxismal), trepidación auricular, bloque atrioventrícular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloque de ramificación de grupo, linfoma de Burkitt, quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de atrofia cardíaca, tumores cardíacos, cardíomiopatía, respuesta de inflamación de derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales de cerebelo, trastornos de cerebelo, taquicardia atrial caótica o de foco múltiple, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítíca crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorectal, falla cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonar, enfermedad de artería coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa de cultivo, fibrosis quístíca, trastornos asociados con terapia de cítocina, demencia pugilística, enfermedades desmielizantes, fiebre hemorrágíca por dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad del cuerpo de Lewy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad media, trastornos del movimiento inducidos por fármacos, que bloquean los receptores de dopamina del sistema nervioso central (CNS), sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocri nopatía , epiglotitis, infección por el virus de Epstein-barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematof agocitica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena de gas, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis gram negativa, sepsis gram positiva, granulomas debido organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénico trombolítico, hemorragia, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infección por VIH/ neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hipercinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimiento hipocinéticos, evaluación hipotalámica-pituitaria-eje adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema cortiespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfederma, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas, migraña, dolor de cabeza, trastorno de sistema múltiple mitocondrial, enfermedad de tejido conectivo mixta, gamopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, micobacterium aviar intracelular, tuberculosis por micobacteria, síndrome mielodiplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos al miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica , linfoma de no Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos reversibles de vasectomía, órganomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/ hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides , enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenial, enfermedad pericardial, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumocitis, neumonía carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatia, órganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonal, y síndrome de cambios de piel), síndrome de pos-perfusión, síndrome de pos-bomba, síndrome de cardiotomía pos-MI, preclampsia, parálisis progresiva de supra-núcleo, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia QRS estrecha regular, hipertensión reno-vascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo de cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, apoplejía, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espíno-cerebelares, miositis por estreptococo, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante, sub-aguda, sincope, sífilis del sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o FAB, telangiectasía , trom boang itis obliterante, trom bocitopenia , toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilídad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardíacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff , enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopatica aguda, poliradiculoneuropatía desmielizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still en adultos, alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, anemia aplástica, arterioesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida del oído autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquioectais, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celiaca, espondilitis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de inicio en niños, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiosítis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapsos de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis corporal de oclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, reticulares livedo, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus bechterev, trastorno neuronal motriz, penfigoide de membrana mucosa, falla orgánica múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de raices nerviosas, neuropatía, hepatitis de no A y no B, neuritis óptica, osteolisis, cáncer de ovario, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad de arteria periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, poliomiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome de pos-bombeo, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y malignidades hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis recurrente óptica, restenosis, enfermedad cardiaca reumática, safo (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, ataque pulmonar, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada con silicón, dermatosis de sneddon-wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens- Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrolisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (receptor de factor de necrosis tumoral), reacción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanag i-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda, curación de heridas, artropatía asociada con yersinia y salmonella.
61. El método de acuerdo con la reivindicación 60, en donde dicha administración a los sujetos es a través de un modo seleccionado de parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, i ntra-cavidad , intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, ¡ntra-miocardio, intraosteal, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, ¡ntraprostática, intrapulmonar, intra-rectal, intra-renal, intra-retinal, intraespinal, intrasinovial, intratoráxica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmica.
62. Un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dos antígenos, que comprende los pasos de: a) obtener un primer anticuerpo parental o una porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo parental o una porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir un segundo antígeno; c) construir primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parentai o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parentai o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1; (X2)n es una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; ó (X2)1 ; d) construir segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parentai o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parentai o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó ( X 1 ) 1 , y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; y e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de manera que se genera una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dicho primer y dicho segundo antígeno, en donde la proteína de unión es capaz de unir un par de antigenos seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1 R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e +GF1 R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF y IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1 ; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; y HER-2 y HER-2.
63. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: : 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, y 106, y en donde los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105 y 107.
64. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo parental o antígeno de unión del mismo, y dicho segundo antígeno parental o porción de unión de antígeno del mismo, se seleccionan del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo injertado de CDR, y un anticuerpo humanizado.
65. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo parental o antígeno de unión del mismo, y dicho segundo antígeno parental o porción de unión de antígeno del mismo, se seleccionan del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados a través de un puente de disulfuro en una región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; un fragmento dAb; una región de determinación de complementariedad aislada (CDR); un anticuerpo de cadena individual; y diacuerpos.
66. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo parental o antígeno de unión del mismo posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble.
67. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho segundo anticuerpo parental o antígeno de unión del mismo posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble.
68. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde la región Fe se selecciona del grupo que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia variante.
69. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde la región Fe se selecciona del grupo que consiste de una región Fe de una IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.
70. El método de acuerdo con la reivindicación 66, en donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros de anticuerpo.
71. El método de acuerdo con la reivindicación 67, en donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros de anticuerpo.
72. El método de acuerdo con la reivindicación 70, en donde dichos parámetros de anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de especificidad de antigeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión de antígeno ortóloga.
73. El método de acuerdo con la reivindicación 71, en donde dichos parámetros de anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión de antígeno ortóloga.
74. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une dicho primer antígeno con una afinidad diferente que la afinidad con la cual dicho segundo anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo une dicho segundo antígeno.
75. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho primer anticuerpo parental o porción de unión de antígeno del mismo, une dicho primer antígeno con una potencia diferente que la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo une dicho segundo antígeno.
76. Un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dos antígenos con propiedades deseadas, que comprende los pasos de: a) obtener un primer anticuerpo parental o porción de antígeno del mismo, capaz de unir un primer antígeno y poseer al menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble; b) obtener un segundo anticuerpo parental o una porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir un segundo antígeno y poseer por lo menos una propiedad deseada exhibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble; c) construir primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parental o una proteína de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1; y d) construir segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 ó (X1)1; y (X2)n es (X2)0 ó (X2)1 ; e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de manera que se genera una Inmunoglobulina de Dominio Variable Doble capaz de unir dicho primer y segundo antígenos con propiedades deseadas, en donde la proteína de unión es capaz de unir un par de antígenos seleccionados del grupo que consiste de CD-20 y CD-19; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-20 y CD-40; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1.2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1; CD-20 y CD3; DLL-4 y PLGF; VEGF y PLGF; ErbB3 y EGFR; ErbB3 y HGF; HER-2 y ErbB3; c-Met y ErB3; PLGF y HER-2; y HER-2 y HER-2.
77. Un método para mejorar una característica de la proteína de unión de la reivindicación 6, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (a) alterar la longitud y/o secuencia de (X1)i de la cadena pesada y/o ligera proporcionando así una cadena pesada y/o ligera pesada; (b) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas.
78. Un método para mejorar una característica de la proteína de unión de la reivindicación 6, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar las primera y segunda cadenas de polipéptido de manera que VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n se cambia a VD2-(X1 )n-VD1 -C- (X2)n, proporcionando así cadenas pesada y ligera alteradas; (c) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas.
79. Un método para mejorar una característica de la proteína de unión de la reivindicación 6, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar las primera y/o segunda cadenas de polipéptido de manera que la secuencia de solo uno de VD1 o VD2 de la cadena pesada y/o ligera se cambia; y (c) determinar la característica de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas.
80. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 77-78, en donde la característica se selecciona del grupo que consiste de unión al antígeno objetivo, producción de expresión de la célula huésped, vida media in vitro, vida media in vivo, estabilidad, solubilidad, y función de efector mejorada.
81. El método de acuerdo con la reivindicación 77, en donde la longitud de (X1)i de la cadena pesada alterada se incrementa.
82. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde la longitud de (X1)i de la cadena pesada alterada se reduce.
83. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde la longitud de (X1)i de la cadena ligera alterada se incrementa .
84. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde la longitud de (X1)i de la cadena ligera alterada se reduce.
85. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (Xlh de la cadena pesada alterada comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 21 ó 22.
86. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (X1)i de la cadena ligera alterada comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 13 ó 14.
87. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (X1)i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 22 y (X ) 1 de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 14.
88. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (X1)i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 21 y (X1)1 de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 14.
89. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (X1)i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 22 y (X ) 1 de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 13.
90. El método de acuerdo con la reivindicación 77 u 80, en donde (X1)i de la cadena pesada alterada es SEC ID NO: 21 y (X 1 ) 1 de la cadena ligera alterada es SEC ID NO: 13.
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Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2066694T1 (sl) 2006-09-29 2016-02-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za diagnosticiranje in zdravljenje raka
CA2725666A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) 2008-06-03 2013-05-30 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ590074A (en) 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100233079A1 (en) * 2008-12-04 2010-09-16 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
MX2011010158A (es) * 2009-04-07 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.
TWI465250B (zh) 2009-08-29 2014-12-21 Abbvie Inc 治療用之ｄｌｌ４結合蛋白質
IN2012DN02737A (es) 2009-09-01 2015-09-11 Abbott Lab
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US8883145B2 (en) 2009-10-16 2014-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment with DLL4 antagonists and an anti-hypertensive agent
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2542582A4 (en) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201211252A (en) 2010-08-26 2012-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
WO2012088290A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
WO2012088302A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
US9133272B2 (en) 2011-03-01 2015-09-15 Amgen Inc. Bispecific binding agents
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) * 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
UA117072C2 (uk) 2011-05-21 2018-06-11 Макродженікс, Інк. Cd3-зв'язувальна молекула, здатна до зв'язування з cd3 людини, і cd3, що не є людським
HUE042192T2 (hu) 2011-09-23 2019-06-28 Oncomed Pharm Inc VEGF/DLL4-kötõ ágensek és alkalmazásaik
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
CA2862999A1 (en) 2012-01-11 2013-07-18 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific antibody fragments for neurological disease proteins and methods of use
US20140004131A1 (en) * 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
KR101535341B1 (ko) 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
WO2014022540A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JP6401702B2 (ja) 2012-09-07 2018-10-10 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー オブ・アルバータ 炎症性肝疾患の診断のための方法および組成物
WO2014057118A1 (en) * 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
JP6371294B2 (ja) 2012-10-31 2018-08-08 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ４アンタゴニストによる処置の方法およびモニタリング
AU2013337775B2 (en) 2012-11-01 2017-03-30 Abbvie Inc. Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013348570B2 (en) * 2012-11-21 2017-01-12 Pharmabcine Inc. Dual-target antibody targeting VEGFR-2 and DLL4, and pharmaceutical composition comprising same
EP2738180A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-04 Molecular Partners AG Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2.
US20140154255A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
CN103864932B (zh) * 2012-12-14 2015-11-25 苏州思坦维生物技术有限责任公司 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
KR102049991B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-02 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
KR102074421B1 (ko) 2013-03-29 2020-02-10 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
KR102089591B1 (ko) 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
WO2015048312A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
US10519251B2 (en) * 2013-12-30 2019-12-31 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CN106456595A (zh) 2014-02-10 2017-02-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于系统性病症的肥大细胞稳定剂治疗
HUE049323T2 (hu) 2014-02-10 2020-09-28 Respivant Sciences Gmbh Hízósejt-stabilizálók tüdõbetegség kezelésére
CN104974258B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 重组抗hgf/dll4双特异性抗体、其制备方法和应用
CN104974260B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗hgf/vegf双特异性抗体、其制备方法及应用
KR102223502B1 (ko) 2014-05-09 2021-03-05 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR/항 Her3 다중 특이 항체 및 이의 이용
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2016004197A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using cobalt
WO2016007764A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Abbvie Inc. Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using non-commonly used sugars
EP3191126B1 (en) 2014-09-13 2020-05-13 Novartis AG Combination therapies of alk inhibitors
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
WO2016070051A2 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10238625B2 (en) 2015-08-07 2019-03-26 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
US10265296B2 (en) 2015-08-07 2019-04-23 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
CA2998740A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 The Scripps Research Institute Dual variable domain immunoconjugates and uses thereof
JP6967003B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-17 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド がんの処置のための方法および組成物
FI3354729T3 (fi) 2015-09-24 2024-04-23 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-garp-vasta-aine
KR20180104635A (ko) 2015-12-30 2018-09-21 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
AU2017209099A1 (en) 2016-01-22 2018-08-02 Janssen Biotech, Inc. Anti-ROR1 antibodies, ROR1 x CD3 bispecific antibodies, and methods of using the same
NZ743881A (en) 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
HUE054726T2 (hu) 2016-03-02 2021-09-28 Eisai R&D Man Co Ltd Eribulinalapú antitest-gyógyszer konjugátumok és alkalmazási eljárások
CN109071646A (zh) 2016-03-11 2018-12-21 供石公司 TGFβ1-结合免疫球蛋白及其用途
JP7038353B2 (ja) * 2016-04-13 2022-03-18 ヴィヴィア バイオテック，エス．エル エクスビボのｂｉｔｅ活性化ｔ細胞
JP7461741B2 (ja) * 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
CA3030298A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Aerpio Therapeutics, Inc. Humanized monoclonal antibodies that target ve-ptp (hptp-.beta.)
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
JP2019528320A (ja) 2016-08-31 2019-10-10 レシュピファント サイエンシス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクター ハフトゥングＲｅｓｐｉｖａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｍｂｈ 特発性肺線維症による慢性咳の治療のためのクロモリン組成物
JP2019531308A (ja) 2016-10-07 2019-10-31 レシュピファント サイエンシス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクター ハフトゥングＲｅｓｐｉｖａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｍｂｈ 肺線維症の治療のためのクロモリン組成物
WO2018085444A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Washington University COMPOSITIONS COMPRISING CelTOS IMMUNOGENS AND ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3551658A1 (en) 2017-01-06 2019-10-16 Scholar Rock, Inc. Isoform-specific, context-permissive tgf 1 inhibitors and use thereof
CN107602702A (zh) * 2017-09-22 2018-01-19 生标（上海）医疗器械科技有限公司 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用
CA3105988A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Abhishek Datta High-affinity, isoform-selective tgf.beta.1 inhibitors and use thereof
EP3820896A1 (en) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. TGFbeta1 INHIBITORS AND USE THEREOF
SI3677278T1 (sl) 2018-07-11 2022-01-31 Scholar Rock, Inc. Izoformno selektivni zaviralci TGFBETA1 in uporaba le-teh
AU2019370339A1 (en) * 2018-11-01 2021-06-10 Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific antibody and use thereof
WO2020097155A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
SG11202112382WA (en) 2019-05-07 2021-12-30 Gracell Biotechnologies Shanghai Co Ltd Engineered immune cell targeting bcma and use thereof
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
US20230050148A1 (en) 2020-01-11 2023-02-16 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
CA3167427A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. Tgfb inhibitors and use thereof
CN111474294B (zh) * 2020-04-28 2023-04-07 广东博创佳禾科技有限公司 一种青枯病菌溶液滴定系统
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
CN113354715B (zh) * 2021-05-07 2023-03-17 暨南大学 Egfr的改造的结合蛋白及其应用
CN113238060B (zh) * 2021-05-08 2022-10-11 迈克生物股份有限公司 用于预测或诊断心肌炎的试剂盒
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
WO2023288277A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgfb1 and uses thereof
CN117915950A (zh) * 2021-08-06 2024-04-19 甘李药业股份有限公司 一种多特异性抗体及其用途
WO2023166098A1 (en) * 2022-03-02 2023-09-07 Biomunex Pharmaceuticals Bispecific antibodies binding to her-3 and to either her-2 or egfr

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
DE3378250D1 (en) * 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4753894A (en) * 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) * 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5128326A (en) * 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
CH0229046H1 (de) * 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5763192A (en) * 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) * 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5780225A (en) * 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0542810A1 (en) * 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2181673T3 (es) * 1991-05-01 2003-03-01 Jackson H M Found Military Med Procedimiento de tratamiento de las enfermedades respiratorias infecciosas.
DE4122599C2 (de) * 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ES2202310T3 (es) * 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) * 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5516637A (en) * 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9504344D0 (en) * 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) * 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US7060808B1 (en) * 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
CA2230494A1 (en) * 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
SI9720020B (en) * 1996-02-09 2001-12-31 Basf Ag Human antibodies that bind human TNF alpha
US5714352A (en) * 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE69730209T2 (de) * 1996-04-04 2005-04-14 Unilever N.V. Multivalentes und multispezifisches Antigenbindungsprotein
US5855913A (en) * 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) * 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) * 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5916771A (en) * 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6986890B1 (en) * 1996-11-21 2006-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody
US6057098A (en) * 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO2001071005A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
NZ521540A (en) * 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
KR20080074231A (ko) * 2000-06-29 2008-08-12 아보트 러보러터리즈 이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법
US6699473B2 (en) * 2000-10-13 2004-03-02 Uab Research Foundation Human anti-epidermal growth factor receptor single-chain antibodies
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
CN100497389C (zh) * 2001-06-13 2009-06-10 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
US7452539B2 (en) * 2001-12-19 2008-11-18 Genentech, Inc. Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
RU2339647C2 (ru) * 2002-08-19 2008-11-27 Астразенека Аб Антитела против моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (мср-1) и их применение
EP1572744B1 (en) * 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JP2008501621A (ja) * 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
PT3095793T (pt) * 2003-07-28 2020-05-04 Genentech Inc Redução da lixiviação de proteína a durante a cromatografia por afinidade com proteína a
US7662928B2 (en) * 2003-08-08 2010-02-16 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-FcRn antibodies for treatment of auto/allo immune conditions
EP1660534A2 (en) * 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
US20060134105A1 (en) * 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
JP5268255B2 (ja) * 2003-11-21 2013-08-21 エイエヌピー テクノロジーズ， インコーポレイテッド 非対称分岐ポリマー抱合体およびマイクロアレイアッセイ
AU2005267720B2 (en) * 2004-08-05 2012-02-23 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
KR20070057839A (ko) * 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
SI3530673T1 (sl) * 2004-09-03 2022-08-31 Genentech, Inc. Humanizirani antagonisti proti beta7 in njihove uporabe
US7910100B2 (en) * 2004-10-01 2011-03-22 Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissen Antibodies directed to the mammalian EAG1 ion channel protein
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
AU2006283532B2 (en) * 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN101291954B (zh) * 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
US7906116B2 (en) * 2005-09-01 2011-03-15 Parkash Gill Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4
EP1933714B1 (en) * 2005-09-21 2020-03-18 The Regents of The University of California Systems and compositions for local imaging and treatment of pain
WO2007109254A2 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
US20080118978A1 (en) * 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
EP2380908A1 (en) * 2006-06-02 2011-10-26 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Hepatocyte growth factor (hgf) binding proteins
KR20090016762A (ko) * 2006-06-06 2009-02-17 제넨테크, 인크. 혈관 발달을 조정하기 위한 조성물 및 방법
KR20160092061A (ko) * 2006-11-02 2016-08-03 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｄ 인자 항체
SI2125894T1 (sl) * 2007-03-22 2019-05-31 Biogen Ma Inc. Vezavne beljakovine, vključno s protitelesi, derivati protiteles in fragmenti protiteles, ki specifično vežejo CD154, ter njihove uporabe
TW200848429A (en) * 2007-04-23 2008-12-16 Wyeth Corp Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
EP2167961A4 (en) * 2007-06-27 2010-07-21 Univ Leland Stanford Junior BETA2-MICROGLOBULIN AND C-REACTIVE PROTEIN (CRP) AS BIOMARKERS FOR PERIPHERAL ARTERY DISEASE
US20090155275A1 (en) * 2007-07-31 2009-06-18 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
NZ590074A (en) * 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2559525C2 (ru) * 2008-07-08 2015-08-10 Эббви Инк Белки, связывающие простагландин е2, и их применение
AU2010242840B2 (en) * 2009-05-01 2014-04-17 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
IN2012DN02737A (es) * 2009-09-01 2015-09-11 Abbott Lab
TW201124427A (en) * 2009-10-15 2011-07-16 Abbott Lab IL-1 binding proteins
KR20140015139A (ko) * 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY33492A (es) * 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2807014A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201211252A (en) * 2010-08-26 2012-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011050262A2 (en) 2011-04-28
CR20120267A (es) 2012-08-14
PE20121249A1 (es) 2012-10-06
JP2013507969A (ja) 2013-03-07
DOP2012000122A (es) 2013-09-15
BR112012009043A2 (pt) 2015-09-08
CN102741423A (zh) 2012-10-17
TW201127956A (en) 2011-08-16
RU2012121189A (ru) 2013-11-27
ECSP12011911A (es) 2012-07-31
US20100260668A1 (en) 2010-10-14
KR20130004563A (ko) 2013-01-11
AR078728A1 (es) 2011-11-30
CA2778176A1 (en) 2011-04-28
CL2012000980A1 (es) 2013-01-11
UY32965A (es) 2011-02-28
AU2010310565A1 (en) 2012-05-31
EP2491129A4 (en) 2013-05-29
DOP2012000117A (es) 2012-07-31
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