MX2011005466A - Proceso de biotecnologia microbiana para degradar completamente gluten en harinas. - Google Patents
Proceso de biotecnologia microbiana para degradar completamente gluten en harinas.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona con el uso de bacterias de acido láctico seleccionadas y enzimas fungales para la degradación completa de gluten de ambos pan y harina de trigo duro, cebada, centeno y avena. En particular, la invención se relaciona con el uso de bacterias de ácido láctico seleccionadas y enzimas fungales para la degradación completa de gluten (concentracion de gluten residual inferior a 20 ppm) de harinas de cereal, que después de la destoxificación se pueden usar e conformidad con un protocolo biotecnológico normalizado para la producción de varios alimentos libres de gluten.
Description
PROCESO DE BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA PARA DEGRADAR
COMPLETAMENTE GLUTEN EN HARINAS
La presente invención se relaciona con ; una
! biotecnología microbiana para degradar completamente gluten
en harinas. Particularmente, el proceso de conformidad cpn la invención involucra el uso de bacteria láctica seleccionada y i proteasas fúngales rutinariamente usadas para la fabricación
de artículos horneados de hoja, bajo condiciones de
fermentación líquida para la degradación de gluten completo
(concentración de gluten residual inferior a 20 ppm) .. Las
harinas de cereal que resultan del proceso de fermentación se pueden usar como materia prima para la producción de
alimentos libres de gluten diseñados para ser comidos: por pacientes celíacos. El proceso de biotecnología propuesto í resulta en varis ventajas económicas, sociales, nutricionales y sensoriales comparados con proceso de producción actual de
alimentos libres de gluten hechos por ingredientes que' son
naturalmente libres de gluten o como resultado de procesos
de extracción.
La epidemiología de intolerancia de gluten o
enfermedad celíaca está creciendo continuamente. Las últimas
investigaciones acerca de población europea y de los Estados
i unidos reportan una incidencia de 1/100 individuos afectados
(Rewers, 2005. Epidemiología de enfermedad celíaca; qué son la prevalencia, incidencia y progresión e enfermedad celíaca. Gastroenteroloty 128:47-51). De conformidad con' el conocimiento actual, el único remedio terapéutico efectivo contra esta intolerancia alimentaria es dieta completamente libre de gluten a ser observada rigurosamente durante toda la vida. (Hamer, 2005. Enfermedad Celíaca: Antecedentes y aspectos bioquímicos. Biotechnol Advanc 23:401-408). Se conoce, por ejemplo, el uso de bacteria láctica para la preparación de artículos horneados de harinas libres de gluten (More y col. Cereal Chemistry, American Association of Cereal Chemists. Minneapolis, EUA, vol . 84, no. 4, 1 de enero de 2007, pág. 357-364 y Moore y col., Investigación de
Tecnología de Alimento Europeo, vol. 226, 6 de junio de 2007, pág. 1309-1316) . Sin embargo, la dieta libre de gluten resulta también en desventajas aparentes. Es muy costosa, los
I
productos libres de gluten, cuando se comparan con productos basados en cereal, presentan calidad y almacenamiento sensorial inferior, la dieta es difícil de ser observada estrictamente y necesita ser supervisada continuamente por dietistas, tomando también en consideración ; los desequilibrios nutricionales (por ejemplo fibras, minerales y vitaminas) que resultan de la ausencia completa de cereales
en la alimentación (Grehn y col., 2001. Jábitats dietéticos
de pacientes celiacos adultos suecos tratados mediante una
diete libre de gluten durante 10 años. Scand J Nutr 45:¦¦ 178-182; Mariani y col., 1998. La dieta libre de gluten': un
I
factor de riesgo nutricional para adolescentes con enfermedad
! celiaca. J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson y
i col., 2005. Investigación de dieta libre de gluten: ¿Están i los americanos con enfermedad celiaca consumiendo cantidades recomendadas de fibra, hierro, calcio y alimentos de grano?
J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169: Además, en algunos casos i
(por ejemplo "silosis refractaria") también la observación completa de dieta libre de gluten no permite una recuperáción
completa de la funcionalidad intestinal (Sollid y Kho'sla,
2004. Futuras opciones terapéuticas para enfermedad celi!aca.
I
Gastroenterol. Hepatol. 2:140-147). Dentro de tratamientos
I
terapéuticos alternativos a dieta libre de gluten, varios estudios han aprovechado el conocimiento actual sobre ¡ las
secuencias de epitopes tóxicos y han considerado el uso en
enzima microbiana, particularmente prolil-endopeptidasa
(PEPs) , para la hidrólisis de estos polipéptidos . Las enzimas i microbianas se han sugerido como suplementos de dieta (Shan y i col., 2004. Análisis bioquímico comparativo de tres proiil-endopeptidasas bacterianas: implicaciones para silósis í
celíaca. Biochem. J. 383:311-318) y/o para destoxificación in
vitro de gluten (Chen y col., 2003. Identificación y
caracterización de Lactobacillus helveticus PeP02, i una
endopeptidasa con especificidad post-prolina . Appl Environ.
Microbiol. 69:1276-1282; Stepniak y col., 2005. Degradación i de gluten altamente eficiente con una prolil-endoproteasa
I
recientemente identificada: implicaciones para enfermedad
celiaca. Am. J. Physiol. Gastrointest . Liver Physiol.
291:G621-G629) .
i La solicitud de patente WO2008/010252 y Cagno y
col. (Journal of Food Protection, vol. 71 no. 7, 2008, ,pág.
1491-1495) describen un proceso para la preparación de
I
artículos horneados de harinas libres de gluten y dirección a
mejorar las características nutricionales, sensoriales Íy de
almacenamiento de estos productos preparado de ingredientes i libres de gluten.
Durante las últimas pocas décadas también, la
biotecnología de artículos horneados fermentados está
considerablemente cambiada, , influenciando los hábitos
nutricionales e poblaciones completas previamente sujetas a
una diete basada en gluten. Actualmente, los artículos
horneados fermentados se fabrican por medio de procesos i tecnológicos extremadamente rápidos (por ejemplo, agentes de i i
I í
fermentación químicos o usando levadura de pastelero), reemplazando completamente los procesos de fermentación prolongados usando bacteria de ácido láctico salvaje y levaduras originadas de materias primas, y usadas j como
"pastas agrias". Por medio de procesos actuales' los
i componentes de cereal (por ejemplo proteínas) no se someten a ninguna actividad hidrolítica durante el procesamiento de alimento, manteniendo las características de materia prima
(Gobbetti, 1998. La microflora de pasta agria: interacciones entre bacteria láctica y levaduras. Trends Food Sci. Technol. 9:267-274). Basado en estas consideraciones y aprovechando las potencialidades de enzima de una mezcla de bacteria láctica seleccionada, varios estudios (Di Cagno y col., 2002, proteólisis mediante bacteria láctica de pasta agria: efectos sobre fracciones e proteína de harina de trigo y péptidos de gliadina involucrados en la intolerancia de cereal humano. Appl. Environ. Microbiol. 68:623-633; Di8 Cagno y col., 2004. El pan hecho de pasta agria de harinas de trigo y no tóxicos e iniciado con lactobacilos seleccionados se tolera en pacientes de silosis celíaca. Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1-96; Di Cagno y col., 2005. La pasta hecha de semolina de trigo de duro fermentada con lactobacjilos
I
seleccionados como una herramienta para una disminución
potencial de la intolerancia de gluten. J. Agr . Food Chem. 52:4393-4402; De Angelis y col., 2005. VSL#3 preparación
probiótica tiene la capacidad de hidrolizar polipéptidós de
gliadina responsables por silosis celiaca. Biochim. Biophys.
I
Acta. 1762:80.93) demostraron que usando una biotecnología
tradicional, basada en el uso de bacteria de ácido láctico seleccionada y tiempos de fermentación prolongados,, es
i posible reducir notoriamente la concentración de glute;n de
cereal inicial. '
Codex Alimentarius, adoptó por WHO (World Héalth
Organization) y FAO (Food and Agricultural Organization),
distingue "productos libres de gluten", que contienen
ingredientes con concentración de gluten inferior a 20 ppm, y
"productos hechos libres de gluten" que tienen ¦ una
concentración de gluten residual inferior a 200 ppm. ' Sin embargo, varios estudios culminaron con líneas de guía 'como i se expidan por "Prolamins Working Group", que sugieren^ en
cualquier caso, que se mantenga un umbral de gluten inferior a 20 ppm (Stern y col., 2001. Análisis y efectos clínicos de
gluten en enfermedad celiaca. Eur. JU. Gastroenterol .
Hepatol. 13:741-747). Un estudio reciente por Rizzello y col.
(Rixxello y col., 2007. Degradación de gluten altamente
eficiente mediante lactobacilos y proteasas fúngales durante
procesamiento de alimento: nuevas perspectivas , para
enfermedad celiaca. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507)
consideraron el uso de una mezcla más completa que consiste
I
de 10 bacterias de ácido láctico seleccionado, protéasas
j fúngales y tiempos de fermentación prolongados (48 h a 37°C),
bajo condiciones de amasado semiliquidas . De conformidad con
I
análisis electroforéticos , cromatográficos e inmunológicos , el gluten contenido en la harina de trigo se degradó a una concentración inferior al umbral de 20 ppm. ;
Se conoce además la Solicitud de Patente i
WO2006/097415 en donde, de manera análoga al estudio arriba mencionado, se describe un proceso para degradación de gluten
por medio del uso de una mezcla compleja que consiste de cuando menos seis bacterias de ácido láctico 1 y/o bifidobacterias y tiempos de fermentación prolongados (24-31 horas) . Sin embargo, el método descrito en este documentjo no
i es apropiado a fin de que el gluten sea completamente
degradado; por lo tanto, resulta la imposibilidad de la
administración de pacientes celiacos. La Figura IB de la
Solicitud de Patente "206/097415, de hecho, muestra que, después de hidrólisis por medio de microorganismos, hay
todavía puntos claros de glialinas no degradadas y esté se confirma en el cuadro 2, nuevamente del mismo documento, | del
¡ que es evidente que mientras que algunas gliadinas se hidrolizan parcialmente, otras no son sensibles al proceso de
hidrólisis.
I
Basados en la literatura y datos previamente
descritos, algunos problemas parecen ser de mayor importancia
para la fabricación de alimentos libres de gluten de harina de cereal destoxificada : (i) simplificar la composición de i las bacterias lácticas seleccionadas que se van a usar 'para
el proceso de degradación; (ii) reducir considerablemente los
tiempos de fermentación, haciendo de esta manera apropiados para usarse en procesos industriales; (iii) demostrar la capacidad de bacterias de ácido láctico y enzimas fúngales a
fin de actuar efectivamente sobre pan y harinas de trigo .duro pertenecientes a diferentes variedad, y en cebada, centeno y
! avena; (iv) para proporcionar un proceso biotecnológico ¡para
I
hidrólisis de gluten permitiendo que harinas de cereal
destoxificado para la producción de productos libres1 de
gluten se use; y (v) demostrar, por medio de pruebas médicas
crónicas in vivo, la tolerancia absoluta para pacientes de celiaca después de administración prolongada de productos i libres de gluten basados en harina de trigo destoxificada .
En la luz de lo anterior, por lo tanto es evidente
la necesidad de proporcionar materiales y métodos para1 la
preparación de artículos horneados libres de gluten hechps de
harina de cereal destoxificada que no muestren, por un lado,
las desventajas salidas de investigación económica, sopial,
nutricional y sensorial de datos de literatura y, por i otra
I
parte, las desventajas de los productos libres de gluten
comercialmente obtenibles en la actualidad. :
i
Los autores de la presente invención ahora observaron que usando solamente dos bacterias de acido láctico seleccionadas, en combinación con proteasas fúngales, los tiempos de fermentación necesitados para degradación de
gluten se disminuyen notoriamente. Además, la capacidad de bacterias de ácido láctico y proteasas fúngales para la
degradación completa de gluten de diferentes variedades de pan y trigo duro, harinas de cebada, centeno y avena se
probó; un protocolo biotecnológico para la producción de varios artículos horneados fermentados de harina de trigo
destoxificada se proporcionó; y se demostró la tolerancia de
producto absoluta para pacientes de celíaca, permitiendo de
esta manera, en una forma completamente innovadora, que la
harina de trigo se usara como un ingrediente para la
fabricación de artículos horneados fermentados libres de
gluten. " ¦
Las bacterias de ácido láctico de conformidad cón
i i í
I la presente invención pertenecen al género Lactobacillus y se aislaron de "pastas agrias" usadas para la fabricación de panes típicos de Italia del Sur. Lactobacillus sanfranciscensis DDPMA12 (depositada como MSCZ N. DSM220é3 el 28 de noviembre de 2008) y Lactobacillus plantarum DPPtvlA125 (depositada com DSMZ N. DSM22064 el 28 de noviembre de 20;08) .
El protocolo biotecnológico que involucra el uso de bacterias de ácido láctico seleccionadas y proteasas fúngales en un proceso de fermentación extremadamente rápido (12-20 h a 30-37°C) de harinas de cereal resuspendidas en agua a 20-50% en peso y uso sucesivo de las mismas, a varios porcentajes de conformidad con las características deseadas, como un ingrediente para una fermentación corta (alrededor de
I
1-3 h) por medio de levadura de panadero, para la producción de artículos horneados fermentados libres de gl'uten (contenido de gluten residual inferior a 20 ppm) se normalizó y optimizó.
Abajo se reporta una delineación del protocolo biotecnológico para la producción de artículos horneados fermentados de harina de trigo libre de gluten dextoxificádo.
Cultivar, lavar y suspensión en agua de cultivos' de bacterias de ácido láctico
i
Mezclar la harina de grano (30%) con agua (70%), que
contiene dos bacterias de ácido láctico seleccionadas
(densidad e célula 108 cfu/g) y proteasas funtales (400 ppm
I
cada una) i
I
i
Fermentación durante 18 horas a 37 !C 1
I
1 I
Mezclado con maíz nativo (10%), harina de arroz (10%,
huevo (5%), azúcar (3%), mantequilla (1%) y levadura de
panadera (1.5%)
i
Fermentación durante 1, 5 horas a 30°C)
i 1 Horneado a 250°C durante 50 minutos :
De- conformidad con una de formulaciones posibles, i los artículos horneados, que contienen 1|0 g equivalente a
gluten inicial, se administraron diariamente a pacientes de
celíaca durante un período de 60 días. Los ensayos
inmunoquímicos e histológicos probaron la tolerancia absoluta
de preparación de harina libre de gluten destoxificado .
De conformidad con análisis complementarios usando
técnicas electroforéticas, cromatográficas e inmunológicas ,
el proceso de fermentación por medio de bacterias de ácido
I i
I
12 .
láctico seleccionadas, no usadas en estudios previos,
proteasas fúngales, de conformidad con la presente invención,
permite: (i) destoxificación de gluten completa (conteniólo de
i gluten residual inferior a 20 ppm) ; (ii) producción de harina
hidrolizada que consiste de una mezcla de péptidos de ibajo
I
peso molecular y, especialmente, aminoácidos (ap. 15,000
mg/kg con respecto a > 1000 mg/kg en harina de trigo)': que
aumentó las características nutricionales con respecto a
productos libres de gluten convencionales; (iii) reducción
notoria de tiempos de procesocomparados con datos reportados
de la literatura, haciendo de esta manera al proceso
apropiado para una transformación a escala industrial; (iv)
producción de artículos horneados libres de gluten ' con
diferentes formulaciones de ingrediente que involucran el' uso
i de harina de trigo destoxificada a diferentes concentración
(20-50%) ; y (v) tolerancia absoluta de la preparación para
I
pacientes de celíaca después de administración prolongada;, de
conformidad con los datos métodos reportados la primera vez.
Los productos que se pueden obtener de conformidad
con el proceso de la presente invención presentan propiedades
ventajosas sensoriales, reológicas y químicas no ofrecidas i por productos del ramo anterior (productos libres de gluten
I
obtenidos de harinas libres dee gluten naturalmente) . ¡ Los
I
i
I i
productos de conformidad con la invención, de hecho,
mantienen las propiedades nutricionales de harinas que
contienen gluten ofreciendo de esta manera características
nutricionales mejores comparadas con productos obtenidas de
harinas libres de gluten. i
Además, los productos de conformidad con la
invención están completamente libres de gluten como resultado i de proceso de degradación de gluten llevado a cabo, por
bacterias de ácido láctico inventivas, por lo demás que los
productos obtenidos usando bacterias de ácido láctico
conocidas (WO2006/097415, WO 2008/010252) . Las bacterias de ácido láctico de conformidad con la Solicitud de Patente WO
2008 / 010252 se usaron bajo las mismas condiciones de' las bacterias de ácido láctico de conformidad con la preáente
invención y no fueron apropiadas para degradación de gluten,
de hecho, los contenidos de gluten residual son del orden de
aproximadamente 6000 - 10000 ppm (figura 5 ) . Por lo tanto,; las
bacterias se pueden usar solamente para descontaminación de
vestigios de gluten pero no presentan los mismos
funcionamientos de bacterias de conformidad con la presente
¡ invención .
i
Con respecto al documento por Rizzello y ^col.
(Appl. Enriron Microbiol. 73:4499-4507, 2007), k i la
posibilidad de obtener una degradación de gluten completa
durante tiempos notoriamente más cortos (18 h comparados con
48 h) impli9ca, primeramente, una ventaja tecnológica
considerable, haciendo al proceso de transformación
comparable con los procesos industriales más frecuentas y
comunes para productos de horno. Un proceso de fermentación
demasiado largo (48 h) , además de aumentar los costos tecnológicos, podría presentar riesgos higiénicos-sanitarios .
Además, un procese de degradación de gluten más rápido inevitablemente resulta en la producción de una materia prima
(harina con gluten completamente hidrolizado) caracterizada
por un perfil diferente de aminoácidos libres y, por lo
tanto, apropiado para resultar en diferentes características
I
sensoriales de productos libres de gluten comparados con un
I
proceso más prolongado caracterizado por cinét'icas enzimáticas inevitablemente diferentes. !
I
Por lo tanto, un objeto específico de la presente
invención es una mezcla que comprende o consiste de bacterias de ácido láctivo Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 y Lactobacillus plantarum DSM 22064. La mezcla puede comprender
además enzimas proteolíticas fúngales, como por ejemplo
proteasas Aspergillus oxyzae, Aspergillus niger o mezclas de
las mismas. i i i i
I
I
Un objeto adicional de la presente invención es el
uso de la mezcla como se define arriba para la degradación
completa del gluten en ambos pan y harinas de trigo duro,
cebada, centeno y avena.
La presente invención se refiere además a un
I
proceso para la preparación de una pasta de harina liquida
con gluten completamente degradado, apropiado para' la
producción de productos libres de gluten fermentados ' que
comprende o consiste de los siguientes pasos:
a) propagar el cultivo de bacterias de ácido láctivo
Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 y lactobacillus
plantarum DSM 22064;
b) mezclar la harina a concentraciones de 20-50%,: de
preferencia 30%, y agua a concentración de 50-80%, | de
i preferencia 70%, que contiene la mezcla de dos bacterias! del
paso a) a densidad de célula de alrededor de 108 cfe/g; !
c) añadir una o más proteasas fúngales, cada una a ; una
concentración de 200-500 ppm, de preferencia 400 ppm;
d) fermentar durante 8-20 h, de preferencia 12 h, a 30-
37°C.
El proceso puede además comprender un paso e} de
secar la pasata liquida obtenida en el paso d) . Entre ¡ las
i harinas apropiadas para usarse en el pr9oceso se encuentran
i
I i
ambs, harinas de pan y trigo duro, cebada, centeno, avena o
mezclas de las mismas, de preferencia pan y trigo duro. ,
Las enzimas proteoliticas fúngales se pueden
seleccionar del grupo que consiste en proteasas Aspergillus
oryzae, Aspergillus niger o mezclas de las mismas.
Por lo tanto, la invención también se refiere a una
pasta de harina liquida o secada en donde el gluten 'está
completamente degradado de conformidad con el proceso como se
define arriba. ¡
Un objeto adicional de la invención es una mezcla
que comprende o consiste de la past como se define arriba en
combinación con una o más harinas naturalmente libres de
gluten, como por ejemplo, aquellas seleccionadas del grupo
que consiste en maíz nativo, maíz, blanco, arroz, qui'noa,
I
amhárico o amaranto 10-30%, de preferencia 20%, y harina de
trigo sarraceno 1-10%, de preferencia 5%, en donde j los
porcentajes se expresan por peso basado en el peso total de
la composición de harina. Otros ingredientes que se pueden
añadir a la formulación para artículos horneados libres de
gluten basados en harina de trigo destoxificada son, , por
ejemplo, azúcar, mantequilla, huevo y crema líquida animal.
Un objeto adicional de la invención es un proceso
I
para la preparación de artículos horneados fermenados usando
harina destoxificade de gluyten de conformidad con el proceso
arriba definido, que comprende o consiste de los siguientes
pasos: ' a) añadir una mezcla de harinas naturalmente libréis de
gluten a 10-40%, de preferencia 30%, levadura de panadefo 1-
2%, sal 0.1-2.0%, y agentes de sstructuración 0.5— | 1% a pasta
de harina liquida des5oxificada e gluten usando el proceso
como se define arriba y amasar;
b) dejar que ocurra la fermentación durante aproximadamente 1-3 h, de preferencia 1.5 h, a 30°C; ' c) hornear durante 50 minutos a 220°C. En donde la pasta de
i harina destoxificada de gluten se seca, el por ciento de
i relación de ingrediente a agua será aproximadamente 1.2:0.8.
Las harinas naturalmente libres de gluten se pueden
seleccionar del grupo de consiste en maíz nativo, maíz
I
i blanco, arroz, quinoa, amhárico, amaranto, harina de trigo sarraceno o mezclas de los mismos. Por otra parte, la harina
destoxificada e gluten se puede seleccionar del grupo que
consiste de ambos pan y harina de trigo duro, cebada,
centeno, avena y mezclas de las mismas, de preferencia pan o
harina de trigo duro. '
i
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención
también artículos horneados fermenados que se pueden obtener
por medio del proceso como se define arriba.
Un objeto adicional de la presente invención s el
proceso para la preparación de artículos horneados
fermentados que comprende o consiste de los siguientes pa'sos:
i a) añadir directamente maíz nativo, harina de arroz, huevo,
azúcar, mantequilla y levadura de panadero a pasta de harina estoxificada e gluten de conformidad con el proceso arriba definido y amasar;
b) dejar que la fermentación ocurra durante 1.5 h a 30°C,.
y
c) hornear la pasta fermentada durante 50 minutos a 250,! C.
Particularmente, en el paso a), los. %' de
ingrediente son como abajo. Maíz nativo 10%, harina de arroz
110 % , huevo 5%, azúcar 3%, mantequilla 1% y levadura de
panadero 1.5%. I
Por lo tanto, los artículos horneados fermentados que se pueden obtener por medio del proceso arriba desdrito
constituyen un objeto de la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención
también es el uso de los productos de conformidad con la
presente invención, es decir, pasta de harina, mezcla de
pasta con harinas libres de gluten, artículos horneados
fermentados, artículos horneados fermentados apropiados para
I
19 :
cubrir desequilibrio nutricionales que resultan de dieta libre de gluten. '
Finalmente, las bacterias de ácido láctico
j
Lactobacillus sanfanciscensis DSM22063 y Lactobcillus
i plantarum DSM 22064 representan un objeto de la presente invención. :
La presente invención se describirá ahora por! vía ilustrativa, pero no limitativa de conformidad con modaliddes preferidas de la misma, con referencia particular a 1 los dibujos anexos.
La Figura 1 muestra aminopeptidadas tipo N (PepN) , dipeptidasa (PePV¡ y tripeptidasa (PepT), (a),; e iminopeptidasa prolina (Pepl), prolidasa (PepQ), prolinasa (PepR), dipeptidil-peptidasa (PepX) b) actividades! de
I
Lactobacillous sanfranciscensis DPPMa 12 (DSM22063) y Lactobacillus plantarum DPPMA125 ( DSM2206 ) , en substratos sintéticos Leu-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu y Prop-p-NA, , Val-FFor-Gly y Gly-For-Wing, respectivamente. Bacteria de ácido láctico usada en el estudio de Rizzello y col. (Rizzelló yt col., 2007, Appl. Environ, Microbiol. 73:4499-450/) se emplearon como control: Lactobacillus alimentarius Í15 , Lactobacillus brevis 14G, L. sanfgranciscensis ' 7a,
Lactobacillus hilgardii 51B y L. sanfranciscensis LS3, L-S10,
¡
l
LS19, LS23, LS38 y LS47. La acatividad enzimática se expresó
como unidad de actividad (U) , es decir, cantidad de enzima necesaria para liberar 1 umol/min de p-nitroanalida ¦ o 1
umol/min de aminoácido para las actividades sobre substratos
i diferentes de p-nitroanilida . i
La Figura 2 muestra perfiles electroforétLcos
I
bidimensionales de diversas variedades de trigo duro (Svevo y
Duilio) antes y después del tratamiento con bacterias de ácido láctico seleccionadas y proteasas fúngales.
La Figura 3 muestra la composición de proteina de
harina de trigo antes y después del proceso de hidrólisis mediante bacterias de ácido lácticoseleccionadas y proteasas
fúngales .
La Figura 4 muestra actividades de aminopeptidasa
(A) , iminopeptidasa prolina (B) y aminopeptidasa prolil-dipeptidil (C) de bacterias de ácido láctico usadas1 de
conformidad con WO2008 /010252 (Lactobacilus sanfranciscensis LS40, L213, LS44, LS35, LS14, LS11, LS1|8, LS4 , LS15 y LS41), y la presente invención [L. sanfranciscensis DPPMA12
(DSM22063) y lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064)].
Los acrónimos 15m, 14G, 7a, 51B, LS3, LS10, LS19m LS23, LS38
y LS47 representan biotipos como se usan de conformidad , con
Rizzello y col., publicación de 2007. 1
La Figura 5 muestra la concentración de gluten
residual (ppm) en pastas fermentadas de Lactobacillus
sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, ÍS18,
LS , LS15 y LS41 (WO2008 /O ' 10252 ) Y DE 1. SANFRANCISCENSIS i dppmal2 (DSM22063 y Lactobacillus plantarum DPPMA125
I
(DSM22064) durante 12 h a 37°C.
i
La Figura 6 muestra la concentración de aminoácidos
libres totales (mg/kg) en pasta fermentada usando diferentes
combinaciones de bacterias lácticas de conformidad con
WO2008/010252 (pasta 1, 2, 3, 4 y 5) y pasta de harina de
trigo fermentada con dos bacterias de ácido láctico (DDPPM12
y DPPMA125) de la presente invención. ,
La Figura 7 muestra el Análisis de Componente
Principal (PCA) de los datos obtenidos de análisis sensorial
de panes (1, 2, 4 y 5) de conformidad con WO2008/010252 y pan
(DPP A12 y DPPMA125) obtenido usando harina de trigo
destoxificada de conformidad con la invención.
Ejemplo 1: Actividd de peptidasa de bacteria
láctica seleccionada '.
L. sanfranciscensis DPPMA12 y L. plantarum DPPMA125
de la Colección de Cultivos del Departamento de Protección de i las Plantas y Microbiología Aplica de la Universidad de
Estudios de Bari, previamente aislados de "pastas agrias"j, se
propagaron a 30°C durante 24 h en un RS modificado (Mmrs), que contiene, además de los ingredientes usuales, 5% de
maltosa y 10% de agua de levadura - pH final 5.7. orno control para actividades de peptidasa de bacterias lácticas usadas en
la publicación reciente por Rizzello y col. Rizzello y col.,
2007. Appl. Environ. Microbiol . 73:4499-4507) se usaron:
Lactobacilus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G:, L.
sanfranciscensis 7a, Lactobacillus hilgardii 51B y L.
sanfranciscensis LS3 , LS10, LS19, LS23, LS38 y LL47. ;
Las células cultivadas durante 24 h, se cosecharon
mediante centrifutación (10000 rpm, 4!C), se lavaron dos veces en tampón de fosfato 50 mM, pH 7.0 y se suspendieron
nuevamente en el mismo tapón a 2.5 (A62 o nm) densidad óptjica, correspondiente a 108 cfu/ml, se usaron para ensayos de í enzima. Las actividades de aminopeptidfasa tipo N (PepN) e i iminopeptidasa de prolina (Pepl), se determinaron usando
substratos sintéticos Leu-p-NA y Pro-p-NA, respectivamente.
La mezcla de reacción consistió de: 0.9 mi de tampón de ki-fosfato 50 mM, pH 7.0 que contiene substrato sintético
disuelto (concentración final 2 mm) Y 100 UL DE SUSPENSIÓN i
CELULAR. La actividad enzimática, expresada como unidad de
i actividad (U) , corresponde a la cantidad de enzima necesaria
para liberar 1 umol/min de p-nitroanilida (Gobbetti y col.,
í
1
i
1996. El sistema proteolítico de Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purificación y ccaracterización de una
proteinasa, una dipeptidasa, y un aminopeptidasa . Appl.
I
Environ. Microbiol. 62: 3220-3226). Prolidasa (PépQ),
prolinasa (PepR) y dipeptidil-peptidasa (PepX) j se
determinaron como se describe por Cagno y colaboradores,j (Di
Cagno y col., 2004. Pan de pasta agria he3cho de harinás de
trigo y no tóxicas e iniciador con lactobacilos seleccionados se tolera en pacientes de silosis celiaca, Appl. Environ. Microbiol. 70: 1088-1096), respectivamente, en Val-Pro, 'Pro-
Gly y Gly-Pro-Ala. Dipeptidasa (PepV) y tripeptidasa (PepT) se determinaron de conformidad con el método Cd-ninidrina
(Gobbetti y col., 1999. Estudio de los efectos de
I
temperatura, pH, NaCl y awq en las actividades proteoliticas
y lipoliticas de bacterias lácticas relacionadas con queso i por metodología de superficie de respuesta cuadrática, Enzime
Microbiol Technol 25: 795-809) usando, respectivamente, ;Leu-Leu y Leu-Leu-Leu. Una unidad de actividad (U) se efine ¡como
la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 umol/miíi de
aminoácido. '
Para propósitos comparativos, la prueba se repitió también para las bacterias láctias decritas en WO2008/010252
i
(L. sanfranciscensis LS40, LS14, LS44, LS35, LS14, LS11, :
j
I
LS18, LS4, LS15 y LS41) .
Ejemplo 2: Extracción de proteina de harina e trigo
y análisis electroforético .
i
Se extrajeron proteínas de harina de trigcp de i conformidad con el método descrito por Weiuss y col. (Weiss y
col., 1993. Caracterización electroforética de alérgenols de
granos de trigo con diferentes cultivados involucrados en
asma de panadero. Electrophoresis . 14:805-816) . Se lleyó a
cabo el a'nalisis electroforético bidimensional | de
aproximadamente 30 ug de proteína de fracción extraída de
acuerdo con el método de inmov-ilina-poliacrilamida ' (De
Angelis y col., 2005. Biochim. Biophys. Acta. 1762:80.93) .
Cuatro geles para cada fermentación independiente¦ se
analizaron y los datos se normalizaron de acuerdo con el
procedimiento como se propone por Bini y col. (Bini y col.,
I
1997. Perfiles de expresión de proteína en carcinoma de ducto i de pecho humano y tejido histológicamente normal.
Electrophoresis. 18:2831-2841) .
Ejemplo 3: Análisis Inmunológico y de
espectrometría de masa MALDI-TOF
Se llevaron a cabo análisis inmunológicos usando
anticuerpo R5, y prueba ELISA de emparedado y competitiva
i
(Tansia Píate, Diffchamb) (Valdez y col., 2003. j El
I
í i
acercamiento de' innovación a determinación de gluten a bajo
nivel en alimentois usndo protocolo de ensayo de enzima de
emparedado-inmunosorbente enlazado. Eur. J. Gastroenterol .
Hepatol. 15:465-474) . El análisis de espectrometría MALDÍ-TOF
se llevó a cabo usando Voyager-De Pro-workstation (PerSepjtive
Biosystems Reino Unido) de acuerdo con el método reportado
por Hernando y col. (Hernando y col., 2003) . La nueva
estrategia para la determinación de gliadina en alimentos
basados en maíz o arroz, desorción/ionizaión de láser ayudada
por matriz fraccionación de espectrometría de masa de tiempo
de vuelo de gliadina de proláminas de maíz o arroz por
tratamiento ácido. J. Mass Spectrom. 38:862-871) . ;
La concentración de proteína se determinó! de
conformidad con el método Bradford (Bradford, 1976. Un méjtodo
rápido y sensible para la cuantificación de cantidades en i microgramo de proteína utilizando el principio de enlace de
proteína-tinte. Anal. Biochem. 72:2248-254) . La concentración
I
de nitrógeno orgánico se determinó de acuerdo con el método
de Kjeldahl. La concentración de aminoácido libre j se
determinó usandOo un analizador de aminoácido (Biochrom Lt . ,
Cambridge Science Park, Reino Unido) (Di Cagno y col., 2,004.
Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096) . !
i
Para propósitos comparativos, la concentración de
i
í
aminoácido libre se determinó también en pasata obtenida
usando lactobacilos descritos en WO2008/010252 . (L.
sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, 'LS11, IÍS18,
I
LS4, LS15 y LS41). Después de fermentación durante 24 horas a
30 °C de conformidad con procedimientos como se indican e!n el
protocolo reportado en la figura 8 de dicho documento. ¡
Ejemplo 4: Fabricación de artículos horneados
I
fermentados usando harina de trigo destoxificada :
Los cultivos de dos bacterias de ácido láctico seleccionadas se propagaron en medio de cultivo, se lavaron y
suspendieron nuevamente en agua como se describió
previamente. Harina de trigo se mezcló a 30% con agua (70%) i que contiene la mezcla de las dos bacterias de ácido láctico
a una densidad de célula de aproximadamente 108 cfu/g, y
enzimas fúngales, cada una a concentración de 400 ppm se añadieron. La fermentación se llevó a cabo durante 12 !h a i
37 °C. Después de la fermentación, directamente a raíz hnativo de pasta líquida 810%), harina de arroz (10%), huevo (5%),
azúcar (3%), mantequilla (1%) y levadura de panadero ( 1 ¡ 5% )
se añadieron. Las concentraciones se basan en el peso' de
pasta total. Después e amasar, la fermentación se deja
durante 1.5 h a 30°C antes de horneado de la pasta fermentada durante 50 minutos a 250°C. ¡
i
El proceso puede comprender5 además un paso de
secado de pasta de harina de trigoliquida . También se usaron
diferentes ingredientes para la producción de pan libre de
gluten .
Para propósitos de comparación también los panes 1,
2, 4 y 5 se produjeron de conformidad con el protocolo de la solicitud de Patente WO2008/010252. El análisis sensorial de
panes obtenidos de conformidad con la invención y conocidos en el ramo, respectivamente, se llevó a cabo, particularmente se consideraron los siguientes descriptores: elasticidad,
fragancia ácida, sabor ácido, dulzura, sequedad y fragahcia.
Cada descriptor se evaluó de acuerdo con una escala de marca
de 0 a 100. Los resultados del análisis sensorial se
í
I
procesaron por el Análisis de Componente Principal. Además,
j los panes se analizaron para volumen especifico, estructura de costra, rigidez y contenido de fibra de acuerdo) con
métodos convencionales de la American Association of Cereal
Chemistry (AACC) .
I
Ejemplo 5: Administración de pacientes de celiaca
de artículos horneados fermentados hechos de harina de tírigo destoxificada \ i
Los artículos horneados basados en harina de trigo
i destoxificada, obtenida como se describió anteriormente!, se
administraron a 5 pacientes de celiaca. Oportunamente, el diagnóstico de patología de celiaca se había adquirido de acuerdo con criterios como se proponen por la European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology j and Nuytrition. La edad promedio del paciente fue alrededor de 15
I
años. Los pacientes de celiaca estuvieron bajo condicionas de remisión desde cuando menos dos años y sometidos a una dieta
i libre de gluten controlada. Todos los pacientes en el reclutamiento mostraron indicadores negativos de patología serológica, así como ensayos histoquímicos negativos. Cada paciente, durante un período de 60 días, consumió diariamente artículos horneados que contenían harina de trigo destoxificada correspondiente a 10 g de equivalente de gluten nativo. Los ensayos inmnoquímico e histológico se llevarbn a
i cabvo en el Departamento de Pediatría y Gastroenterología de
i la Universidad de Estudios de Nápoles, Federico II. j El reclutamiento de pacientes ocurrió con consentimiento informado de los padres a los que el programa experimental , previamente aprobado por el Comité Ético de la Universidad de
Nápoles se había sometido.
Resultados ¦
(1) Actividad de peptidasa de bacteria de ácido
t láctico seleccionada i
La actividad de peptidasa se ensayó en substratos
sintéticos relativamente específicos para actividades de
j peptidasa que son importantes para la degradación de
oligopéptidos derivados de gluten (Figura 1) . Es posible
observar que L. sanfranciscensis DPPMA12 y L. plantarum
!
DPPMA125 muestran todas las actividades enzimáticas
¡ i consideradas. Con la excepción de actividad de 'tipo
tripeptidasa (PepT), dos bacterias de ácido láctico
seleccionadas, y particularmente L. plantarum MPPMA125,
muestran valores para otras actividades de peptidasa
significativamente superiores (P<0.05) a biotipois usado's en
el estudio por Rizzello y col. (Rizzello y col., 2007, Appl.
Environ. Microbiol. 73:4499:4507) . Diferencias j significativas, particularmente para actividades de p'epl,
PepQ, PepR y PepX, con presencia de residuos de prolin'a en
diversas posiciones de enlace, se detectaaron. La glutenina y
en particular gliadinas, contienen un porcentaje muy elevado i e inusual (45-60%) de glutamina y residuos de prolina. Este
últimino iminoácido, consecuentemente, en particular ocurre
en epítopes tóxidos, que resultan de harina de trigo, y
responsable de la patología de celíaca. Para proporcionar i microorganismos apropiados para degradación elevada de enlace
en donde la prolina está involucrada, esta actividad de
enzima es ciertamente un requisito previo para degradación de
gluten entensa y proceso de hidrólisis rápido. , La
disponibilidad de una Colección de Cultivo grande para
tamizar- y el gran número de actividades enzimáticas ensayadas
representan, por lo tanto, el requerimiento para obtener
cepas selecionadas no comúnmnte disponibles. La actividad de
peptidasa de bacterias lácticas seleccionaas se mejora
mediante el uso complementario de proteasas fúngales
rutinariamente usadas en procesos de elaboración de ¡pan.
Estas enzimas se emplean en la industria de elaboración de
pan a fin de modificar la concentración de proteina y, por lo
tanto, la "resistencia de harina", dependiendo de los
artículos horneados para los que están diseñadas.
La Figura 4 muestra una comparación de actividades i de peptidasa para bacterias de ácido láctico conocidas en el
I
ramo y dos bacterias de ácido láctico (DPPMA12 y DPPMA125) de
conformidad con la invención, respectivamente, y es evidente
que las últimas muestran actividades marcadamente superiores
de aminopeptidasa, iminopeptidasa de prolina y aminopeptidasa
de propil-dipeptidilo .
(2) Caracterización de harina hidrolizada. :
Después de la fermentación durante 12 h a 37°C> las
fracciones de proteína se extrajeron selectivamente y se
sometieron a ensayos analíticos complementarios. Como es
evidente usando análisis electroforático bidimensiíonal
(Figura 2),. al final del proceso de fermentación no son i detectables vestigios de gliadinas de harinas de variedad
Svevo y trigo duro Duilio. Se encontraron resultados
¡ similares en la fracción de glutenina para trigo tipo ¡"00"
comercialmente disponible, distintos a variedades de trigo
duro probadas (Arcangelo, Ciccio, Colosseo, Gargano y Simeto)
y harinas de cebada, centeno y avena. Las proteínas de hárina
de trigo, extraídas con 60% de etanol, se analizaron con
técnica MAL-TOF MS . Las crestas correspondientes a la norma
europea de gliadina desaparecieron completamente después de
fermentación durante 12 h a 37°C. Solamente algunas crestas
con masa molecular inferior a 8 kDa se detectaron | por
análisis de espectometría . Los análisis inmunológicos
! llevados a cabo usando anticuerpos R5 y ensayos ELISA
confirmaron que ningunos vestigios de gliadina fueron
detectables en muestra fermentada. DE conformidad co el
mismo método, la concentración de gluten residual determinada
en harina tipo "00" comercialmente disponible, variedad de
trigo duro y harinas de cebada, centeno y avena, en todos los
casos, fue inferior a 20 ppm. El método usado para ^stas
determinaciones es un AIC (Asociación I (taliana de Celíalca) ,
método oficial de WHO y FAO. Con respecto al dato reportado
de literatura (Rizzello y col., 2007. Appl. Environ.
Microbiol. 73:4499-4507), el proceso de hidrólisis se lle'va a
i cabo con la misma efectividad (gluten residual < 20 ppm) pero
I
en tiempos marcadamente más cortos (12 contra 48 h) . Este proceso resulta en régimen levado, por una parte, del uso de
I
concentración superior de cada una de las enzimas proteoliticas fúngales (400 ppm) y, por otra parte,
principalmente de actividad de peptidasa superior de biotipos
de bacterias lácticas seleccionadas. Nuevamente en comparación con referencia de literatura que solamente consideró harina de trigo de pan con baja concentración de
gluten inicial, la presente invención muestra la efectividad i de protocolo también en diversas variedades de trigo duro, y
I
harinas de cebada, centeno y avena que tienen también concentraciones iniciales elevadas de proteina. i
En la Figura 3, se reporta el contenido; de nitrógeno orgánico de harina de trigo para pan tipo "00"
comercialmente disponible antes y después del proceso de
fermentación. La harina hidrolizada consiste casi totalmente
de una mezcla de péptidos de bajo peso molecular y
aminoácidos. Solamente una cantidad inferior a 20%' de
i gluteninas iniciales está todavía presente en harina
hidrolizada . La concentración de aminoácido en hárina hidrolizada es alrededor de 15000 mg/kg comparada con < 1,000 mg/kg que ocurre en harina de trigo. La biodisponibilidad superior de aminoácidos libres hace de esta harina de tjrigo hidrolizada una materia prima con alto contenido nutricio'nal, reteniendo al mismo tiempo otras características
i nutricionales de cereal en términos de sales minerales, vitaminas y fibras. Cuando se usa como un ingrediente para la producción de alimentos libres de gluten, k la harina de trigo hidrolizada cubriría desequilibrios nutricionales que resultan de dieta libre de gluten (Grehn y col, 2001. Scand J. Nutr 45: 178-182; Mariani y col., 1998. J Pediart Gastroenterol Nut 27. 519-523; Thompson y col., 2005, J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169) .
La prueba comparativa con bacterias de ácido láctico conocidas en el ramo muestra que la concentración de aminoácido en la pasta es notoriamente inferior e igual a alrededor de 2000 mg/kg después de la condición de hidrólisis más elevada (figura 6) . Esto confirma el diferente grado de hidrólisis de proteínas de trigo. Además, puesto que : los aminoácidos liberados son precursores de compuestos volátiles que se generan durante el proceso de horneado y i son respnsables por el sabor e artículos horneados, | la
! I I
concentración de aminoácido libre notoriamente superior, ¡como
en el caso de la presente invención, indica síntesis superior
de compuestos volátiles, y por lo tanto, n mejor sabor de los
productos de conformidad con la invención.
i (3) Producción de artículos horneados fermentados
usando harina de trigo destoxificada !
Un ejemplo de aplicación de protocolo
biotecnológico para la fabricación de artículos horneados i fermentados basado en harina de trigo destoxificada se
reportó arriba. Además de la fabricación de artídulos
horneados, el protocolo se normalizó y optimizó ¡para producción de pan libre de gluten con ingredientes
previamente descritos. Además del posible uso directo de i harina de trigo destoxificada, un tratamiento de la misma
I
usando un secador de aspersión y uso subsecuente como materia
seca es posible. Esta posibilidad tecnológica adicional
permite una conservación fácil de la materia primea durante i el tiempo, sin ninguna alteración de características
nutricionales de harina de trigo.
La figura 7 muestra las mejoras propiedades
sensorials del pan de conformidad con la presente invención
(DPPMA12+DPPMA125) comparadas con pans del ramoconoqido.
Además, el cuadro 1 muestra que el panl de conformidad con la
presente invención se caracteriza por volumen especifico
superior, más burbujas de miga, rigidez inferior, y contenido
de fibra superior comparado con el pan el ramo conocido.
Estas diferencias resultan de la presencia de harina de tjrigo
que aún cuando destoxificada s apropiada para características
reologicas y químicas mejores de sabor.
Cuadro 1
I
* Lactobacillus sanfranciscensis DSM18426, DSM18427 ;
Lactobacillus plantarum DSMI8430
(4) Administración a pacientes de celíaca de i artículos horneados hechos de harina de trigo destoxificada
Artículos horneados preparados de conformidad con
el protocolo biotecnológico previamente descrito se ' han
administrado diariamente a pacientes de cel¡íaca
correspondiente a una dosis equivalente a 10 g de gljuten
!
nativo. En el Cuadro 2, los índices inmunoquímicos y hestológicos de pacientes de celíaca en remisión sometidos a consumo (10 g de gluten equivalente al día por 60 gg) b sado harina de trigo destoxificado se reportan.
Cuadro 2
Anti-tTG Inmunoquímica Grado Marsh:
CD3 CD25 ?s
momento de reclutamiento (To) muestran valores serológicos e histológicos normales (Grado de Marsh) . Después de icada consumo diario de 10 g de gluten equivalente, durante un período de 60 días (?ß?) ninguno de los valores bioquímicos e inmunohistoquímicos fue diferente comparado con el valor inicial. En particular, se debe observar que el Grado Marsh, que representa la condición de integridad y funcionalidad de la mucosa intestinal, como se detecta basado en muestra ¡bio- óptica, es absolutamente idéntico al valor inicial. Ningún
paciente desarrolló atrofia de villas intestinales durante el reto. Solamente uno de 5 pacientes reclutados interrumpió 1
prueba debido a razones personales y no dependiendo de
condición patológica eventual. Sobre la base de resultados
adquiridos basados en análisis clínicos más cuidados in vivo,
es posible manifetar que la harina de trigo destoxificada se
! toleró por todos los pacientes. En conclusión, la harina de
trigo destoxificada se puede usar para la preparación de
alimentos libres de gluten.
Claims (24)
- REIVINDICACIONES 1. - Mezcla que comprende o consiste de bacterias i de ácido láctico Latovacillus sanfranciscensis DSM22063 y Lactobacillus plantarum DSM 22064. j 2. - Mezcla de conformidad con la reivindicación 1, j que comprende además proteasas fúngales. ' 3. - Mezcla de conformidad con la reivindicación 2, en donde las proteasas fúngales se seleccionan el grupOj que consiste de proteasas Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, o mezclas de las mismas. ' 4. - Uso de la mezcla de conformidad con cada; una de las reivindicaciones anteriores para degradación completa de gluten en harinas y/o fermentación de las harinas. j 5. - Uso de conformidad con la reivindicación 4j, en donde las harinas se selccionan del grupo de harinas de trigo i tanto suave como duro, cebada, centeno o avena. : 6. - Proceso para la preparación de una pasta de harina liquida, en donde el gluten se degrada completamente, apropiada para la producción de productos libres de gluten fermentados, que comprende o consiste de los siguientes pasos : (: a) propagar el cultivo de bacterias de ácido láctico Lactobacillus sanf anciscensis DSM22063 y actobacillus | i 39 I plantarum DSM 22064; ¡ b) mezclar harina a concentraciones de 20-50%, de preferencia 30%, y agua, a 50-80%, de preferencia 70%, | que contiene la mezcla de dos cepas de bacterias del paso a) a densidad celular de alrededor de 108 cfu/g; ! c) añadir una o más proteasas fúngales, cada una a concentración de 200-500 ppm, de preferencia 400 ppm; ' d) fermentar durante 8-20 h, de preferencia 121 h, a 30-37°C. 7.- Proceso de conformidad con la reivindicación 6, que comprende además un paso e) de secado de pasta liquida obtenida en el paso d) . 8. - Proceso de conformidad con cualquiera dej las reivindicaciones 6-7, en donde la harina se selecciona! del grupo que consiste de ambos pan y harinas de trigo duro, cebada, centeno, avena o mezclas de las mismas, de preferencia harina e trigo tierno y duro. ' 9. - Proceso de conformidad con cada una de, las reivindicaciones 6-8, en donde las enzimas proteoliticas fúngales se seleccionan del grupo que consiste de proteasas Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o mezclas las mismas. • 10.- Pasta de harina liquida o seca en dond;e el I gluten se degrada completamente usando el proceso de ! ccnformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9. 11. - Mezcla que comprende o consiste de una pasta de conformidad con la reivindicación 10 en combinación! con una o más harinas naturalmente libres de gluten. ! sarraceno . 13. - Mezcla de conformidad con cada una de las reivindicaciones 11-12, en donde las harinas están contenidas de conformidad con los siguientes porcentajes: maíz nativo 5-15%, de preferencia 10%, maíz blanco 5-15%, de preferencia j 10%, harina de arroz, quinoa, amhárico o amaranto 10-30%, de preferencia 20%, y harina de trigo sarracena 1—10%; de preferencia 5%, en donde los porcentajes se expresan por 'peso basado en el peso total de la composición de harina. ' 14. - Proceso para la preparación de artículos horneados fermentados por medio de harina destoxificada de gluten usando el proceso de conformidad con cada una dé las reivindicaciones 6-9, que comprende o consiste de : los siguientes pasos: i a) añadir una mezcla de harinas naturalmente libres de Í gluten a 10-40%, de preferencia 30%, levadura de panaderp 1- 2%, sal 0.1-2.0% y agentes de estructuración 0.5-1% a ^asta de harina liguida destoxificada e gluten usando el proceso de conformidad con cada una de las reivindicaciones 6-}9 y amasar; b) dejar que la fermentación ocurra durante aproximadamente 1-3 h, de preferencia 1.5 h, a 30°C; ' c) hornear durante 50 minutos a 220°C. ! 15. - Proceso de conformidad con la reivindicaión 14, en donde la pasta de harina destoxifica de glute se seca, la relación en % de ingrediente a aguaj es aproximadamente 1.2:0.8. 16. - Proceso de conformidad con cada una de las reivindicaciones 14-15, en donde las harinas naturalmente libres de gluten son seleccionadas del grupo que consist.e en harina de maíz nativo, maíz blanco, arroz, quinoa, amhárica, amaranto trigo sarraceno o mezclas de las mismas. ¡ I 17. - Proceso de conformidad con cada una de1 las ! i reivindicación 14-16, en donde la harina destoxificada e gluten se selecciona del grupo que consiste de ambas Dan y ¡ harina de trigo duro, cebada, centeno, avena o mezclas dé las i mismas, de preferencia harina de trigo tierno y duro. 42 18. - Articulo horneado obtenible por medio! del proceso de conformidad con cada una de las reivindicaciones 14-17. 19. - Proceso para la preparación de artículos i i horneados fermentados que comprende o consiste de j los j siguientes pasos: : a) añadir directamente maíz nativo, harina de arroz, huevo, azúcar, mantequilla y levadura de termentador a pasta de harina destoxifica e gluten de conformidad con el proceso de cada una de las reivindicaciones 6-9 y amasar; b) dejar que la fermentación ocurra durante 1.5 h a 30 °C; y c) hornear la pasta fermentada durante 50 minutos a 250°C. 20. - Proceso de conformidad con la reivindic ción 19, en donde en el paso a) los porcentajes de j los ingredientes son los siguientes: maíz nativo 10%, harina de arroz 10%, huevo 5%, azúcar 3%, mantequilla 1% y levadura de panadero 1.5%. ! 21. - Artículos horneados fermentados obtenibles por medio del proceso de conformidad con cada una de las reivindicaciones 12-20. 22. - Uso de pasta de harina de conformidad con . la reivindicación 10, la mezcla de conformidad con j las reivindicaciones 11-13, producto fermentado en horno de conformidad con la reivindicación 18, productos de pastelería fermentados en horno de conformidad con la reivindicación 21 para la preparación de alimentos apropiados para cubhgrir los desequilibrios nutricionales que resultan de régimen alimentario libre de gluten. 23. - Bacteria de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063. : 24. - Bacteria de ácido láctico Lactobacillus ! plantarum DSM 22064. ' \ I ? RESUMEN DE LA INVENCIÓN j La presente invención se relaciona con el usó de bacterias de ácido láctico seleccionadas y enzimas fúngales i para la degradación completa de gluten de ambos pan y harina de trigo duro, cebada, centeno y avena. En particular,; la invención se relaciona con el uso de bacterias de ácido láctico seleccionadas y enzimas fúngales para la degradación completa de gluten (concentración de gluten residual inferior a 20 ppm) de harinas de cereal, que después de la destoxificación se pueden usar e conformidad con un protocolo biotecnológico normalizado para la producción de varios alimentos libres de gluten. i
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