IT202100013433A1 - Lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
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- A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
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- A21D8/045—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with a leaven or a composition containing acidifying bacteria
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Description
Descrizione
LIEVITO MADRE PER LA PREPARAZIONE DI PRODOTTI ALIMENTARI A
BASE VEGETALE
Campo tecnico
La presente invenzione ha per oggetto un lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale, in particolare prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine.
Arte nota
? nota da tempo l'esigenza di ridurre il consumo di carne nella dieta quotidiana, in quanto il consumo di carne ? considerato dannoso sia a livello ambientale ed ecologico sia per la salute della persona.
La carne, in particolare la carne rossa, ? stata classificata nel 2015 come ?probabilmente cancerogena per gli esseri umani? (Gruppo 2a) dall?Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC), mentre la carne lavorata (ad esempio gli insaccati) ? stata classificata come ?cancerogena per gli esseri umani? (Gruppo 1).
Inoltre, ? noto da tempo che la carne contenga alte quantit? di grassi saturi e colesterolo. Pertanto, una dieta che prevede un elevato consumo di carne contribuisce all?aumento di condizioni mediche quali l?obesit? e l?ipercolesterolemia e allo sviluppo di patologie quali patologie cardiovascolari croniche, cardiopatia ischemica, malattia diverticolare, polipi del colon e diabete.
A livello ecologico e ambientale il consumo di carne influisce sia direttamente che indirettamente incidendo sul benessere degli ecosistemi.
? provato che il settore agricolo sia responsabile di emissioni massicce di gas serra (circa un quarto delle emissioni globali) e che circa il 60% di tali emissioni sia dovuto all?allevamento intensivo di animali utilizzati per la produzione di carne e derivati animali.
La necessit? di produrre mangimi per animali in grandi quantit? per soddisfare il fabbisogno degli allevamenti richiede l?utilizzo di vaste superfici agricole i cui spazi sono ricavati spesso mediante deforestazione con una conseguente perdita di biodiversit?, oltre che una diminuzione della qualit? dell?aria.
Inoltre, la produzione di mangimi ? spesso associata alla diffusione di monocolture soggette al trattamento con pesticidi a lenta degradazione altamente tossici per gli insetti impollinatori quali le api, fondamentali per la sopravvivenza degli esseri umani e del pianeta.
Sono state pertanto sviluppate alcune tipologie di alimenti sostitutivi della carne, in grado di mantenere un gusto e una consistenza simili a quelli della carne, in modo da preservare nel consumatore il gusto di una dieta variata riducendo contestualmente i pericoli per la salute e per l?ambiente associati al consumo di carne.
I prodotti alimentari sostitutivi della carne attualmente in commercio sono prodotti a base di proteine derivate da leguminose quali la soia o graminacee quali il frumento.
In particolare, i prodotti alimentari sostitutivi della carne a base di frumento sono generalmente costituiti da un impasto di glutine. Un esempio tipico ? il seitan, un prodotto di origine orientale che si ottiene estraendo il glutine dalla farina di frumento e poi lessando l?impasto ottenuto in acqua contenente salsa di soia, alga kombu e altri aromi.
Con la maggiore consapevolezza degli effetti negativi legati al consumo di carne e la diffusione di diete vegetariane, vegane e macrobiotiche, la richiesta di prodotti sostitutivi della carne ? aumentata esponenzialmente nell?ultima decade. Ad oggi il mercato ? ricco di prodotti alimentari a base di glutine alternativi al seitan.
Il brevetto n. EP0821882 B1 a nome descrive un metodo di produzione di un prodotto a base vegetale sostitutivo della carne costituito da una miscela di glutine e farine di cereali e/o legumi, preferibilmente biologiche, che viene amalgamata con brodo vegetale o acqua, eventualmente insaporita e speziata, impastata, modellata e poi bollita. Il prodotto finale pu? essere commercializzato come sostitutivo di bistecche, stufati, salsicce, macinato, hamburger, prosciutto, bresaola, mortadella, pizzaiola e guanciale. In particolare, la miscela descritta dal brevetto ? costituita da una percentuale in peso tra il 45% e il 99% di glutine e tra lo 0.1% e il 55% di una farina vegetale derivata da cereali e/o legumi.
? pertanto evidente che i sostitutivi della carne presenti sul mercato presentano lo svantaggio di contenere un?alta percentuale in peso di glutine, un complesso proteico che viene idrolizzato in peptidi ad opera dell?enzima transglutaminasi durante la digestione nel tratto intestinale.
Un problema riscontrato nell?utilizzo di questi prodotti riguarda i soggetti predisposti alla celiachia, che possono sviluppare anticorpi anti-tranglutaminasi determinando un processo infiammatorio che porta i linfociti T ad ?aggredire? le cellule dei villi intestinali.
In particolare, la gliadina, proteina presente nel glutine, attivata dall?enzima transglutaminasi, attiva i linfociti T presenti nella lamina propria della mucosa intestinale, che migrano in sede subepiteliale e producono citochine causando apoptosi delle cellule dei villi intestinali.
L?apoptosi delle cellule dei villi provoca un appiattimento della mucosa intestinale che porta a malassorbimento intestinale con conseguenti alterazioni patologiche dello stato di salute del soggetto interessato.
Pertanto, il consumo di prodotti alimentari sostitutivi della carne a base di glutine ? altamente sconsigliato a soggetti predisposti alla celiachia, che ? ad oggi considerata l?intolleranza alimentare pi? frequente colpendo circa l?1% della popolazione.
Presentazione dell?invenzione
Il compito della presente invenzione ? quello di risolvere i problemi citati, escogitando un lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale in grado di diminuire il tenore in glutine del prodotto finito.
Nell'ambito di tale compito, ? ulteriore scopo della presente invenzione fornire un lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale in grado di conferire al prodotto alimentare finito un gusto, una consistenza e un aroma simili a quelli della carne.
Un altro scopo della presente invenzione quello di fornire un lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale in grado di conferire al prodotto alimentare finito una consistenza tale da migliorare l?affettabilit? del prodotto permettendo di mantenere l?integrit? del prodotto in fase di confezionamento. Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di fornire un lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale in grado di migliorare la conservabilit? dell?alimento aumentando la shelf-life del prodotto finito.
Un altro scopo della presente invenzione quello di fornire un prodotto alimentare a base vegetale con un ridotto contenuto di glutine.
Un ulteriore scopo dell?invenzione ? quello di fornire un prodotto alimentare a base vegetale che possa risultare digeribile e non dannoso per i consumatori con predisposizione alla celiachia.
Un altro scopo dell?invenzione ? quello di fornire un prodotto alimentare a base interamente vegetale in grado di sostituire la carne e i suoi derivati pur consentendo al consumatore una dieta variata.
Un ulteriore scopo dell?invenzione ? quello di fornire un prodotto alimentare a base vegetale contenente proteine esclusivamente di origine vegetale.
Un altro scopo dell?invenzione ? quello di fornire un prodotto alimentare a base vegetale con elevate propriet? nutrizionali e di elevata qualit?, ma di costo relativamente economico.
Gli scopi citati vengono raggiunti, secondo la presente invenzione, dal lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale secondo la rivendicazione 1, nonch? dal prodotto alimentare a base vegetale secondo la rivendicazione 4, dal procedimento per la produzione di un prodotto alimentare a base vegetale secondo la rivendicazione 8 e dall?uso del lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale secondo la rivendicazione 10. Il lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale oggetto dell?invenzione ? composto da un impasto di farine e acqua acidificato da un complesso di batteri lattici e lieviti in grado di avviare una fermentazione naturale. Vantaggiosamente la frazione di detti batteri lattici contenuta all?interno di detto lievito madre ? composta da batteri lattici della specie Lactobacillus plantarum, mentre la frazione di detti lieviti contenuta all?interno di detto lievito madre ? costituita da lieviti della specie Saccharomyces cerevisiae.
Vantaggiosamente l?impasto di base di detto lievito madre ? costituito da una miscela di acqua e farine selezionate tra farina di glutine, di cereali e di legumi. Preferibilmente la quantit? di acqua necessaria all?ottenimento di detto impasto di base di detto lievito madre varia da 300g a 500g per 1Kg complessivo di prodotto finito.
Vantaggiosamente detto lievito madre oggetto dell?invenzione ha mostrato una particolare capacit? di digestione delle proteine del glutine.
Detto lievito madre ? impiegato per la formulazione e la produzione di prodotti alimentari a base vegetale, in particolare per prodotti vegetali a basso tenore di glutine.
Vantaggiosamente detti prodotti alimentari a base vegetale addizionati con detto lievito madre oggetto dell?invenzione mostrano un basso tenore in glutine e un?alta digeribilit? anche per i soggetti predisposti alla celiachia.
Preferibilmente detti prodotti alimentari a base vegetale addizionati con detto lievito madre sono composti da glutine in una percentuale in peso da 20% a 40%. Preferibilmente detti prodotti alimentari a base vegetale addizionati con detto lievito madre sono composti da almeno una tipologia di farina di cereali in una percentuale in peso da 5% a 15% e/o almeno una tipologia di farina di legumi in una percentuale in peso da 10% a 30%, oppure con una miscela di almeno una tipologia di farina di cereali e almeno una tipologia di farina di legumi in una percentuale in peso da 10% a 30%.
Vantaggiosamente dette farine di cereali sono selezionate tra farine di grano duro e farine di grano tenero.
Dette farine di cereali possono essere farine di crusca, integrali, fini, extrafini.
Preferibilmente dette farine di cereali sono farine biologiche.
Vantaggiosamente dette farine di legumi sono selezionate tra farine di ceci, piselli, lupino, lenticchie.
Preferibilmente dette farine di legumi sono farine biologiche.
Dette miscele di farine cos? ottenute sono addizionate con detto lievito madre. Detta miscela di glutine, farine e lievito madre ? preferibilmente insaporita per mezzo di una miscela di spezie.
Vantaggiosamente dette spezie presenti in detta miscela sono scelte tra un gruppo comprendente pepe, origano, noce moscata, zenzero, peperoncino e altre.
Detta miscela di farine di cereali e/o legumi addizionata con detta miscela di spezie ? impastata con acqua e/o brodo vegetale.
Preferibilmente la quantit? di detta acqua e/o detto brodo vegetale necessarie variano da 200g a 600g per ogni Kg di prodotto finito ottenuto da detta miscela di farine di cereali e/o legumi utilizzate.
Per donare maggiore elasticit? all?impasto ? vantaggiosamente addizionata una percentuale variabile tra 5% e 20% di almeno un olio vegetale alla miscela cos? ottenuta.
Preferibilmente detto olio vegetale ? selezionato tra olio extravergine di oliva e olio di semi di girasole.
Combinando in diverse proporzioni acqua e/o brodo vegetale con le varie tipologie di farine di cereali e di legumi, le diverse tipologie di spezie, gli oli vegetali e il glutine ? possibile variare la consistenza, il gusto e l?aroma dei prodotti alimentari ottenuti.
Il procedimento per la produzione dei prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine comprende le fasi di:
a) miscelare detto glutine con almeno una detta tipologia di farina di cereali, almeno una detta tipologia di farina di legumi o una detta miscela di almeno una detta tipologia di farina di cereali e almeno una detta tipologia di farina di legumi; b) addizionare detta miscela ottenuta con detto lievito madre;
c) insaporire detta miscela di glutine, farine e lievito madre per mezzo di una miscela di spezie;
d) aggiungere acqua e/o brodo vegetale a detta miscela e impastare fino ad ottenere un composto omogeneo;
e) insaccare detto impasto in forma sostanzialmente cilindrica o eventualmente schiacciata, tramite apposite forme, con involucri tipici degli insaccati (fibrous, cellulosa, etc.);
f) bollire detto insaccato in acqua e/o brodo vegetale e lasciare raffreddare.
Vantaggiosamente, per donare maggiore elasticit? a detto impasto ? addizionato almeno un olio vegetale a detta miscela.
Preferibilmente detto impasto modellato ? bollito in acqua e/o brodo vegetale per 60-90 minuti e lasciato raffreddare per una notte per ottenere una consistenza tale da migliorare l?affettabilit? del prodotto permettendo di mantenere l?integrit? del prodotto in fase di confezionamento.
Breve descrizione dei disegni
I particolari dell?invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata della composizione del lievito madre per la produzione di prodotti alimentari a base vegetale e del prodotto alimentare a base vegetale a basso tenore di glutine.
Negli uniti disegni sono illustrati i dati ottenuti dagli studi effettuati per perfezionare il lievito madre come rivendicato e per indagare l?attivit? proteolitica del lievito madre rivendicato sulle proteine del glutine.
La figura 1 mostra il risultato dell?amplificazione ITS dei lieviti estratti dal primo campione di lievito analizzato;
la figura 2 mostra il risultato dell?amplificazione ITS dei batteri lattici estratti dal primo campione di lievito analizzato;
la figura 3 rappresenta un esempio di sviluppo del ceppo MM6 su Gluten Media; la figura 4 mostra i risultati delle corse elettroforetiche dei ceppi di lieviti estratti dal secondo campione di lievito analizzato e del clone MW1 ottenuto dall?isolamento del primo campione del lievito madre;
la figura 5 mostra i risultati delle corse elettroforetiche dei ceppi di batteri lattici estratti dal secondo campione di lievito analizzato e del clone LP1 ottenuto dall?isolamento del primo campione del lievito madre;
le figure 6-10 sono cromatogrammi che rappresentano i risultati delle analisi di massa del campione denominato ?Delicato Lievito? utilizzando Etanolo 70% per l?estrazione delle proteine;
le figure 11-14 sono cromatogrammi che rappresentano i risultati delle analisi di massa del campione denominato ?Delicato Lievito? utilizzando DMF 1.5M per l?estrazione delle proteine;
le figure 15, 16 sono cromatogrammi che rappresentano i risultati delle analisi di massa del campione denominato ?Delicato No Lievito? utilizzando Etanolo 70% per l?estrazione delle proteine;
le figure 17-19 sono cromatogrammi che rappresentano i risultati delle analisi di massa del campione denominato ?Delicato No Lievito? utilizzando DMF 1.5M per l?estrazione delle proteine;
le figure 20-22 riportano le separazioni su gel elettroforesi con condizioni ottimizzate dei campioni di farina di grano tenero, farina di grano duro, glutine, miscela di farine, Delicato dopo TTS e Veghiamo? con a lato riportata l?analisi ottenuta al densitometro;
le figure 23-27 sono cromatogrammi HPLC che rappresentano i risultati delle analisi di massa dei campioni di Glutine estratto con Etanolo 70%, miscela di farine LG4, miscela di farine LG8, Veghiamo? estratto con Etanolo 70%, Veghiamo? dopo estrazione da gel elettroforesi.
Le figure 28-57 sono cromatogrammi che rappresentano i risultati delle analisi di massa dei campioni di glutine, miscela di farine, Delicato dopo TTS, Veghiamo?. Forme di realizzazione dell?invenzione
Tutti i termini tecnici e scientifici menzionati in questo documento hanno un significato che pu? essere comunemente compreso da un esperto del ramo, se non diversamente definiti.
Il lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale oggetto dell?invenzione ? composto da un impasto di farine e acqua acidificato da un complesso di batteri lattici e lieviti in grado di avviare una fermentazione naturale. In particolare, la frazione di batteri lattici contenuta all?interno del lievito madre ? composta da batteri lattici della specie Lactobacillus plantarum, mentre la frazione di lieviti contenuta all?interno del lievito madre ? costituita da lieviti della specie Saccharomyces cerevisiae.
L?impasto di base del lievito madre ? costituito da una miscela di acqua e farine selezionate tra farina di glutine, di cereali e di legumi.
La quantit? di acqua necessaria all?ottenimento dell?impasto di base del lievito madre varia da 300g a 500g per 1Kg complessivo di lievito.
Il lievito madre oggetto dell?invenzione ha mostrato una particolare capacit? di digestione delle proteine del glutine.
Riportiamo di seguito le analisi effettuate per la caratterizzazione dei componenti del lievito madre e le indagini sull?attivit? proteolitica del lievito madre sulle proteine del glutine (?-gliadina, ?-gliadina e gluteina).
1. Analisi di un primo campione di lievito madre
Inizialmente ? stato analizzato un campione di lievito madre di interesse per la formulazione di prodotti alimentari a base vegetale. Il campione, datato 26.04.2017 ? stato denominato PH407 ed ? stato sottoposto ad analisi microbiologica per la ricerca e il conteggio dei ceppi microbiologici di interesse. In particolare, si ? concentrata l?analisi sul rilevamento della presenza di batteri lattici e lieviti, noti per essere i microrganismi maggiormente coinvolti nei processi fermentativi utili nell?ambito delle biotrasformazioni alimentari.
Inoltre, si ? analizzata la flora generica e genericamente inquinante presente all?interno del campione.
La Tabella 1 riporta le numerazioni ottenute:
La flora generica e genericamente inquinante in Plate Count Agar ? ritenuta di scarsa rilevanza ai fini del processo produttivo del prodotto alimentare a base vegetale, pertanto non si ? ritenuto necessario procedere all?isolamento dei singoli ceppi.
Si ? proceduto all?analisi delle colonie ottenute sulla piastra agarizzata a maggiore diluizione, che rappresentano la flora dominante rispetto alla composizione del lievito madre. Le colonie sono state analizzate dal punto di vista morfologico e mediante osservazione microscopica.
Per procedere all?isolamento in purezza dei ceppi di interesse si sceglie un numero pari alla radice quadrata del numero di colonie simili per morfologia e all?osservazione microscopica. Sono state isolate 7 colonie dal terreno selettivo per lieviti (WL Nutrient Agar) e 5 colonie dal terreno selettivo per batteri lattici (MRS Agar).
I ceppi isolati in purezza sono stati sottoposti ad estrazione del DNA ed amplificazione PCR.
Inizialmente sia per i batteri lattici che per i lieviti si ? provveduto ad uno screening iniziale mediante ITS (Internal Transcribed Spacers) al fine di valutare la presenza di differenti specie (risultati in figura 1 e figura 2).
In seguito per i lieviti ? stata eseguita l?amplificazione del 26S rDNA e per i batteri lattici l?amplificazione del 16S rDNA. Successivamente si ? proceduto al sequenziamento dei campioni e all?attribuzione della specie di appartenenza. I batteri lattici isolati, come emerso dai dati ottenuti, appartengono tutti alla specie Lactobacillus plantarum, dotato di elevata attivit? proteolitica.
I lieviti isolati appartengono tutti alla specie Saccharomyces cerevisiae.
2. Indagine dell?attivit? proteolitica di 6 ceppi di Lactobacillus plantarum Successivamente ? stata svolta un?indagine qualitativa dell?attivit? proteolitica dei sei ceppi di Lactobacillus plantarum presenti all?interno del campione di lievito madre denominato PH407 datato 26.04.2017 precedentemente analizzato.
I batteri lattici sono stati inoculati su terreno di coltura Gluten Media, un terreno agarizzato contenente glutine come unica fonte di azoto.
I sei ceppi analizzati sono stati dapprima sviluppati in terreno di coltura MRS e posti in incubatrice a 37?C per 48 ore in condizioni di anaerobiosi.
Successivamente le cellule sono state centrifugate e lavate con soluzione Ringer e due gocce del diametro di 1 cm per ciascuna coltura sono state depositate su una piastra di Gluten Media (in figura 3 ? rappresentato un esempio di sviluppo del ceppo MM6 su Gluten Media).
Le piastre sono state incubate a 37?C per 48 ore in condizioni di anaerobiosi. Si ? valutata la crescita dei ceppi saggiati su terreno contente il glutine e l?attivit? proteolitica dei ceppi ? stata valutata in funzione del diametro della zona di precipitazione formata intorno alla colonia.
Tutti i ceppi ad esclusione del numero 2 si sono sviluppati su Gluten Media, ma nessuno dei ceppi saggiati ha mostrato un alone di precipitazione intorno alla colonia. Questo non indica necessariamente assenza di attivit? proteolitica nei ceppi saggiati, ma pu? essere indicativo di un?attivit? proteolitica dei ceppi al di sotto del limite di rilevabilit? della tecnica illustrata precedentemente.
3. Indagine di un secondo campione di lievito madre
? stata svolta un?indagine su un secondo campione di lievito madre datato 15.12.2017. Il campione ? stato sottoposto ad analisi microbiologica per la ricerca ed il conteggio selettivo di ciascun gruppo di interesse.
In particolare, si ? concentrata l?analisi sul rilevamento della presenza di batteri lattici e lieviti, noti per essere i microrganismi maggiormente coinvolti nei processi fermentativi utili nell?ambito delle biotrasformazioni alimentari.
Inoltre, si ? analizzata la flora generica e genericamente inquinante presente all?interno del campione.
La tabella 2 riporta le numerazioni ottenute.
Si ? proceduto all?analisi delle colonie ottenute sulla piastra agarizzata a maggiore diluizione, che rappresentano la flora dominante rispetto alla composizione del lievito madre. Le colonie sono state analizzate dal punto di vista morfologico e mediante osservazione microscopica.
Per procedere all?isolamento in purezza dei ceppi di interesse si sceglie un numero pari alla radice quadrata del numero di colonie simili per morfologia e all?osservazione microscopica.
Al fine di procedere all?identificazione dei batteri lattici e dei lieviti dominanti si ? provveduto ad isolare in purezza 3 colonie dal terreno selettivo per lieviti (denominate F1, F2 ed F3) e 3 colonie dal terreno selettivo per i batteri lattici (denominate F5, F6 ed F7).
Successivamente i ceppi isolati in purezza sono stati sottoposti ad estrazione del DNA ed amplificazione PCR al fine di caratterizzare i cloni isolati.
In particolare, per i lieviti ? stata applicata la Multilocus Sequence Typing, metodica indirizzata all?amplificazione dei microsatelliti, mentre per i batteri lattici ? stata applicata la Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD-PCR). ? stato possibile verificare, inserendo nell?analisi molecolare due cloni ottenuti dall?isolamento effettuato sul primo campione di lievito madre (in cui il batterio lattico ? denominato LP1 e il lievito MW1), che i cloni isolati nel secondo campione del lievito madre fossero gli stessi isolati dal primo campione analizzato. Questo passaggio consente anche indirettamente di confermare la specie di appartenenza degli isolati ottenuti.
Per quanto riguarda i lieviti, come mostrato in figura 4, i tre isolati del secondo campione mostrano un profilo identico al clone MW1 purificato nel corso della prima indagine e si confermano essere appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae.
Per quanto riguarda i batteri lattici, come mostrato in figura 5, i tre isolati del secondo campione mostrano profilo identico al clone MM1 purificato nel corso della prima indagine e si confermano essere appartenenti alla specie Lactobacillus plantarum.
4. Indagine dell?attivit? proteolitica del lievito madre
4.1 - In una prima analisi sono stati analizzati due campioni per indagare l?attivit? proteolitica del lievito madre sulle proteine del glutine (?-gliadina, ?-gliadina e gluteina): il primo campione ? stato denominato ?Delicato No Lievito?, mentre il secondo campione ? stato denominato ?Delicato Lievito?.
I campioni sono stati sottoposti a distinte procedure di estrazione. In particolare, l?estrazione ? avvenuta sia mediante Etanolo al 70% utile all?estrazione della proteina gliadina presente nei campioni, che mediante una soluzione di DMF 1.5M utile all?estrazione di frammenti peptidici derivati dall?idrolisi della gliadina.
Pertanto, in totale sono stati analizzati 4 estratti, che sono stati poi sottoposti a centrifuga, separati e concentrati:
1. RDM1106: Delicato Lievito, estrazione con Etanolo 70%;
2. RDM1107: Delicato Lievito, estrazione con DMF 1.5M;
3. RDM1108: Delicato No Lievito, estrazione con Etanolo 70%;
4. RDM1109: Delicato No Lievito, estrazione con DMF 1.5M.
Durante il processo di estrazione i campioni hanno la tendenza a decomporsi, pertanto ? possibile rilevare la presenza di peptidi leggermente differenti da quelli attesi, in particolare durante il processo di idrolisi la glutammina (Gln, Q) si trasforma in acido glutammico (Glu, E).
A causa della strumentazione utilizzata non ? stato possibile identificare il peso della proteina intera (?-gliadina, ?-gliadina e gluteina), ma sono state identificate l sequenze peptidiche allergeniche che derivano dalle proteine stesse.
Le analisi di massa del campione denominato ?Delicato Lievito? utilizzando Etanolo 70% per l?estrazione sono riportate nei cromatogrammi in figura 6-10. I pesi molecolari indicati nei cromatogrammi indicano:
? P.M. 3909.019 rappresenta l?unit? ripetitiva della gliadina-? (33-Mer).
Sequenza: LQLQPFPQPQLPYPQPQLYPQPQLPYPQPQPF;
? P.M. 1506. 13 frammento della gliadina-? in cui l?acido glutammico Glu (E) ? sostituito alla glutammina Gln (Q). Sequenza: PEPELPYPPEPELP;
? P.M. 1458.678. 12 frammento della gliadina-?. Sequenza: FSQPQQQFPQPQ; ? P.M. 1455. 12 frammento che rappresenta il prodotto dell?idrolisi dell??gliadina. In massa si evidenzia M/4=365;
? P.M. 3147. 26 frammento della gliadina-? attivo. Sequenza:
FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ;
? P.M. 2407. 20 frammento della gliadina-? in cui 6 Glu sostituiscono 6 Gln.
Sequenza: LEPEEPFPEEPEQPYPQQPQ;
? P.M. 1669.846. 14 frammento della gliadina-? in cu la glutammina Q ? trasformata in acido glutammico E. Sequenza: PEPELPYPEPELPY.
Le analisi di massa del campione denominato ?Delicato Lievito? utilizzando DMF 1.5M per l?estrazione sono riportate nei cromatogrammi in figura 11-14.
I pesi molecolari indicati nei cromatogrammi indicano:
? P.M. 1526.74. 13 frammento ?-gliadina particolarmente immunogenico. Q trasformato in E per un totale di 4E, P.M. 1530.74. Sequenza: LGEEEPFPPEEPY;
? P.M. 3795.935. 32 frammento di 33-Mer ?-gliadina attivo con E al posto di Q per un totale di 8E. Sequenza:
ELEPFPEPELPYPEPELPYPEPELPYPQPQPF;
? P.M. 1085.544. 9 frammento di 33-Mer inattivo. Sequenza: LPYPQPQPF; ? P.M. 3909.019. 33 frammento di 33-Mer ?-gliadina. Sequenza:
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF;
? P.M. 2401.17. 20 frammento ?-gliadina. Sequenza:
LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ;
? P.M. 1992.0. 17 frammento ?-gliadina. Sequenza: QLQPFPQPQLPYPQPQS; ? P.M. 1501.78. 13 frammento ?-gliadina. Sequenza: PQPQLPYPQPQLP. Le analisi di massa del campione denominato ?Delicato No Lievito? utilizzando Etanolo 70% per l?estrazione sono riportate nei cromatogrammi in figura 15,16. I pesi molecolari indicati nei cromatogrammi indicano:
? P.M. 3909.019. 33 frammento di 33-Mer ?-gliadina. Sequenza:
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF;
? P.M. 1526.74. 13 frammento ?-gliadina particolarmente immunogenico. Q trasformato in E per un totale di 4E. P.M.: 1530.74. Sequenza: LGEEEPFPPEEPY;
? P.M.: 1404.766. 12 frammento di 33-Mer inattivo. Sequenza: LQLQPFPQPQLP.
Le analisi di massa del campione denominato ?Delicato No Lievito? utilizzando DMF 1.5M per l?estrazione sono riportate nei cromatogrammi in figura 17-19.
I pesi molecolari indicati nei cromatogrammi indicano:
? P.M. 1992.0. 17 frammento ?-gliadina. Sequenza: QLQPFPQPQLPYPQPQS; ? P.M. 1532.74. 13 frammento ?-gliadina particolarmente immunogenico. Q trasformato in E per un totale di 5E. Sequenza: LGEEEPFPPEEPY;
? P.M. 1463.678. 12 frammento ?-gliadina con 5E. Sequenza:
FSEPEEEFPEPQ;
? P.M. 2221.085. 19 frammento ?-gliadina. Sequenza:
LGQQQPFPPQQPYPQPQPF.
In conclusione, dagli estratti analizzati ? evidente la presenza della porzione particolarmente allergenica P.M. 1526 presente in quasi tutti i campioni. ? stata osservata la presenza del frammento 33Mer della gliadina-? con peso molecolare 3909.019. Durante l?idrolisi avviene la trasformazione della glutammina (Gln, Q) in acido glutammico (Glu, E), la presenza di questi frammenti ? stata osservata nelle analisi sopra riportate. Pertanto, i peptidi allergenici non sono attaccati da lievito, mentre le proteine sono degradate. Queste ultime sono degradate nei peptidi allergenici a livello digestivo.
4.2 ? In un secondo momento sono stati analizzati 6 diversi campioni:
1. Farina Grano Tenero Lotto: FMV 201902210008
2. Farina Grano Duro Lotto: FMV 201903270003
3. Glutine Lotto: FMV 201903080002
4. Miscela:
Farina Grano Tenero
Farina Grano Duro
Farina di Ceci
Glutine
Lotto: FMV 201902200004
5. Delicato dopo TTS 10/04/2019 Lotto: 020070419
6. Veghiamo? Lotto: 0600303-scadenza 18/06/2019
Inizialmente si ? proceduto all?estrazione delle proteine tramite elettroforesi gel. Successivamente si ? proceduto al taglio delle bande della gliadina con PM:40KDa e all?estrazione per analizzare i campioni tramite HPLC-MS.
I singoli campioni sono stati sottoposti a procedure di estrazione. In modo particolare le gliadine sono state estratte con EtOH al 70%. Di tutti i campioni ? stata fatta la quantificazione su 1gr di materiale e i risultati ottenuti sono stati riportati in mg nelle tabelle sottostanti.
La quantit? maggiore di gliadina, tra le farine analizzate, ? presente nel glutine 72.01 mg su 1gr di campione analizzato.
Nei campioni successivi ? stata osservata un?incongruenza nei risultati. I campioni, Delicato dopo TTS e Veghiamo?, dove il Delicato rappresenta il campione che ha subito tutti i trattamenti e infine ? stato sottoposto al taglio per l?ottenimento del prodotto finale denominato ?Veghiamo??, dalle analisi di quantificazione i risultati sono stati differenti. Possiamo osservare che il campione Delicato mostra come risultato della quantificazione un valore di gliadine pari a 33.99 mg mentre nel Veghiamo? il valore ? stato pari a 22.79 mg.
Le proteine contenute nei campioni sono state separate tramite gel elettroforesi. Sono state fatte diverse prove per ottenere la miglior separazione possibile e i dati ottimali sono stati ottenuti usando un gel elettroforesi al 10% e come tampone il MOPS.
Nelle figure 20-22 sono ripotate le separazioni dei campioni su gel elettroforesi con condizioni ottimizzate con a lato riportata l?analisi ottenuta dal densitometro. I dati sono stati riportati tramite istogrammi: in ascisse sono presenti i range dei pesi molecolari (PM) in KDa mentre sulle ordinate il valore medio della densit? letta al densitometro.
Le zone d?interesse per le gliadine ? quella tra 50-31 KDa. Come possiamo osservare la densit? di gliadine nelle farine ? molto elevata in tutti gli istogrammi riportati.
Si ? inoltre osservato nel campione ?Delicato dopo TTS? la presenza di 3 bande tra 50-31KDa con diverso valore di densit? medio, mentre nel campione ?Veghiamo??, a parit? di condizioni di separazione in gel elettroforesi, ? stata osservata nello stesso intervallo 50-31KDa soltanto un'unica banda della gliadina. Risultati che confermano quanto dichiarato per i dati ottenuti dalla quantificazione. Successivamente ? stata operata una degradazione con l?enzima tripsina e infine i peptidi sono stati estratti con un?opportuna miscela estraente e analizzati con HPLC-MS.
Procedura di estrazione:
Il taglio di ogni singola banda ? stato operato mediante un bisturi chirurgico.
Essendo state le bande colorate con il Blu di Coomassie per la visualizzazione al densitometro, le bande sono state sottoposte ad una prima fase di decolorazione usando una soluzione 100mM di ammonio bicarbonato/acetonitrile (1:1, V/V), incubato a temperatura ambiente e vortexato ogni 30 minuti. ? stato aggiunto altro acetonitrile e lasciato ad incubare fin quando le bande non sono diventate bianche e ripiegate. Le bande sono state conservate a -20?C.
L?estrazione ? avvenuta usando la tripsina in soluzione tampone fino a ricoprire completamente ogni singola banda. Dopo 30 minuti, ove ritenuto necessario si ? provveduto ad aggiungere altra tripsina per evitare che le bande si seccassero e non fossero pi? in contatto con la tripisina. Sono state poi lasciate in incubazione per una notte a 37?C.
Dopo una notte ? stato allontanato l?enzima ed aggiunta una soluzione di acido formico 5%/acetonitrile per estrarre i peptidi che hanno subito la digestione da parte dell?enzima. I campioni sono conservati a -20?C.
Analisi HPLC-MS
Di seguito sono riportate le analisi di massa dei campioni. Nel dettaglio sono stati analizzati i seguenti campioni:
? Glutine Lotto: FMV 201903080002 (LG3-LG6)
? Miscela di farine, Lotto: FMV 201902200004 (LG4-LG8)
? Delicato dopo TTS 10/04/2019 Lotto: 020070419 (LG5-LG7-LG15-LG17) ? Veghiamo? Lotto: 0600303-scadenza 18/06/2019 (LG11-LG19)
Le frazioni ricercate in massa sono state le seguenti:
? LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF 33-mer 3909.019 (altri pesi diagnostici: m/6 = 652.8 e m/4 = 979.6);
? FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ 26-mer 3145.53 e frammenti; ? LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ 20-mer 2401.17 e frammenti;
? LGQQQPFPPQQPYPQPQPF 19-mer 2221.085 e frammenti;
? QLQPFPQPQLPYPQPQS 17-mer 1992.0 e frammenti;
? PQPQLPYPQPQLPY 14-mer 1664.846 e frammenti;
? LGQQQPFPPQQPY 13-mer 31-43 dell??-gliadina, particolarmente immunogenico 1526.74 e frammenti;
? FSQPQQQFPQPQ 12-mer gamma 1458.678 e frammenti.
Di interesse diagnostico possono essere anche le sequenze:
? SGQGSFQPSQQ frammento 206?2161149.494;
? SSQGSFQPSQQN 1293.548;
? PQPQLPYPQPQLP 13-mer 1501.78;
? QLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF 32 frammento di 33-mer 3795.935;
? QPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF 29-mer frammento di 33-mer 3554.792;
? LQLQPFPQPQLP 12-mer frammento di 33-mer inattivo 1404.766;
? LQLQPFPQPQ 10-mer frammento di 33-mer inattivo 1194.629;
? LPYPQPQPF 9-mer frammento di 33-mer inattivo 1085.544;
? QPQPFPQQPYP 12-mer 1325.63.
Inoltre, sono state cercate anche sequenze che presentassero una o pi? deaminazioni dei residui glutammina (Q) che dessero acido glutammico (E). Le prime analisi riguardano l?estrazione delle gliadine con EtOH prima di subire la separazione con gel elettroforesi.
? stata usata una colonna con le seguenti dimensioni: colonna C18 XSelect Peptide CSH 4.6x100 mm, 130A, 3.5microm. Solventi usati: A = H2O/ CH3CN 95:5+0.1%TFA, B = H2O/ CH3CN 5:95+0.1%TFA.
Dai cromatogrammi HPLC (figure 23-27) si ? potuto osservare la netta divisione delle gliadine in rapporto al tempo di eluizione dalla colonna.
Le ?/?-gliadine eluiscono tra 7 min e 16 min. Le ?-gliadine tra 16 min e 18 min. Infine le ?-gliadine eluiscono tra 18 min e 30 min.
Il glutine presenta una elevata concentrazione di gliadine.
LG4, LG8 e ?Veghiamo?? sono i campioni dopo gel elettroforesi. Si pu? osservare la presenza di picchi alti e stretti riconducibili a sostanze lipofiliche rimaste nella colonna.
Sulla base dei risultati ottenuti, la colonna ? stata sostituita con una C18110 ? 100 ? 3.0 mm, i solventi usati H2O+0.01% di HCOOH e CH3CN+0.01% di HCOOH.
Tutte le analisi di massa sono state analizzate in base al rapporto massa/carica (m/z), dove m ? la massa molecolare, z indica il numero di cariche positive presenti sula molecola. Sulla base dei dati presenti in letteratura, queste molecole prendono un numero massimo di 10 cariche, per questo motivo ogni singola massa ? stata analizzata con z=1,2,3?..10.
Sia il glutine che la miscela di farine, presentano una gran quantit? di frammenti che sono stati associati alle sequenze 33-mer,12-mer, 13-mer, 14-mer, 17-mer, 19-mer e 29-mer. Sono riscontrate le stesse sequenze deamminate, con acido glutammico al posto della glutammina.
Il campione ?Delicato? presenta una maggiore quantit? di frammenti tossici rispetto al campione denominato ?Veghiamo??, ma il ?Delicato? presenta solo la frazione 10-mer e 12-mer frammento, le quali sono frazioni inattive mentre il campione ?Veghiamo?? contiene come frazioni inattive la 9-mer, 10-mer e 12-mer frammento di 33-mer.
In conclusione, il campione ?Veghiamo?? mostra una quantit? di gliadine tossiche inferiore rispetto al campione ?Delicato dopo TTS?, pertanto il lievito fresco ? atto a degradare maggiormente le proteine del glutine, arrivando ad una sensibile riduzione sia qualitativa che quantitativa dei frammenti allergenici.
Nelle figure 28-57 sono riportate tutte le analisi di massa con indicati i frammenti tossici e inattivi trovati.
Il lievito madre analizzato ? impiegato per la formulazione e la produzione di prodotti alimentari a base vegetale, in particolare per prodotti vegetali a basso tenore di glutine.
I prodotti alimentari a base vegetale addizionati con il lievito madre oggetto dell?invenzione mostrano un basso tenore in glutine e un?alta digeribilit? anche per i soggetti predisposti alla celiachia. La capacit? del lievito madre di degradare le proteine del glutine e di ridurre i frammenti allergenici derivati dalla degradazione di tali proteine ? dimostrata dalle sopracitate analisi.
I prodotti alimentari a base vegetale che vengono addizionati con il lievito madre sono composti da glutine in una percentuale in peso da 20% a 40%, almeno una tipologia di farina di cereali in una percentuale in peso da 5% a 15% e/o almeno una tipologia di farina di legumi in una percentuale in peso da 10% a 30%, oppure con una miscela di almeno una tipologia di farina di cereali e almeno una tipologia di farina di legumi in una percentuale in peso da 10% a 30%.
Le farine di cereali sono selezionate tra farine di grano duro e grano tenero.
Dette farine di cereali possono essere farine di crusca, integrali, fini, extrafini. Preferibilmente dette farine di cereali sono farine biologiche.
Le farine di legumi sono selezionate tra farine di ceci, piselli, lupino e lenticchie. Preferibilmente dette farine di legumi sono farine biologiche.
Le miscele di farine cos? ottenute sono addizionate con il lievito madre.
La miscela di glutine, farine e lievito madre ? preferibilmente insaporita per mezzo di una miscela di spezie.
Le spezie presenti in detta miscela sono scelte tra un gruppo comprendente pepe, origano, noce moscata, zenzero, peperoncino e altre.
La miscela di farine di cereali e/o legumi addizionata con la miscela di spezie ? impastata con acqua e/o brodo vegetale.
La quantit? di acqua e/o brodo vegetale necessarie variano da 200g a 500g per ogni Kg di prodotto finito.
Per donare maggiore elasticit? all?impasto ? vantaggiosamente addizionata una percentuale variabile tra 5% e 20% di almeno un olio vegetale alla miscela cos? ottenuta.
L?olio vegetale ? selezionato tra olio extravergine di oliva e olio di semi di girasole. Combinando in diverse proporzioni acqua e/o brodo vegetale con le varie tipologie di farine di cereali e di legumi, le diverse tipologie di spezie, gli oli vegetali e il glutine ? possibile variare la consistenza, il gusto e l?aroma dei prodotti alimentari ottenuti.
Esempi di prodotti alimentari a base vegetale ottenuti dalla lavorazione dei componenti sopradescritti sono gli affettati vegetali della linea Veghiamo?.
Un primo esempio ? l?affettato vegetale al lupino, che contiene acqua, farina di lupini 25%, glutine di frumento 22%, olio di semi di girasole, amido di frumento, aromi naturali, sale, aceto di mele, miscela di spezie e piante aromatiche, farina di ceci, semola di grano duro, correttore di acidit?: bicarbonato di sodio, lievito madre.
Un secondo esempio ? l?affettato vegetale speziato, che contiene acqua, glutine di frumento 32%, semola di grano duro 8%, farina di ceci, olio extravergine di oliva, aromi naturali, farina di grano tenero, sale, miscela di spezie e piante aromatiche, lievito madre, olio di semi di girasole.
Un terzo esempio ? l?affettato vegetale con curcuma e zenzero, che contiene acqua, glutine di frumento 32%, semola di grano duro 9%, farina di ceci, olio di semi di girasole, aromi naturali, sale, zenzero in polvere 2%, curcuma in polvere 0,4%, peperoncino in polvere, lievito madre, pepe in polvere, aglio in polvere. I prodotti descritti a titolo esemplificativo, facenti parte di una pi? ampia gamma di prodotti a base vegetale commercializzati dalla Richiedente, sono suscettibili di numerose modifiche e varianti a seconda delle diverse esigenze.
Nella pratica attuazione dell?invenzione, gli ingredienti impiegati, nonch? la forma e le dimensioni, possono essere qualsiasi a seconda delle esigenze.
Il procedimento per la produzione dei prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine risulta facilmente comprensibile dalla descrizione che precede. Il glutine ? miscelato con almeno una tipologia di farina di cereali, almeno una tipologia di farina di legumi o una miscela di almeno una tipologia di farina di cereali e almeno una tipologia di farina di legumi.
La miscela cos? ottenuta ? addizionata con il lievito madre.
La miscela di glutine, farine e lievito madre ? insaporita per mezzo di una miscela di spezie.
Sono aggiunti acqua e/o brodo vegetale e gli ingredienti sono impastati fino ad ottenere un composto omogeneo.
Per donare maggiore elasticit? all?impasto ? addizionato almeno un olio vegetale alla miscela cos? ottenuta.
L?impasto ? modellato in forma sostanzialmente cilindrica con le estremit? arrotondate ottenendo la forma tipica degli insaccati del tipo della bresaola o del salame.
L?impasto modellato ? bollito in acqua e/o brodo vegetale per 60-90 minuti e lasciato raffreddare per una notte sino ad ottenere una consistenza tale da migliorare l?affettabilit? del prodotto permettendo di mantenere l?integrit? del prodotto in fase di confezionamento.
Il procedimento descritto permette di ottenere un prodotto alimentare a base vegetale con un basso tenore in glutine ottenuto grazie all?attivit? proteolitica del lievito madre sulle proteine del glutine. Pertanto, il prodotto finito risulta digeribile e non dannoso per i consumatori con predisposizione alla celiachia.
Inoltre, tale procedimento consente di ottenere un prodotto con un gusto, una consistenza e un aroma simili a quelli della carne grazie ai prodotti dei processi fermentativi operati dal lievito madre, che aumentano altres? la conservabilit? del prodotto stesso aumentando la shelf-life del prodotto finito.
L?attivit? fermentativa del lievito madre ? inoltre in grado di conferire al prodotto finito una consistenza tale da migliorare l?affettabilit? del prodotto permettendo di mantenere l?integrit? del prodotto in fase di confezionamento.
Infine, il procedimento descritto permette di ottenere un prodotto contenente proteine esclusivamente di origine vegetale in grado di sostituire la carne e i suoi derivati pur consentendo al consumatore una dieta variata.
Laddove le caratteristiche tecniche menzionate in ogni rivendicazione siano seguite da segni di riferimento, tali segni di riferimento sono stati inclusi al solo scopo di aumentare la comprensione delle rivendicazioni e di conseguenza essi non hanno alcun valore limitativo sullo scopo di ogni elemento identificato a titolo d?esempio da tali segni di riferimento.
Claims (10)
1) Lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine comprendente:
un impasto di base comprendente una miscela di acqua e farina;
almeno un ceppo di batteri lattici della specie Lactobacillus plantarum atto a operare processi fermentativi utilizzando detto impasto di base come substrato metabolico e dotato di elevata attivit? proteolitica essendo atto a degradare proteine del glutine e loro frammenti allergenici;
almeno un ceppo di lieviti della specie Saccharomyces cerevisiae atto a operare processi fermentativi utilizzando detto impasto di base come substrato metabolico e a cooperare con detto almeno un ceppo di batteri lattici durante detti processi fermentativi.
2) Lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto impasto di base del lievito madre ? costituito da una miscela di acqua e farine selezionate tra farina di glutine, di cereali e di legumi.
3) Lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che la quantit? di acqua necessaria all?ottenimento di detto impasto di base del lievito madre varia da 300g a 500g per 1Kg complessivo di prodotto finito.
4) Prodotto alimentare a base vegetale a basso tenore di glutine comprendente:
una miscela di glutine, almeno una tipologia di farina di cereali e/o almeno una tipologia di farina di legumi oppure una miscela di almeno una tipologia di farina di cereali e almeno una tipologia di farina di legumi;
lievito madre per la preparazione di prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine secondo la rivendicazione 1;
una miscela di spezie atta ad insaporire la miscela di glutine e farine di cereali e/o legumi;
almeno un olio vegetale;
acqua e/o brodo vegetale.
5) Prodotto alimentare a base vegetale a basso tenore di glutine secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detta miscela ? costituita da detto glutine in una percentuale in peso da 20% a 40%.
6) Prodotto alimentare a base vegetale a basso tenore di glutine secondo la rivendicazione 4 o 5, caratterizzato dal fatto che detta miscela ? costituita da detta almeno una tipologia di farina di cereali in una percentuale in peso da 5% a 15%, selezionata tra farine di grano duro e grano tenero, detta almeno una tipologia di farina di cereali essendo scelta tra farina di crusca, integrale, fine, extrafine preferibilmente biologica.
7) Prodotto alimentare a base vegetale a basso tenore di glutine secondo le rivendicazioni 4-6, caratterizzato dal fatto che detta miscela ? costituita da detta almeno una tipologia di farina di legumi in una percentuale in peso da 10% a 30%, selezionata tra farine di ceci, piselli, lupino e lenticchie preferibilmente biologiche.
8) Procedimento per la produzione di prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine comprendente le fasi di:
a) miscelare glutine con almeno una tipologia di farina di cereali, almeno una tipologia di farina di legumi o una miscela di almeno una detta tipologia di farina di cereali e almeno una detta tipologia di farina di legumi;
b) addizionare detta miscela ottenuta con lievito madre;
c) insaporire detta miscela di glutine, farine e lievito madre per mezzo di una miscela di spezie;
d) aggiungere acqua e/o brodo vegetale a detta miscela e impastare fino ad ottenere un composto omogeneo;
e) insaccare detto impasto in forma sostanzialmente cilindrica o eventualmente schiacciata, tramite apposite forme, con involucri tipici degli insaccati;
f) bollire detto insaccato in acqua e/o brodo vegetale e lasciare raffreddare.
9) Procedimento per la produzione di prodotti alimentari a base vegetale secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto insaccato ? bollito in acqua e/o brodo vegetale per 60-90 minuti e lasciato raffreddare per una notte sino ad ottenere una consistenza tale da migliorare l?affettabilit? di detto prodotto permettendo di mantenere l?integrit? di detto prodotto in fase di confezionamento.
10) Uso di un lievito madre secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7 per la formulazione di prodotti alimentari a base vegetale a basso tenore di glutine.
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