PT2373173E - Processo de biotecnologia microbiana para degradar completamente o glúten nas farinhas - Google Patents
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ΡΕ2373173 1 DESCRIÇÃO "PROCESSO DE BIOTECNOLOGIA MICROBIANA PARA DEGRADAR COMPLETAMENTE O GLÚTEN NAS FARINHAS " A presente invenção relaciona-se com uma biotecnologia microbiana para degradar completamente o glúten nas farinhas. Especialmente, o processo de acordo com a invenção envolve a utilização de bactérias lácteas selecionadas e proteases fúngicas utilizadas rotineiramente para o fabrico de alimentos levedados cozidos no forno, em condições de fermentação liquida para a degradação completa do glúten (concentração de glúten residual inferior a 20 ppm) . As farinhas de cereais que resultam de processos de fermentação podem ser utilizadas como matéria-prima para a produção de alimentos isentos de glúten projectados para sem comidos por doentes celiacos. O processo biotecnológico proposto resulta em diversas vantagens económicas, sociais, nutricionais e sensoriais comparadas com o processo de produção de alimentos isentos de glúten feitos com substâncias que são naturalmente isentas de glúten ou como resultado de processos de extracção. A epidemiologia de intolerância ao glúten ou doença celíaca está continuamente em crescimento. Os últimos dados acerca da população Europeia e dos Estados Unidos reportam uma incidência de indivíduos afectados de 2 ΡΕ2373173 1/100 (Rewers, 2005). Epidemiology of celiac disease; what are the prevalence, incidence, and progression of celiac disease. Gastroenterology 128:47-51). De acordo com o conhecimento corrente, o único remédio terapêutico eficaz contra esta intolerância alimentar é uma dieta completamente isenta de glúten a ser observada rigorosamente durante toda a vida (Hamer, 2005. Celiac Desease: Background and biochemical aspects. Biotechnol Advanc 23:401-408). Conhece-se, por exemplo, a utilização de bactérias lácteas para a preparação de alimentos cozidos no forno a partir de farinhas isentas de glúten (More et al. Cereal Chemistry, American Association of Cereal Chemists. Minneapolis, US, vol. 84, no. 4, 1 January 2007, pp 357-364 and Moore et al., European food research and Technology, vol, 226, 6 June 2007, pp 1309-1316). Contudo, a dieta isenta de glúten resulta em desvantagens evidentes. É muita cara, os produtos isentos de glúten, quando comparados com produtos baseados em cereais, exibem qualidades sensoriais e de armazenamento inferiores, a dieta é dificil de ser seguida estrictamente e precisa de ser monitorizada continuamente por dietistas, tendo também em consideração os desequilíbrios nutricionais (por exemplo fibras, minerais e vitaminas) que resultam da completa ausência de cereais na alimentação. (Grehn et al., 2001. Dietary habits of Swedish adult coeliac patients treated by a gluten-free diet for 10 years. Scand J Nutr 45: 178-182; Mariani et al., 1998. The gluten-free diet: a nutritional risk factor for adolescents with celiac disease J Pediatric Gastroenterology Nut 27:519-523; Thompson et al., 2005. Gluten-free diet survey: 3 ΡΕ2373173 are Americans with celiac disease consuming recommended amounts of fibre, iron, calcium and grain foods? J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169). Além disso, também em alguns casos (por exemplo "esprue refractária") a completa observância da dieta isenta de glúten não permite uma completa recuperação da funcionalidade intestinal (Sollid and Khosla, 2004. Future therapeutic options for celiac disease. Gastroenterol. Hepatol. 2:140-147). Nos tratamentos terapêuticos alternativos de dieta isenta de glúten, alguns estudos tomaram vantagem do conhecimento corrente das sequências de epitopos tóxicos e consideraram a utilização de enzimas microbianas, especialmente as prolilendopeptidases (PEPs), para a hidrólise destes polipeptideos. As enzimas microbianas, foram sugeridas em suplementos dietéticos. (Shan et al., 2004. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolylendopeptidases: implications for celiac sprue. Biochem. J. 383:311-318) e/ou para a desintoxicação do glúten in vitro (Chen et al., 2003. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PeP02, an endopeptidase with post-proline specificity. Appl. Environ. Microbiol. 69:1276-1282; Stepniak et al., 2005. Highly efficient glúten degradation with a newly identified prolil-endoprotease: implications for celiac disease. Am. J. Physiol. Gastrointest. Li ver Physiol. 291:G621-G629) . O Patent application W02008/010252 e Di Cagno et al. (Journal of Food Protection, vol 71, no.7, 2008, pp. 1491-1495) descreve um processo para a preparação de 4 ΡΕ2373173 alimentos cozidos no forno a partir de farinhas isentas de glúten e visa melhorar as caracteristicas nutricionais, sensoriais e de armazenamento destes produtos preparados a partir de substâncias isentas de glúten. Especialmente, a W02008/010252 descreve uma mistura de bactérias de ácido láctico (Lactobacillus sanfranciscensis, lactobacillus rossiae, lactobacillus plantarum, Pediococos pentosaceus, e/ou Lactobacillus brevis) para levedar produtos isentos de glúten cozidos no forno.
Di Cagno et al. descreve o rastreio de quarenta e seis estirpes de bactérias de ácido láctico de fermento para actividade proteolítica e grau de acidificação em farinhas isentas de glúten. As culturas de fermento consistiram em Lactobacillus sanfranciscensis LS40 e LS41, lactobacillus plantarum CF1, e foram selecionadas e utilizadas para o fabrico de pão isento de glúten.
Durante as últimas décadas também a biotecnologia de produtos levedados cozidos no forno foi consideravelmente alterada, influenciando os hábitos nutricionais de populações inteiras anteriormente sujeitas a uma dieta baseada no glúten. Correntemente, os produtos levedados cozidos no forno são fabricados por meio de processos tecnológicos extremamente rápidos (por exemplo, agentes químicos de levedura ou utilizando fermento de padeiro), que substituem completamente os processos longos de fermentação que utilizam as bactérias lácteas e fermentos originados a partir de matéria-prima, e utilizados como 5 ΡΕ2373173 "fermentos". Por meio de processos correntes os componentes dos cereais (por exemplo as proteínas)) não são sujeitas a qualquer actividade hidrolitica durante o processamento alimentar, mantendo as características da matéria-prima (Gobbetti, 1998. The sourdough microflora: interactions between lactic bactéria and yeasts. Trends Food Sei. Technol. 9:267-274). Com base nestas considerações e tomando a vantagem das potencialidades enzimáticas de uma mistura de bactérias lácteas selecionadas, diversos trabalhos (Di Cagno et al., 2002. proteolysis by sourdough lactic bactéria: effects on wheat flour protein fractions and gladin peptides involved in human cereal intolerance. Appl. Environ. Microbiol. 68: 623-633; Di Cagno et al., 2004. Sourdough bread made from wheat and non toxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1088-1096; Di Cagno et al., 2005. Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potencial decrease of the glúten intolerance. J. Agr. Food Chem. 53: 4393-4402; De Angelis et al., 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochem Biophys Acta 1762:80-93) demonstraram que utilizando uma biotecnologia tradicional, baseada na utilização de bactérias de ácido lácteo selecionadas e tempos de fermentação longos, é possível reduzir notavelmente a concentração de glúten inicial no cereal. O Codex Alimentarius, adoptado pela WHO (World 6 ΡΕ2373173
Health Organization) e pela FAO (Food Agricultural Orga-nization), distingue "produtos isentos de glúten" que contêm substâncias com concentrações de glúten inferiores a 20 ppm, e "produtos fabricados isentos de glúten", com uma concentração de glúten residual inferior a 200 ppm. Contudo alguns estudos, culminaram com directrizes tais como as editadas por "Prolamins Working Group" sugerem, em qualquer caso, ser mantido um limiar inferior a 20 ppm (Stern et al., 2001. Analysis and clinicai effects of glúten in celiac disease. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13:741-747,). Um estudo recente por Rizzello et al., (Rizzello et al., 2007. Highly eficient glúten degradation by lactobacilli and fungai proteases during food Processing: new perspectives for celiac disease. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507) consideraram a utilização de mais uma mistura complexa que consiste em 10 bactérias de ácido láctico selecionadas, proteases fúngicas e tempos de fermentação longos (48 h a 37°C), em condições semilíquidas de amassar. De acordo com as análises electroforéticas, cromatográficas e imunológicas o glúten contido na farinha de trigo foi degradado para um limiar de concentração inferior a 20 ppm.
Além disso é conhecido o Patent Application WO 2006/097415 (ou US2008/131556) em que analogamente ao estudo acima referido, está descrito um processo para a degradação do glúten por meio da utilização de uma mistura complexa que consiste em pelo menos seis bactérias de ácido láctico e/ou bifidobactérias e tempos de fermentação longos 7 ΡΕ2373173 (24-31 horas). Especialmente, o pedido de patente descreve uma mistura de pelo menos seis espécies de bactérias de ácido láctico e/ou Bifidobactérias no fabrico de fermento isento de glúten. A mistura preferida compreende Strepto-coccus termófilos, Bifidobactérias jovens, Bifidobactérias longum, Bifidobactérias breve, Lactobacilos acidófilos, Lactobacilos plantarum, Lactobacilos casei, Lactobacilos delbrueckii subsp. Bulgaricus. Contudo, este método descrito neste documento não é adequado para o glúten ser completamente degradado; por isso, resulta na impossibilidade da administração aos doentes celiacos. A figura 1B de Patent Application W02006/097415, de facto, revela que, após a hidrólise por meio de microrganismos, há ainda manchas claras de gliadinas não degradadas e isto está confirmado na tabela 2, ainda do mesmo documento, a partir do qual é evidente que enquanto algumas gliadinas são parcialmente hidrolisadas outras não são sensíveis ao processo de hidrólise.
Corseti et al., (Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 48, 2000, páginas 3044-3051, descreve os efeitos de alguns fermentos de bactérias de ácido láctico (e.g. fermento feito utilizando S. Cerevisiae 141, Lactobacillus sanfranciscensis 57 e L. Plantarum 13) e aditivos (e.g. protease) na firmeza e secura do pão.
Com base na literatura e dados previamente descritos, alguns problemas parecem ser de maior preocupação para o fabrico de alimentos isentos de glúten a 8 ΡΕ2373173 partir farinha de cereais desintoxicados: (i) simplificar a composição de bactéria láctea a ser utilizada para o processo de degradação; (ii) reduzir consideravelmente os tempos de fermentação tornando assim adequado para ser utilizado nos processos industriais; (iii) demonstrar a capacidade de bactérias de ácido láctico e enzimas fúngicas para actuarem eficazmente nas farinhas de trigo duro e do pão que pertencem a diferentes variedades, e no centeio, cevada e aveia; (iv) proporcionar um processo biotecno-lógico para a hidrólise do glúten que permita a desintoxicação das farinhas dos cereais para a produção de produtos isentos de glúten a serem utilizados; e (v) demonstrar, por meios testes clinicos habituais in vivo, a tolerância absoluta para os doentes celiacos após a administração em larga escala de produtos isentos de glúten baseados na farinha de trigo desintoxicada. À luz do acima referido, é portanto evidente a necessidade de proporcionar materiais e métodos para a preparação de alimentos isentos de glúten cozidos no forno feitos de farinha de cereal desintoxicada que não exibem, por um lado as desvantagens emergidas da pesquisa de dados da literatura económica, social, nutricional e sensorial, e por outro lado, as desvantagens dos produtos isentos de glúten correntemente disponíveis no mercado.
Os Autores da presente invenção verificaram agora que utilizando apenas duas bactérias de ácido láctico selecionadas, em combinação com proteases fúngicas, os tempos 9 ΡΕ2373173 de fermentação necessários para a degradação decrescem notavelmente. Além disso, provaram a capacidade de bactérias de ácido láctico e proteases fúngicas para a completa degradação do glúten a partir de diferentes variedades de farinhas de pão, trigo duro, cevada, enteio e aveia; proporcionaram um protocolo biotecnológico para a produção de diversos alimentos levedados assados a partir de farinha de trigo desintoxicada; e demonstraram a absoluta tolerância do produto nos doentes celiacos, permitindo assim, num modo inovador, a utilização da farinha de trigo como uma substância para o fabrico alimentos levedados cozidos no forno isentos de glúten.
De acordo com a presente invenção as bactérias de ácido láctico pertencem ao Lactobacillus genus e foram isoladas a partir de "fermentos" utilizados no fabrico de pães típicos do Sudoeste da Itália. Os Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (depositado como DSMZ N. DSM22063 em 28 de Novembro de 2008) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (depositado como DSMZ N. DSM22064 em 28 de Novembro de 2008).
Um protocolo biotecnológico que envolve a utilização de bactérias de ácido láctico selecionadas, e proteases fúngicas num processo de fermentação extremamente rápido (12-20 h a 30-37°C) de farinhas de cereais re-suspendidas em água a 20-50% em peso e sua utilização sucessiva, em diversas percentagens de acordo com as características desejadas, como uma substância para uma 10 ΡΕ2373173 levedura curta (cerca de 1-3 h) por meio de fermento de padeiro, para a produção de alimentos levedados cozidos no forno isentos de glúten (concentração de glúten residual inferior a 20 ppm) foi padronizado e optimizado.
Está referido em baixo um plano de protocolo bioteenológico para a produção de alimentos levedados cozidos no forno a partir de farinha de trigo isentos de glúten desintoxicada.
Preparação das culturas, lavagem e suspensão em água de culturas de bactérias de ácido láctico
I
Mistura de farinha de cereais (30%) com água (70%) que contém duas bactérias de ácido láctico selecionadas (densidade de células efu/g) e proteases fúngicas (400 ppm cada)
I
Fermentação durante 18h a 37°C
I
Mistura com milho nativo (10%), farinha de arroz (10%), ovo (5%), açúcar(3%), manteiga (1%), e fermento de padeiro (1,5%)
I
Fermentação durante 1,5 h a 30°C
I
Cozedura no forno a 250°C durante 50 min 11 ΡΕ2373173
De acordo com uma das possíveis formulações, os alimentos assados, que contêm o equivalente a 10 g do glúten inicial, foram administrados diariamente a doentes celíacos durante um período de 60 dias. Os ensaios histológicos e imunoquímicos provaram a tolerância absoluta da preparação a partir de farinha isenta de glúten desintoxicada .
De acordo com análises complementares que utilizam técnicas electroforéticas, cromatográficas e imunoló-gicas, o processo de fermentação por meio de bactérias de ácido láctico selecionadas, não utilizadas nos trabalhos anteriores, e proteases fúngicas, de acordo com a presente invenção, permite: (i) a desintoxicação completa do glúten (conteúdo de glúten residual inferior a 20 ppm); (ii) produção de farinha hidrolisada que consiste numa mistura de péptidos de baixa massa molecular e especialmente, aminoácidos (ca. 15 000 mg/kg relativamente a < 1000 mg/kg na farinha de trigo) que aumenta os aspectos nutricionais relativamente aos produtos isentos de glúten convencionais; (iii) redução notável de tempos de processo comparados com os dados reportados na literatura, tornando assim o referido processo adequado a uma transformação ajustada à escala industrial; (iv) produção de alimentos cozidos no forno isentos de glúten com formulações de substâncias diferentes que envolvem a utilização de farinha de trigo desintoxicada em concentrações diferentes (20-58%) ; e (v) tolerância absoluta das preparações para os doentes 12 ΡΕ2373173 celíacos após administração alargada, de acordo com dados clínicos reportados pela primeira vez.
Os produtos obtidos de acordo com o processo da presente invenção demonstram propriedades sensoriais, reo-lógicas e químicas vantajosas não oferecidas pelos produtos da técnica anterior (produtos isentos de glúten obtidos a partir de farinhas isentas de glúten naturalmente). Os produtos de acordo com a invenção, de facto, mantêm as propriedades nutricionais de farinhas que contêm glúten oferecendo por isso características nutricionais melhores comparados com os produtos obtidos partir de farinhas isentos de glúten.
Além disso, os produtos de acordo com a invenção estão completamente isentos de glúten como resultado de processo de degradação do glúten realizado por bactérias de ácido láctico inventivas, ao contrário de produtos obtidos que utilizam as bactérias de ácido láctico conhecidas (W02006/097415, WO 2008/010252) . As bactérias de ácido láctico de acordo com o Patent Application WO 2008/010252 foram utilizadas nas mesmas condições de bactérias de ácido láctico de acordo com a presente invenção e não foram adequadas à degradação do glúten, de facto o conteúdo de glúten residual é da ordem de ca. 6000-10000 ppm (figura 5). Portanto as referidas bactérias apenas podem ser utilizadas para a descontaminação de vestígios de glúten mas elas não desempenham o mesmo papel das bactérias de acordo com a presente invenção. 13 ΡΕ2373173
Relativamente ao artigo de Rizzello et al. (Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507, 2001), a possibilidade de obter uma degradação completa de glúten durante tempos notavelmente mais curtos (18 h comparadas com as 48 h) implica, primeiramente, uma vantagem tecnológica considerável que torna o processo comparável aos mais frequentes processos industriais e comuns para os produtos cozidos no forno. Um processo de fermentação muito longo (48 h) , além do aumento de custos tecnológicos, pode apresentar riscos higiénico-sanitários. Além disso, uma degradação de glúten mais rápida resulta inevitavelmente na produção de matéria-prima (farinha com glúten completamente hidrolisado) carac-terizada por um perfil de aminoácidos livres diferente, e, portanto, adequado ao resultado de caracteristicas senso-riais diferentes de produtos isentos de glúten comparados com um processo longo caracterizado por cinéticas enzimáticas diferentes inevitavelmente. É portanto, um objecto especifico da presente invenção uma mistura que compreende ou consiste em bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 e Lactobacillus plantarum 22064 tal como descrito na reivindicação 1. A mistura pode ainda conter enzimas proteoliticas fúngicas, como por exemplo as proteases Aspergillius oryzae, Aspergillius niger ou suas misturas. É ainda um objecto da presente invenção a utilização de mistura como acima definida tal como descrita 14 ΡΕ2373173 na reivindicação 4 para a completa degradação do glúten não só nas farinhas do pão mas também de trigo duro, centeio, cevada e aveia. A presente invenção ainda refere um processo para a preparação de massa de farinha liquida, tal como descrito na reivindicação 6, com glúten completamente degradado adequado à produção de produtos isentos de glúten levedados que compreende ou consiste nos passos seguintes: a) cultura de propagação de bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 e Lactobacillus plantarum 22064; b) mistura de farinhas em concentrações de 20-50%, preferencialmente 30%, e água em concentrações de 50-80%, preferencialmente 70%, que contêm a mistura de duas bactérias de passo a) numa densidade de células de ca. 108 cfu/g; c) adição de uma ou mais proteases fúngicas cada uma numa concentração de 200-500 ppm, preferencialmente 400 ppm; d) fermentação durante 8-20 h, preferencialmente 12 h, a 30-37°C. O processo pode ainda, compreender um passo e) de secagem da massa liquida obtida no passo d) . Entre as farinhas adequadas a serem utilizadas no processo estão quer as farinhas do pão, de aveia, centeio, cevada e trigo 15 ΡΕ2373173 duro quer as suas misturas, preferencialmente do pão e de trigo duro.
As enzimas proteolíticos fúngicas, podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases Aspergillius oryzae, Aspergillius niger ou suas misturas.
Por isso, a invenção também refere a uma massa de farinha liquida ou seca tal como descrito na reivindicação 10 em que o glúten está completamente degradado de acordo com o processo acima referido. É ainda um objecto da invenção uma mistura tal como descrito na reivindicação 11 que compreende ou consiste na massa como acima definida em combinação com uma ou mais farinhas isentas de glúten naturalmente, como por exemplo, as selecionadas a partir do grupo que consiste em farinhas de milho nativo, milho branco, arroz, quinoa, amaranto, teff e trigo sarraceno. Especialmente, as farinhas acima mencionadas, podem ser utilizadas de acordo com as seguintes percentagens: milho nativo 5-15%, preferencialmente 10%, milho branco 5-15%, preferencialmente 10%, arroz, quinoa, teff ou amaranto 10-30%, preferencialmente 20% e farinha de trigo sarraceno 1-10%, preferencialmente 5%, em que as referidas percentagens são expressas em peso baseadas no peso total da composição da farinha. Os outros ingredientes que podem ser adicionados à formulação para os alimentos assados isentos de glúten baseados na 16 ΡΕ2373173 farinha de trigo desintoxicada são, por exemplo, açúcar, manteiga, ovo, e nata liquida animal. É ainda um objecto da invenção um processo para a preparação de alimentos assados levedados, tal como descrito na reivindicação 14, que utiliza farinha desintoxicada de glúten de acordo com o processo acima definido que compreende ou consiste nos seguintes passos: a) adicionar uma mistura de farinhas naturalmente isentas de glúten em 10-40%, preferencialmente 30%, fermento de padeiro 1-2%, sal 0,1-1,0% e agentes es-truturantes 0,5-1% à massa de farinha liquida desintoxicada de glúten utilizando o processo acima referido e amassar: b) deixar a fermentação ocorrer durante aproxima-damente 1-3 h, preferencialmente 1,5 h, a 30°C; c) cozer no forno durante 50 min a 220°C. Quando a massa de farinha desintoxicada de glúten está seca, a proporção dos ingredientes para a água será aproxima-damente 1,2:0,8.
As farinhas naturalmente isentas de glúten podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em farinha de milho nativo, milho branco, arroz, quinoa, amaranto, teff, trigo sarraceno ou suas misturas. Por outro lado a farinha desintoxicada de glúten pode ser selecionada a partir do grupo que consiste quer de farinha de pão quer de 17 ΡΕ2373173 trigo duro, cevada, centeio, aveia e suas misturas, preferencialmente farinha de pão ou de trigo duro.
Portanto, é um objecto da presente invenção também os alimentos levedados cozidos no forno obtidos por meio de processos acima definidos tal como descrito na reivindicação 18. É ainda um objecto da presente invenção o processo para a preparação alimentos levedados cozidos no forno obtidos tal como descrito na reivindicação 19 que compreende ou consiste nos passos seguintes: a) adicionar directamente milho nativo, farinha de arroz, ovo, açúcar, manteiga e fermento de padeiro à massa de farinha desintoxicada de glúten de acordo tal como no processo acima definido e amassar; b) deixar ocorrer a fermentação durante 1,5 h a 30 °C. c) cozer no forno a massa levedada durante 50 minutos a 250°C.
Especialmente, no passo a) as % de ingredientes são como a seguir: milho nativo 10%, farinha de arroz 10%, ovo 5%, açúcar 3%, manteiga 1% e fermento de padeiro 1,5%.
Portanto, os alimentos levedados cozidos no forno tal como descrito na reivindicação 21 obtidos por meio do 18 ΡΕ2373173 processo acima definido constituem um objecto da presente invenção.
Um objecto adicional da presente invenção é também a utilização dos produtos de acordo com a presente invenção, i.e. massa de farinha, mistura da massa com farinhas isentas de glúten, alimentos levedados cozidos no forno, adequados aos desequilíbrios nutricionais que resultam da dieta isenta de glúten, tal como descrito na reivindicação 22.
Finalmente, as bactérias de ácido láctico Lacto-bacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plan-tarum DSM22064 representam um objecto da presente invenção, tal como descrito nas reivindicações 23 e 24. A presente invenção será agora descrita de um modo ilustrativo, mas não limitativo de acordo com as suas formas de realização preferidas, com especial referência para os esquemas incluídos. A Figura 1 ilustra a aminopeptidase tipo N (PepN), dipeptidase (PepV) e tripeptidase (PepT) (a) , e prolina iminopeptidase (Pepl), prolidase (PepQ), prolinase (PepR), dipeptidil-peptidase (PepX) (b) actividades de Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM 22064), em Leu-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu e Pro-p-NA, Val-For-Gly e Gly-For-Wing, substratos de síntese respectivamente. As bactérias 19 ΡΕ2373173 de ácido láctico utilizadas no trabalho de Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507, 2007j como controlo foram: Lactobacillus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7A, Lactobacillus hilgardii 51B e L. sanfranciscensis LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 e LS47. A actividade enzimática foi expressa em unidade de actividade (U) , i,e. como a quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol/min de p-nitroanilida ou 1 pmol/min de aminoácido a partir de p-nitroanilida para as actividades em diferentes substratos. A Figura 2 ilustra perfis de eletroforese bidimensionais de algumas variedades de trigo duro (Svevo e Duilio) antes e depois do tratamento com bactérias de ácido láctico e proteases fúngicas. A Figura 3 ilustra a composição proteica de farinha de trigo antes e depois do processo de hidrólise por bactérias de ácido láctico e proteases fúngicas. A Figura 4 ilustra as actividades de aminopepti-dase (A) , prolinaiminopeptidase (B) e propilaminopeptidase (C) de bactérias de ácido láctico utilizadas de acordo com WO2008/010252 (Lactobacillus sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15 e LS41) e com a presente invenção [L. sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064)]. Os acrónimos 15M, 14G, 7A, 51B, LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 e LS47 suportam os biótipos tal como utilizados de acordo com a publicação de Rizzello et al., 2007. 20 ΡΕ2373173 A Figura 5 ilustra a concentração de glúten residual (ppm) em massas fermentadas a partir de Lactobacillus sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15 e LS41 (WO2008/010252) e a partir de L. sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064)] durante 12 h a 37°C. A Figura 6 ilustra a concentração total de aminoácidos livres (mg/kg) em massas fermentadas que utilizam combinações diferentes de bactérias lácteas de acordo com W02008/0102252 (massa 1, 2, 3, 4 e 5) e massa de farinha de trigo fermentada com duas bactérias de ácido láctico (DDPPMA12 e DPPMA125) da presente invenção. A Figura 7 ilustra a Principal Component Analysis (PCA) dos dados obtidos a partir da análise sensorial de pães (1, 2, 4 e 5) de acordo com W02008/0102252 e pão (DPPMA12 e DPPMA125) obtido utilizando a farinha de trigo desintoxicada de acordo com a invenção.
Exemplo 1: Actividade da peptidase de bactérias de ácido láctico selecionadas foram propagadas a 30°C durante 24 h
As L. sanfranciscensis DPPMA12 e L. plantarum DPPMA125 a partir de Culture Collection do Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata deli'Universita degli di Bari, previamente isoladas a partir de "fermentos", 21 ΡΕ2373173 em MRS (mMRS) modificado, que contém, adicionalmente aos ingredientes habituais, maltose 5% e 10% da água de fermento - pH final 5,6. Como controlo para a preparação das actividades da peptidase de bactérias de ácido láctico utilizadas na publicação recente de Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507, 2007,) foram utilizadas: Lactobacillus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7A, Lactobacillus hilgardii 51B e L. sanfranciscensis LS3, LS10, LSI9, LS23, LS38 e LS47.
Para os doseamentos da enzima foram utilizadas as células cultivadas durante 24 h, recolhidas por centrifugação (1000 rpm, 4°C), lavadas duas vezes em tampão de fosfato 50 mM, pH 7,0 e re-suspendidas no mesmo tampão de densidade óptica a 2,5 (A62o nm) que corresponde a 108 cfu/mL. As actividades de aminopeptidase tipo N (PepN) e prolina iminopeptidase (Pepl), foram determinadas utilizando substratos de sintese Leu-ρ-ΝΑ e Pro-p-Na respec-tivamente. A mistura reaccional consistiu de: 0,9 mL de tampão K-fosfato 50 mM, pH 7,0 que contêm o substrato de sintese (concentração final 2 mM) e 100 pL de suspensão celular. A actividade enzimática, expressa em unidades de actividade (U) , corresponde à quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol/min de p-nitroanilida (Gobberti et al., 1996. The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3220-3226). As prolidase (PepQ), 22 ΡΕ2373173 prolinase (PepR) e dipeptidil-peptidase (PepX) foram determinadas tal como descritas por Cagno e co-autores, (Di Cagno et al.,2004. Sour dough bread tmade from wheat and nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients, Appl. Environ. Microbiol. 70: 1088-1096) foram determinadas em, respec- tivamente, Val-Pro, Pro-Gly e Gly-Pro-Ala. As dipeptidase (PepV) e tripeptidase (PepT) foram determinadas de acordo com o método Cd-ninidrina (Gobbetti et al., 1999. Study of the effects of temperature, pH, NaCl, and aw on the proteolytic and lipolytic activities of cheese-related bactéria by quadratic response surface methodology, Enzyme Microbial Technol 25: 795-809) que utiliza, respecti- vamente, Leu-Leu e Leu-Leu-Leu. Uma unidade de actividade (U) , é definida como a quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol/min de aminoácido.
Para fins comparativos, o ensaio foi repetido também para as bactérias de ácido láctico descrito em WO 2008/010252 (L. sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15 e LS41).
Exemplo 2: Extracção de proteína a partir da farinha de trigo e análise electroforética
Extraíram-se as proteínas a parir de farinha de trigo de acordo com o método descrito por Weiss et al. (Weiss et al., 1993). Electroforetic characterization of wheat grain alergens from different cultivars involved in 23 ΡΕ2373173 baker's asthma. Electrophoresis. 14:805-816). Realizou-se a análise electroforética bi-dimensional de ca. 30 μg de proteína da fracção extraída de acordo com o método da immobilina-poliacrilamida. (De Angelis et al., 2005. Biochem. Biophys. Acta. 1762:80-939. Analisaram-se quatro geles para cada fermentação independente e os dados foram normalizados de acordo com o procedimento proposto por Bini et al. (Bini et al., 1997. Protein expression profile in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue. Electrophoresis. 18: 2831-2841).
Exemplo 3: Análises imunológicas e por espectro metria de massa MALDI-TOF
Realizaram-se as análises imunológicas utilizando o anticorpo R5, e o ensaio ELISA competitivo e intercalado (Transia Plate, Diffchamb) (Valdez et al., 2003. Innovative aproach to low-level glúten determination in foods using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 15:465-474). Realizou-se a análise de espectrometria MALDI-TOF que utiliza a Voyager-De Pro-workstation (PerSeptive Biosystems United Kingdom) de acordo com o método referido por Hernando et al. (Hernando et al., 2003. New strategy for the determination of gliadin in maize or rice-based foods matrix-assisted laser desorption/ionizatiotion time-of-flight mass spectro-metry fractionation of gliadin from maize or rice-prolamine by acid treatment. J. Mass Spectrom. 38:862-871). 24 ΡΕ2373173
Determinou-se a concentração de proteína de acordo com o método (Bradford, 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quanties of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254). Determinou-se a concentração de azoto orgânico de acordo com o método de Kjeldahl. Determinou-se a concentração de aminoácido livre utilizando um analisador de aminoácido (Biochrom Ltd., Cambridge Science Park, United Kingdom) (Di Cagno et al., 2004. Appl. Environ Microbiol. 70:1088-1096).
Para fins comparativos determinou-se também a concentração de aminoácido livre na massa obtida que utiliza o lactobacilo descrito em WO2008/010252 (L. sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15 e LS41) após a fermentação durante 24 horas a 30°C de acordo com os procedimentos tais como indicados no protocolo referido na figura 8 do referido documento.
Exemplo 4: Fabrico de alimentos levedados cozidos no forno que utilizam farinha de trigo desintoxicada
Em meio de cultura foram propagadas culturas de duas bactérias de ácido láctico selecionadas, lavadas em água e re-suspendidas em água como anteriormente descrito. Misturou-se a farinha de trigo a 30% com a água (70%) que continha a mistura das duas referidas bactérias de ácido láctico com uma densidade de células de ca. 10 cfu/g, e 25 ΡΕ2373173 adicionaram-se as enzimas fúngicas, cada uma numa concentração de 400 ppm. A fermentação foi realizada durante 12 h a 37°C. Após a fermentação, adicionaram-se à massa de milho nativo liquida directamente farinha de arroz (10%), ovo 5%, açúcar (3%), manteiga (1%) e fermento de padeiro (1,5%). As concentrações estão baseadas no peso total da massa. Após amassar, deixou-se fermentar durante 1,5 h a 30°C, antes do cozimento no forno da massa levedada durante 50 minutos a 250°C. O processo pode ainda compreender um passo de secagem de liquido da massa de farinha de trigo. Podem também ser utilizados outras substâncias para a produção de pão isento de glúten.
Para fins de comparação os pães 1, 2, 4 e 5 também foram produzidos de acordo com o protocolo do Patent Application W02008/010252. Realizou-se a análise sensorial de pães obtidos de acordo, respectivamente, com a invenção e com a técnica conhecida, tendo sido considerados especialmente os descritores seguintes: elasticidade, aroma ácido, gosto ácido, doçura, secura e aroma. Cada descritor foi avaliado de acordo com uma escala de classificação de 0 a 100. Os resultados da análise sensorial foram processados por Principal Component Analysis. Além do mais, os pães foram analisados pelo volume especifico, estrutura cro-cante, dureza e conteúdo de fibra de acordo com métodos padrão da American Association of Cereal Chemistry (AACC). 26 ΡΕ2373173
Exemplo 5: Administração aos doentes celíacos de alimentos levedados cozidos no forno feitos de farinha de trigo desintoxicada
Os alimentos levedados cozidos no forno feitos de farinha de trigo desintoxicada, obtida tal como previamente descrito, foram administrados a 5 doentes celíacos. Oportunamente o diagnóstico da patologia celíaca foi feito de acordo com os critérios como proposto pela European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. A idade média dos doentes era de ca. 15 anos. Os doentes celíacos estavam em condições de remissão desde pelo menos dois anos e sujeitos a uma dieta isenta de glúten controlada. No recrutamento todos os doentes demonstraram indicadores negativos de patologia serológica, bem como doseamentos histológicos negativos. Cada doente, durante um período de 60 dias, consumiu diariamente alimentos cozidos no forno que continham farinha de trigo desintoxicada correspondente a 10 g de equivalente glúten nativo. Realizaram-se os doseamentos imunoquímicos e histológicos no Dipartimento di Pediatria e Gastroenterologia deli'Universita degli Studi di Napoli, Frederico II. 0 recrutamento dos doentes ocorreu com o consentimento dos pais informados do programa experimental que previamente foi submetido e aprovado por Ethical Committee da Universidade de Nápoles. 27 ΡΕ2373173
Resultados (1) Actividade da peptidase de bactérias de ácido láctico selecionadas A actividade da peptidase foi doseada em substratos de síntese relativamente específicos para as actividades da peptidase que são importantes para a degradação de glúten derivado de oligopeptidos (Figura 1). É possível observar que L. sanfranciscensis DPPMA12 e L. plantariam DPPMA125 demonstram todas as actividades enzi-máticas consideradas. Com a excepção do tipo de actividade da tripeptidase (PepT), duas bactérias de ácido láctico selecionadas, e especialmente a L. plantarum DPPMA125, revelam valores para as outras actividades da peptidase significativamente mais elevadas (P<0,05) do que os biótipos utilizados no estudo de Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507, 2007,). Foram detectadas diferenças significativas, especialmente para as actividades Pepl, PepQ, PepR e PepX, com a presença de resíduos de prolina para as diversas posições das ligações. A Glutenina e em especial as gliadinas, contêm uma percentagem muito elevada e invulgar (45-60%) de resíduos de glutamina e prolina. Este último iminoácido, consequentemente, ocorre especialmente em epi-topos tóxicos, que resultam da farinha de trigo, e responsável pela doença celíaca. Para proporcionar microrganismos adequados para degradação elevada da ligação onde está envolvida a prolina, esta actividade enzimática é certamente um pré-requisito para a degradação intensa do 28 ΡΕ2373173 glúten e processo de hidrólise rápido. A disponibilidade de uma grande Culture Collection a ser varrida e o grande número de actividades enzimáticas doseadas representam, por isso, o requisito para vulgarmente não estarem disponíveis as estirpes selecionadas. A actividade da peptidase de bactérias lácteas selecionadas é realçada pela utilização complementar de proteases fúngicas rotineiramente utilizadas nos processos de fabrico do pão. Estas enzimas são utilizadas na indústria do fabrico do pão a fim de modificar a concentração proteica e, portanto, a "força da farinha", depende dos alimentos cozidos no forno para que são projectados. A figura 4 ilustra uma comparação das actividades da peptidase para a técnica conhecida de bactérias de ácido láctico e duas bactérias de ácido láctico (DPPMA12 e DPPMA125) de acordo com a invenção, respectivamente, e é evidente que o último mostra marcadamente actividades mais elevadas para a aminopeptidase, prolina iminopeptidase e propildipeptidilaminopeptidase. (2) Caracterização da farinha hidrolisada
Após a fermentação durante 12 h a 37°C, as fracções de proteína foram selectivammente extraídas e submetidas a doseamentos analíticos complementares. Como é evidente utilizando a análise electroforética bidimensional (figura 2), no fim do processo da fermentação não foram detectados vestígios de gliadinas a partir das variedades 29 ΡΕ2373173 de farinhas de trigo duro Duilio e Svevo. Encontraram-se resultados semelhantes na fracção da glutenina no pão disponível no mercado de trigo de tipo "00", outras variedades de farinhas de trigo duro ensaiadas (Arcangelo, Ciccio, Colosseo, Gargano e Simeto) e de cevada, centeio, e aveia. Foram analisadas as proteínas da farinha de trigo, extraídas com 60% de etanol por técnicas MALDI-TOF. Os picos correspondentes à gliadina de padrão Europeu desapareceram completamente após a fermentação durante 12 h a 37°C. Apenas alguns picos com massa molecular inferior a 8 kDa foram detectados por análise de espectrometria. As análises imunológicas realizadas utilizando os anticorpos R5 e doseamentos ELISA confirmam que nenhuns vestígios de gliadinas foram detectados na amostra fermentada. De acordo com o mesmo método a concentração de glúten residual determinada nas farinhas do pão disponível no mercado de trigo tipo "00", variedade de trigo duro e de centeio, arroz e aveia foi, em todos os casos inferior a 20 ppm. O método utilizado para estas determinações é um AIC (Associazione Italiana Celiachia), método oficial da WHO e da FAO. Com respeito aos dados reportados na literatura (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4499-4507, 2001), o processo de hidrólise é realizado com a mesma eficácia (glúten residual <20 ppm) mas em tempos marcadamente mais curtos (12 versus 48 h). Isto processa resultados de proporções elevadas, por um lado, a partir da utilização de concentrações maiores de cada uma das enzimas proteolíticas fúngicas (400 ppm), por outro lado, a partir principalmente da actividade mais elevada da peptidase de 30 ΡΕ2373173 biótipos de bactérias de ácido láctico selecionadas. Novamente em comparação com a literatura referida que apenas considera a farinha de trigo com baixa concentração de glúten inicial, a presente invenção ilustra a eficácia do protocolo também para as variedades de farinhas de trigo duro e de cevada, centeio e aveia que têm concentrações de proteina elevada.
Na Figura 3 está referido o conteúdo de azoto orgânico no pão disponível no mercado de farinha de trigo tipo "00", antes e depois do processo da fermentação. A farinha hidrolisada consiste quase totalmente de uma mistura de péptidos de baixo peso molecular e aminoácidos. Apenas uma quantidade inferior a 20% de gluteninas inicial está ainda presente na farinha hidrolisada. A concentração de aminoácidos na farinha hidrolisada é cerca de 15000 mg/kg comparada com < 1000 mg/kg que ocorre na farinha de trigo. A biodisponibilidade mais elevada de aminoácidos livres torna esta farinha de trigo hidrolisada uma matéria-prima com conteúdo nutricional elevado, retendo ao mesmo tempo as outras caracteristicas nutricionais em termos de sais minerais, vitaminas e fibras. Onde é utilizada como uma substância para a produção de alimentos isentos de glúten, a farinha de trigo hidrolisada deverá cobrir os desequilíbrios que resultam da dieta isenta de glúten (Grehn et al., 2001. Scand J Nutr. 45: 178-182; Mariani et al.,1998. J. Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson et al., 2005. J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169). 31 ΡΕ2373173
Os ensaios comparativos da técnica conhecida das bactérias de ácido láctico demonstram que a concentração de aminoácido na massa é notavelmente inferior e igual a cerca de 2000 mg/kg após o estado de hidrólise mais elevado (figura 6). Isto confirma o grau de hidrólise diferente das proteinas do trigo. Para além disso, dado que os aminoácidos são percursores de compostos voláteis que são gerados durante o processo da cozedura no forno e são responsáveis pelo sabor dos alimentos assados, notavelmente indica que quanto mais elevada a concentração de aminoácidos livres, como no caso da presente invenção, mais elevada é a sintese de compostos voláteis, e portanto, um melhor sabor dos produtos de acordo com a invenção. (3) Produção de alimentos levedados cozidos no forno que utilizam farinha de trigo desintoxicada
Foi referido acima um exemplo de aplicação de protocolo biotecnológico para o fabrico de alimentos levedados cozidos no forno baseados na farinha de trigo desintoxicada. Adicionalmente ao fabrico de alimentos cozidos no forno, o protocolo foi padronizado e optimizado também para a produção de pão isento de glúten com os ingredientes anteriormente descritos. Adicionalmente à possível utilização directa de farinha de trigo desintoxicada, é possível um tratamento dela que utiliza um secador-ágil e utilização subsequente. Esta possibilidade tecnológica permite uma fácil conservação da matéria-prima 32 ΡΕ2373173 por mais tempo, sem qualquer alteração das caracteristicas nutricionais da farinha de trigo. A Figura 7 ilustra as melhores propriedades sensoriais do pão de acordo com a presente invenção (DPPMA12+DPPMA125) comparadas com a técnica conhecida do pão. Para além disso a tabela 1 ilustra que o pão de acordo com a presente invenção é caracterizado por um volume especifico maior, mais crocante, menor rigidez, e conteúdo de fibras mais elevado comparado com o pão da técnica conhecida. Estas diferenças resultam da presença da farinha de trigo que embora desintoxicada é adequada para oferecer caracteristicas químicas e reológicas melhores.
Tabela 1
Parâmetros químicos e reológicos Pão Entrada 1* Pão (DPPMA12+DPEMA12 5) Volume especifico (cm3/g) 1,35 ± 0,04 1,48 ± 0,07 Bolhas de crocante (%) 39,2 ± 0,34 42,3 ± 0,47 Rigidez (n) 16,62 ± 0,27 14,75 ± 0,21 Conteúdo de fibras(%) 1,5 ± 0,44 2,8 ± 0,52 *Lactdbacillus sanfranciscensis DSM18426, DSM18427, Lactobacillus plantarum DSM18430 (4) Administração aos doentes celíacos de alimentos cozidos no forno feitos de farinha de trigo desintoxicada diariamente
Os alimentos cozidos no forno preparados de acordo com o protocolo biotecnológico previamente descrito foram administrados diariamente aos doentes celíacos que 33 ΡΕ2373173 correspondem a uma dose equivalente a 10 g de glúten nativo. Na Tabela 2 estão registados os indices imuno-químicos e histológicos na remissão de doentes celiacos sujeitos ao consumo (10 g de equivalente de glúten por dia para 60 gg) com base na farinha de trigo desintoxicada.
Tabela 2
Anti- Imunoquímica Marsh tTG CD3 CD25 γδ Grade To Tgo T0 Τεο To T60 T0 T 60 To T6o F. I . 1,6 1 39 38 6 5 5, 6 8, 6 0 0 I .C. \—1 \—1 cr» \—1 3,7 11 11 9 0,9 3, 8 0 0 R.R. 0,3 0,3 53 56 3 4 11,5 17,8 1 1 I . I . 0,5 0,3 31 36 21 21 8,4 12,8 0 0 Como é possível observar, todos OS doentes no instante de recrutamento (To) demonstram valores seroló-gicos e histológicos (Marsh Grade) normais. Após cada toma diária de equivalente a 10 g de glúten, durante um período de 60 dias, nenhum dos valores bioquímicos e imunohistoló-gicos foi diferente comparado com o valor inicial. Em especial verifica-se que o Marsch Grade, que representa o estado de integridade e funcionalidade da mucosa do intestino, como detectada com base na amostra, é absolutamente idêntica ao valor inicial. Nenhum doente desenvolveu atrofia das vilosidades intestinais durante a mudança. Apenas um dos 5 doentes recrutados interrompeu os ensaios por razões pessoais e que não dependeram de estado patológico ocorrido. Com base nos resultados adquiridos com base em análises 34 ΡΕ2373173 clinicas in vivo mais cuidadosas, é possível afirmar que a farinha de trigo desintoxicada foi tolerada por todos os doentes. Em conclusão, a farinha de trigo desintoxicada pode ser utilizada para a preparação de alimentos isentos de glúten.
Lisboa, 2 de abril de 2013
Claims (24)
- ΡΕ2373173 1 REIVINDICAÇÕES 1. Mistura que compreende ou que consiste em bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063, Lactobacillus plantarum DSM 22064.
- 2. Mistura de acordo com a reivindicação 1, que compreende além disso proteases fúngicas.
- 3. Mistura de acordo com a reivindicação 2, em que as proteases fúngicas são selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases Aspergillus oryzae, Aspergillus niger ou suas misturas.
- 4. Utilização da mistura tal como definida em cada uma das reivindicações precedentes para a degradação completa de glúten em farinhas e/ou fermentação das referidas farinhas.
- 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que as farinhas selecionadas a partir do grupo que consiste em farinhas ou de trigo mole ou duro, cevada, centeio ou aveia.
- 6. Processo para a preparação de uma massa de farinha liquida, em que o glúten está completamente degradado, adequado à produção de produtos isentos de glúten levedados, que compreende ou consiste nos seguintes passos de: 2 ΡΕ2373173 a) cultura de propagação de bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 e Lactobacillus plantarum 22064; b) mistura de farinhas em concentrações de 20-50%, preferencialmente 30%, e água em concentrações de 50-80%, preferencialmente 70%, que contêm a mistura de duas estirpes de bactérias do passo a) numa densidade de células de cerca de 108 cfu/g; c) adicionar uma ou mais proteases fúngicas cada uma numa concentração de 200-500 ppm, preferencialmente 400 ppm; d) fermentar durante 8-20 h, preferencialmente 12 h, a 30-37°C.
- 7. Processo de acordo com a reivindicação 6 que compreende ainda um passo e) de secagem da massa liquida obtida no passo d).
- 8. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 6-7 em que a farinha é selecionada a partir do grupo que consiste quer em farinhas para pão e de trigo duro, cevada, centeio, aveia ou suas misturas, preferencialmente farinha de trigo duro ou mole.
- 9. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 6-8 em que as enzimas proteoliticas fúngicas são selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger ou suas misturas. 3 ΡΕ2373173
- 10. Massa de farinha seca ou líquida em que o glúten é completamente degradado por utilização do processo tal como definido em cada uma das reivindicações 6-9, a referida massa de farinha seca ou líquida compreende as bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 e Lactobacillus plantarum 22064;
- 11. Mistura que compreende ou consiste numa massa tal como definida na reivindicação 10 em combinação com uma ou mais farinhas naturalmente isentas de glúten.
- 12. Mistura de acordo com a reivindicação 11 em que as farinhas naturalmente isentas de glúten são selecionadas a partir do grupo que consiste em farinha de milho nativo, milho branco, arroz, quinoa, teff ou ama-ranto, e trigo sarraceno.
- 13. Mistura de acordo com cada uma das reivindicações 11-12 em que as farinhas encontram-se de acordo com as seguintes percentagens: farinhas de milho nativo 5-15%, preferencialmente 10%, milho branco 5-15%, preferencialmente 10%, arroz, quinoa, teff ou amaranto 10-30%, preferencialmente 20%, e trigo sarraceno 1-10% preferencialmente 5%, em que as referidas percentagens estão expressas em peso com base no peso total da composição da farinha.
- 14. Processo para a preparação de alimentos levedados cozidos no forno feitos de farinha desintoxi- 4 ΡΕ2373173 cada de glúten que utiliza o processo tal como definido em cada uma das reivindicações 6-9 que compreende ou consiste nos passos seguintes: a) adicionar uma mistura de farinhas naturalmente isentas de glúten em 10-40%, preferencialmente 30%, fermento de padeiro 1-2%, sal 0,1-1,0% e agentes estruturantes 0,5-1% à massa de farinha liquida desintoxicada utilizando o processo tal como definido em cada uma das reivindicações 6-9 e amassar: b) deixar a fermentação ocorrer durante aproxima-damente 1-3 h, preferencialmente 1,5 h, a 30°C; c) cozer no forno durante 50 min a 220°C.
- 15. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que quando a massa de farinha desintoxicada de glúten está seca, a proporção dos ingredientes para a água será aproximadamente 1,2:0,8.
- 16. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 14-15, em que as farinhas naturalmente isentas de glúten são escolhidas a partir de um grupo que consiste em farinha de milho nativo, milho branco, arroz, quinoa, teff ou amaranto e trigo sarraceno ou suas misturas.
- 17. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 14-16, em que a farinha desintoxicada de glúten é selecionada a partir do grupo que consiste em quer farinha de pão ou de trigo duro, cevada, centeio e aveia 5 ΡΕ2373173 ou suas misturas, preferencialmente farinha de trigo duro e mole.
- 18. Alimentos cozidos no forno, por meio do processo tal como definido em cada uma das reivindicações 14-17, em que os referidos alimentos cozidos no forno compreendem as bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064.
- 19. Processo para a preparação de alimentos levedados cozidos no forno que compreende ou consiste nos passos seguintes: a) adicionar directamente milho nativo, farinha de arroz, ovo, açúcar, manteiga e levedura de cerveja à massa de farinha desintoxicada de glúten tal como no processo acima definido e amassar; b) deixar ocorrer a fermentação durante 1,5 h a 30°C e c) cozer no forno a massa levedada durante 50 minutos a 250 °C.
- 20) Processo de acordo com a reivindicação 19 em que no passo a) as percentagens dos ingredientes são as seguintes: milho nativo 10%, de farinha de arroz 10%, ovo 5%, açúcar 3%, manteiga 1% e fermento de padeiro 1,5%.
- 21) Alimentos levedados cozidos no forno obtidos por meio do processo tal como definido em cada uma das reivindicações 19-20, os referidos alimentos cozidos no 6 ΡΕ2373173 forno compreendem bactérias de ácido láctico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064.
- 22. Utilização de massa de farinha tal como definido na reivindicação 10, mistura tal como definido nas reivindicações 11-13, o produto levedado no forno tal como definido na reivindicação 18, produtos de confecção levedados no forno tal como definido na reivindicação 21 para a preparação de alimentos adequados a cobrir os desequilíbrios resultantes do regime alimentar isento de glúten.
- 23. Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 bactéria de ácido láctico.
- 24. Lactobacillus plantarum DSM 22064 bactéria ácido láctico. Lisboa, 2 de abril de 2013
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