MX2010004104A - Axmi-066 y axmi-076: proteinas delta-endotoxinicas y metodos para su uso. - Google Patents
Axmi-066 y axmi-076: proteinas delta-endotoxinicas y metodos para su uso.Info
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Abstract
Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas; se proporcionan composiciones que comprenden una secuencia codificadora para polipéptidos pesticidas; las secuencias codificadoras pueden ser utilizadas en construcciones de ADN o cassettes de expresión para transformación y expresión en plantas y bacterias; las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas transformadas; en particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico pesticidas aisladas; adicionalmente, se abarcan las secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos; en particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 5, 2 ó 10, la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 4, 1, 3, 4, 6, 9 u 11, o la secuencia de nucleótidos depositada en un hospedero bacteriano con Número de Acceso B-50045, como también variantes y fragmentos de los mismos.
Description
Las proteínas cristalinas (Cry) (delta-ehdotoxinas) procedentes! j i I del Bacillus thuringiensis tienen potente actividad insecticida contra larvasj ! ' ,< i predominantemente de lepidópteros,, dípteros, y coleópteros. Estas proteínas;
también han mostrado actividad contra órdenes de plagas de Hymenoptera} \ ' ? !
Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Acari, así como otros órdenes de|
invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes, y i i '
Sarcomasügorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. j
En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker; Inc., New York, N.Y.). ¡ i ! . . !
Estas proteínas se clasificaron originalmente como Cryl a CryV basándose J principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases fueron j
específica de Lepidoptera (I), esp'ecífica de Lepidoptera y Díptera (II),
específica de Coleóptera (III), específica de Díptera (IV), y específica de
nematodos (V) y (VI). Las proteínas además se clasificaron en subfamilias; a
las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia se les
asignaron letras divisionales, tales como CryIA, CryIB, CryIC, etc. A las
proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les
dieron nombres tales como Cry1C1, Cry1C2, etc. j
Recientemente se describió una nueva nomenclatura para los
genes Cry basándose en la homología de secuencia de aminoácidos mejor
que en la especificidad del insecto diana (Crickmore;ef al. (1998) Microbiol. I ¦ ; Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la hueva clasificación, a cada toxina se le i í asigna un nombre único que incorpora un rango primario (un número arábigo), ¡ un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS !
I ¦' i i ' ' ' ' ' ' - i
La figura 1 muestra la secuencia de ADN del gen axmi-066 y su ! · ' ' ,! ' . ' i región de ADN circundante (SEC ID NO:8). El primer ATG (que corresponde
al sitio de comienzo de SEC ID ; NO: 1 ; cuya traducción codifica AXMI-066 • I ' ··' * ¦ · ' i
(SEC ID NO:2)) está en la posiciór nucleotídica 52 ¡de la secuencia mostrada
en esta figura. La segunda metionina interna (cuya traducción codifica lo¡s I ' j restos 14 a 637 de SEC ID NO:2) está en la posición 91 de esta figura. El i . . · ¡. . . ¦ ; codón de parada TAA comienza en la posición 1963 de la secuencia en esta i j - l ; ¦ I figura. Los codones de comienzo ATG y el codón de parada TAA se muestran
en negrita. Dos sitios de unión al ribosoma putativos se muestran en cursiva y '¦ ' ' ! · i subrayados. ! ' ' i !
. . ' .. ' · ¦ I i
Las figuras 2A-2D muestran un alineamiento de AXMI-066 larga ' ; ¦ - . i . I,
(SEQ ID NO:2), AXMI-066 (SECÍ ID NO:10), Cry2Áa1 (SEQ ID NO: 14), . ! ¦ i , · ' i
Cry2Ab1 (SEQ ID NO:15), Cry2Ac1 (SEQ ID NO:16), Cry2Ad1 (SEQ ID
??. 7), Cry2Ae1 (SEQ ID NO:18),| cry1Ac (SEQ ID NO:19), y Cry3Aa1 (SEQ
ID NO:20). El alineamiento muestra los restos de aminoácidos más altamente
conservados destacados en negro, y los restos de aminoácidos muy
conservados destacados en gris.
aminoácidos que son más cortas que las secuencias ¡de longitud completa, ya'
sea debido al uso de una sitio de partida en dirección 3' alterno, o debido a
procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad
plaguicida. El procesamient ¦o ¦ se · pue 1de prod .. ucir en ' e íl orga 'n:is ¦mo en el que ' se I
expresa la proteína, o en la plaga de pués de la ingestión de la proteína.
Las proteínas plaguicidas engloban delta-endotoxinas. Las delta-j I ¦' ' ' i endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cr 1 a cry43, cytl y cyt2, y
toxina similar a Cyt. Existen actualme ¦ nte alrededor dé 250 e 1species conocidas i
de delta-endotoxinas con un amplio intervalo de especificidades y toxicidades]
Para una lista extensa, véase Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. S/'o/.j
Rev. 62:807-813, y para actualizaciones regulares1 véase Crickmore et a/J ' ¦ i . ' . ¦ '!' ' i
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www.biols.susx. 'ac.u ¦k/Home/ 'Neil Crickmore/Bt/in -dex.! '' : ' I |
De este modo, se ¡proporcionan aquí nüevas secuencias
nucleótídicas aisladas que confieren actividad plaguicida. Estas secuencias
nucleotídicas aisladas codifican polipéptidos que tienen homología con deltaj
endotoxinas o toxinas binarias conocidas. También se proporcionan las ! ' .. ] ¦ ' ! secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas. La proteíná i ! . ' : í I resultante de la traducción de este gen permite á las células controlar o
exterminar plagas que la ingieren.
cada inserto con homología con un gen de delta-endotoxina conocido. Los
marcos de lectura abierto ¦ s se í designaron c 'omo axmi-066 y axmi-076 !, ' I * > respectivamente. La secuencia de JADN de axmi-06p se proporciona en SEC i ¦ I ID NO:1 , y la secuencia de aminoácidos de la roteína pronosticada se
proporciona en SEC ID NO:2. La secuencia dé ADN de axmi-076 se
proporciona en SEC ID NO:4, y su secuencia de la' proteína pronosticada sé
propo ¦rciona en SEC ID NO:5. j i ¦ ' ¦! ¦ ? !
El marco de lectura abierto pronosticado de axmi-066 tiene una
longitud de 637 am 'in 'oáci ¦dos. ¦ S I in ¦ emb ¦argo ·, e : ;l aline ¡amiento con sus I ;? homólogos endotoxínicos más cercanos sugiere que el comienzo de la ¦ " ¦ ¡ ; traducción de axmi-066 en Bacillus es probable que esté en el codón de
partida de ATG interno treinta y nueve nucleótidos en dirección del primer
codón de partida de ATG (que corresponde a la posición nucleotídica 39 de
SEC ID NO: 1). Esta secuencia codificante se expone en SEC ID NO: 9. El j , ¦ , " I inicio traduccional en este codón de partida interno dará como resultado una ¦I ' :;¦ . ! proteína de 624 aminoácidos con un peso molecular de 71 kD (SEC ID NO:
10). Una posible pero fuerte secue jncia de Shine-Q !algarno está presente 6 '
nucleótidos en dirección de este codón de partida interno, lo que apoya los , i . ¦ .. ; \ resultadas de los alineamientos proteicos. j
CUADRO 1 Actividad de AXMI-066 v AXMI-076 contra insectos
EJEMPLO 11 1 Variantes de AXMI-066
El alineamiento de las secuencias de AXMI-066 (SEC ID NO: 10)
y de la proteína Cry2Aa indica que los bucles apicales 1 y 2 de axmi-066 son
ambos 2 aminoácidos más cortos que los bucles 1 y' 2 de Cry2Aa. AXMI-066 contiene un bucle 3 adicional que e 1stá perdido en C :iy2Aa. ¦ Se . h 'an genera ¦ do ¡j . .• . ? · . ' librerías variantes de AXMI-066 que| contienen inserciones de 2 aminoácidos
en los bucles 1 y 2, respectivamente. También se ha jgenerado una supresión! I del bucle 3 en AXMI-066. Las variantes de AXMI-066 se han expresado yj
ensayado para determinar la actividad insecticida; sobre varios insectos}
ingerirá la plaga, tal como una dieta artificial El material a ensayar puede ' · !¦ ·' . j estar compuesto de un líquido, sólido, o suspensión. El material a ensayar se i puede colocar sobre la superficie y después se puede dejar secar. Como
alternativa, el material a ensayar Je puede mezclar con una dieta artificia
fundida, y después se dispensa en la cámara de] ensayo. La cámara de ! " ! ensayo puede ser, por ejemplo, una^ copa, un plato, o un pocilio de una placa^
de microtitulación. i :'
Los ensayos para plágas succioi adoras (por ejemplo áfidos)^
pueden implicar separar el material de ensayo del insecto mediante una
partición, idealmente una porción que puede ser perforada por las partes
bucales succionadoras del insecto succionador, para permitir la ingestión del
material de ensayo. A menudo, elj material de ensayo se mezcla con un
estimulante de la alimentación, tal co imo sacaros ;a ', ' p 'ara promover la ingestión
del compuesto de ensayo. ¡ í " : Otros tipos de ensayos pueden incluir microinyección de ' ' ' I' i : ¦ ; ¦ I material de ensayo en la boca, o intestino de la plaga, así como el desarrollo;
de plantas transgénicas, seguido del ensayo de la capacidad de la plaga para
. ¦ · [ ;f alimentarse con la planta transgénica. El ensayo con plantas puede implicar el ¦ I ¦ ¾ aislamiento de partes de la plantai normalmente consumidas, por ejemplo
pequeñas jaulas unidas a una hoja, í |o el aislami :ent 'oT de plantas completas en
jaulas que contienen insectos. j ; Otros métodos y enfoques para evaluar p agas son conocidos en
la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Robertson y Preisler, eds.
Claims (6)
- i 84
- 2 - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia que tiene al menos 90% de identidad dé secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 10, y en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una inserción de uno q dos aminoácidos entre los restos 379 y 380 de SEC ID NO: 10. í ' ' '! "
- 3 - La molécula de ácido' nucleico : de conformidad con la i I "'? reivindicación 2, caracterizada además porque^ dicha secuencia de aminoácidos comprende una inserción de dos 'aminoácidos entre los restos | ' -.i 379 y 380 de SEC ID NO: 10, y en la que dicha inserción se selecciona de • ; \¡ grupo que consiste en un resto de glicina y uno de glicina, uno de glicina y uno de treonina, uno de glicina y uno de serina, uno dé glicina y uno de leucina! uno de arginina y uno de glicina, urlo de glicina y uno de asparagina, uno de l 1 ; ' glicina y uno de lisina, uno de histidina y uno de glicina, uno de fenilalanina y • ' ' " · ' ' ' ' uno de glicina, uno de leucina y uno de glicina, o uno de asparagina y uno de glicina. i
- 4. - La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con lá reivindicación 1 , caracterizada aderjiás porque dicha secuencia nucleotídicá i · ¦ · -i - ' ' · I-es una secuencia sintética que se ha diseñado para la expresión en una planta. i j
- 5. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de lá I ' " í · ? reivindicación 1. ¡ ,¡ 1
- 6. - El vector 1 de conformidad "córjT la reivindicáción 5, caracterizado además porque comprende además - una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido ijieterólogo. 1 ' ; . ; j 7. - Una célula hospe'dante , que coqtiene el vector dé la reivindicación 5. 8. - La célula hospedante de conformidad con la reivindicación 7 caracterizada además porque es uná célula hospedante bacteriana. 9. - La célula hospedant Ie de conformidad con la reivindicación 7,j caracterizada además porque es una célula vegetal.;'] 10 10. - Una planta transgénica que comprende la célula hospedante; de la reivindicación 9. 11. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación' 10, caracterizada además porque d ¡cha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repo lo, girasol, .tomate, cruciferas, pimientos,! 15 patata, algodón, arroz, haba; de so Ija, re 'mola 'cha, -' caña ' ' de " a.z¦úca ¦ r ¦, taba ·co, !; cebada, y colza.. 12.- Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.j j j ·· . 13.- Un . polipéptido! aislado , con ! actividad1 plaguicida, on , ·.." . . . I , ¿U| seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la| secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, 2, ó 10; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% dej identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 ó secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID . NO: 5; y g) lá secuencia nucleotídica del inserto 'de ADN del plásmido depositado como • ' ! Número de Acceso B-50045; en la que dicha secuencia nucleotídica está ·' - . . . i , ligada operablemente a un promotor que conduce la expresión de una i secuencia codificante en una célula vegetal. ¡ 25. - La planta de conformidad coh la reivindicación 24, caracterizada además porque dichai molécula de ácido nucleico codifica una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 10, y en la que dicha " i secuencia de aminoácidos comprendé una inserción de uno o dos¡ aminoácidos entre los restos 379 y 3¿0 de SEC ID NO: 10. 26. - La planta de conformidad con la reivindicación 25 caracterizada además porque dicha secuencia de aminoácidos comprende! i 1 ¦ una inserción de dos aminoácidos entre los restos 379 y 380 de SEC ID NO:¡ i- / ; í 10, y en la que dicha inserción se selecciona del grupo que consiste en un! resto de glicina y uno de glicina, uno de glicina y -uno de treonina, uno del glicina y uno de serina, uno de glicina y uno de leucina, uno de arginina y uno de glicina, uno de glicina y uno de asparagina, uno de glicina y uno de lisina, uno de histidina y uno de glicina, uno de fenilalanina [y uno de glicina, uno de leucina y uno de glicina, o uno ¦¦ d' e as 'p 'ara ' gi 'na y uno d "ei glicina. i .' / ' !.' · : 27. - La planta de conformidad! con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicha planta es una célula vegetal. '.
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