NUEVA SAL I CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sal de un derivado de piperidina, a la composición farmacéutica que la contiene y a su uso en terapia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor 1 de la quimiocina (CCRl por sus siglas en inglés) está altamente expresado en los tejidos afectados en diferentes enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas, hiperproliferativas y mediadas inmunológicamente, por ejemplo, el asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerosis múltiple y artritis reumatoide. Por lo tanto, la inhibición de los eventos mediados por CCRl con la sal de la invención, por ejemplo por la activación y migración de las células, se espera que sea efectiva en el tratamiento de tales afecciones. En la manufactura de las formulaciones farmacéuticas, es importante que el compuesto activo esté en una forma en la cual puede ser manejado y procesado convenientemente para obtener un proceso de fabricación viable comercialmente. Con relación a esto, la estabilidad química y la estabilidad física del compuesto activo son factores importantes. El compuesto activo, y las formulaciones que lo contienen, pueden ser capaces de ser almacenadas efectivamente durante períodos apreciables de Ref .189191 tiempo, sin exhibir algún cambio significativo en las características fisicoquímicas (por ejemplo la composición química, densidad, higroscopicidad y solubilidad) del compuesto activo. Además, si el compuesto activo va a ser incorporado en una formulación para la administración pulmonar, por ejemplo, por medio de un inhalador de polvo seco tal como un dispositivo Turbuhaler®, es deseable si el compuesto activo puede ser micronizado fácilmente para dar un polvo con buenas propiedades de flujo y que comprende una fracción de partículas cristalinas finas, elevada (es decir, una fracción en la cual las partículas del compuesto activo tienen un diámetro aerodinámico promedio de la masa menor que 10 µm
(micrómetros)). Tal fracción es capaz de ser llevada profundamente en los pulmones conduciendo a una absorción incrementada y más rápida del compuesto activo. La publicación de la solicitud de patente internacional No. WO 03/051839 describe generalmente ciertos derivados de piperidinilo que tienen actividad como antagonistas de CCRl y, en particular, el compuesto de 4- ( { (2S) -3- [2- (acetilamino) -5-hidroxifenoxi] -2-hidroxi-2-metilpropil }amonio) -1- (4-clorobencil) piperidina y las sales o solvatos del mismo farmacéuticamente aceptables. La única sal de este compuesto descrita específicamente en la solicitud es la sal de ditrifluoroacetato, que es de carácter amorfo, lo cual no la hace adecuada para su uso en una formulación de polvo seco para administración pulmonar. Ahora se ha encontrado sorprendentemente que es posible preparar una sal del compuesto 4- ( { (2S) -3- [2-(acetilamino) -5-hidroxifenoxi] -2-hidroxi-2-metilpropil } amonio) -1- (4-clorobencil) piperidina que tiene buenas propiedades fisicoquímicas, que es capaz de ser formulado en una formulación de polvo seco para administración pulmonar. La estructura de 4- ({ (2S) -3- [2- (acetilamino) -5-hidroxifenoxi] -2-hidroxi-2-metilpropil } amonio) -1- (4-clorobencil) piperidina es mostrada enseguida
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Así, de acuerdo con la presente invención, se proporciona la sal de benzoato de 4- ( { (2S) -3- [2- (acetilamino) -5-hidroxifenoxi] -2-hidroxi-2-metilpropil } amonio) -1- (4-clorobencil) piperidina (referida aquí posteriormente como benzoato de N-{ 2- [ ( (2S) -3- { [1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil Jacetamida, la "sal de benzoato") . La invención también proporciona solvatos (incluyendo hidratos) de la sal de benzoato. Sin embargo, la sal de benzoato es preferentemente anhidra, y preferentemente está en la forma no solvatada. En una modalidad de la invención, la sal de benzoato o el solvato de la misma tiene propiedades cristalinas y preferentemente es al menos 50 % cristalina, más preferentemente al menos 60 % cristalina, todavía más preferentemente al menos 70 % cristalina y aún más preferentemente al menos 80 % cristalina. La cristalinidad puede ser estimada por técnicas de difractometría de rayos X convencionales. En otra modalidad de la invención, la sal del benzoato o el solvato de la misma es desde 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % hasta 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ó 100 % cristalina . Sin que esté limitado por cualquier teoría particular, la sal de benzoato se cree que va a ser polimórfica y dos formas han sido aisladas y caracterizadas hasta la fecha. Un polimorfo (referido aquí como la Forma A) exhibe al menos los siguientes picos de difracción del polvo de rayos X característicos (expresado en grados 2?) (el margen de error es consistente con el capítulo general de la United States Pharmacopeia sobre la difracción de rayos X (USP941) -véase la United States Pharmacopeia Convention. X-Ray Diffraction, General Test <941>. Uni ted Sta tes Pharmacopeia , 25/a. ed. Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention; 2002:2088-2089): (1) 6.1, 10.7 y 19.3, o (2) 6.1, 12.2 y 14.1, o (3) 6.1, 10.7, 12.2, 14.1, 18.1 y 19.3, o (4) 6.1, 10.7, 12.2, 14.1, 15.7, 18.1 y 19.3, o (5) 6.1, 10.7, 12.2, 14.1, 15.1 y 19.3, o (6) 6.1, 10.7, 12.2, 14.1, 15.1, 15.7, 18.1 y 19.3, o (7) 6.1, 10.7, 12.2, 14.1, 15.1, 15.7, 18.1, 19.3, 21.2 y 24.6. La Forma A puede ser preparada substancialmente libre de otras formas físicas por un proceso que comprende las siguientes etapas: (i) poner en contacto una solución calentada de la N-{2- [ ( (2S)-3-{ [1- ( -clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida disuelta en un solvente o mezcla de solventes, adecuada (por ejemplo un solvente orgánico tal como un solvente polar, los ejemplos de los cuales incluyen metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, acetona y acetato de etilo) , con (ii) una solución caliente de ácido benzoico disuelta en un solvente o mezcla de solventes, adecuada (por ejemplo un solvente orgánico tal como un solvente polar, los ejemplos de los cuales incluyen metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, acetona y acetato de etilo) , para obtener una mezcla, (iii) permitir que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente (por ejemplo a 20 °C) para dar un precipitado de la Forma A del benzoato de la N-{ 2- [ ( (2S) -3- { [ 1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil } acetamida, y (iv) separar el precipitado de la mezcla de reacción. El otro polimorfo (referido aquí posteriormente como la Forma B) exhibe al menos los siguientes picos de difracción del polvo de rayos X (XRPD) característicos (expresados en grados 2?) (el margen de error es consistente con el capítulo general de la United States Pharmacopeia sobre la difracción de rayos X (USP941) - véase la United States Pharmacopeia Convention. X-Ray Diffraction, General Test <941>. Uni ted Sta tes Pharma copeia , 25/a. ed. Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention; 2002:2088-2089). (1) 6.5, 9.3 y 10.5, o (2) 6.5, 9.3, 17.6 y 17.8, o (3) 6.5, 9.3, 10.5, 12.0 y 12.4, o (4) 6.5, 9.3, 10.5, 12.0, 12.4, 13.0, 13.6, 15.5, 17.6 y 17.8, o (5) 6.5, 13.0 y 20.2, o (6) 6.5, 9.3, 10.5, 12.0, 12.4, 13.0, 13.6, 15.5, 17.6, 17.8 y 19.2, o (7) 6.5, 9.3, 10.5, 12.0, 12.4, 13.0, 13.6, 15.5, 17.6, 17.8, 19.2, 20.2, 22.8 y 26.0, o (8) 6.5, 9.3, 10.5, 12.0, 12.4, 13.0, 13.6, 15.5, 17.6, 17.8, 19.2, 20.2, 22.8, 24.2, 26.0 y 30.7. La Forma B puede ser preparada substancialmente libre de otras formas físicas por el calentamiento controlado de la Forma A como se describe en los Ejemplos, o por una técnica de suspensión que comprende disolver, por ejemplo, 20 % en peso de una muestra de la Forma A en un solvente adecuado (por ejemplo un solvente orgánico, tal como un solvente polar, los ejemplos de los cuales incluyen metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, 2-butanol, y acetona) para formar una suspensión y homogeneizar la suspensión a temperatura ambiente (20 °C) durante al menos 7 días, o por la disolución de la Forma A y ácido benzoico en un solvente adecuado (por ejemplo isopropanol caliente) para formar una mezcla, permitiendo que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente y periódicamente la siembra de la mezcla con cristales de la Forma B. En donde se haga referencia en esta especificación ya sea a la Forma A o a la Forma B que están substancialmente libres de otras formas físicas (o substancialmente puras), esto significa que preferentemente al menos 90 % en peso, por ejemplo, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 % en peso, de la sal de benzoato está presente en esta forma física . La Tabla 1 que se da posteriormente proporciona datos cristalográficos adicionales sobre las Formas A y B de la sal de benzoato como se determinan a temperatura ambiente. Tabla 1
Los compuestos de la invención son útiles como moduladores de la actividad del receptor de quimiocina CCRl o MlP-la que es el ditrifluoroacetato de [N- { 2- [ ( (2S) -3- { [1- (4-clorobencil) piperidin- -il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil}acetamida, tienen una IC50 abajo de 50 nM en el ensayo de aglutinación de CCRl humana tal como aquel descrito en la sección de ejemplos de aquí] y pueden ser administrados a un mamífero, incluyendo el ser humano, para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas y las enfermedades mediadas inmunológicamente. Los ejemplos de estas afecciones son: 1. tracto respiratorio: enfermedades obstructivas de las vías respiratorias que incluyen: asma, incluyendo asma bronquial, alérgica, intrínseca, extrínseca, inducida por el ejercicio, inducida por los fármacos (incluyendo la inducida por aspirina y NSAID) , asma crónica o inveterada (por ejemplo asma tardía y la hiper-respuesta de las vías respiratorias), y el asma inducida por el polvo, tanto intermitente como persistente y de la totalidad de las severidades, y otras causas de la hiper-respuesta de las vías respiratorias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés), tal como la COPD irreversible; bronquitis, incluyendo bronquitis infecciosa y eosinofílica; enfisema; bronquiectasis; fibrosis quística; sarcoidosis; enfermedad de pulmón del granjero y enfermedades relacionadas; neumonitis por hipersensibilidad; fibrosis de los pulmones, incluyendo alveolitis fibrosante criptogénica, neumonías intersticiales idiopáticas, terapia antineoplásica con una complicación por fibrosis e infección crónica, incluyendo tuberculosis y aspergilosis y otras infecciones fungosas; complicaciones del trasplante del pulmón; trastornos vasculíticos y trombóticos de la vasculatura pulmonar, e hipertensión pulmonar; actividad antitusiva incluyendo tratamiento de la tos crónica asociada con las afecciones inflamatoria y secretoria de las vías respiratorias, y tos iatrogénica; rinitis aguda, alérgica, atrópica y rinitis crónica incluyendo rinitis caseosa, rinitis hipertrófica, rinitis purulenta, rinitis sicca y rinitis medicamentosa, y rinitis vasomotora; rinitis membranosa incluyendo rinitis cruposa, fibrinosa y pseudomembranosa y rinitis escrofulosa; rinitis perenne y por la estación (alérgica) incluyendo rinitis nerviosa (fiebre del heno); poliposis nasal; infección viral aguda incluyendo el resfriado común, y la infección debida al virus sincitial respiratorio, influenza, coronavirus (incluyendo SARS) y adenovirus; 2. huesos y articulaciones: artritis asociada con o que incluye osteoartritis/osteoartrosis, tanto primaria como secundaria con respecto a, por ejemplo, displasia congénita de la cadera; espondilitis cervical y lumbar, y dolor del cuello y lumbar bajo; artritis reumatoide y enfermedad de Still; espondiloartropatías seronegativas incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis reactiva y espondartropatía no diferenciada; artritis séptica y otras artropatías relacionadas con la infección y trastornos de los huesos tales como tuberculosis, incluyendo la enfermedad Potts y el síndrome de Poncet; la sinovitis inducida por cristales, aguda y crónica, incluyendo gota provocada por uratos, enfermedad por la deposición de pirofosfato de calcio, y la inflamación de los tendones, bursal y sinovial relacionada con la apatita de calcio; enfermedad de Behcet; síndrome de Sjogren primario y secundario; esclerosis sistémica y escleroderma limitado; lupus eritematoso sistémico, enfermedad de los tejidos conectivos mezclados, y enfermedad del tejido conectivo no diferenciado; miopatías inflamatorias incluyendo dermatomiositis y polimiositis; polimialgia reumática; artritis juvenil incluyendo las artritis inflamatoria idiopática de cualquier distribución en las articulaciones y síndromes asociados, y fiebre reumática y sus complicaciones sistémicas; vasculitis incluyendo arteritis de las células gigantes, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, poliarteritis microscópica, y vasculitis asociada con la infección viral, reacciones de hipersensibilidad, crioglobulinas, y paraproteínas; dolor lumbar bajo; fiebre mediterránea familiar, síndrome de Muckle-Wells, y la fiebre de Hibernación Familiar, fiebre de Kikuchi, artralgias inducidas por fármacos, tendonitis, y miopatías; y la enfermedad de Reiter; 3. dolor y remodelación del tejido conectivo de trastornos musculoesqueléticos debidos a lesiones [por ejemplo lesiones deportivas] o enfermedad: artritis (por ejemplo artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artropatía por cristales), otras enfermedades de las articulaciones (tales como la degeneración de los discos intervertebrales o la degeneración de la articulación temporomandibular) , la enfermedad de remodelación de los huesos (tal como la osteoporosis, enfermedad de Paget u osteonecrosis) , policondritis, escleroderma, trastorno de los tejidos conectivos mezclados, espondiloartropatías, o enfermedad periodontal (tal como periodontitis) ; 4. de la piel: psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto u otras dermatosis eccematosas, y reacciones de hipersensibilidad del tipo retardado; fito- y fotodermatitis; dermatitis seborreica, dermatitis herpetiforme, liquen plano, liquen escleroso y atrópico, pioderma gangrenoso, sarcoides de la piel, lupus eritematoso discoide, pénfigo, penfigoide, epidermólisis bulosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritemas, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, calvicie de modelo masculino, síndrome de Sweet, síndrome de Weber-Christian, eritema multiforme; celulitis, tanto infecciosa como no infecciosa; paniculitis; linfomas cutáneos, cáncer de la piel diferente del melanoma y otras lesiones displásicas, trastornos inducidos por fármacos incluyendo erupciones fijas provocadas por fármacos; pénfigo buloso; uveítis y conjuntivitis vernal; 5. de los ojos: blefaritis; conjuntivitis, incluyendo conjuntivitis alérgica perenne y vernal; iritis; uveítis anterior y posterior; coroiditis; trastornos autoinmunes; degenerativos o inflamatorios que afectan la retina;
oftalmitis incluyendo oftalmitis del sistema simpático, sarcoidosis; infecciones incluyendo virales, fungosas, y bacterianas; 6. del tracto gastrointestinal; glositis, gingivitis, periodontitis; esofagitis, incluyendo reflujo; gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis incluyendo colitis ulcerativa, proctitis, prurito anal; enfermedad celíaca, síndrome de intestino irritable, y alergias relacionadas con los alimentos que pueden tener efectos alejados del intestino (por ejemplo migraña, eccema o rinitis); 7. abdominales: hepatitis, incluyendo autoinmune, alcohólica y viral; fibrosis y cirrosis del hígado; colecistitis; pancreatitis, tanto aguda como crónica; 8. genitourinaria: nefritis incluyendo intersticial y glomerulonefritis; síndrome nefrótico; cistitis incluyendo cistitis aguda y crónica (intersticial) y úlcera de Hunner, uretritis aguda y crónica, prostatitis, epididimitis, ooforitis y salpingitis; vulvovaginitis; enfermedad de Peyronie; disfunción eréctil (tanto masculina como femenina) ; 9. rechazo de haloinjerto: agudo y crónico después de, por ejemplo, trasplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel o córnea o después de transfusión sanguínea o enfermedad de injerto contra huésped, crónica; 10. del SNC: enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de la demencia incluyendo CJD y nvCJD; amiloidosis; esclerosis múltiple y otros síndromes desmielinantes; ateroesclerosis cerebral y vasculitis; arteritis temporal; miastenia grave; dolor agudo y crónico (agudo, intermitente o persistente, ya sea de origen central o periférico) incluyendo dolor visceral, dolor de cabeza, migraña, neuralgia trigeminal, dolor facial atípico, dolor de las articulaciones y de los huesos, dolor provocado por el cáncer y de la invasión de tumores, síndromes de dolor neuropático incluyendo neuropatías asociadas con las personas diabéticas, con los eventos post-herpéticos, y con VIH; neurosarcoidosis; complicaciones del sistema nervioso central y periférico de procesos malignos, infecciosos o autoinmunes; 11. otros trastornos autoinmunes y alérgicos incluyendo tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, enfermedad de
Addison, diabetes mellitus, púrpura trombocitopénica idiopática, fasciitis eosinofílica, síndrome de hiper-IgE, síndrome antifosfolípidos; 12. otros trastornos con un componente inflamatorio o inmunológico; incluyendo síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA) , lepra, síndrome de Sezary, y síndromes paraneoplásicos, lupus sistémico, eritematoso; lepra lepromatosa, diabetes del tipo I, síndrome nefrótico; 13. cardiovasculares: ateroesclerosis, que afecta la circulación coronaria y periférica; pericarditis;
miocarditis, cardiomiopatías inflamatorias y autoinmunes incluyendo sarcoides del miocardio; lesiones de repercusión isquémica, endocarditis, valvulitis, y aortitis incluyendo infecciosa (por ejemplo sifilítica) ; vasculitis; trastornos de las venas proximales y periféricas incluyendo flebitis y trombosis, incluyendo las trombosis de las venas profundas y complicaciones de las venas varicosas; 14. oncología: tratamiento de los cánceres comunes incluyendo tumores de la próstata, de mama, del pulmón (por ejemplo el cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) (por sus siglas en inglés), de los ovarios, pancreático, del intestino y del colon, del estómago, de la piel y del cerebro, y sarcoma escamoso, y malignidades que afectan la médula ósea incluyendo las leucemias) y los sistemas linfoproliferativos, tales como el linfoma de Hodgkin y diferente de Hodgkin; incluyendo la prevención y el tratamiento de las enfermedades metastáticas y las recurrencias del tumor, y síndromes paraneoplásicos; y, 15. del tracto gastrointestinal: enfermedad celíaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis microscópica, colitis indeterminada, trastorno del intestino irritable, síndrome de intestino irritable, diarrea no inflamatoria, alergias, relacionadas con los alimentos que tienen efectos en un lugar alejado del intestino, por ejemplo, migraña, rinitis y eccema. Por consiguiente, la presente invención proporciona el benzoato de N-{2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida, o un solvato del mismo para su uso en terapia . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del benzoato de N- { 2- [ ( (2S) -3- { [1- ( 4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil Jacetamida, o un solvato del mismo, en la manufactura de un medicamento para su uso en terapia . En el contexto de la presente especificación, el término "terapia" también incluye la "profilaxis" a menos que existan indicaciones específicas que indiquen lo contrario.
Los términos "terapéutico" y "terapéuticamente" deben ser interpretados de acuerdo con esto. La profilaxis se espera que sea particularmente relevante para el tratamiento de personas que han sufrido de un episodio previo de, o que se considera de otra manera que van a estar en un riesgo incrementado de padecer, la enfermedad o afección en cuestión. Las personas en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección particular, generalmente incluyen aquellos que tienen una historia familiar de la enfermedad o afección, o aquellos que han sido identificados por una prueba o selección genética que van a ser particularmente susceptibles al desarrollo de la enfermedad o afección. La invención también proporciona un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un paciente que padece de, o que está en riesgo de padecer, la enfermedad, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva terapéuticamente del benzoato de N- { 2- [ ( (2S) -3- { [ 1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino}-2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida, o un solvato del mismo. La invención todavía proporciona además un método de tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias, por ejemplo una enfermedad de las vías respiratorias obstructivas, reversible, en un paciente que padece de, o que está en riesgo de padecer, la enfermedad, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del benzoato de N- { 2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida, o un solvato del mismo. Para los usos terapéuticos mencionados anteriormente, la dosificación administrada variará, por supuesto con el modo de administración, el tratamiento deseado y el trastorno indicado, pero típicamente puede estar en el intervalo desde 0.001 mg/kg hasta 30 mg/kg. La sal de benzoato o el solvato del mismo de acuerdo con la invención, pueden ser utilizados por sí mismos pero generalmente serán administrados en la forma de una composición farmacéutica en la cual la sal de benzoato o el solvato del mismo (ingrediente activo) , en asociación con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de las formulaciones farmacéuticas adecuadas son descritos, por ejemplo, en "Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1998. Dependiendo del modo de administración, la composición farmacéutica puede comprender desde 0.05 hasta 99 % en peso (por ciento en peso) , más preferentemente desde 0.05 hasta 80 % en peso, todavía más preferentemente desde 0.10 hasta 70 % en peso, y aún más preferentemente desde 0.10 hasta 50 % en peso, del ingrediente activo, todos los porcentajes son en peso estando basados en la composición total. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el benzoato de N-{2- [ ( (2S) -3- { [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil } acetamida, o un solvato del mismo, en asociación con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además un proceso para la preparación de una composición farmacéutica de la invención, que comprende mezclar el benzoato de N-{ 2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida o un solvato del mismo con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas tópicamente (por ejemplo a la piel o a los pulmones y/o a las vías respiratorias) en la forma, por ejemplo, de cremas, soluciones, suspensiones, aerosoles de heptafluoroalcano (HFA) y las formulaciones de un polvo seco, por ejemplo, las formulaciones en el dispositivo inhalador conocido como el Turbuhaler®; o sistémicamente, por ejemplo por administración oral en la forma de tabletas, cápsulas, jarabes, polvos o granulos; o por administración parenteral en la forma de soluciones o suspensiones; o por administración subcutánea, o por administración rectal en la forma de supositorios; o transdérmicamente. En una modalidad de la invención, la sal de benzoato de la invención es administrada por inhalación. En una modalidad adicional, la sal de benzoato de la invención es administrada por medio de un inhalador de polvo seco. El inhalador puede ser un inhalador de una sola dosis o de dosis múltiples, y puede ser un inhalador de un polvo seco accionado por la respiración. Cuando se administra por medio de inhalación, las dosis del compuesto (es decir, la sal de benzoato) de la invención puede estar generalmente en el intervalo desde 0.1 µg hasta 10000 µg, 0.1 hasta 5000 µg, 0.1 hasta 1000 µg, 0.1 hasta 500 µg, 0.1 hasta 200 µg, 0.1 hasta 200 µg, 0.1 hasta 100 µg, 0.1 hasta 50 µg, 5 hasta 5000 µg, 5 hasta 1000 µg, 5 hasta 500 µg, 5 hasta 200 µg, 5 hasta 100 µg, 5 hasta 50 µg, 10 hasta 5000 µg, 10 hasta 1000 µg, 10 hasta 500 µg, 10 hasta 200 µg, 10 hasta 100 µg, 10 hasta 50 µg, 20 hasta 5000 µg, 20 hasta 1000 µg, 20 hasta 500 µg, 20 hasta 200 µg, 20 hasta 100 µg, 20 hasta 50 µg, 50 hasta 5000 µg, 50 hasta 1000 µg, 50 hasta 500 µg, 50 hasta 200 µg, 50 hasta 100 µg, 100 hasta 5000 µg, 100 hasta 1000 µg ó 100 hasta 500 µg. Las formulaciones de polvo seco y los aerosoles de HFA presurizados de los compuestos de la invención pueden ser administrados por una inhalación oral o nasal. Para inhalación, el compuesto está deseablemente dividido finamente. El compuesto dividido de manera fina preferentemente tiene un diámetro promedio de la masa menor que 10 µm, y puede ser suspendido en una mezcla propulsora con la ayuda de un dispersante, tal como un ácido graso de C8-C20 o una sal del mismo, (por ejemplo, ácido oleico), una sal biliar, un fosfolípido, un sacárido de alquilo, un agente tensioactivo perfluorado o polietoxilado, u otro dispersante farmacéuticamente aceptable. Una posibilidad es mezclar el compuesto finamente divido de la invención con una substancia portadora, por ejemplo, un mono, di o polisacárido, un alcohol de azúcar, u otro poliol. Los portadores adecuados son azúcares, por ejemplo lactosa, glucosa, rafinosa, melecitosa, lactitol, maltitol, trehalosa, sucrosa, manitol; y almidón. Alternativamente, el compuesto finamente dividido puede ser recubierto por otra substancia. La mezcla en polvo también puede ser distribuida en cápsulas de gelatina dura, cada una conteniendo la dosis deseada del compuesto activo. Otra posibilidad es procesar el polvo finamente dividido en esferas que se rompen durante el procedimiento de inhalación. Este polvo esferonizado puede ser llenado en el depósito de fármaco de una inhalador de dosis múltiples, por ejemplo, que es conocido como el Turbuhaler® en el cual una unidad de dosificación suministra la dosis deseada que es inhalada entonces por el paciente. Con este sistema, el ingrediente activo, con o sin una substancia portadora, es suministrado al paciente. Para la administración oral el compuesto de la invención puede ser mezclado con un adyuvante o un portador, por ejemplo, lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol; un almidón, por ejemplo, almidón de papa, almidón de maíz o amilopectina; un derivado de celulosa; un aglutinante, por ejemplo, gelatina o polivinilpirrolidona; y/o un lubricante, por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de calcio, polietilenglicol, una cera de parafina, y semejantes, y luego comprimidos en tabletas. Si las tabletas recubiertas son requeridas, los núcleos, preparados como se describió anteriormente, pueden ser recubiertos con una solución de azúcar concentrada que puede contener, por ejemplo, goma arábiga, gelatina, talco y dióxido de titanio. Alternativamente, la tableta puede ser recubierta con un polímero adecuado disuelto en un solvente orgánico fácilmente volátil . Para la preparación de cápsulas de gelatina blanda, el compuesto de la invención puede ser mezclado con, por ejemplo, un aceite vegetal o polietilenglicol. Las cápsulas de gelatina dura pueden contener granulos del compuesto utilizando cualquiera de los excipientes mencionados anteriormente para las tabletas. También las formulaciones líquidas o semisólidas del compuesto de la invención pueden ser llenadas en cápsulas de gelatina dura. Las preparaciones líquidas para aplicación oral pueden estar en la forma de jarabes o suspensiones, por ejemplo, soluciones que contienen el compuesto de la invención, el resto es azúcar y una mezcla de etanol, agua, glicerol y propilenglicol. Opcionalmente, tales preparaciones líquidas pueden contener agentes colorantes, agentes saborizantes, sacarina y/o carboximetilcelulosa como un agente espesante u otros excipientes conocidos por aquellos expertos en el arte. Los compuestos de la invención también pueden ser administrados en conjunción con otros compuestos utilizados para el tratamiento de las afecciones anteriores. Por lo tanto, la invención se refiere además a terapias combinadas en donde un compuesto de la invención o una composición o formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la invención es administrado de manera concurrente o consecutiva o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las afecciones listadas. La presente invención será explicada ahora por la referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una configuración de difracción del polvo de rayos X del benzoato de la N- { 2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil } acetamida (Forma A). La figura 2 muestra una configuración de difracción del polvo de rayos X del benzoato de la N- { 2- [ ( (2S) -3- { [1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida (Forma B) .
La figura 3 muestra el diámetro aerodinámico promedio de la masa (MMAD) (por sus siglas en inglés) y la desviación estándar geométrica (GSD) (por sus siglas en inglés) del benzoato de la N-{ 2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida (Forma B) y la formulación del Pulmicort® Turbuhaler®, como se describe en los ejemplos. Las barras de errores son el % de CI95. La figura 4 muestra la fracción de partículas finas (FPF) del benzoato de la N- { 2- [ ( (2S) -3- { [ 1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida (Forma B) y la formulación del Pulmicort® Turbuhaler®, como se describe en los ejemplos. Las barras de errores son el % de CI95. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Métodos generales Los espectros de 1H RMN fueron registrados a 298K sobre una unidad Varian Inova de 400 MHz (software: VNMR 6.1C y VNMRJ 1.1D; sonda: Nalorac 5 mm DG400-5AT) o un Varian Mercury-VX 300 MHz (software: VNMR 6.1C; sonda: Varian 5 mm AutoSW PFG) . Los picos centrales de acetona-de o sulfóxido de dimetilo (DMSO)-dg fueron utilizados como referencias internas . El siguiente método fue utilizado para el análisis de CL/EM:
Instrumento de EM: serie 1100 de Agilent, equipado con una interfaz de APCl Instrumento de CL: serie 1100 de Agilent, equipado con VWD del detector de UV, automuestreador ALS, bomba binaria y desgasificador. Columna de CL: Chromolith Speed ROD, RP-C18, 04.6 x 50 mm Eluyente: Solvente A: agua + ácido trifluroacético al 0.1 % (TFA); Solvente B: acetonitrilo + TFA al 0.1 % Afecciones: CL: flujo 2.5 ml/minuto; 5 a 95 % de B en el gradiente; tiempo de la corrida de 3.6 minutos; UV 220 nm EM: detección positiva; voltaje capilar 3 kV. Ejemplo 1 Preparación del benzoato de N-{2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil)piperidin-4-il] amino}-2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil}acetamida (sal 1:1), Forma A (a) Las soluciones calientes de la N- { 2- [ ( (2S) -3- { [ 1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida (que puede ser preparada por los procesos descritos en WO 03/051839, o por procesos análogos aquellos descritos en WO 01/98273; 462 mg, 1.0 mmol) en acetato de etilo (10 ml) y ácido benzoico (244 mg, 2.0 mmol) en acetato de etilo (10 ml) fueron mezcladas.
La mezcla resultante se dejó enfriar gradualmente hasta la temperatura ambiente (20 °C) en un vial cerrado. Se formó un precipitado blanco sin turbidez. Después de permanecer a temperatura ambiente toda la noche, el precipitado obtenido fue lavado con acetato de etilo (3 x 10 ml) y se seca in vacuo a 60 °C toda la noche para dar la sal del título como un sólido de color blanco mate (506 mg, 86%). La sal contuvo trazas de acetato de etilo. 1H RMN (399.99 MHz, acetona-d6) d 8.77 (s, ÍH) , 8.07-8.04 (m,
2H), 7.83 (d, J = 8.7 Hz, ÍH) , 7.55-7.50 (m, ÍH) , 7.46-7.41
(m, 2H) , 7.36-7.31 (m, 4H) , 6.52 (d, J = 2.6 Hz, ÍH) , 6.40
(dd, J = 8.7 Hz, 2.6 Hz, ÍH) , 3.97 (d, J = 9.3 Hz, ÍH) , 3.89
(d, J = 9.3 Hz, ÍH), 3.48 (s, 2H) , 3.29 (d, J = 12.1 Hz, ÍH) , 2.94 (d, J = 12.2 Hz, ÍH) , 2.91 - 2.77 (m, 3H) , 2.09-2.00
(m, 4H) , 1.98 (s, 3H) , 1.72-1.59 (m, 2H) , 1.30 (s, 3H) . APCI-EM: m/z 462 [MH+] . La estequiometría, de la base con respecto al ácido, de 1:1, fue confirmada por RMN. Las cantidades adicionales de la sal del título fueron preparadas por el siguiente método: (b) Las soluciones calientes de N- { 2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil Jacetamida (4.0 mg, 8.65 mmol) en acetato de etilo (75 ml) y ácido benzoico (1.16 g, 9.5 mmol) en acetato de etilo (75 ml) fueron mezclados. Cuando la mezcla resultante se ha enfriado gradualmente a temperatura ambiente (20 °C) , se sembró con una partícula de la sal del título obtenida en (a) anterior y se dejó toda la noche en un recipiente cerrado. El precipitado obtenido fue lavado con acetato de etilo (3 x 50 ml) y se secó in vacuo a 60 °C toda la noche para dar la sal del título como un sólido de color blanco mate (4.41 mg, 87 %) . La sal contuvo trazas de acetato de etilo. Ejemplo 2 Preparación del benzoato de N-{2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobencil) piperidin-4-il] amino} -2- idroxi-2-metilpropil) oxi] -4- idroxifenil}acetamida (sal 1:1), Forma B (a) La sal de benzoato preparada por el método del Ejemplo l(b) (Forma A, 10 a 15 mg) fue colocada en una bandeja para Calorimetría de Exploración Diferencial (con una tapa con los bordes doblados hacia abajo) y utilizando una velocidad de calentamiento de 5 K.min-1, y se calienta hasta que se alcanza una temperatura de 155 °C. Una vez que la sal se ha fundido (una temperatura de fusión de inicio de 146.5 °C fue registrada bajo las afecciones utilizadas), la muestra fundida fue enfriada gradualmente a una velocidad de 5 K.min-1 hasta la temperatura ambiente (20 °C) . Luego la misma bandeja fue calentada nuevamente a una velocidad de calentamiento de 5 K.min-1 hasta que una temperatura de 151 °C fue alcanzada y la exploración registrada como una isoterma a 148 °C durante un período de 10 minutos. La bandeja fue enfriada entonces rápidamente hasta la temperatura ambiente conduciendo a la formación de cristales que fueron confirmadas subsiguientemente por la difracción del polvo de rayos X (XRPD) que van a ser una nueva forma física del benzoato de N- { 2- [ ( (2S) -3- { [ 1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino } -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil }acetamida (Forma B) . Algo de la sal de benzoato, amorfa, puede ser formada como un subproducto del proceso. (b) La sal de la Forma B descrita en (a) anterior también puede ser preparada disolviendo, en un vial, 20 % en peso de una muestra de la sal de benzoato preparada por el método del Ejemplo 1 (b) (Forma A) en un solvente tal como metanol (>20 mg/ml), etanol (>20 mg/ml), n-propanol (>20 mg/ml), isopropanol (8.5 mg/ml) o acetona (9.6 mg/ml). Las cifras entre corchetes indican la solubilidad estimada de la sal en estos solventes. El vial fue sellado entonces y la suspensión fue homogeneizada a temperatura ambiente (20 °C) utilizando un magneto. La agitación y la temperatura fueron mantenidas durante un período de al menos 7 días, tiempo después del cual una muestra del material obtenido fue secada y probada por XRPD, La XRPD confirmó que existió una transformación completa de la Forma A a la Forma B.
(c) La sal de la Forma B descrita en (a) anterior también fue preparada por la disolución de la sal de benzoato preparada por el método del Ejemplo 1 (b) (Forma A) (22.0 g, 37.7 mmol) y ácido benzoico (0.46 g, 3.8 mmol) en 2-propanol caliente (190 ml) en un recipiente de fondo redondo para dar una solución rojiza. El recipiente se hizo girar utilizando un dispositivo Rotovapor sobre un baño de agua a 40 °C hasta que la solución se ha enfriado gradualmente hasta 40 °C, después de lo cual la misma fue sembrada con algunos cristales de la sal de la Forma B. El baño de agua se dejó que se enfríe gradualmente de manera descendente hasta la temperatura ambiente toda la noche mientras que el recipiente se está haciendo girar y la mezcla fue sembrada ocasionalmente con algunos cristales de la sal de la Forma B. Un precipitado rosa que se formó, fue aislado por succión, se lava con 2-propanol (2 x 50 ml) y se seca in vacuo a 100 °C durante 20 horas para dar la sal del título (como se confirmó por XRPD) como un sólido de color rosa claro (18.5 g, 84 %) . La sal contuvo trazas de 2-propanol. 1ti RMN (299.95 MHz, DMS0-d6) d 8.87 (s, ÍH) , 7.96-7.91 (m, 2H) , 7.59-7.52 (m, ÍH) , 7.49-7.47 (m, ÍH) , 7.46-7.42 (m, 2H) , 7.36 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 7.29 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 6.39 (d, J = 2.5 Hz, ÍH) , 6.29 (dd, J = 8.5 Hz, 2.5 Hz, ÍH) , 3.78-3.72 (m, 2H) , 3.41 (s, 2H) , 2.79-2.66 (m, 4H) , 1.98 (s, 3H) , 1.97-1.88 (m, 2H) , 1.85-1.76 (m, 2H) , 1.41-1.25 (m, 2H) , 1.19 (s, 3H) . APCI-EM: m/z 462 [MH+] . La estequiometría, de la base con respecto al ácido, de 1:1, fue confirmada por RMN. Ejemplo 3 Análisis de difracción del polvo de rayos X Procedimientos generales Los análisis de difracción del polvo de rayos X
(XRPD) pueden ser efectuados sobre las muestras preparadas de acuerdo con los métodos estándares (véase por ejemplo
Giacovazzo et al . , eds. Fundamentáis of Crystallography,
Oxford University Press (1992); Jenkins & Snyder, eds.,
Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley &
Sons, New York (1996); Bunn, ed. , Chemical Crystallography, Clarendon Press, London (1948); y Klug & Alexander eds., X-ray Diffraction Procedures, John Wiley & Sons, New York
(1974)) . Las configuraciones de difracción del polvo de rayos
X de la Forma A y de la Forma B descritas en los Ejemplos 1 y 2 anteriores (en la forma anhidra) fueron obtenidos como se describe a continuación. Un difractómetro de rayos X del polvo para enfoque de Bragg-Brentano utilizando una radiación de CuKa monocromático (45 kV y 40 mA) fue utilizado para los análisis. Los dispositivos ópticos primarios contuvieron ranuras de ventilación y una ranura de divergencia automática . Las muestras planas fueron preparadas sobre placas con un fondo de resolución de cero que fueron giradas durante las mediciones . Los dispositivos ópticos secundarios contuvieron ranuras de ventilación , una ranura antidispersión automática , una ranura de recepción y un monocromador . La señal difractada fue detectada con un detector relleno con xenón, proporcional . Las configuraciones de difracción fueron colectadas entre 2 ° < 2T ( theta ) < 40 ° en un modo de exploración continuo con un tamaño de paso de 0 . 016 ° 2? a una velocidad de 4 ° 2? por minuto . Los datos de entrada fueron almacenados electrónicamente . La evaluación fue efectuada sobre configuraciones de difracción de entrada o alisadas . Un difractómetro Panalytical X' pert PRO MPD ?-? en el modo de reflexión fue utilizado para las mediciones mencionadas anteriormente. Una persona experta en el arte puede ajustar los parámetros instrumentales para un difractómetro de rayos X del polvo de modo que los datos de la difracción comparables con los datos presentados, pueden ser colectados . Los resultados obtenidos son mostrados en la Figura 1 y la Figura 2 . Ejemplo 4 Calorimetría de exploración diferencial (DSC) Utili zando los métodos estándares , por ej emplo aquellos descritos en Hdhne, G.W. H. et al (1996), Differential Scanning Calorimetry, Springer, Berlín, la respuesta calorimétrica de una muestra de prueba a la temperatura creciente fue investigada utilizando un calorímetro de exploración diferencial de temperatura modulada Q1000 (MTDSC) en el modo de "calentamiento solamente" con una elevación de la velocidad de 5 °C por minuto. Aproximadamente 2 a 5 mg de la muestra de prueba fueron colocados en tazas de aluminio con tapas (sin pliegues hacia abajo) bajo una atmósfera de nitrógeno . Se sabe bien que las temperaturas de inicio y máximas de DSC pueden variar debido a la pureza de la muestra y los parámetros instrumentales, especialmente la velocidad de exploración de la temperatura. Una persona experta en el arte puede utilizar la optimización/calibración de rutina para ajustar los parámetros instrumentales para un calorímetro de exploración diferencial de modo que los datos comparables con los datos presentados aquí pueden ser colectados. La temperatura de fusión para una muestra típica de la sal de la Forma A anhidra se encontró que va a ser de 146 °C + 2 °C (inicio) . La temperatura de fusión para una muestra típica de la sal de la Forma B anhidra se encontró que va a ser de 154 °C + 2 °C (inicio) .
Ejemplo 5 Determinación de la higroscopicidad El cambio de peso de una muestra de prueba a temperatura ambiente (25 °C) y al 80 % de humedad relativa (RH) fue investigada por el registro de las isotermas de absorción-desorción utilizando un analizador SGA-100 de la absorción de vapor, simétrico (VTI Corporation) utilizando diferentes métodos, las características principales son: un ciclo de sorción-desorción único desde 0 hasta 90 % de RH en las etapas de RH del 10 % con un valor de activación de dm/dt de 0. 002 %, (dm/dt = cambio en la masa con el tiempo - cuando la estabilidad en el equilibrio está dentro de este valor la siguiente etapa es iniciada automáticamente, sin embargo, si estas afecciones no son logradas, existe un tiempo máximo de falla para cada etapa de 6 horas) . Aproximadamente 2 a 10 mg de la muestra de prueba fueron colocadas en un sujetador de la muestra y expuestas a diferentes unidades relativas . Muestra de prueba Absorción de agua ( % (p/p ) a 80 % de RH Forma A Anhidra < 2 Forma B anhidra < 0 . 8 Ejemplo 6 Evaluación de las propiedades de desagregación de la sal microni zada Método Este estudio de selección fue propuesto para dar alguna estimación con respecto a las propiedades de desagregación de la sal de benzoato de N-{2- [ ( (2S) -3-{ [1- (4-clorobenci1) piperidin-4-il] amino} -2-hidroxi-2-metilpropil) oxi] -4-hidroxifenil } acetamida, forma B (referida en la parte restante de este ejemplo como la "sal de la Forma B" . Los resultados fueron comparados con los resultados de un polvo de producto estabilizado, la formulación de Pulmicort® Turbuhaler® la cual fue probada de manera idénticamente. La sal de la Forma B fue micronizada para obtener un tamaño de partícula de menos de 5 µM. El polvo de Pulmicort® Turbuhaler® fue vaciado del Pulmicort® Turbuhaler®. La última formulación consiste de polvo de Budesonide micronizado que está esferonizado en pelotillas pequeñas. La micronización de la sal de la Forma B fue efectuada en un molino que aplica un chorro en espiral. Dentro del espacio anular interno del molino con la aplicación de un chorro existe una clasificación en espiral. Las partículas finas pasarán a través de esta zona de clasificación y viajarán hacia fuera a través de un ciclón en el fondo del molino. La fracción capturada en el filtro de escape del molino fue desechada. Para la desagregación de los polvos (tanto la formulación de Pulmicort® Turbuhaler® como la sal de la Forma B) , los polvos fueron rellenados por raspado en un dispositivo inhalador simple que comprende un canal cilindrico con forma de L, que comprende un componente vertical y un componente horizontal. Una boquilla del Turbuhaler® fue afianzada a un extremo del componente horizontal para promover la desagregación del polvo, y el polvo que va a ser probado fue colocado por medio del canal vertical en la curva del canal (es decir, la esquina del canal con forma de L) . Un impulso de flujo de aire (véase posteriormente) activó entonces el flujo de aire a través del componente vertical del canal, atrapando el polvo localizado en la curva, y la mezcla de partículas-aire es movida después de esto a través del componente horizontal del cilindro y finalmente se hace pasar a través de la boquilla del Turbuhaler®. Después de dejar la boquilla del Turbuhaler®, el aerosol fue transferido a un Dimensionador de Partículas Aerodinámicas TSI (APS®) con un dispositivo Impactor Inlet 3306 en donde la nube de aerosol fue analizada para verificar sus propiedades aerodinámicas y la fracción de partículas finas. El dispositivo APS fue colocado de tal manera que permita el retiro de las dosis a flujos de aire opcionales, seguido por el conteo y la clasificación aerodinámica (ca. 0.3-20 µM) de las partículas sobre una base de partícula por partícula. Brevemente, entre la garganta del aparato USP y el dispositivo 3306 Impacter Inlet, una válvula neumática de tres vías y un pre-separador de NGI fueron colocados. Además, un tubo para una fuente de vacío por medio de una válvula de solenoide controlada por un temporizador (Triggor Box) fue colocada entre la válvula y el pre-separador de un modo de una unión en forma de T . Un impulso de flujo de aire breve es generado entonces por medio del inhalador, la garganta del aparato USP, y el pre-separador utilizando el dispositivo Triggor box. Después del final del impulso de aire, la válvula neumática es cambiada de modo que la nube de aerosol en el pre-separador sea extraída hacia el APS por medio del aparato 3306 Impacter Inlet para la evaluación aerodinámica. Cada dosis fue extraída con un impulso del flujo de aire de duración de 0.4 segundos con un flujo de aire máximo de 60 lpm, seguido por el muestreo en el instrumento de APS. El tiempo de muestreo en el software APS fue fijado en 20 segundos. Los parámetros resultantes del APS fueron el diámetro aerodinámico promedio de la masa (MMAD) , la desviación geométrica estándar (GSD) , y la medición de la cantidad de la dosis (datos del conteo de partículas convertidos a datos de la masa utilizando una densidad de partículas = 1) llamada la dosis de partículas finas (FPD) . Las dos primeras dosis (para cada formulación) fueron liberadas y medidas gravimétricamente. El valor promedio de estas dosis gravimétricas, denotadas como "dosis suministradas", o dosis cargadas, fueron utilizadas para la normalización de la (FPD), lo cual proporciona una medida de la fracción de partículas finas (FPF) . La FPF puede ser utilizada por lo tanto para la comparación directa entre las dos formulaciones del polvo (para el ajuste del instrumento utilizado) . El límite para las partículas finas fue ajustado con respecto a un tamaño de partícula aerodinámico de 7 µm. Siete y cinco dosis fueron analizadas entonces con el aparato APS para la formulación de Pulmicort® Turbuhaler® y para la sal de la Forma B, respectivamente. Resul tados Los resultados son mostrados en la Tabla 2. La fracción de partículas finas es FPD dividida entre la dosis suministrada, la cual a su vez es el promedio aritmético de dos mediciones para cada formulación. Los resultados son graficados en la Figura 3 (MMAD y GSD) y en la figura 4 (FPF) . Los resultados de MMAD y GSD muestran una variabilidad muy pequeña (intervalos pequeños de confianza) y la diferencia entre las dos formulaciones con respecto a estos dos parámetros es muy pequeña y se puede considerar más o menos como equivalente. Para la FPF, una variabilidad más grande fue obtenida para la sal de la Forma B, que puede ser atribuida al hecho de que el polvo no está optimizado con respecto a las propiedades del llenado. Sin embargo, se observa sorprendentemente que la FPF es generalmente más elevada para la sal de la Forma B que para la formulación de Pulmicort® Turbuhaler®, lo cual también es reflejado en la FPF normalizada para la sal de la Forma B. Tabla 2 Datos de los Resultados. Las dosis 1-7 son los datos de Pulmicort® Trubuhaler®. Las dosis 8-12 son los datos de la sal de la Forma B. El valor3 de FPF de la sal de la Forma B normalizada es calculado como el promedio de la formulación de la sal de la forma B de FPF/promedio de la formulación de Pulmicort® Trubuhaler® de FPF.
A partir de los resultados presentados anteriormente se puede concluir que la formulación de la sal de la Forma B exhibió un punto medio de tamaño de partícula
(MMAD) y una distribución del tamaño de partícula (GSD) muy semejantes que la formulación del producto establecido
(formulación de Pulmicor® Turbuhaler®) . La fracción del polvo que se distribuye en las partículas finas (fracción de partícula fina) , que es crucial para el suministro exitoso del fármaco al tracto respiratorio, estuvo en un intervalo semejante para dos diferentes polvos, aunque mejor para la sal de la Forma B. Por lo tanto se concluye, de los datos obtenidos en este estudio, que la formación de la sal B exhibe propiedades ventajosas de desagregación. Ensayo de aglutinación de CCRl humano Membranas Las células HEK293, de ECACC, que expresan establemente la CCRl humana recombinante (HEK-CCR1) fueron utilizadas para preparar las membranas celulares que contienen CCRl. Las membranas fueron almacenadas a -70 °C. La concentración de las membranas de cada lote fue ajustada al 10 % de la aglutinación específica de 33 pM [125I] MlP-la. Ensayo de aglutinación 100 µl de las membranas de HEK-CCR1 diluidas en el amortiguador de ensayo de pH 7.4 (NaCl 137 mM (Merck, Cat. No. 1.06404), glucosa 5.7 mM (Sigma, Cat No G5400) , KCl 2.7 mM (Sigma, Cat No P-9333), NaH2P04 0.36 mM x H20 (Merck, Cat No 1.06346), HEPES 10 mM (Sigma, Cat No H3375) , gelatina al 0.1 % (p/v) (Sigma, Cat No G2625)) con la adición de 17500 unidades/L de Bacitracina (Sigma, Cat No. B1025) fueron agregados a cada cavidad de la placa filtrante de 96 cavidades (Millipore opaca de 0.45 µm Cat No. MHVB N4550). 12 µl del compuesto en el amortiguador de ensayo, que contiene 10 % de DMSO, fueron agregados para dar las concentraciones finales del compuesto de 1 x 10"5,5 - 1 x 10"9-5 M. 12 µl de MlP-la recombinante, humano, frío (270-LD-050, R&D Systems, Oxford, UK) , concentración final 10 nM en el amortiguador de ensayo suplementado con DMSO al 10 %, fueron incluidos en ciertas cavidades (sin el compuesto) como un control de aglutinación no específico (NSB) . 12 µl del amortiguador de ensayo con DMSO al 10 % fueron agregados a ciertas cavidades
(sin el compuesto) para detectar la aglutinación máxima (B0). 12 µl de [125I] MlP-la, diluidos en el amortiguador de ensayo hasta una concentración final en las cavidades de
33 pM, fueron agregadas a todas las cavidades. Las placas con la tapa fueron incubadas entonces durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las cavidades fueron vaciadas por filtración al vacío (sistema MultiScreen Resist Vacuum Manifoid, Millipore) y se lava una vez con 200 µl del amortiguador de ensayo. Después de lavado, todas las cavidades recibieron una adición de 50 µl del fluido de centelleos (OptiPhase "Supermix", Wallac Oy, Turko, Finlandia) . La [125I]MIP-la unida fue medida utilizando un contador Wallac Trilux 1450 MicroBeta. Ajustes de la ventana: Bajo 5-Elevado 1020, conteos de 1 minuto/cavidad. Cálculo del desplazamiento porcentual e IC50 La siguiente ecuación fue utilizada para calcular el desplazamiento porcentual. Desplazamiento porcentual = 1 - ( (prueba de cpm - NSB de cpm)/(B0 de cpm - NSB de CPM)) en donde: prueba de cpm = cpm promedio en las cavidades duplicadas con las membranas y el compuesto y [125I]MIP-la cpm; NSB = cpm promedio en las cavidades con las membranas y MIP-la y [125I] MlP-la (sin aglutinación específica) cpm; BjD = cpm promedio en las cavidades con las membranas y el amortiguador de ensayo [125I]MIP-la (aglutinación máxima). La concentración molar del compuesto que produce 50 % de desplazamiento (IC50) fue derivada utilizando el programa XLfit basado en Excel (versión 2.0.9) para ajustar los datos a una función logística de 4 parámetros. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.