MD3250591T2 - Anticorpi umani împotriva glicoproteinei virusului Ebola - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie oferă o compoziţie farmaceutică care cuprinde un prim anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de virusul Ebola (EBOV), în care primul anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) cu SEQ ID NO: 18 şi o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor (LCVR) cu SEQ ID NO: 26; cuprinzând în plus un al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului acestuia care se leagă specific de EBOV, în care al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului acestuia cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 66 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 74; şi cuprinzând în plus un al treilea anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de EBOV, în care al treilea anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 146 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 154; în care HCVR-ul fiecăruia dintre primul şi al treilea anticorp monoclonal izolat este legat de un domeniu constant lgG1 uman.

Description

[0001] DOMENIUL INVENŢIEI

[0002] Prezenta invenţie se referă la anticorpi care se leagă de glicoproteina virusului Ebola, compoziţii farmaceutice care cuprind aceşti anticorpi şi metode de utilizare a acestora.

[0003] STADIUL TEHNICII

[0004] Virusul Ebola (EBOV) şi filovirusurile înrudite provoacă febră hemoragică virală severă la oameni şi la primatele neumane, cu o rată a mortalităţii de până la aproximativ 90% în focarele umane. (Murin, CD. şi colab., (2014), Proc Natl Acad Sci USA, 111 (48): 17182-17187). Mecanismele imune care mediază protecţia sunt în curs de investigare, dar până în prezent, nu au fost aprobate tratamente pentru uz uman.

[0005] Glicoproteina (GP) a virusului Ebola este singura proteină prezentă pe suprafaţa virusului şi pe celulele infectate. Se presupune că este responsabilă de legarea şi fuziunea virusului cu celulele gazdă. Medicul de familie există în mai multe forme. Aceste GP-uri sunt codificate în două cadre de citire deschise. ARNm-ul GP needitat produce o GP (sGP) secretată nestructurală, solubilă, care este sintetizată la începutul infecţiei (Volchkova şi colab. ( 1995), Virology 214:421-430; Volchkova, VA şi colab., (1998), Virology 250:408-414; Sanchez şi colab. ( 1996), Proc Natl Acad Sci USA, 93:3602-3607; Sanchez şi colab. ( 1999) J. Infect. Dis. 179 (supliment) 1, S164)). SGP formează dimeri (Volchkova, et al. ( 1995), Virology 214:421-430; Falzarano, D. şi colab., Chembiochem (2006), 7:1605-161 1) şi cantităţi mari sunt detectate în sângele pacienţilor şi al animalelor infectate experimental (Sanchez şi colab. ( 1996), Proc Natl Acad Sci USA, 93:3602-3607; Dolnik, O. şi colab., (2004), EMBO J 23:2175-2184).

[0006] Mai târziu în timpul infecţiei, se generează un ARNm editat, dobândind capacitate de codificare dintr-un al doilea cadru deschis de citire. Acest ARNm editat codifică o formă de GP care conţine un domeniu transmembranar (TM) ce permite acestei forme de GP să fie legată de membrana plasmatică a celulei şi încorporată în virioni, unde serveşte ca proteină/proteină de fuziune funcţională care leagă receptorul celulei gazdă. În timpul biosintezei acestei forme de GP, proteina este procesată proteolitic în două produse care sunt ţinute împreună prin legături disulfidice. Produsul amino-terminal este denumit GP1 (140 kDa), iar produsul de scindare carboxi-terminal este denumit GP2 (26 kDa) (Sanchez şi colab. 1998), J. Virol. 72:6442-6447).

[0007] GP-ul virusului Ebola (EBOV GP) ar putea fi o ţintă pentru anticorpii protectori, dar rolul anticorpilor în rezistenţa la boli a fost controversat. Titrurile serice neglijabile ale anticorpilor neutralizanţi la pacienţii convalescenţi, împreună cu rezultatele inconsistente în obţinerea protecţiei prin transferul experimental de seruri imune la animale, au dus la speculaţii cu privire la rolul anticorpilor neutralizanţi în recuperarea după infecţie (Peters, CJ şi LeDuc, JW, (1999), J. Infect. Dis. 179 Suppl 1 ; Mihailov, W, (1994), Vopr. Virusol. 39:82; Xu, L. şi colab., (1998), Nature Med. 4: 37). Cu toate acestea, în focarul mai recent al virusului Ebola, câţiva pacienţi care au contractat boala şi care au fost trataţi cu un cocktail de anticorpi monoclonali (ZMapp) specifici pentru GP viral s-au recuperat. Mai mult, alţi pacienţi care au fost trataţi cu serul acestor pacienţi şi alţi pacienţi care au supravieţuit după dobândirea infecţiei, au avut, de asemenea, rezultate pozitive.

[0008] Au fost descrişi mai mulţi anticorpi care se leagă de GP-ul virusului Ebola (a se vedea, de exemplu, brevetele americane nr. 6630144, 6875433, 7335356 şi 8513391). Vezi şi EP1539238, EP2350270 şi EP8513391).

[0009] Deşi progresele tehnologice au îmbunătăţit capacitatea de a produce compoziţii îmbunătăţite de vaccin pe bază de antigen(e) al virusului Ebola, există în continuare necesitatea de a oferi surse suplimentare de protecţie pentru a aborda tulpinile emergente ale virusului Ebola. Mai multe terapii candidate împotriva virusului Ebola sunt în prezent în curs de evaluare, inclusiv vaccinuri post-expunere (Feldman, H, et al. ( 2007), PLos Pathog 3(1):e2), inhibitori cu molecule mici (Cote, M. şi colab. ( 201 1), Nature, 477(7364):344-348; Johansen, LM, şi colab. ( 2013), Sci Transl Med 5(190): 190ra179; Warren, TK, şi colab., (2014), Nature, 508(7496):402-405), terapii bazate pe siRNA (Geisbert, TW, şi colab., (2006), J. Infect Dis. 193(12): 1650-1657; Geisbert, TW ef al, (2010), Lancet 375(9729): 1896-1905) şi anticorpi monoclonali (Saphire, EO, (2013), Imunotherapy 5(1 1): 1221 -1233; Wong, G. şi colab. ( (2014), Tendinţe Microbiotice. 22(8):456-463; Qiu, X et al, (2014), Hum. Vaccin. Imunoter. 10(4):964-967). Administrarea pasivă de anticorpi la primate neumane s-a dovedit a fi eficientă (Dye, JM., et al, (2012), Proc Natl Acad Sci USA 109(13):5034-5039). Mai recent, un amestec de trei anticorpi (ZMapp) este produs în prezent în plantele de tutun şi este în curs de dezvoltare pentru uz uman (Qiu, X. şi colab., (2014), Nature 514(7520):47-53).

[0010] Xiangguo Qiu şi colab., (2012), PLoS Neglected Tropical Diseases 6(3):e1575 dezvăluie faptul că anticorpii monoclonali specifici GP-ului Ebola protejează şoarecii şi cobaii de infecţia letală cu virusul Ebola. Xiangguo Qiu şi colab., (2012), Sci. Trans. Med. 4 (138):138ra81 descrie tratamentul macacilor cynomolgus infectaţi cu virusul Ebola cu anticorpi monoclonali.

[0011] Deşi ideea unei compoziţii de vaccin care cuprinde antigenul de interes (de exemplu, GP) pentru a genera anticorpi neutralizanţi la un pacient este în general considerată o abordare bună, este posibil să nu fie avantajoasă utilizarea la pacienţii care au fost deja expuşi la virus, deoarece ar dura câteva săptămâni pentru ca organismul să răspundă la compoziţia vaccinului. În acel moment, pacientul poate fi deja decedat în faţa infecţiei virale, în funcţie de nivelul de îngrijire şi de terapia paliativă disponibilă. La aceşti pacienţi sau la orice pacient care nu este capabil să dezvolte un răspuns anticorp eficient, poate fi mai benefic să se furnizeze o compoziţie care conţine deja anticorpi protectori care pot viza epitopi comuni unei anumite tulpini de EBOV sau unei varietăţi de tulpini.

[0012] Prin urmare, există încă o nevoie în domeniu de a identifica noi anticorpi, care pot fi utilizaţi pentru a preveni sau trata o infecţie cu virusul Ebola.

[0013] SCURT REZUMAT AL INVENŢIEI

[0014] Prezenta invenţie oferă o compoziţie farmaceutică care cuprinde un prim anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de virusul Ebola (EBOV), în care primul anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) cu SEQ ID NO: 18 şi o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor (LCVR) cu SEQ ID NO: 26;

[0015] cuprinzând în plus un al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului acestuia care se leagă specific de EBOV, în care al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului acestuia cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 66 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 74;

[0016] şi cuprinzând în plus un al treilea anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de EBOV, în care al treilea anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 146 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 154; în care HCVR-ul fiecăruia dintre primul şi al treilea anticorp monoclonal izolat este legat de un domeniu constant lgG1 uman.

[0017] Invenţia oferă în plus compoziţia farmaceutică menţionată mai sus pentru utilizare într-o metodă de prevenire, tratare sau ameliorare a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV sau de reducere a frecvenţei sau severităţii a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta, opţional în care:

[0018] (a) cel puţin un simptom este selectat din grupul constând din febră, cefalee, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile; sau

[0019] (b) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta, cum ar fi un subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau un subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de a dobândi o infecţie cu EBOV, în care subiectul este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană care este suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în apropiere fizică de o persoană infectată, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent.

[0020] Într-o altă formă de realizare, invenţia oferă compoziţia farmaceutică de mai sus, care cuprinde anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului al acestuia pentru utilizare conform metodei de mai sus, în care compoziţia farmaceutică menţionată este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, opţional

[0021] în care al doilea agent terapeutic este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AV1-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau

[0022] în care compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

[0023] Invenţia oferă în plus compoziţia farmaceutică menţionată anterior pentru utilizare într-o metodă de creştere a supravieţuirii sau a probabilităţii de supravieţuire a unui subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau a unui subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de dobândire a acestuia, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta, opţional în care:

[0024] (a) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta; şi/sau

[0025] (b) subiectul care are nevoie de aceasta şi care prezintă riscul de expunere la sau de dobândire a unei infecţii cu EBOV este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător medical, o persoană suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în apropiere fizică de o persoană infectată, un angajat al unui spital, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care un pacient cu Ebola a fost tratat, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent; şi/sau

[0026] (c) compoziţia farmaceutică este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, cum ar fi un al doilea agent terapeutic care este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau

[0027] (d) compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

[0028] Invenţia oferă, de asemenea, compoziţia farmaceutică menţionată mai sus pentru utilizare într-o metodă de neutralizare a EBOV infecţios sau de inhibare a intrării EBOV într-o celulă la un subiect, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta; opţional, în care:

[0029] (a) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta; şi/sau

[0030] (b) subiectul care are nevoie de aceasta este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană care este suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în apropiere fizică de o persoană infectată, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent; şi/sau

[0031] (c) compoziţia farmaceutică este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, cum ar fi un al doilea agent terapeutic care este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau

[0032] (d) compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

[0033] Într-o altă formă de realizare, invenţia oferă compoziţia farmaceutică de mai sus, în care HCVR-ul celui de-al doilea anticorp monoclonal izolat este legat de un domeniu constant lgG1 uman.

[0034] Prezenta dezvăluire descrie anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care se leagă de glicoproteina (GP) a virusului Ebola (EBOV). Anticorpii sunt utili pentru inhibarea sau neutralizarea activităţii virusului Ebola. În anumite aspecte, anticorpii sunt utili pentru blocarea ataşării virusului Ebola la celula gazdă şi/sau pentru prevenirea intrării virusului Ebola în celulele gazdă. În anumite aspecte, anticorpii funcţionează prin inhibarea transmiterii de la celulă la celulă a virusului sau prin uciderea celulelor infectate cu virusul Ebola, reducând producţia de virus patogen. În anumite aspecte, anticorpii sunt utili în prevenirea, tratarea sau ameliorarea a cel puţin unui simptom al infecţiei cu virusul Ebola la un subiect. În anumite aspecte, anticorpii pot fi administraţi profilactic sau terapeutic unui subiect care are sau prezintă riscul de a dobândi o infecţie cu virusul Ebola. În anumite aspecte, compoziţiile care conţin cel puţin un anticorp conform dezvăluirii pot fi administrate unui subiect pentru care un vaccin este contraindicat sau pentru care un vaccin este mai puţin eficient, de exemplu, un pacient vârstnic, un pacient foarte tânăr, un pacient care poate fi alergic la oricare dintre componentele unui vaccin sau un pacient imunocompromis care poate nu răspunde la imunogenii dintr-un vaccin. În anumite aspecte, compoziţiile care conţin cel puţin un anticorp conform dezvăluirii pot fi administrate personalului medical, pacienţilor spitalizaţi sau rezidenţilor din aziluri de bătrâni sau altor pacienţi cu risc ridicat în timpul unei epidemii de virus Ebola. În anumite aspecte, compoziţiile care conţin cel puţin un anticorp conform dezvăluirii pot fi administrate ca tratament de primă linie pacienţilor care au fost deja expuşi la un virus Ebola.

[0035] [Anticorpii invenţiei pot fi de lungime completă (de exemplu, un anticorp lgG1 sau lgG4) sau pot cuprinde doar o porţiune de legare a antigenului (de exemplu, un fragment Fab, F(ab')2 sau scFv) şi pot fi modificaţi pentru a afecta funcţionalitatea, de exemplu, pentru a creşte persistenţa în gazdă sau pentru a elimina funcţiile efectoare reziduale (Reddy şi colab., 2000, J. Immunol). 164: 1925-1933). În anumite variante de realizare, anticorpii pot fi bispecifici.

[0036] Într-un prim aspect, prezenta invenţie oferă anticorpi monoclonali recombinanţi izolaţi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care se leagă specific de GP-ul EBOV.

[0037] Prin urmare, prezenta dezvăluire se referă la un anticorp recombinant izolat sau la un fragment al acestuia care se leagă de antigen, care se leagă specific de virusul Ebola (EBOV) şi/sau de o glicoproteină a virusului Ebola (EBOV-GP), în care anticorpul cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi regiune variabilă a lanţului greu/regiune variabilă a lanţului uşor (HCVR/LCVR) selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0038] Prezenta dezvăluire se referă, de asemenea, la o compoziţie care cuprinde unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, conform dezvăluirii, pentru utilizare într-o metodă de inhibare a transmiterii EBOV de la celulă la celulă, de ucidere a celulelor EBOV sau de reducere a producţiei de EBOV patogen, metoda cuprinzând expunerea respectivei compoziţii la o celulă infectată cu EBOV, în care expunerea are ca rezultat o protecţie sporită a celulelor împotriva infecţiei virale, moartea celulelor infectate cu EBOV sau o producţie redusă de EBOV din celule.

[0039] Prezenta dezvăluire se referă în plus la o compoziţie farmaceutică care cuprinde unul sau mai mulţi anticorpi monoclonali izolaţi sau fragmente de legare a antigenului acestora care se leagă specific de EBOV şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic, în care unul sau mai mulţi anticorpi monoclonali izolaţi sau fragmente de legare a antigenului acestora cuprind o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR selectată din grupul format din SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0040] Prezenta dezvăluire se referă în plus la o compoziţie farmaceutică care cuprinde (a) un prim anticorp anti-EBOV sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea anticorp anti-EBOV sau fragment de legare a antigenului acestuia; (c) un al treilea anticorp anti-EBOV sau fragment de legare a antigenului acestuia, conform dezvăluirii, în care primul anticorp se leagă de sau interacţionează cu un prim epitop de pe EBOV, iar al doilea şi/sau al treilea anticorp se leagă de sau interacţionează cu un epitop diferit de pe EBOV; şi (d) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic, opţional în care:

(i)

epitopii care se leagă de sau interacţionează cu primul, al doilea şi/sau al treilea anticorp anti-EBOV sau fragmentele de legare a antigenului acestora sunt distincti şi nu se suprapun; sau

(ii)

(ii) primul anticorp anti-EBOV sau un fragment al acestuia care leagă antigenul se leagă la sau interacţionează cu un epitop de pe o tulpină de EBOV, iar al doilea şi/sau al treilea anticorp anti-EBOV sau un fragment al acestuia care leagă antigenul se leagă la sau interacţionează cu un al doilea şi/sau un al treilea epitop de pe aceeaşi tulpină sau de pe o tulpină diferită de EBOV, de preferinţă în care tulpinile EBOV sunt selectate din grupul format din tulpinile Zaire.2014, Zaire.1995, Sudan, Bundibugyo şi Cote d'Ivoire.

[0042] Prezenta dezvăluire se referă, de asemenea, la o compoziţie farmaceutică care cuprinde un prim anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care leagă antigenul şi care se leagă specific de EBOV, în care primul anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care leagă antigenul cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 18 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 26; opţional

[0043] cuprinzând în plus un al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen şi care se leagă specific de EBOV, în care al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SEQ ID NO: 66 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SEQ ID NO: 74.

[0044] Prezenta dezvăluire se referă în plus la o moleculă polinucleotidică izolată care cuprinde o secvenţă polinucleotidică care codifică un HCVR şi un LCVR al unui anticorp, aşa cum se prezintă în prezenta dezvăluire;

[0045] un vector care cuprinde secvenţa polinucleotidică; sau

[0046] o celulă care exprimă vectorul.

[0047] Prezenta dezvăluire se referă, de asemenea, la un anticorp sau fragment de legare a antigenului conform dezvăluirii sau la o compoziţie farmaceutică conform dezvăluirii pentru utilizare într-o metodă de prevenire, tratare sau ameliorare a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV sau de scădere a frecvenţei sau severităţii a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV, metoda cuprinzând administrarea respectivului anticorp sau fragment de legare a antigenului sau a respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta, opţional în care:

(a)

metoda cuprinde administrarea unui amestec de anticorpi care cuprinde: (i) un amestec de cel puţin doi anticorpi anti-EBOV; şi/sau (ii) un amestec de trei anticorpi anti-EBOV, în care cei trei anticorpi anti-EBOV cuprind perechi de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum se prezintă în SEQ ID NOs: 18/26, 66/74 şi 146/154;

(b)

cel puţin un simptom este selectat din grupul format din febră, dureri de cap, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile; sau

(c)

compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta, cum ar fi un subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau un subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau care dobândeşte o infecţie cu EBOV, în care subiectul este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană care este suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în apropiere fizică de o persoană infectată, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent.

[0049] Prezenta dezvăluire se referă în plus la anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului conform prezentei dezvăluiri sau la o compoziţie farmaceutică conform prezentei dezvăluiri pentru utilizare într-o metodă de creştere a supravieţuirii sau a probabilităţii de supravieţuire a unui subiect care suferă de infecţie cu EBOV sau a unui subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de dobândire a acestuia, metoda cuprinzând administrarea a cel puţin unuia dintre anticorpi sau fragmente de legare a antigenului menţionate sau a compoziţiei farmaceutice menţionate unui subiect care are nevoie de acestea, opţional în care:

[0050] (a) metoda cuprinde administrarea unui amestec de anticorpi care cuprinde un amestec de cel puţin doi anticorpi anti-EBOV; şi/sau

[0051] (b) metoda cuprinde administrarea unui amestec de anticorpi care cuprinde un amestec de trei anticorpi anti-EBOV, în care cei trei anticorpi anti-EBOV cuprind perechi de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum sunt prezentate în SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154; şi/sau

[0052] (c) anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul, sau compoziţia farmaceutică care cuprinde anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul, sau cocktailul de anticorpi este administrat profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de acesta;

[0053] şi/sau

[0054] (d) subiectul care are nevoie de acesta şi care prezintă riscul de expunere la sau de dobândire a unei infecţii cu EBOV este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană suspectată că a fost expusă la o persoană care prezintă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în apropiere fizică de o persoană infectată, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care un pacient cu Ebola au fost trataţi, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent; şi/sau

[0055] (e) anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia, sau compoziţia farmaceutică care cuprinde anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia, sau cocktailul de anticorpi este administrat în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, cum ar fi un al doilea agent terapeutic este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală) brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau

[0056] (f) compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

[0057] Într-o formă de realizare, prezenta invenţie oferă un anticorp recombinant izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen, care se leagă specific de virusul Ebola (EBOV) şi/sau de o glicoproteină a virusului Ebola (EBOV-GP), în care anticorpul are una sau mai multe dintre următoarele caracteristici:

[0058] (a) cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii lanţului greu (CDR) (HCDR1, HCDR2 şi HCDR3) conţinute în oricare dintre secvenţele regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) selectate din grupul format din SEQ ID NO: 18, 66, 146, 2, 34, 50, 82, 98, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 şi 306; şi trei CDR-uri ale lanţului uşor (LCDR1, LCDR2 şi LCDR3) conţinute în oricare dintre secvenţele regiunii variabile a lanţului uşor (LCVR) selectate din grupul format din SEQ ID NO: 26, 74, 154, 10, 42, 58, 90, 106, 122, 138, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 şi 298;

[0059] (b) este un anticorp monoclonal complet uman;

[0060] (c) se leagă de EBOV sau de o particulă asemănătoare virusului (VLP) care exprimă o EBOV-GP cu o constantă de disociere (KD) mai mică de 10-7 M, măsurată într-un test de rezonanţă plasmonică de suprafaţă;

[0061] (d) demonstrează o creştere de cel puţin 3 ori a timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH 5 sau pH 6 faţă de pH 7,4;

[0062] (e) demonstrează neutralizarea virusului Ebola din Zair cu un IC50 cuprins între aproximativ 10-11 M şi aproximativ 10-9 M;

[0063] (f) demonstrează legarea la celulele care exprimă citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpii declanşatori ai EBOV-GP;

[0064] (g) reacţionează încrucişat cu una sau mai multe tulpini de EBOV selectate din grupul format din Zaire.2014, Zaire.1995, Sudan, Bundibugyo şi Coasta de Fildeş;

[0065] (h) se leagă de GP solubilă (sGP);

[0066] (i) concurează încrucişat cu un anticorp de referinţă, în care anticorpul de referinţă cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) selectată din grupul constând din oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR şi LCVR din Tabelul 1.

[0067] Într-o formă de realizare, prezenta invenţie oferă un anticorp recombinant izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen, care se leagă specific de EBOV şi/sau de o glicoproteină a virusului Ebola (EBOV GP), în care anticorpul are două sau mai multe dintre următoarele caracteristici:

[0068] (a) este un anticorp monoclonal complet uman;

[0069] (b) se leagă de EBOV sau de o particulă asemănătoare virusului (VLP) care exprimă o GP EBOV cu o constantă de disociere (KD) mai mică de 10-7 M, măsurată într-un test de rezonanţă plasmonică de suprafaţă;

[0070] (c) demonstrează o creştere de cel puţin 3 ori a timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH 5 sau pH 6 faţă de pH 7,4;

[0071] (d) demonstrează neutralizarea virusului Ebola din Zair cu un IC50 cuprins între aproximativ 10-11 M şi aproximativ 10-9 M;

[0072] (e) demonstrează legarea la celulele care exprimă GP-ul EBOV, declanşând citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi;

[0073] (f) reacţionează încrucişat cu una sau mai multe tulpini de EBOV selectate din grupul format din Zaire.2014, Zaire.1995, Sudan, Bundibugyo şi Coasta de Fildeş;

[0074] (g) se leagă de GP solubilă (sGP);

[0075] (h) concurează încrucişat cu un anticorp de referinţă, în care anticorpul de referinţă cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) selectată din grupul constând din oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR şi LCVR din Tabelul 1.

[0076] Exemple de anticorpi GP anti-virus Ebola conform prezentei invenţii sunt enumerate în tabelele 1 şi 2 de aici. Tabelul 1 prezintă identificatorii de secvenţă de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţului greu (HCVR), regiunilor variabile ale lanţului uşor (LCVR), regiunilor care determină complementaritatea lanţului greu (HCDR1, HCDR2 şi HCDR3) şi regiunilor care determină complementaritatea lanţului uşor (LCDR1, LCDR2 şi LCDR3) ale anticorpilor GP anti-virus Ebola exemplificaţi. Tabelul 2 prezintă identificatorii de secvenţă de acid nucleic ai anticorpilor GP anti-virus Ebola HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 şi LCDR3 din exemplificarea acestora.

[0077] Sunt dezvăluiţi aici anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând un HCVR cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acestora având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0078] Sunt dezvăluiţi aici anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând un LCVR cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCVR enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acestora având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu acesta.

[0079] Sunt dezvăluiţi aici anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR şi LCVR (HCVR/LCVR) cuprinzând oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR enumerate în Tabelul 1, asociate cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCVR enumerate în Tabelul 1. Conform anumitor variante de realizare, prezenta invenţie furnizează anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR conţinută în oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1.

[0080] Într-un aspect al dezvăluirii, anticorpul izolat sau fragmentul de legare a antigenului cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 şi 306/282.

[0081] Într-un aspect al dezvăluirii, anticorpul izolat sau fragmentul de legare a antigenului cuprinde:

[0082] (a) un domeniu HCDR1 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NO: 20, 68, 148, 4, 36, 52, 84, 100, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 şi 308;

[0083] (b) un domeniu HCDR2 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NO: 22, 70, 150, 6, 38, 54, 86, 102, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 şi 310;

[0084] (c) un domeniu HCDR3 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NO: 24, 72, 152, 8, 40, 56, 88, 104, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 şi 312;

[0085] (d) un domeniu LCDR1 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NO: 28, 76, 156, 12, 44, 60, 92, 108, 124, 140, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 şi 300;

[0086] (e) un domeniu LCDR2 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NOs: 30, 78, 158, 14, 46, 62, 94, 110, 126, 142, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 şi 302;

[0087] (f) un domeniu LCDR3 având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NOs: 32, 80, 160, 16, 48, 64, 96, 112, 128, 144, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 şi 304.

[0088] În anumite aspecte, perechea de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26 (H1H17139P), 66/74 (H1H17161P) şi 146/154 (H1H17203P).

[0089] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR1 cu lanţ greu (HCDR1) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR1 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0090] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR2 cu lanţ greu (HCDR2) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR2 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acestora având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0091] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR3 cu lanţ greu (HCDR3) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR3 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0092] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR1 cu lanţ uşor (LCDR1) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR1 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0093] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR2 cu lanţ uşor (LCDR2) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR2 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acestora având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0094] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o CDR3 cu lanţ uşor (LCDR3) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR3 enumerate în Tabelul 1 sau o secvenţă substanţial similară a acestora având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0095] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o pereche de secvenţe de aminoacizi HCDR3 şi LCDR3 (HCDR3/LCDR3) cuprinzând oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR3 enumerate în Tabelul 1, asociate cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR3 enumerate în Tabelul 1. Conform anumitor variante de realizare, prezenta invenţie furnizează anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând o pereche de secvenţe de aminoacizi HCDR3/LCDR3 conţinută în oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1. În anumite variante de realizare, perechea de secvenţe de aminoacizi HCDR3/LCDR3 este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 24/32 (de exemplu, H1H17139P), 72/80 (de exemplu, H1H17161P) şi 152/160 (de exemplu, H1H17203P).

[0096] Sunt dezvăluiţi aici, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând un set de şase CDR-uri (adică HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) conţinuţi în oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1. În anumite variante de realizare, setul de secvenţe de aminoacizi HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 este selectat din grupul format din SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32 (de exemplu, H1 H 17139P), 68-70-72-76-78-80 (de exemplu, H1 H17161 P); şi 148-150-152-156-158-160 (de exemplu, H1 H17203P).

[0097] Prezenta dezvăluire oferă anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând un set de şase CDR-uri (adică HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) conţinute într-o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum este definită de oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1. De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, cuprinzând setul de secvenţe de aminoacizi HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 conţinute într-o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26 (de exemplu, H1 H 17139P), 66/74 (de exemplu, H1 H17161 P); şi 146/154 (de exemplu, H1 H17203P). Metodele şi tehnicile pentru identificarea CDR-urilor în secvenţele de aminoacizi HCVR şi LCVR sunt bine cunoscute în domeniu şi pot fi utilizate pentru a identifica CDR-urile în secvenţele de aminoacizi HCVR şi/sau LCVR specificate descrise aici. Printre convenţiile exemplificative care pot fi utilizate pentru a identifica limitele CDR-urilor se numără, de exemplu, definiţia Kabat, definiţia Chothia şi definiţia AbM. În termeni generali, definiţia Kabat se bazează pe variabilitatea secvenţei, definiţia Chothia se bazează pe locaţia regiunilor buclei structurale, iar definiţia AbM este un compromis între abordările Kabat şi Chothia. Vezi, de exemplu, Kabat, „Secvenţe de proteine de interes imunologic», Institutele Naţionale de Sănătate, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani şi colab., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); şi Martin şi colab., Proc. Naţional. Acad. Ştiinţă. SUA 86:9268-9272 (1989). Sunt disponibile şi baze de date publice pentru identificarea secvenţelor CDR dintr-un anticorp.

[0098] Prezenta dezvăluire include anticorpi anti-virusul Ebola având o compoziţie modificată modelul de glicozilare. În unele variante de realizare, poate fi utilă modificarea pentru a elimina situsurile de glicozilare nedorite sau un anticorp căruia îi lipseşte o grupare de fucoză prezentă pe lanţul de oligozaharide, de exemplu, pentru a creşte funcţia de citotoxicitate celulară dependentă de anticorpi (ADCC) (vezi Shield şi colab. (2002) JBC 277:267-33). În alte aplicaţii, se poate face modificarea galactozilării pentru a modifica citotoxicitatea dependentă de complement (CDC).

[0099] Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care concurează pentru legarea specifică la virusul Ebola cu un anticorp sau un fragment al acestuia care leagă antigenul şi care cuprinde CDR-urile unui HCVR şi CDR-urile unui LCVR, în care HCVR şi LCVR au fiecare o secvenţă de aminoacizi selectată dintre secvenţele HCVR şi LCVR enumerate în Tabelul 1.

[0100] Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care concurează încrucişat pentru legarea la virusul Ebola cu un anticorp de referinţă sau un fragment al acestuia care leagă antigenul, cuprinzând CDR-urile unui HCVR şi CDR-urile unui LCVR, în care HCVR şi LCVR au fiecare o secvenţă de aminoacizi selectată dintre secvenţele HCVR şi LCVR enumerate în Tabelul 1.

[0101] Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, anticorpi izolaţi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care blochează ataşarea virusului Ebola la şi/sau intrarea într-o celulă gazdă.

[0102] În anumite aspecte, anticorpii sau fragmentele de legare a antigenului conform prezentei invenţii sunt bispecifici, cuprinzând o primă specificitate de legare la un prim epitop din virusul Ebola şi o a doua specificitate de legare la un al doilea epitop din virusul Ebola, în care primul şi al doilea epitop sunt distincte şi nu se suprapun. În anumite variante de realizare, bispecificul poate cuprinde un prim braţ care se leagă de un epitop din glicoproteina virală şi un al doilea braţ care se leagă de un epitop dintr-un antigen viral diferit.

[0103] Într-un al doilea aspect, prezenta invenţie oferă molecule de acid nucleic care codifică anticorpi anti-virusul Ebola sau porţiuni ale acestora. De exemplu, prezenta invenţie oferă molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic HCVR enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0104] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCVR enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic LCVR enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0105] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR1 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic HCDR1 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%.

[0106] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR2 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic HCDR2 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0107] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR3 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic HCDR3 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0108] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR1 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic LCDR1 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0109] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR2 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic LCDR2 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0110] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCDR3 enumerate în Tabelul 1; în anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic LCDR3 enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta.

[0111] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică un HCVR, în care HCVR cuprinde un set de trei CDR-uri (adică HCDR1-HCDR2-HCDR3), în care setul de secvenţe de aminoacizi HCDR1-HCDR2-HCDR3 este aşa cum este definit de oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1.

[0112] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică un LCVR, în care LCVR cuprinde un set de trei CDR-uri (adică LCDR1-LCDR2-LCDR3), în care setul de secvenţe de aminoacizi LCDR1-LCDR2-LCDR3 este aşa cum este definit de oricare dintre anticorpii GP anti-virus Ebola exemplificaţi enumeraţi în Tabelul 1.

[0113] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică atât un HCVR, cât şi un LCVR, în care HCVR cuprinde o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi HCVR enumerate în Tabelul 1 şi în care LCVR cuprinde o secvenţă de aminoacizi a oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi LCVR enumerate în Tabelul 1. În anumite variante de realizare, molecula de acid nucleic cuprinde o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic HCVR enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% cu aceasta şi o secvenţă polinucleotidică selectată dintre oricare dintre secvenţele de acid nucleic LCVR enumerate în Tabelul 2 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99%. În anumite variante de realizare conform acestui aspect al invenţiei, molecula de acid nucleic codifică un HCVR şi un LCVR, în care HCVR şi LCVR sunt ambele derivate din acelaşi anticorp GP anti-virus Ebola enumerat în Tabelul 1.

[0114] De asemenea, sunt dezvăluite aici molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi ale lanţului greu enumerate în Tabelul 1. Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele de aminoacizi ale lanţului uşor enumerate în Tabelul 1.

[0115] Într-un aspect conex, prezenta invenţie oferă vectori de expresie recombinanţi capabili să exprime o polipeptidă care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu sau uşor a unui anticorp GP anti-virusul Ebola. De exemplu, prezenta invenţie include vectori de expresie recombinanţi care cuprind oricare dintre moleculele de acid nucleic menţionate mai sus, adică molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele HCVR, LCVR şi/sau CDR, aşa cum sunt prezentate în Tabelul 1. De asemenea, în domeniul de aplicare al prezentei invenţii sunt incluse celulele gazdă în care au fost introduşi astfel de vectori, precum şi metode de producere a anticorpilor sau a porţiunilor acestora prin cultivarea celulelor gazdă în condiţii care permit producerea anticorpilor sau fragmentelor de anticorpi şi recuperarea anticorpilor şi fragmentelor de anticorpi astfel produse.

[0116] Într-un al treilea aspect, invenţia oferă o compoziţie farmaceutică care cuprinde unul sau mai mulţi anticorpi monoclonali izolaţi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. Unul sau mai mulţi anticorpi izolaţi cuprind o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR selectată din grupul format din secvenţele HCVR şi LCVR enumerate în Tabelul 1. Într-un aspect al dezvăluirii, perechea de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 şi 306/282. Într-un aspect, perechea de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0117] Într-un aspect conex, dezvăluirea prezintă o compoziţie care este o combinaţie de cel puţin doi anticorpi conform invenţiei şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0118] Invenţia prezintă o compoziţie, care este o combinaţie/cocktail de cel puţin trei anticorpi ai invenţiei şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0119] Într-un aspect al dezvăluirii este furnizată o compoziţie farmaceutică cuprinde (a) un prim anticorp anti-virusul Ebola, care cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR aşa cum este descrisă în Tabelul 1, sau un fragment de legare a antigenului acesteia; (b) un al doilea anticorp anti-virusul Ebola, care cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR aşa cum este descrisă în Tabelul 1, sau un fragment de legare a antigenului acesteia; şi (c) un al treilea anticorp anti-virusul Ebola, care cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR aşa cum este descrisă în Tabelul 1, sau un fragment de legare a antigenului acesteia, în care primul anticorp se leagă de sau interacţionează cu un prim epitop de pe GP-ul virusului Ebola, iar al doilea şi/sau al treilea anticorp se leagă de sau interacţionează cu un epitop diferit de pe GP-ul virusului Ebola şi (d) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0120] Într-un alt aspect conex, invenţia prezintă o compoziţie, care este o combinaţie între un anticorp GP anti-virusul Ebola şi un al doilea agent terapeutic.

[0121] Într-un aspect, al doilea agent terapeutic este orice agent care este combinat în mod avantajos cu un anticorp GP anti-virusul Ebola. Printre agenţii exemplificativi care pot fi combinaţi în mod avantajos cu un anticorp anti-virusul Ebola se numără, fără limitare, alţi agenţi care se leagă şi/sau inhibă activitatea virusului Ebola (inclusiv alţi anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul etc.) şi/sau agenţi care nu se leagă direct de virusul Ebola, dar care totuşi inhibă activitatea virală, inclusiv infecţiozitatea celulelor gazdă.

[0122] Este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virusul Ebola care cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum este descrisă în Tabelul 1, sau un fragment de legare a antigenului acesteia; (b) un al doilea anticorp anti-virusul Ebola care cuprinde o pereche de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum este descrisă în Tabelul 1, sau un fragment de legare a antigenului acesteia, în care primul anticorp se leagă de un prim epitop de pe GP-ul virusului Ebola, iar al doilea anticorp se leagă de un al doilea epitop de pe GP-ul virusului Ebola, în care primul şi al doilea epitop sunt distincte şi nu se suprapun; şi (c) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0123] De asemenea, este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virusul Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea anticorp anti-virusul Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia, în care primul anticorp nu intră în competiţie încrucişată cu al doilea anticorp pentru legarea la virusul Ebola; şi (c) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0124] De asemenea, este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia, care interacţionează cu un antigen diferit al virusului Ebola, în care primul anticorp se leagă de un epitop de pe GP-ul virusului Ebola, iar al doilea anticorp se leagă de un epitop de pe un antigen diferit al virusului Ebola; şi (c) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0125] De asemenea, este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (c) un al treilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia, în care primul anticorp se leagă de un prim epitop de pe GP-ul virusului Ebola, iar al doilea şi/sau al treilea anticorp se leagă de un epitop diferit de pe GP-ul virusului Ebola, în care primul, al doilea şi al treilea epitopi sunt distincţi şi nu se suprapun; şi (d) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0126] De asemenea, este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (c) un al treilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia, în care primul anticorp poate sau nu să concureze încrucişat cu al doilea şi/sau al treilea anticorp pentru legarea la virusul Ebola; şi (d) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0127] De asemenea, este dezvăluită aici o compoziţie farmaceutică care cuprinde: (a) un prim anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia; (b) un al doilea şi/sau al treilea anticorp anti-virus Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia, care interacţionează cu un antigen diferit al virusului Ebola, în care primul anticorp se leagă de un epitop de pe virusul Ebola, iar al doilea şi/sau al treilea anticorp se leagă de un epitop de pe un antigen diferit al virusului Ebola; şi (c) un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.

[0128] Într-un aspect al dezvăluirii, compoziţia farmaceutică cuprinde un prim anticorp anti-virusul Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia care se leagă de sau interacţionează cu un epitop de pe o tulpină de virus Ebola şi al doilea şi/sau al treilea anticorp anti-virusul Ebola sau un fragment de legare a antigenului acestuia care se leagă de sau interacţionează cu un al doilea şi/sau un al treilea epitop de pe aceeaşi tulpină sau de pe o tulpină diferită de virus Ebola. Tulpinile virusului Ebola care interacţionează cu un anticorp conform invenţiei pot fi selectate din grupul format din Zaire.2014, Zair.1995, tulpini Sudan, Bundibugyo şi Cote d'Ivoire sau variante ale acestora.

[0129] Într-un aspect conex, invenţia oferă o compoziţie farmaceutică care cuprinde un prim anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen şi care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola, în care primul anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCDR1 cu SEQ ID NO: 20; o secvenţă de aminoacizi HCDR2 cu SEQ ID NO: 22; o secvenţă de aminoacizi HCDR3 cu SEQ ID NO: 24; o secvenţă de aminoacizi LCDR1 cu SEQ ID NO: 28; o secvenţă de aminoacizi LCDR2 cu SEQ ID NO: 30 şi o secvenţă de aminoacizi LCDR3 cu SEQ ID NO: 32 şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. Compoziţia farmaceutică poate cuprinde în plus un al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen şi care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola, în care al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCDR1 cu SEQ ID NO: 68; o secvenţă de aminoacizi HCDR2 cu SEQ ID NO: 70; o secvenţă de aminoacizi HCDR3 cu SEQ ID NO: 72; o secvenţă de aminoacizi LCDR1 cu SEQ ID NO: 76; o secvenţă de aminoacizi LCDR2 cu SEQ ID NO: 78 şi o secvenţă de aminoacizi LCDR3 cu SEQ ID NO: 80. Compoziţia farmaceutică poate cuprinde în plus un al treilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen şi care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola, în care al treilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCDR1 cu SEQ ID NO: 148; o secvenţă de aminoacizi HCDR2 cu SEQ ID NO: 150; o secvenţă de aminoacizi HCDR3 cu SEQ ID NO: 152; o secvenţă de aminoacizi LCDR1 cu SEQ ID NO: 156; o secvenţă de aminoacizi LCDR2 cu SEQ ID NO: 158 şi o secvenţă de aminoacizi LCDR3 cu SEQ ID NO: 160.

[0130] În anumite aspecte, fiecare anticorp poate fi formulat ca o formulare separată şi, dacă se stabileşte că este nevoie de mai mult de un anticorp pentru a obţine eficacitate terapeutică maximă, fiecare dintre formulările de anticorpi poate fi administrată concomitent (concurent sau secvenţial), după cum este necesar. Alternativ, amestecul de anticorpi poate fi co-formulat.

[0131] În anumite aspecte, atunci când doi sau mai mulţi anticorpi sunt combinaţi într-o compoziţie farmaceutică, aceştia se pot lega sau nu de aceiaşi epitopi sau de epitopi care se suprapun pe proteina virusului Ebola. Terapii combinate suplimentare şi co-formulări care implică anticorpii anti-virusul Ebola din prezenta invenţie sunt descrise în altă parte a acestui document.

[0132] Dezvăluirea oferă, de asemenea, metode terapeutice pentru tratarea unei boli sau tulburări asociate cu virusul Ebola (cum ar fi infecţia virală la un subiect) sau a cel puţin unui simptom asociat cu infecţia virală sau a frecvenţei sau severităţii a cel puţin unui simptom asociat cu infecţia cu EBOV, utilizând un anticorp GP anti-virus Ebola sau o porţiune de legare a antigenului dintr-un anticorp al invenţiei sau un cocktail de cel puţin doi sau mai mulţi anticorpi ai invenţiei, în care metodele terapeutice cuprind administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de cel puţin doi sau mai mulţi anticorpi sau fragmente de legare a antigenului ale invenţiei către subiectul care are nevoie de acestea. Într-o formă de realizare, metodele includ administrarea unei combinaţii (cocktail) de cel puţin trei anticorpi conform invenţiei. Într-o formă de realizare, amestecul de anticorpi cuprinde trei anticorpi anti-EBOV având perechile de secvenţe de aminoacizi aşa cum sunt prezentate în SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154. Tulburarea tratată este orice boală sau afecţiune care este îmbunătăţită, ameliorată, inhibată sau prevenită prin inhibarea activităţii virusului Ebola. Dezvăluirea oferă metode pentru prevenirea, tratarea sau ameliorarea a cel puţin unui simptom al infecţiei cu virusul Ebola, metoda cuprinzând administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din cel puţin unul sau mai mulţi anticorpi GP anti-virus Ebola sau fragmente ale acestora care leagă antigenul conform invenţiei, unui subiect care are nevoie de aceştia.

[0133] Într-un aspect conex, invenţia oferă o metodă de neutralizare a EBOV infecţios, metoda cuprinzând expunerea unei celule infectate cu EBOV la o compoziţie care cuprinde unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, în care expunerea are ca rezultat o protecţie sporită a celulei împotriva infecţiei virale sau împotriva morţii celulare. Expunerea poate fi in vitro sau in vivo. Metodele includ administrarea unuia sau mai multor anticorpi conform invenţiei. Metodele includ administrarea unei combinaţii (cocktail) de cel puţin trei anticorpi conform invenţiei. Amestecul de anticorpi cuprinde trei anticorpi anti-EBOV având perechile de secvenţe de aminoacizi aşa cum sunt prezentate în SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0134] Sunt dezvăluite aici metode pentru ameliorarea sau reducerea severităţii, duratei sau frecvenţei apariţiei a cel puţin unui simptom al infecţiei cu virusul Ebola la un subiect prin administrarea unuia sau mai multor anticorpi GP anti-virus Ebola conform invenţiei, în care cel puţin un simptom este selectat din grupul constând din febră, cefalee, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile.

[0135] Sunt dezvăluite aici metode pentru scăderea încărcăturii virale la un subiect, metodele cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente dintr-unul sau mai mulţi anticorpi sau fragmente ale acestora conform invenţiei, care se leagă de GP-ul virusului Ebola şi blochează legarea şi/sau intrarea virusului Ebola în celula gazdă.

[0136] Este dezvăluită aici o metodă de creştere a supravieţuirii sau a probabilităţii de supravieţuire a unui subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau a unui subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de dobândire a acestuia, metoda cuprinzând administrarea a cel puţin unui anticorp sau fragment de legare a antigenului conform invenţiei sau a unei compoziţii farmaceutice care cuprinde cel puţin un anticorp conform invenţiei unui subiect care are nevoie de acesta.

[0137] Este dezvăluită aici o metodă de creştere a supravieţuirii sau a probabilităţii de supravieţuire a unui subiect care suferă de infecţie cu EBOV sau a unui subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de dobândire a acestuia, metoda cuprinzând administrarea unui amestec de anticorpi care cuprinde un amestec de cel puţin doi anticorpi anti-EBOV ai invenţiei. Metoda cuprinde administrarea unui amestec de anticorpi care cuprinde un amestec de cel puţin trei anticorpi anti-EBOV conform invenţiei. Amestecul de anticorpi care urmează să fie administrat cuprinde un amestec de cel puţin trei anticorpi anti-EBOV conform invenţiei, în care cel puţin trei anticorpi cuprind perechi de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR, aşa cum sunt prezentate în SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0138] Într-un aspect al dezvăluirii, subiectul care are nevoie de aceasta este un subiect cu risc de expunere la sau de dobândire a unei infecţii cu virusul Ebola, în care subiectul este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător medical, o persoană suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate, un angajat al unui spital, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent.

[0139] Într-un aspect al dezvăluirii, subiectului care are nevoie de aceasta i se poate administra cel puţin un anticorp anti-EBOV conform invenţiei sau un fragment de legare a antigenului acestuia, sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde cel puţin un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia conform invenţiei, în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic. Al doilea agent terapeutic poate fi selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (cum ar fi corticosteroizii şi medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (antisens). oligomeri morfolino fosforodiamidaţi care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni.

[0140] Compoziţia farmaceutică poate fi administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

[0141] Se poate observa o protecţie sporită la un mamifer expus la sau infectat cu EBOV atunci când mamiferul este tratat cu o compoziţie farmaceutică care cuprinde un cocktail de anticorpi, care cuprinde cel puţin trei anticorpi ai invenţiei.

[0142] Protecţia sporită observată poate fi măsurată printr-o scădere a severităţii sau frecvenţei a cel puţin unui simptom asociat cu infecţia cu EBOV, printr-o scădere a încărcăturii virale sau printr-o creştere a supravieţuirii unui mamifer infectat cu EBOV. Cel puţin un simptom poate fi selectat din grupul constând din febră, cefalee, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile.

[0143] Protecţia sporită poate fi observată atunci când anticorpul este utilizat singur sau atunci când este utilizat în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari sau modalităţi de tratament anti-EBOV.

[0144] Unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari pot fi selectaţi din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (cum ar fi corticosteroizii şi medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva virusului Ebola, un vaccin pentru virusul Ebola, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni.

[0145] Unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari cuprind unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV.

[0146] Unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV cuprind o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) selectată din grupul constând din oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR şi LCVR din Tabelul 1.

[0147] Unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV cuprind o pereche de secvenţe de aminoacizi cu regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) selectate din grupul format din SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 şi 306/282.

[0148] Unul sau mai mulţi anticorpi anti-EBOV cuprind o pereche de secvenţe de aminoacizi cu regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) selectate din grupul format din SEQ ID NO: 18/26, 66/74 şi 146/154.

[0149] Unul sau mai mulţi anticorpi sau fragmente de legare a antigenului acestora pot fi administraţi profilactic sau terapeutic unui subiect care are, sau prezintă riscul de a avea, sau este predispus la dezvoltarea unei infecţii cu virusul Ebola. Subiecţii expuşi riscului includ, dar nu se limitează la, o persoană imunocompromisă, de exemplu, o persoană imunocompromisă din cauza unei boli autoimune sau persoanele care primesc terapie imunosupresoare (de exemplu, după un transplant de organe), sau persoanele care suferă de sindromul imunodeficienţei umane (HIV) sau sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA), anumite forme de anemie care epuizează sau distrug leucocitele, persoanele care primesc radiaţii sau chimioterapie sau persoanele care suferă de o tulburare inflamatorie. Alte subiecţi cu risc de a contracta o infecţie cu virusul Ebola includ lucrătorii din domeniul sănătăţii sau orice persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate sau este expusă la fluide corporale sau ţesuturi ale unor persoane infectate, având, de asemenea, un risc crescut de a dezvolta o infecţie cu virusul Ebola. Mai mult, un subiect prezintă riscul de a contracta o infecţie cu virusul Ebola din cauza proximităţii faţă de un focar al bolii, de exemplu, un subiect locuieşte într-un oraş dens populat sau în imediata apropiere a unor subiecţi cu infecţii confirmate sau suspectate cu virusul Ebola sau alegerea unui loc de muncă, de exemplu, personal de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii unde a fost tratat un pacient cu Ebola, un angajat al unui spital, un cercetător farmaceutic, o persoană care a vizitat sau care intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola sau un călător frecvent.

[0150] Anticorpul sau fragmentul acestuia care se leagă de antigen conform invenţiei este administrat în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic subiectului care are nevoie de acesta. Al doilea agent terapeutic poate fi selectat din grupul constând dintr-un medicament antiinflamator (cum ar fi corticosteroizii şi medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene), un medicament antiinfecţios, un medicament antiviral, un anticorp diferit împotriva virusului Ebola, un vaccin pentru virusul Ebola, terapia ZMapp, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligomeri morfolino fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola), interferoni, un supliment alimentar, cum ar fi antioxidanţii şi orice alt medicament sau terapie cunoscută în domeniu, utilă pentru ameliorarea a cel puţin unui simptom al infecţiei cu virusul Ebola sau pentru reducerea încărcăturii virale la un pacient. Al doilea agent terapeutic poate fi un agent care ajută la contracararea sau reducerea oricăror efecte secundare posibile asociate cu un anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia conform invenţiei, dacă apar astfel de efecte secundare. Anticorpul sau fragmentul acestuia poate fi administrat subcutanat, intravenos, intradermic, intraperitoneal, oral, intranazal, intramuscular sau intracranian. Anticorpul poate fi administrat ca o singură perfuzie intravenoasă pentru concentraţia maximă a anticorpului în serul subiectului. Anticorpul sau fragmentul acestuia poate fi administrat într-o doză de aproximativ 0,1 mg/kg greutate corporală până la aproximativ 100 mg/kg greutate corporală a subiectului. Un anticorp al prezentei invenţii poate fi administrat într-una sau mai multe doze cuprinzând între 50 mg şi 600 mg.

[0151] Prezenta dezvăluire include, de asemenea, un anticorp anti-virusul Ebola sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen, conform invenţiei, pentru utilizare în tratarea unui subiect care are, este suspectat că are sau a fost expus la EBOV sau pentru utilizare în fabricarea unui medicament pentru tratamentul unei boli sau tulburări care ar beneficia de blocarea legării şi/sau activităţii virusului Ebola.

[0152] Alte exemple de realizare vor deveni evidente din analiza descrierii detaliate care urmează. Orice referinţe din descriere la metode de tratament se referă la compuşii, compoziţiile farmaceutice şi medicamentele prezentei invenţii pentru utilizare într-o metodă de tratament al corpului uman (sau animal) prin terapie.

[0153] SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR

[0154] Figura 1: H1 H17161 P neutralizează puternic EBOV viu.

[0155] Figura 2: Prezintă interacţiunea a trei anticorpi anti-EBOV cu GP-ul Ebola sau GP solubilă în Ebola (sGP).

[0156] DESCRIERE DETALIATĂ

[0157] Înainte de descrierea metodelor prezente, trebuie înţeles că această invenţie nu se limitează la anumite metode şi condiţii experimentale descrise, deoarece aceste metode şi condiţii pot varia. De asemenea, trebuie înţeles că terminologia utilizată aici are scopul de a descrie doar anumite variante de realizare şi nu este destinată a fi limitativă, deoarece domeniul de aplicare al prezentei invenţii va fi limitat doar de revendicările anexate.

[0158] Dacă nu sunt definiţi altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi aici au acelaşi înţeles ca cel înţeles în mod obişnuit de o persoană cu experienţă în domeniul căruia îi aparţine această invenţie. Deşi orice metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate în practica sau testarea prezentei invenţii, în continuare sunt descrise metode şi materiale preferate.

[0159] Definiţii

[0160] „Virusul Ebola» sau „EBOV» este un gen din familia Filoviridae, despre care se ştie că provoacă febră hemoragică severă şi cu progresie rapidă. Există multe specii şi tulpini diferite de virus Ebola, bazate pe secvenţa nucleotidelor şi locaţia focarului, de exemplu, Zair, Pădurea Tai (cunoscută anterior sub numele de Coasta de Fildeş), Sudan, Reston şi Bundibugyo. Cele mai letale forme ale virusului sunt tulpinile din Zair şi Sudan. Tulpina Reston este singura tulpină cunoscută care infectează doar primatele neumane. Termenul „virus Ebola» include şi variante ale virusului Ebola izolate din diferite izolate ale virusului Ebola.

[0161] Secvenţa de aminoacizi a glicoproteinei virusului Ebola de lungime completă, notată aici ca „EBOV GP» sau „Ebola virus GP», este exemplificată de secvenţele de aminoacizi găsite în GenBank ca numere de acces AHX24649.1 (vezi şi SEQ ID NO: 314) şi AHX24649.2 (vezi şi SEQ ID NO: 315). Termenul cuprinde, de asemenea, GP-ul virusului Ebola sau un fragment al acestuia cuplat, de exemplu, la o etichetă de histidină (de exemplu, vezi numărul de acces AHX24649.1 cu o etichetă de decahistidină (SEQ ID NO: 318)), Fc de şoarece sau uman sau o secvenţă semnal. Secvenţa de aminoacizi a „GP solubilă» sau „sGP» este prezentată în numărul de acces AHX24650 şi ca SEQ ID NO 316 (cu o secvenţă semnal) şi, de asemenea, SEQ ID NO: 317 (fără secvenţa semnal, dar cu o etichetă myc-myc-hexahistidină). Secvenţa de aminoacizi a „GP1» începe la capătul amino-terminal al GP de lungime completă, la reziduul 1, şi se termină la reziduul 501 al SEQ ID NO: 315. Secvenţa de aminoacizi a „GP2» se întinde de la reziduurile 502 la 676 ale GP de lungime completă prezentată ca SEQ ID NO: 315.

[0162] Termenul „infecţie cu virusul Ebola» sau „infecţie EBOV», aşa cum este utilizat aici, se referă la febra hemoragică severă rezultată din expunerea la virus sau la un animal infectat sau la un pacient uman infectat sau din contactul cu fluidele corporale sau ţesuturile unui animal sau pacient uman infectat cu virusul Ebola. „Simptomele asociate cu o infecţie cu virusul Ebola» includ febră, dureri de cap, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile.

[0163] Termenul „anticorp», aşa cum este utilizat aici, se referă la molecule de imunoglobulină compuse din patru lanţuri polipeptidice, două lanţuri grele (H) şi două lanţuri uşoare (L) interconectate prin legături disulfidice (adică „molecule complete de anticorp»), precum şi la multimerii acestora (de exemplu IgM) sau fragmente ale acestora care leagă antigenul. Fiecare lanţ greu este alcătuit dintr-o regiune variabilă a lanţului greu („HCVR» sau „VH») şi o regiune constantă a lanţului greu (alcătuită din domeniile CH1, CH2 şi CH3). Fiecare lanţ uşor este alcătuit dintr-o regiune variabilă a lanţului uşor („LCVR sau „VL») şi o regiune constantă a lanţului uşor (CL). Regiunile VH şi VL pot fi subdivizate în continuare în regiuni de hipervariabilitate, denumite regiuni de determinare a complementarităţii (CDR), intercalate cu regiuni mai conservate, denumite regiuni cadru (FR). Fiecare VHşi VL este compus din trei CDR-uri şi patru FR, aranjate de la capătul amino-terminal la capătul carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. În anumite variante de realizare ale invenţiei, FR-urile anticorpului (sau fragmentului de legare a antigenului acestuia) pot fi identice cu secvenţele liniei germinale umane sau pot fi modificate natural sau artificial. O secvenţă consens de aminoacizi poate fi definită pe baza unei analize comparative a două sau mai multe CDR-uri.

[0164] Substituţia unuia sau mai multor reziduuri CDR sau omiterea uneia sau mai multor CDR-uri este, de asemenea, posibilă. În literatura ştiinţifică au fost descrişi anticorpi în care se poate renunţa la una sau două CDR-uri pentru legare. Padlan şi alţii. (1995 FASEB J. 9: 133-139) a analizat regiunile de contact dintre anticorpi şi antigenele acestora, pe baza structurilor cristaline publicate, şi a concluzionat că doar aproximativ o cincime până la o treime din reziduurile CDR intră în contact cu antigenul. Padlan a descoperit, de asemenea, mulţi anticorpi în care una sau două CDR-uri nu aveau aminoacizi în contact cu un antigen (vezi şi Vajdos şi colab., 2002 J Mol Biol 320:415-428).

[0165] Reziduurile CDR care nu intră în contact cu antigenul pot fi identificate pe baza studiilor anterioare (de exemplu, reziduurile H60-H65 din CDRH2 nu sunt adesea necesare), din regiuni ale CDR-urilor Kabat situate în afara CDR-urilor Chothia, prin modelare moleculară şi/sau empiric. Dacă o CDR sau un reziduu (sau reziduuri) al acesteia este omis, acesta este de obicei substituit cu un aminoacid care ocupă poziţia corespunzătoare într-o altă secvenţă de anticorpi umani sau într-un consens de astfel de secvenţe. Poziţiile pentru substituţie în cadrul CDR-urilor şi aminoacizii de substituit pot fi, de asemenea, selectaţi empiric. Substituţiile empirice pot fi substituţii conservative sau neconservative.

[0166] Anticorpii monoclonali complet umani anti-virusul Ebola descrişi aici pot cuprinde una sau mai multe substituţii, inserţii şi/sau deleţii de aminoacizi în regiunile cadru şi/sau CDR ale domeniilor variabile ale lanţului greu şi uşor, în comparaţie cu secvenţele germinale corespunzătoare. Astfel de mutaţii pot fi uşor constatate prin compararea secvenţelor de aminoacizi descrise aici cu secvenţele germinale disponibile, de exemplu, din bazele de date publice cu secvenţe de anticorpi. Prezenta invenţie include anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care sunt derivaţi din oricare dintre secvenţele de aminoacizi descrise aici, în care unul sau mai mulţi aminoacizi dintr-una sau mai multe regiuni cadru şi/sau CDR sunt mutaţi la reziduul(ele) corespunzător(e) secvenţei germinale din care a fost derivat anticorpul sau la reziduul(ele) corespunzător(e) unei alte secvenţe germinale umane sau la o substituţie conservatoare de aminoacizi a reziduului(elor) germinale corespunzător(e) (astfel de modificări de secvenţă sunt denumite aici în mod colectiv „mutaţii germinale»). O persoană cu competenţe obişnuite în domeniu, pornind de la secvenţele regiunilor variabile ale lanţurilor grele şi uşoare descrise aici, poate produce cu uşurinţă numeroşi anticorpi şi fragmente de legare a antigenului care cuprind una sau mai multe mutaţii germinale individuale sau combinaţii ale acestora. În anumite aspecte, toate reziduurile cadru şi/sau CDR din domeniile VH şi/sau VL sunt mutate înapoi la reziduurile găsite în secvenţa germinală originală din care a fost derivat anticorpul. În alte aspecte, doar anumite reziduuri sunt mutate înapoi la secvenţa germinală originală, de exemplu, doar reziduurile mutate găsite în primii 8 aminoacizi ai FR1 sau în ultimii 8 aminoacizi ai FR4 sau doar reziduurile mutate găsite în CDR1, CDR2 sau CDR3. În alte aspecte, unul sau mai multe dintre reziduurile cadru şi/sau CDR sunt mutate în reziduul/reziduurile corespunzător(e) unei secvenţe germinale diferite (adică, o secvenţă germinală care este diferită de secvenţa germinală din care a fost derivat iniţial anticorpul). În plus, anticorpii prezentei invenţii pot conţine orice combinaţie de două sau mai multe mutaţii germinale în cadrul regiunilor cadru şi/sau CDR, de exemplu, în care anumite reziduuri individuale sunt mutate la reziduul corespunzător al unei anumite secvenţe germinale, în timp ce anumite alte reziduuri care diferă de secvenţa germinală originală sunt menţinute sau sunt mutate la reziduul corespunzător al unei secvenţe germinale diferite. Odată obţinuţi, anticorpii şi fragmentele de legare a antigenului care conţin una sau mai multe mutaţii germinale pot fi uşor testate pentru una sau mai multe proprietăţi dorite, cum ar fi specificitate de legare îmbunătăţită, afinitate de legare crescută, proprietăţi biologice antagoniste sau agoniste îmbunătăţite sau amplificate (după caz), imunogenitate redusă etc. Anticorpii şi fragmentele de legare a antigenului obţinute în acest mod general sunt cuprinse în prezenta dezvăluire.

[0167] Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi monoclonali complet umani anti-virusul Ebola, care cuprind variante ale oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici, având una sau mai multe substituţii conservative. De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi anti-virusul Ebola având secvenţe de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR cu, de exemplu, 10 sau mai puţine, 8 sau mai puţine, 6 sau mai puţine, 4 sau mai puţine, etc., substituţii conservative de aminoacizi în raport cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici.

[0168] Termenul „anticorp uman», aşa cum este utilizat aici, este destinat să includă anticorpi având regiuni variabile şi constante derivate din secvenţe de imunoglobuline germinale umane. Anticorpii monoclonali umani conform invenţiei pot include reziduuri de aminoacizi necodificate de secvenţele de imunoglobuline germinale umane (de exemplu, mutaţii introduse prin mutageneză aleatorie sau specifică locului in vitro sau prin mutaţie somatică in vivo), de exemplu în CDR-uri şi în special în CDR3. Totuşi, termenul „anticorp uman», aşa cum este utilizat aici, nu are scopul de a include anticorpi monoclonali (mAb) în care secvenţe CDR derivate din linia germinală a unei alte specii de mamifere (de exemplu, şoarece) au fost grefate pe secvenţe FR umane. Termenul include anticorpi produşi recombinant într-un mamifer non-uman sau în celulele unui mamifer non-uman. Termenul nu este destinat să includă anticorpii izolaţi sau generaţi la un subiect uman.

[0169] Termenul „recombinant», aşa cum este utilizat aici, se referă la anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, conform invenţiei, creaţi, exprimaţi, izolaţi sau obţinuţi prin tehnologii sau metode cunoscute în domeniu sub numele de tehnologie ADN recombinant, care includ, de exemplu, splicing-ul ADN şi exprimarea transgenică. Termenul se referă la anticorpi exprimaţi într-un sistem de expresie al unui mamifer non-uman (inclusiv mamifere transgenice non-umane, de exemplu, şoareci transgenici) sau într-un sistem de expresie celulară (de exemplu, celule CHO) sau izolaţi dintr-o bibliotecă de anticorpi umani combinatori recombinanţi.

[0170] Termenul „se leagă specific» sau „se leagă specific de» sau altele asemenea înseamnă că un anticorp sau un fragment al acestuia care leagă antigenul formează un complex cu un antigen care este relativ stabil în condiţii fiziologice. Legarea specifică poate fi caracterizată printr-o constantă de disociere la echilibru de cel puţin aproximativ 1x10-7 M sau mai puţin (de exemplu, un KD mai mic indică o legare mai strânsă). Metodele pentru determinarea legării specifice a două molecule sunt bine cunoscute în domeniu şi includ, de exemplu, dializa de echilibru, rezonanţa plasmonică de suprafaţă şi altele asemenea. Aşa cum este descris aici, anticorpii au fost identificaţi prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, BIACORE™, care se leagă specific de virusul Ebola. Mai mult, anticorpii multispecifici care se leagă de un domeniu din virusul Ebola şi de unul sau mai mulţi antigeni suplimentari sau de un antigen bispecific care se leagă de două regiuni diferite ale virusului Ebola sunt totuşi consideraţi anticorpi care „se leagă în mod specific», aşa cum se utilizează aici.

[0171] Termenul anticorp cu „afinitate ridicată» se referă la acei anticorpi monoclonali (mAb) care au o afinitate de legare la virusul Ebola, exprimată ca KD, de cel puţin 10-7 M; de preferinţă 10-8 M; mai preferabil 10-9 M, chiar mai preferabil 10-10 M, chiar mai preferabil 10-11 M, chiar mai preferabil 10-12 M, măsurată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, BIACORE™ sau ELISA cu afinitate în soluţie.

[0172] Prin termenul „viteză de încetinire», „Koff» sau „kd» se înţelege un anticorp care se disociază de virusul Ebola sau o particulă asemănătoare virusului care exprimă GP-ul virusului Ebola, cu o constantă de viteză de 1 x 10-3 s-1 sau mai puţin, de preferinţă 1 x 10-4 s-1 sau mai puţin, determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, BIACORE™.

[0173] Termenii „porţiune de legare a antigenului» a unui anticorp, „fragment de legare a antigenului» al unui anticorp şi alţii similari, aşa cum sunt utilizaţi aici, includ orice polipeptidă sau glicoproteină naturală, obţinută enzimatic, sintetică sau modificată genetic, care se leagă în mod specific de un antigen pentru a forma un complex. Termenii „fragment de legare a antigenului» al unui anticorp sau „fragment de anticorp», aşa cum sunt utilizaţi aici, se referă la unul sau mai multe fragmente ale unui anticorp care îşi păstrează capacitatea de a se lega de virusul Ebola.

[0174] În variante specifice de realizare, anticorpii sau fragmentele de anticorpi ale invenţiei pot fi conjugaţi cu o grupare, cum ar fi un ligand sau o grupare terapeutică („imunoconjugat»), cum ar fi un medicament antiviral, un al doilea anticorp anti-virusul Ebola sau orice altă grupare terapeutică utilă pentru tratarea unei infecţii cauzate de virusul Ebola.

[0175] Un „anticorp izolat», aşa cum este utilizat aici, este destinat să se refere la un anticorp care este substanţial lipsit de alţi anticorpi (Abs) având specificităţi antigenice diferite (de exemplu, un anticorp izolat care se leagă specific de virusul Ebola sau de un fragment al acestuia, este substanţial lipsit de Abs care se leagă specific de antigeni alţii decât virusul Ebola).

[0176] Un „anticorp blocant» sau un „anticorp neutralizant», aşa cum este utilizat aici (sau un „anticorp care neutralizează activitatea virusului Ebola» sau „anticorp antagonist»), se referă la un anticorp a cărui legare la virusul Ebola are ca rezultat inhibarea a cel puţin unei activităţi biologice a virusului Ebola. De exemplu, un anticorp conform invenţiei poate preveni sau bloca ataşarea virusului Ebola la o celulă gazdă sau intrarea într-o celulă gazdă. În plus, un „anticorp neutralizant» este unul care poate neutraliza, adică poate preveni, inhiba, reduce, împiedica sau interfera cu capacitatea unui agent patogen de a iniţia şi/sau perpetua o infecţie la o gazdă. Termenii „anticorp neutralizant» şi „un anticorp care neutralizează» sau „anticorpi care neutralizează» sunt utilizaţi aici interschimbabil. Aceşti anticorpi pot fi utilizaţi, singuri sau în combinaţie, ca agenţi profilactici sau terapeutici cu alţi agenţi antivirali, la o formulare adecvată, sau în asociere cu vaccinarea activă, ori ca instrument de diagnostic.

[0177] „Citotoxicitatea mediată celular dependentă de anticorpi» sau „ADCC» este un mecanism de apărare imună mediată celular prin care o celulă efectoare a sistemului imunitar lizează activ o celulă ţintă, ale cărei antigene de la suprafaţa membranei au fost legate de anticorpi specifici, cum ar fi cei descrişi aici. Ca atare, este un mecanism prin care, de exemplu, un anticorp specific virusului poate acţiona pentru a limita răspândirea infecţiei. ADCC clasic este mediat de celulele natural killer (celule NK), macrofage, neutrofile şi, în anumite cazuri, eozinofile.

[0178] Termenul „rezonanţă plasmonică de suprafaţă», aşa cum este utilizat aici, se referă la un fenomen optic care permite analiza interacţiunilor biomoleculare în timp real prin detectarea modificărilor concentraţiilor de proteine dintr-o matrice de biosenzori, de exemplu utilizând sistemul BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suedia şi Piscataway, N.J.).

[0179] Termenul „KD», aşa cum este utilizat aici, este destinat să se refere la constanta de disociere de echilibru a unei anumite interacţiuni anticorp-antigen.

[0180] Termenul „epitop» se referă la un determinant antigenic care interacţionează cu un situs specific de legare a antigenului în regiunea variabilă a unei molecule de anticorp cunoscută sub numele de paratop. Un singur antigen poate avea mai mult de un epitop. Astfel, diferiţi anticorpi se pot lega de zone diferite ale unui antigen şi pot avea efecte biologice diferite. Termenul „epitop» se referă şi la un situs de pe un antigen la care răspund celulele B şi/sau T. De asemenea, se referă la o regiune a unui antigen care este legată de un anticorp. Epitopii pot fi definiţi ca structurali sau funcţionali. Epitopii funcţionali sunt în general un subset al epitopilor structurali şi au acele reziduuri care contribuie direct la afinitatea interacţiunii. Epitopii pot fi, de asemenea, conformaţionali, adică compuşi din aminoacizi neliniari. În anumite aspecte, epitopii pot include determinanţi care sunt grupări de suprafaţă chimic active ale moleculelor, cum ar fi aminoacizi, lanţuri laterale de zahăr, grupări fosforil sau grupări sulfonil şi, în anumite variante de realizare, pot avea caracteristici structurale tridimensionale specifice şi/sau caracteristici de sarcină specifice.

[0181] Termenul „competiţie încrucişată», aşa cum este utilizat aici, înseamnă că un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen se leagă de un antigen şi inhibă sau blochează legarea unui alt anticorp sau fragment al acestuia care se leagă de antigen. Termenul include, de asemenea, competiţia dintre doi anticorpi în ambele orientări, adică un prim anticorp care leagă şi blochează legarea celui de-al doilea anticorp şi invers. În anumite variante de realizare, primul anticorp şi al doilea anticorp se pot lega de acelaşi epitop. Alternativ, primul şi al doilea anticorp se pot lega de epitopi diferiţi, dar care se suprapun, astfel încât legarea unuia inhibă sau blochează legarea celui de-al doilea anticorp, de exemplu, prin intermediul unui impediment steric. Competiţia încrucişată dintre anticorpi poate fi măsurată prin metode cunoscute în domeniu, de exemplu, printr-un test de interferometrie cu biostrat, fără marcaj, în timp real. Pentru a determina dacă un anticorp testat intră în competiţie încrucişată cu un anticorp GP de referinţă anti-virusul Ebola conform invenţiei, anticorpul de referinţă este lăsat să se lege de o GP sau o peptidă a virusului Ebola în condiţii de saturare. Apoi, se evaluează capacitatea unui anticorp testat de a se lega de GP-ul virusului Ebola. Dacă anticorpul testat este capabil să se lege de GP-ul virusului Ebola după legarea prin saturaţie cu anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola, se poate concluziona că anticorpul testat se leagă de un epitop diferit de anticorpul de referinţă anti-virus Ebola. Pe de altă parte, dacă anticorpul testat nu este capabil să se lege de GP-ul virusului Ebola după legarea prin saturaţie cu anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola, atunci anticorpul testat se poate lega de acelaşi epitop ca şi epitopul legat de anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola al invenţiei.

[0182] Termenul „identitate substanţială» sau „substanţial identic», atunci când se referă la un acid nucleic sau un fragment al acestuia, indică faptul că, atunci când este aliniat optim cu inserţii sau deleţii nucleotidice adecvate cu un alt acid nucleic (sau catena sa complementară), există identitate a secvenţei nucleotidice în cel puţin aproximativ 90% şi, mai preferabil, cel puţin aproximativ 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% din bazele nucleotidice, măsurată prin orice algoritm bine cunoscut de identificare a secvenţei, cum ar fi FASTA, BLAST sau GAP, aşa cum se discută mai jos. O moleculă de acid nucleic având o identitate substanţială cu o moleculă de acid nucleic de referinţă poate, în anumite cazuri, să codifice o polipeptidă având aceeaşi secvenţă de aminoacizi sau o secvenţă substanţial similară cu cea a polipeptidei codificate de molecula de acid nucleic de referinţă.

[0183] Aşa cum este aplicat polipeptidelor, termenul „similaritate substanţială» sau „substanţial similar» înseamnă că două secvenţe de peptide, atunci când sunt aliniate optim, cum ar fi prin programele GAP sau BESTFIT folosind ponderi implicite ale gap-urilor, au în comun o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, chiar mai preferabil o identitate de secvenţă de cel puţin 95%, 98% sau 99%. De preferinţă, poziţiile reziduurilor, care nu sunt identice, diferă prin substituţii conservative de aminoacizi. O „substituţie conservativă de aminoacizi» este una în care un reziduu de aminoacid este substituit cu un alt reziduu de aminoacid având o catenă laterală (grupare R) cu proprietăţi chimice similare (de exemplu, sarcină sau hidrofobicitate). În general, o substituţie conservatoare a aminoacizilor nu va schimba substanţial proprietăţile funcţionale ale unei proteine. În cazurile în care două sau mai multe secvenţe de aminoacizi diferă una de cealaltă prin substituţii conservative, procentul sau gradul de similaritate poate fi ajustat în sus pentru a corecta natura conservativă a substituţiei. Mijloacele pentru realizarea acestei ajustări sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. (Vezi, de exemplu, Pearson (1994) Methods Mol.) Biol. 24: SOT-SSI). Exemple de grupuri de aminoacizi care au lanţuri laterale cu proprietăţi chimice similare includ 1) lanţuri laterale alifatice: glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină; 2) lanţuri laterale alifatice-hidroxil: serină şi treonină; 3) lanţuri laterale care conţin amidă: asparagină şi glutamină; 4) lanţuri laterale aromatice: fenilalanină, tirozină şi triptofan; 5) lanţuri laterale bazice: lizină, arginină şi histidină; 6) lanţuri laterale acide: aspartat şi glutamat şi 7) lanţuri laterale care conţin sulf: cisteină şi metionină. Grupările de substituţie conservative preferate pentru aminoacizi sunt: valină-leucină-izoleucină, fenilalanină-tirozină, lizină-arginină, alanină-valină, glutamat-aspartat şi asparagină-glutamină. Alternativ, o înlocuire conservatoare este orice modificare având o valoare pozitivă în matricea log-verosimilităţii PAM250 descrisă în Gonnet şi colab. ( 1992) Ştiinţă 256: 1443 45. O înlocuire „moderat conservatoare» este orice modificare având o valoare nenegativă în matricea log-verosimilitudei PAM250.

[0184] Similitudinea secvenţelor pentru polipeptide este de obicei măsurată folosind software de analiză a secvenţelor. Software-ul de analiză a proteinelor potriveşte secvenţe similare folosind măsuri de similaritate atribuite diferitelor substituţii, deleţii şi altor modificări, inclusiv substituţii conservative de aminoacizi. De exemplu, software-ul GCG conţine programe precum GAP şi BESTFIT, care pot fi utilizate cu parametri impliciţi pentru a determina omologia secvenţei sau identitatea secvenţei între polipeptide strâns înrudite, cum ar fi polipeptidele omoloage de la diferite specii de organisme sau între o proteină de tip sălbatic şi o muteină a acesteia. Vezi, de exemplu, GCG versiunea 6.1. Secvenţele polipeptidice pot fi comparate şi folosind FASTA cu parametri impliciti sau recomandaţi; un program în GCG versiunea 6.1. FASTA (de exemplu, FASTA2 şi FASTA3) oferă alinieri şi identitate procentuală a secvenţei regiunilor cu cea mai bună suprapunere între secvenţele de interogare şi cele de căutare (Pearson (2000) supra). Un alt algoritm preferat atunci când se compară o secvenţă a invenţiei cu o bază de date care conţine un număr mare de secvenţe de la diferite organisme este programul de calculator BLAST, în special BLASTP sau TBLASTN, utilizând parametrii impliciţi. Vezi, de exemplu, Altschul şi colab. ( 1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 şi (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

[0185] Prin sintagma „cantitate eficientă terapeutic» se înţelege o cantitate care produce efectul dorit pentru care este administrată. Cantitatea exactă va depinde de scopul tratamentului şi va putea fi determinată de către o persoană de specialitate în domeniu folosind tehnici cunoscute (a se vedea, de exemplu, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[0186] Aşa cum este utilizat aici, termenul „subiect» se referă la un animal, de preferinţă un mamifer, mai preferabil un om, care are nevoie de ameliorarea, prevenirea şi/sau tratamentul unei boli sau tulburări, cum ar fi o infecţie virală. Subiectul poate avea o infecţie cu virusul Ebola sau este predispus la dezvoltarea unei infecţii cu virusul Ebola. Subiecţii „predispuşi la dezvoltarea unei infecţii cu virusul Ebola» sau subiecţii „care pot prezenta un risc crescut de a contracta o infecţie cu virusul Ebola» sunt acei subiecţi cu sistem imunitar compromis din cauza bolilor autoimune, persoanele care primesc terapie imunosupresoare (de exemplu, după un transplant de organe), persoanele care suferă de sindromul imunodeficienţei umane (HIV) sau sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA), anumite forme de anemie care epuizează sau distrug leucocitele, persoanele care primesc radiaţii sau chimioterapie sau persoanele care suferă de o tulburare inflamatorie. În plus, subiecţii de vârstă fragedă sau înaintată prezintă un risc crescut. Orice persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică de un animal infectat sau de un pacient uman sau este expusă la fluide corporale sau ţesuturi de la un animal sau pacient uman infectat prezintă un risc crescut de a dezvolta o infecţie cu virusul Ebola. Mai mult, un subiect prezintă riscul de a contracta o infecţie cu virusul Ebola din cauza proximităţii faţă de un focar al bolii, de exemplu, subiectul locuieşte într-un oraş dens populat sau în imediata apropiere a subiecţilor cu infecţii confirmate sau suspectate cu virusul Ebola sau a alegerii unui loc de muncă, de exemplu, lucrător într-un spital, cercetător farmaceutic, o persoană care a vizitat sau care intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie sau se suspectează că are un focar de virus Ebola sau un călător frecvent.

[0187] Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii „tratare», „tratare» sau „tratament» se referă la reducerea sau ameliorarea severităţii a cel puţin unui simptom sau indicaţie a infecţiei cu virusul Ebola datorită administrării unui agent terapeutic, cum ar fi un anticorp al prezentei invenţii, la un subiect care are nevoie de acesta. Termenii includ inhibarea progresiei bolii sau a agravării infecţiei. Termenii includ, de asemenea, un prognostic pozitiv al bolii, adică subiectul poate fi lipsit de infecţie sau poate avea titruri virale reduse sau deloc la administrarea unui agent terapeutic, cum ar fi un anticorp conform prezentei invenţii. Agentul terapeutic poate fi administrat subiectului într-o doză terapeutică.

[0188] Termenii „a preveni», „a preveni» sau „prevenirea» se referă la inhibarea manifestării infecţiei cu virusul Ebola sau a oricăror simptome sau indicaţii ale infecţiei cu virusul Ebola la administrarea unui anticorp conform prezentei invenţii. Termenul include prevenirea răspândirii infecţiei la un subiect expus la virus sau cu risc de infecţie cu virusul Ebola.

[0189] Aşa cum este utilizat aici, termenul „medicament antiviral» se referă la orice agent sau terapie antiinfecţioasă, fie că este vorba de o substanţă chimică sau de o terapie biologică, utilizată pentru a trata, preveni sau ameliora o infecţie virală la un subiect. De exemplu, în prezenta invenţie, un medicament antiviral poate include, dar fără a se limita la, un anticorp împotriva virusului Ebola (într-o formă de realizare, anticorpul împotriva virusului Ebola poate fi diferit de cele descrise aici), un vaccin pentru virusul Ebola, terapia ZMapp, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni. În prezenta invenţie, infecţia care trebuie tratată este cauzată de un virus Ebola.

[0190] Descriere generală

[0191] Boala cauzată de virusul Ebola este o boală severă, adesea fatală, cauzată de particule virale filamentoase din familia Filoviridae. Există mai multe specii cunoscute din genul virusului Ebola care sunt capabile să provoace boli la oameni. Acestea includ Zair, Sudan, Pădurea Tai (fosta Coastă de Fildeş) şi Bundibugyo. Rezervorul natural al virusului este necunoscut şi până în prezent nu există terapii sau vaccinuri aprobate.

[0192] Genomul virusului constă dintr-o singură catenă de ARN cu sens negativ, cu o lungime de aproximativ 19 kb. Virionii Ebola conţin şapte proteine: o glicoproteină de suprafaţă (GP), o nucleoproteină (NP), patru proteine structurale ale virionilor (VP40, VP35, VP30 şi VP24) şi o ARN polimerază dependentă de ARN (L). (Feldman şi colab.) 1992) Rezistenţă la viruşi 24, 1 -19).

[0193] Singura proteină prezentă la suprafaţa virusului este glicoproteina. Datorită editării ARN-ului, transcripţia genei GP are ca rezultat sinteza mai multor ARNm specifici genei GP care codifică GP-uri virale, inclusiv GP solubilă nestructurală (sGP) şi GP virion de suprafaţă (Volchkova, VA et al., (1998), Virology 250:408-414). Ambele GP-uri sunt sintetizate ca o moleculă precursoare care este scindată proteolitic de către protează celulară furină în timpul procesării intracelulare (Volchkov, VE, et al., ((1998), Proc Natl Acad Sci USA 95:5762-5767). sGP formează dimeri, în timp ce fragmentul carboxi-terminal scindat este un monomer. Spike-urile de suprafaţă virală se formează ca un trimer al GP1,2, alcătuit din două subunităţi GP1 şi GP2 legate printr-o legătură disulfidică (Volchkova, VA ef a/., (1998), Virology 250:408-414; Falzarano, D. et al., (2006), Chembiochem 7: 1605-1611). Se ştie că GP1 mediază ataşarea virală la celula gazdă, iar GP2 este implicată în fuziunea membranei (Sanchez, A. şi colab., (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93:3602-3607; Alazard-Dany, N. şi colab. 2006), J. Gen. Virol. 87: 1247-1257).

[0194] În timpul infecţiei cu EBOV, celulele infectate cu virus eliberează cantităţi semnificative de glicoproteine solubile (sGP). S-a demonstrat că această formă de GP se leagă şi sechestrează anticorpii neutralizanţi ai virusului îndreptaţi împotriva GP de suprafaţă sau a virionului (Dolnik, O. şi colab., (2004), EMBO J 23:2175-2184). În afară de această blocare a anticorpilor, rolul GP solubilă în ceea ce priveşte replicarea virală şi/sau patogenitatea nu a fost bine definit. Studii mai recente realizate de Escudero-Perez şi colab. au arătat că sGP se poate lega de celulele dendritice şi macrofagele neinfectate şi le poate activa şi poate induce secreţia de citokine pro- şi antiinflamatorii. În plus, au demonstrat că sGP afectează funcţia celulelor endoteliale şi poate afecta permeabilitatea vasculară. (Escudero-Perez, et al., (2014), PLOS Pathogens, voi. 10, Numărul 11: 1-17). Acest lucru ar putea explica reacţia inflamatorie disreglată a gazdei după infecţie şi ar putea contribui la patogenitatea virusului.

[0195] Imunoterapia pasivă pentru profilaxia sau tratamentul bolilor infecţioase a fost utilizată de mai bine de un secol, de obicei sub formă de seruri umane convalescente care conţin titruri ridicate de anticorpi neutralizanţi (Good et al., (1991); Cancer 68: 1415-1421). Astăzi, mai mulţi anticorpi monoclonali purificaţi sunt în curs de dezvoltare preclinică şi clinică pentru utilizare ca antimicrobieni (Marasco et al. 2007; Nature Biotechnology 25: 1421-1434). Au fost descrişi anumiţi anticorpi care se leagă de glicoproteina virusului Ebola. (Vezi de exemplu Audet şi colab. (2014), Rapoarte ştiinţifice 4:6881; Chen şi colab. (2014), ACS Chim Biol. Oct. 17; 9(10):2263-73; Koellhoffer JF, colab., (2012), Chembiochem nov. 26; 13(17):2549-57; Qiu, X., şi alţii, Nature (2014) 2 octombrie;514(7520):47-53).

[0196] Inventatorii au descris în prezenta invenţie anticorpi complet umani şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola şi modulează interacţiunea virusului Ebola cu acele celule. Anticorpii GP anti-virusul Ebola se pot lega de virusul Ebola cu afinitate mare. În anumite variante de realizare, anticorpii prezentei invenţii sunt anticorpi blocanţi, în care anticorpii se pot lega de GP-ul virusului Ebola şi pot bloca ataşarea şi/sau intrarea virusului în celulele gazdă. În anumite variante de realizare, anticorpii invenţiei pot bloca legarea virusului Ebola la celule şi, ca atare, pot inhiba sau neutraliza infecţia virală a celulelor gazdă. În anumite variante de realizare, anticorpii invenţiei pot media citotoxicitatea mediată de celule dependentă de anticorpi (ADCC) şi, ca atare, pot ajuta la distrugerea celulelor care adăpostesc virusul. În anumite variante de realizare, anticorpii pot acţiona în ambele moduri, de exemplu, pot neutraliza infecţiozitatea virală şi pot media ADCC. În unele variante de realizare, anticorpii pot fi utili pentru tratarea unui subiect care suferă de o infecţie cu virusul Ebola. Anticorpii, atunci când sunt administraţi unui subiect care are nevoie de aceştia, pot reduce infecţia cu un virus, cum ar fi virusul Ebola, la subiect. Acestea pot fi utilizate pentru a reduce încărcătura virală la un subiect. Acestea pot fi utilizate singure sau ca terapie adjuvantă cu alte componente sau modalităţi terapeutice cunoscute în domeniu pentru tratarea unei infecţii virale. În anumite variante de realizare, aceşti anticorpi se pot lega de un epitop la capătul amino-terminal al GP-ului virusului Ebola. În anumite variante de realizare, aceşti anticorpi se pot lega de un epitop la capătul carboxi-terminal al GP-ului virusului Ebola. În plus, anticorpii identificaţi pot fi utilizaţi profilactic (înainte de infecţie) pentru a proteja un mamifer de infecţie sau pot fi utilizaţi terapeutic (după ce infecţia este instalată) pentru a ameliora o infecţie instalată anterior sau pentru a ameliora cel puţin un simptom asociat cu infecţia.

[0197] Secvenţa completă de aminoacizi a unei GP-uri exemplare a virusului Ebola este prezentată în GenBank ca numerele de acces AHX24649.1 şi AHX24649.2 şi, de asemenea, în SEQ ID NOs: 314 şi respectiv 315. GP1 se întinde de la reziduurile de aminoacizi 1-501 ale GP de lungime completă, iar GP2 se întinde de la reziduurile de aminoacizi 502 până la 676 ale GP de lungime completă prezentate în SEQ ID NO. 314 sau SEQ ID NO: 315). GP-ul EBOV de lungime completă, prezentat şi cu numărul de acces AHX24649.1, poate fi cuplat la o etichetă de decahistidină, cum ar fi cea prezentată în SEQ ID NO: 318. GP solubilă (sGP) este prezentată ca numărul de acces GenBank AHX24650.1 şi, de asemenea, ca SEQ ID NO: 316 (cu secvenţa semnal ataşată) şi, de asemenea, ca SEQ ID NO: 317 (fără secvenţa semnal, dar conţinând o etichetă myc-myc-his).

[0198] În anumite aspecte, anticorpii invenţiei sunt obţinuţi de la şoareci imunizaţi cu un imunogen primar, cum ar fi o GP a virusului Ebola de lungime completă sau cu o formă recombinantă de GP a virusului Ebola sau fragmente ale acesteia, urmată de imunizare cu un imunogen secundar sau cu un fragment activ imunogenic de GP a virusului Ebola. În anumite variante de realizare, anticorpii sunt obţinuţi de la şoareci imunizaţi cu ADN care codifică GP a virusului Ebola de lungime completă (Zaire.2014, vezi GenBank KJ660346.2; de asemenea, SEQ ID NO: 313). Imunogenul poate fi un fragment biologic activ şi/sau imunogen al GP-ului virusului Ebola sau ADN-ului care codifică fragmentul activ al acestuia. Fragmentul poate fi derivat din orice regiune a GP virală, inclusiv fragmentul amino-terminal (de exemplu GP1) sau fragmentul carboxi-terminal (de exemplu GP2). Peptidele pot fi modificate pentru a include adăugarea sau substituţia anumitor reziduuri pentru marcare sau în scopul conjugării cu molecule purtătoare, cum ar fi KLH. De exemplu, o cisteină poate fi adăugată fie la capătul N-terminal, fie la capătul C-terminal al unei peptide sau o secvenţă de linker poate fi adăugată pentru a pregăti peptida pentru conjugare, de exemplu, cu KLH pentru imunizare.

[0199] Anumiţi anticorpi anti-virusul Ebola conform prezentei invenţii sunt capabili să se lege de virusul Ebola şi să neutralizeze activitatea acestuia, aşa cum s-a determinat prin teste in vitro sau in vivo. Capacitatea anticorpilor conform invenţiei de a se lega şi de a neutraliza activitatea virusului Ebola şi, prin urmare, ataşarea şi/sau intrarea virusului într-o celulă gazdă, urmată de infecţia virală ulterioară, poate fi măsurată utilizând orice metodă standard cunoscută de specialiştii în domeniu, inclusiv teste de legare sau teste de activitate, aşa cum este descris aici.

[0200] Teste in vitro exemplificative, nelimitative, pentru măsurarea activităţii de legare sunt ilustrate în Exemplul 3, de aici. În Exemplul 3, afinitatea de legare şi constantele de disociere ale anticorpilor GP anti-virus Ebola pentru virusul Ebola au fost determinate prin Biacore. În exemplele 4 şi 7, s-au utilizat teste de neutralizare pentru a determina infecţiozitatea diverselor tulpini ale virusului Ebola.

[0201] Anticorpii specifici pentru GP-ul virusului Ebola pot să nu conţină marcaje sau fragmente suplimentare sau pot conţine o marcajă sau un fragment N-terminal sau C-terminal. Într-o formă de realizare, marcajul sau gruparea este biotina. Într-un test de legare, locaţia unui marker (dacă există) poate determina orientarea peptidei faţă de suprafaţa pe care este legată peptida. De exemplu, dacă o suprafaţă este acoperită cu avidină, o peptidă care conţine o biotină N-terminală va fi orientată astfel încât porţiunea C-terminală a peptidei să fie distală de suprafaţă. Într-o formă de realizare, marcajul poate fi un radionuclid, un colorant fluorescent sau un marcaj detectabil prin RMN. În anumite aspecte, astfel de anticorpi marcaţi pot fi utilizaţi în teste de diagnostic, inclusiv teste imagistice.

[0202] Fragmente de anticorpi care se leagă de antigen

[0203] Dacă nu se specifică altfel în mod specific, termenul „anticorp», aşa cum este utilizat aici, va fi înţeles ca cuprinzând molecule de anticorpi care cuprind două lanţuri grele de imunoglobuline şi două lanţuri uşoare de imunoglobuline (adică „molecule complete de anticorpi»), precum şi fragmente ale acestora care leagă antigenul. Termenii „porţiune de legare a antigenului» a unui anticorp, „fragment de legare a antigenului» al unui anticorp şi alţii similari, aşa cum sunt utilizaţi aici, includ orice polipeptidă sau glicoproteină naturală, obţinută enzimatic, sintetică sau modificată genetic, care se leagă în mod specific de un antigen pentru a forma un complex. Termenii „fragment de legare a antigenului» al unui anticorp sau „fragment de anticorp», aşa cum sunt utilizaţi aici, se referă la unul sau mai multe fragmente ale unui anticorp care îşi păstrează capacitatea de a se lega specific de virusul Ebola. Un fragment de anticorp poate include un fragment Fab, un fragment F(ab')2, un fragment Fv, un fragment dAb, un fragment care conţine o CDR sau o CDR izolată. În anumite variante de realizare, termenul „fragment de legare a antigenului» se referă la un fragment polipeptidic al unei molecule multispecifice de legare a antigenului. Fragmentele de legare a antigenului dintr-un anticorp pot fi derivate, de exemplu, din molecule complete de anticorpi folosind orice tehnici standard adecvate, cum ar fi digestia proteolitică sau tehnicile de inginerie genetică recombinantă care implică manipularea şi exprimarea ADN-ului care codifică domenii variabile şi (opţional) constante ale anticorpilor. Un astfel de ADN este cunoscut şi/sau este uşor disponibil, de exemplu, din surse comerciale, biblioteci de ADN (inclusiv, de exemplu, biblioteci de fagi-anticorpi) sau poate fi sintetizat. ADN-ul poate fi secvenţiat şi manipulat chimic sau utilizând tehnici de biologie moleculară, de exemplu, pentru a aranja unul sau mai multe domenii variabile şi/sau constante într-o configuraţie adecvată sau pentru a introduce codoni, a crea reziduuri de cisteină, a modifica, adăuga sau elimina aminoacizi etc.

[0204] Exemple nelimitative de fragmente care leagă antigenul includ: (i) fragmente Fab; (ii) fragmente F(ab')2; (iii) fragmente Fd; (iv) fragmente Fv; (v) molecule Fv cu lanţ unic (scFv); (vi) fragmente dAb; şi (vii) unităţi minime de recunoaştere constând din reziduuri de aminoacizi care imită regiunea hipervariabilă a unui anticorp (de exemplu, un anticorp izolat regiune de determinare a complementarităţii (CDR), cum ar fi o peptidă CDR3) sau o peptidă FR3-CDR3-FR4 constrânsă. Alte molecule modificate genetic, cum ar fi anticorpii specifici domeniului, anticorpii cu un singur domeniu, anticorpii cu domeniu deletat, anticorpii himerici, anticorpii grefaţi pe CDR, diacorpii, triacorpii, tetracorpii, minicorpii, nanocorpii (de exemplu, anticorpii monovalenţi nanocorpi, nanocorpi bivalenţi etc.), imunofarmaceutice modulare mici (SMIP) şi domenii IgNAR variabile Shark sunt, de asemenea, incluse în expresia „fragment de legare a antigenului», aşa cum este utilizată aici.

[0205] Un fragment de legare a antigenului al unui anticorp va cuprinde de obicei cel puţin un domeniu variabil. Domeniul variabil poate avea orice dimensiune sau compoziţie de aminoacizi şi va cuprinde, în general, cel puţin o CDR, care este adiacentă sau în cadru cu una sau mai multe secvenţe cadru. În fragmentele de legare a antigenului care au un domeniu VL asociat cu un domeniu VH, domeniile VH şi VL pot fi situate unul faţă de celălalt în orice aranjament adecvat. De exemplu, regiunea variabilă poate fi dimerică şi poate conţine dimeri VH - VH, VH - VL sau VL - VL. Alternativ, fragmentul de legare a antigenului al unui anticorp poate conţine un domeniu monomeric VH sau VL.

[0206] În anumite variante de realizare, un fragment de legare a antigenului dintr-un anticorp poate conţine cel puţin un domeniu variabil legat covalent la cel puţin un domeniu constant. Configuraţii exemplificative, nelimitative, ale domeniilor variabile şi constante care pot fi găsite într-un fragment de legare a antigenului al unui anticorp al prezentei invenţii includ: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1- CH2; (V) VH-CH1- CH2- CH3; (vi) VH-CH2- CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2- CH3; şi (xiv) VL-CL. În orice configuraţie de domenii variabile şi constante, inclusiv oricare dintre configuraţiile exemplificative enumerate mai sus, domeniile variabile şi constante pot fi fie legate direct unul de celălalt, fie pot fi legate printr-o regiune balama sau linker completă sau parţială. O regiune balama poate fi alcătuită din cel puţin 2 (de exemplu, 5, 10, 15, 20, 40, 60 sau mai mulţi) aminoacizi, care au ca rezultat o legătură flexibilă sau semi-flexibilă între domeniile variabile şi/sau constante adiacente dintr-o singură moleculă polipeptidică. Mai mult, un fragment de legare a antigenului dintr-un anticorp conform prezentei invenţii poate cuprinde un homo-dimer sau hetero-dimer (sau alt multimer) al oricăreia dintre configuraţiile de domenii variabile şi constante enumerate mai sus, în asociere necovalentă una cu cealaltă şi/sau cu unul sau mai multe domenii monomerice VH sau VL (de exemplu, prin legături disulfidice).

[0207] Ca şi în cazul moleculelor complete de anticorpi, fragmentele care leagă antigenul pot fi monospecifice sau multispecifice (de exemplu, bispecifice). Un fragment de legare multispecifică a unui anticorp va cuprinde de obicei cel puţin două domenii variabile diferite, în care fiecare domeniu variabil este capabil să se lege specific la un antigen separat sau la un epitop diferit de pe acelaşi antigen. Orice format de anticorp multispecific, inclusiv formatele exemplificative de anticorpi bispecifici dezvăluite aici, poate fi adaptat pentru utilizare în contextul unui fragment de legare a antigenului dintr-un anticorp al prezentei invenţii, utilizând tehnici de rutină disponibile în domeniu.

[0208] Prepararea anticorpilor umani

[0209] Metodele de generare a anticorpilor umani la şoareci transgenici sunt cunoscute în domeniu. Oricare astfel de metode cunoscute pot fi utilizate în contextul prezentei invenţii pentru a produce anticorpi umani care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola. Un imunogen care cuprinde oricare dintre următoarele poate fi utilizat pentru a genera anticorpi împotriva virusului Ebola. În anumite variante de realizare, anticorpii invenţiei sunt obţinuţi de la şoareci imunizaţi cu o GP nativă a virusului Ebola, de lungime completă (vezi, de exemplu, numerele de acces GenBank AHX24649.1 (SEQ ID NO: 314) şi AHX24649.2 (SEQ ID NO: 315) sau cu ADN care codifică glicoproteina sau fragmentul acesteia. Alternativ, GP-ul virusului Ebola sau un fragment al acestuia poate fi produs folosind tehnici biochimice standard şi modificat şi utilizat ca imunogen. Într-o formă de realizare, imunogenul este o GP a virusului Ebola produsă recombinant sau un fragment al acesteia. În anumite variante de realizare ale invenţiei, imunogenul poate fi o GP a virusului Ebola disponibilă comercial. În anumite variante de realizare, se pot administra una sau mai multe injecţii de rapel. În anumite variante de realizare, injecţiile de rapel pot cuprinde una sau mai multe GP-uri ale virusului Ebola disponibile comercial. În anumite variante de realizare, imunogenul poate fi o GP recombinantă a virusului Ebola exprimată în E. coli sau în orice alte celule eucariote sau de mamifere, cum ar fi celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO).

[0210] Folosind tehnologia VELOCIMMUNE® (a se vedea, de exemplu, brevetul american US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) sau orice altă metodă cunoscută pentru generarea de anticorpi monoclonali, se izolează iniţial anticorpi himerici cu afinitate mare împotriva GP a virusului Ebola, având o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Tehnologia VELOCIMMUNE® implică generarea unui şoarece transgenic având un genom care cuprinde regiuni variabile ale lanţurilor grele şi uşoare umane legate operaţional de loci endogeni ai regiunilor constante de şoarece, astfel încât şoarecele produce un anticorp care cuprinde o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece ca răspuns la stimularea antigenică. ADN-ul care codifică regiunile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare ale anticorpului este izolat şi legat operaţional de ADN-ul care codifică regiunile constante ale lanţurilor grele şi uşoare umane. ADN-ul este apoi exprimat într-o celulă capabilă să exprime anticorpul complet uman.

[0211] În general, un şoarece VELOCIMMUNE® este expus la antigenul de interes, iar celulele limfatice (cum ar fi celulele B) sunt recuperate de la şoarecii care exprimă anticorpi. Celulele limfatice pot fi fuzionate cu o linie celulară de mielom pentru a prepara linii celulare de hibridom nemuritor, iar astfel de linii celulare de hibridom sunt analizate şi selectate pentru a identifica liniile celulare de hibridom care produc anticorpi specifici antigenului de interes. ADN-ul care codifică regiunile variabile ale lanţului greu şi ale lanţului uşor poate fi izolat şi legat de regiunile constante izotipice dorite ale lanţului greu şi ale lanţului uşor. O astfel de proteină anticorp poate fi produsă într-o celulă, cum ar fi o celulă CHO. Alternativ, ADN-ul care codifică anticorpii himerici specifici antigenului sau domeniile variabile ale lanţurilor uşoare şi grele poate fi izolat direct din ADN-ul limfocite specifice antigenului.

[0212] Iniţial, se izolează anticorpi himerici de mare afinitate, având o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Ca şi în secţiunea experimentală de mai jos, anticorpii sunt caracterizate şi selectate pentru caracteristicile dorite, inclusiv afinitate, selectivitate, epitop etc. Regiunile constante de şoarece sunt înlocuite cu o regiune constantă umană dorită pentru a genera anticorpul complet uman al invenţiei, de exemplu lgG1 sau lgG4 de tip sălbatic sau modificat. Deşi regiunea constantă selectată poate varia în funcţie de utilizarea specifică, caracteristicile de legare a antigenului cu afinitate ridicată şi specificitatea ţintei se află în regiunea variabilă.

[0213] Bioechivalenţi

[0214] Anticorpii GP şi fragmentele de anticorpi anti-virus Ebola conform prezentei invenţii cuprind proteine având secvenţe de aminoacizi care variază de cele ale anticorpilor descrişi, dar care îşi păstrează capacitatea de a se lega de virusul Ebola. Astfel de variante de anticorpi şi fragmente de anticorpi cuprind una sau mai multe adăugiri, deleţii sau substituţii de aminoacizi în comparaţie cu secvenţa parentală, dar prezintă o activitate biologică care este în esenţă echivalentă cu cea a anticorpilor descrişi. În mod similar, secvenţele de ADN care codifică anticorpii din prezenta invenţie cuprind secvenţe care cuprind una sau mai multe adiţii, deleţii sau substituţii de nucleotide în comparaţie cu secvenţa descrisă, dar care codifică un anticorp sau un fragment de anticorp care este în esenţă bioechivalent cu un anticorp sau un fragment de anticorp al invenţiei.

[0215] Două proteine care leagă antigenul, sau anticorpi, sunt considerate bioechivalente dacă, de exemplu, sunt echivalenţi farmaceutici sau alternative farmaceutice a căror rată şi grad de absorbţie nu prezintă o diferenţă semnificativă atunci când sunt administrate în aceeaşi doză molară în condiţii experimentale similare, fie în doză unică, fie în doze multiple. Anumiţi anticorpi vor fi consideraţi echivalenţi sau alternative farmaceutice dacă sunt echivalenţi în ceea ce priveşte gradul de absorbţie, dar nu şi rata de absorbţie, şi totuşi pot fi consideraţi bioechivalenţi, deoarece astfel de diferenţe în rata de absorbţie sunt intenţionate şi se reflectă în etichetare, nu sunt esenţiale pentru atingerea unor concentraţii eficiente de medicament în organism, de exemplu, în cazul utilizării cronice, şi sunt considerate nesemnificative din punct de vedere medical pentru produsul medicamentos specific studiat.

[0216] Într-o formă de realizare, două proteine care leagă antigenul sunt bioechivalente dacă nu există diferenţe semnificative clinic în ceea ce priveşte siguranţa, puritatea sau potenţa lor.

[0217] Într-o formă de realizare, două proteine care leagă antigenul sunt bioechivalente dacă un pacient poate fi comutat o dată sau de mai multe ori între produsul de referinţă şi produsul biologic fără o creştere aşteptată a riscului de efecte adverse, inclusiv o modificare semnificativă clinic a imunogenităţii sau o eficacitate diminuată, în comparaţie cu terapia continuată fără o astfel de comutare.

[0218] Într-o formă de realizare, două proteine care leagă antigenul sunt bioechivalente dacă ambele acţionează printr-un mecanism sau mecanisme de acţiune comune pentru afecţiunea sau condiţiile de utilizare, în măsura în care astfel de mecanisme sunt cunoscute.

[0219] Bioechivalenţa poate fi demonstrată prin metode in vivo şi/sau in vitro. Măsurile de bioechivalenţă includ, de exemplu, (a) un test in vivo la oameni sau alte mamifere, în care concentraţia anticorpului sau a metaboliţilor acestuia este măsurată în sânge, plasmă, ser sau alt fluid biologic în funcţie de timp; (b) un test in vitro care a fost corelat cu datele de biodisponibilitate in vivo la om şi este predictiv în mod rezonabil pentru acestea; (c) un test in vivo la oameni sau alte mamifere în care efectul farmacologic acut adecvat al anticorpului (sau al ţintei sale) este măsurat în funcţie de timp; şi (d) într-un studiu clinic bine controlat care stabileşte siguranţa, eficacitatea sau biodisponibilitatea ori bioechivalenţa unui anticorp.

[0220] Variantele bioechivalente ale anticorpilor conform invenţiei pot fi construite, de exemplu, prin efectuarea diferitelor substituţii de reziduuri sau secvenţe sau prin ştergerea reziduurilor sau secvenţelor terminale sau interne care nu sunt necesare pentru activitatea biologică. De exemplu, reziduurile de cisteină care nu sunt esenţiale pentru activitatea biologică pot fi şterse sau înlocuite cu alţi aminoacizi pentru a preveni formarea de punţi disulfidice intramoleculare inutile sau incorecte la renaturare. În alte contexte, anticorpii bioechivalenţi pot include variante de anticorpi care cuprind modificări ale aminoacizilor, care modifică caracteristicile de glicozilare ale anticorpilor, de exemplu, mutaţii care elimină sau îndepărtează glicozilarea.

[0221] Anticorpi anti-virus Ebola care cuprind variante Fc

[0222] Conform anumitor aspecte ale prezentei dezvăluiri, sunt furnizaţi anticorpi anti-virusul Ebola care cuprind un domeniu Fc care cuprinde una sau mai multe mutaţii care amplifică sau diminuează legarea anticorpilor la receptorul FcRn, de exemplu, la pH acid în comparaţie cu pH-ul neutru. De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi GP anti-virusul Ebola care cuprind o mutaţie în regiunea CH2 sau CH3 a domeniului Fc, în care mutaţia (mutaţiile) creşte afinitatea domeniului Fc la FcRn într-un mediu acid (de exemplu, într-un endosom unde pH-ul variază de la aproximativ 5,5 la aproximativ 6,0). Astfel de mutaţii pot duce la o creştere a timpului de înjumătăţire seric al anticorpului atunci când este administrat unui animal. Exemple nelimitative de astfel de Fc modificările includ, de exemplu, o modificare la poziţia 250 (de exemplu, E sau Q); 250 şi 428 (de exemplu, L sau F); 252 (de exemplu, L/Y/F/W sau T), 254 (de exemplu, S sau T) şi 256 (de exemplu, S/R/Q/E/D sau T); sau o modificare la poziţia 428 şi/sau 433 (de exemplu, H/L/R/S/P/Q sau K) şi/sau 434 (de exemplu, A, W, H, F sau Y [N434A, N434W, N434H, N434F sau N434Y]); sau o modificare la poziţia 250 şi/sau 428; sau o modificare la poziţia 307 sau 308 (de exemplu, 308F, V308F) şi 434. Într-o formă de realizare, modificarea cuprinde o modificare 428L (de exemplu, M428L) şi 434S (de exemplu, N434S); o modificare 428L, 2591 (de exemplu, V259I) şi 308F (de exemplu, V308F); o modificare 433K (de exemplu, H433K) şi o modificare 434 (de exemplu, 434Y); o modificare 252, 254 şi 256 (de exemplu, 252Y, 254T şi 256E); o modificare 250Q şi 428L (de exemplu, T250Q şi M428L); şi o modificare 307 şi/sau 308 (de exemplu, 308F sau 308P). Într-un aspect, modificarea cuprinde o modificare 265A (de exemplu, D265A) şi/sau o modificare 297A (de exemplu, N297A).

[0223] De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi anti-virus Ebola care cuprind un domeniu Fc ce cuprinde una sau mai multe perechi sau grupuri de mutaţii selectate din grupul format din: 250Q şi 248L (de exemplu, T250Q şi M248L); 252Y, 254T şi 256E (de exemplu, M252Y, S254T şi T256E); 428L şi 434S (de exemplu, M428L şi N434S); 257I şi 3111 (de exemplu, P257I şi Q3111); 257I şi 434H (de exemplu, P257I şi N434H); 376V şi 434H (de exemplu, D376V şi N434H); 307A, 380A şi 434A (de exemplu, T307A, E380A şi N434A); şi 433K şi 434F (de exemplu, H433K şi N434F). Toate combinaţiile posibile ale mutaţiilor domeniului Fc menţionate anterior şi ale altor mutaţii din domeniile variabile ale anticorpilor dezvăluite aici sunt avute în vedere în cadrul domeniului de aplicare al prezentei invenţii.

[0224] Prezenta invenţie include, de asemenea, anticorpi anti-virus Ebola care cuprind o regiune constantă himerică a lanţului greu (CH), în care regiunea himerică CH cuprinde segmente derivate din regiunile CH ale mai multor izotipuri de imunoglobulină. De exemplu, anticorpii conform invenţiei pot cuprinde o regiune himerică CH care cuprinde o parte sau tot un domeniu CH 2 derivat dintr-o moleculă lgG1 umană, lgG2 umană sau lgG4 umană, combinată cu o parte sau tot un domeniu CH 3 derivat dintr-o moleculă lgG1 umană, lgG2 umană sau lgG4 umană. Conform anumitor variante de realizare, anticorpii invenţiei cuprind o regiune himerică CH având o regiune balama himerică. De exemplu, o balama himerică poate cuprinde o secvenţă de aminoacizi „balama superioară» (reziduuri de aminoacizi de la poziţiile 216 până la 227 conform numerotării EU) derivată dintr-o regiune balama lgG1 umană, o lgG2 umană sau o regiune balama lgG4 umană, combinată cu o secvenţă de „balama inferioară» (reziduuri de aminoacizi de la poziţiile 228 până la 236 conform numerotării EU) derivată dintr-o regiune balama lgG1 umană, o lgG2 umană sau o regiune balama lgG4 umană. Conform anumitor variante de realizare, regiunea balama himerică cuprinde reziduuri de aminoacizi derivate dintr-o balama superioară lgG1 umană sau o balama superioară lgG4 umană şi reziduuri de aminoacizi derivate dintr-o balama inferioară lgG2 umană. Un anticorp care cuprinde o regiune himerică CH, aşa cum este descris aici, poate, în anumite variante de realizare, să prezinte funcţii efectoare Fc modificate fără a afecta negativ proprietăţile terapeutice sau farmacocinetice ale anticorpului. (A se vedea, de exemplu, cererea provizorie a SUA) Nr. 61/759.578, depusă la 1 februarie 2013).

[0225] Caracteristicile biologice ale anticorpilor

[0226] În general, anticorpii prezentei invenţii funcţionează prin legarea la GP-ul virusului Ebola. De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi şi fragmente de anticorpi care leagă antigenul şi care leagă GP-ul virusului Ebola (de exemplu, la 25°C sau la 37°C) cu un KD mai mic de 10-7 M, măsurat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, utilizând formatul de analiză descris aici. În anumite variante de realizare, anticorpii sau fragmentele acestora care leagă antigenul se leagă de GP-ul virusului Ebola cu un KD mai mic de aproximativ 10 nM, mai mic de aproximativ 5 nM, mai mic de aproximativ 1 nM, mai mic de aproximativ 500 pM, mai mic de 250 pM sau mai mic de 100 pM, măsurat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, utilizând formatul de testare descris aici sau un test substanţial similar.

[0227] Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care se leagă de virusul Ebola cu un timp de înjumătăţire disociativ (t½) mai mare de aproximativ 3 minute, măsurat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă la 25°C, sau mai mare de aproximativ 1 minut, măsurat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă la 37°C, de exemplu, şi o creştere de cel puţin 3 ori a timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH 5 sau pH 6; utilizând un format de testare aşa cum este definit aici sau un test substanţial similar. În anumite variante de realizare, anticorpii sau fragmentele de legare a antigenului conform prezentei invenţii se leagă de virusul Ebola cu un t½ mai mare de aproximativ 10 minute, mai mare de aproximativ 30 de minute, mai mare de aproximativ 60 de minute, mai mare de aproximativ 100 de minute, mai mare de aproximativ 200 de minute, mai mare de aproximativ 300 de minute, mai mare de aproximativ 400 de minute, mai mare de aproximativ 500 de minute, mai mare de aproximativ 600 de minute, mai mare de aproximativ 700 de minute, mai mare de aproximativ 800 de minute, mai mare de aproximativ 900 de minute sau mai mare de aproximativ 1000 de minute, măsurat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă la 25°C sau la 37°C, de exemplu, utilizând un format de testare aşa cum este definit aici (de exemplu, format de captare a anticorpilor monoclonali sau de captare a antigenului) sau un test substanţial similar.

[0228] Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul şi care neutralizează infecţiozitatea virusului Ebola pentru celulele gazdă. În unele variante de realizare, anticorpii prezintă o potenţă de neutralizare împotriva VLP-urilor Zaire.2014 cu un IC50 cuprins între aproximativ 10-11 M şi aproximativ 10-9 M. Anticorpii invenţiei reacţionează, de asemenea, încrucişat cu VLP-urile virusului Ebola care conţin GP-uri din diverse tulpini de EBOV, inclusiv Zaire.1995, Zaire.2014, Ebola Sudan, Bundibugyo şi Coasta de Fildeş. Anticorpii conform invenţiei mediază, de asemenea, ADCC, aşa cum se arată în Exemplul 5. În plus, anticorpii conform invenţiei concurează încrucişat cu alţi anticorpi care se leagă de GP-ul EBOV, aşa cum se arată în Exemplul 6.

[0229] Dezvăluirea oferă un anticorp recombinant izolat sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen şi care se leagă specific de GP-ul virusului Ebola, în care anticorpul sau fragmentul acestuia prezintă una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: (a) este un anticorp monoclonal complet uman; (b) se leagă de EBOV sau de o particulă asemănătoare virusului (VLP) care exprimă o glicoproteină a virusului Ebola cu o constantă de disociere (KD mai mică de 10-7 M, măsurată într-un test de rezonanţă plasmonică de suprafaţă; (c) demonstrează o creştere de cel puţin 3 ori a timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH 5 sau pH 6 faţă de pH 7,4; (d) demonstrează neutralizarea virusului Ebola din Zair cu un IC50 cuprins între aproximativ 10-11 M şi aproximativ 10-9 M; (e) demonstrează citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi a celulelor infectate cu virusul Ebola; (f) reacţionează încrucişat cu una sau mai multe tulpini de VLP-uri ale virusului Ebola selectate din grupul format din Zaire.2014, Zaire.1995, Sudan, Bundibugyo şi Coasta de Fildeş; (g) concurează încrucişat cu un anticorp de referinţă, în care anticorpul de referinţă cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) şi o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor (LCVR) selectată din grupul format din oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR şi LCVR din Tabelul 1.

[0230] Anticorpii prezentei invenţii pot poseda una sau mai multe dintre caracteristicile biologice menţionate anterior sau orice combinaţii ale acestora. Anumite proprietăţi ale anticorpilor conform invenţiei sunt rezumate mai jos. Alte caracteristici biologice ale anticorpilor prezentei invenţii vor fi evidente pentru o persoană cu competenţe obişnuite în domeniu dintr-o analiză a prezentei dezvăluiri, inclusiv a exemplelor de lucru de aici.

mAb

mAb Proprietăţi

Neutralizare pseudovirus

Neutralizare Virus viu

ADCC

sGP Legare

IC50 (M)

H1H17161P

Neutralizator,

8.3E-11

Da

Nu

Nu

[0232] ADCC-, sGP-_______________________________________________________

H1H17139P NeNeutralizator,

Nu \tab Nu \tab Da Da

[0234] ADCC +, sGP+______________________________________________________

H1H17203P Neutralizator,

2E-10 \tab Nu Da Nu

[0236] ADCC +, sGP-

[0237] ________________________________________________________________________________

[0238] Cartografierea epitopilor şi tehnologiile conexe

[0239] Prezenta invenţie include anticorpi anti-virusul Ebola care interacţionează cu unul sau mai mulţi aminoacizi găsiţi în GP-ul virusului Ebola. Epitopul de care se leagă anticorpii poate consta dintr-o singură secvenţă contiguă de 3 sau mai mulţi (de exemplu, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau mai mulţi) aminoacizi situaţi în molecula GP a virusului Ebola (de exemplu, un epitop liniar într-un domeniu). Alternativ, epitopul poate consta dintr-o pluralitate de aminoacizi (sau secvenţe de aminoacizi) necontigui localizaţi în cadrul GP-ului virusului Ebola (de exemplu, un epitop conformaţional).

[0240]

[0241] Diverse tehnici cunoscute specialiştilor în domeniu pot fi utilizate pentru a determina dacă un anticorp „interacţionează cu unul sau mai mulţi aminoacizi» dintr-un polipeptid sau proteină. Tehnicile exemplificative includ, de exemplu, teste de blocare încrucişată de rutină, cum ar fi cel descris în Antibodies, Harlow şi Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Alte metode includ analiza mutaţională cu scanare a alaninei, analiza prin blot de peptide (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), analiză de scindare a peptidelor, studii cristalografice şi analiză RMN. În plus, se pot utiliza metode precum excizia epitopilor, extracţia epitopilor şi modificarea chimică a antigenelor (Tomer (2000) Prot. Ştiinţă. 9: 487-496). O altă metodă care poate fi utilizată pentru identificarea aminoacizilor dintr-un polipeptid cu care interacţionează un anticorp este schimbul hidrogen/deuteriu detectat prin spectrometrie de masă. În termeni generali, metoda de schimb hidrogen/deuteriu implică marcarea cu deuteriu a proteinei de interes, urmată de legarea anticorpului la proteina marcată cu deuteriu. Apoi, complexul proteină/anticorp este transferat în apă, iar protonii interschimbabili din aminoacizii protejaţi de complexul de anticorpi suferă un schimb invers deuteriu-hidrogen la o rată mai lentă decât protonii interschimbabili din aminoacizii care nu fac parte din interfaţă. Prin urmare, aminoacizii care fac parte din interfaţa proteină/anticorp pot reţine deuteriu şi, prin urmare, pot prezenta o masă relativ mai mare în comparaţie cu aminoacizii care nu sunt incluşi în interfaţă. După disocierea anticorpului, proteina ţintă este supusă scindării cu protează şi analizei prin spectrometrie de masă, dezvăluind astfel reziduurile marcate cu deuteriu care corespund aminoacizilor specifici cu care interacţionează anticorpul. Vezi, de exemplu, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen şi Smith (2001) Anal. Chim. 73: 256A-265A.

[0242]

[0243]

[0244] Termenul „epitop» se referă la un situs de pe un antigen la care răspund celulele B şi/sau T. Epitopii celulelor B pot fi formaţi atât din aminoacizi contigui, cât şi din aminoacizi necontigui juxtapuşi prin plierea terţiară a unei proteine. Epitopii formaţi din aminoacizi contigui sunt de obicei reţinuţi la expunerea la solvenţi denaturanţi, în timp ce epitopii formaţi prin pliere terţiară sunt de obicei pierduţi la tratamentul cu solvenţi denaturanţi. Un epitop include de obicei cel puţin 3, şi mai frecvent, cel puţin 5 sau 8-10 aminoacizi într-o conformaţie spaţială unică.

[0245] Profilarea asistată de modificare (MAP), cunoscută şi sub denumirea de profilare a anticorpilor bazată pe structura antigenului (ASAP), este o metodă care clasifică un număr mare de anticorpi monoclonali (mAb) îndreptaţi împotriva aceluiaşi antigen în funcţie de similarităţile profilului de legare al fiecărui anticorp la suprafeţele antigenice modificate chimic sau enzimatic (a se vedea US 2004/0101920). Fiecare categorie poate reflecta un epitop unic, fie distinct diferit de, fie se suprapune parţial cu epitopul reprezentat de o altă categorie. Această tehnologie permite filtrarea rapidă a anticorpilor identici genetic, astfel încât caracterizarea se poate concentra pe anticorpi distincţi genetic. Atunci când este aplicată la screening-ul hibridomului, MAP poate facilita identificarea clonelor rare de hibridom care produc anticorpi monoclonali (mAb) având caracteristicile dorite. MAP poate fi utilizată pentru a sorta anticorpii invenţiei în grupuri de anticorpi care leagă diferiţi epitopi.

[0246] Anticorpii virusului Ebola sau fragmentele acestora care leagă antigenul se leagă de un epitop în oricare dintre regiunile exemplificate în GP-ul virusului Ebola, fie în formă naturală, fie produsă recombinant, fie de un fragment al acestuia.

[0247] Prezenta dezvăluire include anticorpi GP anti-virusul Ebola care se leagă de acelaşi epitop sau de o porţiune a epitopului. De asemenea, prezenta invenţie include şi anticorpi anti-GP a virusului Ebola care concurează pentru legarea la GP a virusului Ebola sau la un fragment al acesteia cu oricare dintre anticorpii specifici exemplificativi descrişi aici. De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi GPP anti-virus Ebola care concurează încrucişat pentru legarea la virusul Ebola cu unul sau mai mulţi anticorpi obţinuţi din anticorpii descrişi în tabelele 1 şi 2.

[0248] Se poate determina cu uşurinţă dacă un anticorp se leagă de acelaşi epitop ca şi un anticorp GP de referinţă anti-virusul Ebola sau concurează pentru legare cu acesta, utilizând metode de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, pentru a determina dacă un anticorp testat se leagă de acelaşi epitop ca un anticorp GP de referinţă anti-virusul Ebola al invenţiei, anticorpul de referinţă este lăsat să se lege de o GP sau o peptidă a virusului Ebola în condiţii de saturare. În continuare, se evaluează capacitatea unui anticorp testat de a se lega de GP-ul virusului Ebola. Dacă anticorpul testat este capabil să se lege de GP-ul virusului Ebola după legarea prin saturaţie cu anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola, se poate concluziona că anticorpul testat se leagă de un epitop diferit de anticorpul de referinţă anti-virus Ebola. Pe de altă parte, dacă anticorpul testat nu este capabil să se lege de GP-ul virusului Ebola după legarea prin saturaţie cu anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola, atunci anticorpul testat se poate lega de acelaşi epitop ca şi epitopul legat de anticorpul GP de referinţă anti-virus Ebola al invenţiei.

[0249] Pentru a determina dacă un anticorp concurează pentru legarea cu un anticorp GP de referinţă anti-virusul Ebola, metodologia de legare descrisă mai sus se efectuează în două orientări: Într-o primă orientare, anticorpul de referinţă este lăsat să se lege de o GP a virusului Ebola în condiţii de saturare, urmată de evaluarea legării anticorpului testat la GP a virusului Ebola. Într-o a doua orientare, anticorpul testat este lăsat să se lege de o GP a virusului Ebola în condiţii de saturare, urmată de evaluarea legării anticorpului de referinţă la GP a virusului Ebola. Dacă, în ambele orientări, doar primul anticorp (saturant) este capabil să se lege de GP a virusului Ebola, atunci se concluzionează că anticorpul testat şi anticorpul de referinţă concurează pentru legarea la GP a virusului Ebola. După cum va fi înţeles de o persoană cu competenţe obişnuite în domeniu, un anticorp care concurează pentru legarea cu un anticorp de referinţă nu se poate lega neapărat de epitopul identic ca anticorpul de referinţă, dar poate bloca steric legarea anticorpului de referinţă prin legarea unui epitop suprapus sau adiacent.

[0250] Doi anticorpi se leagă de acelaşi epitop sau de unul care se suprapune dacă fiecare inhibă competitiv (blochează) legarea celuilalt la antigen. Adică, un exces de 1, 5, 10, 20 sau 100 de ori al unui anticorp inhibă legarea celuilalt cu cel puţin 50%, dar de preferinţă 75%, 90% sau chiar 99%, măsurat într-un test de legare competitivă (vezi, de exemplu, Junghans şi colab., Cancer Res. 1990 50: 1495-1502). Alternativ, doi anticorpi au acelaşi epitop dacă practic toate mutaţiile aminoacizilor din antigen care reduc sau elimină legarea unui anticorp reduc sau elimină legarea celuilalt. Doi anticorpi au epitopi suprapuşi dacă unele mutaţii ale aminoacizilor care reduc sau elimină legarea unui anticorp reduc sau elimină legarea celuilalt.

[0251] Se pot efectua apoi experimente suplimentare de rutină (de exemplu, analize ale mutaţiilor peptidice şi ale legării) pentru a confirma dacă lipsa observată de legare a anticorpului testat se datorează de fapt legării la acelaşi epitop ca şi anticorpul de referinţă sau dacă blocarea sterică (sau un alt fenomen) este responsabilă pentru lipsa legării observate. Experimente de acest tip pot fi efectuate folosind ELISA, RIA, rezonanţă plasmonică de suprafaţă, citometrie în flux sau orice alt test cantitativ sau calitativ de legare a anticorpilor disponibil în domeniu.

[0252] Imunoconjugate

[0253] Dezvăluirea cuprinde un anticorp monoclonal GP uman anti-virusul Ebola conjugat cu o grupare terapeutică („imunoconjugat»), cum ar fi un medicament antiviral pentru tratarea infecţiei cu virusul Ebola. Aşa cum este utilizat aici, termenul „imunoconjugat» se referă la un anticorp, care este legat chimic sau biologic de un agent radioactiv, o citokină, un interferon, o ţintă sau o grupare reporter, o enzimă, o peptidă sau o proteină sau un agent terapeutic. Anticorpul poate fi legat de agentul radioactiv, citokină, interferon, ţintă sau grupare reporter, enzimă, peptidă sau agent terapeutic în orice locaţie de-a lungul moleculei, atâta timp cât este capabil să se lege de ţinta sa. Exemple de imunoconjugate includ conjugatele de anticorpi şi medicamente şi proteinele de fuziune anticorp-toxină. Într-o formă de realizare, agentul poate fi un al doilea anticorp diferit împotriva virusului Ebola sau GP a virusului Ebola. În anumite forme de realizare, anticorpul poate fi conjugat cu un agent specific pentru o celulă infectată viral. Tipul de grupare terapeutică care poate fi conjugată cu anticorpul anti-virusul Ebola va lua în considerare afecţiunea care trebuie tratată şi efectul terapeutic dorit care trebuie obţinut. Exemple de agenţi adecvaţi pentru formarea imunoconjugatelor sunt cunoscute în domeniu; vezi, de exemplu, WO 05/103081.

[0254] Anticorpi multispecifici

[0255] Anticorpii prezentei dezvăluiri pot fi monospecifici, bispecifici sau multispecifici. Anticorpii multispecifici pot fi specifici pentru diferiţi epitopi ai unei polipeptide ţintă sau pot conţine domenii de legare a antigenului specifice pentru mai mult de o polipeptidă ţintă. Vezi, de exemplu, Tutt et al. , 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer şi colab. , 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.

[0256] Oricare dintre moleculele multispecifice de legare a antigenului conform invenţiei sau variante ale acestora pot fi construite folosind tehnici standard de biologie moleculară (de exemplu, ADN recombinant şi tehnologie de exprimare a proteinelor), aşa cum va fi cunoscut de o persoană cu competenţe obişnuite în domeniu.

[0257] În unele aspecte, anticorpii specifici virusului Ebola sunt generaţi într-un format bispecific (un „bispecific») în care regiunile variabile care se leagă la domenii distincte ale virusului Ebola sunt legate între ele pentru a conferi specificitate cu domeniu dublu în cadrul unei singure molecule de legare. Bi-specificităţile concepute corespunzător pot spori eficacitatea inhibitorie generală a proteinelor virusului Ebola prin creşterea atât a specificităţii, cât şi a avidităţii de legare. Regiunile variabile cu specificitate pentru domenii individuale (de exemplu, segmente ale domeniului N-terminal) sau care se pot lega de diferite regiuni dintr-un domeniu sunt asociate pe o schelă structurală care permite fiecărei regiuni să se lege simultan de epitopii separaţi sau de diferite regiuni dintr-un domeniu. Într-un exemplu pentru o proteină bispecifică, regiunile variabile ale lanţului greu (VH) dintr-un liant cu specificitate pentru un domeniu sunt recombinate cu regiuni variabile ale lanţului uşor (VL) dintr-o serie de lianţi cu specificitate pentru un al doilea domeniu pentru a identifica parteneri VL neînrudiţi care pot fi asociaţi cu un VH original fără a perturba specificitatea originală pentru acel VH. În acest fel, un singur segment VL (de exemplu, VL1) poate fi combinat cu două domenii VH diferite (de exemplu, VH1 şi VH2) pentru a genera o bi-specificitate compusă din două „braţe» de legare (VH1 - VL1 şi VH2 - VL1). Utilizarea unui singur segment VL reduce complexitatea sistemului şi, prin urmare, simplifică şi creşte eficienţa proceselor de clonare, exprimare şi purificare utilizate pentru a genera bispecificitatea (vezi, de exemplu, USSN 13/022759 şi US2010/0331527).

[0258] Alternativ, anticorpii care leagă mai mult de un domeniu şi o a doua ţintă, cum ar fi, dar fără a se limita la, de exemplu, un al doilea anticorp anti-virus Ebola diferit, pot fi preparaţi într-un format bispecific folosind tehnicile descrise aici sau alte tehnici cunoscute de specialiştii în domeniu. Regiunile variabile ale anticorpilor care se leagă de regiuni distincte pot fi legate împreună cu regiuni variabile care se leagă de situsuri relevante, de exemplu, pe virusul Ebola, pentru a conferi specificitate duală a antigenului în cadrul unei singure molecule de legare. Bi-specificităţile de acest fel, concepute corespunzător, îndeplinesc o dublă funcţie. Regiunile variabile cu specificitate pentru domeniul extracelular sunt combinate cu o regiune variabilă cu specificitate pentru exteriorul domeniului extracelular şi sunt asociate pe o schelă structurală care permite fiecărei regiuni variabile să se lege de antigenele separate.

[0259] Un format exemplar de anticorp bispecific care poate fi utilizat în contextul prezentei invenţii implică utilizarea unui prim domeniu imunoglobulinic (Ig) CH3 şi a unui al doilea domeniu Ig CH3, în care primul şi al doilea domeniu Ig CH3 diferă unul de celălalt prin cel puţin un aminoacid şi în care cel puţin o diferenţă de aminoacizi reduce legarea anticorpului bispecific la Proteina A în comparaţie cu un anticorp bispecific căruia îi lipseşte diferenţa de aminoacizi. Într-o formă de realizare, primul domeniu Ig CH3se leagă de Proteina A, iar al doilea domeniu Ig CH3conţine o mutaţie care reduce sau elimină legarea Proteinei A, cum ar fi o modificare H95R (prin numerotarea exonilor IMGT; H435R prin numerotarea EU). Al doilea CH3ar putea include în plus o modificare Y96F (de IMGT; Y436F de EU). Alte modificări care pot fi găsite în cadrul celui de-al doilea CH3includ: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M şi V82I (prin IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M şi V422I prin EU) în cazul anticorpilor lgG 1; N44S, K52N şi V82I (IMGT; N384S, K392N şi V422I prin EU) în cazul anticorpilor lgG2; şi Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q şi V82I (prin IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q şi V422I prin EU) în cazul anticorpilor lgG4. Variaţii ale formatului de anticorp bispecific descris mai sus sunt avute în vedere în cadrul prezentei invenţii.

[0260] Alte formate bispecifice exemplificative care pot fi utilizate în contextul prezentei invenţii includ, fără limitare, de exemplu, formate bispecifice bazate pe scFv sau diabody, fuziuni IgG-scFv, domeniu variabil dual (DVD)-lg, Quadroma, knobs-into-holes, lanţ uşor comun (de exemplu, lanţ uşor comun cu knobs-into-holes etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, fermoar leucină, Duobody, lgG 1/lgG2, Fab cu acţiune duală (DAF)-lgG şi formate Mab2 bispecifice (vezi, de exemplu, Klein şi colab. 2012, mAbs 4:6, 1-11 şi referinţele citate acolo, pentru o trecere în revistă a formatelor menţionate anterior). Anticorpii bispecifici pot fi construiţi şi folosind conjugarea peptidă/acid nucleic, de exemplu, în care aminoacizi nenaturali cu reactivitate chimică ortogonală sunt utilizaţi pentru a genera conjugate anticorp-oligonucleotidă specifice situsului, care apoi se auto-asamblează în complexe multimerice cu compoziţie, valenţă şi geometrie definite. (A se vedea, de exemplu, Kazane şi colab., J. Am. Chem. Soc. [Epub: dec. 4, 2012]).

[0261] Administrare şi formulări terapeutice

[0262] Invenţia oferă compoziţii terapeutice care cuprind anticorpi GP anti-virus Ebola sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, conform prezentei invenţii. Compoziţiile terapeutice conform invenţiei vor fi administrate împreună cu purtători, excipienţi şi alţi agenţi adecvaţi, care sunt încorporaţi în formulări pentru a asigura un transfer, o eliberare, o toleranţă îmbunătăţite şi altele asemenea. O multitudine de formulări adecvate pot fi găsite în formularul cunoscut de toţi chimiştii farmaceutici: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Aceste formulări includ, de exemplu, pulberi, paste, unguente, jeleuri, ceruri, uleiuri, lipide, vezicule care conţin lipide (cationice sau anionice) (cum ar fi LIPOFECTIN™), conjugate de ADN, paste de absorbţie anhidre, emulsii ulei-în-apă şi apă-în-ulei, emulsii carbowax (polietilen glicoli cu diferite greutăţi moleculare), geluri semisolide şi amestecuri semisolide care conţin carbowax. Vezi şi Powell şi colab. „Compendiu de excipienţi pentru formulări parenterale» PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-31 1.

[0263] Doza de anticorp poate varia în funcţie de vârsta şi mărimea subiectului căruia i se administrează, boala ţintă, afecţiuni, calea de administrare şi altele asemenea. Când un anticorp conform prezentei invenţii este utilizat pentru tratarea unei boli sau tulburări la un pacient adult sau pentru prevenirea unei astfel de boli, este avantajos să se administreze anticorpul conform prezentei invenţii în mod normal într-o singură doză de aproximativ 0,1 până la aproximativ 60 mg/kg greutate corporală, mai preferabil aproximativ 5 până la aproximativ 60, aproximativ 10 până la aproximativ 50 sau aproximativ 20 până la aproximativ 50 mg/kg greutate corporală. În funcţie de gravitatea afecţiunii, frecvenţa şi durata tratamentului pot fi ajustate. În anumite variante de realizare, anticorpul sau fragmentul acestuia care se leagă de antigen conform invenţiei poate fi administrat ca o doză iniţială de cel puţin aproximativ 0,1 mg până la aproximativ 800 mg, aproximativ 1 până la aproximativ 500 mg, aproximativ 5 până la aproximativ 300 mg sau aproximativ 10 până la aproximativ 200 mg, până la aproximativ 100 mg sau până la aproximativ 50 mg. În anumite variante de realizare, doza iniţială poate fi urmată de administrarea unei a doua sau a mai multor doze ulterioare de anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia într-o cantitate care poate fi aproximativ aceeaşi sau mai mică decât cea a dozei iniţiale, în care dozele ulterioare sunt separate de cel puţin 1 zi până la 3 zile; cel puţin o săptămână, cel puţin 2 săptămâni; cel puţin 3 săptămâni; cel puţin 4 săptămâni; cel puţin 5 săptămâni; cel puţin 6 săptămâni; cel puţin 7 săptămâni; cel puţin 8 săptămâni; cel puţin 9 săptămâni; cel puţin 10 săptămâni; cel puţin 12 săptămâni; sau cel puţin 14 săptămâni.

[0264] Diverse sisteme de administrare sunt cunoscute şi pot fi utilizate pentru a administra compoziţia farmaceutică a invenţiei, de exemplu, încapsularea în liposomi, microparticule, microcapsule, celule recombinante capabile să exprime virusurile mutante, endocitoza mediată de receptori (vezi, de exemplu, Wu şi colab. ( 1987) J. Biol. Chim. 262:4429-4432). Metodele de administrare includ, dar nu se limitează la, căile intradermică, transdermică, intramusculară, intraperitoneală, intravenoasă, subcutanată, intranazală, epidurală şi orală. Compoziţia poate fi administrată pe orice cale convenabilă, de exemplu prin perfuzie sau injecţie în bolus, prin absorbţie prin mucoasele epiteliale sau mucocutanate (de exemplu, mucoasa orală, mucoasa rectală şi intestinală etc.) şi poate fi administrată împreună cu alţi agenţi biologic activi. Administrarea poate fi sistemică sau locală. Compoziţia farmaceutică poate fi administrată şi într-o veziculă, în special un lipozom (vezi, de exemplu, Langer (1990) Science 249: 1527-1533).

[0265] Utilizarea nanoparticulelor pentru a elibera anticorpii prezentei invenţii este, de asemenea, avută în vedere aici. Nanoparticulele conjugate cu anticorpi pot fi utilizate atât în aplicaţii terapeutice, cât şi diagnostice. Nanoparticulele conjugate cu anticorpi şi metodele de preparare şi utilizare sunt descrise în detaliu de Arruebo, M. şi colab. 2009 („Nanoparticule conjugate cu anticorpi pentru aplicaţii biomedicale» în J. Nanomat. Volumul 2009, ID articol 439389, 24 pagini, doi: 10.1 155/2009/439389). Nanoparticulele pot fi dezvoltate şi conjugate cu anticorpi conţinuţi în compoziţii farmaceutice pentru a viza celulele infectate viral. Nanoparticulele pentru administrarea de medicamente au fost descrise şi în, de exemplu, brevetele US 8257740 sau US 8246995.

[0266] În anumite situaţii, compoziţia farmaceutică poate fi administrată într-un sistem cu eliberare controlată. Într-o formă de realizare, se poate utiliza o pompă. Într-o altă variantă de realizare, se pot utiliza materiale polimerice. Într-o altă formă de realizare, un sistem cu eliberare controlată poate fi plasat în apropierea ţintei compoziţiei, necesitând astfel doar o fracţiune din doza sistemică.

[0267] Preparatele injectabile pot include forme farmaceutice pentru injecţii intravenoase, subcutanate, intracutanate, intracraniene, intraperitoneale şi intramusculare, perfuzii prin picurare etc. Aceste preparate injectabile pot fi preparate prin metode cunoscute publicului. De exemplu, preparatele injectabile pot fi preparate, de exemplu, prin dizolvarea, suspendarea sau emulsionarea anticorpului sau a sării sale descrise mai sus într-un mediu apos steril sau într-un mediu uleios utilizat în mod convenţional pentru injecţii. Ca mediu apos pentru injecţii, există, de exemplu, soluţie salină fiziologică, o soluţie izotonică care conţine glucoză şi alţi agenţi auxiliari etc., care pot fi utilizaţi în combinaţie cu un agent de solubilizare adecvat, cum ar fi un alcool (de exemplu, etanol), un polialcool (de exemplu, propilen glicol, polietilen glicol), un surfactant neionic [de exemplu, polisorbat 80, HCO-50 (aduct de polioxietilenă (50 mol) din ulei de ricin hidrogenat)] etc. Ca mediu uleios se utilizează, de exemplu, ulei de susan, ulei de soia etc., care pot fi utilizaţi în combinaţie cu un agent de solubilizare, cum ar fi benzoatul de benzil, alcoolul benzilic etc. Injecţia astfel preparată se introduce, de preferinţă, într-o fiolă adecvată.

[0268] O compoziţie farmaceutică conform prezentei invenţii poate fi administrată subcutanat sau intravenos cu un ac şi o seringă standard. În plus, în ceea ce priveşte administrarea subcutanată, un dispozitiv de administrare prin stilou injector (pen) are aplicaţii în administrarea unei compoziţii farmaceutice conform prezentei invenţii. Un astfel de dispozitiv de administrare a stiloului injector (pen) poate fi reutilizabil sau de unică folosinţă. Un dispozitiv reutilizabil de administrare a unui stilou injector (pen) utilizează, în general, un cartuş înlocuibil care conţine o compoziţie farmaceutică. Odată ce toată compoziţia farmaceutică din cartuş a fost administrată şi cartuşul este gol, acesta poate fi uşor aruncat şi înlocuit cu un cartuş nou care conţine compoziţia farmaceutică. Dispozitivul de administrare a stiloului injector (pen-ului) poate fi apoi reutilizat. Într-un dispozitiv de administrare cu stilou injector (pen) de unică folosinţă, nu există un cartuş înlocuibil. Mai degrabă, dispozitivul de administrare cu stilou injector (pen) de unică folosinţă vine preumplut cu compoziţia farmaceutică ţinută într-un rezervor din interiorul dispozitivului. Odată ce rezervorul este golit de compoziţia farmaceutică, întregul dispozitiv este aruncat.

[0269] Numeroase dispozitive reutilizabile de administrare sub formă de stilou injector (pen) şi autoinjector au aplicaţii în administrarea subcutanată a unei compoziţii farmaceutice conform prezentei invenţii. Exemplele includ, dar cu siguranţă nu se limitează la, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Marea Britanie), stiloul injector DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Elveţia), stiloul injector HUMALOG M IX 75/25™, stiloul injector HUMALOG™, stiloul injector HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, I N), NOVOPEN™ I, I I şi I I I (Novo Nordisk, Copenhaga, Danemarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhaga, Danemarca), stiloul injector BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ şi OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germania), ca să numim doar câteva. Exemple de dispozitive de administrare sub formă de stilou injector (pen) de unică folosinţă, cu aplicaţii în administrarea subcutanată a unei compoziţii farmaceutice conform prezentei invenţii, includ, dar cu siguranţă nu se limitează la, stiloul injector SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) şi KWIKPEN™ (Eli Lilly), autoinjectorul SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germania), EPIPEN (Dey, L.P.) şi stiloul injector HUM IRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), pentru a numi doar câteva.

[0270] În mod avantajos, compoziţiile farmaceutice pentru administrare orală sau parenterală descrise mai sus sunt preparate în forme farmaceutice într-o doză unitară adecvată pentru a se potrivi unei doze de ingrediente active. Astfel de forme de dozare într-o doză unitară includ, de exemplu, tablete, pilule, capsule, injecţii (fiole), supozitoare etc. Cantitatea de anticorp conţinută este în general de aproximativ 5 până la aproximativ 500 mg per formă de dozare într-o doză unitară; în special sub formă de injecţie, este de preferat ca anticorpul să fie conţinut în aproximativ 5 până la aproximativ 100 mg şi în aproximativ 10 până la aproximativ 250 mg pentru celelalte forme de dozare.

[0271] Utilizări terapeutice ale anticorpilor

[0272] Anticorpii prezentei dezvăluiri sunt utili pentru tratamentul şi/sau prevenirea unei boli, tulburări sau afecţiuni asociate cu infecţia cu virusul Ebola şi/sau pentru ameliorarea a cel puţin unui simptom asociat cu o astfel de boală, tulburare sau afecţiune.

[0273] În anumite aspecte, anticorpii invenţiei sunt utili pentru tratarea subiecţilor care suferă de infecţia respiratorie severă şi acută cauzată de virusul Ebola. În unele variante de realizare, anticorpii invenţiei sunt utili în scăderea titrurilor virale sau în reducerea încărcăturii virale în gazdă. Într-o formă de realizare, un anticorp sau un fragment al acestuia care se leagă de antigen, conform invenţiei, poate fi administrat într-o doză terapeutică unui pacient cu infecţie cu virusul Ebola.

[0274] Unul sau mai mulţi anticorpi conform prezentei dezvăluiri pot fi administraţi pentru a ameliora, preveni sau reduce severitatea unuia sau mai multor simptome sau afecţiuni ale bolii sau tulburării. Anticorpii pot fi utilizaţi pentru a ameliora sau a reduce severitatea a cel puţin unui simptom al infecţiei cu virusul Ebola, inclusiv, dar fără a se limita la, febră, dureri de cap, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile.

[0275] De asemenea, se are în vedere utilizarea profilactică a unuia sau mai multor anticorpi conform prezentei dezvăluiri la subiecţii cu risc de a dezvolta o infecţie cu virusul Ebola, cum ar fi persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană suspectată că a fost expusă la o persoană care purtă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate, un angajat al unui spital, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola sau un călător frecvent.

[0276] Într-un alt aspect al dezvăluirii, anticorpii prezenţi sunt utilizaţi pentru prepararea unei compoziţii farmaceutice pentru tratarea pacienţilor care suferă de o infecţie cu virusul Ebola. Într-o altă formă de realizare a invenţiei, anticorpii prezenţi sunt utilizaţi ca terapie adjuvantă cu orice alt agent sau orice altă terapie cunoscută de specialiştii în domeniu, utilă pentru tratarea sau ameliorarea unei infecţii cu virusul Ebola.

[0277] Terapii combinate

[0278] Terapiile combinate pot include un anticorp GP anti-virusul Ebola conform invenţiei şi orice agent terapeutic suplimentar care poate fi combinat în mod avantajos cu un anticorp conform invenţiei sau cu un fragment biologic activ al unui anticorp conform invenţiei. Anticorpii prezentei invenţii pot fi combinaţi sinergic cu unul sau mai multe medicamente sau agenţi utilizaţi pentru tratarea infecţiei cu virusul Ebola.

[0279] De exemplu, agenţii exemplificativi pentru tratarea unei infecţii virale pot include, de exemplu, un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (cum ar fi corticosteroizii şi medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva virusului Ebola, un vaccin pentru virusul Ebola, terapia ZMapp, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola), interferoni sau orice altă terapie paliativă pentru tratarea unei infecţii cu virusul Ebola.

[0280] În unele aspecte, anticorpii dezvăluirii pot fi combinaţi cu un al doilea agent terapeutic pentru a reduce încărcătura virală la un pacient cu infecţie cu virusul Ebola sau pentru a ameliora unul sau mai multe simptome ale infecţiei.

[0281] În anumite aspecte, al doilea agent terapeutic este un alt anticorp diferit sau un amestec de anticorpi specific pentru GP-ul virusului Ebola, în care anticorpul sau anticorpii diferiţi din amestec se pot lega sau nu de acelaşi epitop sau de un epitop suprapus, ca un anticorp al prezentei invenţii. În anumite variante de realizare, al doilea agent terapeutic este un anticorp împotriva unei proteine diferite a virusului Ebola. Al doilea anticorp poate fi specific pentru una sau mai multe proteine diferite ale virusului Ebola din diferite tulpini ale virusului. Se are în vedere în prezenta invenţie utilizarea unei combinaţii („cocktail») a anticorpilor conform invenţiei cu activitate de neutralizare sau inhibitorie împotriva virusului Ebola. În unele variante de realizare, anticorpii necompetitori pot fi combinaţi şi administraţi unui subiect care are nevoie de aceştia, pentru a reduce capacitatea virusului Ebola de a scăpa din cauza mutaţiei. În unele variante de realizare, anticorpii care cuprind combinaţia se leagă de epitopi distincti care nu se suprapun pe GP. Anticorpii care cuprind combinaţia pot bloca ataşarea şi/sau intrarea virusului în şi/sau fuziunea cu celulele gazdă. Anticorpii pot interacţiona cu GP dintr-o tulpină de EBOV selectată din Zair, Sudan, Bundibugyo sau Coasta de Fildeş şi, atunci când sunt utilizaţi singuri sau în combinaţie cu oricare unul sau mai mulţi dintre agenţii menţionaţi mai sus, pot neutraliza oricare una sau mai multe dintre tulpinile de virus Ebola menţionate.

[0282] De asemenea, se are în vedere utilizarea unei combinaţii de anticorpi GP anti-virusul Ebola conform prezentei invenţii, în care combinaţia cuprinde unul sau mai mulţi anticorpi care nu intră în concurenţă încrucişată. În anumite variante de realizare, combinaţia include un cocktail care cuprinde un amestec de cel puţin trei anticorpi conform invenţiei. Anticorpii din cadrul amestecului pot diferi în ceea ce priveşte capacitatea lor de a neutraliza virusul sau celulele infectate cu virusul, capacitatea lor de a media citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC) sau capacitatea lor de a se lega de glicoproteina solubilă (sGP) a EBOV.

[0283] Aşa cum este utilizat aici, termenul „în combinaţie cu» înseamnă că se pot administra componente suplimentare active terapeutic înainte de, concomitent cu sau după administrarea a cel puţin unui anticorp GP anti-virus Ebola conform invenţiei sau a unui cocktail care cuprinde unul sau mai mulţi dintre anticorpii conform prezentei invenţii. Termenul „în combinaţie cu» include, de asemenea, administrarea secvenţială sau concomitentă a unui anticorp GP anti-virusul Ebola şi a unui al doilea agent terapeutic.

[0284] Componenta (componentele) terapeutic(e) activă(e) suplimentară (suplimentare) poate (pot) fi administrată (administrate) unui subiect înainte de administrarea unui anticorp GP anti-virusul Ebola conform prezentei invenţii. De exemplu, o primă componentă poate fi considerată administrată „înainte de» o a doua componentă dacă prima componentă este administrată cu 1 săptămână înainte, cu 72 de ore înainte, cu 60 de ore înainte, cu 48 de ore înainte, cu 36 de ore înainte, cu 24 de ore înainte, cu 12 ore înainte, cu 6 ore înainte, cu 5 ore înainte, cu 4 ore înainte, cu 3 ore înainte, cu 2 ore înainte, cu 1 oră înainte, cu 30 de minute înainte, cu 15 minute înainte, cu 10 minute înainte, cu 5 minute înainte sau cu mai puţin de 1 minut înainte de administrarea celei de-a doua componente. În alte variante de realizare, componenta (componentele) terapeutic activă (active) suplimentară (suplimentare) poate (pot) fi administrată (administrate) unui subiect după administrarea unui anticorp GP anti-virusul Ebola conform prezentei invenţii. De exemplu, o primă componentă poate fi considerată administrată „după» o a doua componentă dacă prima componentă este administrată la 1 minut, la 5 minute, la 10 minute, la 15 minute, la 30 de minute, la 1 oră, la 2 ore, la 3 ore, la 4 ore, la 5 ore, la 6 ore, la 12 ore, la 24 de ore, la 36 de ore, la 48 de ore, la 60 de ore, la 72 de ore după administrarea celei de-a doua componente. În alte variante de realizare, componenta (componentele) terapeutic activă (active) suplimentară (suplimentare) poate (pot) fi administrată (administrate) unui subiect concomitent cu administrarea unui anticorp GP anti-virusul Ebola conform prezentei invenţii. Administrarea „concomitentă», în sensul prezentei invenţii, include, de exemplu, administrarea unui anticorp GP anti-virusul Ebola şi a unei componente active terapeutic suplimentare la un subiect într-o singură formă de dozare sau în forme de dozare separate administrate subiectului la un interval de aproximativ 30 de minute sau mai puţin una de cealaltă. Dacă se administrează în forme farmaceutice separate, fiecare formă farmaceutică poate fi administrată pe aceeaşi cale (de exemplu, atât anticorpul GP anti-virus Ebola, cât şi componenta terapeutic activă suplimentară pot fi administrate intravenos etc.); alternativ, fiecare formă farmaceutică poate fi administrată pe o cale diferită (de exemplu, anticorpul GP anti-virus Ebola poate fi administrat intravenos, iar componenta terapeutic activă suplimentară poate fi administrată oral). În orice caz, administrarea componentelor într-o singură doză, în forme de dozare separate pe aceeaşi cale sau în forme de dozare separate pe căi diferite este considerată „administrare concomitentă» în sensul prezentei dezvăluiri. În sensul prezentei dezvăluiri, administrarea unui anticorp GP anti-virus Ebola „înainte de», „concomitent cu» sau „după» (aşa cum sunt definiţi aceşti termeni mai sus) administrarea unei componente terapeutic active suplimentare este considerată administrarea unui anticorp GP anti-virus Ebola „în combinaţie cu» o componentă terapeutic activă suplimentară.

[0285] Prezenta dezvăluire include compoziţii farmaceutice în care un anticorp GP anti-virusul Ebola al prezentei invenţii este co-formulat cu una sau mai multe dintre componentele terapeutice active suplimentare, aşa cum sunt descrise în altă parte a acestui document.

[0286] Regimuri de administrare

[0287] Conform anumitor variante de realizare, o singură doză de anticorp GP anti-virus Ebola conform invenţiei (sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde o combinaţie de anticorp GP anti-virus Ebola şi oricare dintre agenţii activi terapeutic suplimentari menţionaţi aici) poate fi administrată unui subiect care are nevoie de aceasta. Conform anumitor forme de realizare ale prezentei invenţii, se pot administra unui subiect doze multiple de anticorp GP anti-virus Ebola (sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde o combinaţie de anticorp GP anti-virus Ebola şi oricare dintre agenţii activi terapeutic suplimentari menţionaţi aici) pe parcursul unei perioade de timp definite. Metodele conform acestui aspect al invenţiei includ administrarea secvenţială către un subiect a unor doze multiple de anticorp GP anti-virus Ebola conform invenţiei. Aşa cum este utilizat aici, „administrare secvenţială» înseamnă că fiecare doză de anticorp GP anti-virusul Ebola este administrată subiectului la un moment diferit în timp, de exemplu, în zile diferite, separate de un interval predeterminat (de exemplu, ore, zile, săptămâni sau luni). Prezenta dezvăluire include metode care constau în administrarea secvenţială pacientului a unei singure doze iniţiale de anticorp GP anti-virus Ebola, urmată de una sau mai multe doze secundare de anticorp GP anti-virus Ebola şi, opţional, urmată de una sau mai multe doze terţiare de anticorp GP anti-virus Ebola.

[0288] Termenii „doză iniţială», „doze secundare» şi „doze terţiare» se referă la secvenţa temporală de administrare a anticorpului GP anti-virusul Ebola conform invenţiei. Astfel, „doza iniţială» este doza administrată la începutul schemei de tratament (denumită şi „doză de bază»); „dozele secundare» sunt dozele administrate după doza iniţială; iar „dozele terţiare» sunt dozele administrate după dozele secundare. Dozele iniţială, secundară şi terţiară pot conţine aceeaşi cantitate de anticorpi GP anti-virusul Ebola, dar, în general, pot diferi unele de altele în ceea ce priveşte frecvenţa de administrare. În anumite variante de realizare, totuşi, cantitatea de anticorpi GP anti-virusul Ebola conţinută în dozele iniţiale, secundare şi/sau terţiare variază una de la alta (de exemplu, ajustată în sus sau în jos, după caz) pe parcursul tratamentului. În anumite variante de realizare, două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4 sau 5) doze sunt administrate la începutul schemei de tratament ca „doze de încărcare», urmate de doze ulterioare care sunt administrate mai rar (de exemplu, „doze de întreţinere»).

[0289] În anumite aspecte exemplificative ale prezentei dezvăluiri, fiecare doză secundară şi/sau terţiară este administrată la 1 până la 48 de ore (de exemplu, 1, 1 ½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11 ½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21 ½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25 25½, 26, 26½ sau mai mult) după doza imediat precedentă. Expresia „doza imediat precedentă», aşa cum este utilizată aici, înseamnă, într-o secvenţă de administrări multiple, doza de anticorp GP anti-virusul Ebola, care este administrată unui pacient înainte de administrarea următoarei doze din secvenţa fără doze intermediare.

[0290] Metodele conform acestui aspect al dezvăluirii pot cuprinde administrarea către un pacient a oricărui număr de doze secundare şi/sau terţiare dintr-un anticorp GP anti-virusul Ebola. De exemplu, în anumite variante de realizare, pacientului i se administrează o singură doză secundară. În alte variante de realizare, pacientului i se administrează două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau mai multe) doze secundare. În mod similar, în anumite variante de realizare, pacientului i se administrează o singură doză terţiară. În alte variante de realizare, pacientului i se administrează două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau mai multe) doze terţiare.

[0291] În anumite aspecte ale dezvăluirii, frecvenţa la care dozele secundare şi/sau terţiare sunt administrate unui pacient poate varia pe parcursul schemei de tratament. Frecvenţa administrării poate fi, de asemenea, ajustată în timpul tratamentului de către un medic, în funcţie de nevoile fiecărui pacient în parte, în urma examenului clinic.

[0292] Utilizări diagnostice ale anticorpilor

[0293] Anticorpii GP anti-virus Ebola conform prezentei invenţii pot fi utilizaţi pentru a detecta şi/sau măsura virusul Ebola într-o probă, de exemplu, în scopuri diagnostice. Unele variante de realizare prevăd utilizarea unuia sau mai multor anticorpi ai prezentei invenţii în teste pentru detectarea unei boli sau a unei tulburări, cum ar fi o infecţie virală. Testele de diagnostic exemplare pentru virusul Ebola pot cuprinde, de exemplu, punerea în contact a unei probe, obţinute de la un pacient, cu un anticorp GP anti-virus Ebola conform invenţiei, în care anticorpul GP anti-virus Ebola este marcat cu un marker sau o moleculă reporter detectabilă sau utilizat ca ligand de captură pentru a izola selectiv virusul Ebola din probele pacientului. Alternativ, un anticorp GP anti-virus Ebola nemarcat poate fi utilizat în aplicaţii de diagnostic în combinaţie cu un anticorp secundar care este el însuşi marcat detectabil. Marcajul sau molecula reporter detectabilă poate fi un radioizotop, cum ar fi 3H, 14C, 32P, 35S, sau 125I; o grupare fluorescentă sau chemiluminiscentă, cum ar fi izotiocianatul de fluoresceină sau rodamina; sau o enzimă, cum ar fi fosfataza alcalină, β-galactozidaza, peroxidaza de hrean sau luciferaza. Printre testele specifice exemplificative care pot fi utilizate pentru detectarea sau măsurarea virusului Ebola într-o probă se numără testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), radioimunoanaliză (RIA) şi sortare celulară activată prin fluorescenţă (FACS).

[0294] Probele care pot fi utilizate în testele de diagnostic ale virusului Ebola conform prezentei invenţii includ orice probă de ţesut sau fluid obţinută de la un pacient, care conţine cantităţi detectabile fie de virus Ebola, fie de fragmente ale acestuia, în condiţii normale sau patologice. În general, nivelurile de virus Ebola dintr-o anumită probă obţinută de la un pacient sănătos (de exemplu, un pacient care nu este afectat de o boală asociată cu virusul Ebola) vor fi măsurate pentru a stabili iniţial un nivel de bază sau standard al virusului Ebola. Acest nivel iniţial al virusului Ebola poate fi apoi comparat cu nivelurile virusului Ebola măsurate în probele obţinute de la persoane suspectate de a avea o afecţiune asociată cu virusul Ebola sau simptome asociate cu o astfel de afecţiune.

[0295] Anticorpii specifici pentru virusul Ebola pot să nu conţină marcaje sau fragmente suplimentare sau pot conţine o marcajă sau un fragment N-terminal sau C-terminal. Într-o formă de realizare, marcajul sau gruparea este biotina. Într-un test de legare, locaţia unui marker (dacă există) poate determina orientarea peptidei faţă de suprafaţa pe care este legată peptida. De exemplu, dacă o suprafaţă este acoperită cu avidină, o peptidă care conţine o biotină N-terminală va fi orientată astfel încât porţiunea C-terminală a peptidei să fie distală de suprafaţă.

[0296] EXEMPLE

[0297] Următoarele exemple sunt prezentate pentru a oferi specialiştilor în domeniu o dezvăluire şi o descriere completă a modului de realizare şi utilizare a metodelor şi compoziţiilor invenţiei şi nu au scopul de a limita domeniul de aplicare al ceea ce inventatorii consideră a fi invenţia lor. S-au depus eforturi pentru a asigura acurateţea în ceea ce priveşte numerele utilizate (de exemplu, cantităţi, temperatură etc.), dar trebuie luate în considerare unele erori şi abateri experimentale. Dacă nu se specifică altfel, părţile sunt părţi în greutate, greutatea moleculară este greutatea moleculară medie, temperatura este în grade Celsius, temperatura camerei este de aproximativ 25°C, iar presiunea este la sau aproape de cea atmosferică.

[0298] Exemplul 1: Generarea de anticorpi umani împotriva virusului Ebola

[0299] Anticorpii umani împotriva virusului Ebola au fost generaţi la un şoarece care cuprinde ADN care codifică regiunile variabile ale lanţului greu al imunoglobulinei umane şi ale lanţului uşor kappa. Într-o formă de realizare, anticorpii umani împotriva virusului Ebola au fost generaţi într-un şoarece VELOCIMMUNE®. Într-o formă de realizare, şoarecii Veloclmmune® (VI) au fost imunizaţi cu ADN care codifică GP-ul virusului Ebola de lungime completă [Zaire ebolavirus 2014 (GenBank: KJ660346.2)]. Anticorpii au fost generaţi în urma unui regim accelerat care a cuprins 2 imunizări la un interval de 2 săptămâni. Răspunsul imun al anticorpilor a fost monitorizat printr-un test imunospecific GP-ului virusului Ebola. De exemplu, serurile au fost analizate pentru titruri specifice de anticorpi împotriva GP-ului EBOV purificat de lungime completă, proteinelor GP din subunităţi (GP1 şi GP2) şi particulelor asemănătoare virusurilor (VLP) care exprimă GP-ul EBOV. Clonele producătoare de anticorpi au fost izolate utilizând atât tehnologia de sortare a celulelor B (BST), cât şi metodele hibridomului. De exemplu, atunci când s-a obţinut un răspuns imun dorit, splenocitele au fost recoltate şi fuzionate cu celule de mielom de şoarece pentru a le păstra viabilitatea şi a forma linii celulare de hibridom. Liniile celulare de hibridom au fost analizate şi selectate pentru a identifica liniile celulare care produc anticorpi specifici GP-ului virusului Ebola. Folosind această tehnică şi diverşii imunogeni descrişi mai sus, s-au obţinut mai mulţi anticorpi himerici (adică anticorpi care posedă domenii variabile umane şi domenii constante de şoarece); anticorpii exemplificaţi generaţi în acest mod au fost desemnaţi ca H1M 17354N, H2aM 17356N, H1M 17357N, H2aM 17358N, H2aM 17359N şi H2aM 17360N.

[0300] Anticorpii anti-virusul Ebola au fost, de asemenea, izolaţi direct din celulele B de şoarece antigen-pozitive fără fuziune cu celulele de mielom, aşa cum este descris în brevetul american 7582298. Folosind această metodă, au fost obţinuţi mai mulţi anticorpi GP complet umani anti-virusul Ebola (adică anticorpi care posedă domenii variabile umane şi domenii constante umane); anticorpii exemplificativi generaţi în acest mod au fost desemnaţi ca H1 H 17134P, H1 H17139P, H1 H 17142P, H1 H17151 P, H1 H17161 P, H1 H17162P, H1 H17193P, H1 H17196P, H1 H 17199P, H1 H17203P, H1 H17214P, H1 H17219P, H1 H17223P şi H1 H17228P.

[0301] Proprietăţile biologice ale anticorpilor exemplificaţi generaţi în conformitate cu metodele din acest exemplu sunt descrise în detaliu în exemplele prezentate mai jos.

[0302] Exemplul 2: Aminoacid şi nucleotid cu regiuni variabile ale lanţurilor grele şi uşoare

[0303] Secvenţe

[0304] Tabelul 1 prezintă identificatorii de secvenţă de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţurilor greu şi uşor şi CDR-urile anticorpilor anti-virus Ebola selectaţi conform invenţiei. Identificatorii de secvenţă de acid nucleic corespunzători sunt prezentaţi în Tabelul 2.

[0305] Tabelul 1: Identificatori de secvenţă de aminoacizi

SEQ ID NO:

Denumire anticorp

HCVR

HCDR1

HCDR2

HCDR3

LCVR

LCDR1

LCDR2

LCDR3

H1H17134P

2

4

6

8

10

12

14

16

H1H17139P

18

20

22

24

26

28

30

32

H1H17142P

34

36

38

40

42

44

46

48

H1H17151P

50

52

54

56

58

60

62

64

H1H17161P

66

68

70

72

74

76

78

80

H1H17162P

82

84

86

88

90

92

94

96

H1H17193P

98

100

102

104

106

108

110

112

H1H17196P

114

116

118

120

122

124

126

128

H1H17199P

130

132

134

136

138

140

142

144

H1H17203P

146

148

150

152

154

156

158

160

H1H17214P

162

164

166

168

170

172

174

176

H1H17219P

178

180

182

184

186

188

190

192

H1H17223P

194

196

198

200

202

204

206

208

H1H17228P

210

212

214

216

218

220

222

224

H1H17354N

226

228

230

232

234

236

238

240

H1H17356N

242

244

246

248

250

252

254

256

H1H17357N

258

260

262

264

266

268

270

272

H1H17358N2

274

276

278

280

282

284

286

288

H1H17359N

290

292

294

296

298

300

302

304

H1H17360N

306

308

310

312

282

284

286

288

H1M17354N

226

228

230

232

234

236

238

240

H2aM17356N

242

244

246

248

250

252

254

256

H1M17357N

258

260

262

264

266

268

270

272

H2aM17358N

274

276

278

280

282

284

286

288

H2aM17359N

290

292

294

296

298

300

302

304

H2aM17360N

306

308

310

312

282

284

286

288

[0307] Tabelul 2: Identificatori de secvenţă de acid nucleic

SEQ ID NOs:

Denumire anticorp

HCVR

HCDR1

HCDR2

HCDR3

LCVR

LCDR1

LCDR2

LCDR3

H1H17134P

1

3

5

7

9

11

13

15

H1H17139P

17

19

21

23

25

27

29

31

H1H17142P

33

35

37

39

41

43

45

47

H1H17151P

49

51

53

55

57

59

61

63

[0309] (continuare)

SEQ ID NO:

Denumire anticorp

HCVR

HCDR1

HCDR2

HCDR3

LCVR

LCDR1

LCDR2

LCDR3

H1H17161P

65

67

69

71

73

75

77

79

H1H17162P

81

83

85

87

89

91

93

95

H1H17193P

97

99

101

103

105

107

109

111

H1H17196P

113

115

117

119

121

123

125

127

H1H17199P

129

131

133

135

137

139

141

143

H1H17203P

145

147

149

151

153

155

157

159

H1H17214P

161

163

165

167

169

171

173

175

H1H17219P

177

179

181

183

185

187

189

191

H1H17223P

193

195

197

199

201

203

205

207

H1H17228P

209

211

213

215

217

219

221

223

H1H17354N

225

227

229

231

233

235

237

239

H1H17356N

241

243

245

247

249

251

253

255

H1H17357N

257

259

261

263

265

267

269

271

H1H17358N2

273

275

277

279

281

283

285

287

H1H17359N

289

291

293

295

297

299

301

303

H1H17360N

305

307

309

311

281

283

285

287

H1M17354N

225

227

229

231

233

235

237

239

H2aM17356N

241

243

245

247

249

251

253

255

H1M17357N

257

259

261

263

265

267

269

271

H2aM17358N

273

275

277

279

281

283

285

287

H2aM17359N

289

291

293

295

297

299

301

303

H2aM17360N

305

307

309

311

281

283

285

287

[0311] Anticorpii sunt denumiţi în mod obişnuit în acest document conform următoarei nomenclaturi: prefixul Fc (de exemplu „H1 H», „H2M» etc.), urmat de un identificator numeric (de exemplu, „17139», „17161» etc., aşa cum se arată în Tabelul 1 sau 2), urmat de un sufix „P», „P2», „N», N2 sau „B». Prefixele H1, H şi H2M de pe denumirile anticorpilor utilizate aici indică izotipul particular al regiunii Fc a anticorpului. Astfel, conform acestei nomenclaturi, un anticorp poate fi denumit aici, de exemplu, Ή1Η17359Ν," "H2aM17359N," etc. De exemplu, un anticorp „H1 M» are un Fc lgG1 de şoarece, iar un anticorp „H2M» are un Fc lgG2 de şoarece (izotip a sau b) (toate regiunile variabile sunt complet umane, aşa cum este indicat de prima literă Ή' din denumirea anticorpului). După cum va fi de înţeles de către o persoană cu competenţe obişnuite în domeniu, un anticorp având un anumit izotip Fc poate fi convertit într-un anticorp cu un izotip Fc diferit (de exemplu, un anticorp cu un lgG1 Fc de şoarece poate fi convertit într-un anticorp cu un lgG4 uman etc.), dar în orice caz, domeniile variabile (inclusiv CDR-urile) - care sunt indicate de identificatorii numerici prezentaţi în Tabelul 1 sau 2 - vor rămâne aceleaşi, iar proprietăţile de legare la antigen sunt de aşteptat să fie identice sau substanţial similare, indiferent de natura domeniului Fc.

[0312] Exemplul 3: Legarea anticorpilor la GP-ul virusului Ebola, determinată prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă

[0313] A. Constanta ratei de disociere dependentă de pH la 37°C

[0314] Constantele ratei de disociere a legării (kd) şi timpii de înjumătăţire prin disociere (t½) pentru legarea GP a virusului Ebola la anticorpii monoclonali purificaţi anti-GP a virusului Ebola la 37°C au fost determinate utilizând un test cu biosenzor de rezonanţă plasmonică de suprafaţă în timp real pe un instrument Biacore T200. Suprafaţa senzorului CM4 Biacore a fost derivatizată prin cuplarea cu amină cu un anticorp monoclonal de şoarece anti-Fc uman (GE, # BR-1008-39) sau un anticorp monoclonal de capră anti-Fc de şoarece (GE, # BR-1008-38) pentru a captura anticorpi monoclonali GP purificaţi anti-virusul Ebola. Toate studiile de legare Biacore din Exemplul 3A au fost efectuate într-o soluţie tampon compusă din 0,01 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15 M NaCI, 0,05% v/v surfactant P20 (tampon de curgere PBS-P) la pH-uri de 7,4, 6,0 şi 5,0. Testul de detectare a pH-ului scăzut a fost efectuat pentru a evalua dacă anticorpii îşi menţin legarea la pH scăzut. Aceasta ar imita condiţiile pe care virusul le va întâlni în timpul fuziunii membranare, la acidificarea endosomului. Diferite concentraţii de GP a virusului Ebola cu o etichetă polihistidină C-terminală (EbolaGP.his; Sino Biologicals, Catalog # 40442-V08B1) preparate în tampon PBS-P (variind de la 90 nM la 11,1 nM, diluţii de 3 ori) au fost injectate peste suprafaţa captată de anticorpi monoclonali GP anti-virus Ebola la un debit de 25 μΙ/minute. Asocierea GP-ului virusului Ebola cu anticorpul monoclonal capturat a fost monitorizată timp de 5 minute, iar disocierea GP-ului virusului Ebola în tamponul PBS-P utilizat în proces a fost monitorizată timp de 6 minute. Toate experimentele cu constante de viteză de disociere au fost efectuate la 37°C. Constantele de viteză de disociere cinetică (kd) au fost determinate prin ajustarea senzorogramelor în timp real la un model de legare 1:1 folosind software-ul de ajustare a curbelor Scrubber 2.0c. Timpii de înjumătăţire disociativi (t½) au fost calculaţi din constantele de viteză cinetică ca:

[0315]

[0316] Parametrii ratei de disociere pentru legarea GP a virusului Ebola la anticorpii monoclonali GP purificaţi anti-virus Ebola la 37°C sunt prezentaţi în Tabelul 3.

[0317] Tabelul 3: Dependenţa timpilor de înjumătăţire disociativi de pH la 37°C

t½ Ratio

mAb Capturat

pH7.4 / pH6.0

pH7.4 / pH5.0

H1H1238N(‑) control

NB

NB

H1H17162P

0.3

0.3

H1H17177P

0.2

0.2

H1H17193P

1.1

0.8

H1H17196P

1.0

1.0

H1H17150P

0.2

0.2

H1H17151P

0.03

0.01

H1H17160P

0.2

0.4

H1H17161P

0.2

0.2

H1H17214P

1.0

1.0

H1H17219P

1.0

1.0

H1H17223P

0.4

0.4

H1H17228P

0.6

0.5

H1H17142P

0.5

0.5

H1H17141P

0.3

0.3

H1H17139P

0.2

0.2

H1H17134P

0.6

0.6

H1H17211P

6.7

3.0

H1H17210P

0.2

0.2

H1H17203P

0.2

0.1

H1H17199P

0.4

0.1

H1M17348N

0.3

0.4

H1M17349N

2.7

6.9

H1M17350N

0.1

1.1

H1M17351N

NB

NB

H1M17352N

1.1

1.1

H1M17353N

1.6

0.3

H1M17354N

1.3

1.3

H1M17357N

0.8

0.5

H2aM17355N

0.5

0.6

H2aM17356N

0.9

0.9

H2aM17358N

0.7

0.4

H2aM17359N

0.8

0.7

H2aM17360N

0.2

0.5

H2aM17361N

0.2

0.5

NB - Nicio legătură detectabilă în condiţiile de testare

[0319] B. Afinitate de legare şi cinetică la 25°C şi 37°C

[0320] Constantele de disociere la echilibru (valorile KD) pentru legarea GP-ului virusului Ebola la anticorpii monoclonali GP purificaţi anti-virus Ebola au fost determinate utilizând un biosenzor de rezonanţă plasmonică de suprafaţă în timp real, utilizând un instrument Biacore 4000. Suprafaţa senzorului CM4 Biacore a fost derivatizată prin cuplarea cu amină cu un anticorp monoclonal de şoarece anti-Fc uman (GE, # BR-1008-39) sau un anticorp monoclonal de capră anti-Fc de şoarece (GE, # BR-1008-38) pentru a captura anticorpi monoclonali GP purificaţi anti-virusul Ebola. Toate studiile de legare Biacore din Exemplul 3B au fost efectuate într-o soluţie tampon compusă din 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfactant P20 (tampon de funcţionare HBS-ET). Diferite concentraţii de GP a virusului Ebola cu o etichetă polihistidină C-terminală (Sino Biologicals, catalog # 40442-V08B1) preparate în tampon HBS-ET (variind de la 90 nM la 3,3 nM, diluţii de 3 ori) au fost injectate peste suprafaţa captată de anticorpul monoclonal GP anti-virus Ebola la un debit de 30 μΙ/minute. Asocierea GP-ului virusului Ebola cu anticorpul monoclonal capturat a fost monitorizată timp de 5 minute, iar disocierea GP-ului virusului Ebola în tamponul HBS-ET a fost monitorizată timp de 10 minute. Toate experimentele cinetice de legare au fost efectuate la 25°C şi 37°C. Constantele de viteză de asociere cinetică (ka) şi disociere (kd) au fost determinate prin ajustarea senzorogramelor în timp real la un model de legare 1:1 folosind software-ul de ajustare a curbelor Scrubber 2.0c. Constantele de echilibru ale disocierii de legare (KD) şi timpii de înjumătăţire disociativi (t½) au fost calculaţi din constantele de viteză cinetică astfel:

[0321]

[0322] Parametrii cinetici de legare pentru GP-ul virusului Ebola la anticorpii monoclonali GP purificaţi anti-virus Ebola la 25°C şi 37°C sunt prezentaţi în tabelele 4A şi 4B.

[0323] Tabelul 4A: Cinetica de legare la 25°C

mAb

ka (1/Ms)

kd (1/s)

KD (M)

t1/2 (min)

H1H17162P

2.18E+04

≤ 1E‑5

4.60E‑10

≥ 1155

H1H17177P

3.18E+03

1.12E‑05

3.53E‑09

1030.3

H1H17193P

4.58E+03

1.08E‑04

2.36E‑08

106.6

H1H17196P

2.56E+04

≤ 1E‑5

3.91E‑10

≥ 1155

H1H17150P

2.16E+04

5.42E‑05

2.51E‑09

213.1

H1H17151P

1.26E+04

9.44E‑05

7.49E‑09

122.3

H1H17160P

6.85E+04

3.76E‑03

5.48E‑08

3.1

H1H17161P

5.29E+04

≤ 1E‑5

1.89E‑10

≥ 1155

H1H17214P

3.76E+04

≤ 1E‑5

2.66E‑10

≥ 1155

H1H17219P

3.11E+04

2.90E‑05

9.34E‑10

398.3

H1H17223P

3.00E+04

6.08E‑05

2.03E‑09

190.0

H1H17228P

4.49E+04

1.69E‑03

3.76E‑08

6.9

H1H17142P

2.00E+04

2.81E‑05

1.41E‑09

410.7

H1H17141P

1.98E+04

9.69E‑05

4.90E‑09

119.2

H1H17139P

2.29E+04

1.63E‑04

7.13E‑09

70.8

H1H17134P

7.65E+04

9.41E‑04

1.23E‑08

12.3

H1H17211P

3.33E+04

2.14E‑04

6.43E‑09

54.0

H1H17210P

1.09E+02

2.06E‑04

1.89E‑06

56.0

H1H17203P

2.78E+04

1.68E‑04

6.04E‑09

68.7

H1H17199P

1.25E+04

2.36E‑04

1.89E‑08

49.0

H1M17348N

IC

IC

IC

IC

H1M17349N

7.03E+04

8.69E‑04

1.24E‑08

13.3

H1M17350N

IC

IC

IC

IC

H1M17351N

NB

NB

NB

NB

H1M17352N

IC

IC

IC

IC

H1M17353N

IC

IC

IC

IC

H1M17354N

4.94E+04

3.16E‑03

6.39E‑08

3.7

H1M17357N

IC

IC

IC

IC

H2aM17355N

1.44E+04

≤ 1E‑5

6.96E‑10

≥ 1155

H2aM17356N

2.18E+04

9.57E‑05

4.40E‑09

120.7

H2aM17358N

3.22E+02

2.01E‑04

6.23E‑07

57.5

H2aM17359N

3.82E+03

1.95E‑04

5.09E‑08

59.4

H2aM17360N

2.30E+04

1.06E‑05

4.63E‑10

1086.5

H2aM17361N

1.22E+02

1.25E‑04

1.02E‑06

92.5

NB - Nicio legătură detectabilă în condiţiile de testare Sensogramă de legare IC-inconcludentă pentru potrivire

[0325] Tabelul 4B Cinetica de legare la 37°C.

mAb

ka (1/Ms)

kd (1/s)

KD (M)

t1/2 (min)

H1H17162P

3.47E+04

≤ 1E‑5

2.88E‑10

≥ 1155

H1H17177P

1.68E+04

1.62E‑04

9.62E‑09

71.3

H1H17193P

1.58E+04

5.03E‑04

3.18E‑08

22.9

H1H17196P

3.16E+04

≤ 1E‑5

3.17E‑10

≥ 1155

H1H17150P

3.18E+04

3.94E‑05

1.24E‑09

292.8

H1H17151P

2.26E+04

3.83E‑04

1.70E‑08

30.2

H1H17160P

5.72E+04

5.63E‑03

9.85E‑08

2.1

H1H17161P

4.39E+04

≤ 1E‑5

2.28E‑10

≥ 1155

H1H17214P

3.67E+04

1.54E‑04

4.20E‑09

74.9

H1H17219P

4.41E+04

≤ 1E‑5

2.27E‑10

≥ 1155

H1H17223P

3.51E+04

2.42E‑04

6.89E‑09

47.7

H1H17228P

7.32E+04

3.83E‑03

5.23E‑08

3

H1H17142P

2.60E+04

1.74E‑04

6.68E‑09

66.6

H1H17141P

2.65E+04

2.92E‑04

1.10E‑08

39.6

H1H17139P

2.48E+04

5.12E‑04

2.06E‑08

22.5

H1H17134P

6.99E+04

4.69E‑04

6.70E‑09

24.6

H1H17211P

1.90E+04

7.31E‑04

3.84E‑08

15.8

H1H17210P

6.19E+02

6.12E‑04

9.89E‑07

18.9

H1H17203P

3.85E+04

1.19E‑03

3.09E‑08

9.7

H1H17199P

3.04E+04

1.28E‑03

4.22E‑08

9

H1M17348N

IC

IC

IC

IC

H1M17349N

1.77E+04

1.93E‑03

1.09E‑07

6

H1M17350N

4.84E+02

1.00E‑03

2.07E‑06

11.5

H1M17351N

NB

NB

NB

NB

H1M17352N

4.09E+04

1.55E‑03

3.80E‑08

7.4

H1M17353N

2.33E+02

5.38E‑04

2.31E‑06

21.5

H1M17354N

5.08E+04

5.73E‑03

1.13E‑07

2

H1M17357N

2.35E+04

1.84E‑03

7.81E‑08

6.3

H2aM17355N

1.99E+04

2.06E‑04

1.03E‑08

56.2

H2aM17356N

7.26E+03

2.50E‑04

3.44E‑08

46.2

H2aM17358N

1.07E+04

5.67E‑04

5.28E‑08

20.4

H2aM17359N

1.54E+04

3.52E‑04

2.29E‑08

32.8

H2aM17360N

2.43E+04

3.37E‑04

1.39E‑08

34.3

H2aM17361N

1.83E+04

4.15E‑04

2.27E‑08

27.8

NB - Nicio legătură detectabilă în condiţiile de testare IC- Sensogramă de legare neconcludentă pentru potrivire

[0327] Rezultate

[0328] Aşa cum se arată în tabelele 4A şi 4B de mai sus, anticorpii s-au legat de proteina GP a virusului Ebola cu valori K_D cuprinse între 934 pM şi 1890 nM la 25°C şi între 227 pM şi 231 OnM la 37°C. La pH 7,4, anticorpii au prezentat valori ale timpului de înjumătăţire disociativ (t½) cuprinse între 3,0 minute şi peste 1 155 minute la 25°C şi între 2,0 minute şi peste 1 155 minute la 37°C. Nu s-a observat nicio pierdere a legăturii la pH scăzut. Mai mulţi anticorpi au prezentat valori crescute ale timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH scăzut faţă de pH 7,4. Anticorpii cu creşteri de 3 ori sau mai mari ale valorilor timpului de înjumătăţire disociativ (t½) la pH 5 şi/sau pH 6 includ H1 H17162P, H1 H17177P, H1 H17150P, H1 H17151 P, H1 H17160P, H1 H17161 P, H1 H17141 P, H1 H17139P, H1 H17210P, H1 H17203P, H1 H17199P, H1 M17348N, H1 M17350N, H2aM17360N şi H2aM17361 N.

[0329] Exemplul 4: Generarea de pseudoparticule ale virusului Ebola şi studii de neutralizare

[0330] Pseudoparticulele virusului Ebola (numite şi particule de tip virus sau VLP) au fost generate prin co-transfectarea celulelor 293T cu un amestec de construcţii plasmidice care exprimă GP-ul virusului Ebola, gag-pol-ul HIV şi un vector proviral HIV care codifică luciferaza de licurici. Supernatantele conţinând pseudoparticule de virus Ebola au fost recoltate la 48 de ore după transfecţie, clarificate folosind centrifugare, alicotate şi congelate la -80°C. Pseudoparticulele de control au fost generate prin substituirea plasmidei care exprimă GP a virusului Ebola cu o plasmidă care codifică glicoproteina virusului stomatitei veziculare (VSVg).

[0331] Test de neutralizare bazat pe pseudoparticule de Ebola

[0332] Pseudoparticulele generate aşa cum s-a descris mai sus au fost testate în teste de neutralizare. Mai exact, diluţiile de anticorpi au fost incubate cu pseudoparticule ale virusului Ebola timp de 1 oră la temperatura camerei. Celulele Huh7 sunt detaşate folosind EDTA 0,02M, spălate şi incubate cu amestecurile de anticorpi/pseudoparticule timp de 72 de ore. Eficienţa infecţiei a fost cuantificată prin detectarea luciferazei cu testul de luciferază BrightGlo (Promega, San Luis Obispo, CA, SUA) şi citită într-un cititor de plăci Victor® X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, SUA) pentru producerea de lumină.

[0333] Tabelul 5: Neutralizarea VLP în Zair 2014

AB ID

ID-ul anticorpului hibridom corespunzător

Neutralizatorul Zairului 2014 VLP

IC50 (M)

H1H17134P

-

-

H1H17139P

-

-

H1H17142P

+

1.59E‑09

H1H17151P

+

1.51E‑09

H1H17161P

+

2.55E‑10

H1H17162P

+

2.86E‑10

H1H17193P

-

-

H1H17196P

+

1.68E‑09

H1H17199P

-

-

H1H17203P

+

8.68E‑10

H1H17214P

+

8.99E‑10

H1H17219P

+

6.95E‑10

H1H17223P

+

1.58E‑09

H1H17228P

+

3.26E‑09

H1M17354N

H1M17354N

-

-

H2aM17356N

H2aM17356N

+

4.77E‑09

H1M17357N

H1M17357N

-

-

H2aM17358N

H2aM17358N

+

4.68E‑09

H2aM17359N

H2aM17359N

+

3.36E‑09

H2aM17360N

H2aM17360N

+

3.75E‑09

[0335] Datele prezentate mai sus în Tabelul 5 arată că 14 din cei 20 de anticorpi anti-virusul Ebola ai prezentei invenţii, utilizând designul experimental descris aici, neutralizează puternic infecţiozitatea cu un IC50 cuprins între aproximativ 10-11 M şi aproximativ 10-9M.

[0336] Exemplul 5: Citotoxicitate mediată celular dependentă de anticorpi (ADCC) de către anticorpi anti-virusul Ebola

[0337] Citotoxicitatea mediată celular dependentă de anticorpi (ADCC) a fost testată prin capacitatea anticorpilor de a semnaliza prin intermediul unui sistem reporter bazat pe CD16 (kit Promega ADCC reporter bioassay core, San Luis Obispo, CA, SUA). Au fost însămânţate 293 de celule care exprimă GP-ul virusului Ebola. O zi mai târziu, se adaugă anticorpi diluaţi produşi în liniile celulare fuc- (vezi brevetul SUA nr. 8409838) şi celule efectoare (raport efector/ţintă de 1,5:1) şi se incubează peste noapte. Activitatea reporterului a fost măsurată cu testul BioGlo® luciferase (Promega, San Luis Obispo, CA, SUA) şi citită într-un cititor de plăci Victor® X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, SUA) pentru producerea de lumină.

[0338] Tabelul 6: Rezultate ADCC

ADCC Reporter Bioassay

Ab ID

Clone ID

ADCC Activity

H1H17134P

+

H1H17139P

+

H1H17142P

+

H1H17151P

+

H1H17161P

-

H1H17162P

-

H1H17193P

+

H1H17196P

+

H1H17199P

+

H1H17203P

+

H1H17214P

+

H1H17219P

-

H1H17223P

+

H1H17228P

+

H1M17354N

HCAF05C08‑22

+

H2aM17356N

HCAF08C07‑09

+

H1M17357N

HCAF09D11‑13

+

H2aM17358N

HCAF12C05‑14

+

H2aM17359N

HCAF12C06‑26

+

H2aM17360N

HCAF12G09‑07

+

[0340] Capacitatea anticorpilor de a media ADCC a fost calculată pe baza activităţii în comparaţie cu un control izotip (negativ). Orice valoare mai mare de 5 ori faţă de controlul negativ a fost considerată pozitivă. Datele de mai sus din Tabelul 6 arată că 17 din cei 20 de anticorpi anti-virusul Ebola au mediat ADCC.

[0341] Exemplul 6: Concurenţă încrucişată între octeţi

[0342] Competiţia de legare între anticorpii monoclonali anti-GP ai virusului Ebola, despre care s-a determinat anterior că se leagă de GP a virusului Ebola, a fost determinată utilizând un test de interferometrie cu biostrat (BLI) în timp real, fără marcaj, pe un biosenzor Octet HTX (ForteBio Corp., o divizie a Pall Life Sciences). Legarea controalelor relevante pentru GP solubilă (sGP), GP1 sau GP2 a fost măsurată în acelaşi format de analiză, iar răspunsul acesteia a fost scăzut din reactivul GP al virusului Ebola de interes pentru fiecare anticorp monoclonal testat. Întregul experiment a fost efectuat la 25°C într-o soluţie tampon compusă din 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfactant P20, 1,0 mg/ml BSA (tampon Octet HBS-ET), cu placa agitată la o viteză de 1000 rpm. Pentru a evalua dacă doi anticorpi sunt capabili să concureze unul cu celălalt pentru legarea la epitopii lor respectivi de pe GP-ul virusului Ebola exprimat cu o etichetă polihistidină C-terminală (GP-ul virusului Ebola.h, Sino Biologicals Inc., vezi şi GenBank AHX24649.1 şi SEQ ID NO: 314), aproximativ ~1,0 nm de GP-ul virusului Ebola au fost mai întâi capturaţi pe biosenzori Octet acoperiţi cu anticorpi anti-penta-His (Fortebio Inc, # 18-5079) prin imersarea biosenzorilor timp de 3 minute în godeuri care conţin o soluţie de GP-ul virusului Ebola de 2C^g/ml. Biosenzorii capturaţi cu antigen au fost apoi saturaţi cu primul anticorp monoclonal anti-GP-ul virusului Ebola (denumit ulterior mAb-1) prin imersarea în godeuri care conţin o soluţie de GP-ul virusului Ebola de 5C^g/ml timp de 5 minute. Biosenzorii au fost apoi imersaţi în godeuri conţinând o soluţie de 5C^g/ml dintr-un al doilea anticorp monoclonal GP anti-virusul Ebola (denumit ulterior mAb-2) timp de 3 minute. Toţi biosenzorii au fost spălaţi în tampon Octet HBS-ET între fiecare etapă a experimentului. Răspunsul de legare în timp real a fost monitorizat pe parcursul experimentului şi a fost înregistrat răspunsul de legare la sfârşitul fiecărei etape. Răspunsul legării mAb-2 la GP-ul virusului Ebola precomplexat cu mAb-1 a fost comparat, iar comportamentul competitiv/necompetitiv al diferiţilor anticorpi monoclonali anti-GP-ul virusului Ebola a fost determinat utilizând un prag de inhibare de 50%. Tabelul 7 defineşte explicit relaţiile anticorpilor care concurează în ambele direcţii, independent de ordinea de legare.

[0343] După cum se arată în Tabelul 7, coloana din stânga prezintă anticorpii mAb1 capturaţi folosind biosenzorii AHC Octet, iar coloana din dreapta prezintă anticorpii (mAb2) care intră în competiţie încrucişată cu anticorpul mAb1.

[0344] Tabelul 7: Competiţie încrucişată între anticorpii anti-GP ai virusului Ebola pentru legarea la GP a virusului Ebola

Primul anticorp monoclonal (mAb-1) capturat folosind biosenzori AHC Octet

Anticorpii mAb-2 s-au dovedit a concura cu mAb-1

H1H17160P

H1H17160P, H1M17354N, H1M17357N, H1H17228P, H1H17203P

H1M17354N

H1H17160P, H1M17354N, H1M17357N, H1H17228P, H1H17203P

H1M17357N

H1H17160P, H1M17354N, H1M17357N, H1H17228P, H1H17203P

H1H17228P

H1H17160P, H1M17354N, H1M17357N, H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N

H1H17203P

H1H17160P, H1M17354N, H1M17357N, H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N

H1H17151P

H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17353N, H1H17223P, H1H17196P, H1H17193P

H1H17142P

H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N,

H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1M17353N, H1H17223P, H1H17196P, H1H17193P

H1H17177P

H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17359N

H1H17228P, H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, 1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17141P, H1H17223P H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H1H17214P

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N H1H17141P, H1H17223P, H1H17139P H1H17193P, H1M17350N

H1H17199P

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17141P, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17358N

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17360N

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N H1M17353N, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H1M17352N

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17356N

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N H1M17353N, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17361N

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17139P, H1H17193P, H1M17350N

H2aM17355N

H1H17203P, H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N H1M17353N, H1H17193P, H1M17350N

H1H17211P

H1H17151P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N H1H17193P, H1M17350N

H1M17348N

H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17193P

H1M17350N

H1M17353N

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P, H1H17193P

H1H17141P

H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H1M17353N H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P

H1H17223P

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1M17353N H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P

H1H17196P

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H1M17353N, H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P

H1H17139P

H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H1M17353N H1H17141P, H1H17223P, H1H17196P, H1H17139P

H1H17193P

H1H17151P, H1H17142P, H1H17177P, H2aM17359N, HIH17214P, H1H17199P H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N H2aM17355N, H1H17211P, H1M17348N, H1M17353N, H1H17193P, H1M17350N

H1M17350N

H1H17177P, H2aM17359N, H1H17214P, H1H17199P, H2aM17358N, H2aM17360N, H1M17352N, H2aM17356N, H2aM17361N, H2aM17355N H1H17211P, H1M17348N, H1H17193P, H1M17350N

H1H17219P

H1H17219P, H1H17150P, H1H17161P

H1H17150P

H1H17219P, H1H17150P, H1H17161P

H1H17161P

H1H17219P, H1H17150P, H1H17161P

H1M17349N

H1M17349N

H1H17134P

H1H17134P

H1H17162P

H1H17162P

H1H17210P

H1H17210P

[0346] Exemplul 7: Legarea secvenţială a H1H17203P, H1H17139P şi H1H17161P la glicoproteina virusului Ebola

[0347] Pe baza informaţiilor obţinute din experimentele de competiţie încrucişată, s-a efectuat un studiu secvenţial de legare pentru a determina dacă trei anticorpi candidaţi individuali sunt capabili să se lege simultan de glicoproteina (GP) solubilă a virusului Ebola, confirmând astfel că situsurile de legare de pe GP-ul virusului Ebola sunt independente pentru fiecare anticorp monoclonal. Dacă da, aceste informaţii ar susţine utilizarea acestor anticorpi într-un cocktail terapeutic.

[0348] În consecinţă, s-au testat experimente de legare secvenţială pentru trei anticorpi monoclonali anti-GP ai virusului Ebola, direcţionând împotriva GP a virusului Ebola, H1 H17203P, H1H17139P şi H1 H17161P, pentru a se stabili legătura independentă şi necompetitivă cu GP a virusului Ebola. Acest experiment a fost realizat utilizând un test de interferometrie cu biostrat (BLI) în timp real, fără marcaj, pe un biosenzor Octet RED (ForteBio Corp., o divizie a Pall Life Sciences). Întregul experiment a fost efectuat la 25°C în soluţie tampon compusă din 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfactant P20, 1. 0 mg/mL BSA (tampon Octet HBS-ET) cu agitarea plăcii la o viteză de 1000 rpm. Pentru a evalua dacă trei anticorpi se pot lega simultan de antigenul GP al virusului Ebola capturat, exprimat cu o etichetă polihistidină C-terminală (GP.his al virusului Ebola, Sino Biologicals), aproximativ ~0,6 nm de GP.h al virusului Ebola au fost mai întâi capturaţi pe biosenzori Octet acoperiţi cu anticorpi anti-penta-His (Fortebio Inc, # 18-5079) prin imersarea biosenzorilor timp de 3 minute în godeuri care conţin o soluţie de 20 µg/ml de GP.h al virusului Ebola. Biosenzorii captaţi cu antigen au fost apoi saturaţi cu primul anticorp monoclonal GP anti-virusul Ebola (denumit ulterior H1 H17161 P) prin imersie în godeuri conţinând o soluţie de REGN H1H17161 P de 50 µg/ml timp de 5 minute. Biosenzorii au fost apoi imersaţi în godeuri conţinând o soluţie de 50 µg/ml dintr-un al doilea anticorp monoclonal GP anti-virusul Ebola (denumit ulterior H1 H17139P) timp de 5 minute. În final, s-au injectat 50 µg/ml din al treilea anticorp (denumit ulterior H1 H17161 P) timp de 5 minute pentru a atinge saturaţia. Răspunsul de legare în timp real a fost monitorizat pe parcursul experimentului şi a fost înregistrat răspunsul de legare la sfârşitul fiecărei etape.

[0349] Rezultate

[0350] Cei trei anticorpi monoclonali candidaţi testaţi au fost capabili să se lege simultan de GP-ul virusului Ebola, ceea ce indică faptul că fiecare anticorp nu a interferat cu situsul de legare de pe GP-ul virusului Ebola al celorlalţi anticorpi testaţi, sugerând că fiecare s-a legat sau a interacţionat cu epitopi diferiţi. Acest lucru susţine rolul utilizării acestor trei anticorpi într-un cocktail terapeutic de anticorpi.

[0351] Exemplul 8: Legarea anticorpilor anti-Ebola la diferite tulpini de particule asemănătoare virusului Ebola (VLP)

[0352] A fost efectuat un studiu pentru a determina dacă anticorpii GP anti-virusul Ebola ar reacţiona cu particulele de tip virus (VLP) care conţin GP din alte tulpini ale virusului Ebola. În acest studiu au fost incluse VLP-uri conţinând GP-uri din Bundibugyo NC_014373, Cote d'ivoire FJ217162, Sudan NC_006432, Zair.1995, Zair.2014 AY354458 şi un control negativ, glicoproteina VSV (VSVg). Studiul a fost realizat utilizând „MesoScale Discovery» (MSD), o tehnologie care permite legarea/fixarea VLP-urilor tulpinii Ebola (care exprimă glicoproteinele/proteinele de suprafaţă virale Ebola) la o suprafaţă de carbon, urmată de un test de legare de tip ELISA. Scopul a fost de a identifica profilurile de legare ale anticorpilor monoclonali în raport cu diferite tulpini de Ebola.

[0353] Testul a fost efectuat pe plăci microgodeuri din polipropilenă cu 96 de godeuri, preparând mai întâi o diluţie 1:10 a supernatanţilor din diferitele VLP/godeu (aşa cum se menţionează în tabelul următor) şi adăugând diluţiile în PBS (50 μΙ/godeu) şi incubând la 4°C peste noapte.

[0354] Lichidul din godeuri a fost aruncat, urmat de blocare cu 150 μΙ/godeu în PBS + 2% BSA şi incubare timp de o oră la temperatura camerei. Conţinutul fiecărui godeu a fost apoi aruncat, iar godeurile au fost spălate cu PBS utilizând un aparat de spălat plăci AquaMax2000 destinat MSD. Cincizeci de microlitri de anticorp primar au fost diluaţi în PBS + 1% BSA şi incubaţi la temperatura camerei sub agitare la o viteză intermediară (5). Conţinutul godeurilor a fost apoi aruncat, iar plăcile au fost spălate cu PBS. În fiecare godeu s-au adăugat cincizeci de microlitri de reactiv de detecţie sulfo-TAG (Fc uman sau de şoarece) la o concentraţie de 1 μg/ml în PBS + 0,5% BSA şi s-au incubat la temperatura camerei timp de o oră, sub agitare la o viteză intermediară (5). Conţinutul godeurilor a fost aruncat, iar plăcile au fost spălate cu PBS + 0,5% BSA. În fiecare godeu s-au adăugat 150 μΙ de tampon de citire 1 X fără surfactant, iar plăcile au fost citite pe un SECTORImager6000 de pe codul de bare.

[0355] Rezultatele, prezentate în Tabelul 8 de mai jos, demonstrează că toţi anticorpii anti-GP ai virusului Ebola testaţi se leagă de VLP-urile care conţin GP-urile Zaire 2014 şi Zaire 1995. Anumiţi dintre anticorpii testaţi se leagă de VLP-urile care conţin GP-urile din alte tulpini de virus Ebola, pe lângă faptul că se leagă de cele două tulpini Zaire menţionate în Tabelul 8. În special, pe lângă legarea la VLP-urile care conţin GP-urile din Zair 2014 şi Zair 1995, anticorpii anti-virus Ebola desemnaţi ca H1H17161P şi H1H17162P se leagă de VLP-urile care conţin GP-urile din tulpinile Sudan şi Bundibugyo, în timp ce anticorpii anti-virus Ebola desemnaţi ca H2aM 17356N şi H1H17142P se leagă de tulpinile Bundibugyo şi Cote d'Ivoire.

[0356] Tabelul 8: Reactivitate încrucişată a anticorpilor anti-virusul Ebola cu GP-uri din diverse tulpini ale virusului Ebola

Legarea anticorpilor anti-virus Ebola la VLP-uri care conţin GP-uri din diverse tulpini ale virusului Ebola

AbPID

Sudan

Bundibugyo

Cote d'Ivoire

Zaire 2014

Zaire 1995

H1H17161P

+

+

-

+

+

H1H17139P

-

-

-

+

+

H1H17203P

-

-

-

+

+

H1H17219P

-

-

-

+

+

H1H17162P

+

+

-

+

+

H1H17199P

-

-

-

+

+

H1H17193P

-

-

-

+

+

H1M17354N

-

-

-

+

+

H1M17357N

-

-

-

+

+

H1H17134P

-

-

-

+

+

H1H17360N

-

-

-

+

+

H1H17358N2

-

-

-

+

+

H2aM17356N

-

+

+

+

+

H1H17223P

-

-

-

+

+

H1H17196P

-

-

-

+

+

H1H17151P

-

-

-

+

+

H1H17142P

-

+

+

+

+

H1H17214P

-

-

-

+

+

H1H17228P

-

-

-

+

+

H2aM17359N

-

-

-

+

+

[0358] Exemplul 9. Neutralizarea in vitro a virusului Ebola viu/infecţios (EBOV)

[0359] Anticorpii desemnaţi ca H1 H17203P, H1 H17139P şi H1 H17161 P au fost analizaţi pentru capacitatea lor de a neutraliza EBOV infecţios în celulele Vero. Celulele Vero au fost placate pe plăci cu 384 de godeuri în DMEM-10% FBS şi lăsate să crească până la o confluenţă de aproximativ 75% la 37°C. H1H17203P, H1H17139P şi H1H17161 P au fost diluate conform indicaţiilor. Tulpinile EBOV (Mayinga, Kikwit, Makona şi Mayinga adaptată la cobai) au fost decongelate şi diluate corespunzător până la o concentraţie de oxigen (MOI) între 0,01-0,1. Un anticorp anti-EBOV disponibil comercial, denumit KZ52, a fost utilizat drept control pozitiv. (Vezi Maruyama, T. şi colab., J Virol 73, 6024-6030 (1999).) Anticorpii au fost incubaţi cu virusul timp de 1 oră la 37°C. Amestecul de anticorpi/virus a fost apoi adăugat la celulele pre-placate, iar plăcile au fost incubate la 37°C timp de 24 de ore. După perioada de incubare, plăcile au fost scoase din incubator şi inactivate prin imersare în formalină tamponată neutră 10%, plasate într-o pungă termosigilată şi depozitate la 4°C peste noapte în BSL-4. Plăcile au fost spălate de 3 ori în 1X-PBS, iar celulele au fost permeabilizate la temperatura camerei (RT) cu 25 μΙ de Triton X-100 0,1% în 1X-PBS timp de 15-20 de minute. Triton-X a fost aruncat, iar plăcile au fost blocate cu 3,5% BSA în 1X-PBS timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost tratate peste noapte la 4°C cu anticorp primar anti-EBOV GP 4F3 (vezi IBT BIOSERVICES pentru anticorpul monoclonal de şoarece anti-EBOV GP 4F3, număr de catalog 0201-020) diluat 1:1500 în 1X-PBS. Plăcile au fost spălate în 1X-PBS timp de 10-15 minute şi repetate de două ori. Celulele au fost incubate timp de 1 oră cu anticorp secundar anti-şoarece conjugat cu Alexa-fluor-488. Anticorpul secundar a fost eliminat şi plăcile au fost spălate în 1X-PBS timp de 10-15 minute şi repetate de două ori. Plăcile au fost incubate cu 25 μΙΛΛ βΙΙ de Hoechst (1:50.000 în 1X-PBS) timp de 30 de minute la temperatura camerei. Plăcile au fost imagistice prin microscopie cu fluorescenţă utilizând canale de fluorescenţă albastre şi verzi.

[0360] Rezultate

[0361] Rezultatele, prezentate în Figura 1, au demonstrat că anticorpul H1 H17161 P a neutralizat virusul viu şi a fost mai puternic decât anticorpul de control pozitiv KZ52, însă anticorpii desemnaţi ca H1 H17203P şi H1 H17139P nu au acţionat ca neutralizatori.

[0362] Exemplul 10: Legarea anticorpilor anti-Ebola la GP solubilă (sGP)

[0363] A patra genă din genomul EBOV codifică două proteine unice, o glicoproteină secretată dimerică, nestructurală, denumită sGP, şi o glicoproteină de anvelopă (GP) trimerică, ataşată de virioni. Aceste două GP au în comun primii 295 de aminoacizi, dar au capături C-terminale unice. Pentru a determina dacă anticorpii monoclonali principali Regeneron se leagă de sGP, a fost produsă intern o proteină recombinantă sGP.mmh (SEQ ID NO: 317). Biosenzorul Octet HTX bazat pe interferometrie a fost utilizat pentru a determina dacă anticorpii monoclonali H1 H17203P, H1 H17139P, H1 H17161P se pot lega de proteina sGP.mmh a virusului Ebola. Formatul testului a implicat capturarea H1 H17203P, H1 H17139P, H1 H17161 P pe vârfuri de senzori anti-hFc, urmată de imersia în soluţii de 300 nM de Ebola GP.I Oxhis (SEQ ID NO: 318), sGP.mmh (SEQ ID NO: 317) sau hCNTFR (receptor al factorului neurotrofic ciliar.mmh, care este o proteină de control negativ). Fiecare anticorp monoclonal a fost captat la un nivel între 0,94 - 1,36 nm.

[0364] După cum se arată în Figura 2, toţi anticorpii monoclonali (mAb) au prezentat legare specifică la proteina Ebola GP.I Oxhis şi nicio legare la proteina de control negativ; în timp ce doar H1H17139 a demonstrat legare specifică la proteina Ebola sGP.mmh. Această constatare sugerează că epitopul de legare al H1H17139 este probabil localizat într-o regiune comună în primii 295 de aminoacizi atât ai sGP, cât şi ai GP; în timp ce ceilalţi anticorpi monoclonali (mAbs) recunosc posibil doar capătul C-terminal al GP Ebola.

[0365] Exemplul 11: Legarea anticorpilor anti-EBOV GP suplimentari la Ebola GP.h, Ebola GP solubilă.mmh şi hCNTFR.mmh

[0366] Un studiu suplimentar a fost efectuat pentru a determina caracteristicile de legare ale anticorpilor anti-EBOV GP suplimentari ai invenţiei; în special, studiul a fost efectuat pentru a determina capacitatea acestor anticorpi suplimentari de a se lega de GP solubilă şi GP. Acest studiu a fost realizat utilizând un test de interferometrie cu biostrat (BLI) în timp real, fără marcaj, pe un biosenzor Octet HTX (ForteBio Corp., o divizie a Pall Life Sciences). Întregul experiment a fost efectuat la 25°C în soluţie tampon compusă din 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfactant P20, 1. 0 mg/mL BSA (tampon Octet HBS-ET) cu agitarea plăcii la o viteză de 1000 rpm. Pentru a evalua dacă anticorpii au fost capabili să se lege de sGP Ebola sau de alţi reactivi GP Ebola, s-au folosit aproximativ ~1. Un număr de anticorpi monoclonali (mAb) anti-GP anti-Ebola au fost capturaţi pe biosenzori Octet acoperiţi cu anticorpi anti-Fc uman (Fortebio Inc, # 18-5064) prin imersarea biosenzorilor timp de 3 minute în godeuri conţinând soluţii de mAb de 20 μg/mL. Biosenzorii captaţi cu anticorpi monoclonali au fost testaţi pentru legarea la reactivi proteici selectaţi prin imersare în godeuri conţinând soluţii 300 nM de proteine GP Ebola sau controale irelevante timp de 5 minute. Toţi biosenzorii au fost spălaţi în tampon Octet HBS-ET între fiecare etapă a experimentului. Răspunsul de legare în timp real a fost monitorizat pe parcursul experimentului şi a fost înregistrat răspunsul de legare la sfârşitul fiecărei etape.

[0367] Rezultate

[0368] Aşa cum se arată în Tabelul 9, orice valoare sub 0,10 nm a fost determinată ca fiind un anticorp care nu se leagă. Pe baza rezultatelor de până în prezent, toţi anticorpii testaţi, cu excepţia unuia (H1H17360N), au arătat legare la GP de lungime completă a EBOV, iar treisprezece din cei douăzeci de anticorpi testaţi au arătat legare la GP solubilă (sGP).

[0369] Tabelul 9: Legarea anticorpilor anti-Ebola GP la Ebola GP.h., Ebola GP solubilă. mmh şi hCNTFR. Mmh

Numaăr anricorp

Legare la sGP

300 nM Ebola sGP (F2) Bind (nm)

300 nM Ebola GP.h legat (nm)

300 nM hCNTFR.mmh (Control Negativ) Legat (nm)

H1H17161P

Nu

0.00

0.55

‑0.01

H1H17139P

Da

0.19

0.55

0.01

H1H17203P

Nu

0.02

0.61

0.01

H1H17219P

Nu

0.01

0.68

0.01

H1H17162P

Nu

0.03

0.49

0.02

H1H17199P

Da

0.33

0.38

0.00

H1H17193P

Da

0.26

0.33

0.02

H1M17354N

Da

0.18

0.71

0.02

H1M17357N

Nu

0.10

0.56

0.01

H1H17134P

Nu

0.01

0.70

‑0.01

H1H17360N

Nu

0.09

0.09

0.03

H1H17358N2

Da

0.30

0.35

0.01

H1H17356N

Da

0.22

0.23

0.02

H1H17223P

Da

0.31

0.61

0.02

H1H17196P

Da

0.25

0.62

0.01

H1H17151P

Da

0.33

0.43

‑0.02

H1H17142P

Da

0.28

0.34

0.01

H1H17214P

Da

0.38

0.52

0.01

H1H17228P

Da

0.35

0.58

0.00

H1H17359N

Da

0.39

0.51

0.00

Claims (6)

1. O compoziţie farmaceutică care cuprinde un prim anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de virusul Ebola (EBOV), în care primul anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu (HCVR) cu SECV ID NR. 18 şi o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor (LCVR) cu SECV ID NR. 26; cuprinzând în plus un al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului al acestuia care se leagă specific de EBOV, în care al doilea anticorp monoclonal izolat sau un fragment de legare a antigenului al acestuia cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SECV ID NR. 66 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SECV ID NR. 74; şi cuprinzând în plus un al treilea anticorp monoclonal izolat care se leagă specific de EBOV, în care al treilea anticorp monoclonal izolat cuprinde o secvenţă de aminoacizi HCVR cu SECV ID NR. 146 şi o secvenţă de aminoacizi LCVR cu SECV ID NR. 154; în care HCVR-ul fiecăruia dintre primul şi al treilea anticorp monoclonal izolat este legat de un domeniu constant lgG1 uman.

2. O compoziţie farmaceutică conform revendicării 1 pentru utilizare într-o metodă de prevenire, tratare sau ameliorare a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV sau de scădere a frecvenţei sau severităţii a cel puţin unui simptom al infecţiei cu EBOV, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta, opţional în care: (a) cel puţin un simptom este selectat din grupul constând din febră, cefalee, oboseală, pierderea poftei de mâncare, mialgie, diaree, vărsături, dureri abdominale, deshidratare şi sângerări inexplicabile; sau (b) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta, cum ar fi un subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau un subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de a dobândi o infecţie cu EBOV, în care subiectul este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate, un angajat al unui spital, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent.

3. Compoziţia farmaceutică care cuprinde anticorpul sau fragmentul acestuia care se leagă de antigen pentru utilizare conform revendicării 2, în care compoziţia farmaceutică menţionată este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, opţional în care al doilea agent terapeutic este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau în care compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

4. Compoziţia farmaceutică conform revendicării 1 pentru utilizare într-o metodă de creştere a supravieţuirii sau a probabilităţii de supravieţuire a unui subiect care suferă de o infecţie cu EBOV sau a unui subiect expus la EBOV sau cu risc de expunere la EBOV sau de dobândire a acestuia, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta, opţional în care: (a) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta; şi/sau (b) subiectul care are nevoie de aceasta şi care prezintă risc de expunere la EBOV sau de dobândire a unei infecţii cu EBOV este selectat din grupul format dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană care este suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent; şi/sau (c) compoziţia farmaceutică este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, cum ar fi un al doilea agent terapeutic care este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un medicament antiinflamator (de exemplu, corticosteroizi şi medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri mici interferente care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-35 001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (morfolinooligomeri fosfordiamidaţi antisens care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau (d) compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

5. Compoziţia farmaceutică conform revendicării 1 pentru utilizare într-o metodă de neutralizare a EBOV infecţios sau de inhibare a intrării EBOV într-o celulă la un subiect, metoda cuprinzând administrarea respectivei compoziţii farmaceutice unui subiect care are nevoie de aceasta; opţional, în care: (a) compoziţia farmaceutică este administrată profilactic sau terapeutic subiectului care are nevoie de aceasta; şi/sau (b) subiectul care are nevoie de aceasta este selectat din grupul constând dintr-o persoană imunocompromisă, un lucrător din domeniul sănătăţii, o persoană care este suspectată că a fost expusă la o persoană care poartă virusul Ebola, o persoană care intră în contact fizic sau în imediata apropiere fizică a unei persoane infectate, un angajat al spitalului, un cercetător farmaceutic, personalul de întreţinere responsabil cu curăţarea unei unităţi spitaliceşti sau a unei instituţii în care a fost tratat un pacient cu Ebola, persoane care au vizitat sau intenţionează să viziteze o zonă sau o ţară despre care se ştie că are sau se suspectează că are un focar de virus Ebola şi un călător frecvent; şi/sau (c) compoziţia farmaceutică este administrată în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic, cum ar fi un al doilea agent terapeutic care este selectat din grupul constând dintr-un medicament antiviral, un anticorp diferit împotriva EBOV, un vaccin pentru EBOV, TKM Ebola (ARN-uri interferente mici care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini antisens fosforodiamidat care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau TKM Ebola (ARN-uri interferente mici care vizează ARN polimeraza virală), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVl-7537 (oligomeri morfolini antisens osforodiamidat care vizează gena VP24 a virusului Ebola) şi interferoni; şi/sau (d) compoziţia farmaceutică este administrată subcutanat, intravenos, intradermic, intramuscular, intranazal sau oral.

6. Compoziţia farmaceutică conform revendicării 1, în care HCVR-ul celui de-al doilea anticorp monoclonal izolat este legat de un domeniu constant lgG1 uman.