ES3054263T3

ES3054263T3 - Human antibodies to ebola virus glycoprotein

Info

Publication number: ES3054263T3
Application number: ES16703030T
Authority: ES
Inventors: Christos Kyratsous; William Olson; Peter Mason; Neil Stahl
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2026-02-02
Anticipated expiration: 2036-01-25
Also published as: EA038993B1; CN107667115B; US12152067B2; TW201639883A; US20170355751A1; HRP20251642T1; RS67563B1; CL2022003763A1; US20190048066A1; MD3250591T2; JP2023065648A; WO2016123019A1; EP4653051A2; US11530255B2; KR20170102328A; SI3250591T1; SG10202007835QA; SMT202500454T1; MY208081A; PH12017501277B1

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos de unión a antígeno, que se unen a las glicoproteínas del virus del Ébola, composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos de uso. Los anticuerpos de la invención son útiles para inhibir o neutralizar la actividad del virus del Ébola, proporcionando así un medio para tratar o prevenir la infección por este virus en humanos. En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de uno o más anticuerpos que se unen al virus del Ébola para prevenir la adhesión y/o entrada del virus en las células huésped. Los anticuerpos de la invención pueden usarse profiláctica o terapéuticamente, solos o en combinación con uno o más agentes antivirales o vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos humanos contra la glucoproteína del virus del Ébola

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende tres anticuerpos monoclonales que se unen a la glucoproteína del virus del Ébola, y a métodos de uso de la misma.

[0005] Antecedentes

[0006] El virus del Ébola (VEBO) y los filovirus relacionados, causan fiebre hemorrágica vírica grave en seres humanos y en primates no humanos, con un índice de letalidad de hasta aproximadamente el 90 % en brotes humanos. (Murin, C.D.et al., (2014), Proc Natl Acad Sci USA, 111(48):17182-17187). Se están investigando los mecanismos inmunitarios que actúan como mediadores en la protección, pero hasta ahora, no se ha aprobado ningún tratamiento para su uso en seres humanos.

[0007] La glucoproteína (GP) del virus del Ébola es la única proteína presente en la superficie del virus y en las células infectadas. Se supone que es responsable de la unión y fusión del virus con las células hospedadoras. La GP existe de varias formas. Estas GP se codifican en dos marcos de lectura abiertos. El ARNm no editado de la GP produce una GP soluble (sGP) no estructural secretada que se sintetiza en las primeras fases de la infección (Volchkova,et al.(1995), Virology 214:421-430; Volchkova, VAet al., (1998), Virology 250:408-414; Sanchez,et al.(1996), Proc NatI Acad Sci USA, 93:3602-3607; Sanchez,et al.(1999) J. Infect. Dis. 179 (supl. 1, S164)). La sGP forma dímeros (Volchkova,et al.(1995), Virology 214:421-430; Falzarano, D.et al., Chembiochem (2006), 7:1605-1611) y se detectan cantidades elevadas en la sangre de pacientes y animales infectados experimentalmente (Sanchez,et al.(1996), Proc Natl Acad Sci USA, 93:3602-3607; Dolnik, O.et al., (2004), EMBO J 23:2175-2184).

[0008] Más tarde en la infección, se genera un ARNm editado, adquiriendo capacidad de codificación a partir de un segundo marco de lectura abierto. Este ARNm editado codifica una forma de GP que contiene un dominio transmembrana (TM) que permite que esta forma de GP se fije a la membrana plasmática de la célula y se incorpore a los viriones, donde actúa como la proteína funcional de unión al receptor de la célula hospedadora/proteína de fusión. Durante la biosíntesis de esta forma de GP, la proteína se procesa proteolíticamente en dos productos que se mantienen unidos por enlaces disulfuro. El producto aminoterminal se denomina GP1 (140 kDa) y el producto de escisión carboxiterminal se denomina GP2 (26 kDa) (Sanchez,et al.(1998), J. Virol.72:6442-6447).

[0009] La GP del virus del Ébola (GP del VEBO) puede ser una diana para los anticuerpos protectores, pero el papel de los anticuerpos en la resistencia a la enfermedad ha sido controvertido. Títulos séricos despreciables de anticuerpos neutralizantes en pacientes convalecientes, junto con resultados inconsistentes al lograr protección con la transferencia experimental de sueros inmunitarios a animales, han dado lugar a especulaciones sobre el papel de los anticuerpos neutralizantes en la recuperación de la infección (Peters, CJ y LeDuc, JW, (1999), J. Infect. Dis.179 supl.

[0010] 1; Mikhailov, VV, (1994), Vopr. Virusol.39:82; Xu, L.et al., (1998), Nature Med.4: 37). Sin embargo, en el brote más reciente del virus del Ébola, unos pocos pacientes que contrajeron la enfermedad y que fueron tratados con un cóctel de anticuerpos monoclonales (ZMapp) específicos para la GP vírica se recuperaron de la enfermedad. Así mismo, otros pacientes que fueron tratados con el suero de estos pacientes y de otros pacientes que sobrevivieron tras adquirir la infección, también tuvieron resultados positivos.

[0011] Se han descrito varios anticuerpos que se unen a la GP del virus del Ébola (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU n.º 6630144, 6875433, 7335356 y 8513391. Véanse también los documentos EP1539238, EP2350270 y EP8513391). Aunque los avances tecnológicos han mejorado la capacidad de producir composiciones mejoradas de vacunas con antígeno(s) mejorado(s) del virus del Ébola, sigue siendo necesario proporcionar fuentes adicionales de protección para hacer frente a las cepas emergentes del virus del Ébola. Actualmente se están evaluando varias terapias candidatas contra el virus del Ébola, incluidas vacunas administradas después de la exposición (Feldman, H,et al.(2007), PLos Pathog 3(1):e2), inhibidores de moléculas pequeñas (Cote, M.et al.(2011), Nature, 477(7364):344-348; Johansen, LM,et al.(2013), Sci Transl Med 5(190):190ra179; Warren, TK,et al., (2014), Nature, 508(7496):402-405), terapias basadas en ARNpi (ARN pequeño de interferencia) (Geisbert, TW,et al., (2006), J. Infect Dis.193(12):1650-1657; Geisbert, TWet al., (2010), Lancet 375(9729):1896-1905), y anticuerpos monoclonales (Saphire, EO, (2013), Immunotherapy 5(11):1221-1233; Wong, G.et al.(2014), Trends Microbiol.22(8):456-463; Qiu, Xet al., (2014), Hum. Vaccin. Immunother.10(4):964-967). La administración pasiva de anticuerpos a primates no humanos ha demostrado ser eficaz (Dye, JM.,et al., (2012), Proc Natl Acad Sci USA 109(13):5034-5039). Más recientemente, un cóctel de tres anticuerpos (ZMapp) se está produciendo actualmente en plantas de tabaco y está en fase de desarrollo para su uso en seres humanos (Qiu, X.et al., (2014), Nature 514(7520):47-53).

[0012] Xiangguo Qiuet al., (2012), PLoS Neglected Tropical Diseases 6(3):e1575 desvelan que los anticuerpos monoclonales específicos de la GP del virus del Ébola protegen a ratones y cobayas de la infección letal por el virus del Ébola. Xiangguo Qiuet al., (2012), Sci. Trans. Med. 4(138):138ra81 describen el tratamiento de macacos cangrejeros infectados con el virus del Ébola mediante anticuerpos monoclonales.

[0013] Aunque la idea de una composición de vacuna que comprende el antígeno de interés (p. ej. la GP) para generar anticuerpos neutralizantes en un paciente se considera generalmente un buen enfoque, puede no ser ventajoso para su uso en pacientes que ya han estado expuestos al virus, ya que el organismo tardaría varias semanas en responder a la composición de vacuna. En ese momento, el paciente puede haber sucumbido ya a la infección vírica, en función del nivel de cuidados y de la terapia paliativa disponible. En estos pacientes, o en cualquiera que no sea capaz de generar una respuesta eficaz de anticuerpos, puede ser más beneficioso proporcionar una composición que ya contenga anticuerpos protectores que puedan dirigirse a epítopos comunes a una cepa particular de VEBO o a una variedad de cepas.

[0014] En consecuencia, sigue existiendo la necesidad en la técnica de identificar nuevos anticuerpos, que puedan usarse para prevenir o tratar una infección por el virus del Ébola.

[0015] Breve sumario de la invención

[0016] La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente al virus del Ébola (VEBO), en donde el primer anticuerpo monoclonal aislado comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR,heavy chain variable region) de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR,light chain variable region) de SEQ ID NO: 26;

[0017] que comprende además un segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEBO, en donde el segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 74;

[0018] y que comprende además un tercer anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente al VEBO, en donde el tercer anticuerpo monoclonal aislado comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 146 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 154; en donde la HCVR de cada uno del primer y tercer anticuerpos monoclonales aislados está unida a un dominio constante de IgG1 humana.

[0019] La invención proporciona además la composición farmacéutica anterior para su uso en un método de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, o de disminución de la frecuencia o gravedad de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

[0020] (a) el al menos un síntoma se selecciona del grupo que consiste en fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable; o

[0021] (b) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite, tal como un sujeto que padece una infección por el VEBO, o un sujeto expuesto o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirir una infección por el VEBO, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia.

[0022] En una realización adicional, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el método anterior en donde dicha composición farmacéutica se administra junto con un segundo agente terapéutico, opcionalmente en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (fármaco antívirico de Tekmira contra el virus del Ébola) (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

[0023] en donde la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

[0024] La invención proporciona además la composición farmacéutica anterior para su uso en un método para aumentar la supervivencia, o la probabilidad de supervivencia de un sujeto que padece una infección por el VEBO, o de un sujeto expuesto al VEBO, o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirirlo, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

[0025] (a) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite; y/o (b) el sujeto que lo necesite, que está en riesgo de exposición a una infección por el VEBO, o de adquirir dicha infección, se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia; y/o

[0026] (c) la composición farmacéutica se administra junto con un segundo agente terapéutico, tal como un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

[0027] (d) la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

[0029] La invención también proporciona la composición farmacéutica anterior para su uso en un método de neutralización del VEBO infeccioso o de inhibición de la entrada del VEBO en una célula de un sujeto, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite;

[0030] opcionalmente en donde:

[0032] (a) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite; y/o (b) el sujeto que lo necesite se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia; y/o

[0033] (c) la composición farmacéutica se administra junto con un segundo agente terapéutico, tal como un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

[0034] (d) la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

[0036] En una realización adicional, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la HCVR del segundo anticuerpo monoclonal aislado está unida a un dominio constante de IgG1 humana.

[0038] La presente divulgación describe anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la glucoproteína (GP) del virus del Ébola (VEBO). Los anticuerpos son útiles para inhibir o neutralizar la actividad del virus del Ébola. En algunos aspectos, los anticuerpos son útiles para bloquear la unión del virus del Ébola a la célula hospedadora y/o para impedir la entrada del virus del Ébola en las células hospedadoras. En algunos aspectos, los anticuerpos actúan inhibiendo la transmisión del virus de célula a célula o destruyendo las células infectadas por el virus del Ébola, reduciendo la producción de virus patógenos. En determinados aspectos, los anticuerpos son útiles para prevenir, tratar o mejorar al menos un síntoma de la infección por el virus del Ébola en un sujeto. En determinados aspectos, los anticuerpos pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente a un sujeto que tiene, o que está en riesgo de adquirir, una infección por el virus del Ébola. En determinados aspectos, las composiciones que contienen al menos un anticuerpo de la divulgación, pueden administrarse a un sujeto para el que una vacuna está contraindicada, o para el que una vacuna es menos eficaz, por ejemplo, un paciente anciano, un paciente muy joven, un paciente que pueda ser alérgico a uno cualquiera o más componentes de una vacuna, o un paciente inmunodeprimido que podría no responder a los inmunógenos de una vacuna. En determinados aspectos, las composiciones que contienen al menos un anticuerpo de la divulgación, pueden administrarse a personal médico, a pacientes hospitalizados o a residentes de residencias de ancianos u otros pacientes de alto riesgo durante un brote del virus del Ébola. En determinados aspectos, las composiciones que contienen al menos un anticuerpo de la divulgación, pueden administrarse como tratamiento de primera línea a pacientes que ya han estado expuestos a un virus del Ébola.

[0040] Los anticuerpos de la divulgación pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo de IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')<2>o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, p. ej., para aumentar la persistencia en el hospedador o para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddyet al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). En determinados aspectos, los anticuerpos pueden ser biespecíficos.

[0041] En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales recombinantes aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la GP del VEBO.

[0042] Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo recombinante aislado o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al virus del Ébola (VEBO) y/o a una glucoproteína del virus del Ébola (GP-VEBO), en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada/región variable de cadena ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154.

[0043] La presente divulgación también se refiere a una composición que comprende uno o más anticuerpos contra el VEBO o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según la divulgación, para su uso en un método para inhibir la transmisión del VEBO célula a célula, destruir células infectadas por el VEBO o reducir la producción del VEBO patógeno, comprendiendo el método la exposición de dicha composición a una célula infectada por el VEBO, en donde la exposición tiene como resultado una mayor protección de las células frente a la infección vírica, a la muerte de las células infectadas por el VEBO o a la reducción de la producción del VEBO de las células.

[0044] La presente divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno del mismos, que se unen específicamente al VEBO y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el uno o más anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154.

[0045] La presente divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende (a) un primer anticuerpo contra el VEBO o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el VEBO o fragmento de unión a antígeno del mismo; (c) un tercer anticuerpo contra el VEBO o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la divulgación, en donde el primer anticuerpo se une a, o interactúa con, un primer epítopo del VEBO y el segundo y/o tercer anticuerpo se une a, o interactúa con, un epítopo diferente del VEBO; y (d) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde:

[0046] (i) los epítopos que se unen a, o interactúan con, el primer, segundo y/o tercer anticuerpos contra el VEBO o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son distintos y no se solapan; o

[0047] (ii) el primer anticuerpo contra el VEBO o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a, interactúa con, un epítopo de una cepa del VEBO y el segundo y/o tercer anticuerpo contra el VEBO o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a, o interactúa con, un segundo y/o un tercer epítopo de la misma cepa o de una cepa diferente del VEBO, preferentemente en donde las cepas del VEBO se seleccionan del grupo que consiste en las cepas del Zaire.2014, Zaire.1995, Sudán, Bundibugyo de Costa de Marfil.

[0048] La presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEBO, en donde el primer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 26; opcionalmente que comprende además un segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEBO, en donde el segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 74.

[0049] La presente divulgación se refiere además a una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una HCVR y una LCVR de un anticuerpo como se expone en la presente divulgación; un vector que comprende la secuencia de polinucleótidos; o

[0050] una célula que expresa el vector.

[0051] La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación o una composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un método de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, o de disminución de la frecuencia o gravedad de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, comprendiendo el método administrar dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o dicha composición farmacéutica, a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

[0052] (a) el método comprende administrar un cóctel de anticuerpos que comprende: (i) una mezcla de al menos dos anticuerpos contra el VEBO; y/o (ii) una mezcla de tres anticuerpos contra el VEBO, en donde los tres anticuerpos contra el VEBO comprenden pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se expone en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154;

[0053] (b) el al menos un síntoma se selecciona del grupo que consiste en fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable; o

[0054] (c) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite, tal como un sujeto que padece una infección por el VEBO, o un sujeto expuesto o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirir una infección por el VEBO, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia.

[0056] La presente divulgación se refiere además al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación, o a una composición farmacéutica de la presente divulgación, para su uso en un método para aumentar la supervivencia, o la probabilidad de supervivencia de un sujeto que padece una infección por el VEBO, o de un sujeto expuesto al VEBO, o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirirlo, comprendiendo el método administrar al menos uno de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o dicha composición farmacéutica, a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

[0058] (a) el método comprende administrar un cóctel de anticuerpos que comprende una mezcla de al menos dos anticuerpos contra el VEBO; y/o

[0059] (b) el método comprende administrar un cóctel de anticuerpos que comprende una mezcla de tres anticuerpos contra el VEBO, en donde los tres anticuerpos contra el VEBO comprenden pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se expone en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154; y/o

[0060] (c) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el cóctel de anticuerpos, se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite; y/o

[0061] (d) el sujeto que lo necesite, que está en riesgo de exposición a una infección por el VEBO, o de adquirir dicha infección, se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia; y/o

[0062] (e) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el cóctel de anticuerpos, se administra junto con un segundo agente terapéutico, dicho segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

[0063] (f) la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

[0065] La presente divulgación proporciona un anticuerpo recombinante aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al virus del Ébola (VEBO) y/o a una glucoproteína del virus del Ébola (GP-VEBO), en donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes propiedades:

[0067] (a) comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 146, 2, 34, 50, 82, 98, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 y 306; y tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 154, 10, 42, 58, 90, 106, 122, 138, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 y 298;

[0068] (b) es un anticuerpo monoclonal completamente humano;

[0069] (c) se une al VEBO, o a una partícula similivírica (VLP,virus like particle) que expresa una GP del VEBO con una constante de disociación (K<D>) inferior a 10<-7>M, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial; (d) demuestra un aumento de al menos 3 veces en la semivida (t½) de disociación a pH 5 o pH 6 en comparación con pH 7,4;

[0070] (e) demuestra neutralización del virus del Ébola Zaire con una CI<50>que varía de aproximadamente 10<-11>M a aproximadamente 10<-9>M;

[0071] (f) demuestra unión a células que expresan la GP del VEBO desencadenando citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos;

[0072] (g) reacciona de forma cruzada con una o más cepas del VEBO seleccionadas del grupo que consiste en Zaire.2014, Zaire.1995, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil;

[0073] (h) se une a la GP soluble (sGP);

[0074] (i) compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la Tabla 1.

[0075] La presente divulgación proporciona un anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEBO y/o a una glucoproteína del virus del Ébola (GP del VEBO), en donde el anticuerpo tiene dos o más de las siguientes características:

[0076] (a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano;

[0077] (b) se une al VEBO, o a una partícula similivírica (VLP) que expresa una GP del VEBO con una constante de disociación (K<D>) inferior a 10<-7>M, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial;

[0078] (c) demuestra un aumento de al menos 3 veces en la semivida (t½) de disociación a pH 5 o pH 6 en comparación con pH 7,4;

[0079] (d) demuestra neutralización del virus del Ébola Zaire con una CI<50>que varía de aproximadamente 10<-11>M a aproximadamente 10<-9>M;

[0080] (e) demuestra unión a células que expresan la GP del VEBO desencadenando citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos;

[0081] (f) reacciona de forma cruzada con una o más cepas del VEBO seleccionadas del grupo que consiste en Zaire.2014, Zaire.1995, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil;

[0082] (g) se une a la GP soluble (sGP);

[0083] (h) compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la Tabla 1.

[0084] En las Tablas 1 y 2 del presente documento se enumeran anticuerpos ilustrativos contra la GP del virus del Ébola. En la Tabla 1 se exponen los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR), las regiones variables de cadena ligera (LCVR), las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de anticuerpos contra la GP del virus del Ébola. En la Tabla 2 se exponen los identificadores de la secuencia de ácido nucleico de las HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola.

[0085] En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0086] En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0087] En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR y LCDR (HCDR/LCDR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR enumeradas en la Tabla 1 emparejada con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR enumeradas en la Tabla 1. La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR contenidas en cualquiera de los anticuerpos ilustrativos contra la GP del virus del Ébola enumerados en la Tabla 1.

[0088] En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 y 306/282.

[0089] En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 68, 148, 4, 36, 52, 84, 100, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 y 308;

[0090] (b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 70, 150, 6, 38, 54, 86, 102, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 y 310;

[0091] (c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 72, 152, 8, 40, 56, 88, 104, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 y 312;

[0092] (d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28, 76, 156, 12, 44, 60, 92, 108, 124, 140, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 y 300;

[0093] (e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, 78, 158, 14, 46, 62, 94, 110, 126, 142, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 y 302;

[0094] (f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32, 80, 160, 16, 48, 64, 96, 112, 128, 144, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 y 304.

[0095] En determinados aspectos, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 (H1H17139P), 66/74 (H1H17161P) y 146/154 (H1H17203P).

[0096] En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1. La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contenidas en cualquiera de los anticuerpos ilustrativos contra la GP del virus del Ébola enumerados en la Tabla 1. En determinados aspectos, el par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24/32 (p. ej., H1H17139P), 72/80 (p. ej., H1H17161P) y 152/160 (p. ej., H1H17203P).

[0097] En el presente documento se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir,HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en cualquiera de los anticuerpos ilustrativos contra la GP del virus del Ébola enumerados en la tabla 1. En determinados aspectos, el par de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32 (p. ej., H1H17139P), 68-70-72-76-78-80 (p. ej., H1H17161P); y 148-150-152-156-158-160 (p. ej., H1H17203P).

[0098] La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir,HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenido en un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos ilustrativos contra la GP del virus del Ébola enumerados en la Tabla 1. La presente divulgación incluye anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 (p. ej., H1H17139P), 66/74 (p. ej., H1H17161P); y 146/154 (p. ej., H1H17203P). Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, p. ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un punto medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, p. ej., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikaniet al., J. Mol. Biol.

[0099] 273:927-948 (1997); y Martinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.86:9268-9272 (1989). También se dispone de bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

[0100] La presente divulgación incluye anticuerpos contra el virus del Ébola que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunos aspectos, para eliminar sitios de glucosilación no deseables, puede ser útil la modificación o bien un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC,antibody dependent cellular cytotoxicity) (véase, Shieldet al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede realizarse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0101] En el presente documento también se desvelan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que compiten por la unión específica al virus del Ébola con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde cada una de la HCVR y la LCVR tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1.

[0102] En el presente documento también se desvelan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que compiten de forma cruzada por la unión al virus del Ébola con un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde cada una de la HCVR y la LCVR tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1.

[0103] La presente divulgación también proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que bloquean la unión y/o entrada del virus del Ébola en una célula hospedadora.

[0104] En determinados aspectos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación, son biespecíficos y comprenden una primera especificidad de unión a un primer epítopo del virus del Ébola y una segunda especificidad de unión a un segundo epítopo del virus del Ébola, en donde el primer y segundo epítopos son distintos y no se solapan. En determinados aspectos, el biespecífico puede comprender un primer brazo que se une a un epítopo de la glucoproteína vírica y un segundo brazo que se une a un epítopo de un antígeno vírico diferente. En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos o partes del mismo contra el virus del Ébola. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0105] En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las la mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir,HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola ilustrativos enumerados en la Tabla 1.

[0106] En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir,LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola ilustrativos enumerados en la Tabla 1.

[0107] En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la misma. En determinados aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y LCVR, en donde tanto la HCVR como la LCVR proceden del mismo anticuerpo contra la GP del virus del Ébola enumerado en la Tabla 1.

[0108] En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada enumeradas en la Tabla 1. En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera enumeradas en la Tabla 1.

[0109] En un aspecto relacionado, la presente divulgación también proporciona vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola. Por ejemplo, la presente divulgación incluye vectores de expresión recombinante que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se exponen en la Tabla 1. Dentro del alcance de la presente divulgación también se incluyen células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o partes de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos.

[0110] En un tercer aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la GP del virus del Ébola y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El uno o más anticuerpos aislados pueden comprender un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1. En un aspecto de la divulgación, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 146/154, 2/10, 34/42, 50/58, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 y 306/282. En un aspecto, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18/26, 66/74 y 146/154.

[0111] En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de al menos dos anticuerpos de la divulgación y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0112] La invención proporciona una composición, que es una combinación/cóctel de al menos tres anticuerpos, como se define en las reivindicaciones, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0113] En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se describe en la Tabla 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se describe en la Tabla 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y (c) un tercer anticuerpo contra el virus del Ébola, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se describe en la Tabla 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo se une a, o interactúa con, un primer epítopo de la GP del virus del Ébola y el segundo y/o tercer anticuerpo se une a, o interactúa con, un epítopo diferente de la GP del virus del Ébola y d) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0114] En otro aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y un segundo agente terapéutico.

[0115] En un aspecto, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combina ventajosamente con un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola. Como agentes ilustrativos que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo contra el virus del Ébola se incluyen, sin limitación, otros agentes que se unen y/o inhiben la actividad del virus del Ébola (incluidos otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, etc.) y/o agentes, que no se unen directamente al virus del Ébola pero que, no obstante, inhiben la actividad vírica, incluida la infectividad de las células hospedadoras.

[0116] En el presente documento se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se describe en la Tabla 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se describe en la Tabla 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo de la GP del virus del Ébola y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo de la GP del virus del Ébola, en donde el primer y segundo epítopos son distintos y no se solapan; y (c) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0117] En el presente documento también se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo no compite de forma cruzada con el segundo anticuerpo por la unión al virus del Ébola; y (c) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En el presente documento también se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que interactúa con un antígeno diferente del virus del Ébola, en donde el primer anticuerpo se une a un epítopo de la GP del virus Ébola y el segundo anticuerpo se une a un epítopo de un antígeno diferente del virus Ébola; y (c) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0118] En el presente documento también se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (c) un tercer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo de la GP del virus Ébola y el segundo y/o tercer anticuerpo se une a un epítopo diferente de la GP del virus Ébola, en donde el primer, el segundo y el tercer epítopos son distintos y no se solapan; y (d) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0119] En el presente documento también se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (c) un tercer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo puede o no competir de forma cruzada con el segundo y/o tercer anticuerpo por la unión al virus del Ébola; y (d) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En el presente documento también se desvela una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un segundo y/o tercer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que interactúa con un antígeno diferente del virus del Ébola, en donde el primer anticuerpo se une a un epítopo del virus del Ébola y el segundo y/o tercer anticuerpo se une a un epítopo de un antígeno diferente del virus del Ébola; y (c) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0120] En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une o interactúa con un epítopo de una cepa del virus del Ébola y el segundo y/o tercer anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a, o interactúa con, un segundo y/o un tercer epítopo de la misma cepa o de una cepa diferente del virus del Ébola. Las cepas del virus Ébola que interactúan con un anticuerpo de la divulgación pueden seleccionarse del grupo que consiste en las cepas de Zaire.2014, Zaire.1995, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil, o variantes de las mismas.

[0122] En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la GP del virus Ébola, en donde el primer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR1 de SEQ ID NO: 20; una secuencia de aminoácidos de HCDR2 de SEQ ID NO: 22; una secuencia de aminoácidos de HCDR3 de SEQ ID NO: 24; una secuencia de aminoácidos de LCDR1 de SEQ ID NO: 28; una secuencia de aminoácidos de LCDR2 de SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de LCDR3 de SEQ ID NO: 32, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además un segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la GP del virus Ébola, en donde el segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR1 de SEQ ID NO: 68; una secuencia de aminoácidos de HCDR2 de SEQ ID NO: 70; una secuencia de aminoácidos de HCDR3 de SEQ ID NO: 72; una secuencia de aminoácidos de LCDR1 de SEQ ID NO: 76; una secuencia de aminoácidos de LCDR2 de SEQ ID NO: 78 y una secuencia de aminoácidos de LCDR3 de SEQ ID NO: 80. La composición farmacéutica puede comprender además un tercer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la GP del virus Ébola, en donde el tercer anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR1 de SEQ ID NO: 148; una secuencia de aminoácidos de HCDR2 de SEQ ID NO: 150; una secuencia de aminoácidos de HCDR3 de SEQ ID NO: 152; una secuencia de aminoácidos de LCDR1 de SEQ ID NO: 156; una secuencia de aminoácidos de LCDR2 de SEQ ID NO: 158 y una secuencia de aminoácidos de LCDR3 de SEQ ID NO: 160.

[0124] En determinados aspectos, cada anticuerpo puede formularse como una formulación por separado, y si se determina que se necesita más de un anticuerpo para lograr la máxima eficacia terapéutica, cada una de las formulaciones de anticuerpo puede administrarse conjuntamente (al mismo tiempo o secuencialmente), según sea necesario. Como alternativa, el cóctel de anticuerpos puede formularse conjuntamente.

[0126] En determinados aspectos, cuando se combinan dos o más anticuerpos en una composición farmacéutica, estos pueden unirse o no a los mismos epítopos o a epítopos solapantes de la proteína del virus del Ébola. En cualquier parte del presente documento, se desvelan combiterapias y coformulaciones adicionales que implican los anticuerpos contra el virus del Ébola de la presente divulgación.

[0128] La divulgación también proporciona métodos terapéuticos para tratar una enfermedad o un trastorno asociado al virus del Ébola (tal como infección vírica en un sujeto), o al menos un síntoma asociado a la infección vírica, o a la frecuencia o gravedad de al menos un síntoma asociado a infección por el VEBO, usando un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola o una parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, o un cóctel de al menos dos o más anticuerpos de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la divulgación, al sujeto que lo necesite. Los métodos pueden comprender la administración de una combinación (cóctel) de al menos tres anticuerpos de la divulgación. El cóctel de anticuerpos puede comprender tres anticuerpos contra el VEBO que tengan los pares de secuencias de aminoácidos expuestos en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección, que mejore, se alivie, se inhiba o se prevenga a través de la inhibición de la actividad del virus del Ébola. La divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar o mejorar al menos un síntoma de la infección por el virus del Ébola, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno o más anticuerpos contra la GP del virus del Ébola o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.

[0130] En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un método de neutralización del VEBO infeccioso, comprendiendo el método exponer una célula infectada con el VEBO a una composición que comprende uno o más anticuerpos contra el VEBO o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en donde la exposición tiene como resultado una mayor protección de la célula frente a la infección vírica o frente a la muerte celular. La exposición puede serin vitrooin vivo.Los métodos pueden comprender la administración de uno o más anticuerpos de la divulgación. Los métodos pueden comprender la administración de una combinación (cóctel) de al menos tres anticuerpos de la divulgación. El cóctel de anticuerpos puede comprender tres anticuerpos contra el VEBO que tengan los pares de secuencias de aminoácidos expuestos en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154.

[0132] En el presente documento se desvelan métodos para mejorar o reducir la gravedad, duración o frecuencia de aparición, de al menos un síntoma de infección por el virus del Ébola en un sujeto mediante la administración de uno o más anticuerpos contra la GP del virus del Ébola de la divulgación, en donde el al menos un síntoma se selecciona del grupo que consiste en fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable.

[0134] En el presente documento se desvelan métodos para disminuir la carga vírica en un sujeto, comprendiendo los métodos la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación que se unen a la GP del virus del Ébola y bloquean la unión del virus del Ébola y/o su entrada en la célula hospedadora.

[0135] En el presente documento se desvela un método para aumentar la supervivencia, o la probabilidad de supervivencia de un sujeto que padece infección por el VEBO, o de un sujeto expuesto al VEBO, o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirirlo, comprendiendo el método administrar al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno divulgado en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento, a un sujeto que lo necesite.

[0136] En el presente documento se desvela un método para aumentar la supervivencia, o la probabilidad de supervivencia de un sujeto que padece infección por el VEBO, o de un sujeto expuesto al VEBO, o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirirlo, comprendiendo el método administrar un cóctel de anticuerpos que comprende una mezcla de al menos dos anticuerpos contra el VEBO divulgados en el presente documento. El método puede comprender administrar un cóctel de anticuerpos que comprenda una mezcla de al menos tres anticuerpos contra el VEBO desvelados en el presente documento. El cóctel de anticuerpos a administrar puede comprender una mezcla de al menos tres anticuerpos contra el VEBO desvelados en el presente documento, en donde los al menos tres anticuerpos comprenden pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se expone en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154.

[0137] En un aspecto de la divulgación, el sujeto que lo necesite es un sujeto que está en riesgo de exposición a una infección por el virus del Ébola o de adquirirla, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia.

[0138] En un aspecto de la divulgación, al sujeto que lo necesite se le puede administrar al menos un anticuerpo contra el VEBO divulgado en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica que comprenda al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento, junto con un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (tal como corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones.

[0139] La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

[0140] Puede observarse una protección mejorada en un mamífero expuesto al VEBO, o infectado con éste, cuando dicho mamífero se trata con una composición farmacéutica que comprende un cóctel de anticuerpos, que comprende al menos tres de los anticuerpos divulgados en el presente documento.

[0141] La protección mejorada observada puede medirse por una disminución de la gravedad o la frecuencia de al menos un síntoma asociado a la infección por el VEBO, por una disminución de la carga vírica o por un aumento de la supervivencia de un mamífero infectado por el VEBO. El al menos un producto puede seleccionarse del grupo que consiste en fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable.

[0142] La protección mejorada puede observarse cuando el anticuerpo se usa solo, o cuando se usa junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales o modalidades de tratamiento contra el VEBO.

[0143] El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (tal como corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el virus del Ébola, una vacuna para el virus del Ébola, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones.

[0144] El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden comprender uno o más anticuerpos contra el VEBO.

[0145] El uno o más anticuerpos contra el VEBO comprenden una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) y de región variable de cadena ligera (LCVR), seleccionadas del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la Tabla 1.

[0146] El uno o más anticuerpos contra el VEBO pueden comprender un par de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) y de región variable de cadena ligera (LCVR), seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 y 306/282.

[0147] El uno o más anticuerpos contra el VEBO comprenden un par de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) y de región variable de cadena ligera (LCVR), seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74 y 146/154.

[0148] El uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente a un sujeto que tenga, o corra el riesgo de tener, o esté predispuesto a desarrollar una infección por el virus del Ébola. Entre los sujetos en riesgo se incluyen, pero sin limitación, una persona inmunodeprimida, por ejemplo, una persona inmunodeprimida debido a una enfermedad autoinmunitaria, o las que reciben terapia inmunosupresora (por ejemplo, tras un trasplante de órgano), o las afectadas por el síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), determinadas formas de anemia que agotan o destruyen los glóbulos blancos, las personas que reciben radioterapia o quimioterapia, o las afectadas por trastorno inflamatorio. Otros sujetos en riesgo de adquirir una infección por el virus del Ébola, incluyen a los trabajadores sanitarios, o a cualquier persona que entre en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, o que esté expuesta a líquidos o tejidos corporales de individuos infectados, quienes también tiene un mayor riesgo de desarrollar una infección por el virus del Ébola. Así mismo, un sujeto está en riesgo de contraer una infección por el virus del Ébola debido a su proximidad a un brote de la enfermedad, p. ej., un sujeto que reside en una ciudad densamente poblada o en estrecha proximidad con sujetos que presentan infecciones confirmadas por el virus del Ébola o que se sospecha que las presentan, o por su ocupación, p. ej., personal de mantenimiento encargado de la limpieza de un centro hospitalario o institución donde se ha tratado a un paciente con Ébola, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, una persona que ha visitado, o tiene previsto visitar, una zona o un país donde se sabe o se sospecha que existe un brote del virus del Ébola, o que viaja con frecuencia.

[0149] El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento, puede administrarse junto con un segundo agente terapéutico al sujeto que lo necesite. El segundo agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un fármaco antiinflamatorio (tal como corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un fármaco antiinfeccioso, un fármaco antivírico, un anticuerpo diferente contra el virus del Ébola, una vacuna para el virus del Ébola, terapia ZMapp, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola), interferones, un suplemento dietético, tal como antioxidantes y cualquier otro fármaco o terapia conocida en la técnica, útil para mejorar al menos un síntoma de la infección por el virus del Ébola, o para reducir la carga vírica en un paciente. El segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociado(s) a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación, si ocurriera dicho efecto o efectos secundarios. El anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intranasal, intramuscular o intracraneal. El anticuerpo puede administrarse como una única infusión intravenosa para obtener la máxima concentración del anticuerpo en el suero del sujeto. El anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto. Un anticuerpo de la presente divulgación puede administrarse a una o más dosis que comprendan entre 50 mg y 600 mg.

[0150] La presente divulgación también incluye un anticuerpo contra el virus del Ébola o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, o ha estado expuesto al VEBO, o para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que se beneficiaría del bloqueo de la unión y/o actividad del virus del Ébola.

[0151] Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0152] Breve descripción de las figuras

[0153] Figura 1:H1H17161P neutraliza con fuerza el VEBO vivo.

[0154] Figura 2:Muestra la interacción de tres anticuerpos contra el VEBO con la GP del virus del Ébola o la GP soluble (sGP) del virus del Ébola.

[0155] Descripción detallada

[0156] Antes de describir los presentes métodos, debe entenderse que la invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

[0157] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto familiarizado con la materia a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o en el ensayo de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.

[0158] Definiciones

[0159] El "virus Ébola" o "VEBO" es un género de la familiaFiloviridae, que se sabe que causa fiebre hemorrágica grave y de rápido avance. Existen muchas especies y cepas diferentes del virus del Ébola en función de la secuencia de nucleótidos y de la localización del brote, por ejemplo, Zaire, bosque de Tai (antes conocida como Costa de Marfil o Cote d'lvoire), Sudán, Reston y Bundibugyo. Las formas más letales del virus son las cepas Zaire y Sudán. La cepa Reston es la única cepa conocida que infecta únicamente a primates no humanos. La expresión "virus del Ébola" también incluye variantes del virus del Ébola aisladas de diferentes cepas del virus del Ébola.

[0160] La secuencia de aminoácidos de la glucoproteína del virus del Ébola de longitud completa, denominada en el presente documento "GP del VEBO" o "GP del virus del Ébola", se ilustra mediante las secuencias de aminoácidos que se encuentran en GenBank con los números de registro AHX24649.1 (véase también la SEQ ID NO: 314) y AHX24649.2 (véase también la SEQ ID NO: 315). La expresión también abarca la GP del virus del Ébola o un fragmento de la misma acoplada, por ejemplo, a una etiqueta de histidina (véase, p. ej., el número de registro AHX24649.1 con una etiqueta de decahistidina (SEQ ID NO: 318)), a la Fc de ratón o de ser humano o a una secuencia señal. La secuencia de aminoácidos de la "GP soluble" o "sGP" se muestra en el número de registro AHX24650 y como SEQ ID NO 316 (con una secuencia señal) y también SEQ ID NO: 317 (sin la secuencia señal pero con una etiqueta de myc-mychexahistidina). La secuencia de aminoácidos de la "GP1" comienza en el extremo aminoterminal de la GP de longitud completa en el resto 1 y termina en el resto 501 de la SEQ ID NO: 315. La secuencia de aminoácidos de la "GP2" abarca los restos 502 a 676 de la GP de longitud completa mostrada como SEQ ID NO: 315.

[0161] La expresión "infección por el virus del Ébola", o "infección por VEBO", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la fiebre hemorrágica grave que resulta de la exposición al virus, o a un animal infectado, o a un paciente humano infectado, o del contacto con los líquidos o tejidos corporales de un animal o paciente humano que tiene una infección por el virus del Ébola. Entre los "síntomas asociados a una infección por el virus del Ébola" se incluyen fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable.

[0162] El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H,heavy) y dos cadenas ligeras (L,light) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir,"moléculas de anticuerpo completo"), así como multímeros de las mismas (p. ej., IgM) o fragmentos de unión a antígenos de las mismas. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "V<H>") y una región constante de cadena pesada (que comprende los dominios C<H>1, C<H>2 y C<H>3). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera ("LCVR o "V<L>") y una región constante de cadena ligera (C<L>). Las regiones V<H>y V<L>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR,complementarity determining regions), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR,framework regions). Cada V<H>y V<L>está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En determinados aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de manera natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

[0163] También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlanet al.(1995 FASEB J.9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdoset al.2002 J Mol Biol 320:415-428).

[0164] Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 con frecuencia no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.

[0165] Los anticuerpos monoclonales contra el virus del Ébola completamente humanos divulgados en el presente documento, pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la estirpe germinal correspondientes. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la estirpe germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la estirpe germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la estirpe germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la estirpe germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la estirpe germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios V<H>y/o V<L>se retromutan a los restos localizados en la secuencia de la estirpe germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la estirpe germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados localizados dentro de los 8 primeros aminoácidos de la FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de la FR4, o únicamente los restos mutados localizados dentro de la CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más de los restos de la región marco y/o CDR se mutan al resto o restos correspondientes de una secuencia de la estirpe germinal diferente (es decir, una secuencia de la estirpe germinal que es diferente de la secuencia de la estirpe germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Por otro lado, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la estirpe germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la estirpe germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la estirpe germinal original, se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de la estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal, pueden analizarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. La presente divulgación abarca anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.

[0166] La presente divulgación también incluye anticuerpos monoclonales contra el virus del Ébola completamente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento, que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos contra el virus del Ébola que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

[0167] La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Los Acm humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y específica de sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo), por ejemplo en las CDR y, en particular, en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos monoclonales (Acm) en los que secuencias de CDR procedentes de la estirpe germinal de otra especie de mamífero (p. ej., ratón), se hayan injertado en secuencias de FR humanas. La expresión incluye anticuerpos producidos de forma recombinante en un mamífero no humano o en células de un mamífero no humano. La expresión no pretende incluir anticuerpos aislados de un sujeto humano o que se hayan generados en un sujeto humano. El término "recombinante", como se utiliza en el presente documento, se refiere a anticuerpos o a fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación, creados, expresados, aislados u obtenidos mediante tecnologías o métodos conocidos en la técnica como tecnología de ADN recombinante que incluye, p. ej., corte y empalme de ADN y expresión transgénica. El término se refiere a anticuerpos expresados en un mamífero no humano (incluyendo mamíferos no humanos transgénicos, p. ej., ratones transgénicos) o en un sistema de expresión celular (p. ej., células CHO) o aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes.

[0168] La expresión "se une específicamente", o "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10<-7>M o menor (p. ej., una K<D>menor indica una unión más estrecha). En la técnica se conocen bien métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos se han identificado mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>, que se unen específicamente al virus del Ébola. Así mismo, los anticuerpos multiespecíficos, que se unen a un dominio en el virus del Ébola y uno o más antígenos adicionales o uno biespecífico que se une a dos regiones diferentes del virus del Ébola se consideran, no obstante, anticuerpos que se "unen específicamente", como se utiliza en el presente documento.

[0169] La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos Acm que tienen una afinidad de unión al virus del Ébola, expresada como K<D>, de al menos 10<-7>M; preferentemente de 10<-8>M; más preferentemente de 10<-9>M, incluso más preferentemente de 10<-10>M, incluso más preferentemente de 10<-11>M, incluso más preferentemente de 10<-12>M, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>o ELISA de afinidad en solución.

[0170] Por la expresión "tasa de disociación lenta", "Koff" o "kd" se entiende un anticuerpo que se disocia del virus del Ébola, o de una partícula similivírica que expresa la GP del virus del Ébola, con una constante de velocidad de 1 x 10<-3>s<-1>o menor, preferentemente de 1 x 10<-4>s<-1>o menor, determinada mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>,

[0171] Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utilizan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se utilizan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse al virus del Ébola.

[0172] En aspectos específicos, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la divulgación pueden estar conjugados con una fracción tal como un ligando o una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un fármaco antivírico, un segundo anticuerpo contra el virus del Ébola, o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una infección causada por el virus del Ébola.

[0173] Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está carece sustancialmente de otros anticuerpos (Ac) que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente al virus del Ébola, o un fragmento del mismo, carece sustancialmente de Ac que se unen específicamente a antígenos diferentes del virus del Ébola.

[0174] Un "anticuerpo bloqueante" o un "anticuerpo neutralizante", como se utiliza en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad del virus del Ébola o "anticuerpo antagonista"), pretende referirse a un anticuerpo cuya unión al virus del Ébola da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica del virus del Ébola. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede impedir o bloquear la unión al virus del Ébola, o su entrada, en una célula hospedadora. Además, un "anticuerpo neutralizante" es uno que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con, la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un hospedador. Las expresiones "anticuerpo neutralizante" y "un anticuerpo que neutraliza" o "anticuerpos que neutralizan" se utilizan indistintamente en el presente documento. Estos anticuerpos pueden usarse, en solitario o en combinación, como agentes profilácticos o terapéuticos con otros agentes antivíricos en una formulación adecuada, o en asociación con la vacunación activa, o como herramienta de diagnóstico.

[0175] La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC", es un mecanismo de defensa inmunitaria mediado por células, mediante el cual una célula efectora del sistema inmunitario causa activamente la lisis a una célula diana, cuyos antígenos de la superficie de la membrana se han unido mediante anticuerpos específicos, tales como los descritos en el presente documento. Como tal, es un mecanismo a través del cual, por ejemplo, un anticuerpo específico de un virus puede actuar para limitar la propagación de la infección. La ADCC clásica está mediada por linfocitos citolíticos naturales (células NK), macrófagos, neutrófilos y, en determinados casos, eosinófilos.

[0176] La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE<™>(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala (Suecia) y Piscataway, N.J.).

[0177] El término "K<D>", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

[0178] El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas zonas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. El término "epítopo" se refiere también a un lugar en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinados aspectos, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinados aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

[0180] La expresión "compite de forma cruzada", como se utiliza en el presente documento, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un antígeno e inhibe o bloquea la unión de otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. La expresión también incluye la competencia entre dos anticuerpos en ambas orientaciones, es decir, que un primer anticuerpo se une y bloquea la unión de un segundo anticuerpo y viceversa. En determinados aspectos, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo pueden unirse al mismo epítopo. Como alternativa, el primer y segundo anticuerpos pueden unirse a diferentes epítopos, pero solapantes, de tal manera que la unión de uno inhibe o bloquea la unión del segundo anticuerpo, p. ej., a través de impedimento estérico. La competencia cruzada entre anticuerpos puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un ensayo de interferometría de biocapa en tiempo real y sin marcaje. Para determinar si un anticuerpo de ensayo compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia de la divulgación contra la GP del virus del Ébola, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una GP o a un péptido del virus del Ébola en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la GP del virus del Ébola. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la GP del virus del Ébola después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola, se puede concluir que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de referencia contra el virus del Ébola. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la GP del virus del Ébola después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el del anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola de la divulgación.

[0182] La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente 95 %, 96%, 97%, 98 % o 99 % de las bases de nucleótidos, medida a través de cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

[0184] Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 90 % de identidad de secuencia, aún más preferentemente al menos el 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas (p. ej., carga o hidrofobicidad) similares. En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la materia conocen bien medios para hacer este ajuste. (Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 144345. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

[0186] La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000)supra).Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, p. ej., Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol.

[0187] 215: 403-410 y (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402.

[0188] Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la materia podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[0189] Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que necesita la mejora, la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno tal como una infección vírica. El sujeto puede tener una infección por el virus del Ébola o estar predispuesto a desarrollar una infección por el virus del Ébola. Los sujetos "predispuestos a desarrollar una infección por el virus del Ébola", o sujetos "que puedan presentar un riesgo elevado de contraer una infección por el virus del Ébola", son aquellos sujetos con sistemas inmunitarios deprimidos debido a una enfermedad autoinmunitaria, aquellas personas que reciben terapia inmunosupresora (por ejemplo, tras un trasplante de órgano), aquellas personas afectadas por el síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), determinadas formas de anemia que agotan o destruyen los glóbulos blancos, las personas que reciben radioterapia o quimioterapia, o las afectadas por trastorno inflamatorio. Adicionalmente, los sujetos de edad extremadamente joven o avanzada corren un mayor riesgo. Cualquier persona que entre en contacto físico o en estrecha proximidad física con un animal o con un paciente humano infectado, o que esté expuesta a líquidos o tejidos corporales de un animal o de un paciente humano infectado, tiene un mayor riesgo de desarrollar una infección por el virus del Ébola. Así mismo, un sujeto está en riesgo de contraer una infección por el virus del Ébola debido a su proximidad a un brote de la enfermedad, p. ej., un sujeto que reside en una ciudad densamente poblada o en estrecha proximidad con sujetos que presentan infecciones confirmadas por el virus del Ébola o que se sospecha que las presentan, o por su ocupación, por ejemplo, un trabajador de hospital, investigador farmacéutico, una persona que ha visitado, o tiene previsto visitar, una zona o un país donde se sabe o se sospecha que existe un brote del virus del Ébola, o que viaja con frecuencia.

[0190] Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refieren a la reducción o mejora de la gravedad de al menos un síntoma o indicación de una infección por el virus del Ébola debido a la administración de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo de la presente divulgación, a un sujeto que lo necesite. Los términos incluyen la inhibición del avance de la enfermedad o del empeoramiento de la infección. Los términos también incluyen el pronóstico positivo de la enfermedad, es decir, el sujeto puede estar libre de infección o puede presentar una cantidad de virus reducida o nula después de la administración de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo de la presente divulgación. El agente terapéutico puede administrarse al sujeto a una dosis terapéutica. Los términos "prevenir", "que previene" o "prevención", se refieren a la inhibición de la manifestación de la infección por el virus del Ébola o de cualquier síntoma o indicio de infección por el virus del Ébola después de la administración de un anticuerpo de la presente divulgación. Los términos incluyen la prevención de la propagación de la infección en un sujeto expuesto al virus o en riesgo de presentar una infección por el virus del Ébola.

[0191] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fármaco antivírico" se refiere a cualquier agente antiinfeccioso o terapia antiinfecciosa, ya sea una fracción química o una terapia biológica, que se utiliza para tratar, prevenir o mejorar una infección vírica en un sujeto. Por ejemplo, en la presente invención un fármaco antivírico puede incluir, pero sin limitación, un anticuerpo contra el virus del Ébola (en una realización, el anticuerpo contra el virus del Ébola puede ser diferente de los descritos en el presente documento), una vacuna para el virus del Ébola, terapia ZMapp, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones. En la presente invención, la infección a tratar está causada por un virus del Ébola.

[0192] Descripción general

[0193] La enfermedad por el virus del Ébola es una enfermedad grave, a menudo mortal, causada por partículas víricas filamentosas que pertenecen a la familiaFiloviridae.Se conocen varias especies del género del virus del Ébola capaces de causar la enfermedad en el ser humano. Estas incluyen Zaire, Sudán, bosque de Tai (anteriormente Costa de Marfil) y Bundibugyo. Se desconoce el reservorio natural del virus y, hasta la fecha, no existen terapias ni vacunas aprobadas.

[0194] El genoma del virus consiste en una única cadena de ARN de sentido negativo de aproximadamente 19 kb de longitud. Los viriones del Ébola contienen siete proteínas: una glucoproteína (GP) de superficie, una nucleoproteína (NP), cuatro proteínas estructurales de virión (VP40, VP35, VP30 y VP24) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (L). (Feldman,et al.(1992) Virus Res.24, 1-19).

[0195] La única proteína presente en la superficie del virus es la glucoproteína. Debido a la edición del ARN, la transcripción del gen GP da lugar a la síntesis de varios ARNm específicos del gen GP que codifican GP víricas, incluidas la GP soluble (sGP) no estructural y la GP de superficie del virión (Volchkova, VAet al., (1998), Virology 250:408-414). Ambas GP se sintetizan como una molécula precursora que escinde proteolíticamente la proteasa celular furina durante el procesamiento intracelular (Volchkov, VE,et al., ((1998), Proc Natl Acad Sci USA 95:5762-5767). La sGP forma dímeros, mientras que el fragmento carboxiterminal escindido es un monómero. Las espigas vírica de superficie se forman como un trímero de GP<1,2>compuesto por dos subunidades GP1 y GP2 unidas por un enlace disulfuro (Volchkova, VAet al., (1998), Virology 250:408-414; Falzarano, D.et al., (2006), Chembiochem 7:1605-1611). Se sabe que la GP1 actúa como mediadora en la unión vírica a la célula hospedadora y que la GP2 está implicada en la fusión de membranas (Sanchez, A.et al., (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93:3602-3607; Alazard-Dany, N.,et al.(2006),J. Gen.Virol.87:1247-1257).

[0197] Durante la infección por el VEBO, se liberan cantidades significativas de glucoproteínas solubles (sGP) de las células infectadas por el virus. Se ha demostrado que esta forma de GP se une a los anticuerpos neutralizantes del virus dirigidos contra la GP de superficie o del virión y los secuestra (Dolnik, O.et al., (2004), EMBO J 23:2175-2184). Aparte de este bloqueo por anticuerpos, el papel de la GP soluble en términos de replicación vírica y/o patogenia, no se ha definido bien. Estudios más recientes de Escudero-Perez,et al.,han demostrado que la sGP puede unirse a células dendríticas y macrófagos no infectados, activarlos e inducir la secreción de citocinas pro y antiinflamatorias. Además, demostraron que la sGP afecta a la función de las células endoteliales y puede afectar a la permeabilidad vascular. (Escudero-Perez,et al., (2014), PLOS Pathogens, vol.10, publicación 11:1-17). Esto puede explicar la desregulación de la reacción inflamatoria del hospedador tras la infección y puede contribuir a la patogenia del virus.

[0199] La inmunoterapia pasiva para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades infecciosas se utiliza desde hace más de un siglo, normalmente en forma de suero humano convaleciente que contiene altos títulos de anticuerpos neutralizantes (Goodet al., (1991); Cancer 68: 1415-1421). Actualmente, múltiples anticuerpos monoclonales purificados se encuentran en desarrollo preclínico y clínico para su uso como agentes antimicrobianos (Marasco et al 2007; Nature Biotechnology 25: 1421-1434). Se han descrito determinados anticuerpos que se unen a la glucoproteína del virus del Ébola. (Véase, p. ej., Audet et. al. (2014), Scientific Reports 4:6881; Chen,et al.(2014), ACS Chem Biol.

[0200] 17 de oct.; 9(10): 2263-73; Koellhoffer JF, et.al., (2012), Chembiochem Nov.26; 13(17):2549-57; Qiu, X., et al., Nature (2014) Oct 2;514(7520):47-53).

[0202] Los inventores han descrito en el presente documento anticuerpos completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a GP del virus del Ébola y modulan la interacción del virus del Ébola con dichas células. Los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola pueden unirse al virus del Ébola con gran afinidad. En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos bloqueantes en donde los anticuerpos pueden unirse a la GP del virus Ébola y bloquear la unión y/o la entrada del virus en las células hospedadoras. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación pueden bloquear la unión del virus del Ébola con las células y de tal manera que pueden inhibir o neutralizar la infección vírica de las células hospedadoras. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación pueden actuar como mediadores en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y de tal manera que, pueden ayudar a destruir las células que llevan el virus. En determinados aspectos, los anticuerpos pueden actuar de ambas maneras, p. ej. pueden neutralizar la infectividad vírica y actuar como mediadores en la ADCC. En algunos aspectos, los anticuerpos pueden ser útiles para tratar a un sujeto que padece una infección por el virus del Ébola. Cuando se administran a un sujeto que lo necesita, los anticuerpos pueden reducir la infección por un virus, como el virus del Ébola, en dicho sujeto. Pueden utilizarse para disminuir la carga vírica en un sujeto. Pueden usarse en solitario o como terapia complementaria con otras fracciones terapéuticas o modalidades conocidas en la materia para tratar una infección vírica. En determinados aspectos, estos anticuerpos pueden unirse a un epítopo en el extremo amínico de la GP del virus Ébola. En determinados aspectos, estos anticuerpos pueden unirse a un epítopo en el extremo carboxílico de la GP del virus del Ébola. Por otro lado, los anticuerpos identificados pueden usarse profilácticamente (antes de la infección) para proteger a un mamífero de la infección, o pueden usarse terapéuticamente (una vez establecida la infección) para mejorar una infección previamente establecida, o para mejorar al menos un síntoma asociado a la infección.

[0204] La secuencia de aminoácidos de longitud completa de una GP ilustrativa del virus del Ébola se muestra en el GenBank como números de registro AHX24649.1 y AHX24649.2 y también en las SEQ ID NO: 314 y 315, respectivamente. La GP1 abarca desde el resto de aminoácido 1-501 de la GP de longitud completa y la GP2 abarca desde el resto de aminoácido 502 hasta el 676 de la GP de longitud completa mostrada en las SEQ ID NO: 314 o SEQ ID NO: 315). La GP del VEBO de longitud completa, también mostrada en el número de registro AHX24649.1, puede estar acoplada a una etiqueta de decahistidina, tal como se muestra en la SEQ ID NO: 318. La GP soluble (sGP) se muestra como número de registro AHX24650.1 del GenBank y también como SEQ ID NO: 316 (con la secuencia señal unida) y también como SEQ ID NO: 317 (sin la secuencia señal, pero conteniendo una etiqueta de myc-myc-his).

[0206] En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como una GP de longitud completa del virus del Ébola, o con una forma recombinante de GP del virus del Ébola o fragmentos de la misma seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la GP del virus del Ébola. En determinados aspectos, los anticuerpos se obtienen de ratones inmunizados con ADN que codifica la GP del virus del Ébola de longitud completa (Zaire.2014, véase GenBank KJ660346.2; también SEQ ID NO: 313). El inmunógeno puede ser un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de la GP del virus del Ébola o del ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede proceder de cualquier región de la GP vírica, incluido el fragmento aminoterminal (p. ej. GP1), o el fragmento carboxiterminal (p. ej. GP2). Los péptidos pueden modificarse para que incluyan la adición o sustitución de determinados restos para etiquetarlos o con fines de conjugación con moléculas transportadoras, tales como, KLH. Por ejemplo, puede añadirse una cisteína en el extremo aminoterminal o carboxiterminal de un péptido, o puede añadirse una secuencia enlazadora para preparar el péptido para su conjugación, por ejemplo, con KLH, para la inmunización.

[0208] Determinados anticuerpos contra el virus del Ébola de la presente divulgación, tienen la capacidad de unirse y neutralizar la actividad de dicho virus, según lo determinado en ensayosin vitrooin vivo. La capacidad de los anticuerpos de la divulgación para unirse al virus del Ébola y neutralizar su actividad y, por tanto, la unión y/o entrada del virus en una célula hospedadora seguido de la consiguiente infección vírica, puede medirse utilizando cualquier método estándar conocido por los expertos en la materia, incluyendo ensayos de unión o ensayos de actividad, como se describe en el presente documento.

[0210] En el Ejemplo 3 del presente documento, se ilustran ejemplos de ensayosin vitropara medir la actividad de unión. En el Ejemplo 3, la afinidad de unión y las constantes de disociación de los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola se determinaron mediante Biacore. En los Ejemplos 4 y 7, se utilizaron ensayos de neutralización para determinar la infectividad de diversas cepas del virus Ébola.

[0212] Los anticuerpos específicos de la GP del virus del Ébola pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o una fracción aminoterminal o carboxiterminal. En una realización, el marcador o la fracción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la parte carboxiterminal del péptido sea distal a la superficie. En una realización, el marcador puede ser un radionúclido, un colorante fluorescente o un marcador detectable por MRI. En determinados aspectos, dichos anticuerpos marcados pueden usarse en ensayos de diagnóstico que incluyen ensayos de obtención de imágenes.

[0214] Fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos

[0216] A menos que se indique específicamente lo contrario, el término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir,"moléculas de anticuerpo completas") así como los fragmentos de unión a antígenos de las mismas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se utilizan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente al virus del Ébola. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')<2>, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. En determinados aspectos, la expresión "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una molécula de unión a antígeno multiespecífica. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y (opcionalmente) constantes de anticuerpos. Dicho ADN se conoce y/o puede adquirirse fácilmente, p. ej., en fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

[0218] Algunos ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR injertadas, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), pequeños inmunofármacos modulares (SMIP,small modular immunopharmaceuticals) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen en la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento.

[0220] Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR, que sea adyacente a una o más secuencias marco o esté dentro del marco de lectura. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V<H>asociado a un dominio V<L>, los dominios V<H>y V<L>pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V<H>- V<H>, V<H>- V<L>o V<L>- V<L>. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<H>o V<L>monomérico.

[0222] En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones no limitativas e ilustrativas de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) V<H>-C<H>1; (ii) V<H>- C<H>2; (iii) V<H>-C<H>3; (iv) V<H>-C<H>1-C<H>2; (v) V<H>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (vi) V<H>-C<H>2-C<H>3; (vii) V<H>-C<L>; (viii) V<L>-C<H>1; (ix) V<L>-C<H>2; (x) V<L>-C<H>3; (xi) V<L>-C<H>1-C<H>2; (xii) V<L>-C<H>1-C<H>2-C<H>3; (xiii) V<L>-C<H>2-C<H>3; y (xiv) V<L>-C<L>. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, que incluye cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Así mismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o un heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V<H>o V<L>monoméricos (por ejemplo, mediante enlaces disulfuro).

[0224] Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación mediante técnicas habituales disponibles en la técnica.

[0226] Preparación de anticuerpos humanos

[0228] En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente divulgación para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a la GP del virus del Ébola. Para generar anticuerpos contra el virus del Ébola, puede usarse un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de los siguientes. Los anticuerpos pueden obtenerse de ratones inmunizados con una GP originaria, de longitud completa, del virus del Ébola (Véase, por ejemplo, los números de registro del GenBank AHX24649.1 (SEQ ID NO: 314) y AHX24649.2 (SEQ ID NO: 315) o con ADN que codifique la glucoproteína o un fragmento de la misma. Como alternativa, la GP del virus del Ébola o un fragmento de la misma puede producirse usando técnicas bioquímicas convencionales y modificarse y usarse como inmunógeno. El inmunógeno puede ser una GP del virus del Ébola producida de manera recombinante o un fragmento de la misma. El inmunógeno puede ser una GP del virus del Ébola disponible en el comercio. En determinados aspectos, pueden administrarse una o más inyecciones de refuerzo. Las inyecciones de refuerzo pueden comprender una o más GP del virus del Ébola disponibles en el comercio. El inmunógeno puede ser una GP recombinante del virus del Ébola expresada enE. colio en cualquier otra célula eucariota o de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino (CHO,Chinese Hamster Ovary).

[0230] Utilizando tecnología VELOCIMMUNE<®>(véase, por ejemplo, el documento US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE<®>) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra la GP del virus del Ébola que tengan una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE<®>implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a locus endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano.

[0232] Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE<®>se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tal como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales y dichas estirpes celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

[0233] Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la divulgación, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

[0234] Bioequivalentes

[0235] Los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse al virus del Ébola. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Análogamente, las secuencias de ADN que codifican anticuerpos de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado en el presente documento.

[0236] Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, p. ej., el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto.

[0237] Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza, o potencia.

[0238] Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede alternar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o una disminución de la eficacia, en comparación con la continuación de la terapia sin dicho cambio.

[0239] Dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante uno o más mecanismos de acción comunes para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

[0240] La bioequivalencia puede demostrarse mediante métodosin vivoy/oin vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una pruebain vitroque se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos; (c) una pruebain vivoen seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

[0241] Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, p. ej., mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

[0242] Anticuerpos contra el virus del Ébola que comprenden variantes de Fc

[0243] De acuerdo con determinados aspectos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos contra el virus del Ébola que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, p. ej., a pH ácido, en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos contra la GP del virus del Ébola que comprenden una mutación en la región C<H>2 o C<H>3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (p. ej., en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Algunos ejemplos no limitativos de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (p. ej., 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y una en 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (p. ej., H433K) y una modificación en 434 (p. ej., 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (p. ej., 308F o 308P). En otro aspecto más, la modificación comprende una modificación en 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación en 297A (por ejemplo, N297A).

[0245] Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos contra el virus del Ébola que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 2571 y 3111 (por ejemplo, P257I y Q311I); 2571 y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (p. ej., D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Se contemplan todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc mencionadas anteriormente y otras mutaciones dentro de los dominios variables del anticuerpo divulgados en el presente documento dentro del alcance de la presente invención.

[0247] La presente divulgación también incluye anticuerpos contra el virus del Ébola que comprenden una región constante de cadena pesada (C<H>) quimérica, en donde la región C<H>quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones C<H>de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden comprender una región C<H>quimérica que comprende parte o todo el dominio C<H>2 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio C<H>3 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación comprenden una región C<H>quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, en combinación con una secuencia "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. De acuerdo con determinados aspectos, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región C<H>quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, presentar funciones efectoras de Fc modificadas sin que ello afecte negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, p. ej., la solicitud provisional de EE.UU. Nº 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013).

[0248] Características biológicas de los anticuerpos

[0250] En general, los anticuerpos de la presente divulgación funcionan uniéndose a la GP del virus del Ébola. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a la GP del virus del Ébola (p. ej., a 25 °C o a 37 °C) con una K<D>inferior a 10<-7>M, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo descrito en el presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden unirse a la GP del virus del Ébola con una K<D>inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a 250 pM o inferior a 100 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo descrito en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.

[0252] La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al virus del Ébola con una semivida (t½) de disociación de más de aproximadamente 3 minutos medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, o de más de aproximadamente 1 minuto medida por resonancia de plasmón superficial a 37 °C, p. ej., y un aumento de al menos 3 veces en la semivida (t½) de disociación a pH 5 o pH 6; usando un formato de ensayo como el definido en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación pueden unirse al virus del Ébola con una t½ superior a aproximadamente 10 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 200 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente 400 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos, superior a aproximadamente 600 minutos, superior a aproximadamente 700 minutos, superior a aproximadamente 800 minutos, superior a aproximadamente 900 minutos o superior a aproximadamente 1000 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o a 37 °C p. ej., usando un formato de ensayo como el definido en el presente documento (p. ej., un formato de captura de Acm o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.

[0254] La presente divulgación incluye también anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que neutralizan la infectividad del virus Ébola en sus células hospedadoras. En algunos aspectos, los anticuerpos presentan una fuerza de neutralización frente a las VLP Zaire.2014 con una CI<50>que varía de aproximadamente 10<-11>M a aproximadamente 10<-9>M. Los anticuerpos de la divulgación también reaccionan en cruzado las VLP del virus Ébola que contienen GP (glucoproteínas) de diversas cepas del VEBO, incluyendo Zaire.1995, Zaire.2014, Ébola, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil. Los anticuerpos de la divulgación también actúan como mediadores en la ADCC como se muestra en el Ejemplo 5. Por otro lado, los anticuerpos de la divulgación compiten de forma cruzada con otros anticuerpos que se unen a la GP del VEBO, como se muestra en el Ejemplo 6.

[0256] La divulgación proporciona un anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la GP del virus Ébola, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano; (b) se une al virus del Ébola, o a una partícula similivírica (VLP) que expresa una glucoproteína del virus del Ébola con una constante de disociación (K<D>) inferior a 10<-7>M, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial; (c) demuestra un aumento de al menos 3 veces en la semivida (t½) de disociación a pH 5 o pH 6 en comparación con pH 7,4; (d) demuestra neutralización del virus del Ébola Zaire con una CI<50>que varía de aproximadamente 10<-11>M a aproximadamente 10<-9>M; (e) demuestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de las células infectadas por el virus del Ébola; (f) reacciona de forma cruzada con una o más cepas de VLP del virus del Ébola seleccionadas del grupo que consiste en Zaire.2014, Zaire.1995, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil; (g) compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la Tabla 1.

[0258] Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mismas. A continuación se resumen algunas de las propiedades de los anticuerpos. Otras características biológicas de los anticuerpos serán evidentes para un experto en la materia a partir de una revisión de la presente divulgación que incluye los ejemplos de trabajo del presente documento.

[0260] Acm Propiedades de los Acm Neutralización Neutralización de ADCC Unión a de pseudovirus virus vivos sGP

[0261] CI50 (M)

[0262] H1H17161P Neutralizante, ADCC-, sGP- 8,3E-11 Sí No No H1H17139P No neutralizante, ADCC , sGP+ No No Sí Sí H1H17203P Neutralizante, ADCC , sGP- 2E-10 No Sí No

[0263] Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

[0265] La presente divulgación incluye anticuerpos contra el virus del Ébola que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de la GP del virus del Ébola. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos localizados dentro de la molécula de GP del virus del Ébola (p. ej., un epítopo lineal en un dominio). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos localizados dentro de la GP del virus del Ébola (p. ej. un epítopo conformacional).

[0267] Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo cruzado habituales, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Otros métodos incluyen análisis mutacionales de barrido de alanina, análisis de hibridación de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análisis de escisión de péptidos, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden conservar deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem.73: 256A-265A.

[0269] El término "epítopo" se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial exclusiva.

[0271] El perfilado asistido por modificación (MAP,Modification-Assisted Profiling), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP,Antigen Structure-based Antibody Profiling) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (Acm) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (véase el documento US 2004/0101920). Cada categoría puede corresponder a un epítopo exclusivo ya sea claramente distinto o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen Acm que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la divulgación en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

[0273] Los anticuerpos del virus del Ébola o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden unirse a un epítopo dentro de una o más de las regiones ilustradas en la GP del virus del Ébola, bien en forma natural o producida de manera recombinante, o a un fragmento de la misma.

[0275] La presente divulgación incluye anticuerpos contra la GP del virus del Ébola que se unen al mismo epítopo, o a una parte del epítopo. Análogamente, la presente divulgación también incluye anticuerpos contra la GP del virus del Ébola que compiten por la unión a la GP del virus del Ébola o a un fragmento de la misma con cualquiera de los anticuerpos específicos ilustrativos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos contra la GP del virus del Ébola que compiten de forma cruzada para unirse al virus del Ébola con uno o más anticuerpos obtenidos a partir de los anticuerpos descritos en las Tablas 1 y 2.

[0277] Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola usando métodos habituales conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola de la divulgación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una GP o péptido del virus del Ébola en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la GP del virus del Ébola. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la GP del virus del Ébola después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola, se puede concluir que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de referencia contra el virus del Ébola. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la GP del virus del Ébola después de la unión por saturación con el anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el del anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola de la divulgación.

[0279] Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo de referencia contra la GP del virus del Ébola, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una GP del virus del Ébola en condiciones de saturación seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la GP del virus del Ébola. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una GP del virus del Ébola en condiciones de saturación seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la GP del virus del Ébola. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la GP del virus del Ébola, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la GP del virus del Ébola. Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

[0281] Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o a epítopos solapantes si cada uno de ellos inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo, inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 % medido en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghanset al., Cancer Res.199050:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

[0283] Para confirmar si la ausencia de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe efectivamente a que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es el responsable de la ausencia de unión observada, puede realizarse experimentación habitual adicional (p. ej., mutación de péptidos y análisis de unión). Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia.

[0284] Inmunoconjugados

[0285] La divulgación abarca un anticuerpo monoclonal contra la GP del virus del Ébola humano conjugado con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un fármaco antivíri

[0286] se utiliza en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo, que está química o biológicamente unido a un agente radiactivo, una citocina, un interferón, una fracción diana o indicadora, una enzima, un péptido o proteína o un agente terapéutico. El anticuerpo puede estar unido al agente radiactivo, citocina, interferón, fracción diana o indicadora, enzima, péptido o agente terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana. Como ejemplos de inmunoconjugados se incluyen conjugados de anticuerpo y fármaco y proteínas de fusión de anticuerpo y toxina. En un aspecto, el agente puede ser un segundo anticuerpo diferente contra el virus del Ébola, o la GP del virus del Ébola. En determinados aspectos, el anticuerpo puede conjugarse con un agente específico de una célula infectada por un virus. El tipo de fracción terapéutica que puede conjugarse con el anticuerpo contra el virus del Ébola, tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico que se desea lograr. En la técnica se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados; véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.

[0287] Anticuerpos multiespecíficos

[0288] Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecífico o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, p. ej., Tuttet al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kuferet al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244.

[0289] Cualquiera de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la divulgación, o variantes de las mismas, pueden construirse usando técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, tecnología de ADN recombinante y expresión de proteínas), como sabrá un experto familiarizado con la materia.

[0290] En algunos aspectos, se generan anticuerpos específicos del virus del Ébola en un formato biespecífico (un "biespecífico") en el que las regiones variables que se unen a distintos dominios del virus del Ébola se unen entre sí para conferir especificidad de doble dominio dentro de una sola molécula de unión. Los biespecíficos diseñados adecuadamente pueden mejorar la eficacia inhibidora global de la proteína del virus del Ébola al aumentar tanto la especificidad como la avidez de unión. Las regiones variables con especificidad para dominios individuales, (p. ej., segmentos del dominio aminoterminal), o que pueden unirse a diferentes regiones dentro de un dominio, se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región se una simultáneamente a los epítopos separados, o a diferentes regiones dentro de un dominio. En un ejemplo de un biespecífico, las regiones variables de la cadena pesada (V<H>) de un ligante con especificidad para un dominio se recombinan con regiones variables de la cadena ligera (V<L>) a partir de una serie de ligantes con especificidad para un segundo dominio para identificar parejas V<L>no afines que se pueden emparejar con una V<H>original sin alterar la especificidad original para esa V<H>. De este modo, un único segmento V<L>(por ejemplo, V<L>1) se puede combinar con dos dominios V<H>diferentes (por ejemplo, V<H>1 y V<H>2) para generar un biespecífico comprendido por dos "brazos" de unión (V<H>1-V<L>1 y V<H>2-V<L>1). El uso de un solo segmento de V<L>reduce la complejidad del sistema y, por lo tanto, simplifica y aumenta la eficiencia en los procesos de clonación, expresión y purificación utilizados para generar el biespecífico (véase, por ejemplo, USSN13/022759 y US2010/0331527).

[0291] Como alternativa, los anticuerpos que se unen a más de un dominio y una segunda diana, tales como, pero sin limitación, por ejemplo, un segundo anticuerpo diferente contra el virus del Ébola, pueden prepararse en un formato biespecífico usando técnicas descritas en el presente documento, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las regiones variables de anticuerpos que se unen a regiones distintas pueden unirse junto con regiones variables que se unen a sitios relevantes en, por ejemplo, virus del Ébola, para conferir especificidad de antígeno doble dentro de una única molécula de unión. Los biespecíficos adecuadamente diseñados de esta naturaleza cumplen una doble función. Las regiones variables con especificidad para el dominio extracelular se combinan con una región variable con especificidad del exterior del dominio extracelular y se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región variable se una a los antígenos separados.

[0292] Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente divulgación implica el uso de un primer dominio C<H>3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C<H>3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C<H>3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un aspecto, el primer dominio C<H>3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C<H>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C<H>3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C<H>3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (según IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (según IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente divulgación se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

[0293] Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente divulgación incluyen, sin limitación, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones de IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, Quadroma, botones en ojales (knobs-into-holes), cadena ligera común (p. ej., cadena ligera común con "botones en ojales", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body (Strand-Exchange Engineered Domain, diseño de dominios para el intercambio de cadenas) de anticerpos, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab<2>(véase, por ejemplo, Kleinet al.2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). Además, pueden construirse anticuerpos biespecíficos utilizando conjugación de péptido/ácido nucleico, p. ej., en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazaneet al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).

[0295] Administración terapéutica y formulaciones

[0297] La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación. Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrarán con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. Una multitud de formulaciones adecuadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN<™>), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm. Sci. Technol.52:238-311.

[0299] La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y la estatura de un sujeto a recibir la administración, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares. Cuando un anticuerpo de la presente divulgación se usa para tratar una enfermedad o un trastorno en un paciente adulto, o para prevenir dicha enfermedad, es ventajoso administrar el anticuerpo de la presente divulgación, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinados aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg o de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg o hasta aproximadamente 50 mg. En determinados aspectos, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos de 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.

[0301] Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wuet al.(1987) J. Biol. Chem.

[0302] 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

[0304] En el presente documento también se contempla el uso de nanopartículas para suministrar los anticuerpos de la presente divulgación. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo pueden usarse para aplicaciones tanto terapéuticas como de diagnóstico. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo y los métodos de preparación y uso se describen en detalle en Arruebo, M.,et al.2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volumen 2009, Artículo ID 439389, 24 páginas, doi: 10.1155/2009/439389). Se pueden desarrollar nanopartículas y conjugarlas a anticuerpos contenidos en composiciones farmacéuticas para dirigirlas a células infectadas por virus. También se han descrito nanopartículas para el suministro de fármacos, por ejemplo, en los documentos US 8257740 o US 8246995.

[0305] En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba. En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada cerca de la diana de la composición, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.

[0306] Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosa, subcutánea, intracutánea, intracraneal, intraperitoneal e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleaginoso usado convencionalmente para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros coadyuvantes, etc., que pueden usarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio oleaginoso, se emplean, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de esta manera se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

[0307] Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo inyector de pluma tiene aplicaciones evidentes en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

[0308] Numerosos dispositivos de suministro de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención. Algunos ejemplos incluyen, pero ciertamente sin limitación, AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25<™>, pluma HUMALOG<™>, pluma HUMALIN 70/30<™>(Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN<™>I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR<™>(Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD<™>(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN<™>, OPTIPEN PRO<™>, OPTIPEN STARLET<™>y OPTICLIK<™>(Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de suministro de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR<™>(Sanofi-Aventis), la FLEXPEN<™>(Novo Nordisk) y la KWIKPEN<™>(Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK<™>(Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET<™>(Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA<™>(Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.

[0309] Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo esté contenido en aproximadamente de 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente de 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

[0310] Usos terapéuticos de los anticuerpos

[0311] Los anticuerpos de la presente divulgación son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o trastorno o afección asociada a infección por el virus del Ébola y/o para mejorar al menos un síntoma asociado a dicha enfermedad, trastorno o afección.

[0312] En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación son útiles para tratar a sujetos que padecen la infección respiratoria grave y aguda causada por el virus del Ébola. En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación son útiles para disminuir los títulos virales o reducir la carga vírica en el hospedador. En un aspecto, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación puede administrarse a una dosis terapéutica a un paciente con infección por el virus del Ébola.

[0313] Se pueden administrar uno o más anticuerpos de la presente divulgación para aliviar o prevenir o disminuir la gravedad de uno o más de los síntomas o afecciones de la enfermedad o trastorno. Los anticuerpos pueden utilizarse para mejorar o reducir la gravedad de al menos un síntoma de infección por el virus del Ébola, incluyendo, pero sin limitación, fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable.

[0314] También se contempla en el presente documento el uso de uno o más anticuerpos de la presente divulgación profilácticamente en sujetos con riesgo de desarrollar una infección por el virus del Ébola, tal como un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola o que viaja con frecuencia.

[0315] En un aspecto adicional de la divulgación, los presentes anticuerpos se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes que padecen una infección por el virus del Ébola. En otro aspecto de la divulgación, los presentes anticuerpos se usan como terapia complementaria con cualquier otro agente o cualquier otra terapia conocida por los expertos en la materia, útil para tratar o mejorar una infección por el virus del Ébola.Combiterapias

[0316] Las combiterapias pueden incluir un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse de manera ventajosa con un anticuerpo de la divulgación, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la divulgación. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden combinarse sinérgicamente con uno o más fármacos o agentes utilizados para tratar la infección por el virus del Ébola. Por ejemplo, como agentes ilustrativos para tratar una infección vírica pueden incluirse, p. ej., un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (tal como corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el virus del Ébola, una vacuna para el virus del Ébola, terapia ZMapp, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola), interferones, o cualquier otra terapia paliativa para tratar una infección por el virus del Ébola.

[0317] En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación pueden combinarse con un segundo agente terapéutico para reducir la carga vírica en un paciente con infección por el virus del Ébola, o para mejorar uno o más síntomas de la infección.

[0318] En determinados aspectos, el segundo agente terapéutico es otro anticuerpo diferente, o un cóctel de anticuerpos específicos para la GP del virus Ébola, en donde el anticuerpo o anticuerpos diferentes dentro del cóctel pueden o no unirse al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, como un anticuerpo de la presente divulgación. En determinados aspectos, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo contra una proteína diferente del virus del Ébola. El segundo anticuerpo puede ser específico de una o más proteínas diferentes del virus del Ébola procedentes de distintas cepas del virus. En el presente documento se contempla el uso de una combinación ("cóctel") de los anticuerpos de la divulgación con actividad neutralizadora o inhibidora frente al virus del Ébola. En algunos aspectos, se pueden combinar anticuerpos que no compiten entre sí y administrarlos a un sujeto que lo necesite, para reducir la capacidad del virus del Ébola de evadir la respuesta debido a mutaciones. En algunos aspectos, los anticuerpos que comprenden la combinación se unen a epítopos distintos no solapantes de la GP. Los anticuerpos que comprenden la combinación pueden bloquear la unión del virus y/o su entrada en y/o fusión con las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden interactuar con la GP de una cepa del VEBO seleccionada de Zaire, Sudán, Bundibugyo o Costa de Marfil, y cuando se usa en solitario o junto con uno cualquiera o más de los agentes indicados anteriormente, pueden neutralizar una cualquiera o más de las cepas del virus del Ébola indicada.

[0319] En el presente documento también se contempla el uso de una combinación de anticuerpos contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación, en donde la combinación comprende uno o más anticuerpos que no compiten de forma cruzada. En determinados aspectos, la combinación incluye un cóctel que comprende una mezcla de al menos tres anticuerpos de la divulgación. Los anticuerpos dentro del cóctel pueden diferir en su capacidad para neutralizar el virus o las células infectadas por el virus, o en su capacidad para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), o en su capacidad para unirse a la glucoproteína soluble (sGP) del VEBO.

[0320] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "junto con" significa que pueden administrarse uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales antes de, de manera concurrente con, o después de, la administración de al menos un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación, o de un cóctel que comprende uno o más de los anticuerpos de la presente divulgación. La expresión "junto con" también incluye la administración secuencial o concomitante de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y un segundo agente terapéutico.

[0321] El/los componente(s) terapéuticamente activo(s) adicional(es) puede(n) administrarse a un sujeto antes de la administración de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "antes que" un segundo componente si el primer componente se administra 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas antes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes, 10 minutos antes, 5 minutos antes, o menos de 1 minuto antes de la administración del segundo componente. En otros aspectos, el/los componente(s) terapéuticamente activo(s) adicional(es) puede(n) administrarse a un sujeto después de la administración de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "después" de un segundo componente si el primer componente se administra 1 minuto después, 5 minutos después, 10 minutos después, 15 minutos después, 30 minutos después, 1 hora después, 2 horas después, 3 horas después, 4 horas después, 5 horas después, 6 horas después, 12 horas después, 24 horas después, 36 horas después, 48 horas después, 60 horas después, 72 horas después de la administración del segundo componente. En otros aspectos más, el/los componente(s) terapéuticamente activo(s) adicional(es) puede(n) administrarse a un sujeto de manera concurrente con la administración de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación. La administración "concurrente", para los fines de la presente divulgación, incluye, p. ej., la administración al sujeto de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y un componente terapéuticamente activo adicional en una forma farmacéutica única, o en formas farmacéuticas independientes administradas al sujeto en aproximadamente 30 minutos o menos entre sí. Si se administran en formas farmacéuticas independientes, cada forma farmacéutica puede administrarse por la misma vía (p. ej., tanto el anticuerpo contra la GP del virus del Ébola como el componente terapéuticamente activo adicional, pueden administrarse por vía intravenosa, etc.); como alternativa, cada forma farmacéutica puede administrarse por una vía diferente (p. ej., el anticuerpo contra la GP del virus del Ébola puede administrarse por vía intravenosa y el componente terapéuticamente activo adicional puede administrarse por vía oral). En cualquier caso, la administración de los componentes en una forma farmacéutica única, en formas farmacéuticas independientes, por la misma vía, o en formas farmacéuticas independientes, por vías diferentes, se considera "administración concurrente", para los fines de la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, la administración de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola "antes de", "concurrente con", o "después de" (como se han definido anteriormente esos términos en el presente documento) la administración de un componente terapéuticamente activo adicional, se considera administración de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola "junto con" un componente terapéuticamente activo adicional.

[0323] La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación se coformula con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra cualquier otra parte del presente documento.

[0325] Pautas de administración

[0327] De acuerdo con determinados aspectos, puede administrarse una dosis única de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación (o una composición farmacéutica que comprenda una combinación de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto que lo necesite. De acuerdo con determinados aspectos de la presente divulgación, pueden administrarse múltiples dosis de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola (o una composición farmacéutica que comprenda una combinación de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación. Como se utiliza en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo contra la GP del virus del Ébola se administra al sujeto en un punto de tiempo diferente, p. ej., en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (p. ej., horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola, seguida de una o más dosis secundarias del anticuerpo contra la GP del virus del Ébola y, opcionalmente, seguidas de una o más dosis terciarias del anticuerpo contra la GP del virus del Ébola.

[0329] Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias" se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo contra la GP del virus del Ébola, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinados aspectos, sin embargo, la cantidad de anticuerpo contra la GP del virus del Ébola contenida en las dosis iniciales, secundarias y/o terciarias varía entre sí (p. ej., ajustadas al alza o a la baja según corresponda) durante el transcurso del tratamiento. En determinados aspectos, dos o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (p. ej., "dosis de mantenimiento").

[0331] En determinados aspectos ilustrativos de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 48 horas (p. ej., 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ o más) después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de anticuerpo contra la GP del virus del Ébola, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.

[0332] Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola. Por ejemplo, en determinados aspectos, al paciente se le administra únicamente una sola dosis secundaria. En otros aspectos, al paciente se le administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias. Análogamente, en determinados aspectos, al paciente se le administra únicamente una sola dosis terciaria. En otros aspectos, al paciente se le administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias.

[0333] En determinados aspectos de la divulgación, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual, después de la exploración clínica.

[0334] Usos diagnósticos de los anticuerpos

[0335] Los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola de la presente divulgación pueden usarse para detectar y/o medir el virus del Ébola en una muestra, p. ej., con fines diagnósticos. Algunos aspectos de la divulgación contemplan el uso de uno o más anticuerpos de la presente divulgación en ensayos para detectar una enfermedad o trastorno, tal como infección vírica. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos para el virus del Ébola pueden comprender, p. ej., poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo contra la GP del virus del Ébola de la divulgación, en donde el anticuerpo contra la GP del virus del Ébola está marcado con un marcador detectable o una molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente el virus del Ébola de las muestras del paciente. Como alternativa, un anticuerpo no marcado contra la GP del virus del Ébola puede usarse en aplicaciones diagnósticas junto con un anticuerpo secundario que esté a su vez marcado de manera detectable. El marcador detectable o la molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como<3>H,<14>C,<32>P,<35>S o<125>I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos específicos ilustrativos que pueden utilizarse para detectar o medir el virus del Ébola en una muestra incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay), radioinmunoanálisis (RIA) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS,Fluorescence-Activated Cell Sorting).

[0336] Las muestras que pueden usarse en ensayos diagnósticos del virus del Ébola de acuerdo con la presente divulgación, incluyen cualquier muestra de tejido o líquido que pueda obtenerse de un paciente, que contenga cantidades detectables del virus del Ébola o de fragmentos del mismo, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles del virus del Ébola de una muestra concreta obtenida de un paciente sano (p. ej., un paciente no afectado por una enfermedad asociada al virus del Ébola) se medirán inicialmente para establecer un nivel de referencia, o estándar, del virus del Ébola. Este nivel de referencia del virus del Ébola puede compararse después con los niveles del virus del Ébola medidos en muestras obtenidas de individuos que se sospecha que padecen una afección asociada al virus del Ébola o síntomas asociados a dicha afección.

[0337] Los anticuerpos específicos del virus del Ébola pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o una fracción aminoterminal o carboxiterminal. En un aspecto, el marcador o la fracción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la parte carboxiterminal del péptido sea distal a la superficie.

[0338] Ejemplos

[0339] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos familiarizados con la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han realizado intentos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, la temperatura ambiente es de aproximadamente 25 °C y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

[0340] Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra el virus del Ébola

[0341] En un ratón que contenía ADN que codificaba las regiones variables de las cadenas pesada y ligera kappa de inmunoglobulina humana, se generaron anticuerpos humanos contra el virus del Ébola. En un aspecto, los anticuerpos humanos contra el virus del Ébola se generaron en un ratón VELOCIMMUNE<®>. En un aspecto, se inmunizó a ratones VelocImmune<®>(VI) con ADN que codificaba la GP de longitud completa del virus del Ébola [Zaire ebolavirus 2014 (GenBank: KJ660346.2)]. Los anticuerpos se generaron siguiendo un régimen acelerado que comprendía 2 inmunizaciones separadas por 2 semanas. La respuesta inmunitaria de los anticuerpo se controló mediante un inmunoensayo específico de la GP del virus del Ébola. Por ejemplo, se analizaron los sueros para determinar los títulos de los anticuerpos específicos contra la GP de longitud completa purificada del VEBO, las proteínas de las subunidades de la GP (GP1 y GP2) y las partículas similivíricas (VLP) que expresan la GP del VEBO. Los clones productores de anticuerpos se aislaron utilizando tanto la tecnología de clasificación de linfocitos B (BST,B-cell Sorting Technology) como los métodos de hibridoma. Por ejemplo, cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se exploraron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que producían anticuerpos específicos de la GP del virus del Ébola. Utilizando esta técnica y los diversos inmunógenos descritos anteriormente, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos (es decir, anticuerpos que poseían dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron H1M17354N, H2aM17356N, H1M17357N, H2aM17358N, H2aM17359N y H2aM17360N. También se aislaron anticuerpos contra el virus del Ébola directamente de linfocitos B de ratón positivos al antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en la patente de EE. UU. 7582298. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos contra la GP del virus del Ébola completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseían dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron H1H17134P, H1H17139P, H1H17142P, H1H17151P, H1H17161P, H1H17162P, H1H17193P, H1H17196P, H1H17199P, H1H17203P, H1H17214P, H1H17219P, H1H17223P y H1H17228P.

[0342] Las propiedades biológicas de los anticuerpos ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos que se exponen a continuación.

[0343] Ejemplo 2: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable de la cadena pesada y ligeraEn la Tabla 1 se exponen los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y de las CDR de los anticuerpos contra el virus del Ébola seleccionados desvelados en el presente documento. En la Tabla 2 se exponen los identificadores de secuencia de ácidos nucleicos correspondientes.

[0344] Tabla 1: Identificadores de secuencia de aminoácidos

[0347]

[0348] continuación

[0351]

[0353] Tabla 2: Identificadores de secuencias de ácidos nucleicos

[0356]

[0358] Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo de Fc (p. ej., "H1H", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (p. ej., "17139", "17161", etc., como se muestra en la Tabla 1 o 2), seguido de un sufijo "P", "P2", "N", N2 o "B". Los prefijos H1H y H2M de las denominaciones de los anticuerpos utilizadas en el presente documento indican el isotipo particular de la región Fc del anticuerpo. Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, p. ej., "H1H17359N", "H2aM17359N", etc. Por ejemplo, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón (isotipo a o b) (todas las regiones variables son completamente humanas como lo indica la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular puede convertirse en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón puede convertirse en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluidas las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1 o 2, permanecerán iguales, se espera que las propiedades de unión al antígeno sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.

[0359] Ejemplo 3: Unión de anticuerpos a la GP del virus Ébola determinada mediante Resonancia de Plasmón Superficial

[0360] A. Constante de velocidad de disociación dependiente del pH a 37 °C

[0361] Utilizando un ensayo biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore T200, se determinaron las constantes de velocidad de disociación (kd

) y las semividas (t<½>) de disociación de la unión de la GP del virus del Ébola a anticuerpos monoclonales purificados contra la GP del virus del Ébola a 37 °C. La superficie del sensor CM4 Biacore se derivatizó mediante acoplamiento de aminas con un anticuerpo de ratón monoclonal contra la Fc humana (GE, n.º BR-1008-39) o con un anticuerpo monoclonal de cabra contra la Fc de ratón (GE, n.º BR-1008-38) para capturar Acm purificados contra la GP del virus del Ébola. Todos los estudios de unión Biacore del Ejemplo 3A se realizaron en un tampón compuesto por Na<2>HPO<4>/NaH<2>PO<4>0,01 M, NaCl 0,15 M, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v (tampón de trabajo PBS-P) a un pH de 7,4, 6,0 y 5,0. Se realizó un seguimiento a pH bajo para evaluar si los anticuerpos conservaban la unión a pH bajo. Esto imitaría las condiciones que el virus encontrará durante la fusión de membranas, tras la acidificación del endosoma. Diferentes concentraciones de GP del virus del Ébola con una etiqueta de polihistidina carboxiterminal (EbolaGP.his; Sino Biologicals, catálogo n.º 40442-V08B1) preparadas en tampón de trabajo PBS-P (que variaba de 90 nM a 11,1 nM, diluciones de factor 3) se inyectaron sobre la superficie capturada con el Acm contra la GP del virus del Ébola a un caudal de 25 µl/minuto. La asociación de la GP del virus del Ébola al anticuerpo monoclonal capturado se controló durante 5 minutos y la disociación de la GP del virus del Ébola en el tampón de trabajo PBS-P se controló durante 6 minutos. Todos los experimentos de constante de velocidad de disociación se realizaron a 37 °C. Las constantes de velocidad de disociación (kd

) cinética se determinaron ajustando los sensorgramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las semividas (t½) de disociación se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética de la siguiente manera:

[0364]

[0366] En la Tabla 3 se muestran los parámetros de velocidad de disociación de la unión de la GP del virus del Ébola a Acm purificados contra la GP del virus del Ébola a 37 °C.

[0367] Tabla 3: De endencia del H de las semividas de disociación a 37 °C

[0370]

[0371] continuación

[0374]

[0376] B. Afinidad de unión y cinética a 25 °C y 37 °C

[0377] Usando un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real con un instrumento Biacore 4000, se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (valoresKD

) de la unión de la GP del virus del Ébola a los Acm purificados contra la GP del virus del Ébola. La superficie del sensor CM4 Biacore se derivatizó mediante acoplamiento de aminas con un anticuerpo de ratón monoclonal contra la Fc humana (GE, n.º BR-1008-39) o con un anticuerpo monoclonal de cabra contra la Fc de ratón (GE, n.º BR-1008-38) para capturar Acm purificados contra la GP del virus del Ébola. Todos los estudios de unión Biacore del Ejemplo 3B se realizaron en un tampón compuesto por HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v (tampón de trabajo HBS-ET). Diferentes concentraciones de GP del virus del Ébola con una etiqueta de polihistidina carboxiterminal (Sino Biologicals, Catálogo n.º 40442-V08B1) preparadas en tampón de trabajo HBS-ET (que variaba de 90 nM a 3,3 nM, diluciones de factor 3) se inyectaron sobre la superficie capturada con el Acm con la GP del virus del Ébola a un caudal de 30 µl/minuto. La asociación de la GP del virus del Ébola al anticuerpo monoclonal capturado se controló durante 5 minutos y la disociación de la GP del virus del Ébola en el tampón de trabajo HBS-ET se controló durante 10 minutos. Todos los experimentos de cinética de unión se realizaron a 25 °C y 37 °C. Las constantes de velocidad de asociación (ka

) y disociación (kd

) cinéticas se determinaron ajustando los sensorgramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes de equilibrio de disociación (KD

) de la unión y las semividas (t½) de disociación, se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética de la siguiente manera:

[0380]

[0381] En las Tablas 4A y 4B se muestran los parámetros cinéticos de unión de la GP del virus del Ébola a los Acm purificados contra la GP del virus del Ébola a 25 °C y 37 °C.

[0382] Tabla 4A: Cinética de unión a 25 °C

[0385]

[0386] continuación

[0387]

[0389] Tabla 4B in tica de uni n a 37 .

[0390]

[0392] continuación

[0393]

[0395] Resultados

[0396] Como se muestra en las Tablas 4A y 4B anteriores, los anticuerpos se unieron a la GP del virus del Ébola con valores de K<D>que variaban de 934 pM a 1890 nM a 25 °C y de 227 pM a 2310 nM a 37 °C. A pH 7,4, los anticuerpos mostraron valores de semivida (t½) de disociación que variaban de 3,0 minutos a más de 1155 minutos a 25 °C y de 2,0 minutos a más de 1155 minutos a 37 °C. No se observó pérdida de unión a pH bajo. Varios anticuerpos mostraron valores de semivida (t½) de disociación aumentados a pH bajo en relación con pH 7,4. Los anticuerpos con aumentos de 3 veces o mayores en los valores de semivida (t½) de disociación a pH 5 y/o pH 6 incluyen H1H17162P, H1H17177P, H1H17150P, H1H17151P, H1H17160P, H1H17161P, H1H17141P, H1H17139P, H1H17210P, H1H17203P, H1H17199P, H1M17348N, H1M17350N, H2aM17360N y H2aM17361N.

[0397] Ejemplo 4: Generación de pseudopartículas del virus del Ébola y estudios de neutralización

[0398] Las pseudopartículas del virus del Ébola (también denominadas partículas similivíricas o VLP) se generaron mediante la cotransfección de células 293T con una mezcla de construcciones plasmídicas que expresaban la GP del virus del Ébola, el gen gag-pol del VIH y un vector provírico del VIH que codifica la luciferasa de luciérnaga. Los sobrenadantes que contenían pseudopartículas del virus del Ébola se recogieron 48 horas después de la transfección, se clarificaron usando centrifugación, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C. Las pseudopartículas de control se generaron sustituyendo el plásmido que expresaba la GP del virus del Ébola por un plásmido que codificaba la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VEVg).

[0399] Ensayo de neutralización del Ébola basado en pseudopartículas

[0400] Las pseudopartículas generadas como se ha descrito anteriormente se analizaron en ensayos de neutralización. Específicamente, diluciones de anticuerpos se incubaron con pseudopartículas del virus del Ébola durante 1 h a temperatura ambiente. Las células Huh7 se desprenden utilizando EDTA 0,02 M, se lavan y se incuban con las mezclas de anticuerpos/pseudopartículas durante 72 h. La eficacia de la infección se cuantificó mediante la detección de luciferasa con el ensayo de luciferasa BrightGlo<®>(Promega, San Luis Obispo, CA, EE.UU.) y la lectura se realizó en un lector de placas Victor<®>X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) para medir la producción de luz.

[0401] Tabla 5: Neutralización de VLP de Zaire 2014

[0404]

[0406] continuación

[0407]

[0409] Los datos mostrados en la Tabla 5 indican que 14 de los 20 anticuerpos contra el virus del Ébola divulgados en el presente documento, utilizando el diseño experimental descrito en el presente documento, neutralizan con fuerza la infectividad con una IC<50>que varía de aproximadamente 10<-11>M a aproximadamente 10<-9>M.

[0410] Ejemplo 5: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por anticuerpos contra el virus del ÉbolaLa citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) se comprobó a través de la capacidad de los anticuerpos para señalizar a través de un sistema indicador basado en CD16 (kit básico de bioensayo indicador de ADCC de Promega, San Luis Obispo, CA, EE. UU.). Se sembraron células 293 que expresaban la GP del virus del Ébola. Al día siguiente, se añaden anticuerpos diluidos producidos en estirpes celulares fuc⁻ (véase la patente de EE.UU n.º 8.409.838) y células efectoras (relación efector:diana de 1,5:1) y se incuban durante la noche. La actividad indicadora se midió con el ensayo de luciferasa BioGlo<®>(Promega, San Luis Obispo, CA, EE.UU.) y la lectura se realizó en un lector de placas Victor<®>X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) para medir la producción de luz.

[0411] Tabla 6: Resultados de ADCC

[0414]

[0416] La capacidad de los anticuerpos para actuar como mediadores en la ADCC se calculó basándose en la actividad comparada con un control de isotipo (negativo). Cualquier valor superior a 5 veces por encima del control negativo se consideró positivo. Los datos anteriores de la Tabla 6 muestran que 17 de los 20 anticuerpos contra el virus del Ébola, actuaron como mediadores en la ADCC.

[0417] Ejemplo 6: Competencia cruzada en Octec

[0419] La competencia de unión entre anticuerpos monoclonales contra la GP del virus del Ébola, que previamente se había determinado que se unían a la GP del virus del Ébola, se determinó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa (BLI,bio-layer interferometry) en tiempo real y sin marcaje en un biosensor Octet HTX (ForteBio Corp., una división de Pall Life Sciences). La unión de los controles pertinentes con respecto a la GP soluble (sGP), GP1 o GP2, se midió en el mismo formato de ensayo y su respuesta se restó de la del reactivo de GP del virus Ébola de interés de cada Acm analizado. Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón comprendido por HEPES 0,01 M pH7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, BSA 1,0 mg/ml (tampón HBS-P de Octet) agitando la placa a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si dos anticuerpos podían competir entre sí por la unión a sus respectivos epítopos en la GP del virus del Ébola expresada con una etiqueta de polihistidina carboxiterminal (GP.h del virus del Ébola, Sino Biologicals Inc., véase también GenBank AHX24649.1 y SEQ ID NO: 314), aproximadamente ~1,0 nm de GP del virus del Ébola se capturó primero en biosensores Octet recubiertos con anticuerpos contra penta-His (Fortebio Inc, n.º 18-5079) sumergiendo los biosensores durante 3 minutos en pocillos que contenían una solución de 20 µg/ml de la GP del virus del Ébola. A continuación, los biosensores con antígeno capturado, se saturaron con el primer anticuerpo monoclonal contra la GP del virus de Ébola (en lo sucesivo denominado Acm-1) mediante inmersión durante 5 minutos en pocillos que contenían una solución de 50 µg/ml de Acm-1. A continuación, los biosensores se sumergieron durante 3 minutos en pocillos que contenían una solución de 50 µg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal contra la GP del virus del Ébola (en lo sucesivo denominado Acm-2). Todos los biosensores se lavaron en tampón HBS-ET de Octet entre cada etapa del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el experimento y al final de cada etapa se registró la respuesta de unión. Se comparó la respuesta de unión del Acm-2 a la GP del virus del Ébola previamente complejada con el Acm-1 y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de diferentes anticuerpos monoclonales contra la GP del virus del Ébola utilizando un umbral de inhibición del 50 %. La Tabla 7 define explícitamente las relaciones de los anticuerpos que compiten en ambas direcciones, independientemente del orden de unión.

[0421] Como se muestra en la Tabla 7, la columna de la izquierda muestra los anticuerpos Acm1 que se capturan utilizando los biosensores AHC Octet y la columna de la derecha muestra los anticuerpos (Acm2) que compiten de forma cruzada con el anticuerpo Acm1.

[0423] Tabla 7:Competencia cruzada de anticuerpos contra la GP del virus del Ébola para unirse a la GP del virus del

[0424] Ébola

[0426]

[0427] (continuación)

[0428]

[0429] (continuación)

[0431]

[0433] Ejemplo 7: Unión secuencial de H1H17203P, H1H17139P y H1H17161P a la glucoproteína del virus del ÉbolaTomando la información obtenida de los experimentos de competencia cruzada, se realizó un estudio de unión secuencial para determinar si tres anticuerpos candidatos individuales eran capaces de unirse simultáneamente a la glucoproteína (GP) soluble del virus del Ébola, confirmando de este modo que los sitios de unión en la GP del virus del Ébola son independientes para cada anticuerpo monoclonal. De ser así, esta información respaldaría el uso de estos anticuerpos en un cóctel terapéutico.

[0434] En consecuencia, en experimentos de unión secuencial, se evaluó que tres anticuerpos monoclonales contra la GP del virus del Ébola, H1H17203P, H1H17139P y H1H17161P, se unieran de manera independiente y no competitiva a la GP del virus del Ébola. Este experimento se realizó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa (BLI) en tiempo real y sin marcaje en un biosensor Octet RED (ForteBio Corp., una división de Pall Life Sciences). Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón comprendido por HEPES 0,01 M pH7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, BSA 1,0 mg/ml (tampón HBS-P de Octet) agitando la placa a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si tres anticuerpos eran capaces de unirse simultáneamente al antígeno capturado, la GP del virus del Ébola expresada con una etiqueta de polihistidina carboxiterminal (GP.his del virus del Ébola, Sino Biologicals), en primer lugar, se capturaron aproximadamente ~0,6 nm de GP.h del virus del Ébola en biosensores Octet recubiertos con anticuerpos contra penta-His (Fortebio Inc, n.º 18-5079) sumergiendo los biosensores durante 3 minutos en pocillos que contenían una solución de 20 µg/ml de GP.h del virus del Ébola. A continuación, los biosensores con antígeno capturado, se saturaron con el primer anticuerpo monoclonal contra la GP del virus de Ébola (en lo sucesivo denominado H1H17161P) mediante inmersión en pocillos durante 5 minutos que contenían una solución de 50 µg/ml de H1H17161P REGN (Regeneron). A continuación, los biosensores se sumergieron durante 5 minutos en pocillos que contenían una solución de 50 µg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal contra la GP del virus del Ébola (en lo sucesivo denominado H1H17139P). Por último, se inyectaron 50 µg/ml del tercer anticuerpo (en lo sucesivo denominado H1H17161P) durante 5 minutos para alcanzar la saturación. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el experimento y al final de cada etapa se registró la respuesta de unión.

[0435] Resultados

[0436] Los tres anticuerpos monoclonales candidatos analizados fueron capaces de unirse simultáneamente a la GP del virus del Ébola, lo que indica que ninguno de los anticuerpo interfería con el sitio de unión en la GP del virus del Ébola de los otros anticuerpos analizados, lo que sugiere que cada uno de ellos se unía o interactuaba con epítopos distintos. Esto respalda un papel para el uso de estos tres anticuerpos en un cóctel terapéutico de anticuerpos.

[0437] Ejemplo 8: Unión de anticuerpos contra el virus del Ébola a distintas cepas de partículas similivíricas (VLP) del virus del Ébola

[0438] Se realizó un estudio para determinar si los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola reaccionarían con partículas similivíricas (VLP) que contuvieran las GP de otras cepas del virus del Ébola. En este estudio se incluyeron las VLP que contenían las GP de Bundibugyo NC_014373, Costa de Marfil FJ217162, Sudán NC_006432, Zaire.1995, Zaire.2014 AY354458 y como control negativo, la glucoproteína del VEV (VEVg). El estudio se realizó utilizando "MesoScale Discovery" (MSD), una tecnología que permite la unión/fijación de las VLP de la cepa del Ébola (que expresan las glucoproteínas/proteínas de superficie del virus del Ébola) a una superficie de carbono, seguido de un ensayo de unión de tipo ELISA. El objetivo era identificar los perfiles de unión de los Acm con respecto a diversas cepas del virus del Ébola.

[0439] El ensayo se realizó en placas de micropocillos de polipropileno de 96 pocillos preparando primero una dilución 1:10 de los sobrenadantes de las distintas VLP/pocillo (como se indica en la tabla siguiente) y añadiendo las diluciones a PBS (50 µl/pocillo) e incubando a 4 °C durante toda la noche.

[0440] Se descartó el líquido de los pocillos seguido de un bloqueo con 150 µl/pocillo de PBS BSA al 2 % e incubación durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se descartó el contenido de cada pocillo y los pocillos se lavaron con PBS utilizando un lavador de placas AquaMax2000 diseñado para MSD. Se diluyeron cincuenta microlitros de anticuerpo primario en PBS BSA al 1 % y se incubaron a temperatura ambiente con agitación a velocidad intermedia (5). A continuación, se descartó el contenido de los pocillos y las placas se lavaron con PBS. A cada pocillo se añadieron cincuenta microlitros de reactivo de detección sulfo-TAG (Fc humano o de ratón) a una concentración de 1 µg/ml en PBS BSA al 0,5 % y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con agitación a velocidad intermedia(5). El contenido de los pocillos se descartó y las placas se lavaron con PBS BSA al 0,5 %. A cada pocillo se añadieron 150 µl de tampón de lectura 1X sin tensioactivo y las placas se leyeron en un SECTORImager6000 a partir del código de barras.

[0442] Los resultados, que se presentan a continuación en la Tabla 8, demuestran que todos los anticuerpos contra la GP del virus del Ébola analizados se unen a las VLP que contienen las GP de Zaire 2014 y Zaire 1995. Algunos de los anticuerpos analizados se unen a las VLP que contienen las GP de otras cepas del virus del Ébola, además de unirse a las dos cepas Zaire indicadas en la Tabla 8. En particular, además de unirse a las VLP que contienen las GP de Zaire 2014 y Zaire 1995, los anticuerpos contra el virus del Ébola denominados H1H17161P y H1H17162P se unen a las VLP que contienen las GP de las cepas Sudán y Bundibugyo, mientras que los anticuerpos contra el virus del Ébola denominados H2aM17356N y H1H17142P se unen a las cepas Bundibugyo y Costa de Marfil.

[0444] Tabla 8: Reactividad cruzada de los anticuerpos contra el virus del Ébola con las GP de diversas cepas del virus del Ébola

[0447]

[0450] Ejemplo 9. Neutralización in vitro del virus del Ébola (VEBO) Vivo/Infeccioso

[0452] Los anticuerpos denominados H1H17203P, H1H17139P y H1H17161P, se analizaron con respecto a su capacidad para neutralizar el VEBO infeccioso en células Vero. En placas de 384 pocillos con DMEM-FBS al 10 %, se sembraron células Vero y se dejaron crecer hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 75 % a 37 °C. H1H17203P, H1H17139P y H1H17161P se diluyeron según lo indicado. Se descongelaron cepas del VEBO (Mayinga, Kikwit, Makona y Mayinga adaptada a cobaya) y se diluyeron adecuadamente hasta alcanzar una multiplicidad de infección (MDI) entre 0,01 y 0,1. Como control positivo se utilizó un anticuerpo contra el VEBO denominado KZ52 disponible en el comercio. (Véase Maruyama, T.et al., J Virol 73, 6024-6030 (1999). Los anticuerpos se incubaron con el virus durante 1 hora a 37 °C. A continuación, la mezcla de anticuerpos/virus se añadió a las células previamente sembradas en placas y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Después del período de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se inactivaron sumergiéndolas en formol tamponado neutro al 10 %, se colocaron en una bolsa termosellada y se conservaron a 4 °C durante la noche en BSL-4. Las placas se lavaron 3 veces en 1X-PBS y las células se permeabilizaron a temperatura ambiente (TA) con 25 µl de Tritón X-100 al 0,1 % en 1X-PBS durante 15-20 minutos. Se descartó el Triton-X y las placas se bloquearon con BSA al 3,5 % en 1X-PBS durante 1 hora a TA. Las placas se trataron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario contra la GP del VEBO, 4F3 (para obtener información sobre el anticuerpo monoclonal de ratón contra la GP del VEBO, 4F3, véase IBT BIOSERVICES, número de catálogo 0201-020) diluido a 1:1500 en 1X-PBS. Las placas se lavaron en 1X-PBS durante 10-15 minutos y el procedimiento se repitió dos veces. Las células se incubaron durante 1 hora con anticuerpo secundario contra ratón conjugado con Alexa-fluor-488. El anticuerpo secundario se descartó y las placas se lavaron en 1X-PBS durante 10-15 minutos y el procedimiento se repitió dos veces. Las placas se incubaron con 25 µl/pocillo de Hoechst (1:50.000 en 1X-PBS) durante 30 minutos a TA. Las placas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia utilizando los canales de fluorescencia azul y verde.

[0453] Resultados

[0454] Los resultados, mostrados en la Figura 1, demostraron que el anticuerpo H1H17161P neutralizaba el virus vivo y era más fuerte que el anticuerpo de control positivo KZ52, pero los anticuerpos denominados H1H17203P y H1H17139P no actuaron como neutralizantes.

[0455] Ejemplo 10: Unión de anticuerpos contra el virus del Ébola a la GP soluble (sGP)

[0456] El cuarto gen del genoma del VEBO codifica dos proteínas exclusivas, una glucoproteína no estructural, dimérica, secretada, denominada sGP y una glucoproteína (GP) trimérica, de envoltura, unida al virión. Estas dos GP comparten los primeros 295 aminoácidos, pero tienen extremos carboxílicos (C) exclusivos. Para determinar si los Acm principales de Regeneron se unían a la sGP, se produjo internamente, en el laboratorio, una proteína sGP.mmh recombinante (SEQ ID NO: 317). Para determinar si los anticuerpos monoclonales H1H17203P, H1H17139P y H1H17161P podían unirse a la proteína sGP.mmh del Ébola, se utilizó el biosensor Octet HTX basado en interferometría. El formato del ensayo consistió en capturar H1H17203P, H1H17139P, H1H17161P, sobre las puntas del sensor contra hFc, seguido de inmersión en soluciones de 300 nM de GP.10xhis (SEQ ID NO: 318), sGP.mmh (SEQ ID NO: 317) del virus del Ébola o hCNTFR (receptor del factor neurotrófico ciliar.mmh, que es una proteína de control negativo). Cada Acm se capturó a un nivel entre 0,94 - 1,36 nm.

[0457] Como se muestra en la Figura 2, todos los Acm mostraron unión específica a la GP.10xhis del Ébola (GP del virus del Ébola marcada con una etiqueta de 10 restos de histidina) y no mostraron unión a la proteína de control negativo; mientras que, únicamente H1H17139 demostró unión específica a la sGP.mmh del Ébola. (GP soluble del virus del Ébola marcada con una etiqueta de mmh (dos repeticiones del epítopo myc e histidina). Este hallazgo sugiere que el epítopo de unión de H1H17139 probablemente se encuentra en una región común dentro de los primeros 295 aminoácidos tanto de la sGP como de la GP; mientras que los otros Acm posiblemente solo reconocen el extremo carboxílico (C) de la GP del Ébola.

[0458] Ejemplo 11: Unión de otros anticuerpos contra la GP del VEBO a la GP.h del virus del Ébola, a la GP soluble.mmh del virus del Ébola y al hCNTFR.mmh

[0459] Se realizó un estudio adicional para determinar las características de unión de otros anticuerpos contra la GP del virus del Ébola divulgados en el presente documento; en particular, el estudio se realizó para determinar la capacidad de estos otros anticuerpos para unirse a la GP soluble y a la GP. Este estudio se realizó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa (BLI) en tiempo real y sin marcaje en un biosensor Octet HTX (ForteBio Corp., una división de Pall Life Sciences). Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón comprendido por HEPES 0,01 M pH7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, BSA 1,0 mg/ml (tampón HBS-P de Octet) agitando la placa a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si los anticuerpos eran capaces de unirse a la sGP del virus del Ébola o a otros reactivos de la GP del virus del Ébola, aproximadamente ~1,0 nm de Acm contra la GP del virus del Ébola GP, se capturaron en biosensores Octet recubiertos de anticuerpos contra Fc de ser humano (Fortebio Inc, n.º 18-5064), sumergiendo los biosensores durante 3 minutos en pocillos que contenían soluciones de 20 µg/ml de Acm. Se comprobó la unión de los biosensores con Acm capturados a reactivos de proteína seleccionados mediante inmersión en pocillos que contenían soluciones de 300 nM de proteínas GP del virus del Ébola o controles irrelevantes durante 5 minutos. Todos los biosensores se lavaron en tampón HBS-ET de Octet entre cada etapa del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el experimento y al final de cada etapa se registró la respuesta de unión.

[0460] Resultados

[0461] Como se muestra en la Tabla 9, se determinó que cualquier valor por debajo de 0,10 nm era un anticuerpo que no presentaba unión. Basándose en los resultados obtenidos hasta ahora, todos los anticuerpos analizados, excepto uno (H1H17360N), mostraron unión a la GP de longitud completa del VEBO, y trece de los veinte anticuerpos analizados, mostraron unión a la GP soluble (sGP).

[0462] Tabla 9:Unión de anticuerpos contra la GP del virus del Ébola a la GP.h del virus del Ébola (GP del Ébola con etiqueta de His), a la GP soluble.mmh del virus Ébola (GP soluble con etiqueta mmh) y al hCNTFR.mmh (humanciliar neurotrohic factor rece tor

rece tor humano del factor neurotrófico ciliar con eti ueta mmh

[0463]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente al virus del Ébola (VEBO), en donde el primer anticuerpo monoclonal aislado comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) de SEQ ID NO: 26;

que comprende además un segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al VEBO, en donde el segundo anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 74;

y que comprende además un tercer anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente al VEBO, en donde el tercer anticuerpo monoclonal aislado comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR de SEQ ID NO: 146 y una secuencia de aminoácidos de LCVR de SEQ ID NO: 154;

en donde la HCVR de cada uno del primer y tercer anticuerpos monoclonales aislados está unida a un dominio constante de IgG1 humana.

2. Una composición farmacéutica de la reivindicación 1, para su uso en un método de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, o de disminución de la frecuencia o gravedad de al menos un síntoma de la infección por el VEBO, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

(a) el al menos un síntoma se selecciona del grupo que consiste en fiebre, cefalea, cansancio, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación y sangrado inexplicable; o

(b) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite, tal como un sujeto que padece una infección por el VEBO, o un sujeto expuesto o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirir una infección por el VEBO, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia.

3. La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 2, en donde dicha composición farmacéutica se administra junto con un segundo agente terapéutico, opcionalmente en donde

el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

en donde la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, para su uso en un método para aumentar la supervivencia, o la probabilidad de supervivencia de un sujeto que padece una infección por el VEBO, o de un sujeto expuesto al VEBO, o en riesgo de exposición al VEBO o de adquirirlo, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde:

(a) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite; y/o (b) el sujeto que lo necesite, que está en riesgo de exposición a una infección por el VEBO, o de adquirir dicha infección, se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia; y/o

(c) la composición farmacéutica se administra junto con un segundo agente terapéutico, tal como un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un fármaco antivírico, un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra el VEBO, una vacuna para el VEBO, TKM Ébola (pequeños ARN interferentes que se dirigen a la ARN polimerasa vírica), brincidofovir (CMX-001), favipiravir (T-705), BCX-4430, AVI-7537 (oligómeros antisentido de morfolino fosforodiamidato que se dirigen al gen VP24 del virus del Ébola) e interferones; y/o

(d) la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, para su uso en un método de neutralización del VEBO infeccioso o de inhibición de la entrada del VEBO en una célula de un sujeto, comprendiendo el método administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite;

opcionalmente en donde:

(a) la composición farmacéutica se administra profiláctica o terapéuticamente al sujeto que lo necesite; y/o (b) el sujeto que lo necesite se selecciona del grupo que consiste en un individuo inmunodeprimido, un trabajador sanitario, una persona que se sospecha que ha estado expuesta a otra persona portadora del virus del Ébola, una persona que entra en contacto físico o en estrecha proximidad física con un individuo infectado, un empleado de hospital, un investigador farmacéutico, personal de mantenimiento responsable de la limpieza de una instalación hospitalaria o institución en la que se haya tratado a un paciente con Ébola, personas que han visitado o tengan previsto visitar una zona o un país que se sabe o que se sospecha que tiene un brote del virus del Ébola y que viajan con frecuencia; y/o

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la HCVR del segundo anticuerpo monoclonal aislado está unida a un dominio constante de IgG1 humana.