RU2686630C1 - Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) - Google Patents
Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2686630C1 RU2686630C1 RU2017145321A RU2017145321A RU2686630C1 RU 2686630 C1 RU2686630 C1 RU 2686630C1 RU 2017145321 A RU2017145321 A RU 2017145321A RU 2017145321 A RU2017145321 A RU 2017145321A RU 2686630 C1 RU2686630 C1 RU 2686630C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ebola virus
- protein
- strain
- virus
- zaire
- Prior art date
Links
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 title claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 26
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 claims description 24
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 21
- 108010088468 Ebola virus envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 5
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012880 independent component analysis Methods 0.000 description 43
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 35
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 9
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108010026586 Ebola virus nucleoprotein VP40 Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 208000030820 Ebola disease Diseases 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 4
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 2
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101150117028 GP gene Proteins 0.000 description 2
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001115376 Sudan ebolavirus Species 0.000 description 2
- 241001115400 Zaire ebolavirus Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000009828 Arbovirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282418 Hominidae Species 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000944608 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000028227 Viral hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000012965 maculopapular rash Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39575—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from other living beings excluding bacteria and viruses, e.g. protozoa, fungi, plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
Abstract
Изобретение относится к области иммунологии. Предложены штаммы гибридных культивируемых клеток животных и антитела, способные к связыванию с белком GP вируса Эбола, subtype Zaire. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в создании диагностикумов и иммунохимических тест-систем для определения наличия вируса Эбола в биологических образцах, а также в создании лекарственных препаратов против вируса Эбола. 14 н.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител к белку GP вируса Эбола с помощью новых гибридных клонов клеток (гибридомы) животных. Изобретение может быть использовано для создания диагностикумов и иммунохимических тест-систем для определения наличия вируса Эбола в биологических образцах или антител к белку GP вируса Эбола. Изобретение может быть использовано для создания лекарственных препаратов против вируса Эбола.
Возбудитель геморрагической лихорадки Эбола относится к семейству Filoviridae, роду Ebolavirus. Заболевание, вызванное вирусами ZEBOV (Zaire ebolavirus) и SUDV (Sudan ebolavirus), сопровождается 53-90% летальностью [1]. Возбудитель впервые выделен осенью 1976 года во время обширных вспышек в Судане и Заире геморрагического заболевания с летальностью 50-90% [2, 3, 4, 14]. Позднее были выявлены вспышки в Кении [5], Габоне [6], Республике Конго [7], Уганде [8], Кот-д'Ивуаре [9]. Вариант вируса Рестон обнаружен у обезьян в Юго-Восточной Азии [5, 10]. Занос вируса Рестон с импортируемыми обезьянами выявлен в США [11].
Природный цикл вируса до сих пор неизвестен, но не вызывает сомнения возможность заражения в природных условиях человекообразных обезьян - шимпанзе и горилл, у которых наблюдается высокая смертность. Обсуждается возможная роль в качестве природного резервуара насекомоядных, летучих мышей, грызунов [12].
Вирус включен в список кандидатов для использования в качестве биологического оружия [13]. Легко осуществляется внутригоспитальная инфекция с передачей вируса от человека к человеку [1].
Инкубационный период составляет в среднем 6 суток. Клиническая картина сходна с лихорадкой Марбург, но протекает тяжелее [14]. Основная симптоматика включает астению, тошноту, рвоту, абдоминальную боль, атралгию, макулопапулезную сыпь на сгибательных поверхностях предплечий и верхних частях голени. У половины больных развивается геморрагический синдром. Причину гибели связывают с развитием ДВС-синдрома, отека легких и головного мозга [2, 4].
Спасение больных зависит от раннего применения иммунной плазмы и специфических противовирусных иммуноглобулинов [2, 14]. Разработка средств антителотерапии в отношении вируса Эбола проводится с 1990-х гг.Из восьми белков вируса ключевой мишенью для средств иммунотерапии является вирусный гликопротеин (GP), являющийся решающим фактором патогенности. Этот белок находится на поверхности вирусного капсида и служит для прикрепления вируса и слияния с мембраной [15].
Моноклональные антитела (МКА), обладающие высокой специфичностью к белку GP вируса Эбола, а также вируснейтрализующей активностью рассматриваются в качестве кандидатных высокоэффективных противовирусных препаратов [16].
Первым для лечения больных лихорадкой Эбола людей был использован препарат ZMapp™ на основе коктейля из трех химерных мышиных моноклональных антител, разработанный калифорнийской компанией Марр Biopharmaceutical Inc в 2014 году. Препарат продемонстрировал положительные результаты при лечении восьми обезьян. Лечение человека препаратом ZMapp началось в конце июля 2014 г. Первыми пациентами стали американский врач Кент Брэнтли и его жена, медсестра Нэнси Райтбол. Препарат вводился пациентам через девять дней после инфицирования. В ходе лечения удалось добиться полного выздоровления пациентов. Однако, дальнейшие исследования показали, что ZMapp специфически нейтрализует штамм Заир, и не действует на штамм Судан [16].
В настоящее время получены и охарактеризованы около 20 моноклональных антител, продемонстрировавших многообещающие результаты при исследовании их на животных моделях. Некоторые из них были рекомендованы для перехода к тестированию на приматах [17]. Например, МКА KZ52, изолированные от выжившего человека, успешно защищали мышей и морских свинок от летальной инфекции. Однако, в ходе тестирования данных антител на приматах было показано, что для полной защиты обезьян одних KZ52 недостаточно [18].
Наиболее перспективные препараты для лечения людей представляют собой коктейли из нескольких МКА.
МАb114 - человеческое моноклональное антитело, выделено от выжившего больного после вспышки лихорадки Эбола в 1995 году в Демократической Республика Конго. При исследовании МАb114 в экспериментах на приматах было показано, что данные МКА полностью защищали животных от летальной дозы вируса Эбола (3 животных в группе). Однако полностью добиться устранения всех клинических симптомов инфекции у животных удалось лишь в комбинации МАb114 с МАb100 [19].
Препараты МВ-003, ZMAb и MIL77E являются коктейлями моноклональных антител.
Препарат МВ-003 содержит три химерных мышиных моноклональных антитела: 13С6, 6D8 и 13F6. Были проведены исследования МВ-003 на высших приматах. Препарат вводился в концентрации 50 мг/кг через 24 и 48 часов после заражения животных вирусом Эбола. Выживаемость животных составила 67% [16].
ZMAb также содержит три МКА: 2G4, 4G7 и 1Н3, полученные от мышей, иммунизированных вирусом везикулярного стоматита (VSV) со встроенным геном GP вируса Эбола. При исследовании препарата на приматах установлено, что если вводить Zmab, через сутки после заражения вирусом Эбола (25 мг/кг, внутривенно, трехкратно) все животные в группе выживают. Если лечение начинается через 48 часов после заражения, выживаемость падает до 50% [16].
Препарат MIL77E, содержащий два МКА: 13С6 и 2G4, продемонстрировал полную защиту обезьян при введении через 3 дня после заражения летальной дозой EBOV. Соотношение МКА 13С6: 2G4 составляло 1:2, соответственно. Для всех других коктейлей антител (МВ-003, ZMAb, ZMapp), соотношение составляло 1:1:1 [16].
МКА также могут быть использованы для выявления антигена и специфических противовирусных антител. Чувствительность диагностикумов на основе МКА не ниже 95% при обнаружении антител (AT), а для определения антигена - 4,5 lgБOE/мл (БОЕ бляшкообразующая единица) [2, 20]. Известны МКА 4А2, продуцируемых гибридомой 4А2 (субкласс иммуноглобулинов IgGl) и МКА 1С1, продуцируемых гибридомой 1С1 (субкласс иммуноглобулинов IgGl), которые используют совместно в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) [21]. МКА 1В2, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1В2 (субкласс иммуноглобулинов IgGl) и МКА 7В11, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Rattus Norvegicus 7В11 (субкласс иммуноглобулинов IgG) предложены для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) [22].
Известны мышиные гибридомы, продуцирующие МКА к белку GP вируса Эбола [23, 24, 25, 26]. Гибридому Э4/N-6G5, продуцирующую МКА а к структурному белку GP вируса Эбола, штамм Заир, относящиеся к изотипу Ig G, предложено использовать в качестве «индикаторных» антител в тест-системе на основе ИФА [27]. Еще 5 гибридом (GPE118, GPE274, GPE325, GPE463, GPE534) было получено при использовании в качестве антигена для иммунизации рекомбинантного белка EBOV rGPdTM, конъюгированного с белком теплового шока HSP65 из М. Tuberculosis. Проведен иммунохимический анализ эпитопной специфичности полученных антител, на основании которого отобрано 3 гибридомы (GPE 534, GPE 118 и GPE 325), продуцирующие МКА высокой аффинности и специфичные к разным антигенным детерминантам белка GP. Несмотря на то, что авторы рассматривают полученные МКА в качестве кандидатных компонентов комбинированного терапевтического средства для профилактики и лечения геморрагической лихорадки Эбола, данных по их вируснейтрализующей активности in vitro и in vivo не представлено [15]. Известна гибридома GPE 325, синтезирующая МКА класса IgM, селективно связывающая гликопротеин GP вируса Эбола с константой диссоциации 2,6 нМ [28].
Задачей изобретения является получение новых высокоактивных и продуктивных штаммов гибридных клонов клеток, секретирующих вируснейтрализующие МКА к различным эпитопам белка GP вируса Эбола, для последующего конструирования на их основе высокоспецифичных и стандартных отечественных тест-систем для определения антигена вируса Эбола или специфических антител к нему.
Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала штаммов гибридом, продуцирующих МКА к антигенам вируса Эбола, обладающих высокой аффинностью, а также в расширении спектра групповой реактивности полученных МКА к белку GP вируса Эбола.
Указанный технический результат достигается путем получения новых гибридных клонов культивируемых клеток Mus. Musculus 6G3, 4В9, 5D9, 2С8, 8С2, 3A12 и 1А5, являющихся продуцентами МКА к белку GP вируса Эбола. Полученные МКА обладают специфичностью и сродством к вируснейтрализующим эпитопам белка GP, что, в свою очередь, дает возможность определять вирусный антиген в биологических жидкостях человека и животных. Нейтрализующие свойства МКА дают возможность рассматривать их в качестве кандидатных терапевтических препаратов для профилактики и лечения геморрагической лихорадки Эбола.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 в виде таблицы 1 представлены концентрации IgG (А280), выделенных из культуральной жидкости (КЖ).
На фигуре 2 в виде таблицы 2 представлены концентрации IgG (А280), выделенных из асцитической жидкости (АЖ) клонов 5D9, 4В9, 6G3 и 2С8.
На фигуре 3 представлены графики титрования пероксидазных конъюгатов МКА на планшете с иммобилизованным рекомбинантным белком GP вируса Эбола. Звездочкой (*) помечены пероксидазные конъюгаты МКА (1А5*, 3А12*, 2С8*, 8С2*, 6G3* 4В9*, 5D9*).
На фигуре 4 в виде таблицы 3 представлены конкурентные отношения МКА исследованных клонов МКА. Цифрами указана степень подавления связывания конъюгатов МКА с рекомбинантным белком GP вируса Эбола, штамм Заир, Ebola virus/H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, выраженная в %. Звездочкой (*) помечены пероксидазные конъюгаты МКА.
На фигуре 5 представлены данные по детекции рекомбинантных белков GP вируса Эбола, экспрессированных в бакуловирусной системе (GP-B) и в клетках человека (GP-H) методом «сэндвич»-ИФА с применением МКА клонов 6G3, 4В9 или 2С8 в качестве «захватывающих» антител и пероксидазных конъюгатов этих же клонов (6G3*, 4В9*, 2С8*) в качестве детектирующих антител. GP-B - рекомбинантный белок GP вируса Эбола (subtype Zaire, strain H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15), синтезированный в бакуловирусной системе экспрессии. GP-H - рекомбинантный белок GP вируса Эбола (subtype Zaire, strain H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15), синтезированный в клетках человека.
На фигуре 6 в виде таблицы 4 представлены константы взаимодействия моноклональных антител (1А5, 5D9, 6G3, 4В9, 2С8) с указанием следующих параметров: ka (1/M*s) - параметр константа ассоциации, единицы измерения 1/M*s; kd (1/s) - параметр константа диссоциации, единицы измерения 1/s; KD (М) - параметр, измеряемый по формуле (ka/kd), единицы измерения М.
На фигуре 7 в виде таблицы 5 представлены результаты исследования вируснейтрализующих свойств МКА. рЕТ28 Н8 - контрольное однодоменное антитело, специфичное к интерферону бета человека и используемое в тесте на нейтрализацию для исключения ложноположительных результатов. Сыворотка альпака, иммунизированного Ad5-GP-8a, 50х - контрольная сыворотка, полученная при иммунизации альпака рекомбинантным аденовирусом, несущим ген белка GP вируса Эбола и обладающая нейтрализующим действием в отношении вируса Эбола. Используется в тесте на нейтрализацию в качестве положительного контроля.
На фигуре 8 в виде таблицы 6 представлена оценка вируснейтрализующих свойств МКА на примере нативного вируса Эбола. Контроль вируса - рабочая культура вируса Эбола, штамм Заир: биологическая активность - 5,2×10*8 БОЕ/мл). НК - негативные колонии, образованные вирусом Эбола в монослое клеток почки зеленой мартышки GMK-AH-1 (Д) под агаровым покрытием.
Созданные гибридные клоны культивируемых клеток Mus. Musculus: 6G3, 4В9, 5D9, 2С8, 8С2, 3A12 и 1А5 - характеризуются следующими свойствами.
Видовая принадлежность:
Mus. Musculus
Способ получения штаммов:
Штаммы получены путем слияния клеток мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14 с клетками селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных введением внутримышечно аденовируса со встроенным геном белка GP вируса Эбола. Селекцию гибридом проводят на питательной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением HAT Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Штаммы синтезируют МКА, специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе с рекомбинантным белком GP вируса Эбола.
Культуральные свойства штаммов:
Гибридные клетки растут в виде суспензии in vitro или в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости после введения сингенным мышам линии Balb/c.
Культивирование штаммов in vitro:
В качестве ростовой среды используют среду RPMI-1640 («Sigma», США), содержащую 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед./мл инсулина, 60 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СO2. Для культивирования используют пластиковые планшеты или флаконы объемом 50 и 250 мл («Greiner», Германия). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2 суток. Кратность рассева 1:2-1:4.
Культивирование штаммов в организме животного in vivo:
За 14 суток до введения клеток гибридомы мышей линии Balb/c предварительно обрабатывают внутрибрюшинно 2,6,10,14-тетраметилпентадеканом (Pristane) («Sigma», США) в дозе 0,5 мл/животное. Далее праймированным животным вводят в брюшную полость гибридные клетки штамма в дозе 5-10×106 клеток. Асцитные жидкости, содержащие МКА, получают через 7-15 суток после введения.
Биотехнологическая характеристика штаммов (продуктивность):
- титр МКА в культуральной жидкости при выращивании in vitro -1:729 (в ИФА) (для каждого штамма);
- титр МКА в асцитной жидкости при выращивании in vivo -1:500000-1:1000000 (в ИФА) (для каждого штамма).
Условия хранения и поддержания жизнеспособности штаммов:
Штамм сохраняют посредством криоконсервации в жидком азоте. За 24 часа до замораживания клетки гибридомы пассируют с кратностью рассева 1:2. Осажденные центрифугированием клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ФСТ, 10% диметилсульфоксида) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн./мл., по 1 мл. Выдерживают 24 часа при минус 70°С, затем переносят в жидкий азот (минус 196°С).
Восстановление после размораживания:
Быстрое размораживание штамма проводят при 37°С. Гибридомные клетки разводят в 10 раз ростовой средой без сыворотки, осаждают центрифугированием в течении 10 мин. при 2000 об/мин. и ресуспендируют в ростовой среде, содержащей 20% эмбриональной сыворотки коров в концентрации 3-4×105 клеток/см3. Жизнеспособность восстановленных клеток составляет 70-80% и устанавливается по дифференциальной окраске клеток с использованием 0,4% раствора трипанового синего, рН=7,2-7,3.
Стабильность штаммов:
Стабильность продуцирования антител гибридными клетками сохраняется на протяжении 70 пассажей в культуре клеток и 5 пассажей на мышах линии BALB/c.
Контаминация:
Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на стандартные питательные среды (мясопептонный агар (МПА) - для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов). Заражение микоплазмой не выявлено (тест-система «Mycoplasma Stain Kit», фирмы Flow Lab.).
Кариотип гибридных клеток, модальное число хромосом не определялись.
Характеристика продуцируемых МКА к белку GP к вирусу Эбола:
- мишень - белок GP вируса Эбола;
- специфичность связывания с белком GP - 100%;
- константы диссоциации для полученных МКА составляют от 1,8 до 102 нМ.
- Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - 6G3, 4В9, 3A12 и 8С2 - IgGl, 5D9 и 2С8 - IgG2a, 1А5 - IgG2b. (ИФА, тест-система «Моusе-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Получение штаммов гибридом.
Мышей линии Balb/c 8-недельного возраста массой 18-20 г. иммунизируют 3х-кратно с интервалом 2 недели. В качестве антигена для иммунизации используют аденовирус человека пятого серотипа, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола, штамм Заир (Ebola virus/H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1; GenBank ID: КМ233045.1)[29]. Антиген с инфекционной множественностью 108 инф. частиц (100 мкл/мышь) вводят внутримышечно без адъюванта. Для бустерной иммунизации используют рекомбинантный белок GP вируса Эбола, штамм Заир, Ebola virus/H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, полученный в бакуловирусной системе экспрессии. Бустерная доза (50 мкг/мышь) вводится без адъюванта, внутрибрюшинно, за 4 суток до выделения селезенки.
Через 4 суток после введения бустерной дозы антигена получают суспензию клеток селезенки мыши стандартным методом в охлажденной ростовой среде без сыворотки.
Для слияния используют перевиваемую клеточную линию мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, дефектную по гену гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), не продуцирующую собственные иммуноглобулины. Гибридизацию проводят по методу, предложенному Kohler G. и Milstain С.[30]. Суспензию клеток селезенки и миеломные клетки смешивают в соотношении 5:1 соответственно. После слияния клетки ресуспендируют в селективной среде с HAT, вносят в 96-луночные панели с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×106 кл/мл, по 50 мкл/лун) в концентрации 1,5×105 клеток в лунку в объеме 0,1 мл. Панели с клетками инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2.
Замену среды в лунках с гибридомными клонами проводят каждые 2-3 суток, используя в течение 14 суток после слияния среду с HAT. Для селекции гибридом, продуцирующих МКА заданной специфичности, из лунок с растущими колониями отбирают культуральные жидкости и тестируют на наличие антител к белку GP вируса Эбола в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), когда клоны гибридных клеток занимают не менее 50% поверхности лунки. Клоны, обнаружившие специфическую активность, реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×106 кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность.
Пример 2. Получение МКА.
Скрининг МКА заданной специфичности и иммунологической активности проводят методом непрямого ИФА. Для этого в лунки иммунологических микропланшетов («Greiner», Германия) вносят 0,1 мл антигена в рабочем разведении в 0,1М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5. В качестве антигена используют рекомбинантный белок GP вируса Эбола, штамм Заир, Ebola virus/H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, полученный в бакуловирусной системе экспрессии. Микропланшеты инкубируют 18 часов при 4°С. Свободные участки пластика блокируют 1% Top Block («Yuro», Швейцария) в 0,01М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Инкубируют в течение 30 минут при 37°С и вносят в лунки 0,1 мл культуральной жидкости МКА в различных разведениях (без разведения, с 1:3 до 1:2187). Микропланшеты инкубируют 1 час при 37°С и добавляют пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении. Инкубируют 1 час при 37°С. После каждого этапа не - связавшиеся реагенты отмывают ФСБ с добавлением 0,1% Tween-20 (ФСБТ). В качестве хромогена используют тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность окраски в лунках определяют после остановки реакции 1М H2SO4 на спектрофотометре Multiscan MCC («Flow», Англия) при длине волны 450 нм.
Клоны, обнаружившие специфическую активность к белку GP вируса Эбола, реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×106 кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность. Позитивные реклонированные гибридомы наращивают в культуральных флаконах размером 25 см3 и 75 см3 («Greiner»,Германия).
Выделение МКА из культуральных жидкостей (КЖ). Имуноглобулины (Ig) класса G осаждают из КЖ насыщенным раствором сульфата аммония (до 50% насыщения), инкубируют двое суток при 4°С, центрифугируют, осадок растворяют в ФСБ и очищают на колонке с Protein A-agarose. IgG элюируют с колонки 0.1М ацетатом Na с 0.1М NaCl (рН=2,2). Элюат нейтрализут карбонатным буфером (рН=9,5), осаждают насыщенным раствором сульфата аммония (до 50% насыщения), инкубируют двое суток при 4°С, центрифугируют, осадок растворяют в ФСБ и обессоливают в колонках с полусухим Сефадексом G-25 Medium в ФСБ. Объем каждого препарата - 0,2 мл. Концентрации IgG (A280) представлены в таблице 1 (фигура 1).
Выделение IgG из асцитной жидкости (АЖ) проводят осаждением белков при помощи каприловой кислоты ("Sigma", США). Для выделения МКА используют АЖ от 4-х клонов МКА (5D9, 4В9, 6G3, 2С8), которые разводят 0,06 М ацетатным буфером, рН=4,0, добавляют каприловую кислоту (3,3 мкл/мл АЖ), инкубируют 30 мин при 20°С, центрифугируют. Супернатант фильтруют через PVDF-фильтр (0,45 мкм) и диализуют в течение суток против ФСБ. Затем добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (до 50% насыщения), инкубируют 18 часов при 4°С, центрифугируют, осадок растворяют в ФСБ и обессоливают в колонках с полусухим Сефадексом G-25 Medium в ФСБ. Оптическую плотность растворов Ig измеряют на спектрофотометре ("Eppendorf", Германия) при длине волны 280 нм. Концентрацию белка определяют по формуле:
C=D/1,4, где D - оптическая плотность, С - концентрация белка (мг/мл), 1,4 - оптическая плотность раствора IgG с концентрацией 1 мг/мл.
Характеристики полученных препаратов представлены в таблице 2 (фигура 2).
Пример 3. Синтез конъюгатов МКА с пероксидазой хрена и оценка эпитопной специфичности МКА методом конкурентного ИФА.
Для синтеза пероксидазных конъюгатов к 1,0 мл водного раствора пероксидазы (концентрация 4 мг/мл, RZ не менее 3) добавляют 200 мкл 0,1М водного раствора NaIO4 и перемешивают на шейкере 20 мин при комнатной температуре в темноте. Активированную таким образом пероксидазу диализуют в течение ночи против 0,001М ацетата натрия, рН=4,0. Затем к 1,0 мл полученного раствора пероксидазы добавляют 1,0 мл раствора очищенных МКА в 0,1М карбонатном буфере, рН=9,5, доводят рН до 9,5 0,4М карбонатным буфером и инкубируют 2 часа при комнатной температуре в темноте. После этого добавляют 0,1 мл водного раствора NaBH4 (концентрация 4 мг/мл), инкубируют 2 часа при комнатной температуре и диализуют против ФСБ в течение 18 часов. После диализа осаждают Ig сульфатом аммония до 50% насыщения, диализуют против ФСБ для удаления сульфата. Полученный конъюгат разводят в 2 раза глицерином и хранят при минус 20°С.
Активность полученных конъюгатов в системе прямого ИФА с использованием иммобилизованного рекомбинантного белка GP вируса Эбола, штамм Заир, Ebola virus/H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, полученного в бакуловирусной системе экспрессии, представлена на фигуре 3.
Постановка конкурентного ИФА.
В лунки 96-луночной микропанели, предварительно сенсибилизированные рекомбинантным белком GP вируса Эбола, штамм Заир, Ebola virus/H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15 в рабочем разведении, вносят очищенные МКА в концентрации 0,1 мг/мл и инкубируют 1 час при 37°С. Затем вносят конъюгированные с пероксидазой хрена МКА в разведениях, позволяющих получить оптическую плотность в пределах 1-1,5 при взаимодействии с антигеном в отсутствии конкурирующих антител. Определение активности МКА проводят спектрофотометрически, при длине волны 450 нм. Конкурентные отношения между МКА (Кинг) вычисляют по формуле:
Кинг=100-(А450 пробы с конкурирующими МКА/А450 пробы без конкурирующих МКА)×100
Результаты представлены в таблице 3 (фигура 4).
Показано, что немеченые МКА клонов 2С8 и 8С2 блокируют связывание аналогичных конъюгатов на 57,8 и 80,1%, соответственно. Такие же результаты показаны для МКА клонов 6G3 и 4В9 (блокировка на 90,6 и 94,6%), т.е. пары МКА 2С8 - 8С2 и 6G3 - 4В9 узнают одинаковые эпитопы белка GP.
Таким образом, из полученных результатов следует, что общие эпитопы белка GP детектируют МКА группы клонов 2С8=8С2 и 6G3=4В9.
Пример 4. Использование МКА для детекции белка GP методом «сэндвич»-ИФА.
В лунки 96-луночной микропанели, предварительно сенсибилизированные очищенными МКА клонов 6G3, 4В9 или 2С8 (10 мкг/мл в 0,1М карбонатном буфере, рН=9,5) вносят антиген в концентрациях 0, 10, 20, 50, 100, 200 и 500 нг/мл и инкубируют 1 час при 37°С. В качестве антигена используют рекомбинантный белок GP, штамм Заир, полученный в бакуловирусной системе экспрессии (subtype Zaire, strain H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, GP-B) и рекомбинантный белок GP, штамм Заир, синтезированный в клетках человека (subtype Zaire, strain H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15, GP-H). Панель промывают 4 раза ФСБТ и затем вносят конъюгированные с пероксидазой хрена МКА клонов 6G3, 4В9 или 2С8 в рабочих разведениях. Планшет промывают 4 раза ФСБТ и добавляют 100 мкл приготовленного хромоген-субстратного раствора с тетраметилбензидином (ТМБ). Инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляют 100 мкл стоп-раствора для остановки реакции (1М H2SO4). Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом.
Из результатов, представленных на фигуре 5, видно, что присутствие в комбинации «сэндвич»-ИФА МКА клона 2С8 (в качестве захватывающего или детектирующего) позволяет выявлять белок GP вируса Эбола, экспрессированный в клетках человека (GP-H), а МКА клонов 6G3, 4В9 в различных комбинациях выявляют белок GP вируса Эбола, синтезированный в бакуловирусной системе экспрессии(GР-В).
Пример 5. Определение констант взаимодействия МКА.
Константы взаимодействия моноклональных антител определяют путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore 3000 («General Electric», Швеция). Для этого рекомбинантный белок GP EBOV ковалентно иммобилизуют на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 («General Electric», Швеция), а затем пропускают над поверхностью чипа различные концентрации полученных моноклональных антител. Обработку данных и вычисление констант проводят в автоматическом режиме при помощи программы Biaevaluation (General Electric, Швеция).
Из данных, представленных на фигуре 6, следует, что константы реакций МКА 1А5, 5D9, 6G3, 4В9 и 2С8 с белком GP EBOV составляют от 1,8 до 102 нМ.
Пример 6. Оценка вируснейтрализующих свойств полученных МКА.
Для проведения реакции вирусной нейтрализации используют псевдотипированный вирус везикулярного стоматита, содержащий в своем составе белок GP вируса Эбола (VSV-GP). Разведения препарата VSV-GP готовят на буфере (10 мМ Трис-HCl рН=7,5, 1 мМ ЭДТА, 10% сахароза) десятикратными разведениями. В приготовленном разведении концентрация вируса VSV-GP составляет 1000 БОЕ/мл.
Смесь равных объемов МКА и вируса инкубируют в течение 90 мин при температуре 37°С и вносят по 200 мкл на однодневный монослой клеток Vero Е6, предварительно слив ростовую среду. После адсорбции комплекса антиген-антитело на клетках в течение 120 мин при температуре 37°С, наносят агаровое покрытие. Через 48 часов производят учет.
Результаты исследования вируснейтрализующих свойств полученных МКА представлены на фигуре 7. Из этих данных следует, что наиболее эффективно нейтрализуют вирус VSV-GP МКА 4В9, 6G3 и 5D9.
Пример 7. Оценка вируснейтрализующих свойств полученных МКА на примере нативного вируса Эбола.
Вируснейтрализующие свойства МКА определяют в реакции нейтрализации на культуре клеток почки зеленой мартышки GMK-AH-1(Д). Разведения вируссодержащей суспензии на основе вируса Эбола, штамм Заир («антиген»), готовят на разводящей жидкости десятикратным шагом. В приготовленном рабочем разведении концентрация вируса Эбола составляет 120 БОЕ/мл.
Смесь равных объемов МКА и «антигена» вируса Эбола инкубируют в течение 60 мин при температуре от 36,5° до 37,5°С, затем вносят по 0,5 мл на 3-х суточный монослой клеток GMK-АН-1(Д), предварительно сливая ростовую среду, и, после адсорбции комплекса антиген+антитело на клетках в течение 60 мин при температуре от 36,5° до 37,5°С декантируют, затем наносят первичное агаровое покрытие.
Для исключения ложноположительных результатов использовали однодоменное антитело рЕТ28 Н8, специфичное к интерферону бета человека. В качестве положительного контроля использовали обладающую нейтрализующим действием в отношении вируса Эбола сыворотку альпака, иммунизированного рекомбинантным аденовирусом, несущим ген белка GP вируса Эбола (Ad5-GP-8a, 50х).
Через 7 суток инфицированный монослой клеток окрашивают 0,1% нейтральным красным и инкубируют в течение 48 часов при температуре от 36,5° до 37,5°С, затем производят учет негативных колоний во флаконах.
За титр антител исследуемого препарата принимают его высшее разведение, которое подавляет на 50% и более (по сравнению с контрольной сывороткой) негативные колонии, образованные вирусом Эбола на культуре клеток под агаровым покрытием.
Полученные данные представлены в таблице 6 (фигура 8). Титр нейтрализации вируса Эболы для МКА 6G3, 4В9 и 2С8 составил 1:2500. Полученные на основе мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14 штаммы Mus musculus L. 6G3, 4В9, 5D9, 2С8, 3A12, 8С2 и 1А5 отличаются от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса Эбола.
Предлагаемые в настоящем изобретении гибридомы: 6G3, 4В9, 5D9, 2С8, 3A12, 8С2, 1А5 - продуценты МКА, специфически взаимодействующих в ИФА с рекомбинантным белком GP вируса Эбола, обладают вируснейтрализующей активностью в отношении псевдотипированного вируса везикулярного стоматита, содержащего в своем составе белок GP вируса Эбола, а также в отношении нативного вируса Эбола (штамм Заир). Гибридомы 6G3, 4В9, 3А12 и 8С2 синтезируют МКА класса IgGl, гибридомы 2С8 и 5D9 - МКА класса IgG2a, гибридома 1А5 - МКА класса IgG2b. Нейтрализующие свойства МКА дают возможность в дальнейшем рассматривать их в качестве кандидатных терапевтических препаратов для профилактики и лечения геморрагической лихорадки Эбола.
Источники информации:
1. Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / Под ред. Академика РАН Д.К. Львова. - М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство», 2013. - 1200 с: ил.
2. Борисевич И.В., Маркин В.А., Фирсова И.В. и др. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок (Марбург, Эбола, Ласса и боливийской) // Вопр. вирусол. - 2006. - №5. - С. 8-16.
3. Львов Д.К., Клименко С.С, Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. - М.:Медицина, 1989. - 336 с.
4. Leroy Е.М., Baize S., Lu C.Y. et al. Diagnosis of Ebola hemorrhagic fever by RT-PCR in an epidemic setting //J. Med. Virol. - 2000. - V. 60. - P. 463-472.
5. Peters C.J., Sanchez A., Feldman H. et al. Filoviruses as emerging pathogens // Semin. Virol. - 1994. - V.5. - P. 147-154.
6. Georges A.J., Leroy E.M., Renat A.F. et al. Ebola hemorrhagic fever // J. Infect. Dis.- 1999. -V. 179.-Suppl. 1. - P. 65-75.
7. Peterson A.T., Carroll D.S., Mills J.N. et al. Pottential mammalian Flavivirus reservoirs // Emerg/ Infect. Dis. - 2004. - V. 10. - №12. - P. 2073-2081.
8. Francesconi P., Yoti Z., Declich S. et al. Ebola hemorrhagic fever transmission and risk factors of contacs, Uganda // Emerg. Infect. Dis. - 2003. - V.9. - №11. - P. 1430-1437.
9. Formenty P., Boesch C, Wyers M. et al. Ebola virus outbreakamong wild chimpanzees living in a rain forest of Cote d'lvoire // J. Infect. Dis. - 1999. - V.179.-Suppl. 1. - P.120-126.
10. Viral hemorrhagic fevers. Report of WHO Expert Сотр. Tehn. Rep. - №721. - Geneva: WHO, 1985. - 126 p.
11. Morikawa S., Saijo M., Kurane I. Current knowledge on lower virulence of Reston Ebola virus (in French: Connaissances actuelles sur la moindre virulence du virus Ebola Reston) // соmр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 2007. - V.30. - №5-6. - P. 391-398.
12. Peterson A., Bauer J.T., Mills J.N. Ecologic and geographic distribution of Filovirus disease // Emerg. Infect. Dis. - 2004. - V.10. - №1. - P. 40-47.
13. Borio L., Inglesby Т., Peters C.J. et al. Hemorrhagic fever viruses as biological weapons // JAMA. - 2003. - V. 287. - P. 2391-2405.
14. Swanepoel R., Leman P.A., Burt F.J. et al. Experimental inoculation of plants and animals wits Ebola virus // Emerg. Infect. Dis. - 1996. - V. 2. - P. 321-325.
15. Шемчукова О.Б., Дементьева И.Г., Варламов H.E., Позднякова Л.П., Боков М.Н., Алиев Т.К., Панина А.А., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Свешников П.Г. Получение и характеристика моноклональных антител против гликопротеина вируса Эболы // Вест. Моск. Ун-та. Сер 16. Биология. - 2016. - №1. - С. 29-34.
16. Moekotte A.L., Huson М.А., van der Ende A.J., Agnandji S.T., Huizenga E., Goorhuis A., Grobusch M.P. Monoclonal antibodies for the treatment of Ebola virus disease. // Expert Opin Investig Drugs. - 2016. - Vol. 25 (11). - P. 1325-1335.
17. 
E, Alvarez MM, 
AR, et al. Anti-Ebola therapies based on monoclonal antibodies: current state and challenges ahead // Crit Rev Biotechnol. - 2015 - Vol. 26 - p. 1-16.
18. Murin CD, Fusco ML, Bornholdt ZA, et al. Structures of protective antibodies reveal sites of vulnerability on Ebola virus // Proc Natl Acad Sci USA. - 2014 - Vol. 111 - p. 17182-17187.
19. Corti D, Misasi J, Mulangu S, et al. Protective monotherapy against lethal Ebola virus infection by a potently neutralizing antibody // Science. - 2016 - Vol. 351 - p. 1339-1342.
20. Борисевич И.В., Михайлов В.В., Потрываева Н.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антигена вируса Эбола // Вопр. Вирусол. - 1996. - №5. - С. 232-234.
21. Патент RU №2395577. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1B2 - продуцент моноклональных антител для выявления белка vp40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), и набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления белка vp40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga)./ Авторы: Казачинская Е.И. и др., заявка №2008150265/13, приоритет 18.12.2008.
22. Патент RU №2395576 штамм гибридных клеток животного Mus musculus L.1B2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga)./Aвторы: Казачинская Е.И. и др., заявка №2008149653/13, приоритет 16.12.2008
23. Reynard О., Volchkov V.E. Characterization of a Novel Neutralizing Monoclonal Antibody Against Ebola Virus GP. // J Infect Dis. - 2015. - Vol. 212, Suppl 2. - P. 372-378.;
24. Lucht A., Grunow R., Otterbein C, Feldmann H., Becker S. Production of monoclonal antibodies and development of an antigen capture ELISA directed against the envelope glycoprotein GP of Ebola virus.// Med Microbiol Immunol. - 2004. - Vol. 193 (4). - P. 181-187.;
25. Shahhosseini S., Das D., Qiu X., Feldmann H., Jones S.M., Suresh M.R. Production and characterization of monoclonal antibodies against different epitopes of Ebola virus antigens // J Virol Methods. - 2007. - Vol. 143 (1). - P. 29-37.
26. Marceau C.D., Negi S.S., Hernandez H., et al. Novel neutralizing monoclonal antibodies protect rodents against lethal filovirus challenges.// Trials Vaccinology. - 2014. - Vol. 3. - P. 89-94.
27. Патент RU №2186106. Штамм гибридных клеток Э4/N-6G5 животных Mus Musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу Эбола./Авторы: Ручко С.В. и др., заявка №2001108229/13, приоритет 29.03.2001.
28. Патент RU №2630304. Моноклональное антитело, связывающееся с гликопротеином вируса Эбола, фрагменты ДНК, кодирующие указанное антитело, и антигенсвязывающий фрагмент./Авторы: Алиев Т.К. и др., заявка №2015157142, приоритет 31.12.2015.
29. Патент RU №2578160. Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса эбола (варианты)./Авторы: Логунов Д.Ю. и др., заявка №2015111368/10, приоритет 31.03.2015.
30. Kohler G., Milstain С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. - 1976. - Vol. 256. - P. 495-497.
Claims (14)
1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 6G3, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 4B9, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
3. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 5D9, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
4. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 2C8, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
5. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 3A12, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
6. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 8C2, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
7. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, депонированный в Коллекции перевиваемых клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, номер 1A5, - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire).
8. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 1, относящееся к изотипу IgG1, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении вируса Эбола, subtype Zaire.
9. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 2, относящееся к изотипу IgG1, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении вируса Эбола, subtype Zaire.
10. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 3, относящееся к изотипу IgG2a, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении псевдотипированного вируса везикулярного стоматита, содержащего в своем составе белок GP вируса Эбола (VSV-GP).
11. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 4, относящееся к изотипу IgG2a, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении вируса Эбола, subtype Zaire.
12. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 5, относящееся к изотипу IgG1, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении псевдотипированного вируса везикулярного стоматита, содержащего в своем составе белок GP вируса Эбола (VSV-GP).
13. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 6, относящееся к изотипу IgG1 и способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении псевдотипированного вируса везикулярного стоматита, содержащего в своем составе белок GP вируса Эбола (VSV-GP).
14. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных по п. 7, относящееся к изотипу IgG2b, способное специфично распознавать белок GP вируса Эбола, subtype Zaire с KD от 1,8 до 102 нМ, и обладающее вируснейтрализующими свойствами в отношении псевдотипированного вируса везикулярного стоматита, содержащего в своем составе белок GP вируса Эбола (VSV-GP).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145321A RU2686630C1 (ru) | 2017-12-22 | 2017-12-22 | Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145321A RU2686630C1 (ru) | 2017-12-22 | 2017-12-22 | Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2686630C1 true RU2686630C1 (ru) | 2019-04-29 |
Family
ID=66430279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145321A RU2686630C1 (ru) | 2017-12-22 | 2017-12-22 | Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2686630C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705763C1 (ru) * | 2018-12-21 | 2019-11-12 | Общество с ограниченной ответственностью "Люминесцентные диагностические приборы" | Моноклональное антитело, специфичное к вирусу Эбола |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2186106C1 (ru) * | 2001-03-29 | 2002-07-27 | Вирусологический центр Научно-исследовательского института микробиологии | Штамм гибридных клеток э4/n-6g5 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу эбола |
| RU2393220C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 3f9 - продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления белка vp35 вируса марбург, и моноклональные антитела 3f9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток |
| RU2395575C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАТРИКСНОГО БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) |
| RU2395577C1 (ru) * | 2008-12-18 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) |
| US20160215040A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-07-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human Antibodies to Ebola Virus Glycoprotein |
-
2017
- 2017-12-22 RU RU2017145321A patent/RU2686630C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2186106C1 (ru) * | 2001-03-29 | 2002-07-27 | Вирусологический центр Научно-исследовательского института микробиологии | Штамм гибридных клеток э4/n-6g5 животных mus musculus l., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу эбола |
| RU2393220C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 3f9 - продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления белка vp35 вируса марбург, и моноклональные антитела 3f9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток |
| RU2395575C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАТРИКСНОГО БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) |
| RU2395577C1 (ru) * | 2008-12-18 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) |
| US20160215040A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-07-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human Antibodies to Ebola Virus Glycoprotein |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ДОЛЖНИКОВА И. В. и др. "Векторные вакцины против болезни, вызванной вирусом Эбола", ACTA NATURAE, Т. 9, N. 3 (34), 2017, 05.06.2017. * |
| КАЗАЧИНСКАЯ, Е.А. Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека [Текст]: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук (03.01.06) / Казачинская Елена Ивановна; - Кольцово, 2010. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705763C1 (ru) * | 2018-12-21 | 2019-11-12 | Общество с ограниченной ответственностью "Люминесцентные диагностические приборы" | Моноклональное антитело, специфичное к вирусу Эбола |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smith et al. | Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen | |
| Guthmiller et al. | An efficient method to generate monoclonal antibodies from human B cells | |
| JP6925336B2 (ja) | 抗呼吸器合胞体ウイルスの完全ヒト抗体 | |
| Zhang et al. | Tulane virus recognizes the A type 3 and B histo-blood group antigens | |
| CA3081694A1 (en) | Monoclonal antibodies for ebola and marburg viruses | |
| CN105087497A (zh) | 杂交瘤细胞株zjeb8-01、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用 | |
| CN106381288B (zh) | 一种抗h3n2亚型犬流感病毒核蛋白单克隆抗体杂交瘤2d10及单克隆抗体 | |
| CN109265542B (zh) | 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| CN105112375A (zh) | 杂交瘤细胞株zjed0-02、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用 | |
| CN109180810B (zh) | 特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| Zhou et al. | Broadly neutralizing anti-S2 antibodies protect against all three human betacoronaviruses that cause severe disease | |
| CN103910796B (zh) | 一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体 | |
| CN103254312B (zh) | 一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| RU2686630C1 (ru) | Штаммы гибридных клеток животных Mus. Musculus - продуценты моноклональных антител к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) и моноклональные антитела к белку GP вируса Эбола (subtype Zaire) | |
| Ou et al. | Development and characterization of rabbit and mouse antibodies against ebolavirus envelope glycoproteins | |
| CN100575361C (zh) | 抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白b的人源化单链抗体 | |
| CN109942702B (zh) | 一种人鼠嵌合抗HEV全分子IgG及其应用 | |
| Voronina et al. | Cross-reactive fc-fused single-domain antibodies to hemagglutinin stem region protect mice from group 1 influenza a virus infection | |
| CN114805579B (zh) | 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用 | |
| CN103214571B (zh) | 一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| CN110294802B (zh) | 一种单克隆抗体10g12及其应用 | |
| RU2771288C1 (ru) | Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 | |
| CN114478755A (zh) | 抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用 | |
| CN103588874A (zh) | 一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用 | |
| Morris et al. | Broadly neutralizing antibodies |