CN114478755A

CN114478755A - 抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用

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Publication number: CN114478755A
Application number: CN202110740865.1A
Authority: CN
Inventors: 迟航; 葛良鹏; 王铁成; 杨希; 高玉伟; 梁浩; 李元果; 郎巧利; 赵永坤; 吴梦; 冯娜; 刘作华; 杨松涛; 刘雪芹; 夏咸柱; 黄楠
Original assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences; Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences; Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN114478755B

Abstract

本发明提供了一种抗SARS‑CoV‑2抗体，包括单克隆抗体11‑2G和/或单克隆抗体18‑4A；所述抗体11‑2G包括轻链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.1中的自N端90－97位和/或重链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.2中的自N端100－112位；所述抗体18‑4A轻链可变区CDR3，序列SEQ ID NO.3中的自N端90－98位和/或重链链可变区CDR3，序列SEQ ID NO.4中的自N端100－115位。本发明成功筛选到了针对新型冠状病毒RBD SARS‑CoV‑2的全人源单克隆抗体，对SARS‑CoV‑2表面刺突蛋白具有高亲和力，具有诊断和/或治疗和/或预防新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的应用价值和前景。

Description

抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用

技术领域

本发明涉及抗新型冠状病毒的全人源抗体及其双抗体组合物，主要针对刺突蛋白受体结合域，属于医学生物抗体技术领域。

背景技术

新型冠状病毒(serve acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)为冠状病毒科β属冠状病毒，是一种有包膜结构的单股正链RNA病毒，包含4种主要的结构蛋白：分别是刺突蛋白(Spike Protein，S)、小包膜蛋白(Envelope Protein，E)和膜糖蛋白(Membrane Protein，M)等3种膜蛋白，以及1种与病毒RNA结合的核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)。其中，S蛋白为同源三聚体，能够识别并结合宿主细胞表面受体，在介导病毒包膜与细胞膜融合方面有关键作用，不仅是病毒的主要免疫原，也是疫苗和抗病毒药物研发的主要靶点。S蛋白包含S1和S2两个亚基，其中S1亚基分为N-端区(N-terminaldomain，NTD)和含受体结合域(receptor binding domain，RBD)的C-端区，S2亚基包含融合肽、2个7肽重复序列HR(hepeat repeat region，HR)和跨膜区等膜融合过程所需基本元件。与SARS-CoV相似，SARS-CoV-2进入细胞经过了RBD与宿主细胞表面的血管紧张素酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合、S2蛋白介导膜融合等两个过程。

研发特异有效的抗体药物是病毒性传染病防治的重要策略，中和抗体特异性强、亲和力高，能够快速中和冠状病毒，既可以在病原体暴露后给药，并在短时间内发挥疗效，也可以用作有效的预防性药物，是重大传染病防控体系中不可替代的核心药物之一。输注动物和病人来源的多克隆抗血清可应用于传染性疾病的预防和治疗，但外源动物蛋白在患者体内存在诱发超敏反应的风险。在SARS和新冠肺炎疫情期间，输注恢复期病人血浆在小规模临床中取得了一定效果，但病人血浆存在来源有限，输注剂量不易控制等问题，可重复性降低。抗体药物由于靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，近年来已成为生物药行业中发展最快的分支，病毒特异性单克隆抗体更是被认为是抗血清最有效的替代物，而全人源抗体已逐渐成为抗体药物研发的首要选择。

当前新冠中和抗体研发主要通过单细胞测序技术、抗体文库展示技术、杂交瘤融合技术等3条主要技术路线开展。单细胞测序技术主要是利用分离康复者血清中的B细胞或经抗原免疫后的人源化抗体转基因小鼠B细胞进行单细胞测序，获得特异性的全人单克隆抗体基因，用于后续制备全人源基因工程抗体。但该技术在单个B细胞的分离和PCR扩增过程中难度较大。抗体文库展示技术主要是将外源肽段、基因等和噬菌体衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面，进行高通量筛选及富集，获得特异性的全人单克隆抗体基因，用于后续制备全人源基因工程抗体。但由于该技术是以原核表达系统为基础，表达的抗体在氨基酸修饰、蛋白糖基化等方面存在一定缺陷。杂交瘤融合技术主要是分离经抗原免疫后的人源化抗体转基因小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，筛选获得特异性的全人单克隆抗体基因，构建并筛选分泌高活性抗体的细胞株，制备全人源基因工程抗体。当前FDA批准的32款全人源抗体中，有23个(＞70％)来源于人源化抗体转基因小鼠。人抗体转基因动物是人抗体药物开发的有效手段之一，能为抗体序列发现提供源头创新保障，并为突发性生物安全事件提供应急预案，已成为制备全人抗体药物的主流技术。但由于人源化抗体转基因小鼠这一核心资源一直被国外少数几家公司垄断，且几乎不对外授权使用该小鼠，使得国内大范围应用受到限制。

值得注意的是，单克隆中和抗体药物开发可以精准靶向新冠病毒的抗原表位，被认为是具有治疗和预防潜力的特异性抗病毒疗法，但单个中和抗体应用于抗病毒治疗时可能存在病毒逃逸突变株产生的潜在风险，而同时给予针对不同识别区域或者不同表位的单抗组合物，即采用“鸡尾酒”抗体则能够有效削弱单个抗体常常发生的RNA病毒因突变造成的逃逸，增强抗病毒效力。

目前我国新型冠状病毒肺炎疫情得到了有效控制，但全球范围内部分国家仍处于疫情的高发或平台期，冠状病毒病确诊病例仍在持续增多，病毒也在不断进化，防控形势不容乐观。因此，研发新型冠状病毒特异性全人源抗体对于新冠肺炎的紧急预防与救治意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供针对新型冠状病毒,尤其是刺突蛋白受体结合域(RBD)的抗SARS-CoV-2抗体。

一种抗SARS-CoV-2抗体，包括单克隆抗体11-2G和/或单克隆抗体18-4A；所述抗体11-2G包括轻链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.1中的自N端90－97位和/或重链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.2中的自N端100－112位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR3，序列SEQID NO.3中的自N端90－98位和/或重链链可变区CDR3，序列SEQ ID NO.4中的自N端100－115位。

上述抗SARS-CoV-2抗体，抗体11-2G包括轻链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.1中的自N端51－53位和/或重链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.2中的自N端53－61位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.3中的自N端51－53位和/或重链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.4中的自N端53－61位。

上述抗SARS-CoV-2抗体，抗体11-2G包括轻链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.1中的自N端27－33位和/或重链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.2中的自N端26－35位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.3中的自N端27－33位和/或重链链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.4中的自N端26－35位。

上述抗SARS-CoV-2抗体，还包括FR框架区，所述抗体11-2G包括轻链可变区FR为SEQ ID NO.1中的自N端1-26，34-50，54-89，98-107位和/或重链可变区FR为SEQ ID NO.2中的自N端1-25，36-52，62-99，113-123位；所述抗体18-4A轻链可变区FR为SEQ ID NO.3中的自N端1-26，34-50，54-89，99-108位和/或重链链可变区FR为SEQ ID NO.4中的自N端1-25，36-52，62-89，106-116位。

上述单克隆抗体11-2G，包括轻链可变区序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示，和/或重链可变区序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一目的是利用“鸡尾酒”法，提供一种新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(RBD)的抗SARS-CoV-2单克隆抗体组合物，所述双抗体组合物能够充分发挥抗体“鸡尾酒”疗法的协同增效的功效，提高阻断新型冠状病毒入侵感染的中和活性。此目的是通过以下措施实现的：

一种双抗体“鸡尾酒”组合物，包括：

第一单克隆抗体11-2G，包括是上述任一所述轻链可变区和/或重链可变区或至少90％相同的氨基酸序列；

第二单克隆抗体18-4A，包括上述任一所述轻链可变区和/或重链可变区或至少90％相同的氨基酸序列。

上述双抗体组合物，命名为11-2G&18-4A，含有非竞争的特异性结合于SARS-CoV-2的S蛋白受体结合区的单克隆抗体。本发明还提供了与所述抗体相关的生物材料，包括所述抗体的核酸分子和核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断和/或治疗和/或预防新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的产品，所述产品的活性成分为上述抗体或生物材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了上述所述抗体、生物材料或所述产品的下述任一应用：

(1)在制备诊断新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的试剂中的应用；

(2)在治疗和/或预防和/或抑制新型冠状病毒的药物或制剂中的应用；

(3)在治疗和/或预防新型冠状病毒感染的药物或制剂中的应用。

(4)在抗新型冠状病毒感染或冠状病毒感染所致疾病鸡尾酒疗法制剂中的组分使用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了上述所述抗体的药物组合物，包括上述任一所述抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

本发明提供一种利用人抗体转基因小鼠通过杂交瘤快速筛选技术制备全人源单克隆抗体的方法，利用抗原特异性免疫原免疫人抗体转基因小鼠(CAMouse^HG)，然后分离小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行杂交瘤融合，以SARS-CoV-2RBD蛋白筛选到针对新型冠状病毒RBD SARS-CoV-2的全人源单克隆抗体。

有益效果

1、本发明成功筛选到了针对新型冠状病毒RBD SARS-CoV-2的全人源单克隆抗体11-2G和18-4A，上述抗体是能有效抑制SARS-CoV-2侵入的中和抗体，对SARS-CoV-2表面刺突蛋白具有高亲和力，具有诊断和/或治疗和/或预防新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的应用价值和前景。

2、本发明提供的新型冠状病毒全人中和抗体鸡尾酒组合物，通过协同组合，非竞争的特异性结合于SARS-CoV-2的S蛋白受体结合区的单克隆抗体，具有更高的体外中和新型冠状病毒活性的特性，具有明显的协同增效的效果。

3、本发明所提供的抗体鸡尾酒组合物为全人源抗体组合物，减少后期的人工改造，提高了抗体组合物的成药性。

4、本发明可以采用多元表达系统进行表达，比如酵母表达系统、CHO、大肠杆菌等，生产制造的应用范围更广，适用于规模化生产。

附图说明

图1：与SARS-CoV-2RBD结合EC₅₀检测结果

图2：抗体阻断S-RBD蛋白与ACE2受体蛋白结合IC₅₀检测结果

图3：抗重组抗体亲和力检测结果

图4：假型病毒中和实验检测结果

图5：活病毒中和实验检测结果

图6：酵母表达截断形式(scFV-Fc)抗体假型病毒中和实验检测结果

图7：酵母表达截断形式(scFV-Fc)抗体活病毒中和实验检测结果

图8：重组抗体组合物表位分析结果

图9：重组抗体组合物假型病毒中和实验检测结果

图10：重组抗体组合物活病毒中和实验检测结果

具体实施方式

下面是具体实施例证对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例证只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术是由熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语和相关领域技术人员所通常理解的具有相同的含义。

活病毒：病毒是一种非细胞生命形态，它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。它的复制、转录、和转译的能力都是在宿主细胞中进行，当它进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量完成生命活动，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。

假型病毒：假型病毒是指一种病毒的基因组由另一种病毒的囊膜所包裹而形成的没有致病性的病毒粒子。

实施例1动物免疫

利用S-RBD蛋白免疫重庆金迈博生物技术有限公司拥有的人抗体转基因小鼠(CAMouse^HG)(CN108486125A、CN108486126A、CN105274116A、CN105441455A)，4次免疫后采集小鼠眼眶血，分离血清后用间接ELISA法进行免疫效价检测，选取血清稀释1:12800倍OD450＞1.0和血清稀释100倍后仍能阻断S-RBD蛋白与ACE2蛋白结合的小鼠进行加强免疫，4天后进行杂交瘤融合实验。

实施例2杂交瘤融合和筛选、验证

1)分离小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行混合，使用离心机将混合细胞液离心，1200rpm/min，离心5min，离心结束后，弃上清，用PBS 10mL重悬，使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，离心后弃上清，用电融合液10mL重悬，继续使用离心机离心，1200rpm/min，离心5min，离心后弃上清，用电融合液重悬细胞，将细胞悬液加入电融合槽，设置好电压参数，点击融合按钮，进行电融合；2)将得到的杂交瘤细胞混合液转移至加有HAT的半固体培养基中，混匀后加入培养皿，铺板到10cm大皿中，放于37℃，5％CO2培养箱中培养，7-10天后挑取单个克隆至含有HT培养基的96孔板中，继续培养2-3天进行检测；3)间接ELISA检测：采用间接ELISA方法检测阳性单克隆，包被抗原为S-RBD蛋白，检测样品为杂交瘤上清，酶标二抗为Anti Human IgG(Fab)-HRP，将检测阳性的单克隆从96孔板传至24孔板，待细胞生长占孔底面积的75％时，取细胞上清进行进一步检测。

实施例3重组抗体表达和纯化

1)将具有活病毒中和作用杂交瘤单克隆克隆用5’RACE方法进行序列测定，获得抗体的重链和轻链V区序列，按照常规重组抗体的表达方式构建IgG1型重组抗体；2)取对数生长期的293F细胞按照0.8×10⁶cells/mL密度进行传代。待细胞长到1.5×10⁶cells/mL，并且细胞活率大于95％后，将细胞稀释到1×10⁶cells/mL后进行转染。取2个无菌的2mL EP管，一个加入200μL Opti-MEM培养液和20μg重组质粒DNA(浓度为1.5mg/mL)，另一个加入200μLOpti-MEM培养液和60μL PEI(1μg/μL)，各自混匀后室温孵育5min。再将混匀的PEI溶液快速加入混匀的重组质粒DNA中，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵15min，再逐滴加入准备好的293F细胞中，边加边轻轻震荡细胞。将转染好的细胞至于震动培养箱中培养，每天用台盘兰染色法计算细胞活率，当活细胞量下降至60％左右时，400×g离心20min收取细胞上清液。利用HITRAP PROTEIN G HP(GE)进行上清中蛋白的纯化。先用5倍柱体积的超纯水冲洗柱子，再用5倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PB buffer，0.2mol/L NaCl，PH＝7.2)平衡柱子。将收集的细胞上清用0.45μm过滤膜过滤后与等体积的结合缓冲液混合，再上样，流速为1mL/min，收集流穿液。用10倍柱体积的结合缓冲液洗柱子，直到紫外和电导均为基线。用洗脱缓冲液(100mmol/L甘氨酸，PH＝2.7)洗脱至中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl，PH＝9.0)中，流速1mL/min。洗脱后立即用10倍柱体积的结合缓冲液重新平衡柱子。再将纯化后的蛋白用PBS透析过夜后用超滤管浓缩并调整浓度至1mg/mL。

实施例4重组抗体EC₅₀检测

将纯化后的11-2G和18-4A重组单克隆抗体进行EC₅₀检测，实验方法如下：用包被液将S-RBD蛋白稀释至2μg/mL，100μL/孔，4度包被过夜。取出包被好的ELISA板，PBST(取250μL吐温-20至500mL PBS中)洗涤三次，1％BSA PBS(取1g BSA至100mL PBS中)37度封闭1h。取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤三次，加入培养基上清，根据所测浓度进行4倍连续稀释(浓度范围设定为100000ng/ml-0.1ng/mL，用1％BSA PBS稀释)，并设置HT培养基上清(同样连续稀释)为阴性对照，设置加1％BSA PBS为空白对照，37℃孵育2h。取出孵育好的ELISA板，PBST洗涤三次，Mouse Anti-Human IgG(Fab)-HRP(1:5000，用1％BSA PBS稀释)，37度孵育2h。取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤三次，加入TMB显色15min，用终止液(2.5M H₂SO₄)终止，酶标仪读取OD450数值。计算EC₅₀值：将OD₄₅₀值和相应的浓度梯度输入Graphpad Prism软件计算EC₅₀值。

经检测，11-2G与S-RBD蛋白结合EC₅₀值为3.84ng/mL，18-4A与S-RBD蛋白结合EC₅₀值为8.35ng/mL，检测结果如图1所示。

实施例5重组抗体IC₅₀检测

将纯化后的11-2G和18-4A重组单克隆抗体进行IC₅₀检测，实验方法如下：用包被液将S-RBD蛋白稀释至2μg/mL，100μL/孔，4度包被过夜。取出包被好的ELISA板，PBST洗涤三次，2％BSA PBS(取2g BSA至100ml PBS中)37度封闭1h。表达抗体孵育：取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤三次，加入杂交瘤上清，根据所测浓度(杂交瘤上清浓度检测参照试剂盒进行)进行4倍连续稀释(浓度范围设定为100000ng/ml-0.1ng/mL，用1％BSA PBS稀释)，并设置HT杂交瘤上清(同样连续稀释)为阴性对照，设置加1％BSA PBS孔为空白对照，孵育至37度2h。ACE2蛋白孵育：取出孵育好的ELISA板，PBST洗涤三次，将浓度为1μg/mL的ACE2蛋白加至ELISA板中37度孵育1h。取出孵育好的ELISA板，PBST洗涤三次，加入Anti-6×His

-HRP，稀释1:5000倍，37度孵育1h。取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤三次，加入TMB显色15min，用终止液(2.5M H₂SO₄)终止，酶标仪读取OD₄₅₀数值。计算IC₅₀值：不添加抑制物质的对照孔(阴性对照)的OD值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为B。B/B0％就叫做结合率，在结合率为50％时所对应的抑制物质的浓度为IC₅₀。

经检测，11-2G阻断S-RBD蛋白与ACE2受体蛋白结合IC₅₀值分别为55.96ng/mL，18-4A不具备阻断S-RBD蛋白与ACE2受体蛋白结合的活性，检测结果如图2所示。

实施例6重组抗体亲和力检测

利用Biacore T200检测重组抗体的亲和力，方法如下：1)打开Biacore T200控制软件按照标准流程安装CM5芯片。2)根据样本量选择合适的试管模块，开始捕获芯片，偶联缓冲液为HBS-ET。根据样品架位置表，准备足够体积的样品，EDC/NHS，blocking buffer，Anti-IgG(Fc)，根据软件要求对应位置放于试管架上。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱，系统自动运行偶联程序。3)偶联完成后进行样品检测，根据标准程序设定配体11-2G和18-4A,Contact time为30s,flow rate为10μL/min，分析物为SARS-CoV-2RBD，Associationtime为120s，Flow rate为30μL/min，Dissociation time为480s，再生时间30s。4)按照要求准备需要检测的对应样品，并按照位置要求放于样品舱，开始自动运行程序进行检测。5)根据运行结果，进行数据的拟合分析，得到最终的亲和力拟合KD值。

经检测，11-2G与SARS-CoV-2RBD的亲和力为4.51E-10，18-4A与SARS-CoV-2RBD的亲和力为2.34E-10，结果如图3和表1所示。

表1重组抗体动力学及亲和力参数

实施例7重组抗体假型病毒中和活性检测

利用Lipofectamine 3000脂质体将HIV pNL4-3.Luc.RE骨架质粒和编码SARS-CoV-2S蛋白基因的真核表达质粒pcDNA3.1-SARS2-S共转染293T细胞，包装HIV骨架的SARS-CoV-2假型病毒。通过假型病毒中和实验检测纯化后的重组单克隆抗体的假型病毒中和抗体效价，方法如下：1)取96孔细胞培养板，用DMEM培养液将抗体从100μg/mL进行3倍倍比稀释，每个抗体稀释度设置3个重复，每个孔的终体积为100μL。细胞对照和病毒对照孔不参与倍比稀释。2)用DMEM培养液稀释SARS-CoV-2假型病毒(使病毒对照孔荧光素酶报告基因的读值RLU控制在200000～400000之间)，除细胞对照孔外，其余孔每孔加入50μL。将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱孵育1小时。3)将293T-hACE2细胞进行消化、计数，按每孔2×10⁴个细胞铺到孵育后的细胞培养板，加入细胞体积为50μL。每个孔总体积为200μL，于37℃、5％CO₂培养箱内培养48h。4)取出96孔细胞培养板，弃去100μL细胞培养上清，每孔等体积加入荧光素酶检测试剂，避光放置5分钟，于多功能酶标仪读取各孔RLU数值。5)计算中和百分率，绘制中和曲线，并计算中和50％SARS-CoV-2假型病毒的最高抗体稀释度作为抗体的假型病毒中和抗体效价。假型病毒中和百分率的计算公式为：

经检测，抗体11-2G和18-4A均具有中和假型病毒活性，即可抑制SARS-CoV-2S蛋白与hACE2受体的结合，假型病毒中和抗体效价分别为0.103μg/mL和1.274μg/mL，检测结果如图4所示。

实施例8重组抗体SARS-CoV-2活病毒中和活性检测

在生物安全三级实验室(BSL-3)利用SARS-CoV-2中和实验(CPE法)检测纯化后的重组单克隆抗体11-2G的活病毒中和抗体效价，方法如下：1)取96孔细胞培养板，用DMEM培养液将抗体11-2G从25μg/mL进行2倍倍比稀释，每个抗体稀释度设置4个重复，每个孔的终体积为100μL。细胞对照和病毒对照孔不参与倍比稀释。2)将SARS-CoV-2活病毒调整至100TCID₅₀/50μL，除细胞对照孔外，其余孔每孔加入50μL SARS-CoV-2。将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱孵育1小时。3)将Vero E6细胞进行消化、计数，按每孔1×10⁴个细胞铺到孵育后的细胞培养板，加入细胞体积为50μL，每个孔总体积为200μL，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。4)每天观察细胞病变效应(CPE)，3天左右细胞病变明显时记录每孔的病变结果。利用Reed-Muench法，通过活病毒感染细胞形成细胞病变效应的百分比而计算出抗体的SARS-CoV-2活病毒中和抗体效价(IC₅₀)。

经检测，抗体11-2G和18-4A均具有SARS-CoV-2中和活性，即可抑制SARS-CoV-2入侵宿主细胞，活病毒中和抗体效价(IC₅₀)分别为0.276μg/mL和2.481μg/mL，检测结果如图5所示。

实施例9酵母表达截断形式(scFV-Fc)抗体假型病毒中和活性检测

用DMEM培养液将抗体从50μg/mL进行3倍倍比稀释，通过假型病毒中和实验检测纯化后的酵母表达重组单克隆抗体11-2G-JM和18-4A-JM的假型病毒中和抗体效价，实验方法参照前述假型病毒中和实验检测方法进行。

经检测，抗体11-2G-JM和18-4A-JM均具有中和假型病毒活性，即可抑制SARS-CoV-2S蛋白与hACE2受体的结合，假型病毒中和抗体效价(IC₅₀)分别为0.187μg/mL和为17.83μg/mL，检测结果如图6所示。

实施例10酵母表达截断形式(scFV-Fc)抗体活病毒中和活性检测

用DMEM培养液将抗体从50μg/mL进行2倍倍比稀释，通过SARS-CoV-2中和实验(CPE法)检测纯化后的酵母表达重组单克隆抗体11-2G-JM和18-4A-JM的假型病毒中和抗体效价，实验方法参照前述活病毒中和实验检测方法进行。

经检测，抗体11-2G-JM和18-4A-JM均具有SARS-CoV-2中和活性，即可抑制SARS-CoV-2入侵宿主细胞，活病毒中和抗体效价(IC₅₀)分别为0.276μg/mL和12.503μg/mL，检测结果如图7所示。

实施例11重组抗体组合物表位分析

用ForteBio Octet分子相互作用技术平台，将11-2G固相化到Anti Human IgG Fc传感器上，用人血清白蛋白封闭传感器至饱和，再将传感器加入SARS-CoV-2RBD蛋白，使之与11-2G抗体充分结合至饱和后，放入PBS缓冲液中平衡，再加入18-4A与进行再结合，观察结果。

经检测，11-2G与SARS-CoV-2RBD蛋白蛋白结合至饱和后，18-4A仍能与SARS-CoV-2RBD蛋白结合，表明18-4A与11-2G同时能结合SARS-CoV-2RBD蛋白的不同位点，因此18-4A与11-2G为不同表位的2个重组单克隆抗体，检测结果如图8所示。

实施例12 11-2G与18-4A抗体组合物假型病毒中和活性检测

通过假型病毒中和实验检测11-2G与18-4A抗体组合物的假型病毒中和抗体效价，取96孔细胞培养板，首孔分别加入50μg/mL的抗体11-2G和50μg/mL的抗体18-4A，用DMEM培养液将11-2G与18-4A抗体组合物从终浓度100μg/mL进行3倍倍比稀释，其余实验操作参照前述假型病毒中和实验检测方法进行。

经检测，11-2G与18-4A抗体组合物的假型病毒中和抗体效价(IC₅₀)为0.038μg/mL，检测结果如图9所示。

实施例13 11-2G与18-4A抗体组合物活病毒中和活性检测

利用SARS-CoV-2中和实验(CPE法)检测11-2G与18-4A抗体组合物的活病毒中和抗体效价，取96孔细胞培养板，首孔分别加入25μg/mL的11-2G抗体和25μg/mL的18-4A抗体，用DMEM培养液将11-2G与18-4A抗体组合物从终浓度50μg/mL进行2倍倍比稀释，其余实验操作参照前述假型病毒中和实验检测方法进行。

经检测，11-2G与18-4A抗体组合物的活病毒中和抗体效价(IC₅₀)为0.195μg/mL，检测结果如图10所示。

SEQUENCE LISTING

<110>军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、重庆市畜牧科学院

<120>抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用

<160>

<210> 1

<211> 107

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 1

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY GESYRATGIP 60

DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSLTFGG GTKVEIK 107

<210> 2

<211> 123

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 2

qvqlqqagpg lvkpsqtlsl tcaisgdsvs snsaiwnwir qspsrglewl grtyyrskwy 60

ndyavsvksr itinpdtskn qfslqlnsvt pedtavyyca rvdiltgysf dywgqgtlvt 120

vss 123

<210> 3

<211> 108

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 3

eivltqspgt lslspgerat lscrashivs ssylawyqqk pgqaprlliy gassratgip 60

drfsgsgsgt dftltisrle pedfavyccq qyagspftfg pgtkvdik 108

<210> 4

<211> 126

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 4

QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSAAWNWIR QSPSRGLEWL GRTYYRSKWY 60

NDYAVSVKSR ITINPDTSKN QFSLQLNSVT PEDTAVYYCA REGALLWFGE GAFDYWGQGT 120

LVTVSS 126

Claims

1.一种抗SARS-CoV-2抗体，包括单克隆抗体11-2G和/或单克隆抗体18-4A；所述抗体11-2G包括轻链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.1中的自N端90－97位和/或重链可变区CDR3，序列为SEQ ID NO.2中的自N端100－112位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR3，序列SEQID NO.3中的自N端90－98位和/或重链链可变区CDR3，序列SEQ ID NO.4中的自N端100－115位。

2.如权利要求1所述的抗SARS-CoV-2抗体，抗体11-2G包括轻链可变区CDR2，序列为SEQID NO.1中的自N端51－53位和/或重链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.2中的自N端53－61位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.3中的自N端51－53位和/或重链可变区CDR2，序列为SEQ ID NO.4中的自N端53－61位。

3.如权利要求1或2所述的抗SARS-CoV-2抗体，，抗体11-2G包括轻链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.1中的自N端27－33位和/或重链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.2中的自N端26－35位；所述抗体18-4A轻链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.3中的自N端27－33位和/或重链链可变区CDR1，序列为SEQ ID NO.4中的自N端26－35位。

4.如权利要求1-3任一所述的抗SARS-CoV-2抗体，还包括FR框架区，所述抗体11-2G包括轻链可变区FR为SEQ ID NO.1中的自N端1-26，34-50，54-89，98-107位和/或重链可变区FR为SEQ ID NO.2中的自N端1-25，36-52，62-99，113-123位；所述抗体18-4A轻链可变区FR为SEQ ID NO.3中的自N端1-26，34-50，54-89，99-108位和/或重链链可变区FR为SEQ IDNO.4中的自N端1-25，36-52，62-89，106-116位。

5.如权利要求1-4任一所述的抗SARS-CoV-2抗体，包括轻链可变区序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示，和/或重链可变区序列如SEQ ID NO.2 或SEQ ID NO.4所示。

6.一种双抗体“鸡尾酒”组合物，包括：

第一单克隆抗体11-2G，包括权利要求1-5任一所述轻链可变区和/或重链可变区或至少90%相同的氨基酸序列；

第二单克隆抗体18-4A，包括权利要求1-5任一所述轻链可变区和/或重链可变区或至少90%相同的氨基酸序列。

7.编码权利要求1-6任一所述抗体的核酸分子。

8.含有权利要求7所述核酸分子的表达盒、重组载体和/或重组微生物。

9.诊断和/或治疗和/或预防新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的产品，其特征在于：所述产品的活性成分为上述抗体或生物材料。

10.上述所述抗体、生物材料或所述产品的下述任一应用：

（1）在制备诊断新型冠状病毒或新型冠状病毒感染的试剂中的应用；

（2）在治疗和/或预防和/或抑制新型冠状病毒的药物或制剂中的应用；

（3）在治疗和/或预防新型冠状病毒感染的药物或制剂中的应用；

（4）在抗新型冠状病毒感染或冠状病毒感染所致疾病鸡尾酒疗法制剂中的组分使用。

11.药物组合物，包括上述任一所述抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。