TW201639883A - 抗伊波拉病毒醣蛋白之人體抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供與抗伊波拉病毒醣蛋白結合之單株抗體或其抗原結合片段，包括此抗體之醫藥組成物及使用方法。本發明之抗體可用於抑制或中和伊波拉病毒活性，因此提供治療或預防人類中伊波拉病毒感染之方法。在某些實施例中，本發明係提供一或多種與伊波拉病毒結合之抗體用於預防伊波拉病毒黏附及/或進入宿主細胞之用途。本發明之抗體可用於預防上或治療上且可單獨或與一或多種其他的抗病毒劑或疫苗組合使用。

Description

抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
本發明係關於與抗伊波拉病毒醣蛋白結合之抗體、包括這些抗體之醫藥組成物以及其使用方法。
伊波拉病毒(EBOV)和相關的絲狀病毒(filovirus)造成人類和非人類靈長動物中數種嚴重的病毒性出血熱，其中在人類暴發中高達約90%的死亡率(Murin,C.D.et al.,(2014),Proc Natl Acad Sci USA,111(48)：17182-17187)。媒介保護作用的免疫機制正在研究中，但至目前為止仍無經認可供人類使用之治療。
伊波拉病毒醣蛋白(GP)為存在病毒表面及被感染細胞上的唯一蛋白。其被假定負責病毒與宿主細胞之結合和融合。GP係以數種形式存在。這些GP係以二種開放閱讀框編碼。未編輯的GP mRNA產生一非結構分泌性可溶性GP(sGP)，其係在早期感染期間所合成(Volchkova,et al.(1995),Virology 214：421-430；Volchkova,VA et al.,(1998),Virology 250：408-414；Sanchez,et al.(1996),Proc Natl Acad Sci USA,93：3602-3607；Sanchez,et al.(1999)J.Infect.Dis.179(suppl.1,S164))。sGP形成二聚物(Volchkova,et al.(1995),Virology 214：421-430；Falzarano,D.et al.,Chembiochem(2006), 7：1605-1611)且在病患及試驗受感染動物的血液中偵測到高含量(Sanchez,et al.(1996),Proc Natl Acad Sci USA,93：3602-3607；Dolnik,O.et al.,(2004),EMBO J 23：2175-2184)。
感染後期，產生編輯過的mRNA，從第二開放閱讀框獲得編碼能力。此編輯過的mRNA係編碼一種含有跨膜(TM)區之GP型，其使得該GP型被細胞質膜栓住，並併入病毒體中，在其中其係作為功能性宿主細胞受體-結合蛋白/融合蛋白。在此GP形式之生物合成期間，此蛋白係經蛋白水解處理形成二種藉由雙硫鍵連結一起的產物。此胺基端產物稱為GP1(140kDa)而羧基端裂解產物則稱為GP2(26kDa)(Sanchez,et al.(1998),J.Virol.72：6442-6447)。
伊波拉病毒GP(EBOV GP)可為保護性抗體之目標，但抗體在疾病阻抗中的角色已有爭議。在康復期之病患中，中和抗體之可忽略的血清效價與從實驗轉移免疫血清給動物所達到的保護作用之不一致的結果，已產生中和抗體在感染復原中之角色的推測(Peters,CJ and LeDuc,JW,(1999),J.Infect.Dis.179 Suppl 1；Mikhailov,VV,(1994),Vopr.Virusol.39：82；Xu,L.et al.,(1998),Nature Med.4：37)。然而，在更新近的伊波拉病毒暴發中，一些接觸疾病的病患及經病毒性GP專一性單珠抗體混合物(ZMapp)治療的病患已從疾病中康復。再者，以來自這些病患及感染後存活下來的其他病患之血清治療的其他病患，亦具有正面結果。
數種結合伊波拉病毒GP之抗體已有描述(參見，例如，美國專利第6630144、6875433、7335356和8513391號。亦參見EP1539238、EP2350270和EP8513391)。
當技術進展已增進製造改良的伊波拉病毒抗原疫苗組成物之能力的同時，仍需要提供處理新出現的伊波拉病毒株之另外保護來源。目 前有數種抗伊波拉病毒的候選治療劑正在評估當中，包括暴露後疫苗(Feldman,H,et al.(2007),PLos Pathog 3(1)：e2)、小分子抑制劑(Cote,M.et al.(2011),Nature,477(7364)：344-348；Johansen,LM,et al.(2013),Sci Transl Med 5(190)：190ra179；Warren,TK,et al.,(2014),Nature,508(7496)：402-405),siRNA-based therapeutics(Geisbert,TW,et al.,(2006),J.Infect Dis.193(12)：1650-1657；Geisbert,TW et al.,(2010),Lancet 375(9729)：1896-1905)及單株抗體(Saphire,EO,(2013),Immunotherapy 5(11)：1221-1233；Wong,G.et al.(2014),Trends Microbiol.22(8)：456-463；Qiu,X et al.,(2014),Hum.Vaccin.Immunother.10(4)：964-967)。非人類靈長動物之被動抗體給藥已證明為有效的(Dye,JM.,et al.,(2012),Proc Natl Acad Sci USA 109(13)：5034-5039)。更新近，最近已在菸草植株中製造三種抗體的混合物(ZMapp)，且已開發供人類使用(Qiu,X.et al.,(2014),Nature 514(7520)：47-53)。
當包括感興趣抗原(例如GP)之疫苗組成物在病患中產生中和抗體之想法一般被認為是一良好方法之同時，用於已暴露於病毒之病患可能並非有利的，因為可能要花數星期讓身體對疫苗組成物產生反應。在該時間點之前，依照可取得的照護和緩和治療的層級，病患可能因該病毒感染而死亡。在這些病患中，或在任何無法達到有效抗體反應之病患中，提供一已含有可能以EBOV特定病毒株或各種病毒株之共有表位為目標的保護性抗體組成物，可能更為有利。
因此，在本項技術中對於鑑別可用於預防或治療伊波拉病毒感染之新的抗體，仍有需求。
本發明係提供結合伊波拉病毒(EBOV)醣蛋白(GP)之抗體及其抗原結合片段。本發明之抗體可用於抑制或中和伊波拉病毒的活性。在 某些實施例中，此等抗體可用於阻斷伊波拉病毒與宿主細胞黏附及/或預防伊波拉病毒進入宿主細胞。在某些實施例中，此等抗體係藉由抑制細胞-對-細胞的病毒傳播，或藉由殺死受伊波拉病毒感染的細胞，降低病原性病毒的產生來作用。在特定的實施例中，此等抗體可用於一對象中預防、治療或改善至少一種伊波拉病毒感染之症狀。在特定的實施例中，此等病毒可預防性或治療性投予患有或處於得到伊波拉病毒感染風險之對象中。在特定的實施例中，含有至少一種本發明抗體之組成物可投予一不適合疫苗或疫苗效力較低的對象，例如年長病患、非常年輕的病患、對任何一或多種疫苗成份過敏的病患，或對疫苗中之免疫原無反應的免疫功能不足的病患。在特定的實施例中，含有至少一種本發明抗體的組成物可在伊波拉病毒暴發期間投予醫療人員、住院病患或療養院所居住者或其他高風險病患。在特定的實施例中，含有至少一種本發明抗體的組成物可作為第一線治療投予已暴露於伊波拉病毒的病患。
本發明之抗體可為全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或僅包括一抗原結合部份(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，及可經修飾影響功能性，例如增加在宿主中的持續性，或消除殘餘的效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。在特定的實施例中，此等抗體可為雙專一性的。
在一第一方面，本發明係提供專一與EBOV GP結合之單離的重組單株抗體或其抗原結合片段。
在一實施例中，本發明係提供專一與伊波拉病毒(EBOV)及/或伊波拉病毒醣蛋白(EBOV-GP)結合之單離的重組抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有一或多項下列特性：(a)包括三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其係包含在由下列組成之群中選出的任一重鏈可變區(HCVR)序列內：SEQ ID NO：18、66、146、2、34、50、82、98、114、130、162、178、194、210、226、242、258、274、290和306；以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其係包含在由下列組成之群中選出的任一輕鏈可變區(LCVR)序列：SEQ ID NO：26、74、154、10、42、58、90、106、122、138、170、186、202、218、234、250、266、282和298；(b)為一全長的人類單株抗體；(c)與EBOV，或如表面電漿共振所測表現具有低於10-7M之解離常數(KD)的類病毒顆粒(VLP)結合；(d)相對於pH 7.4，在pH 5或pH 6時展現至少增加3-倍的解離半衰期(t½)；(e)展現以範圍從約10-11M至約10-9M之IC50中和薩伊伊波拉病毒(Zaire Ebola virus)；(f)展現與表現EBOV-GP觸發抗體-依賴的細胞毒性之細胞結合；(g)與一或多種由下列組成之群中選出的EBOV病毒株交叉反應：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)；(h)與可溶性GP(sGP)結合；(i)與參照抗體交叉競爭，其中該參照抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1之HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
在一實施例中，本發明係提供專一與EBOV及/或伊波拉病毒醣蛋白(EBOV GP)結合之單離的重組抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有二或多項下列特性：(a)為一全長的人類單株抗體； (b)與EBOV，或如表面電漿共振所測表現具有低於10-7M之解離常數(KD)之表現EBOV GP的類病毒顆粒(VLP)結合；(c)相對於pH 7.4，在pH 5或pH 6時展現至少增加3-倍的解離半衰期(t½)；(d)展現以範圍從約10-11M至約10-9M之IC50中和薩伊伊波拉病毒；(e)展現與表現EBOV-GP觸發抗體-依賴的細胞毒性之細胞結合；(f)與一或多種由下列組成之群中選出的EBOV病毒株交叉反應：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)；(g)與可溶性GP(sGP)結合；(h)與參照抗體交叉競爭，其中該參照抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1之HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
本發明之示例的抗-伊波拉病毒GP抗體係列於文中之表1和2中。表1係列出示例的抗-伊波拉病毒GP抗體之重鏈可變區(HCVR)、輕鏈可變區(LCVR)、重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)、輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的胺基酸序列辨識碼。表2係列出示例的抗-伊波拉病毒GP抗體之HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2 HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列辨識碼。
本發明係提供包括一HCVR之抗體或其抗原結合片段，而該HCVR係包括一選自表1所列的任何胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一LCVR之抗體或其抗原結合片段，而該LCVR係包括一選自表1所列的任何胺基酸序列之胺基酸序列，或具有 至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明係提供包括一對HCVR和一LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)之抗體或其抗原結合片段，而該HCVR和LCVR胺基酸序列對係包括表1所列的任何HCVR胺基酸序列與表1所列的任何LCVR胺基酸序列相配對。根據特定的實施例，本發明係提供抗體或其抗原結合片段，其係包括一包含在表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體內的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
在一實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段係包括由下列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：18/26、66/74、146/154、2/10、34/42、50/58、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282。
在一實施例中，此單離的抗體或抗原結合片段係包括：(a)一HCDR1區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：20、68、148、4、36、52、84、100、116、132、164、180、196、212、228、244、260、276、292和308；(a)一HCDR2區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：22、70、150、6、38、54、86、102、118、134、166、182、198、214、230、246、262、278、294和310；(b)一HCDR3區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、72、152、8、40、56、88、104、120、136、168、184、200、216、232、248、264、280、296和312； (c)一LCDR1區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：28、76、156、12、44、60、92、108、124、140、172、188、204、220、236、252、268、284和300；(d)一LCDR2區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列SEQ ID NO：30、78、158、14、46、62、94、110、126、142、174、190、206、222、238、254、270、286和302；(e)一LCDR3區，其係具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：32、80、160、16、48、64、96、112、128、144、176、192、208、224、240、256、272、288和304.
在特定的實施例中，此HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：18/26(H1H17139P)、66/74(H1H17161P)和146/154(H1H17203P)。
本發明亦提供包括一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結合片段，該重鏈CDR1係包括一選自表1所列的任何HCDR1胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結合片段，該重鏈CDR2係包括一選自表1所列的任何HCDR2胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結合片段，該重鏈CDR3係包括一選自表1所列的任何HCDR3胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結合片段，該輕鏈CDR1係包括一選自表1所列的任何LCDR1胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結合片段，該輕鏈CDR2係包括一選自表1所列的任何LCDR2胺基酸序列之胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結合片段，該輕鏈CDR3係包括一選自表1所列的任何LCDR3胺基酸序列之胺基酸序列，或實質上具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其類似序列。
本發明亦提供包括一對HCDR3和一LCDR3胺基酸序列對(HCDR3/LCDR3)之抗體或其抗原結合片段，而該胺基酸序列對係包括表1所列的任何HCDR3胺基酸序列與表1所列的任何LCDR3胺基酸序列相配對。根據特定的實施例，本發明係提供抗體或其抗原結合片段，其係包括一包含在表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體內的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。在特定的實施例中，h3HCDR3/LCDR3胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：24/32(例如H1H17139P)、72/80(例如H1H17161P)和152/160(例如H1H17203P)。
本發明亦提供包括一組六個包含在表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體內的CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在特定的實施例中，此HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係由下列組 成之群中選出：SEQ ID NO：20-22-24-28-30-32(例如H1H17139P)、68-70-72-76-78-80(例如H1H17161P)；和148-150-152-156-158-160(例如H1H17203P)。
在一相關的實施例中，本發明係提供包括一組六個包含在表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體所定義之HCVR/LCVR胺基酸序列對內的CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。例如，本發明係包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列對，其係包含在由下列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列內：SEQ ID NO：18/26(例如H1H17139P)、66/74(例如H1H17161P)；和146/154(例如H1H17203P)。用於鑑別HCVR和LCVR胺基酸序列內的CDR之方法和技術已為本項技術所熟知並可用於鑑別文中所揭示的指定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內之CDR。可用鑑別CDR範圍之示例的慣用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。概括而言，Kabat定義係以序列變異性為基礎，Chothia定液係以結構環區域的位置為基礎，而AbM定義為Kabat和Chothia法之折衷。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。亦可取得公用數據供鑑別抗體內的CDR序列。
本發明包括具有修飾糖基化模式之抗-伊波拉病毒抗體。在某些實施例中，移除不欲的糖基化位置之修飾作用可能為有用的，或在寡糖鏈上缺乏岩藻糖基團存在之抗體，例如，用以增加抗體依賴的細胞毒殺(ADCC)功能(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他的應用上，可進行半乳糖基化之修飾作用以修改補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)。
本發明亦提供，與包括HCVR之CDR和LCVR之CDR的抗體或其抗原結合片段競爭和伊波拉病毒專一結合之抗體及其抗原結合片段，其中該HCVR和LCVR各自具有選自表1所列的HCVR和LCVR序列之胺基酸序列。
本發明亦提供，與包括HCVR之CDR和LCVR之CDR的參照抗體或其抗原結合片段交叉競爭與伊波拉病毒結合之抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR和LCVR各自具有選自表1所列的HCVR和LCVR序列之胺基酸序列。
本發明亦提供阻斷伊波拉病毒黏附及/或進入宿主細胞之抗體及其抗原結合片段。
在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段為雙專一性的，其包括一與伊波拉病毒之第一表位結合的第一專一性及與伊波拉病毒之第二表位結合的第二專一性，其中該第一和第二表位為不同且非重疊的。在特定的實施例中，此雙專一性可包括與一病毒醣蛋白之表位結合的第一臂及與一不同病毒抗原之表位結合的第二臂。
在第二方面，本發明係提供編碼抗-伊波拉病毒抗體或其部分之核酸分子。例如，本發明係提供編碼表1所列的任何HCVR胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何LCVR胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何LCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何HCDR1胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何HCDR1核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何HCDR2胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何HCDR2核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何HCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何HCDR3核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何LCDR1胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何LCDR1核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何LCDR2胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何LCDR2核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼表1所列的任何LCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括由表2所列的任何LCDR3核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子，其中該HCVR係包括一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組係如表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子，其中該LCVR係包括一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係如表1所列的任何示例抗-伊波拉病毒GP抗體所定義。
本發明亦提供編碼HCVR和LCVR二者之核酸分子，其中該HCVR係包括表1所列的任何HCVR胺基酸序列之胺基酸序列，及其中該LCVR係包括表1所列的任何LCVR胺基酸序列之胺基酸序列。在特定的實施例中，此核酸分子係包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列，及由表2所列的任何LCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之其實質上類似序列。在特定的實施例中根據本發明此方面，此核酸分子係編碼HCVR和LCVR，其中該HCVR和LCVR二者係衍生自表1所列的相同抗-伊波拉病毒GP抗體。
本發明係提供編碼表1所列的任何重鏈胺基酸序列之核酸分子。本發明亦提供編碼表1所列的任何輕鏈胺基酸序列之核酸分子。
在一相關方面，本發明係提供重組的表現載體，其能表現一包括抗-伊波拉病毒GP抗體之重鏈或輕鏈可變區的多肽。例如，本發明係包括重組的表現載體，其係包含任何上述之核酸分子，亦即編碼任何如表1中所示的HCVR、LCVR及/或CDR序列之核酸分子。本發明之範圍亦包括 其中已導入此等載體之宿主細胞，以及藉由在得以產生抗體或抗體片段之條件下培養宿主細胞，並回收所產生的抗體或抗體片段來製造抗體或其部份之方法。
在第三方面，本發明係提供包括一或多種專一與伊波拉病毒GP結合之單離的單株抗體或其抗原結合片段以及醫藥上可接受載劑或稀釋的醫藥組成物。此一或多種單離的抗體係包括由表1所列的HCVR和LCVR序列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對。在一實施例中，此HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：18/26、66/74、146/154、2/10、34/42、50/58、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282.在一實施例中，此HCVR/LCVR胺基酸序列對係由SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154組成之群中選出。
在一相關方面，本發明之特色為一組成物，其為至少二種本發明抗體及一醫藥上可接受載劑或稀釋劑之組合物。
在一相關方面，本發明之特色為一組成物，其為至少三種本發明抗體及一醫藥上可接受載劑或稀釋劑之組合物/混合物。
在一實施例中，此醫藥組成物係包括(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體其係包括一對如表1所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對，或其抗原結合片段；(b)一第二抗-伊波拉病毒抗體其係包括一對如表1所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對，或其抗原結合片段；及(c)一第三抗-伊波拉病毒抗體其係包括一對如表1所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對，或其抗原結合片段，其中第一抗體係與伊波拉病毒GP上的第一表位結合或相互作用，而第二及/或第三抗體係與伊波拉病毒GP上的不同表位結合或相互作用，及(d)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在另外的相關方面，本發明之特色為一組成物，其為一抗-伊波拉病毒GP抗體及一第二治療劑之組合物。
在一實施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-伊波拉病毒GP抗體組合之藥劑。可有利地與抗-伊波拉病毒抗體組合之示例藥劑包括(不限於)其他結合及/或抑制-伊波拉病毒活性之藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段等)及/或不會直接與伊波拉病毒結合但會抑制病毒活性包括宿主感染性之藥劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括：(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體其係包括一對如表1所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對，或其抗原結合片段；(b)一第二抗-伊波拉病毒抗體其係包括一對如表1所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對，或其抗原結合片段，其中第一抗體係與伊波拉病毒GP上的第一表位結合，而第二抗體係與伊波拉病毒GP上的第二表位結合，其中第一和第二表位為不同且非重疊的；及(c)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括：(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)一第二抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗體不會和第二抗體交叉競爭與伊波拉病毒結合；及(c)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括：(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)一與不同的伊波拉病毒抗原相互作用之第二抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，其中第一抗體係與伊波拉病毒GP上的一表位結合，而第二抗體係與不同伊波拉病毒抗原上的一表位結合；及(c)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括： (a)一第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)一第二抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(c)一第三抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，其中第一抗體係與伊波拉病毒GP上的第一表位結合，而第二及/或第三抗體係與伊波拉病毒GP上的不同表位結合，其中第一、第二和第三表位為不同且非重疊的；及(d)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括：(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)一第二抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(c)一第三抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，其中第一抗體可能會或可能不會和第二及/或第三抗體交叉競爭與伊波拉病毒結合；及(d)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在特定的實施例中，本發明係提供一醫藥組成物，其包括：(a)一第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)一與不同伊波拉病毒抗原相互作用之第二及/或第三抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，其中第一抗體係與伊波拉病毒上的一表位結合，而第二及/或第三抗體係與不同伊波拉病毒抗原上的一表位結合；及(c)一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
在一實施例中，此醫藥組成物係包括與一種伊波拉病毒株上的表位結合或相互作用之第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片，以及與伊波拉病毒之相同或不同病毒株上的第二及/或第三表位結合或相互作用的第二及/或第三抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段。與本發明抗體相互作用之伊波拉病毒株可從下列組成之群中選出：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹伊波拉病毒、邦地布優伊波拉病毒和象牙海岸伊波拉病毒或其變體。
在一相關方面，本發明係提供一醫藥組成物，其包括一專一與伊波拉病毒GP結合的第一單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該第一單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括一SEQ ID NO：20之HCDR1胺 基酸序列；一SEQ ID NO：22之HCDR2胺基酸序列；一SEQ ID NO：24之HCDR3胺基酸序列；一SEQ ID NO：28之LCDR1胺基酸序列；一SEQ ID NO：30之LCDR2胺基酸序列及一SEQ ID NO：32之LCDR3胺基酸序列，以及一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。此醫藥組成物可進一步包括一專一與伊波拉病毒GP結合的第二單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該第二單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括一SEQ ID NO：68之HCDR1胺基酸序列；一SEQ ID NO：70之HCDR2胺基酸序列；一SEQ ID NO：72之HCDR3胺基酸序列；一SEQ ID NO：76之LCDR1胺基酸序列；一SEQ ID NO：78之LCDR2胺基酸序列及一SEQ ID NO：80之LCDR3胺基酸序列。此醫藥組成物可進一步包括一專一與伊波拉病毒GP結合的第三單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該第三單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括一SEQ ID NO：148之HCDR1胺基酸序列；一SEQ ID NO：150之HCDR2胺基酸序列；一SEQ ID NO：152之HCDR3胺基酸序列；一SEQ ID NO：156之LCDR1胺基酸序列；一SEQ ID NO：158之LCDR2胺基酸序列及一SEQ ID NO：160之LCDR3胺基酸序列。
在特定的實施例中，各抗體可調配成分開的調配物且若經測定需要一種以上的抗體以達到最大效力，則各抗體調配物，若需要，可共投予(同時或先後)。另一種選擇，抗體混合物可共調配。
在特定的實施例中，當一醫藥調配物中係組合二或多種以上的抗體時，其可能是或不是與伊波拉病毒蛋白上的相同或重疊表位結合。涉及本發明之抗-伊波拉病毒抗體的另外組合治療或共調配係揭示於文中的他處。
在第四方面，本發明係提供使用本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體或抗體之抗原結合部份或至少二或多種本發明抗體之混合物，供治療 與伊波拉病毒有關的疾病或病症(例如病毒感染患者)或至少一種與病毒感染有關的症狀或至少一種與EBOV感染有關症狀之頻率或嚴重度的治療方法，其中該治療方法係包括將一治療上有效量之至少二或多種本發明抗體或抗原結合片段投予有此需要之對象。在一實施例中，此方法係包括投予至少三種本發明抗體之組合物(混合物)。在一實施例中，此抗體混合物包括三種抗-EBOV抗體，其係具有SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154中所述的胺基酸序列對。所治療的病症為任何藉由抑制伊波拉病毒活性而加以改善、改進、抑制或防止之疾病或症狀。在特定的實施例中，本發明係提供預防、治療或改善至少一種伊波拉病毒感染之症狀的方法，該方法包括將一治療上有效量之至少一或多種抗-伊波拉病毒GP抗體或其抗原結合片段投予有此需要之對象。
在一相關方面，本發明係提供中和傳染性EBOV之方法，該方法包括將一經EBOV感染的細胞暴露於包括一或多種抗-EBOV抗體或其抗原結合片段之組成物，其中該暴露係造成細胞保護增強而免於病毒感染或細胞死亡。在特定的實施例中，此暴露可在活體外或活體內。在一實施例中，此方法係包括投予一或多種本發明抗體。在一實施例中，此方法係包括投予至少三種本發明抗體之組合物(混合物)。在一實施例中，此抗體混合物係包括三種具有SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154中所述之胺基酸序列對的抗-EBOV抗體。
在某些實施例中，本發明係藉由投予一或多種本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體，提供於一患者中改善或降低至少一種伊波拉病毒感染症狀之嚴重度、持續時間或發生頻率之方法，其中該至少一種症狀係由下列組成之群中選出：發燒、頭痛、疲勞、失去食慾、肌痛、腹瀉、嘔吐、腹痛、脫水和不明原因出血。
在特定的實施例中，本發明係提供於一對象中降低病毒載量之方法，該方法包括將一有效量之一或多種與本伊波拉病毒GP結合及阻斷伊波拉病毒結合及/或進入宿主中的發明抗體或其片段投予一患者。
在一相關方面，本發明係提供增加患有EBOV感染之患者，或暴露於EBOV，或處於暴露或得到EBOV風險之對象的存活性或存活可能性之方法，該方法包括將至少一種本發明之抗體或抗原結合片段，或包括至少一種本發明抗體之醫藥組成物投予有此需要之對象。
在一實施例中，係提供增加患有EBOV感染之患者，或暴露於EBOV，或處於暴露或得到EBOV風險之對象的存活性或存活可能性之方法，該方法包括投予一包含至少二種本發明抗-EBOV抗體之混合物的抗體混合劑。在一實施例中，該方法包括投予一包含至少三種本發明抗-EBOV抗體之混合物的抗體混合劑。在一實施例中，此投予的抗體混合物係包括至少三種本發明之抗-EBOV抗體，其中該至少三種抗體係包括如SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154中所述的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
在一實施例中，有此需要的對象為處於暴露或得到伊波拉病毒感染風險之對象，其中該對象係由下列組成之群中選出：免疫功能不全個體、健康照護工作者、疑似已暴露於藏有伊波拉病毒者之個人、與感染個體有身體接觸或身體距離極近、醫院員工、醫藥研究員、負責清潔治療過伊波拉病患之醫院設施或機構的維護人員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的個人以及飛行常客。
在一實施例中，可投予有此需要的對象至少一種本發明之抗-EBOV抗體或其抗原結合片段，或包括至少一種本發明抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物與一第二治療劑之組合。此第二治療劑可由下列組成之群中選出：抗病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、 不同的抗EBOV抗體、伊波拉病毒疫苗、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。
在一實施例中，此醫藥組成物可由皮下、靜脈內、皮內、肌肉內、鼻內或口服給藥。
在一相關的實施例中，當以包括抗體混合物(其係包括至少三種本發明抗體)之醫藥組成物治療暴露於或已感染EBOV的哺乳動物時，在該等哺乳動物中可觀察到強化的保護作用。
在一實施例中，觀察到的強化保護作用可藉由減少至少一種與EBOV感染之相關症狀的嚴重性或頻率，或藉由減少病毒載量，或藉由增加感染EBOV之哺乳動物的存活率來測量。至少一種症狀可由下列組成之群中選出：發燒、頭痛、疲勞、失去食慾、肌痛、腹瀉、嘔吐、腹痛、脫水和不明原因出血。
當抗體單獨使用時，或當其與一或多種另外的治療劑或抗-EBOV治療型式組合使用時，可觀察到強化的保護作用。
此一或多種另外的治療劑可由下列組成之群中選出：抗病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、不同的抗伊波拉病毒抗體、伊波拉病毒疫苗、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。
在一實施例中，此一或多種另外的治療劑係包括一或多種抗-EBOV抗體。
在一實施例中，此一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由表1之任何HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
在一相關的實施例中，此一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對，其係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282。
在另外相關的實施例中，此一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對，其係由SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154組成之群中選出。
在特定的實施例中，此一或多種抗體或其抗原結合片段可預防性或治療性投予具有或處於具有或傾向發生伊波拉病毒感染風險之對象處於風險之對象包括(但不限於)免疫功能不全的人，例如因自體免疫疾病之免疫功能不全的人，或接受免疫抑制治療的人(例如，器官移植後)，或患有人類免疫功能缺乏症候群(HIV)或後天免疫缺乏症候群(AIDS)的人、耗損或破壞白血球之特定形式的貧血、接受放射線或化療的人，或患有發炎病症的人。其他處於得到伊波拉病毒感染風險之對象包括健康照護工作者、或與感染個體有身體接觸或身體距離極近，或暴露於感染個體之體液或組織，以及具有發生伊波拉病毒感染之增加風險的任何人。再者，由於靠近疾病爆發而處於接觸伊波拉病毒感染風險之對象，例如居住在人口稠密城市或極靠近已確診或疑似伊波拉病毒感染之對象，或選擇的職業，例如負責清潔治療過伊波拉病患之醫院設施或機構的維護人員、醫院員工、醫藥研究員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的 個人或飛行常客。
在特定的實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予有此需要的對象。此第二治療劑可由下列組成之群中選出：抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、抗感染藥、抗病毒藥、不同的抗伊波拉病毒抗體、伊波拉病毒疫苗、ZMapp治療、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)、干擾素、保健食品例如抗氧化劑和本項技術中已知可用於改善至少一種伊波拉病毒感染的症狀，或用於降低患病之病毒載量的其他藥物或治療。在特定的實施例中，此第二治療劑可為幫助對抗或降低與本發明抗體或其抗原結合片段有關的任何可能副作用之藥劑，若此等副作用將發生的話。抗體或其片段可由皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、口服、鼻內、肌肉內或顱內給藥。在一實施例中，此抗體可以單一的靜脈內輸液作為該對象血清中之最大抗體濃度給藥。抗體或其片段可以約0.1mg/kg體重至約100mg/kg體重的劑量來給藥。在特定的實施例中，本發明之抗體可以一或多個包括介於50mg至600mg之劑量來給藥。
本發明亦包括本發明之抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段用於治療患有、疑似患有或已暴露於EBOV之對象，或用於製造醫藥品供治療因阻斷伊波拉病毒結合及/或活性而得利之疾病或病症。
由審閱確認詳細的說明，其他的實施例將變得顯而易見。
詳細說明
在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法 和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。雖然在施行或試驗本發明時可使用任何類似或相當於該等與文中所述的方法和物質者，但較佳的方法和物質為目前所述。
定義
「伊波拉病毒」或「EBOV」為纖維病毒科之一屬，其已知造成嚴重和快速的進行性出血熱。以核苷酸序列和暴發地區為基準有許多種不同的伊波拉病毒種和病毒株，例如薩伊(Zaire)、Tai Forest(先前稱為象牙海岸(Cote d’Ivoire或Ivory Coast))、蘇丹(Sudan)、雷斯頓(Reston)和邦地布優(Bundibugyo)。最致命的病毒形式為薩伊和蘇丹病毒株。雷斯頓病毒株為已知僅感染非人類靈長類之唯一病毒株。術語「伊波拉病毒」亦包括從不同伊波拉病毒分離物中分離出來的伊波拉病毒之變體。
全長伊波拉病毒醣蛋白之胺基酸序列，在文中稱為「EBOV GP」或「伊波拉病毒GP」，係以GenBank中所發現登錄號AHX24649.1(亦參見SEQ ID NO：314)和AHX24649.2(亦參見SEQ ID NO：315)之胺基酸序列作為示例。此術語亦涵蓋連結，例如一組胺酸標籤(例如參見帶有十組胺酸標籤之登錄號AHX24649.1(SEQ ID NO：318))、小鼠或人類Fc，或訊號序列的伊波拉病毒GP或其片段。「可溶性GP」或「sGP」胺基酸序列係如登錄號AHX24650和SEQ ID NO 316(帶有一訊號序列)以及SEQ ID NO：317(無訊號序列但帶有myc-myc-六組胺酸標籤)所示。「GP1」之胺基酸序 列始於全長GP之殘基1的胺基端及末端為SEQ ID NO：315的501殘基。「GP2」之胺基酸序列係跨越全長GP之502至676殘基，如SEQ ID NO：315所示。
術語「伊波拉病毒感染」或「EBOV感染」，如文中所用係指因暴露於病毒或感染的動物或感染的人類病患，或接觸來自感染伊波拉病毒動物或人類病患之體液或組織所導致的嚴重出血熱。「與伊波拉病毒感染有關的症狀」包括發燒、頭痛、疲勞、失去食慾、肌痛、腹瀉、嘔吐、腹痛、脫水和不明原因出血。.
術語「抗體」，如文中所用，希望係指包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。各重鏈係由一重鏈可變區(HCVR或VH)及一重鏈恆定區(包括CH1、CH2和CH3區)所組成。各輕鏈係由一輕鏈可變區(LCVR或VL)及一輕鏈恆定區(CL1)所組成。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明特定的實施例中，抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖系序列相同，或可為天然的或經人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
一或多個CDR殘基之取代，或一或多個CDR之刪除亦為可能的。抗體已描述於科學文獻中，其中一或多個CDR可經分配供結合。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)以公開的晶體結構為基礎，分析了抗體及其抗原間的接觸區，並結論出僅約五分之一至三分一的CDR殘基實際與抗原接觸。Padlan亦發現許多抗體，其中一至二個CDR並無胺基酸與抗 原接觸(亦參見Vajdos等人.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
未與抗原接觸之CDR殘基可基於之前的研究(例如CDRH2中之H60-H65殘基通常不需要)，由位於Chothia CDR外部之Kabat CDR區，藉由分子模型及/或以經驗加以鑑定。若CDR或其殘基被消除，其通常係經一在另外的人類抗體序列或相同之此等序列中占據對應位置之胺基酸取代。CDR內供取代的位置和取代的胺基酸亦可以經驗來選擇。根據經驗的取代可為保守的或非保守取代。
文中所揭示的全長人類抗-伊波拉病毒單株抗體，相較於對應的生殖系序列，係在重鏈和輕鏈可變區之框架及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所述之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個框架及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中統稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，VH及/或VL區內的所有框架及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個框架及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初從其衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明抗體在框架及/或CDR 區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段可容易地測試其一或多種所欲的性質，例如結合專一性改善、結合親和力增加、拮抗或促效性生物性質改善或增進(視情況而定)、致免疫力降低等。以此通用方法所得的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中
本發明亦包括全長的人類抗-伊波拉病毒單株抗體，其係包含具有一或多個保守取代之文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括抗-伊波拉病毒抗體，其相對於文中所揭示之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類FR序列上之mAb。此術語包括於非人類哺乳動物中，或於非人類哺乳動物細胞中重組產生的抗體。此術語不希望包括分離自或產生自人類對象之抗體。
術語「重組的」，如文中所用，係指藉由本項技術中已知的技術，如包括例如DNA剪接和基因轉殖表現之重組DNA技術所創造、表 現、分離或獲得之本發明抗體或其抗原結合片段。此術語係指表現在非人類哺乳動物(包括基因轉殖非人類哺乳動物，例如基因轉殖小鼠)，或細胞(例如CHO細胞)表現系統或分離自重組的組合人類抗體庫之抗體。
術語「專一結合」或其類似術語係指抗體或其抗原結合片段與抗原形成一在生理條件下相當穩定的複合物。專一結合其特徵可為至少約1x10-7M或更低之平衡解離常數(例如，較小的KD係代表較高的結合)。測定二種分子是否為專一結合之方法已為本項技術所熟知並包括，例如平衡透析、表面電漿共振及其類似方法。如文中所述，與伊波拉病毒專一結合之抗體係藉由表面電漿共振，例如BIACORETM來鑑別。再者，與伊波拉病毒之一區及與一或多個另外的抗原結合之多專一性抗體，或與伊波拉病毒之二個不同區結合的雙專一性抗體，雖然如此，如文中所用仍被視為「專一結合」之抗體。
術語「高親和力」抗體係指該等具有對伊波拉病毒之結合親和力，如表面電漿共振，例如BIACORETM或溶液親和性ELISA所測，以KD表示，至少10-7M；至少較佳的10-8M；更佳地10-9M；甚佳地10-10M，甚至更佳地10-11M，甚至更佳地10-12M。
術語「緩慢解離速率」、「Koff」或「kd」係指一抗體，如表面電漿共振，例如BIACORETM所測，以1 x 10-3s-1或更低，較佳地1 x 10-4s-1或更低之速率常數，從伊波拉病毒，或表現伊波拉病毒GP之病毒類顆粒解離。
術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一結合形成一複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」，如文中所用，係指一或多種保留與伊波拉病毒結合能力 之抗體片段。
在特定的實施例中，本發明之抗體或抗體片段可與一基團，例如配體或治療基團接合(免疫接合物)，例如抗病毒藥、第二抗-伊波拉病毒抗體，或可用於治療伊波拉病毒所造成的感染之任何其他的治療基團。.
「單離的抗體」，如文中所用，希望係指一抗體其實質上不具有不同抗原專一性之其他抗體(Ab)(例如，專一與伊波拉病毒結合之單離的抗體或其片段實質上無專一結合伊波拉病毒以外的抗原之Ab)。
「阻斷抗體」或「中和抗體」，如文中所用(或「中和伊波拉病毒活性之抗體」或「拮抗劑抗體」)希望係指一抗體其與伊波拉病毒結合導致抑制至少一項伊波拉病毒之生物活性。例如，本發明抗體可防止或阻斷伊波拉病毒黏附或進入宿主細胞。此外，「中和抗體」為一抗體可中和，亦即預防、抑制、降低、阻礙或干擾病原引發感染及/或將感染永存於宿主中之能力。術語「中和抗體」和「中和化抗體」可交換使用。這些抗體，依照適合的調配物，可單獨或與其他的抗病毒劑組合或與活性疫苗聯合使用，作為預防藥劑或治療劑，或作為診斷工具。
「抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性」或「ADCC」為細胞媒介的反應，據此，免疫系統的效應子細胞係有效地溶離目標細胞(其膜表面抗原已與專一性抗體，例如文中所述的抗體結合)。因此，經由此一機制，例如病毒專一性抗可用於限制感染傳播。經典的ADCC係由天然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、嗜中性粒細胞及在特定的情況下嗜酸性粒細胞所媒介。
術語「表面電漿共振」，如文中所用，係指藉由偵測生物感測器基質內的蛋白濃度改變，例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)，而得以進行即時分子 生物相互作用之分析的光學現象。
術語「KD」，如文中所用，希望係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原上不同的區域結合並可具有不同的生物效應。術語「表位」亦指B及/或T細胞回應抗原之抗原上的位置。其亦指與抗體結合之抗原區。表位可以結構或功能加以定義。功能表位一般為結構表位之子群，且具有該等直接促成相互作用之親和力的殘基。表位亦可為構形上的，亦即由非線性胺基酸組成。在特定的實施例中，表位可包括分子之化學活性表面分群，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基之決定位，及在特定的實施例中，可具有特異的三維結構特性，及/或特異的帶電特性。
術語「交叉競爭」，如文中所用係指抗體或其抗原結合片段與一抗原結合並抑制或阻斷另外的抗體或其抗原結合片段之結合。此術語亦包括二種抗體間以二種向位相互競爭，亦即結合第一抗體並阻斷第二抗體之結合且反之亦然。在特定的實施例中，第一抗體和第二抗體可與相同的表位結合。另一種選擇，第一和第二抗體可與不同但重疊的表位結合，使得一抗體之結合抑制或阻斷了第二抗體之結合，例如經由位阻現象。抗體間的交叉競爭可藉由本項技術中已知的方法來測量，例如即時、免標定生物薄膜干涉分析。就測定一試驗抗體是否與本發明之參照抗-伊波拉病毒GP抗體交叉競爭，係在飽和條件下讓此參照抗體與伊波拉病毒GP或多肽結合。接著，評估試驗抗體與伊波拉病毒GP結合之能力。若試驗抗體在與參照抗-伊波拉病毒GP抗體飽和結合後，能與伊波拉病毒GP結合，則可結 論出該試驗抗體係與不同於參照抗-伊波拉病毒抗體的表位結合。另一方面，若試驗抗體在與參照的抗-伊波拉病毒GP抗體飽和結合後，不能與伊波拉病毒GP結合，則該試驗抗體可能與如同本發明參照抗-伊波拉病毒GP抗體結合的表位之相同表位結合。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳化對齊時，以任何熟知的序列一致性演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或GAP來測量，有至少約90%，及更佳地至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列一致性。具有與參照核酸分子實質上一致性的核酸分子，在特定情況下，可編碼與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列之多肽。
當用於多肽時，術語「實質類似」或「實質上類似」係指二個胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時，享有至少90%序列一致性，甚佳地至少95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白的功能性質。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可上調序列一致性之百分比或類似程度以修正此取代作用之保守性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知(參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331)。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及 組胺酸；6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及7)含硫側鏈：半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另一種選擇，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443 45(其係以引用的方式併入本文中)所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如GAP和BESTFIT程式，其可使用內定參數，測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，一種GCG Version 6.1內的程式，作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列一致性百分比(前文Pearson(2000))。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時，另外較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。
「治療上有效量」一詞係指就其投予產生所欲的效用之量。確切的量將依照治療目的而定，且可由熟習本項技術者使用已知的技術確定(參見，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
如文中所用，「對象」係指需要改善、防止及/或治療疾病 或病症，例如病毒感染之動物，較佳的哺乳動物，更佳地人類。此對象可能具有伊波拉病毒感染或有發生伊波拉病毒感染之傾向。「有發生伊波拉病毒感染傾向」之對象，或「可能處於接觸伊波拉病毒感染升高風險」之對象為因自體免疫疾病而患有免疫系統功能不全之對象、接受免疫抑制治療的人(例如器官移植後)、患有人類免疫功能缺乏症候群(HIV)或後天免疫缺乏症候群(AIDS)的人、耗損或破壞白血球之特定形式的貧血、接受放射線或化療的人，或患有發炎病症的人。另外，極年輕或年長的對象係處於升高的風險中。與感染個體有身體接觸或身體距離極近，或暴露於來自感染動物或人類病患之體液或組織的任何人係具有發生伊波拉病毒感染之增加風險。再者，由於靠近疾病爆發而處於接觸伊波拉病毒感染風險之對象，例如居住在人口稠密城市或極靠近已確診或疑似伊波拉病毒感染之對象，或選擇的職業，例如醫院員工、醫藥研究員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的個人，或飛行常客。
如文中所用，術語「治療」係指由於將一治療劑例如本發明之抗體投予一有此需要的患者，而降低或改善至少一種伊波拉病毒感染之症狀或適應症的嚴重度。此術語包括抑制疾病進程或感染惡化。此術語亦包括正面的疾病預後，亦即該對象因投予治療劑例如本發明抗體而可能免於感染或可能降低或無病毒效價。此治療劑可以一治療劑量投予該對象。
術語「預防」係指由於投予本發明之抗體，而抑制伊波拉病毒感染之表現或任何伊波拉病毒感染的症狀或適應症。此術語包括於一暴露於病毒或處於具有伊波拉病毒感染風險之對象中預防感染的傳播。
如文中所用，術語「抗病毒劑」係指用於一對象中治療、預防或改善病毒感染之任何抗感染劑或治療，無論是一化學基團或一生物治療。例如，在本發明中，抗病毒劑可包括(但不限於)抗伊波拉病毒抗體(在 一實施例中此抗伊波拉病毒抗體可不同於文中所述之抗體)、伊波拉病毒之疫苗、ZMapp治療、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。在本發明中，所治療的感染係由伊波拉病毒所造成。
一般說明
伊波拉病毒疾病係由纖維病毒科成員之絲狀病毒顆粒所造成的嚴重、通常致命性疾病。已知有數種的伊波拉病毒屬病毒能造成人類疾病。這些包括薩伊(Zaire)、蘇丹(Sudan)、Tai Forest(先前稱為象牙海岸)和邦地布優(Bundibugyo)。這些病毒的天然儲存者仍為未知且至目前為止仍無被認可的治療或疫苗。
病毒的基因體係由長度約19kb之單股負義RNA所組成。伊波拉病毒含有7種蛋白：一種表面醣蛋白(GP)、一種核蛋白(NP)、四種病毒體結構蛋白(VP40、VP35、VP30和VP24)以及一種RNA-依賴的RNA聚合酶(L)(Feldman,et al.(1992)Virus Res.24,1-19)。
存在病毒表面上的僅有蛋白為醣蛋白。由於RNA編輯，GP基因的轉錄造成數種編碼病毒GP，包括非結構可溶性GP(sGP)和表面病毒體GP之GP基因專一性mRNA的合成(Volchkova,VA et al.,(1998),Virology 250：408-414)。二種GP合成為前驅分子，其係藉由細胞蛋白酶furin於胞內處理期間被蛋白分解性裂解(Volchkov,VE,et al.,((1998),Proc Natl Acad Sci USA 95：5762-5767)。sGP形成二聚體，而裂解的羧基-端片段為一單體。病毒表面刺突形成GP1,2之三聚體，其係由以雙硫鍵連接的二種亞單位GP1和GP2所構成(Volchkova,VA et al.,(1998),Virology 250：408-414；Falzarano,D. et al.,(2006),Chembiochem 7：1605-1611)。GP1已知係媒介病毒與宿主細胞之黏附而GP2係涉及膜融合(Sanchez,A.et al.,(1996),Proc Natl Acad Sci USA 93：3602-3607；Alazard-Dany,N.,et al.(2006),J.Gen.Virol.87：1247-1257)。
在EBOV感染期間，大量的可溶性醣蛋白(sGP)從病毒感染的細胞中釋出。此GP已顯示係結合並隔離針對表面或病毒體GP之病毒中和性抗體(Dolnik,O.et al.,(2004),EMBO J 23：2175-2184)。除了此抗體-阻斷之外，可溶性GP的角色就病毒複製及/或致病性而言並未完整定義。Escudero-Perez等人之更新近的研究已顯示，sGP可能不會結合及活化非感染的樹突狀細胞和巨噬細胞並引發前發炎和抗發炎細胞激素的分泌。此外，其驗證了sGP影響內皮細胞功能並可能影響血管通透性(Escudero-Perez,et al.,(2014),PLOS Pathogens,Vol.10,Issue 11：1-17)。此項可解釋感染後之失調的發炎宿主反應並可能促成病毒的致病性。
用於預防或治療傳染性疾病之被動性免疫治療已使用超過1世紀，通常係以含有高效價中和抗體之恢復期人類血清的形式(Good et al.,(1991)；Cancer 68：1415-1421)。至今，多純化單株抗體目前係在臨床前和臨床開發中用作為抗-微生物劑(Marasco et al 2007；Nature Biotechnology 25：1421-1434)。與伊波拉病毒醣蛋白結合之特定的抗體已有描述(參見，例如Audet et.al.(2014),Scientific Reports 4：6881；Chen,et.al.(2014),ACS Chem Biol.Oct.17；9(10)：2263-73；Koellhoffer JF,et.al.,(2012),Chembiochem Nov.26；13(17)：2549-57；Qiu,X.,et.al.,Nature(2014)Oct 2；514(7520)：47-53)。
發明者們已於文中描述專一與伊波拉病毒GP結合之全人類抗體及其抗原結合片段及調節這些細胞與伊波拉病毒之相互作用。抗-伊波拉病毒GP抗體可以高親和力與伊波拉病毒結合。在特定的實施例中，本發 明之抗體係阻斷抗體，其中該等抗體可與伊波拉病毒GP結合並阻斷黏附及/或進入宿主細胞。在特定的實施例中，本發明之抗體可阻斷伊波拉病毒與細胞的黏附且如此一來可抑制或中和宿主細胞的病毒感染。在特定的實施例中，本發明之抗體可媒介抗體依賴的細胞-媒介細胞毒性(ADCC)且如此一來，可幫助破壞潛藏病毒的細胞。在特定的實施例中，此等抗體可以二種方式來作用，例如其可中和病毒感染性並可媒介ADCC。在某些實施例中，此等抗體可用於治療患有伊波拉病毒感染之對象。此等抗體，當投予有此需要的對象時，可降低該對象中病毒，例如伊波拉病毒感染。其可用於一對象中降低病毒載量。其可單獨使用或作為與用於治療病毒感染之其他本項技術中已知的治療分子或形式之輔助治療。在特定的實施例中，這些抗體可與伊波拉病毒GP之胺基端的表位結合。在特定的實施例中，這些抗體可與伊波拉病毒GP之羧基端的表位結合。再者，所鑑定的抗體可預防上(感染前)用於保護哺乳動物免於感染，或可治療上(感染確立後)用於改善先前確立的感染，或改善至少一種與感染有關的症狀。
示例的伊波拉病毒GP之全長胺基酸序列分別係以GenBank登錄號AHX24649.1和AHX24649.2，以及以SEQ ID NO：314和315來表示。GP1係跨越全長GP之1-501殘基，而GP2係跨越全長GP之502至676殘基，如SEQ ID NO：314或SEQ ID NO：315所示)。全長EBOV GP，亦如登錄號AHX24649.1所示，可與十組胺酸標籤結合，例如如SEQ ID NO：318所示。可溶性GP(sGP)係如GenBank登錄號AHX24650.1以及如SEQ ID NO：316(帶有連接的訊號序列)和如SEQ ID NO：317(無訊號序列，但含有一myc-myc-his標籤)所示。
在特定的實施例中，本發明之抗體可從小鼠以初級免疫原，例如全長伊波拉病毒GP，或以重組形式的伊波拉病毒GP或其片段使其免 疫，接著以第二免疫原或以伊波拉病毒GP之致免疫活性片段使其免疫來取得。在特定的實施例中，此等抗體係由以編碼全長伊波拉病毒GP之DNA使小鼠免疫所取得(Zaire.2014,see GenBank KJ660346.2；also SEQ ID NO：313)。免疫原可為一編碼其活性片段的伊波拉病毒GP或DNA之生物活性及/或致免疫片段。此片段可衍生自病毒GP之任何區域，包括胺基端片段(例如GP1)，或羧基端片段(例如GP2)。胜肽可經修飾以包括用於標定或用於接合載體分子，例如KLH目的之添加或取代的特定殘基。例如，可在胜肽的N端或C端加入一半胱胺酸，或可加入一連接子序列以製備供接合，例如致免疫用的KLH之多肽。
如活體外或活體內分析所測，本發明之特定的抗-伊波拉病毒抗體能結合及中和伊波拉病毒活性。本發明抗體結合及中和伊波拉病毒活性且因此讓病毒黏附及/或進入宿主細胞之能力接著確認病毒感染，可使用任何熟習本項技術者已知的標準方法來測量，包括如文中所述之結合分析或活性分析。
用於測量結合活性之非限定、示例性活體外分析係說明於文中實例3。在實例3中，抗-伊波拉病毒GP抗體對伊波拉病毒之結合親和力及解離常數係以Biacore來測定。在實例4和7中，中和分析係用來測定各種伊波拉病毒株之感染性。
對伊波拉病毒GP具專一性之抗體可能不含有另外的標記或基團，或其可能含有一N-端或C-端標記或基團。在一實施例中，此標記或基團為生物素。在一結合分析中，標記(若有的話)的位置可決定胜肽相對於與胜肽結合之表面的向位。例如，若表面係塗覆上抗生物素，則含有N-端生物素之胜肽將會朝向使得胜肽C-端部分遠離表面之向位。在一實施例中，此標記可為放射性核種、螢光染劑或MRI-可偵測的標記。在特定的實施例 中，此經標定的抗體可用於診斷分析，包括造影分析。
抗體之抗原結合片段
除非另有指出，否則術語「抗體」如文中所用，應了解係涵蓋包括二條免疫球蛋白重鏈和二條免疫球蛋白輕鏈之抗體分子(亦即「全抗體分子」)以及其抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一結合形成一複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」如文中所用，係指一或多種保留與伊波拉病毒專一結合能力之抗體的片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含CDR之片段或分離的CDR。在特定的實施例中，術語「抗原結合片段」係指多專一性抗原結合分子之多肽片段。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區之DNA操作和表現的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。此DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態，或導入密碼子，創造半胱胺酸殘基，修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR- 嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地將包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括與一或多個框架序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VL區與VH區結合之抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另一種選擇，抗體之抗原結合片段可含有單體的VH或VL區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。可在本發明之抗體的抗原結合片段內發現的可變區和恆定區之非限定、示例性組態包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列任何的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單一VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變和恆定區組態之同型二聚體或異型二聚體(或其他多聚體)。
如同全抗體分子，抗原結合片段可為單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體之多專一性抗原結合片段典型地應包括至少二個不同 的可變區，其中各可變區能專一與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的表位結合。任何多專一性抗體型式，包括文中所揭示的示例性雙專一性抗體型式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
製備人類抗體
於基因轉殖小鼠中產生人類抗體之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法可用於本發明內文中製造專一與伊波拉病毒GP結合之人類抗體。包括下列任一之免疫原可用於產生抗伊波拉病毒之抗體。在特定的實施例中，本發明抗體係從小鼠中以初級免疫原例如全長的天然伊波拉病毒GP(參見，例如GenBank登錄號AHX24649.1(SEQ ID NO：314)及AHX24649.2(SEQ ID NO：315)或以編碼醣蛋白或其片段之DNA使其免疫所獲得。另一種選擇，伊波拉病毒GP或其片段可使用標準生化技術來製造並經修改及用作為免疫原。在一實施例中，免疫原為一重組產生的伊波拉病毒GP或其片段。在本發明特定的實施例中，免疫原可為市售的伊波拉病毒GP。在特定的實施例中，可投予一或多種激發注射。在特定的實施例中，此激發注射可包括一或多種市售的伊波拉病毒GP。在特定的實施例中，免疫原可為表現在大腸桿菌(E.coli)或任何其他真核或哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之重組的伊波拉病毒GP。
使用VELOCIMMUNETM技術(參見，例如US 6,596,541,Regeneron Pharmaceuticals,VELOCIMMUNE®)，或任何用於產生單株抗體之其他已知方法，起先將具有人類可變區和小鼠恆定區對伊波拉病毒GP具高親和力的嵌合抗體分離。VELOCIMMUNE®技術係涉及產生具有包括人類重鏈和輕鏈可變區操作上連接內生性小鼠恆定區基因座之基因體的基因 轉殖小鼠，使得此小鼠回應抗原刺激，產生包括人類可變區和小鼠恆定區之抗體。將編碼此抗體之重鏈和輕鏈可變區的DNA分離出並與編碼人類重鏈和輕鏈恆定區之DNA操作性連接。然後將此DNA表現在能表現全人類抗體的細胞中。
一般而言，係將VELOCIMMUNE®小鼠施以感性趣抗原，並從表現抗體的小鼠中回收淋巴細胞(例如B-細胞)。此淋巴細胞可與骨髓瘤細胞融合，用以製備不死的雜交瘤細胞株，並篩選此等雜交瘤細胞株及選擇辨識產生對感性趣抗原具專一性之抗體的雜交瘤細胞株。可將編碼重鏈和輕鏈可變區的DNA分離並與重鏈和輕鏈之所欲的同型恆定區連接。此一抗體蛋白可在細胞，例如CHO細胞中製造。另一種選擇，編碼抗原-專一性嵌合抗體或重鏈和輕鏈之可變區的DNA可直接從抗原-專一性淋巴細胞分離。
起初，將具有人類可變區和小鼠恆定區之高親和力嵌合抗體分離。如在下文實驗部分中，將抗體定性並就所欲的特性做選擇，包括親和性、選擇性、表位等。已所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區，產生本發明之全人類抗體，例如野生型或修飾型IgG1或IgG4。當所選的恆定區可能根據特定用途而變時，高親和力抗原結合和目標專一性特質係留在可變區中。
生物等效性
本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體及抗體片段係涵蓋具有與所述的抗體不同但保留與伊波拉病毒結合能力之胺基酸序列的蛋白。此等變異抗體及抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體基本上相當之生物活性。同樣地， 本發明之編碼-抗體的DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係涵蓋包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代之序列，但編碼抗體或抗體片段者其基本上與本發明之抗體或抗體片段為生物等效的。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品，當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效的。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品的研究上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白，若相較於無此變更之持續治療，病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無增加預期的有害效應之風險(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內及/或活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中抗體或其代謝物濃度係以血液、血漿、血清或其他生物體液作為時間之函數所測量；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相關及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中抗體(或其目標)的適當急性 藥理效用係以時間為函數所測量；及(d)以建立抗原結合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明抗體之生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效的抗體可包括抗體變體，其係包含修飾抗體之糖基化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
包括Fc變體之抗-伊波拉病毒
根據本發明之特定的實施例，抗-伊波拉病毒抗體係提供包括一Fc區，其包括，例如，相較於中性pH，在酸性pH時增進或減低抗體與FcRn受體結合的一或多個突變。例如，本發明係包括抗-伊波拉病毒GP抗體，其係包括一在Fc區之CH2或CH3區的突變，其中該(等)突變增加了在酸性環境中(例如，在其中pH範圍從約5.5至約6.0的核內體中)Fc區對FcRn之親和力。此等突變，當投予動物時可造成抗體在血清中之半衰期增加。此等Fc修飾之非限定實例包括，例如，在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)，254(例如S或T)，及256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾；或在位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])之修飾；或在位置250及/或428之修飾；或在位置307或308(例如308F、V308F)及434之修飾。在一實施例中，此修飾係包括一428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；一428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；一433K(例如H433K)和一434(例如434Y)修飾；一252、 254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；一250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L)；以及一307及/或308修飾(例如308F或308P)。又在另外的實施例中，此修飾係包括一265A(例如D265A)及/或一297A(例如N297A)修飾。
例如，本發明係包括包含一Fc區之抗-伊波拉病毒抗體，而該Fc區係包括一或多對或多組由下列組成之群中選出的突變：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc區突變之所有可能的組合，以及文中所揭示的抗體可變區內的其他突變，係涵蓋在本發明的範圍內。
本發明亦包括包含一嵌合重鏈恆定(CH)區之抗-伊波拉病毒抗體，其中該嵌合的CH區係包括衍生自一個以上的免疫球蛋白同型之CH區的片段。例如，本發明之抗體可包括一嵌合的CH區，其係包括部份或全部衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH2區，與部份或全部衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3區組合。根據特定的實施例，本發明之抗體係包括一具有嵌合絞鏈區之嵌合CH區。例如，嵌合絞鏈可包括一衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「上絞鏈」胺基酸序列(根據EU編號，從位置216至227之胺基酸殘基)，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「下絞鏈」序列(根據EU編號，從位置228至236之胺基酸殘基)組合。根據特定的實施例，此嵌合絞鏈區係包括衍生自人類IgG1或人類IgG4上絞鏈之胺基酸殘基以及衍生自人類IgG2下絞鏈之胺基酸殘基。包括如文中所述之嵌合CH區的抗體，在特定的 實施例中，在對抗體之治療或藥物動力學性質無不利的影響下，可具有修飾的Fc效應子功能。(參見，例如2013年2月1日申請的第61/759,578號美國臨時申請案)。
抗體之生物特性
一般而言，本發明抗體係藉由與伊波拉病毒GP結合來作用。例如，本發明係包括，如以表面電漿共振測量，例如使用如文中所述的分析形式，係以低於約10-7M之KD與伊波拉病毒GP結合(例如，於25℃或於37℃)之抗體及抗體的抗原結合片段。在特定的實施例中，此等抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振測量，例如使用如文中所述的分析形式或實質上類似的分析，係以低於約10nM，低於約5nM，低於約1nM，低於約500pM，低於250pM，或低於100pM之KD與伊波拉病毒GP結合。
本發明亦包括抗體及其抗原結合片段，其如使用文中所定義之分析形式或實質上類似的分析，以表面電漿共振於25℃測量，係以大於約3分鐘之解離半衰期(t½)與伊波拉病毒結合，或例如以表面電漿共振於37℃測量，係以大於約1分鐘之解離半衰期(t½)與伊波拉病毒結合，及在pH 5或pH 6時解離半衰期(t½)增加至少3-倍。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如使用文中所定義之分析形式(例如mAb-捕捉或抗原捕捉形式)或實質上類似的分析，例如以表面電漿共振於25℃或於37℃測量，係以大於約10分鐘，大於約30分鐘，大於約60分鐘，大於約100分鐘，大於約200分鐘，大於約300分鐘，大於約400分鐘，大於約500分鐘，大於約600分鐘，大於約700分鐘，大於約800分鐘，大於約900分鐘，或大於約1000分鐘之t½與伊波拉病毒結合。
本發明亦包括中和伊波拉病毒對宿主細胞之感染力的抗體 或其抗原結合片段。某些實施例中，此等抗體係具有範圍從約10-11M至約10-9M之IC50的抗Zaire.2014 VLP中和效力。本發明之抗體亦與來自各種EBOV病毒株，包括Zaire.1995、Zaire.2014、蘇丹伊波拉病毒、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)之含有GP的伊波拉病毒VLP交叉反應。如實例5中所示，本發明抗體亦媒介ADCC。再者，如實例6中所示，本發明抗體係與其他結合EBOV GP的抗體交叉競爭。
在一實施例中，本發明係提供專一與伊波拉病毒GP結合之單離的重組抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段係具有一或多項下列特性：(a)為一全長的人類單株抗體；(b)與EBOV，或如表面電漿共振所測，與表現具有低於10-7M解離常數(KD)之伊波拉病毒醣蛋白的類病毒顆粒(VLP)結合；(c)相對於pH 7.4，在pH 5或pH 6時展現至少增加3-倍的解離半衰期(t½)；(d)展現以範圍從約10-11M至約10-9M之IC50中和薩伊伊波拉病毒；(e)展現伊波拉病毒感染細胞之抗體-依賴的細胞毒性；(f)與一或多種由下列組成之群中選出的伊波拉病毒VLP病毒株交叉反應：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)；(g)與參照抗體交叉競爭，其中該參照抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1之HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
本發明抗體可具有一或多項前述生物特性或其任何組合。本發明抗體之特定的性質係彙整於下。由審閱本揭示文(包括文中的操作實例)，本項技術之一般技術者應能明白本發明抗體之其他生物特性。
表位定位及相關技術
本發明係包括與一或多個在伊波拉病毒GP內發現的胺基酸相互作用之抗-伊波拉病毒抗體。與抗體結合之表位可由3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)位於伊波拉病毒GP內的單一連續序列所組成(例如一區域內的線性表位)。另一種選擇，表位可由多數個位於伊波拉病毒GP內的非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成(例如構形表位)。
本項技術之一般技術者已知的各種技術皆可用於測定一抗體是否與一多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸相互作用」。示例的技術包括，例如，習用的交叉阻斷分析，例如描述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中。其他的方法包括丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol.Biol.248：443-63)、胜肽裂解分析結晶學研究及NMR分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer(2000),Prot.Sci.9：487-496)。可用於辨識一多肽內與抗體相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換法係包括以氘標定感興趣蛋白，接著讓抗體與氘-標定的蛋白結合。接著，將蛋白/抗體複合物轉置於水中，並讓受抗體複合物保護的胺基酸內之可交換質子，以比非介面部份之胺基酸內可交換質子更慢的速率進行氘-至-氫回復交換。因此，形成蛋白/抗體介面部份的胺基酸可保留氘，且因此相較於非包括在界面中的胺基酸，係具有相對較 高的質量。解離抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體相互作用之專一性胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
術語「表位」係指在B及/或T細胞反應的抗原上之位置。B-細胞表位可由連續的胺基酸或由蛋白之三級摺疊並列的非連續胺基酸所形成。由連續胺基酸所形成的表位典型地在暴露於變性溶劑時仍保持原狀，而由三級摺疊所形成的表位典型地在以變性溶劑處理時則會流失。一表位典型地在一獨特的空間構形中係包括至少3個或更多個，通常至少5個或5或8-10個胺基酸。
修飾-輔助的分型(MAP)，亦稱為抗原結構為基礎之抗體分型(ASAP)為一種根據各抗體對化學性或酵素性修飾抗原表面之結合相似性來分類抗相同抗原之大量單株抗體(mAb)的方法(參見US 2004/0101920)。各類可反映與另一類代表的表位明顯不同或部分重疊之獨特表位。此技術能快速過濾基因相同的抗體，使得定性可集中在基因不同的抗體上。當應用於雜交瘤篩選時，MAP可過濾產生具有所欲特性之mAb的稀有雜交瘤選植株之身份。MAP可用於將本發明抗體分類成與不同表為結合之抗體組。
在特定的實施例中，伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段係與在伊波拉病毒GP(天然形式，或重組產生的，或其片段)內作為示例的任何一或多個區域內之表位結合。
本發明包括與相同表位或部份表位結合之抗-伊波拉病毒GP抗體。同樣地，本發明亦包括與如文中所述的任何特定示例之抗體競爭與伊波拉病毒GP或其片段結合之抗-伊波拉病毒GP抗體。例如，本發明係包括與一或多種由表1和2中所述的抗體所得來的抗體交叉競爭和伊波拉 病毒結合之抗-伊波拉病毒GP抗體。
藉由使用本項技術中已知的習用方法，可容易地測定一抗體是否與參照的抗-伊波拉病毒GP抗體相同之表位結合或是與其競爭結合。例如，測定試驗抗體是否與本發明之參照抗-伊波拉病毒GP抗體上相同的表位結合，係讓參照抗體與伊波拉病毒GP或胜肽於飽和的條件下結合。接著，評估試驗抗體與伊波拉病毒GP結合之能力。若試驗抗體在與參照的抗-伊波拉病毒GP抗體飽和結合後，能與伊波拉病毒GP結合，則其可結論出，該試驗抗體係與參照的抗-伊波拉病毒抗體不同的表位結合。另一方面，若試驗抗體在與參照的抗-伊波拉病毒GP抗體飽和結合後，不能與伊波拉病毒GP結合，則試驗抗體可能與結合本發明參照抗-伊波拉病毒GP抗體的表位相同之表位結合。
為了測定一抗體是否與參照的抗-伊波拉病毒GP抗體競爭結合，係以二個取向進行上述結合方法：第一個取向，讓參照的抗體在飽和的條件下與伊波拉病毒GP結合，接著評估試驗抗體與伊波拉病毒GP之結合。第二個取向，讓試驗抗體在飽和的條件下與伊波拉病毒GP結合，接著評估參照的抗體與伊波拉病毒GP之結合。若在二個方向中，僅有第一(飽和)抗體能與伊波拉病毒GP結合，則結論出試驗抗體係和參照的抗體競爭與伊波拉病毒GP相結合。本項技術之一般技術者應了解，與參照抗體競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合，但可能係藉由與重疊或相鄰的表位結合，在立體上阻斷參照抗體之結合。
若各競爭性抑制(阻斷)另一抗體對抗原的結合，則此二種抗體係與相同或重疊的表位結合。亦即，如於競爭性結合分析中所測，一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳地75%、90%或甚至99%(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另一種選擇，若基本上降低或消除一抗體之結合抗原中的所有胺基酸突變，係降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗體係具有相同的表位。若降低或消除一抗體結合之某些胺基酸突變降低或消除了另一種抗體之結合，則二種抗體係具有重疊的表位。
然後可進行另外的例行實驗(例如胜肽突變和結合分析)，以確定所觀察到無試驗抗體結合是否事實上係由於與參照抗體相同之表位結合所致，或是否係因立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀或本項技術中可取得的其他量性或質性抗體-結合分析來進行。
免疫接合物
本發明係涵蓋與一治療基團，例如治療伊波拉病毒感染之抗病毒藥接合之人類抗-伊波拉病毒GP單株抗體(免疫接合物)。如文中所用，術語「免疫接合物」係指化學上或生物上與一放射線試劑、細胞激素、干擾素、標靶或受體基團、酵素、胜肽或蛋白或治療劑連接之抗體。此抗體可能沿著分子在任何位置與放射線試劑、細胞激素、干擾素、標靶或受體基團、酵素、胜肽或蛋白或治療劑連接，只要其能與其目標結合。免疫接合物之實例包括抗體藥物接合物和抗體-毒素融合蛋白。在一實施例中，此試劑可為抗伊波拉病毒或伊波拉病毒GP之第二不同的抗體。在特定的實施例中，此抗體可與對病毒感染細胞具特異性之抗原接合。此類可與抗-伊波拉病毒抗體接合之治療基團應考慮所欲治療的症狀和所希望達到的治療效用。用於形成免疫接合物之適合的試劑已為本項技術所知；參見，例如WO 05/103081。
多專一性抗體
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。
本項技術之一般技術應了解，可使用標準分子生物技術(例如重組的RNA和蛋白表現技術)來建構本發明之任何多專一性抗原結合分子或其變體。
在某些實施例中，伊波拉病毒-專一性抗體係以雙專一性形式產生(「雙專一性」)其中與伊波拉病毒不同區結合之可變區係連接一起，賦予單一結合分子內之雙-區專一性。適當設計的雙專一性可經由增加專一性和結合親和力二者來增進整體伊波拉病毒-蛋白抑制效用。具有對個別區專一性之可變區(例如，N-端區的片段)，或其可與一區域內的不同區結合，在結構骨幹上為成對的，使得各區能同時與個別的表位，或與一區域內的不同區結合。在一雙專一性的實例中，來自對一區域具有專一性之結合子的重鏈可變區(VH)係與來自一系列對第二區域具專一性之結合子的輕鏈可變區(VL)組合，在無破壞原本對VH之專一性下，用以鑑別可與原來VH配對之非同源VL夥伴。以此方式，單一VL片段(例如，VL1)可與二個不同的VH區(例如，VH1和VH2)組合，產生包括二條結合「臂」(VH1-VL1和VH2-VL1)之雙專一性抗體。使用單一VL片段降低了此系統的複雜性且藉此簡化及增加用於產生雙專一性之選殖、表現和純化程序的效率(參見，例如USSN13/022759和US2010/0331527)。
另一種選擇，與一個以上的區和第二目標，例如(但不限於)，例如第二不同的抗-抗伊波拉病毒體結合之抗體，可使用文中所述的技術， 或熟習本項技術者已知的其他技術以雙專一形式來製備。與不同區結合的抗體可變區可與在，例如伊波拉病毒上相關位置結合的可變區連結一起，賦予單一結合分子內的雙抗原專一性。此性質之適當設計的雙專一性係作為雙功能。對胞外區具專一性的可變區與對胞外區外部具專一性的可變區組合，且在結構骨幹上為成對的，其使得各可變區得以與個別的抗原結合。
可用於本發明內文中之示例的雙專一性抗體形式係涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3區和第二Ig CH3區，其中該第一和第二Ig CH3區彼此至少有一個胺基酸不同，且相較於缺乏此胺基酸差異之雙專一性抗體，其中至少一個胺基酸的差異降低了此雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH3區與蛋白A結合而第二Ig CH3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為Y436F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用，就IgG1抗體之情況而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗體之情況為：N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗體之情況為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之雙專一性抗體形式之變異係涵蓋在本發明的範圍內。
可用於本發明內容中之其他示例雙專一性抗體形式係包括(不限於)，例如scFv-基底或雙抗體雙專一性形式、IgG-scFv融合物、雙可變區(DVD)-Ig、四源雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈(leucine zipper)、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG 和Mab2雙專一形式(參見，例如Klein et al.2012,mAbs 4：6,1-11及文中所引述的參考文獻，供審閱前述形式)。雙專一性抗體亦可使用胜肽/核酸接合來建構，例如其中係使用具有垂直化學反應性之非天然胺基酸來產生位點-專一性之抗體-寡核苷接合物，然後其可自我組合成帶有定義組成、價數和幾何形狀之多聚合複合物(參見，例如Kazane et al.,J.Am.Chem.Soc.[Epub：Dec.4,2012])。
治療給藥及調配物
本發明係提供包括本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體或其抗原結合片段的治療組成物。本發明之治療組成物係以適合的載劑、賦形劑和其他併入調配物中提供改善轉移、遞送、耐受性及類似性質之試劑來給藥。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell et al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體之劑量可依照給藥對象的年齡和體型大小、目標疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。當本發明之抗體係治療成人病患之疾病或症狀，或用於預防此一疾病時，有利的一般可以約0.1至約60mg/kg體重，更佳的約5至約60，約10至約50或約20至約50mg/kg體重之單一劑量投予本發明抗體。依照症狀之嚴重度，治療之頻率和持續時期可調整。在特定的實施例中，可投予本發明之抗體或其抗原結合片段至少約0.1 mg至約800mg，約1至約500mg，約5至約300mg或約10至約200mg，至約100mg或至約50mg作為起始劑量。在特定的實施例中，起始劑量之後可接著投予第二或多數個後續劑量之抗體或其抗原結合片段，其量可大約與起始劑量相同或略少，其中該後續劑量係隔開至少1天至3天；至少一週，至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或至少14週。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導入方法包括(但不限於)皮內、經皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部。醫藥組成物亦可以囊泡，特別是微脂體來遞送(參見，例如Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
使用奈米粒子遞送本發明抗體亦涵蓋在本文中。抗體-接合的奈米粒子可用於治療和診斷應用。抗體-接合的奈米粒子及製備方法係詳細描述於Arruebo,M.,et al.2009(“Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”in J.Nanomat.Volume 2009,Article ID 439389,24 pages,doi：10.1155/2009/439389)。可開發奈米粒子並與抗體接合包含在以病毒感染細胞為目標之醫藥組成物中。用於藥物遞送之奈米粒子亦已描述於，例如US 8257740或US 8246995中。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦。在另外的實施例中，可使用多聚物。又在另外 的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內和肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。就注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖和其他佐劑之等張溶液等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。就油性媒劑，可使用的有芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
本發明之醫藥組成物可以標準針和注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後且補充匣變空，則此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一旦醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不一定限於)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK),DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland),HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不一定僅限於SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICK TM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET TM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRA TM Pen(Abbott Labs,Abbott Park,IL)，僅提出一些。.
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的抗體係含有約5至約100毫克而其他劑型為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
本發明之抗體可用於治療及/或預防與伊波拉病毒感染有關的疾病或病症或症狀，及/或用於改善至少一種與此等疾病、病症或症狀有關的症狀。
在特定的實施例中，本發明之抗體可用於治療患有由伊波拉病毒所引起的嚴重或急性呼吸道感染。在某些實施例中，本發明之抗體可用於減低病毒效價或降低宿主的病毒載量。在一實施例中，本發明之抗體 或其抗原結合片段係以一治療劑量投予患有伊波拉病毒感染之病患。
可投予一或多種本發明之抗體可用於治療用以減緩或預防或降低一或多項疾病或病症之症狀或症狀的嚴重性。此等抗體可用於改善或降低至少一項伊波拉病毒感染之症狀，包括(但不限於)發燒、頭痛、疲勞、失去食慾、肌痛、腹瀉、嘔吐、腹痛、脫水和不明原因出血。
在本文中亦涵蓋將一或多種本發明之抗體預防性使用於處於發生伊波拉病毒感染風險之對象，例如免疫功能不全個體、健康照護工作者、疑似已暴露於藏有伊波拉病毒者之個人、與感染個體有身體接觸或身體距離極近、醫院員工、醫藥研究員、負責清潔治療過伊波拉病患之醫院設施或機構的維護人員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的個人或飛行常客。
在本發明另一實施例中，本發明抗體係用於製備醫藥組成物供治療患有伊波拉病毒感染之病患。在本發明另外的實施例中，本發明抗體係與熟習本項技術者已知可用於治療或改善伊波拉病毒感染之任何其他藥劑或其他治療一起，作為輔助治療。
組合治療
組合治療可包括本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體及可有利地與本發明抗體或與本發明抗體之生物活性片段組合之任何另外的治療劑。本發明抗體可與一或多種用於治療伊波拉病毒感染的藥物或試劑協同性組合。
例如，用於治療病毒感染之示例藥劑可包括，例如抗-病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、不同的抗伊波拉抗體、伊波拉病毒疫苗、ZMapp治療、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的 小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)、干擾素及治療伊波拉病毒感染之其他緩和治療。
在某些實施例中，本發明抗體可與第二治療劑組合，用於伊波拉病毒感染之患者中降低病毒載量，或改善一或多項感染的症狀。
在特定的實施例中，第二治療劑為另外的抗體，或對伊波拉病毒GP具專一性之抗體混合物，其中混合物中一或多種不同的抗體可能會或可能不會與本發明抗體相同之表位或重疊之表位結合。在特定的實施例中，第二治療劑為一抗不同伊波拉病毒蛋白之抗體。此第二抗體可能對一或多種來自不同病毒株之不同伊波拉病毒蛋白具專一性。本文係涵蓋使用具有中和或抑制抗伊波拉病毒活性之本發明抗體的組合物(「混合物」)。在某些實施例中，非競爭性抗體可經組合並投予有此需要的對象，用以降低伊波拉病毒因突變而逃脫的能力。在某些實施例中，包括此組合的抗體係與GP上不同的非重疊表位結合。包括此組合的抗體可阻斷病毒黏附及/或進入及/或與宿主細胞融合。抗體可與由薩伊(Zaire)、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)或象牙海岸(Cote d’Ivoire)、雷斯頓(Reston)所和選出的EBOV病毒株之GP相互作用，且當單獨使用或與任何一或多種上述藥劑組合時，可中和任何一或多種所述之伊波拉病毒株。
文中亦涵蓋使用本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體，其中該組合係包括一或多種不會交叉競爭的抗體。在特定的實施例中，此組合係包括至少三種本發明抗體之混合和物的混合劑。混合劑中的抗體可在中和病毒或病毒感染細胞的能力上，或在其媒介抗體依賴的細胞毒性(ADCC)之能力上，或在其結合EBOV可溶性醣蛋白(sGP)之能力上有所不同
如文中所用，術語「組合」係指另外的治療活性組份可在投 予至少一種本發明抗-伊波拉病毒GP抗體或包括一或多種本發明抗體之混合物之前、同時或之後給藥。術語「組合」亦包括先後或隨附投予一抗-伊波拉病毒GP抗體和一第二治療劑。
另外的治療活性組份可在投予本發明抗-伊波拉病毒GP抗體之前投予一對象。例如，若第一組份係在投予第二組份1週前，72小時前，60小時前，48小時前，36小時前，24小時前，12小時前，6小時前，5小時前，4小時前，3小時前，2小時前，1小時前，30分鐘前，15分鐘前，10分鐘前，5分鐘前或少於1分鐘前給藥，則第一組份可視係為在第二組份「之前」給藥。在其他實施例中，另外的治療活性組份可在本發明抗-伊波拉病毒GP抗體給藥之後投予患者。例如，若第一組份係在投予第二組份1分鐘後，5分鐘後，10分鐘後，15分鐘後，30分鐘後，1小時後，2小時後，3小時後，4小時後，5小時後，6小時後，12小時後，24小時後，36小時後，48小時後，60小時後，72小時後給藥，則第一組份可視為係在第二組「之後」給藥。又在其他的實施例中，另外的治療活性組份可在本發明抗-伊波拉病毒GP抗體給藥的同時投予患者。「同時」給藥，就本發明之目的係包括，例如抗-伊波拉病毒GP抗體和另外的治療活性組份係以單一劑型(例如共調配)投予患者或以分開的劑型彼此相隔30分鐘之內或更短，投予患者。若以分開的劑型給藥，各劑型可經由相同的路徑給藥(例如抗-伊波拉病毒GP抗體和另外的治療活性組份可由靜脈內等給藥)；另一種選擇，各劑型可經由不同的路徑給藥(例如抗-伊波拉病毒GP抗體可由靜脈內給藥而另外的治療活性組份可由口服給藥)。無論如何，就本揭示文之目的，以單一劑型、以相同路徑之分開的劑型，或以不同路徑之分開的劑型投予組份全部皆視為「同時給藥」。就本揭示文之目的，在另外的治療活性組份給藥「之前」、「同時」或「之後」(該等術語係如上文中所 定義)投予抗-伊波拉病毒GP抗體係視為抗-伊波拉病毒GP抗體與另外的治療活性組份「組合」給藥。
本發明係包括其中本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調配之醫藥組成物。
給藥療法
根據本發明特定的實施例，單一劑量的抗-伊波拉病毒GP抗體(或包括抗-伊波拉病毒GP抗體與任何文中所提及的另外治療活性劑組合之醫藥組成物)可投予有此需要的對象。根據本發明特定的實施例，多劑量的抗-伊波拉病毒GP抗體(或包括抗-伊波拉病毒GP抗體與任何文中所提及的另外治療活性劑組合之醫藥組成物)可於一定義的時程內投予一對象。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明抗-伊波拉病毒GP抗體投予一對象。如文中所用，「先後給藥」係指各劑量之抗-伊波拉病毒GP抗體係於不同的時間點投予該對象，例如以預定的間隔隔開(例如小時、日、週或月)之不同日。本發明係包括，包含先後將一單一起始劑量之抗-伊波拉病毒GP抗體投予病患，接著一或多個第二劑量之抗伊波拉病毒GP-抗體及視需要接著一或多個第三劑量之抗-伊波拉病毒GP抗體之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予本發明活抗-伊波拉病毒GP抗體之暫時順序。因此，「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗-伊波拉病毒GP抗體，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。然而，在特定的實施例中，包含在起始、第二及/或第三劑量中之抗-伊波拉病毒GP抗體之量，在治療期間可互不相 同(例如，若適當經上調或下調)。在特定的實施例中，係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量作為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎，投予後續劑量(例如「維持劑量」)。.
在本發明特定的示例性實施例中，各第二及/或第三劑量係緊接前面劑量之後的1至48小時(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞，如文中所用，係指在一多重給藥之順序中，抗-伊波拉病毒GP抗體之劑量，在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序投予患者。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之抗-伊波拉病毒GP抗體投予一病患。例如，在特定的實施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第二劑量投予該病患。同樣地，在特定的實施例中，僅將一單一的第三劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第三劑量投予該病患。
在本發明特定的實施例中，在治療療法期間，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率可不同。在治療期間，給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
抗體之診斷用途
本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體亦可用於偵測或測量樣本中之伊波拉病毒，例如用作診斷目的。某些實施例係涵蓋於分析中使用一 或多種本發明之抗體來偵測疾病或病症，例如病毒感染。伊波拉病毒之示例性診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-伊波拉病毒GP抗體接觸，其中該抗-伊波拉病毒GP抗體係經可偵測的標記或報導子分子標定，或用作為選擇性分離來自病患樣本之伊波拉病毒的捕捉配體。另一種選擇，未標定的抗-伊波拉病毒GP抗體可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合，用於診斷用途。可偵測標記或報導子分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於樣本中偵測或測量伊波拉病毒之特定示例性分析包括酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)。
根據本發明可用於伊波拉病毒診斷分析之樣本包括任何含有可偵測量之伊波拉病毒或其片段，其係在正常或病理條件下可從病患得來的組織或液體樣本。一般而言，係測量得自健康病患(例如未罹患與伊波拉病毒相關疾病之病患)之特定樣本中伊波拉病毒的量，以先建立一基線或標準的伊波拉病毒量。然後可將此伊波拉病毒之基線量與得自疑似具有伊波拉病毒相關症狀或與此等症狀有關的症狀之個體樣本中所測量的伊波拉病毒量相比較。
對伊波拉病毒具專一性的抗體可能不含有另外的標記或基團，或其可含有N-端或C-端標記或基團。在一實施例中，此標記或基團為生物素。在一結合分析中，標記的位置(若有)，在與胜肽結合時，可決定相對於表面之胜肽向位。例如，若一表面係塗覆上抗生物素，則含有N-端生素物之胜肽將會朝向使胜肽的C-端部分遠離此表面的向位。
圖1：H1H17161P有效地中和活的EBOV。
圖2：顯示三種抗-EBOV抗體與伊波拉GP或伊波拉可溶性GP(sGP)之相互作用。
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明，且不希望限制發明者所認為的發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，室溫為約25℃，而壓力為或接近大氣壓。
實例1：產生抗伊波拉病毒之人類抗體
以包括編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區之DNA的小鼠產生抗伊波拉病毒之人類抗體。在一實施例中，此抗伊波拉病毒之人類抗體係於VELOCIMMUNE®小鼠中產生。在一實施例中，係將VelocImmune®(VI)小鼠以編碼全長伊波拉病毒GP之DNA[薩伊伊波拉病毒2014(GenBank：KJ660346.2)]產生免疫力。在包括相隔2週之二次致免疫的加速療法後，產生抗體。以伊波拉病毒GP-專一性免疫分析監測抗體免疫反應。例如，就純化的全長EBOV GP、亞單位GP蛋白(GP1和GP2)及表現EBOV GP之類病毒顆粒(VLP)的專一性抗體效價，進行血清分析。使用B-細胞分選技術(BST)和雜交瘤法分離產生抗體的選殖株。例如，當達到所欲的免疫反應時，收取脾細胞並與小鼠的骨髓瘤細胞融合以保存其生存力並形成雜交瘤細胞株。篩選雜交瘤細胞株並選擇鑑別製造伊波拉病毒GP- 專一性抗體之細胞株。使用此技術，及上述的各種免疫原，得到數種嵌合抗體(亦即具有人類可變區和小鼠恆定區之抗體)；以此方式所產生的示例抗體係稱為H1M17354N、H2aM17356N、H1M17357N、H2aM17358N、H2aM17359N和H2aM17360N。
如美國專利7582298所述，亦從未與骨髓瘤融合之抗原-陽性小鼠B細胞直接分離抗-伊波拉病毒抗體。使用此方法，得到數種全人類抗-伊波拉病毒GP抗體(亦即具有人類可變區和人類恆定區之抗體)；以此方式所產生的示例抗體係稱為H1H17134P、H1H17139P、H1H17142P、H1H17151P、H1H17161P、H1H17162P、H1H17193P、H1H17196P、H1H17199P、H1H17203P、H1H17214P、H1H17219P、H1H17223P和H1H17228P。
根據此實例方法所產生的示例抗體之生物性係詳述於下文所述的實例中。
實例2：重鏈和輕鏈可變區胺基酸和核酸序列
表1係列出所選的本發明抗-伊波拉病毒抗體之重鏈和輕鏈可變區和CDR的胺基酸序列辨識碼。對應的核酸序列辨識碼係列於表2中。
抗體典型地在文中係根據下列命名法來命名：Fc字首(例如「H1H」、「H2M」等)，接著數字辨識碼(例如，如表1或2中所示之「17139」、 「17161」等)，接著「P」、「P2」、「N」、「N2」或「B」字尾。文中所用之抗體名稱上的H1H和H2M字首係指抗體特定的Fc區同型。因此，根據此命名法，一抗體在文中可稱為，例如「H1H17359N」、「H2aM17359N」等。例如，「H1M」抗體係具有小鼠IgG1 Fc，而「H2M」抗體係具有小鼠IgG2 Fc(a或b同型)(當抗體名稱中以首字「H」表示時，則所有的可變區為全人類)。本項技術之一般技術者應了解，具有特定Fc同型之抗體可轉變為具有不同Fc同型之抗體(例如帶有小鼠IgG1 Fc之抗體可轉變為帶有人類IgG4之抗體等)，但無論如何，可變區(包括CDR)-其係以如表1或2所示的數字辨識碼表示-則仍不變，且結合性質預期為相同的或實質上類似的，與Fc區之性質無關。
實例3：以表面電漿共振測定抗體與伊波拉病毒GP結合
A. 37℃時pH依賴的解離速率
37℃時伊波拉病毒GP與純化的抗-伊波拉病毒單株抗體結合之結合解離速率常數(k d)和解離半衰期(t½)係使用即時表面電漿共振生物感測器分析於Biacore T200儀器上所測定。將CM4 Biacore感測器表面以結合單株小鼠抗-人類Fc抗體(GE,# BR-1008-39)或單株山羊抗-小鼠Fc抗體(GE,# BR-1008-38)之胺衍生化，以捕捉純化的抗-伊波拉病毒GP mAb。實例3A中所有的Biacore結合研究係在0.01M Na2HPO4/NaH2PO4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant P20(PBS-P電泳緩衝液)所組成的緩衝液中於pH 7.4、6.0和5.進行。進行低pH追捕用以評估抗體在低pH時是否維持結合。此項應模擬病毒在膜融合期間因核內體酸化所遇到的狀況。不同濃度之帶有C-端多組胺酸標籤的伊波拉病毒GP(EbolaGP.his；Sino Biologicals，型號40442-V08B1)係以PBS-P電泳緩衝液製備(範圍從90nM至11.1nM,3-倍稀釋)，將其以25μL/分鐘之流速注射於抗-伊波拉病毒GP mAb捕捉的表面。 監測伊波拉病毒GP與捕捉的單株抗體之結合歷時5分鐘及監測伊波拉病毒GP在PBS-P電泳緩衝液中之解離歷時6分鐘。所有的解離速率常數實驗係於37℃進行。動力學解離(k d)速率常數係藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體將即時感測圖與1：1結合模型擬合所測。解離半衰期(t½)係由如下之動力學速率常數所計算：
在37℃時伊波拉病毒GP與純化的抗-伊波拉病毒GP mAb結合的解離速率參數係如表3所示。
NB-在所試驗的分析條件下無可偵測的結合
B. 25℃和37℃時結合親和力和動力學
伊波拉病毒GP與純化的抗-伊波拉病毒GP mAb結合之平衡解離常數(K D值)係使用即時表面電漿共振生物感測器使用Biacore 4000儀器所測。將CM4 Biacore感測器表面以結合單株小鼠抗-人類Fc抗體(GE, # BR-1008-39)或單株山羊抗-小鼠Fc抗體(GE,# BR-1008-38)之胺衍生化，以捕捉純化的抗-伊波拉病毒GP mAb。實例3B中所有的Biacore結合研究係在0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20(PBS-P電泳緩衝液)所組成的緩衝液進行。不同濃度之帶有C-端多組胺酸標籤的伊波拉病毒GP(Sino Biologicals，型號40442-V08B1)係以HBS-ET電泳緩衝液所製備(範圍從90nM至3.3nM,3-倍稀釋)，將其以30μL/分鐘之流速注射於抗-伊波拉病毒GP mAb捕捉的表面。監測伊波拉病毒GP與捕捉的單株抗體之結合歷時5分鐘及監測伊波拉病毒GP在HBS-ET電泳緩衝液中之解離歷時10分鐘。所有的結合動力學實驗係於25℃和37℃進行。動力學結合(k a)和解離(k d)速率常數係藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體將即時感測圖與1：1結合模型擬合所測。結合解離平衡常數(K D)和解離半衰期(t½)係由如下之動力學速率常數所計算： ，及
在25℃和37℃時伊波拉病毒GP與純化的抗-伊波拉病毒GP mAb結合的結合動力學參數係如表4A和4B所示。
NB-在所試驗的分析條件下無可偵測的結合
IC-用於擬合之非決定性結合感測圖
NB-在所試驗的分析條件下無可偵測的結合
IC-用於擬合之非決定性結合感測圖
結果
如上表4A和4B所示，在25℃時，伊波拉病毒GP係以範圍從934pM至1890nM之K D值與抗體結合，及在37℃時，係以範圍從227pM至2310nM之K D值與抗體結合。在pH 7.4，25℃時，抗體係顯示範圍從3.0分鐘至大於1155分鐘的解離半衰期，及37℃時，係顯示範圍從2.0分鐘至大於1155分鐘的解離半衰期。在低pH時並未觀察到失去結合。有數種抗體在低pH時，相對於pH 7.4，顯示增加的解離半衰期(t½)。在pH 5及/或pH 6時具有增加3-倍或更大之解離半衰期(t½)的抗體包括H1H17162P、H1H17177P、H1H17150P、H1H17151P、H1H17160P、H1H17161P、H1H17141P、H1H17139P、H1H17210P、H1H17203P、H1H17199P、H1M17348N、H1M17350N、H2aM17360N和H2aM17361N。
實例4：產生伊波拉病毒假型顆粒及中和作用研究
藉由以表現伊波拉病毒GP、HIV gag-pol和編碼螢火蟲螢光酶之HIV前病毒載體之質體結構混合物轉染293T細胞，產生伊波拉病毒假型顆粒(亦稱為類病毒顆粒或VLP)。在轉染後48小時收取含有伊波拉病毒假型顆粒之上清液，使用離心使其澄清，分成等份並於-80℃冷凍。藉由以編碼口腔泡疹病毒(Vesicular Stomatitis virus)醣蛋白(VSVg)之質體取代表現伊波拉病毒GP之質體，產生對照的假型顆粒。
伊波拉假型顆粒為基礎的中和分析
將如上述所產生的假型顆粒以中和分析進行檢測。特言之，將抗體的稀釋液以伊波拉病毒假型顆粒於室溫培養1h。使用0.02M EDTA分開Huh7細胞，清洗並以抗體/假型顆粒混合物培養72h。以BrightGlo®螢光酶分析(Promega,San LuisObispo,CA,USA)偵測螢光酶並於Victor® X3盤式判讀儀(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上讀取光產生讀數，將感染效率量化。
上表5中所示的數據係顯示20種本發明抗-伊波拉病毒抗體中有14種，使用文中所述的實驗設計，以範圍從約10-11M至約10-9M的IC50，有效地中和感染力。
實例5：抗-伊波拉病毒抗體之抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性(ADCC)
抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性(ADCC)係以經由CD16為基礎的報導子系統(Promega ADCC reporter bioassay core kit,San Luis Obispo,CA,USA)抗體對抗訊號之能力來檢測。植入表現伊波拉病毒GP之293細胞。一天後，加入於fuc-細胞株(參見美國專利第8409838號)中所產生的稀釋抗體和效應子細胞(1.5：1效應子對標靶的比率)並培養至隔夜。報導子活性係以BioGlo®螢光酶分析(Promega,San Luis Obispo,CA,USA)來測量並於Victor® X3盤式判讀儀(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上讀取光產生讀數。
抗體媒介的ADCC之能力係以相較於同型(負)對照組之活性為基礎所計算。任何大於負對照組5倍以上的值係視為陽性。上表6中所示的數據顯示，20種抗-伊波拉病毒抗體中有17種媒介了ADCC。
實例6：八位組(Octet)交叉競爭
於前面所測定出與伊波拉病毒GP結合之抗-伊波拉病毒GP單株抗體間的結合競爭係使用即時、免標定生物薄膜干涉(BLI)分析於Octet HTX生物感測器(ForteBio Corp.,A Division of Pall Life Sciences)上所測定。相關對照組對可溶性GP(sGP)、GP1或GP2之結合係以相同的分析形式來測量並將其反應從各試驗的mAb之所指伊波拉病毒GP試劑中減去。整個實驗係在25℃於0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20、1.0mg/mL BSA所組成的緩衝液中(Octet HBS-ET緩衝液)以1000rpm的速度震盪分析盤來進行。就評估二種抗體是否能彼此競爭與其在帶有C-端多組胺酸標籤的表現伊波拉病毒GP(伊波拉病毒GP.h,Sino Biologicals Inc.，亦參見GenBank AHX24649.1和SEQ ID NO：314)上之各別表位結合，係藉由將感測器浸入含20μg/mL伊波拉病毒GP溶液之孔槽中3分鐘，將大約~1.0nm的伊波拉病毒GP先捕捉至塗覆抗-五-His抗體的Octet生物感測器(Fortebio Inc,# 18-5079)。然後以第一抗-伊波拉病毒GP單株抗體(後續稱為mAb-1)藉由浸入含50μg/mL的mAb-1溶液5分鐘使抗原-捕捉的生物感測器飽和。然後隨後將生物感測器浸入含50μg/mL的第二抗-伊波拉病毒GP單株抗體(後續稱為mAb-2)溶液3分鐘。在試驗的各步驟之間以Octet HBS-ET緩衝液沖洗所有的生物感測器。於實驗期間監測即時的結合反應並記錄每個步驟終了時的結合反應。比較與mAb-1預複合的伊波拉病毒GP結合的mAb-2之反應並使用50%抑制閥植測定不同的抗-伊波拉病毒GP單株抗體之競爭/非競爭行為。表7明確定義了以二個方向競爭之抗體的關係，與結合順序無關。
如表7所示，左邊攔位係顯示使用AHC Octet生物感測器捕捉的mAb1抗體，而右邊攔位係顯示與mAb1抗體交叉競爭的抗體(mAb2)。
表7：抗-伊波拉病毒GP抗體對結合伊波拉病毒GP之交叉競爭
實例7：H1H17203P、H1H17139P和H1H17161P與伊波拉病毒醣蛋白之順序結合
採用從交叉競爭實驗所得來的資料，進行一項順序結合研究，用以測定三種個別的候選抗體是否能同時與可溶性伊波拉病毒醣蛋白(GP)結合，藉此確認伊波拉病毒GP對各單株抗體的結合位置為獨立的。若是如此，此資料應能支持這些抗體與治療混合物中之用途。
因此，順序結合實驗，係就三種抗-伊波拉病毒GP單株抗體H1H17203P、H1H17139P和H1H17161P對伊波拉病毒GP之獨立結合和非競爭性與伊波拉病毒GP結合進行試驗。此實驗係使用即時、免標定生物薄膜干涉(BLI)分析於Octet RED生物感測器(ForteBio Corp.,A Division of Pall Life Sciences)上所測定。整個實驗係在25℃於0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20、1.0mg/mL BSA所組成的緩衝液中(Octet HBS-ET緩衝液)以1000rpm的速度震盪分析盤來進行。就評估三種抗體是否能同時與表現的帶有C-端多組胺酸標籤之捕捉的抗原伊波拉病毒(伊波拉病毒GP.his,Sino Biologicals)結合，係藉由將生物感測器浸入含20μg/mL伊波拉病毒GP.h.溶液之孔槽中3分鐘，將大約~0.6nm的伊波拉病毒GP.h.先捕捉至塗覆抗-五-His抗體的Octet生物感測器(Fortebio Inc,# 18-5079)。然後以第一抗-伊波拉病毒GP單株抗體(後續稱為H1H17161P)藉由浸入含50μg/mL的REGN H1H17161P溶液5分鐘使抗原-捕捉的生物感測器飽和。然後隨後將生物感測器浸入含50μg/mL的第二抗-伊波拉病毒GP單株抗體(後續稱為H1H17139P)溶液5分鐘。最後注射50ug/mL的第三抗體(後續稱為H1H17161P)5分鐘以達到飽和。在實驗期間監 測即時的結合反應並記錄每個步驟終了時的結合反應。
結果
所試驗的三種候選單株抗體能同時與伊波拉病毒GP結合，其顯示各抗體不會干擾其他所試驗的抗體之伊波拉病毒GP上的結合位置，表示其各自與不同的表位結合或相互作用。此項支持了在治療抗體混合物中使用這三種抗體之角色。
實例8：抗-伊波拉病毒抗體與不同類伊波拉病毒顆粒(VLP)病毒株之結合
進行一研究用以測定抗-伊波拉病毒GP抗體是否會與含有來自其他伊波拉病毒株之GP的類病毒顆粒(VLP)作用。本研究係包括含有來自Bundibugyo NC_014373、Cote d'Ivoire FJ217162、Sudan NC_006432、Zaire.1995、Zaire.2014 AY354458之GP和負對照組VSV醣蛋白(VSVg)之VLP。此研究係使用「MesoScale Discovery」(MSD)，一種讓伊波拉病毒株VLP(表現伊波拉病毒醣蛋白/病毒表面蛋白)結合/固定在碳表面之技術，接著ELISA-類型結合分析。其目的為鑑別mAb與有關各種伊波拉病毒株之結合面貌。
此分析係以96孔聚丙烯微孔盤，藉由先製備來自各種VLP/孔(如下表所示)上清液之1：10稀釋液並於稀釋液加入PBS(50μl/孔)及於4℃培養至隔夜來進行。
將孔槽中液體丟棄，接著以150μl/孔之PBS+2%BSA阻斷並於室溫培養1小時。然後將各孔的內容物丟棄並以PBS使用為MSD所設計的AquaMax2000盤式清洗器清洗孔槽。將50毫升的初級抗體以PBS+1% BSA稀釋並在室溫於中速(5)震盪下培養。然後將孔槽的內容物丟棄並以PBS清洗分析盤。於各孔中加入濃度1μg/ml溶於PBS+0.5% BSA之50毫升的sulfo-TAG偵測試劑(人類或小鼠Fc)並在室溫於中速(5)震盪下培養1 小時。將各孔的內容物丟棄並以PBS+0.5% BSA清洗分析盤。於各孔槽中加入150μl無界面活性劑的1X判讀緩衝劑(Read Buffer)並於barcode之SECTORImager6000上讀取分析盤讀數。
結果，如表所示，顯示所有試驗的抗-伊波拉病毒GP抗體與含有Zaire 2014和Zaire 1995 GP之VLP結合。如表8所述，某些試驗的抗體除了與二種薩伊(Zaire)病毒株結合之外，係與含有其他伊波拉病毒株GP之VLP結合。特言之，除了與含有Zaire 2014和Zaire 1995之GP的VLP結合之外，稱為H1H17161P和H1H17162P之抗-伊波拉病毒抗體係與含有蘇丹(Sudan)和邦地布優(Bundibugyo)病毒株GP的VLP結合，而稱為H2aM17356N和H1H17142P的抗-伊波拉病毒抗體係與邦地布優和象牙海岸病毒株結合。
實例9. 活體外活的/傳染性伊波拉病毒(EBOV)之中和作用
將稱為H1H17203P、H1H17139P和H1H17161P之抗體於非洲綠猴腎臟細胞(Vero cell)中就其中和傳染性EBOV之能力進行試驗。將非洲綠猴腎臟細胞置入384-孔盤之DMEM-10% FBS中並於37℃使其生長至約75%滿度。將H1H17203P、H1H17139P和H1H17161P如所指進行稀釋。將EBOV病毒株(Mayinga、Kikwit、Makona和天竺鼠適應株Mayinga)融化並適當稀釋至介於0.01-0.1之MOI。使用稱為KZ52的市售抗-EBOV抗體作為正對照組(參見Maruyama,T.et al.,J Virol 73,6024-6030(1999)。將抗體與病毒於37℃培養1小時。然後將抗體/病毒混合物加到預置入盤中的細胞中並將測定盤於37℃培養24小時。培養期過後，將測定盤從培養器中移出並藉由浸入10%中性緩衝甲醛中使其失活，置入一熱密封袋中並在4℃於BSL-4中儲存至隔夜。以1X-PBS清洗測定盤3次並將細胞於室溫(RT)以25μl的0.1% Triton X-100之1X-PBS溶液透化15-20分鐘。將Triton-X丟棄並以3.5% BSA之 1X-PBS溶液於RT阻斷1小時。將測定盤以1：1500之1X-PBS稀釋的抗-EBOV GP初級抗體4F3(參見IBT BIOSERVICES之小鼠抗-EBOV GP單株抗體4F3，型號0201-020)於4℃處理至隔夜。以1X-PBS清洗測定盤10-15分鐘並重複二次。將細胞以Alexa-fluor-488接合的抗-小鼠二級抗體培養1小時。將二級抗體丟棄及以1X-PBS清洗測定盤10-15分鐘並重複二次。將測定盤以25μl/孔的Hoechst(1：50,000溶於1X-PBS)於RT培養30分鐘。將測定盤藉由螢光顯微鏡使用藍色和綠色螢光頻道造影。
結果
結果，如圖1所示，顯現H1H17161P抗體中和活的病毒且比正對照組抗體KZ52更有效，但稱為H1H17203P和H1H17139P之抗體並未發揮中和劑之作用。
實例10：抗-伊波拉抗體與可溶性GP(sGP)之結合
EBOV基因體中的第四基因係編碼二種獨特的蛋白，一種非結構二聚化分泌性醣蛋白稱為sGP，以及一種三聚化病毒體-黏附的包膜醣蛋白(GP)。這二種GP分享前端的295個胺基酸，但具有獨特的C端。就測定此Regeneron前導mAb是否與sGP結合，係在內部製造一重組的sGP.mmh蛋白(SEQ ID NO：317)。使用以干涉測量為基礎的生物感測器I Octet HTX來測定H1H17203P、H1H17139P、H1H17161P單株抗體是否能與伊波拉sGP.mmh蛋白結合。分析的形式係包括將H1H17203P、H1H17139P、H1H17161P捕捉至抗-hFc感測器尖端，接著浸入300nM的Ebola GP.10xhis(SEQ ID NO：318)、sGP.mmh(SEQ ID NO：317)或hCNTFR(睫狀節神經營養因子受體.mmh，其為一負對照蛋白)之溶液中。各mAb係捕捉0.94-1.36nm之間的量。
如圖2所示，所有的mAb皆顯示與伊波拉Ebola GP.10xhis專 一結合且並未與負對照蛋白結合；然而，僅H1H17139顯現與伊波拉sGP.mmh專一結合。此項發現顯示，H1H17139的結合表位可能位於sGP和GP之前端295個胺基酸內的共同區域；而其他的mAb可能僅辨識伊波拉GP的C-端。
實例11：另外的抗-EBOV GP抗體與伊波拉GP.h、伊波拉GP可溶性.mmh和hCNTFR.mmh之結合
進行另一項研究用以測定另外的本發明抗-EBOV GP抗體之結合特性；特言之，進行此研究以測定這些另外的抗體與可溶性GP和GP之結合能力。此研究係使用即時、免標定生物薄膜干涉(BLI)分析於Octet HTX生物感測器(ForteBio Corp.,A Division of Pall Life Sciences)上所測定。整個實驗係在25℃於0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20、1.0mg/mL BSA所組成的緩衝液中(Octet HBS-ET緩衝液)以1000rpm的速度震盪分析盤來進行。就評估抗體是否能與伊波拉sGP或其他伊波拉GP試劑結合，係藉由將生物感測器浸入含20μg/mL之mAb溶液的孔槽中3分鐘，將大約~1.0nm的抗-伊波拉GP捕捉至塗覆抗-人類Fc(Fortebio Inc,# 18-5064)抗體的Octet生物感測器。捕捉mAb的生物感測器係就所選的蛋白試劑，藉由浸入含300nM的伊波拉GP蛋白溶液或相關對照組之孔槽中5分鐘進行試驗。在試驗的各步驟之間以Octet HBS-ET緩衝液沖洗所有的生物感測器。在實驗期間監測即時的結合反應並記錄每個步驟終了時的結合反應。
結果
如表9所示，任何0.10nm以下的值係測定為非結合抗體。基於最新的結果，所有的試驗抗體，除了一種(H1H17360N)以外，皆顯示與EBOV全長GP結合，而20種試驗抗體中有13種顯示與可溶性GP(sGP) 結合。
<110> 再生元醫藥公司Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
<120> 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體Human Antibodies TO EBOLA VIRUS GLYCOPROTEIN
<130> 10139WO01
<150> 62/107,581
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<220>
<223> 合成的
<400> 250
<210> 251
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 251
<210> 252
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 252
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 253
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 254
<210> 255
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 255
<210> 256
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 256
<210> 257
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 257
<210> 258
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 258
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 259
<210> 260
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 260
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 261
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 262
<210> 263
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 263
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 264
<210> 265
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 265
<210> 266
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 266
<210> 267
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 267
<210> 268
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 268
<210> 269
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 269
<210> 270
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 270
<210> 271
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 271
<210> 272
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 272
<210> 273
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 273
<210> 274
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 274
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 275
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 276
<210> 277
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 277
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 278
<210> 279
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 279
<210> 280
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 280
<210> 281
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 281
<210> 282
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 282
<210> 283
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 283
<210> 284
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 284
<210> 285
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 285
<210> 286
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 286
<210> 287
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 287
<210> 288
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 288
<210> 289
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 289
<210> 290
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 290
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 291
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 292
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 293
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 294
<210> 295
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 295
<210> 296
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 296
<210> 297
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 297
<210> 298
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 298
<210> 299
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 299
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 300
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 301
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 302
<210> 303
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 303
<210> 304
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 304
<210> 305
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 305
<210> 306
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 306
<210> 307
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 307
<210> 308
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 308
<210> 309
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 309
<210> 310
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 310
<210> 311
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 311
<210> 312
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 312
<210> 313
<211> 2051
<212> DNA
<213> Ebola virus
<400> 313
<210> 314
<211> 676
<212> PRT
<213> 伊波拉病毒
<400> 314
<210> 315
<211> 676
<212> PRT
<213> 伊波拉病毒
<400> 315
<210> 316
<211> 364
<212> PRT
<213> 伊波拉病毒
<400> 316
<210> 317
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-332：AHX24650之薩伊_伊波拉_GP aa 33至364aa 333-360：myc-myc-六組胺酸標籤
<400> 317
<210> 318
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa 1-618：薩伊伊波拉病毒(病毒株H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15)GP(aa 33至650(AHX24649.1))aa 619-628：+組胺酸標籤
<400> 318

Claims (52)

  1. 一種單離的重組抗體或其抗原結合片段，其專一結合至伊波拉病毒(EBOV)及/或伊波拉病毒醣蛋白(EBOV-GP)，其中該抗體係具有一或多項下列特徵：(a)包括三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其係包含在由下列組成之群中選出的任一重鏈可變區(HCVR)序列內：SEQ ID NO：18、66、146、2、34、50、82、98、114、130、162、178、194、210、226、242、258、274、290和306；以及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其係包含在由下列組成之群中選出的任一輕鏈可變區(LCVR)序列：SEQ ID NOs：26、74、154、10、42、58、90、106、122、138、170、186、202、218、234、250、266、282和298；(b)為一全長的人類單株抗體；(c)與EBOV，或以表面電漿共振所測表現具有低於10-7M之解離常數(KD)的類病毒顆粒(VLP)結合；(d)相對於pH 7.4，在pH 5或pH 6時展現至少增加3-倍的解離半衰期(t½)；(e)展現以範圍從約10-11M至約10-9M之IC50中和薩伊伊波拉病毒(Zaire Ebola virus)；(f)展現結合至表現EBOV-GP觸發抗體-依賴的細胞毒性之細胞；(g)與一或多種由下列成之群中選出的EBOV病毒株交叉反應：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)；(h)與可溶性GP(sGP)結合；(i)與參照抗體交叉競爭，其中該參照抗體係包括一重鏈可變區(HCVR) 和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1之HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
  2. 一種單離的重組抗體或其抗原結合片段，其專一結合至伊波拉病毒(EBOV)及/或伊波拉病毒醣蛋白(EBOV-GP)，其中該抗體係具有二或多項下列特色：(a)為一全長的人類單株抗體；(b)與EBOV，或以表面電漿共振所測表現具有低於10-7M解離常數(KD)之表現EBOV-GP的類病毒顆粒(VLP)結合；(c)相對於pH 7.4，在pH 5或pH 6時展現至少增加3-倍的解離半衰期(t½)；(d)展現以範圍從約10-11M至約10-9M之IC50中和薩伊伊波拉病毒；(e)展現結合至表現EBOV-GP觸發抗體-依賴的細胞毒性之細胞；(f)與一或多種由下列組成之群中選出的EBOV病毒株交叉反應：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)；(g)與可溶性GP(sGP)結合；(h)與參照抗體交叉競爭，其中該參照抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1之HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
  3. 如請求項1或2之單離的抗體或其抗原結合片段，係包括一HCVR其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、66、146、2、34、50、82、98、114、130、162、178、194、210、226、242、258、274、290和306。
  4. 如請求項1至3中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，係包括一 LCVR其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：26、74、154、10、42、58、90、106、122、138、170、186、202、218、234、250、266、282和298。
  5. 如請求項1至4中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，係包括：(a)一HCDR1區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：20、68、148、4、36、52、84、100、116、132、164、180、196、212、228、244、260、276、292和308；(b)一HCDR2區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：22、70、150、6、38、54、86、102、118、134、166、182、198、214、230、246、262、278、294和310；(c)一HCDR3區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：24、72、152、8、40、56、88、104、120、136、168、184、200、216、232、248、264、280、296和312；(d)一LCDR1區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：28、76、156、12、44、60、92、108、124、140、172、188、204、220、236、252、268、284 and 300；(e)一LCDR2區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：30、78、158、14、46、62、94、110、126、142、174、190、206、222、238、254、270、286和302；(f)一LCDR3區，其具有由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：32、80、160、16、48、64、96、112、128、144、176、192、208、224、240、256、272、288和304。
  6. 如請求項1至5中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，係包括一對由下列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO： 18/26、66/74、146/154、2/10、34/42、50/58、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282。
  7. 如請求項1至6中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，其係包括SEQ ID NO：20之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：22之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：24之HCDR3胺基酸序列；SEQ ID NO：28之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：30之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：32之LCDR3胺基酸序列。
  8. 如請求項1至6中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，其係包括SEQ ID NO：68之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：70之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：72之HCDR3胺基酸序列；SEQ ID NO：76之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：78之LCDR2胺基酸序列和SEQ ID NO：80之LCDR3胺基酸序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之單離的抗體或其抗原結合片段，其係包括SEQ ID NO：148之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：150之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：152之HCDR3胺基酸序列；SEQ ID NO：156之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：158之LCDR2胺基酸序列和SEQ ID NO：160之LCDR3胺基酸序列。
  10. 一種單離的單株抗體或其抗原結合片段，其係與包括HCVR之CDR和LCVR之CDR的參照抗體或抗原結合片段競爭與EBOV及/或EBOV GP結合，其中該HCVR係具有由表1所列的HCVR序列組成之群中選出的胺基酸序列；及其中該LCVR係具有由表1所列的LCVR序列組成之群中選出的胺基酸序列。
  11. 一種單離的單株抗體或其抗原結合片段，其係與包括HCVR之CDR 和LCVR之CDR的參照抗體或抗原結合片段相同的EBOV及/或EBOV GP上的表位結合，其中該HCVR係包括由表1所列的HCVR序列組成之群中選出的胺基酸序列；及其中該LCVR係包括由表1所列的LCVR序列組成之群中選出的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之單離的抗體，其中該抗體防止伊波拉病毒黏附及/或進入宿主細胞。
  13. 一種中和傳染性EBOV之方法，該方法包括將一感染EBOV的細胞暴露於包括一或多種根據請求項1至12中任一項之抗-EBOV抗體或其抗原結合片段之組合物，其中該暴露使得細胞保護強化而免於病毒感染或免於細胞死亡。
  14. 如請求項13之方法，其中係於活體外或活體內中和該傳染性EBOV。
  15. 如請求項13之方法，其中該強化的保護係當單獨使用抗體或與一或多種另外的治療劑或抗-EBOV治療形式組合使用時所觀察到。
  16. 如請求項15之方法，其中該一或多種另外的治療劑係由下列組成之群中選出：抗病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、不同的抗EBOV抗體、伊波拉病毒疫苗、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。
  17. 如請求項15之方法，其中該一或多種另外的治療劑係包括一或多種抗-EBOV抗體。
  18. 如請求項17之方法，其中該一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其係由任何表1所列的HCVR和LCVR胺基酸序列組成之群中選出。
  19. 如請求項18之方法，其中該一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對，其係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282。
  20. 如請求項19之方法，其中該一或多種抗-EBOV抗體係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對，其係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154。
  21. 一種醫藥組成物，其係包括一或多種根據請求項1至12中任一項之專一與EBOV結合的單離單株抗體或其抗原結合片段以及一醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  22. 如請求項21之醫藥組成物，其中該一或多種單離的抗體係包括由表1所列的HCVR和LCVR序列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  23. 如請求項22之醫藥組成物，其中該HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：18/26、66/74、146/154、2/10、34/42、50/58、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和306/282。
  24. 如請求項23之醫藥組成物，其中該HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154。
  25. 一種醫藥組成物，係包括(a)第一抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；(b)第二抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段；及(c)第三抗-伊波拉病毒抗體或其抗原結合片段，根據請求項1至12中任一項，其中該第一抗體係與EBOV上的第一表位結合或相互作用，而第二及/或第三抗體 係與EBOV上的不同表位結合或相互作用，及(d)醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  26. 如請求項25之醫藥組成物，其中該第一、第二和第三抗-EBOV抗體係包括一對由表1所列的HCVR和LCVR序列組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  27. 如請求項25之醫藥組成物，其中與第一、第二及/或第三抗-EBOV抗體或其抗原結合片段結合或相互作用之表位為不同且非重疊的。
  28. 如請求項25之醫藥組成物，其中該第一抗-EBOV抗體或其抗原結合片段係與一EBOV病毒株上的表位結合或相互作用，而第二及/或第三抗-EBOV抗體或其抗原結合片段係與EBOV之相同病毒株或不同病毒株上的第二及/或第三表位結合或相互作用。
  29. 如請求項28之醫藥組成物，其中該EBOV病毒株係由下列組成之群中選出：Zaire.2014、Zaire.1995、蘇丹(Sudan)、邦地布優(Bundibugyo)和象牙海岸(Cote d’Ivoire)病毒株。
  30. 一種醫藥組成物，其係包括專一與EBOV結合之第一單離的單株抗體或其抗原結合片段，其中該第一單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括SEQ ID NO：20之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：22之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：24之HCDR3胺基酸序列；SEQ ID NO：28之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：30之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：32之LCDR3胺基酸序列，以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  31. 如請求項30之醫藥組成物，進一步係包括專一與EBOV結合之第二單離的單株抗體或其抗原結合片段，其中該第二單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括SEQ ID NO：68之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：70之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：72之HCDR3胺基酸序列； SEQ ID NO：76之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：78之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：80之LCDR3胺基酸序列。
  32. 如請求項31之醫藥組成物，進一步係包括一專與EBOV結合之第三單離的單株抗體或其抗原結合片段，其中該第三單離的單株抗體或其抗原結合片段係包括SEQ ID NO：148之HCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：150之HCDR2胺基酸序列；SEQ ID NO：152之HCDR3胺基酸序列；SEQ ID NO：156之LCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：158之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：160之LCDR3胺基酸序列。
  33. 一種單離的多核苷酸分子，係包括編碼如請求項1至12中任一項所述抗體之HCVR及/或LCVR的多核苷酸序列。
  34. 一種包括如請求項33之多核苷酸序列的載體。
  35. 一種表現如請求項34之載體的細胞。
  36. 一種預防、治療或改善至少一種EBOV感染之症狀，或降低至少一種EBOV感染之症狀的頻率或嚴重度的方法，該方法包括將一如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段，或如請求項21至31中任一項之醫藥組成物，投予有此需要之對象。
  37. 如請求項36之方法，係包括投予一包括至少二種抗-EBOV抗體混合物之混合劑。
  38. 如請求項36或37之方法，係包括投予包括三種抗-EBOV抗體混合物之抗體混合劑，其中該三種抗-EBOV抗體係包括如SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154中所述之HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  39. 如請求項36之方法，其中該至少一種症狀係由下列組成之群中選出：發燒、頭痛、疲勞、失去食慾、肌痛、腹瀉、嘔吐、腹痛、脫水和不明原因出血。
  40. 如請求項36之方法，其中該醫藥組成物係以預防性或治療性投予有此需要之對象。
  41. 如請求項40之方法，其中該有此需要之對象為患有EBOV感染之對象，或暴露於，或處於暴露於EBOV風險，或得到EBOV感染之對象，其中該對象係由下列組成之群中選出：免疫功能不全個體、健康照護工作者、疑似已暴露於藏有伊波拉病毒者之個人、與感染個體有身體接觸或身體距離極近、醫院員工、醫藥研究員、負責清潔治療過伊波拉病患之醫院設施或機構的維護人員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的個人以及飛行常客。
  42. 如請求項36至41中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段，或包括該抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物係與第二治療劑組合給藥。
  43. 如請求項42之方法，其中該第二治療劑係由下列組成之群中選出：抗病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、不同的抗EBOV抗體、伊波拉病毒疫苗、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。
  44. 如請求項36至43中任一項之方法，其中該醫藥組成物係由皮下、靜脈內、皮內、肌肉內、鼻內或口服給藥。
  45. 一種增加患有EBOV感染之對象，或暴露於EBOV，或處於暴露於或得到EBOV風險之對象的存活性或存活可能性之方法，該方法包括將至少一種如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段，或如請求項21至31中任一項之醫藥組成物投予有此需要之對象。
  46. 如請求項45之方法，係包括投予包括至少二種抗-EBOV抗體混合物之抗體混合劑。
  47. 如請求項45或46之方法，係包括投予包括三種抗-EBOV抗體混合物之抗體混合劑，其中該三種抗-EBOV抗體係包括如SEQ ID NO：18/26、66/74和146/154中所述之HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  48. 如請求項45至47中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段，或包括該抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物，或該抗體混合劑係以預防性或治療性投予有此需要之對象。
  49. 如請求項45至48中任一項之方法，其中該處於暴露於或得到EBOV感染之風險中的有此需要對象係由下列組成之群中選出：免疫功能不全個體、健康照護工作者、疑似已暴露於藏有伊波拉病毒者之個人、與感染個體有身體接觸或身體距離極近、醫院員工、醫藥研究員、負責清潔治療過伊波拉病患之醫院設施或機構的維護人員、探訪或計畫探訪已知具有或疑似具有伊波拉病毒暴發之區域或國家的個人以及飛行常客。
  50. 如請求項45至49中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段，或包括該抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物，或抗體混合劑係與第二治療劑組合給藥。
  51. 如請求項50之方法，其中該第二治療劑係由下列組成之群中選出：抗病毒藥、抗發炎藥(例如皮質類固醇和非類固醇抗發炎藥)、不同的抗EBOV抗體、伊波拉病毒疫苗、TKM伊波拉(以病毒RNA聚合酶為標靶的小型干擾RNA)brincidofovir(CMX-001)、法匹拉韋(favipiravir)(T-705)、BCX-4430、AVI-7537(以伊波拉病毒VP24基因為標靶之反義磷醯二胺嗎福啉代寡核苷酸)及干擾素。
  52. 如請求項45至51中任一項之方法，其中該醫藥組成物係由皮下、靜脈內、皮內、肌肉內、鼻內或口服給藥。
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