ES2728095T3 - Anticuerpos monoclonales para los virus del Ebola y Marburgo - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende anticuerpos monoclonales que se unen a la glucoproteína del virus del Ébola, comprendiendo dichos anticuerpos: (a) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; y/o (b) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales para los virus del Ébola y Marburgo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los virus del Ébola y Marburgo son virus altamente patógenos y virulentos que causan fiebre hemorrágica rápidamente mortal en los seres humanos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende anticuerpos monoclonales que se unen a la glucoproteína del virus del Ébola como se define en las reivindicaciones adjuntas al presente documento.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de diagnóstico que comprende detectar la presencia de un antígeno del virus del Ébola dentro de una muestra con la composición de la invención.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar la composición de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas al presente documento.
TÉCNICA ANTERIOR
El documento WO2004/018649 describe catorce MAb, de los cuales 10 eran protectores en ratones. Algunos de los MAb protectores (13F6, 6D8, 12B5, 13C6 y 6D3) fueron eficaces cuando se administraron hasta 2 días después de la exposición.
Jones, Steven, Feldmann, Heinz, "Therapeutic Antibodies to Ebola and Marburg Viruses", Google, (20060613), URL: Las actas del Simposio de verano CTRI de 2006 hacen referencia a anticuerpos monoclonales (mAb) contra los virus del Ébola y Marburgo, y su uso como profilaxis posterior a la exposición para evitar enfermedades graves en las personas expuestas a los virus.
SOLTES ETAL., "On the influence of vector design on antibody phage display", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 127(4) (2006), páginas 626-637, describen el uso de la presentación en fagos en la generación de anticuerpos monoclonales.
CHRIS DRUAR ET AL., "Analysis of the expressed heavy chain variable-region genes of Macaca fascicularis and isolation of monoclonal antibodies specific for the Ebola virus' soluble glycoprotein", IMMUNOGENETICS, vol. 57(10) (2005), páginas 730-738, describen diversos anticuerpos monoclonales específicos contra la glucoproteína soluble del virus del Ébola.
TAKADA, A. ET AL., "Protective efficacy of neutralizing antibodies against Ebola virus infection", VACCINE, (2007), vol. 25, páginas 993-999, describen diversos anticuerpos neutralizantes contra el virus del Ébola y su potencial utilidad terapéutica en el tratamiento posterior a la exposición de las infecciones por el virus del Ébola.
SHAHHOSSEINI, S. ET AL., "Production and characterization of monoclonal antibodies against different epitopes of Ebola virus antigens", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, (2007), vol. 143, páginas 29-37, describen la producción y caracterización por ELISA y análisis mediante inmunoelectrotransferencia de diversos anticuerpos monoclonales contra diferentes epítopos de antígenos del virus del Ébola.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1 Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones infectados por MA-ZEBOV y tratados con MAb 1 día después de la infección. Curva de supervivencia de ratones infectados por el virus de MA-Ébola tratados con 100 |jg de MAb. Se trató por vía intraperitoneal a los ratones con 100 jg de cada MAb el día 1. Los ratones de control recibieron volúmenes iguales de PBS.
Figura 2 Cambios en el peso de cobayas infectadas por GPA-Ébola tratadas con MAb. Cambios en el peso de cobayas infectadas por virus tratadas con cóctel de MAb. Se trató por vía intraperitoneal a las cobayas con 5D2, 5E6, 7C9, 7G4 o 10C8 (3 mg/tratamiento) el día 1 y 4G7 1H3 2G4 [(2 mg 1 mg 1 mg)/tratamiento] el día 2. Las cobayas de control recibieron un volumen igual de PBS. Los resultados se muestran como las medias y desviaciones estándar de 6 cobayas.
Figura 3 Cambios en el peso de cobayas infectadas por GPA-Ébola tratadas con MAb. Cambios en el peso de cobayas infectadas por virus tratadas con cóctel de MAb. Se trató por vía intraperitoneal a las cobayas con 5D2, 5E6, 7C9, 7G4 o 10C8 (3 mg/tratamiento) el día 1 y 4G7 1H3 2G4 [(2 mg 1 mg 1 mg)/tratamiento] el día 2. Las cobayas de control recibieron un volumen igual de PBS. Los resultados se muestran como el peso del grupo de 6 cobayas.
Figura 4 Inmunoprecipitación. Se transfectaron células 293T con pCAGGS-ZEbovGP1,2 usando Fugene 6. Después de 48 horas, se recogieron las células y se lavaron 2X con PBS frío antes de lisarlas con tampón RIPA 2X. Después de clarificar el lisado celular, se le añadió 100 |jg de proteína a cada perla de proteína A+G acoplada a McAb (5 |jg). Las muestras de IP se procesaron en SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a la membrana Hybond-P. La transferencia se sondó con anti-EBOV-GPI de ratón.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o pruebas de la presente invención, ahora se describen los procedimientos y materiales preferentes.
DEFINICIONES
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que puede romper una partícula vírica formada o inhibir la formación de una partícula vírica o evitar la unión a o la infección de células de mamíferos por una partícula vírica.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo de diagnóstico" o "anticuerpo de detección" o "anticuerpo para detectar" se refiere a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que puede detectar la presencia de una diana antigénica dentro de una muestra. Como apreciará un experto en la técnica, dichos anticuerpos de diagnóstico tienen preferentemente una alta especificidad por su diana antigénica.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos con inmunogenicidad reducida en humanos.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos con inmunogenicidad reducida en humanos construidos mediante la unión genética de una región variable no humana a dominios constantes humanos.
En el presente documento se describen una serie de anticuerpos monoclonales contra los virus del Ébola y Marburgo. Específicamente, se desarrollaron antígenos usando un vector de replicación vivo del virus de la estomatitis vesicular descrito en la solicitud PCT PCT/CA03/001125.
El sistema de administración de vacunas basado en VSV se utilizó para desarrollar anticuerpos monoclonales en ratones.
Específicamente, en el presente documento se describen los anticuerpos monoclonales 1H3, 2G4, 4G7, 5D2, 5E6, 7C9, 7G4 y 10C8. Como se analiza a continuación, 1H3 comprende una cadena pesada de 1H3 (SEQ ID NO: 1) y una cadena ligera de 1H3 (SEQ ID NO: 2); 2G4 comprende una cadena pesada de 2G4 (SEQ ID NO: 3) y una cadena ligera de 2G4 (SEQ ID NO: 4); 4G7 comprende una cadena pesada de 4G7 (SEQ iD NO: 5) y una cadena ligera de 4G7 (SEQ ID NO: 6); 5D2 comprende una cadena pesada de 5D2 (SEQ ID NO: 7) y una cadena ligera de 5D2 (SEQ ID No : 8); 5E6 comprende una cadena pesada de 5E6 (SEQ ID NO: 9) y una cadena ligera de 5E6 (SEQ ID n O: 10); 7C9 comprende una cadena pesada de 7C9 (SEQ ID No : 11) y una cadena ligera de 7C9 (SEQ ID NO: 12); 7G4 comprende una cadena pesada de 7G4 (SEQ ID NO: 13) y una cadena ligera de 7G4 (SEQ ID NO: 14); y 10C8 comprende una cadena ligera de 10C8 (SEQ ID NO: 16) y una cadena pesada de 10C8 (s Eq ID NO: 15). Estos anticuerpos también parecen tener una alta afinidad y avidez por las glucoproteínas del virus del Ébola, lo que significa que se podrían usar como herramientas de diagnóstico altamente sensibles.
Por ejemplo, como se muestra en la figura 1, los ratones infectados por MA-ZEBOV y posteriormente tratados con los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente mostraron un incremento de la supervivencia en comparación con los ratones tratados con PBS. Los resultados se resumen en las tablas 1 y 2.
Las figuras 2 y 3 muestran cambios de peso en cobayas tratadas con anticuerpos monoclonales o mezclas de los mismos después de la infección. Como se puede observar, las cobayas tratadas con los anticuerpos monoclonales mostraron un peso consecuente, mientras que las tratadas con PBS mostraron un adelgazamiento significativo. Los resultados se resumen en la tabla 3.
Siguen las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesada y ligera de 1H3, 2G4, 4G7, 5D2, 5E6, 7C9, 7G4 y 10C8. Como apreciará un experto en la técnica, las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se pueden deducir fácilmente a partir de las secuencias de nucleótidos. En consecuencia, en algunos modos de realización, la invención se refiere a secuencias de aminoácidos deducidas de la cadena ligera de 1H3 (SEQ ID NO: 2); la cadena ligera de 2G4 (SEQ ID NO: 4); la cadena ligera de 4G7 (SEQ ID NO: 6); la cadena ligera de 5D2 (SEQ ID NO: 8); la cadena ligera de 5E6 (SEQ iD NO: 10); la cadena ligera de 7C9 (SEQ ID NO: 12); la cadena ligera de 7G4 (SeQ ID NO: 14), la cadena ligera de 10C8 (s Eq ID NO: 16), la cadena pesada de 1H3 (SEQ ID NO: 1); la cadena pesada
de 2G4 (SEQ ID NO: 3); la cadena pesada de 4G7 (SEQ ID NO: 5); la cadena pesada de 5D2 (SEQ ID NO: 7), la cadena pesada de 5E6 (SEQ ID nO: 9), la cadena pesada de 7C9 (SEQ ID NO: 11), la cadena pesada de 7g 4 (SEQ ID NO: 13) y la cadena pesada de 10C8 (SEQ ID NO: 15).
secuencia de la cadena pesada de mAb 1H3: 373 pb
T GGGGCAGAGCTT GT GAAGCCAGGGGCCT CAGT CAAGTT GT CCT GCACAGC TT CT G GCTT CAACATT AAAG ACACCTAT AT ACATT G GGT G AAACAG GG GCCT G AACAGGGCCTGGAGTGGATT GGAAGGATT GAT CCT GCGAAT GGTAATACTAA
AT AT GACCCGAAGTT CCAGGGCAAGGCCACT AT CACAGCAGACACAT CCT CC AATACAGCCTACCTGCAGCTCAGCGGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCT ATTACTGTGCTAGGGAGTCGAGGATATCTACTATGCTTACGACGGGGTACTTT G ACT ACT G G G GCC AAG GCACCACT CT CACAGT CTCCT CAGCCAAAACAACAG CCCCATCG (SEQ ID No. 1)
secuencia de la cadena ligera de mAb 1H3: 303 pb
GCAATCATGTCTGCATCTCCAG G G G AG AAG GTCACCATG ACCTGC AGTG CCA GCT CAAGT GTAAGTT ACAT GT ACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGAT CCT CCCC CAGACT CCT GATTT AT GACACAT CCAACCTGGCTT CTGGAGT CCCT GTT CGCT T CAGT GGCAGTGGGTCTGG G ACCT CTT ACT CT CT CACAAT CAGCCG AAT G G A GGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGTAC ACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGAT (SEQ ID No. 2)
secuencia de la cadena pesada de mAb 2G4: 364 pb
TGGAGGAGGCTT GAT GCAACCTGGAGGAT CCAT GAAACT CT CCT GT GTT GCC T CAGGATT CACTTT CAGTAACT ACT GGAT GAACT GGGT CCGCCAGT CT CCAGA GAAGGGGCTT GAGTGGGTT GCT GAAATT AGATT GAAAT CT AAT AATT AT GCAA CAC ATT AT G CG G AGT CTGT GAAAG G G AG GTT CACCATTT CAAG AG AT G ATT CC AAAAGGAGT GT CT ACCT GCAAAT GAATACCTT AAGAGCT GAAG ACACT G GCAT TTATTACT GTACCCGGGG G AAT G GTAACT ACAG G GCTAT G G ACT ACT G G G GT CAAGGAACCT CAGT CACCGT CT CCT CAGCCAAAACAACACCCCCAT CA (SEQ ID No. 3)
secuencia de la cadena ligera de mAb 2G4: 306 pb
GCCTCCCTATCTGTATCTGTG G G AG AAACT GTCT CCAT CACAT GT CG AGCAA GTGAGAATATTTACAGTAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCT CCT CAGCT CCTGGT CTATT CT GCAACAAT CTT AGCAGATGGT GT GCCAT CAAG GTT CAGT G GCAGT GGAT CAG GC ACT CAGTATT CCCT CAAG AT CAACAGCCT G CAGT CT G AAG ATTTT GG G ACTT ATTACT GT CAAC ATTTTT G GG GT ACT CCGTA CACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGAT (SEQ ID No. 4)
secuencia de la cadena pesada de mAb 4G7: 358 pb
T GGACCT GAGCTGGAGAT GCCTGGCGCTT CAGT GAAGAT AT CCT GCAAGGCT TCTG GTTCCT CATT CACT G GCTT CAGTAT G AACT G G GT G AAGCAG AGC AAT G G AAAG AGCCTT G AGT G G ATT G G AAATATT G AT ACTTATT ATG GT G GTACTACC T ACAACCAG AAATT CAAG G GCAAG GCCACATT G ACT GTG GACAAAT CCTCCA GCACAGCCTACAT GCAGCT CAAGAGCCT GACAT CT G AGGACT CT GCAGT CTA TTACTGTGCAAGATCGGCCTACTACGGTAGTACTTTTGCTTACTGGGGCCAAG GGACT CTGGT CACT GT CT CT GCAGCCAAAACAACAGCCCCAT CG (SEQ ID No.
5)
secuencia de la cadena ligera de mAb 4G7: 306 pb
GCCT CCCTATCT GCAT CT GTGGGAGAAACT GT CACCATCACAT GTCGAGCAA GT G AGAAT ATTT ACAGTTATTTAGCAT G GTAT CAG CAG AAACAG G G AAAAT CT CCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCCAAAACCTTAATAGAGGGTGTGCCATCAAG GTT CAGTGGCAGTGGAT CAGGCACACAGTTTT CT CT GAAGAT CAACAGCCT G CAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTTCTGTCAACATCATTTTGGTACTCCATTC ACATTCGGCTCGGGGACAGAGTTGGAAATAAAACGGGCTGAT (SEQ ID No. 6)
secuencia de la cadena pesada de mAb 5D2: 340 pb
GGGACCTGGCCTGGT GAGACCTTCTCAGT CT CT GT CCCTCACCT GCACT GT C ACT G G CTACT C AAT CACCAGT G ATT ATGCCTG G AACT G G AT CCG GCAGTTT C CAG G AAAC AAACT G G AGT G GCTG G G CTATATAACC AACACT G GTAG CACT G G CTT CAACCCAT CT CT CAAAAGTCG AAT CT CT AT CACT CG AG ACACAT CCAAG A ACCAGTT CTT CCT GCAGTT GATTT CT GT GACTACT G AGGACACAGCCACAT AT CACTGTGCAAGGGGCCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCT CT GCAGCCAAAACAACAGCCCCAT CG (SEQ ID No. 7)
secuencia de la cadena ligera de mAb 5D2: 321 pb
CT CACTTT GTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT CCAT CT CTT GCAAGT CAAG T CAGAGCCT CTT AGATAGT GATGG AAAGACAT AT CT GAATTGGTT GTT ACAGA GGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTC T GG AGT CACT G ACAG GTT CACT G GCAGT G G AT CAG G GACAG ATTT CAC ACT G AAAAT CAGCAG AGT GG AG GCT GAG GATTT G G G AGTTTATT ATT GTT G GCAAG GTACACACTCT CCATT CACGTTCGGCT CGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACG GGCTGAT (SEQ ID No. 8)
secuencia de la cadena pesada de mAb 5E6: 370 pb
TGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGC CTCTGGATCCGCTTTCAGTAGATATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCG G AG AAG AG GCT G GAGT G G GTCGCATACATT AGT CGTGGTGGT G GTTT CAT CT ACT AT CCAGACACT GT GAAGGGCCGATT CACCAT CT CCAGAGACAAT GCCAA GAACACCCT GTACCT GCAAAT GAGCAGTCT GAAGT CT GACGACACAGCCAT G TATTACTGTGCAAGACACGTTTACTACGGTAGTAGCCCCCTCTATGCTATGGA CT ACT GGGGT CAAGG AACCT CAGT CACCGT CT CCT CAGCCAAAACAACAGCC CCATCG (SEQ ID No. 9)
secuencia de la cadena ligera de mAb 5E6: 324 pb
T CAGCCT CTTT CT CCCTGGGAGCCT CAGCAAAACT CACGT GCACCTT GAGT A GTCAGCACAGTACGTTCACCATTGAATGGTATCAGCAACAGCCACTCAAGCC TCCTAAGT ATGT G AT G G AGCTTAAG AAAG AT G G AAGCCACAGTAC AG GT G AT GGGATT CCT GAT CGCTT CT CTGGAT CCAGCT CTGGT GCT GATCGCT ACCTT A GCATTT CCAACAT CCAGCCT G AAG AT G AAGCAATATAC AT CTGTGGTGTGGGT GATACAATTAAT GAACAATTT GT GTAT GTTTTCGGCGGT GGAACCAAGGT CAC TGTCCTAGGT (SEQ ID No. 10)
secuencia de la cadena pesada de mAb 7C9: 358bp
T GGG GCAGAGCTT GT GAAGCCAGGGGCCT CAGT CAAGTT GT CCT GCACAGC TT CT G GCTT CAACATT AAAG ACACCTAT AT G CACT G G GT G AAGG AG AG GCCT G ACAAG G GCCTG GAGT G G ATT G G AAG G ATT GAT CCAGCG AAT G GT AAT ACT A AAT GT G ACT CG AG GTTT CAG G GCAAG GCCACTAT AACAGCAG ACACAT CCTC CAACACAGCCT ACCT GCAGCT CAGCAGCCT GACAT CT GAGGACACT GCCGT C T ATT ACT GTGCTAGAAGGATCTACTTT G GTAAG G G CTTT G ACTTTT G G G G CC A AGGCACCACT CT CACAGT CT CCT CAGCCAAAACAACAGCCCCAT CG (SEQ ID No. 11)
secuencia de la cadena ligera de mAb 7C9: 324 pb
T CCT CCCT GAGT GT GT CAGCAGGAGAGAAGGT CACT AT GAGCT GCAAGT CCA GT C AG AGT CT GTTT AACAGT G G AGAT CAAAAG AACT ACTT G GCCT G GTACCA GCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGG G AAT CTGGGGTCCCT GAT CGCTT CACAG GCAGT G GAT CT G G AACC GATTT CA CT CTTACCATCAGCAGT GT GCAGGCT GAAGACCTGGCAGTTTATTACT GT CAG AAT GAT CAATTTT AT CCT CCCACGTTCGGT GAT GGGACCAAGCTGGACCT GAA ACGGGCTGAT (SEQ ID No. 12)
secuencia de la cadena pesada de mAb 7G4: 367 pb
T GGAGGGGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTT CTCT GAGACT CT CCT GT GCAACT TCTGGCTTCACCTTTACTGATCACTACATGGGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAG G AAAG GCACTT GAGT G GTT G GCTTTT GTT AGAT ACAAAGCTAAG G GTT ACACA ACAGAGT ACACT GCAT CT GT GAAGGGT CGGTT CACCAT CT CCAGAGATAATT C CCAAAGCAT CCT CT AT CTT CAAAT GAACACCCT G AG AACT GAGGACAGT GCCA CTTATT ACTGTG C AAG AGAT AGAGGGGGTTACGTGGGAGCTATGGACTACTG GGGT CAAGGAACCT CAGT CACCGT CT CCT CAGCCAAAACGACACCCCCAT CT
(SEQ ID No. 13)
secuencia de la cadena ligera de mAb 7G4: 321 pb
CT CT CCCT GCCT GT CAGT CTT GGAGAT CAAGCCT CCAT CT CTT GCAGAT CT AG T CAG AGCCTT GT ACACAG G AAT G GAAAC ACCT ATTT CCATT G GTACCT GCAG A AGCCAGGCCAGT CT CCAAAACT CCT GAT CTACAAAGTTTCCAACCGATTTT CT G G G GT CCCAG ACAGGTT CAGT G GCAGTG GAT CAG G G ACAG ATTT CACACT CA AGAT CAGCAG AGT G G AG GCT G AG GAT CTG G GAGTTTATTT CT GCT CT CAAAG TACACATGTTCCGTACACTTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG GCTGAT (SEQ ID No. 14)
secuencia de la cadena pesada de mAb 10C8: 352 pb
TGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACATCT T CTGGCTT CAACATTAAAGACTACTTTCTACACTGGGT GAAACAGAGGCCT GA ACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAA T AT GCCCCGAAGTT CCAGGACAAGGCCACT AT GACT GCAGACACAT CCT CCA ACACAGCCT ACCT GCACCT CAGCAGCCT GACAT CT GAGGACACTGGCGT CT A
TTACTGTAATGCAGATGGTAACTACGGGAAGAACTACTGGGGCCAAGGCACC ACT CT CACCGT CT CCT CAGCCAAAACAACAGCCCCATCG (SEQ ID No. 15)
secuencia de la cadena ligera de mAb 10C8: 324 pb
CT CT CCCT GCCT GTCAGT CTTGGAGAT CAAGCCT CCAT CT CTT GCAGAT CT AG TCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTTTTTACATTGGTACCTGCAGA AGCCAGGCCAGT CT CCAAAGCT CCT GAT CT ACAGAGTTTCCAACCGATTTT CT G G G GT CCCAG ACAGGTT C AGT G GC AGTG G AT CAG G G ACAG ATTT CACACT CA AG AT CAGCAG AGT G G AG GCT G AG GAT CTG G GAGTTTATTT CT GCT CT CAAAG TACACATGTTCCTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA CGGGCTGAT (SEQ ID No. 16)
Una o más de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente que codifican el anticuerpo se pueden someter a técnicas de humanización o convertir en moléculas humanas quiméricas para generar una variante de anticuerpo que tiene inmunogenicidad reducida en humanos. Las técnicas de humanización son bien conocidas en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6.309.636 y la patente de EE. UU. 6.407.213 a las que se hace referencia específicamente para su divulgación sobre técnicas de humanización. Los quiméricos también son bien conocidos, véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6.461.824, la patente de EE. UU. 6.204.023, la patente de EE. UU. 6.020.153 y la patente de EE. UU. 6.120.767.
Se pueden preparar anticuerpos quiméricos preparando un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de región constante de una cadena ligera o pesada humana unida genéticamente a un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en cadena ligera de 1H3 (SEQ ID NO: 2); cadena ligera de 2G4 (SEQ ID NO: 4); cadena ligera de 4G7 (SEQ ID NO: 6); cadena ligera de 5D2 (SEQ ID NO: 8); cadena ligera de 5E6 (SEQ ID NO: 10); cadena ligera de 7C9 (SEQ ID NO: 12); cadena ligera de 7G4 (SEQ ID NO: 14) y cadena ligera de 10C8 (SEQ ID NO: 16) o una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en cadena pesada de 1H3 (SEQ ID NO: 1); cadena pesada de 2G4 (SEQ ID NO: 3); cadena pesada de 4G7 (SEQ ID NO: 5); cadena pesada de 5D2 (SEQ ID NO: 7), cadena pesada de 5E6 (SEQ ID NO: 9), cadena pesada de 7C9 (SEQ ID NO: 11), cadena pesada de 7G4 (SEQ ID NO: 13) y cadena pesada de 10C8 (SEQ ID NO: 15). Es de destacar que todas estas secuencias se describen anteriormente.
En el presente documento también se describen anticuerpos recombinantes que comprenden al menos una región variable modificada, seleccionada dicha región del grupo que consiste en cadena ligera de 1H3 (SEQ ID NO: 2); cadena ligera de 2G4 (SEQ ID NO: 4); cadena ligera de 4G7 (SEQ ID NO: 6); cadena ligera de 5D2 (SEQ ID NO: 8); cadena ligera de 5E6 (SEQ ID NO: 10); cadena ligera de 7C9 (SEQ ID NO: 12); cadena ligera de 7G4 (SEQ ID NO: 14), cadena ligera de 10C8 (SEQ ID NO: 16), cadena pesada de 1H3 (SEQ ID NO: 1); cadena pesada de 2G4 (SEQ ID NO: 3); cadena pesada de 4G7 (SEQ ID NO: 5); cadena pesada de 5D2 (SEQ ID NO: 7), cadena pesada de 5E6 (SEQ ID NO: 9), cadena pesada de 7C9 (SEQ ID NO: 11), cadena pesada de 7G4 (s Eq ID NO: 13) y cadena pesada de 10C8 (SEQ ID NO: 15), en la que al menos uno, pero menos de aproximadamente 30 de los residuos de aminoácidos de dicha región variable se ha cambiado o eliminado sin interrumpir la unión con el antígeno. Es de destacar que todas estas secuencias se describen anteriormente.
En el presente documento también se describen fragmentos inmunorreactivos de cualquiera de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente, se preparan anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados usando medios conocidos en la técnica, por ejemplo, preparando deleciones anidadas usando degradación enzimática o enzimas de restricción convenientes.
Es de destacar que, en todos los modos de realización que describen la preparación de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o fragmentos inmunorreactivos de anticuerpos monoclonales, estos anticuerpos se someten a cribado para garantizar que la unión al antígeno no se haya interrumpido. Esto se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios conocidos en la técnica, pero un procedimiento conveniente implicaría el uso de una colección de presentación de fagos. Como apreciará un experto en la técnica, como se usa en el presente documento, "fragmento inmunorreactivo" se refiere en este contexto a un fragmento de anticuerpo de longitud reducida en comparación con el anticuerpo natural u original que conserva un grado o porcentaje aceptable de
actividad de unión al antígeno diana. Como apreciará un experto en la técnica, lo que sea un grado aceptable dependerá del uso previsto.
Es de destacar que, como se analiza en el presente documento, cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente o variante humanizada de los mismos se puede formular en un tratamiento farmacéutico para proporcionar inmunidad pasiva a individuos con sospecha o riesgo de desarrollar fiebre hemorrágica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo. La preparación farmacéutica puede incluir un excipiente o vehículo adecuado. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1995, Gennaro ed. Como será evidente para un experto en la técnica, la dosificación total variará de acuerdo con el peso, la salud y las circunstancias del individuo, así como la eficacia del anticuerpo.
Tabla 1 Eficacia protectora dependiente de la dosis de McAb en ratones
Tratamiento3 Dosis (pg/tratamiento) Tiempo medio hasta la muerteb N.° de supervivientes/total McAb 4G7 100 7,00 (n = 1) 5/6
50 7,00 (n = 1) 5/6
25 6,00 (n = 3) 3/6
12,5 6,80 (n = 5) 1/6
6,25 8,20 (n = 5) 2/6
McAb 5D2 100 NPc 6/6
50 NPc 6/6
25 NPc 6/6
12,5 NPc 6/6
6,25 7,50 (n = 2) 4/6
McAb 5E6 100 NPc 6/6
50 NPc 6/6
25 NPc 6/6
12,5 6,50 (n = 2) 4/6
6,25 6,67 (n = 3) 3/6
McAb 7C9 100 NPc 6/6
50 NPc 6/6
25 7,00 (n = 1) 5/6
12,5 7,00 (n = 1) 5/6
6,25 6,50 (n = 4) 2/6
McAb 7G4 100 NPc 6/6
50 7,50 (n = 1) 4/6
25 7,00 (n = 1) 5/6
12,5 7,60 (n = 5) 1/6
6,25 6,60 (n = 5) 1/6
McAb IOCS 100 7,00 (n = 1) 5/6
50 7,00 (n = 1) 516
25 7,50 (n = 4) 2/6
12,5 7,00 (n = 5) 1/6
6,25 6,40 (n = 5) 1/6
PBS 5,80 (n = 5) 0/5
aSe trataron ratones por vía intraperitoneal con anticuerpos 1 día después de la exposición con 1000 LD50 del virus del Ébola adaptado a ratón.
b Datos de animales que murieron (el número de animales se muestra entre paréntesis).
c NP: no procede.
Tabla 2. Dependencia temporal de la eficacia protectora de los MAb en ratones MAb Día de tratamientô Media de tiempo hasta la N.° de supervivientes/total muerteb
1H3100 pg -4 6,70 ± 0,61 (n = 10) 0/10
-1 6,60 ± 0,61 (n = 10) 0/15
1 8,10 ± 0,74 (n = 9) 6/15
2 6,60 ± 0,80 (n = 5) 5/10
3 6,40 ± 0,97 (n = 10) 0/10
2G4 100 pg -4 7,40 ± 0,63 (n = 10) 0/10
-1 7,86 ± 0,74 (n = 14) 1/15
1 8,00 (n = 6) 9/15
2 7,30 ± 0,47 (n = 3) 7/10
3 5,70 ± 1,13 (n = 10) 0/10
4G7 100 |jg -4 7,42 ± 0,46 (n = 7) 3/10
-1 7,08 ± 0,74 (n = 14) 1/15
1 8,25 ± 0,43 (n = 4) 11/15
2 NPc 10/10
3 5,67 ± 1,34 (n = 9) 1/10
5D2 100 jg -4 7,00 (n = 1) 9/10
-1 8,00 ± 1,00 (n = 2) 13/15
1 no disponible 15/15
2 7,00 (n = 4) 6/10
3 6,30 ± 1,05 (n = 10) 0/10
5E6 100 jg -4 7,00 (n = 2) 8/10
-1 8,25 ± 0,43 (n = 4) 11/15
1 7,00 (n = 1) 14/15
2 6,00 (n = 1) 9/10
3 5,80 ± 1,03 (n = 10) 0/10
7C9 100 jg -4 7,00 (n = 1) 9/10
-1 7,75 ± 0,43 (n = 4) 11/15
1 8,00 ± 0,82 (n = 3) 12/15
2 7,00 (n = 1) 9/10
3 6,10 ± 0,67 (n = 10) 0/10
7G4 100 jg -4 8,20 ± 0,71 (n = 10) 0/10
-1 8,07 ± 0,59 (n = 14) 1/15
1 no disponible 15/15
2 7,10 ± 0,57 (n = 9) 1/10
3 6,70 ± 0,44 (n = 10) 0/10
10C8 100 jg -4 7,83 ± 0,64 (n = 6) 4/10
-1 7,64 ± 1,17 (n = 14) 1/15
1 8,50 ± 0,50 (n = 2) 13/15
2 6,83 ± 0,37 (n = 6) 4/10
3 6,30 ± 1,13 (n = 10) 0/10
17F8d 100 jg -4 6,00 ± 1,10 (n = 9) 1/10
-1 6,13 ± 0,88 (n = 15) 0/15
1 7,21 ± 0,86 (n = 14) 1/15
2 6,10 ± 0,83 (n = 10) 0/10
3 6,00 ± 1,13 (n = 10) 0/10
PBS -4 5,40 ± 1,43 (n = 10) 0/10
-1 6,60 ± 0,80 (n = 5) 0/5
3 5,00 ± 0,60 (n = 10) 0/10 aSe trataron ratones por vía intraperitoneal con cada anticuerpo en el momento indicado antes o después de la exposición con 1000 LD50 del virus del Ébola adaptado a ratón.
b Datos de animales que murieron (el número de animales se muestra entre paréntesis).
c NP: no procede.
d Mab de control: anti-MAR GP.
Tabla 3 Eficacia protectora de los MAb en cobayas
Tratamiento Día de tratamiento3 Tiempo medio hasta la N.° de
muerteb supervivenc¡a/Totalc Cóctel de
5D2 (3 mg) 1
4G7(2 mg) 1H3 (1 mg) 2G4(1 mg) 2 NPd 6/6
Cóctel de
5E6 (3 mg) 1
4G7(2 mg) 1H3 (1 mg) 2G4(1 mg) 2 N/A 6/6
Cóctel de
7C9 (3 mg) 1
4G7(2 mg) 1H3 (1 mg) 2G4(1 mg) 2 N/A 6/6
Cóctel de
7G4 (3 mg) 1
4G7(2 mg) 1H3 (1 mg) 2G4(1 mg) 2 N/A 6/6
Cóctel de
10C8 (3 mg) 1
4G7(2 mg) 1H3 (1 mg) 2G4(1 mg) 2 9,00 (n = 1) 5/6
Cóctel de
PBS 1
PBS 2 7,00 (n = 6) 0/6
a Se trataron cobayas institucionalmente con los MAb con la dosis que se muestra en la tabla en los días indicados después de la exposición con 1000 LD50 del virus del Ébola adaptado para cobayas.
b Datos de todos los animales que murieron (el número de animales se muestra entre paréntesis).
c Tasa de supervivencia el día 28 después de la exposición.
d NP: no procede.________________________________________________________________________________
Tabla 4. Resumen del resultado mediante ELISA de McAb anti-Ebola-GP
Tabla 5 Supervivencia prolongada observada en cobayas tratadas con McAb Tratamientoa Media de tiempo hasta la muerteb Prueba de la t de Student MAb1H3 11,7 ± 2,18 (n = 5) p = 0,0181
MAb 2G4 11,5 ± 1,50 (n = 2) NPc
MAb 4G7 10,5 ± 1,50 (n = 2) NPc
MAb 5D2 9,4 ± 1,02 (n = 5) p = 0,0244
MAb 5E6 10,8 ± 1,47 (n = 5) p = 0,0092
MAb 7C9 9,6 ± 0,80 (n = 5) p = 0,0056
MAb 7G4 9,6 ± 0,80 (n = 5) p = 0,0056
MAb 10C8 9,4 ± 1,20 (n = 5) p = 0,0428
PBS 7,67 ± 0,75 (n = 6) NPc
a Se trataron cobayas por vía intraperitoneal con 5 mg del MAb como se muestra en la tabla el día 1 después de la exposición con 1000 LD50 del virus del Ébola adaptado para cobayas.
b Datos de todos los animales que murieron (el número de animales se muestra entre paréntesis).
c NP: no procede.________________________________________________________________________________
Tabla 6 Eficacia protectora de los MAb en cobayas
Tratamiento Día de tratamiento3 Tiempo medio hasta la N.° de muerteb supervivencia/Total c
Cóctel de 4G7 (2 mg) 1H3 (1,5mg) 2G4 -1 11.176 ± 3,09 (n = 3) 3/6 (1,5mg)
Cóctel de 4G7 (2 mg) 1H3 (1,5mg) 2G4 1 7,92 ± 0,42 (n = 3) 3/6 (1,5mg)
Cóctel de 4G7 (2 mg) 1H3 (1,5mg) 2G4 2 NPd 6/6 (1,5mg)
Cóctel de 4G7 (2 mg) 1H3 (1,5mg) 2G4 3 11.176 ± 3,09 (n = 3) 4/6 (1,5mg)
PBS 2 6,58 ± 0,59 (n = 6) 3/6 a Se trataron cobayas institucionalmente con los MAb con la dosis que se muestra en la tabla en los días indicados antes o después de la exposición con 1000 LD50 del virus del Ébola adaptado para cobayas.
b Datos de todos los animales que murieron (el número de animales se muestra entre paréntesis).
c Tasa de supervivencia el día 28 después de la exposición.
d NP: no procede.________________________________________________________________________________
Tabla 7 Epítopos unidos por McAb ZEbov GP
Nombre del mAb GP de Ébola con epítopo Secuencia de epítopos Posición del epítopo 1H3(IgG2a/K ): sGP3 SNTTGKLIWKVNPEI 267-280aa 2G4(IgG2b/K ): GP2a REAIVNAQPKCNPNL 502-516aa 4G7(IgG2a/K}: GP2a REAIVNAQPKCNPNL 502-516aa 5D2 (IgG2a/K ): GP1b,c,d DPGTNTTTEDHKIMA 329-343aa 5E6 (IgG2a/X): GP1b,c,d ATQVEQHHRRTDNDS 401-415aa 7C9(IgG2a,K ): GP1bc se desconoce se desconoce 7G4(IgG1, k ): GP1bc se desconoce se desconoce 10C8(IgG2a,K ): GP1bc se desconoce se desconoce a: determinado usando el virus de la estomatitis vesicular recombinante (VSV) que contiene el gen ZEbov GP para identificar los cambios de aminoácidos en las variantes antigénicas que escapan a la neutralización de anticuerpos; b: determinado por la reactividad mediante inmunoelectrotransferencia con Ébola Zaire 1976 o VLP,
c: determinado por ELISA usando proteína GP1 recombinante;
d: determinado por ELISA utilizando una colección de péptidos.
Claims (7)
1. Una composición que comprende anticuerpos monoclonales que se unen a la glucoproteína del virus del Ébola, comprendiendo dichos anticuerpos:
(a) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; y/o
(b) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de s Eq ID NO: 6 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos anticuerpos comprenden una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos anticuerpos comprenden una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos anticuerpos comprenden: (a) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena pesada codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en un procedimiento para proporcionar inmunidad pasiva a individuos con sospecha o en riesgo de desarrollar fiebre hemorrágica.
6. Un procedimiento de diagnóstico que comprende detectar la presencia de un antígeno del virus del Ébola dentro de una muestra con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
7. Un procedimiento para preparar la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende la etapa de proporcionar un anticuerpo quimérico:
proporcionando: (a) un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de la región constante de una cadena ligera humana unida genéticamente a la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un dominio de la región constante de una cadena pesada humana unida genéticamente a una molécula de ácido nucleico codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; y/o (b) un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un
dominio de la región constante de una cadena ligera humana unida genéticamente a la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 y un dominio de la región constante de una cadena pesada humana unida genéticamente a una molécula de ácido nucleico codificada por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5;
expresar el vector de expresión en un huésped adecuado; y
recuperar el anticuerpo quimérico de dicho huésped.
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