LT4265B

LT4265B - Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof

Info

Publication number: LT4265B
Application number: LT97-020A
Authority: LT
Inventors: Jeffrey M Friedman; Yiying Zhang
Original assignee: Univ Rockefeller
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 1997-12-29
Also published as: SI0777732T1; US6001968A; US20040214214A1; CN102002102A; US20110218332A1; US7994301B2; US7521258B2; ZA956868B; US8173793B2; CO4410343A1; IL188522A0; DK0777732T3; IL162093A; US6734160B2; PT777732E; US7544492B1; LT97020A; EP2402444A1; ATE526408T1; US20030040039A1

Description

kaip hormonas. Šiame išradime taip pat pateikiamos nukleino rūgšties molekulės, skirtos naudoti kaip molekuliniai zondai arba kaip poiimerazinės grandininės reakcijos (PRC) amplifikacijos pradmenys, t. y. sintetiniai arba gamtiniai oligonukleotidai. Dar kita prasme šiame išradime pateikiamas klonavimo vektorius, kuris apima šio išradimo nukleino rūgštis; ir bakterijų, vabzdžių arba žinduolių ekspresijos vektorius, kuris apima šio išradimo nukleino rūgštis, veiksmingai sujungtas su ekspresijos kontroline seka. Tokiu būdu, šis išradimas susijęs ir su bakterijų arba žinduolių ląstelėmis, transfekuotomis arba transformuotomis atitinkamu ekspresijos vektoriumi, ir atitinkamai su aukščiau minėtų darinių panaudojimu išradimo moduliatoriams gauti. Taip pat pateikiami antikūnai prieš OB polipeptidą. Be to, duodamas žinduolių kūno svorio moduliavimo būdas. Specifiniuose pavyzdžiuose pateikiami genai, koduojantys dvi pelės ir žmogaus OB polipeptidu izoformas.

Šis išradimas iš esmės yra susijęs su žinduolių, įskaitant gyvulius ir žmones, kūno svorio kontrole, tiksliau - su medžiagomis, čia identifikuojamomis kaip svorio moduliatoriai, ir su tokių moduliatorių panaudojimu diagnostikoje ir terapijoje.

Išradimo prielaidos

Nutukimas, apibrėžiamas kaip kūno riebalų perteklius, lyginant su neriebaline kūno mase, yra surištas su svarbiomis fiziologinėmis ir medicininėmis patologijomis, tarp pastarųjų yra hipertenzija, padidintas lipidų kiekis kraujyje ir II tipo arba nesusijęs su insulinu cukrinis diabetas (NIDDM). JAV yra 6-10 milijonų žmonių, sergančių NIDDM, jų tarpe 18% yra 65 metų amžiaus [Harris et ai, Int. J. Obės., 11:275-283 (1987)]. Apie 45% vyrų ir 70% moterų, sergančių NIDDM, yra nutukę, ir jų diabetas pastebimai sumažėja arba išnyksta, sumažinus kūno svorį [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648 (1991)]. Kaip aprašyta žemiau, tiek nutukimas, tiek NIDDM žymia dalimi yra paveldimi, nors polinkio genai nebuvo identifikuoti. Tokių sutrikimų, susijusių su metabolizmu, molekulinės genetikos pagrindas yra svarbi, mažai tyrinėta problema.

Maisto energijos asimiliacija, laikymas ir sunaudojimas sudaro sudėtingą homeostatinę sistemą, kuri yra svarbiausia daugialąsčių gyvūnų išgyvenimui. Ant žemės gyvenančių žinduolių atveju, didelio kiekio metabolinio “kuro”, tokio kaip trigliceridai, atsargų sukaupimas riebaliniuose audiniuose yra labai svarbus, išgyvenant maisto trūkumo periodus. Poreikis išlaikyti fiksuotą energijos atsargų lygį, nesikeičiant organizmo dydžiui ir formai, reikalauja, kad būtų pasiekiamas balansas tarp energijos gavimo ir sunaudojimo. Tačiau molekuliniai mechanizmai, reguliuojantys energetinį balansą, vis dar reikalauja išaiškinimo. Molekulių, kurios perduoda maitinimo informaciją ir kontroliuoja energijos balansą, išskyrimas būti} posūkio taškas, norint suprasti kūno svorio reguliavimą sveikame ir sergančiame organizme.

Individualūs nutukimo lygiai didžiąja dalimi yra apspręsti genetiškai. Kūno svorio atitikimo proporcijų ir nutukimo tyrimai tarp mono- ir dizigotinių dvynių arba įsūnių ir jų fiziologinių tėvų duoda pagrindą manyti, kad nutukimo paveldimumas (0,4-0,8) viršija daugumą kitų požymių, kurie, kaip paprastai laikoma, turi esminį genetinį komponentą, tokių kaip šizofrenija, alkoholizmas ir aterosklerozė [Stunkard et ai., N. Engi. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. Taip pat buvo aprašyti šeimyniniai panašumai energijos sunaudojimo greičiuose [Bogardus et ai., Diabetes, 35:1-5 (1986)]. Geografiškai apribotų populiacijų genetinė analizė duoda pagrindo manyti, kad palyginus nedidelis skaičius genų gali paaiškinti 30-50% kūno sudėties nukrypimų [Moli et ai., Am. J. Hum. Genet., 49:12431255 (1991)]. Tačiau, bendroje populiacijoje nebuvo genetiškai nustatytas nei vienas apibrėžtoje chromosominėje padėtyje esantis genas, atsakingas už nutukimą.

Graužikų nutukimo modeliai apima tur būt septynias viengenines mutacijas. Labiausiai tirtos pelių nutukimo mutacijos yra ob (nutukimo) ir db (diabeto) genai. Kai jie yra ant to pačio genetinio kamieno fono, ob ir db duoda neatskiriamus metabolinius ir elgsenos fenotipus, kas leidžia manyti, kad šie genai gali funkcionuoti tuo pačiu fiziologiniu keliu [Coleman et ai., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Pelės, homozigotinės bet kuriai mutacijai, yra hiperfaginės ir hipometabolinės, susidarant nutukusiam fenotipui, kas pastebima jau 1 mėn. amžiaus individuose. Tokių gyvuliukų svoris linkęs stabilizuotis, esant 60-70 g. (plg. 30-35 g. kontrolinių gyvuliukų), ob ir db gyvuliukai rodo daugybę kitų hormoninių ir metabolinių pokyčių, todėl sunku nustatyti pirminį defektą, priskirtiną mutacijai [Bray et ai., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].

Kiekvieną graužikų nutukimo modelį lydi karbohidratų metabolizmo pakitimai, panašūs į žmonių II tipo diabetą. Kai kuriais atvejais diabeto išsivystimo lygis dalinai priklauso nuo pelės linijos [Leiter, Endocrinology, 124:912-922 (1989)]. Ir ob, ir db atveju, giminingos C57BL/Ks pelės išvysto smarkų diabetą su pilna β ląstelių nekroze ir salelių atrofija, susidarant reliatyviąjai insulinopenijai. Atvirkščiai, giminingos C57BL/6J ob ir db pelės išvysto pereinamąjį, rezistentišką insulinui diabetą, kurį galų gale kompensuoja β ląstelių hipertrofija, panaši į žmogaus II tipo diabetą.

ob ir db pelių fenotipas yra panašus į žmonių nutukimą dėl kitokių priežasčių, negu diabeto išsivystymas - mutantinės pelės ėda daugiau ir mažiau sunaudoja energijos negu nenutukusios kontrolinės (kaip ir nutukę žmonės). Šis fenotipas yra taip pat gana panašus į fenotipą, matomą gyvuliukuose su ventramedialinio pagumburio pakenkimais, kas leidžia manyti, kad abiejose mutacijose gali būti trukdoma tinkamai susumuoti arba atsakyti į maistinę informaciją centrinės nervų sistemos viduje. Šią hipotezę remia parabiozės eksperimentų rezultatai [Coleman, Diabetologįa, 9:294-298 (1973)], kurie duoda pagrindo manyti, kad ob pelėms trūksta cirkuliuojančio pasisotinimo faktoriaus, ir kad db pelės yra rezistentiškos ob faktoriaus efektams (tikriausiai dėl ob receptoriaus defekto). Šie eksperimentai leidžia padaryti išvadą, kad šių mutantinių pelių nutukimas gali atsirasti dėl įvairių defektų centriniuose nerviniuose mazguose ir/arba postuluoto grįžtamojo ryšio mechanizmo integraciniame centre, kuris reguliuoja kūno kompoziciją.

Naudojant molekulinius ir klasikinius genetinius markerius, ob ir db genai buvo priskirti atitinkamai artimąjai 6 chromosomai ir viduriniąjai 4 chromosomai [Bahary et ai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman et ai., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. Abiem atvejais mutacijos priskiriamos pelių genomo sritims, kurios yra sintoniškos su žmogaus sritimis, kas leidžia manyti, kad, jeigu yra žmogaus ob ir db homologai, tai jie turėtų atitikti atitinkamai žmogaus chromosomas 7q ir lp. Defektai db gene gali duoti nutukimą kitų rūšių žinduoliuose: genetiniuose krosuose tarp Zucker fa/fa žiurkių ir Brown Norway +/+ žiurkių, fa mutacija (žiurkių 5 chromosoma) yra flankuota tuo pačiu lokusu, kuris flankuoja db pelėje [Truett et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)].

Kadangi kūno svorį, matyt, veikia daugybė faktorių, nebuvo galima numatyti, kurie faktoriai, o tiksliau kurie homeostatiniai mechanizmai pirmiausiai apspredžia kūno svorį. Tokiu būdu, pagrindinė problema, iškylanti šiame išradime, yra gauti kūno svorio moduliatorius, kurie leistų kontroliuoti žinduolių nutukimą ir riebalų kiekį.

Išradimo santrauka

Pagal šį išradimą, gyvūnų, ypatingai žinduolių, nutukimo kontrolės problema buvo išspręsta, pateikiant nutukimo polipeptidus (OB) ir nukleino rūgščių molekules, koduojančias šiuos polipeptidus, taip kaip aprašyta šiame išradime. Šis išradimas pirmą kartą pateikia išskirtus polipeptidus, tinkamus kūno svorio ir nutukimo moduliacijai, t.y. kontrolei ir reguliavimui, o taip pat nukleino rūgščių sekas, koduojančias tokius polipeptidus, kurios ne tik suteikia galimybę gauti OB polipeptidus rekombinantiniu būdu, bet ir pačios yra naudingos kūno svorio moduliacijoje.

Šio išradimo nutukimo polipeptidai (OB) turi maždaug 145-167 aminorūgštis, gali moduliuoti gyvūnų, ypatingai žinduolių, kūno svorį; išradimas apima ir šio polipeptido alelinius variantus arba analogus, įskaitant jų fragmentus, turinčius tą patį biologinį aktyvumą. Polipeptidai gali būti pagaminti rekombinantiniais arba cheminės sintezės būdais. Tinkamiausi polipeptidai apima tokius, kurių aminorūgščių seka yra SEQ ID NOS: 2, 4, 5 arba 6, arba jų alelinius variantus arba analogus, įskaitant fragmentus.

Šio išradimo imunogeniniai OB polipeptidu fragmentai yra: Val-Pro-Ile-Gln-LysVal-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO:18); Leu-His-Pro-Ile-LeuSer-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO:19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-LeuPro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:20); and Ser-ArgLeu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO:21).

Žmogaus OB polipeptido analogai apima tokius analogus, kurie turi žmogaus aminorūgščių sekas SEQ ID NOS: 4 ir 6, kur viena arba daugiau aminorūgščių 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163, ir 166 padėtyse (pagal SEQ ID NO:4 numeraciją) yra pakeistos kita aminorūgštimi, tokia kaip nesutampanti su pelės OB polipeptido aminorūgštimi, kaip nurodyta SEQ ID NO:2, arba alaninu. Tokie analogai taip pat apima analogus, kuriuose: (a) serino liekana 53 padėtyje yra pakeista glicinu, alaninu, valinu, cisteinu, metioninu arba treoninu; (b) serino liekana 98 padėtyje yra pakeista glicinu, alaninu, valinu, cisteinu, metioninu arba treoninu; ir (c) arginino liekana 92 padėtyje yra pakeista asparaginu, lizinu, histidinu, glutaminu, glutamino rūgštimi, asparto rūgštimi, serinu, treoninu, metioninu arba cisteinu. Geriausiai, kai OB polipeptido analogas pagal šį išradimą turi 83% arba daugiau aminorūgščių sekos homologijos žmogaus polipeptido aminorūgščių sekai, parodytai SEQ ID NO:2, 4, 5 arba 6.

Kiti žmogaus OB polipeptido analogai pagal šį išradimą turi aminorūgščių seką SEQ ID NOS: 4 ir 6 ir juose: (a) viena arba daugiau asparto rūgšties liekanų pakeista glutamino rūgštimi; (b) viena arba daugiau izoleucino liekanų pakeista leucinu; (c) viena arba daugiau glicino arba valino liekanų pakeista alaninu; (d) viena arba daugiau arginino liekanų pakeista histidinu; (e) viena arba daugiau tirozino arba fenilalanino liekanų pakeista triptofanu; (f) viena arba daugiau iš 121-128 liekanų (pagal SEQ ID NO:4 numeraciją) pakeista glicinu arba alaninu; ir (g) viena arba daugiau liekanų 54-60 arba 118-166 padėtyse (pagal SEQ ID NO:4 numeraciją) pakeista lizinu, glutamino rūgštimi, cisteinu arba prolinu.

Dabartiniu metu tinkamiausi žmogaus OB polipeptido sutrumpinti analogai pagal šį išradimą apima tokius, kuriuose (pagal SEQ ID NO:4 numeraciją): (a) viena arba daugiau liekanų 121-128 padėtyse yra pašalinta; (b) 1-116 liekanos yra pašalintos; (c) 1-21 ir 54-167 liekanos yra pašalintos; (d) 1-60 ir 117-167 liekanos yra pašalintos; (e) 1-60 liekanos yra pašalintos; (f) 1-53 liekanos yra pašalintos; ir (g) (a) poskyrio analogas, kuriame pašalintos 1-21 liekanos. OB polipeptidai ir ob polipeptido analogai pagal šį išradimą, kuriuose nėra 21 aminorūgšties “signalinės” sekos (pvz., SEQ ID NO:4 1-21 aminorūgščių), gali turėti N-galinę aminorūgštį arba aminorūgščių seką, tokią kaip (1) metioninas, (2) seką glicinas-serinas-histidinas-metioninas (SEQ ID NO:38), (3) seką metioninas-glicinas-serinas-serinas-histidinas-histidinas-histidinas-histidinas-histidinashistidinas-serinas-serinas-glicinas-leucinas-valinas-prolinas-argininas-glicinas-serinashistidinas-metioninas (SEQ ID NO:98), (4) seką leucinas-glutamino rūgštis-lizinasargininas-glutamino rūgštis-alaninas-glutamino rūgštis-alaninas (SEQ ID NO:26), (5) seką glutamino rūgštis-alaninas-glutamino rūgštis-alaninas (SEQ ID NO:27), (6) seką leucinasglutamino rūgštis-lizinas-argininas (SEQ ID NO:28), (7) seką metioninas-glicinas-serinasserinas-histidinas-histidinas-histidinas-histidinas-histidinas-histidinas-serinas-serinasleucinas-valinas-prolinas-argininas-glicinas-serinas-prolinas (SEQ ID NO:99) ir (8) seką glicinas-serinas-prolinas.

OB polipeptido dariniai pagal šį išradimą turi vieną arba daugiau cheminių grupių, prijungtų prie jo, įskaitant vandenyje tirpius polimerus, tokius kaip polietilenglikolis. Polietilenglikoliu derivatizuoti dariniai gali būti mono-, di-, tri- arba tetrapolietilenglikolinti dariniai, pvz., N-galiniai monopolietilenglikoliai. Tinkamiausi Ngaliniai mono-polietilenglikolinti išradimo ob polipeptidu dariniai apima OB polipeptidus, turinčius SEQ ID NO:4 22-166 aminorūgščių liekanas arba SEQ ID NO:6 22-166 aminorūgščių liekanas, esant reikalui, turinčius (polietilenglikolintą) metioniną 21 padėtyje.

Išskirta nukleino rūgšties molekulė, pateikiama šiame išradime, koduoja OB polipeptidą, alelinį variantą arba analogą, įskaitant fragmentus, kurie aprašyti aukščiau.

Atskirai pateikiamos DNR molekulės, skirtos panaudoti OB polipeptido ekspresijai, pasižyminčiam žinduolių kūno svorio moduliavimo aktyvumu, ir pasirinktos iš grupės, kurią sudaro: (a) DNR molekulės, parodytos SEQ ID NO:1 ir 3, arba jų fragmentai; (b) DNR molekulės, kurios hibridizuojasi su DNR molekulėmis, apibrėžtomis (a) dalyje, arba jų galintys hibridizuotis fragmentai; ir (c) DNR molekulės, kurios koduoja aminorūgščių sekos ekspresiją, užkoduotą bet kurios iš aukščiau paminėti} DNR molekulių. Tokių molekulių iliustracija yra žmogaus genominė DNR molekulė SEQ ID NO:22 ir 24.

Tinkamiausios DNR molekulės pagal šj išradimą, koduoja polipeptidą, turint} aminorūgščių seką, parodytą: (a) SEQ ID NO:2; (b) SEQ ID NO:2 22-167 aminorūgštis; (c) SEQ ID NO:4; (d) SEQ ID NO:4 22-167 aminorūgštis; (e) SEQ ID NO:5; (f) SEQ ID NO:5 22-166 aminorūgštis; (g) SEQ ID NO:6 ir (h) SEQ ID NO:6 22-166 aminorūgštis; o taip pat polipeptidus, kurie turi aukščiau nurodytą N-galinę aminorūgštį arba aminorūgščių seką. Kaip iliustracija, tinkamiausia DNR molekulė turi seką, parodytą kaip baltymą koduojanti seka SEQ ID NO:3 ir ypatingai turi seką, parodytą kaip seka, koduojanti 22-167 aminorūgštis.

Taip pat pateikiamos detektuojama žyme pažymėtos nukleino rūgšties molekulės, galinčios hibridizuotis su išradimo DNR molekule, ir apima nukleino rūgšties molekules, galinčias hibridizuotis su nekoduojančia OB nukleino rūgšties dalimi, o nekoduojanti dalis yra pasirinkta iš grupės, susidedančios iš introno, 5’ nekoduojančios dalies ir 3’ nekoduojančios dalies. Šiame išradime taip pat pateikiami oligonukleotidiniai pradmenys, skirti žmogaus genominės DNR, koduojančios ob polipeptidą, amplifikacijai, tokie kaip oligonukleotidai parodyti SEQ ID NO:29-32.

Išradime patekiami vektoriai apima DNR molekulę pagal šj išradimą, kaip aprašyta aukščiau; pageidautina, kad jie turėtų ekspresijos vektoriaus formą, kuris apima DNR molekulę, veiksmingai surištą su ekspresijos kontroline seka. Pagal išradimą vienaląsčio šeiminiko ląstelės transformuojamos arba transfekuojamos DNR molekulėmis pagal išradimą arba aukščiau aprašytu vektoriumi. Tinkamiausios šeimininko ląstelės apima bakterijas, mieles, žinduolių ląsteles, augalų ląsteles, vabzdžių ląsteles ir žmonių audinių kultūrų ląsteles. Kaip iliustracija, tokios šeimininko ląstelės yra parinktos iš grupės, kurią sudaro E.Coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, mielės, CHO, Rl.l, BW, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10, ir Sf9 ąstelės. Dabartiniu metu tinkamiausi mielės-šeimininkai apima Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula ir Torulopsis. Taip pat pateikiamos žinduolių ląstelės, turinčios ob polipeptidą koduojančią DNR seką ir modifikuotos in vitro, kad būtų galima gauti didesnę ob polipeptido ekspresiją homologinių rekombinantinių veiksmų pagalba, susidedančią iš ekspresijos reguliatorinės sekos įterpimo į funkciškai artimą vietą prie ob polipeptido koduojančios sekos. Ekspresijos reguliatorinė seka gali būti arba nebūti ob polipeptido ekspresijos seka ir gali pakeisti mutantinio ob polipeptido reguliatorinę seką ląstelėje.

Šiame išradime pateikiami ob polipeptido pagaminimo būdai, apimantys: (a) aukščiau aprašytos ląstelės kultivavimą sąlygose, kuriose ekspresuojamas ob polipeptidas; ir (b) ob polipeptido išskyrimą. Į šią metodiką taip pat gali įeiti stadijos: (c) polipeptido chromatografavimas per Ni-chelatų sudarymo kolonėlę; ir (d) polipeptido valymas gelfiltracijos būdu. Tinkamiausiame realizavimo variante po (c) stadijos ir prieš (d) stadiją į metodą įjungiama ob polipeptido chromatografavimas per stiprių katijonitų kolonėlę.

Šis išradimas taip pat pateikia žymėtus ir nežymėtus monokloninius ir polikloninius antikūnus, būdingus išradimo ob polipeptidams ir gyvybingų ląstelių linijas, kurios gamina monokloninį antikūną pagal išradimą. Antikūno gavimas pagal išradimą apima: (a) ob polipeptido prijungimą prie nešančio baltymo; (b) gyvūno-šeimininko imunizavimą (a) stadijos OB polipeptido fragmento-nešančio baltymo konjugatu, sumaišytu su stimuliatoriumi; ir (c) antikūno gavimą iš imunizuoto gyvūno-šeimininko.

Išradimas taip pat pateikia OB polipeptido buvimo mėginyje išmatavimo būdus, apimančius: (a) mėginio, kuriame tikimasi, kad yra OB polipeptido, kontaktą su antikūnu (pageidautina prijungtu prie kieto pagrindo), kuris specifiškai rišasi su OB polipeptidų sąlygose, kuriose gali susiformuoti reakcijos kompleksai tarp antikūno ir OB polipeptido; ir (b) reakcijos komplekso tarp antikūno ir ob polipeptido, esančio mėginyje, susidarymo nustatymą; nustatymas, kad susidarė toks kompleksas, rodo kad mėginyje buvo OB polipeptidas. Atitinkamai pateikiami in vitro metodai, skirti OB polipeptido kiekiui biologiniame mėginyje įvertinti, apimantys: (a) reakcijos komplekso susidarymo biologiniame mėginyje nustatymą aukščiau minėtu būdu; ir (b) susidariusio reakcijos komplekso kiekio įvertinimą; šis reakcijos komplekso kiekis atitinka OB polipeptido kiekį biologiniame mėginyje. Nustatant arba diagnozuojant ligą, susijusią su padidintais arba sumažintais OB polipeptido kiekiais pagal šį išradimą, atliekamas aukščiau minėtas įvertinimas, ir nustatyti kiekiai lyginami su esančio OB polipeptido kiekiais normaliuose subjektuose arba buvusiais prieš tam tikrą laiką tame pačiame subjekte. OB polipeptido kiekio padidėjimas, lyginant su normaliais arba ankstesniais kiekiais, rodo ligą, susijusią su padidintais OB polipeptido kiekiais, o OB polipeptido kiekio sumažėjimas, lyginant su normaliais kiekiais, rodo ligą, susijusią su sumažintais OB polipeptido kiekiais. Atitinkamai pateikiami terapinio ligos, susijusios su padidintais arba sumažintais OB polipeptido kiekiais žinduoliuose, gydymo kontroliavimo in vitro būdai, apimantys aukščiau aprašytą OB polipeptido kiekių įvertinimą eilėje biologinių mėginių, paimtų skirtingu laiku iš žinduolio, kuriam atliekamas toks terapinis gydymas.

Farmacinės kompozicijos pagal šį išradimą apima aukščiau aprašytą OB polipeptidą kartu su farmaciškai tinkamu nešikliu, ir yra tinkamos naudoti gyvūno kūno svorio sumažinimui terapiniais metodais. Papildomos farmacinės kompozicijos pagal šį išradimą, skirtos panaudoti terapiniuose metoduose gyvūno kūno svorio padidinimui, apima OB polipeptido antagonistą, geriausiai pasirinktą iš grupės, susidedančios iš antikūno, kuris prisijungia prie OB peptido ir neutralizuoja jo aktyvumą, ob polipeptido fragmento, kuris prisijungia, bet neaktyvuoja OB polipeptido receptoriaus, ir OB polipeptido antagonisto, kuris yra maža molekulė. Šia išradimas taip pat apima atitinkamas kūno išvaizdą gerinančias kosmetines kompozicijas, skirtas individo kūno svorio sumažinimui arba padidinimui; šitokios kompozicijos yra naudingos kosmetikoje individo kūno išvaizdai pagerinti. Tokios kosmetinės kompozicijos skiriamos individui dozėmis, pakankamomis individo kūno svorio sureguliavimui iki norimos apimties.

Šis išradimas taip pat susijęs su nukleino rūgšties molekulių pagal šį išradimą, o taip pat antiprasminių nukleino rūgšties molekulių, galinčių hibridizuotis su nukleino rūgštimi, koduojančia OB polipeptidą pagal šį išradimą, panaudojimu vaistų (pvz., genų terapijai), skirtų gyvūno kūno svorio modifikavimui, gamyboje. Taip pat apimamas ir OB polipeptido arba antagonisto pagal išradimą panaudojimas vaistų, skirtų gyvūno kūno svorio modifikavimui, gamyboje. Taip sukurti vaistai gali būti naudojami žinduolių kūno svorio modifikavimui, gydant sutrikimus, pasirinktus iš grupės, į kurią įeina diabetas, aukštas kraujo spaudimas ir didelis cholesterolio kiekis, ir kaip dalis kombinuotos terapijos su vaistais, skirtais tokių sutrikimų gydymui. Tokie vaistai gali būti naudojami terapiniuose metoduose, apimančiuose intravenines, intraarterines, intraperitonines, intramuskulines, subkutanines, nazalines, peroralines arba pulmonarines vaistų įvedimo sistemas.

Čia pateikti duomenys rodo, kad yra nustatyta, kad išradimo OB polipeptidų formą pirmiausiai išskiria žinduolių adipocitai, ir kad polipeptidai funkcionuoja kaip hormonai.

Išradime pateikiami pavyzdžiai demonstruoja, kad OB polipeptidas, kitaip vadinamas “leptinu”, cirkuliuoja pelės, žiurkės ir žmogaus plazmoje. Leptino nėra plazmoje, gautoje iš ob/ob pelių, jo koncentracija db/db pelių plazmoje yra dešimt kartų didesnė, o fa/fa žiurkių plazmoje - dvidešimt karti} didesnė. Svarbiausia, kad rekombinantinio leptino kasdieninės injekcijos dramatiškai sumažina ob/ob pelių kūno masę, labai paveikia laukinio tipo pelių kūno masę ir neturi įtakos db/db pelėms.

Kitu aspektu, vienų rūšių ob polipeptidas yra biologiškai aktyvus kitose rūšyse. Pavyzdžiui, žmogaus polipeptidas yra aktyvus pelėse.

Pirmuoju atveju šio išradimo moduliatoriai apima nukleino rūgšties molekules, įskaitant rekombinantinės DNR molekules (pvz., kDNR arba vektorių, turintį kDNR arba išsirtą genominę DNR), arba jų degeneracinius variantus, kurie koduoja polipeptidus ir patys tarnauja kaip svorio kontrolės moduliatoriai, kaip pažymėta toliau, arba išlaikytus variantus arba jų fragmentus, ypatingai tokius fragmentus, kuriuose nėra signalinio peptido (čia vadinamas dar subrendusiu OB polipeptidų); polipeptidai turi aminorūgščių sekas, tokias kaip parodyta fig. 1A-E (SEQ ID NO:2), fig. 3 (SEQ ID NO:4), fig. 5 (SEQ ID NO:5) ir fig. 6 (SEQ ID NO:6). Specifiniuose realizavimo variantuose pateiktos pelės ir žmogaus ob polipeptidų abiejų variantų sekos. Abu polipeptidai rasti formoje, kurioje pašalintas glutaminas 49, kas gali būti dėl mRNR sujungimo anomalijos. Įvairių rūšių OB polipeptidai gali būti labai homologiški; kaip parodyta fig. 4, pelės ir žmogaus OB polipeptidai yra daugiau nei 80% homologiški.

Nukleino rūgšties molekulės, rekombinantinės DNR molekulės arba klonuoti genai gali turėti nukleotidų sekas arba jos gali būti komplementarios DNR koduojančioms sekoms, parodytoms fig. 1A-E (SEQ ID NO:1) ir fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3). Atskiru atveju tokios DNR molekulės gali būti kDNR arba genominė DNR, išskirta iš chromosomų. Nukleino rūgšties molekulės pagal išradimą taip pat gali atitikti 5’ ir 3’ flankuojančioms DNR sekoms ir introninėms DNR sekoms. Taigi, šis išradimas taip pat susijęs su nukleino rūgšties, turinčios nukleotidų seką, parodytą fig. 1A-E (SEQ ID NO:1) ir fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3), degeneracinių variantų, alelinių variantų ir panašių giminingų molekulių identifikacija.

Išradimo nukleino rūgšties molekulė gali būti DNR arba RNR, įskaitant jų sintetinius variantus, turinčius fosfato arba fosfato analogo, pvz., trifosfato jungtis. Čia turima galvoje ir viengrandininės ir dvigrandininės sekos.

Šis išradimas taip pat susijęs su nukleino rūgšties molekulėmis, skirtomis panaudoti kaip molekuliniai zondai arba kaip pradmenys polimerazinės grandininės reakcijos (PCR) amplifikacijai, t.y. sintetiniai arba gamtiniai oligonukleotidai, turintys seką, atitinkančią fig. 1A-E (SEQ ID NO:1), fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3) ir fig. 20 A-C (SEQ ID NO:22-24) parodytos sekos dalį; arba koduojančių sekų 5’ ir 3’ flankuojančios sekos; arba genominės DNR introninės sekos. Ypatingai, išradime aptariama nukleino rūgšties molekulė, turinti mažiausiai 10 nukleotidų; nukleino rūgšties molekulės seka atitinka to paties skaičiaus nukleotidų seką nukleotidų sekose, parodytose fig. 1A-E (SEQ ID NO:1), fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3) ir fig. 20A-C (SEQ ID NO:22) arba yra jai komplementari. Geriau, kai molekulės nukleinorūgšties seka turi mažiausiai 15 nukleotidų. Dar geriau, kai nukleino rūgšties seka turi mažiausiai 20 nukleotidų. Išradimo realizavimo variante, kuriame oligonukleotidas yra zondas, oligonukleotidas yra pažymėtas detektuojama žyme, pvz., radionuklidu (tokiu kaip ³²P) arba fermentu.

Dar vienu požiūriu, išradimas yra susijęs su klonavimo vektoriumi, apimančiu nukleino rūgštis pagal išradimą, kurios koduoja ob polipeptidą; ir bakterijų, vabzdžių arba žinduolių ekspresijos vektoriumi, kuris apima nukleino rūgšties molekules pagal išradimą, koduojančias ob polipeptidą, veiksmingai surištą su ekspresijos kontroline seka. Tokiu būdu, išradimas susijęs ir su šeimininko ląstele, tokia kaip bakterijos ląstelė, mielių ląstelė, vabzdžio ląstelė arba žinduolio ląstelė, transfekuota arba transformuota atitinkamu ekspresijos vektoriumi, o tuo pačiu ir su aukščiau minėtų darinių panaudojimu išradimo moduliatoriams gauti.

Dar kitu požiūriu, šis išradimas susijęs su antikūnais, kurie rišasi su OB polipeptidu. Tokie antikūnai gali būti sukeliami prieš viso ilgio polipeptidą arba prieš jo antigeninius fragmentus. Vienu atžvilgiu, tokie antikūnai inhibuoja funkcinį (t.y. kūno svorio ir riebalų kompozicijos moduliavimo) ob polipeptido aktyvumą. Kitu atžvilgiu, antikūnai gali būti panaudoti cirkuliuojančio ob polipeptido plazmoje arba serume kiekio nustatymui. Dar kitu atžvilgiu, specifinei sričiai antikūnai, ypatingai monokloniniai antikūnai, gali būti naudojami kaip OB polipeptido struktūros zondai.

Visos aukščiau paminėtos medžiagos čia turi būti laikomos kūno svorio ir riebalinės sudėties moduliatoriais, ir, kaip tokios, gali būti naudojamos įvairiomis prasmėmis. Tiksliau, išradime aptariamas tiek diagnostinis, tiek ir terapinis panaudojimas, taip pat tam tikras panaudojimas žemės ūkyje, o taip pat visokios čia apibrėžti} moduliatorių, tiek nukleino rūgšties molekulių, tiek ir peptidų, panaudojimo galimybės. Be to, kūno svorio moduliavimas susijęs su specifine terapine reikšme ir nauda ta prasme, kad būsenos - tiek nutukimaas, tiek, atvirkščiai, kacheksija - yra nepageidautinos kūno būsenos, ir jos gali būti gydomos, skiriant vieną arba daugiau šio išradimo moduliatorių.

Taigi, yra siūlomas žinduolio kūno svorio moduliavimo būdas, kuris apima baltymo, koduojamo nukleino rūgštimi, turinčia nukleotidų seką, pasirinktą iš sekos, prodytos fig. 1A-E (SEQ ID NO:1), sekos, parodytos fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3) ir jų degeneracinių ir alelinių variantų, ekspresijos kontroliavimą. Tokią kontrolę galima realizuoti, įvedant minėtus nukleotidus genų terapijos būdu į paciento arba šeimininko riebalines ląsteles nutukimo sumažinimui arba kontrolei. Atvirkščiai, nukleotidų antagonistų, tokių kaip antiprasminės molekulės, pagaminimas ir skyrimas turėtų būti naudingas ir vykdomas tuo atveju, kai atsiranda ir yra gydomos būsenos, apibūdinamos žymiu svorio praradimu, tokios kaip nervinė anoreksija, vėžys arba AIDS. Tokius darinius reikėti} įvesti, panašiai kaip ir nukleotidus, tiesiogiai į riebalines ląsteles, kad būtų paveikiami tokie pokyčiai.

Atitinkamai baltymai, apibūdinti fig. 1A-E, 3, 5 ir 6 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ir SEQ ID NO:6), jų išlaikyti variantai, jų aktyvūs fragmentai ir giminingos mažos molekulės gali būti įjungtos į kompozicijas terapiniam vartojimui, norint sumažinti arba kontroliuoti perdėtą kūno riebumą arba svorio augimą. Atitinkamai gali būti pagaminti ir panašiai panaudoti antikūnai ir kiti minėtų baltyminių medžiagų, tokių kaip jų fragmentai, antagonistai, norint pasiekti atvirkštinį efektą. Taigi, išradimas pirmiausiai yra skirtas farmacinėms kompozicijoms, į kurias įeina šio išradimo OB polipeptidas, arba, kitu atveju, jo antagonistas, sumaišytas su farmaciškai tinkamu nešikliu arba priedu.

Be to, išradimo OB polipeptidas gali būti vartojamas kosmetiniams tikslams, t.y. pagerinti kūno išvaizdai, sumažinant riebalines sankaupas. OB polipeptidas gali būti vartojamas atskirai arba kartu su kitomis kosmetinėmis priemonėmis tikslui pasiekti, pvz., kosmetine chirurgija.

Šių nukleotidų ir atitinkamų peptidų diagnostinis panaudojimas išsiplečia iki nukleino rūgščių panaudojimo tolimesnių jų alelinių variacijų mutacijų identifikavimui taip, kad išplečiamas aktyvių nukleotidinių medžiagų, naudingų tiek diagnostikoje, tiek ir terapijoje, panaudojimo diapazonas. Atskiru atveju, gali būti nustatomos nagrinėjamų nukleotidų tiek homozigotinės, tiek ir heterozigotinės mutacijos, iš ko galima būtų daryti tikslesnę prielaidą apie pacientų būseną, nustatant individų rizikos faktorių nutukimo prasme. Konkrečiau, dabar yra manoma, kad heterozigotinės mutacijos yra susiję su nedideliu arba vidutiniu nutukimu, tuo tarpu homozigotinės mutacijos yra susiję su labiau išreikšto ir daug didesnio nutukimo būsena. Taigi, gali būti atliekamas DNR testavimas, naudojant aukščiau minėtas atrastas medžiagas, kaip lygio atžymas tikslių ilgalaikių tam tikrų tendencijų prognozių palengvinimui, kad būtų galima rekomenduoti dietos arba kiti} asmeninių įpročių pakeitimus, arba tiesioginį terapinį įsikišimą, norint išvengti tokios būsenos.

Šio išradimo naudingumas diagnostikoje susijęs su šio išradimo moduliatorių buvimo ir kiekio išmatavimo metodais ląstelių mėginiuose arba biologiniuose ekstraktuose (arba mėginiuose), paimtuose iš tiriamųjų subjektų, kuriuose galima įvertinti tiek nukleino rūgščių (genominės DNR arba mRNR) ir/arba baltymo kiekius tokiuose testuojamuose mėginiuose. Laikant, kad padidintas nukleotido aktyvumas ir gaunamo baltymo buvimas atspindi subjekto sugebėjimą slopinti nutukimą, terapeutas, analizuojantis tokius nutukusio subjekto rezultatus, galės nustatyti, kad nutukimo priežastis yra kitoks faktorius, o ne disfunkcija šio išradimo nukleotidų aktyvumo ir buvimo atžvilgiu. Atvirkščiai, sumažinti nukleotido ir/arba ekspresuoto baltymo kiekiai, leisti) manyti, kad jų kiekius reikia didinti, gydant tokias nutukimo būsenas, ir turėti) būti vykdomas atitinkamas terapinis režimas.

Be to, atrasti ir fig. 1A-E ir 2A ir B pateikti nukleotidai, kaip trumpai paminėta aukščiau, tinka atitinkamų RNR kiekio matavimui. Panašiai gali būti pagaminta ir atitinkamai pažymėta rekombinantinio baltymo medžiaga, atitinkanti fig. 1A-E ir 3 parodytus polipeptidus, ir panaudota, pavyzdžiui, radioiimminėje analizėje, norint, pavyzdžiui, išmatuoti riebalų ir/arba OB baltymo kiekius plazmoje, arba nustatymui OB receptoriaus buvimo ir kiekio audiniuose, tokiuose kaip pogumburio audinys.

Dar daugiau, šiame išradime svarstoma ne tik nukleotidų ir čia pateiktų baltymų v

identifikacija, bet ir receptorių tokioms medžiagoms išaiškinimas. Šia prasme fig. 1A-E, 3, 5 ir/arba 6 parodyti polipeptidai gali būti pagaminti ir panaudoti atitinkamos ekspresijos bibliotekos skryningui, norint išskirti aktyvius receptorius. Po to, receptoriai turi būti klonuojami, o po to vienas receptorius arba kartu su ligandu gali būti panaudojamas mažų molekulių, kurios galėtų pasižymėti panašiu į šiuos moduliatorius aktyvumu, skryningui.

Be to, šis išradimas yra susijęs su farmacinėmis kompozicijomis, j kurias įeina kai kurie iš moduliatorių, geriausia polipeptidai, kurių sekos yra pavaizduotos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ir SEQ ID NO:6, jų antikūnai, atitinkamos mažos molekulės, kaip agonistai arba jų antagonistai, arba aktyvūs fragmentai, pagamintomis sudarant tokias receptūras, kurios tinka įvairiems vaisto vartojimo būdams, kai tokia terapija yra reikalinga. Tokios receptūros apima farmaciškai tinkamus nešiklius arba kitokias reikiamas pagalbines medžiagas, ir jos turi turėti efektyvius dozių intervalus, kuriuos kiekvienu atveju turi nustatyti klinicistas arba terapeutas.

Taigi, pagrindinis šio išradimo objektas yra čia aprašomas išgrynintos formos kūno svorio moduliatoriai, kurie turi tam tikras charakteristikas ir aktyvumą, susijusį su žinduolių nutukimo ir riebalų kiekio kontrole ir jų variacijomis.

Kitas šio išradimo objektas yra pateikti čia nurodytų svorio kontrolės moduliatorių nustatymo ir išmatavimo metodus, kaip efektyvios diagnozės ir patologinių būsenų, kuriose tokių moduliatorių kiekio kitimai yra arba gali būti charakteringas bruožas, kontrolės priemones.

Dar kitas šio išradimo objektas yra pateikti metodą ir su juo susijusią test-sistemą medžiagų, tokių kaip vaistai, agentai ir pan., kurie gali būti veiklūs arba imituodami arba inhibuodami moduliatorių pagal išradimą aktyvumą žinduolių atveju, skryningui.

Dar kitas šio išradimo objektas yra pateikti žinduolių gydymo būdą, norint kontroliuoti žinduolių kūno svorį ir riebalų kiekį, ir/arba gydyti tam tikras patologines būsenas, kurių charakteringas bruožas yra nenormalus kūno svorio sumažėjimas arba padidėjimas.

Dar kitas šio išradimo objektas yra paruošti genetinius darinius, skirtus panaudoti genetinėse terapinėse metodikose, ir/arba farmacines kompozicijas palyginamiems terapiniams metodams, kurie apima arba yra paremti vienu arba daugiau moduliatorių, rišančių partnerių arba agentų, kurie gali kontroliuoti jų gaminimąsi, arba kurie imituoja arba slopina jų aktyvumą.

Kiti aspektai ir privalumai paaiškės šios srities specialistams iš toliau duodamo aprašymo apžvalgos, kuri duodama su nuorodomis j žemiau pateiktus iliustracinius brėžinius

Trumpas brėžiniu aprašymas

Fig.l (A-E) parodyta nukleino rūgšties seka (SEQ ID NO:1) ir dedukuota aminorūgščių seka (SEQ ID NO:2), išvesta pelės OB kDNR. Po 39 bazių poros 5’ lyderio eina numatytas 167 aminorūgščių atviro skaitymo rėmelis ir apie 3,7 kb 3’ netransliuota seka. (Anksčiau pateiktoje paraiškoje Ser. Nr. 08/347563, paduotoje 1994 m. lapkričio 30 d. ir Ser. Nr. 08/438431, paduotoje 1995 m. gegužės 10 d., papildoma 58 bazių 5’ nekoduojanti seka, kaip vėliau pasirodė, buvo klonavimo artifaktas. Šis artifaktas neturi reikšmės į kodavimo sritį, 39 bazės 5’ nekoduojančią sritį, dabar pavaizduotą fig. 1, arba 3’ nekoduojančią geno sritį. Parodyta 3’ netransliuotos sekos iš viso apie 2500 bazių porų. Numatytos baltymo sekos analizė iš stebėjimų ir naudojant SigSeą kompiuterinę programą rodo signalinės sekos buvimą (pabraukta). Pastebėtas kDNR mikroheterogeniškumas ta prasme, kad apie 70% kDNR turi glutamino kodoną 49 padėtyje ir 30% - neturi (žr. fig. 5 ir 6 infra). Ši aminorūgštis yra pabraukta, kaip ir arginino kodonas, kuris yra mutuotas C57BL/6J ob/ob pelėse (1J pelėse).

Fig.2 (A ir B) parodyta nukleino rūgšties seka (SEQ ID NO:3), išvesta žmogaus OB kDNR. Nukleotidai sunumeruoti nuo 1 iki 701, pradedant startine vieta prie 46 nukleotido ir baigiant prie 550 nukleotido.

Fig.3 parodyta pilna dedukuota aminorūgščių seka (SEQ ID NO:4), išvesta žmogaus OB genui, atitinkančiam nukleino rūgšties seką, parodytą fig.2A ir B. Aminorūgštys sunumeruotos nuo 1 iki 167. Signalinės sekos pertraukimo vieta yra po 21 aminorūgšties (Ala); taigi subrendęs baltymas prasideda nuo 22 aminorūgšties (Vai) ir tęsiasi iki 167 aminorūgšties (Cys).

Fig.4 duotas palyginimas tarp pelės (SEQ ID NO:2) ir žmogaus (SEQ ID NO:4) dedukuotų aminorūgščių sekų. Žmogaus OB dedukuota aminorūgščių seka yra labai homologiška pelės aminorūgščių sekai. Konservatyvūs pokyčiai pažymėti brūkšneliais, o nekonservatyvūs - žvaigždutėmis. Kintamas glutamino kodonas yra pabrauktas, kaip ir neprasminės mutacijos padėtis C57BL/6J ob/ob (1J) pelėse. Iš viso yra 83% aminorūgščių identiškumo, nors rasti tik astuoni pakeitimai tarp valino prie 22 kodono (signalinės sekos peraugimas betarpiškai žemyn einančia kryptimi) ir cisteino 117 padėtyje.

Fig.5 parodyta pilno ilgio aminorūgščių seka (SEQ ID NO:5), išvesta pelės OB genui, kaip parodyta fig. 3, tik 49 padėtyje nėra glutamino. Aminorūgštys sunumeruotos nuo 1 iki 166. Signalinės sekos skilimo vieta yra po 21 aminorūgšties (Ala) (taigi prieš glutamino 49 deleciją); taigi subrendęs baltymas prasideda nuo 22 aminorūgšties (Vai) ir tęsiasi iki 166 aminorūgšties (Cys).

Fig.6 parodyta pilna dedukuota aminorūgščių seka (SEQ ID NO:6) išvesta žmogaus OB genui, kaip parodyta fig. 4, tik 49 padėtyje nėra glutamino. Aminorūgštys sunumeruotos nuo 1 iki 166. Signalinės sekos skilimo vieta yra po 21 aminorūgšties (Ala) (taigi prieš glutamino 49 deleciją); taigi subrendęs baltymas prasideda nuo 22 aminorūgšties (Vai) ir tęsiasi iki 166 aminorūgšties (Cys).

Fig.7 (A) ob padėties pelių chromosomoje fizikinis žemėlapis, ir YAC ir PI klonavimo žemėlapiai. “M” ir “N” atitinka Midi ir Notl restrikcijos vietas. Skaičiai atitinka individualius gyvuliukus, kurie buvo rekombinantiniai 1606 mejozių, kurios buvo pažymėtos, ob srityje. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl3 ir Cpa atitinka padėtis ob srityje, kuri rišasi su DNR zondais. YAC buvo išskirtos, naudojant D6Rckl3 ir Pax-4 kaip zondus, o galai buvo regeneruoti, naudojant vektorių PCR ir/arba plazmidės galo regeneraciją ir naudojami vėl naujų YAC išskyrimui. (B) Gauta YAC yra sankaupa. Viena iš YAC šioje sankaupoje, Y902A0925, buvo chimerinė. Kiekvienas iš zondų, naudotų rekombinantinių gyvuliukų genotipo nustatymai, yra pažymėti skliausteliuose. (6) atitinka YAC 107 (5) atitinka M16( + ) (arba M16(pLUS)); (4) atitinka adų (+); (3) atitinka aač/(pICL); (2) atitinka 53(pICL); ir (1) atitinka 53(+). (C) PI yra sankaupa bakteriofago PI klonų, išskirtų, naudojant pasirinktus YAC galinius zondus, ob genas buvo išskirtas PI klone, išskirtame naudojant YAC YB6S2F12 periferinį galą (galą (4)) (kitaip dar vadinamą adu( + )).

Fig. 8 parodyta 192 nepriklausomų izoliatų iš ketvirtojo egzono sulaikymo bandymo, kurie buvo PCR amplifikuoti ir charakterizuoti, nudažymo etidžio bromidu fotografija.

Fig. 9 yra PCR-amplifikuotų klonų, kuriuose įtariama, kad yra ob, nudažymo etidžio bromidu fotografija. Kiekvienas iš 7 klonų, kuris nėra artifaktas, reamplifikuotas, naudojant PCR, atlikta jų elektroforezė ant 1% agarozės gelio TBE, ir nudažyti etidžio bromidu. Dydžio žymekliai (tolimiausias kairysis nenumeruotas takelis) yra komerciškai gaunamos “1 kb kopėtėlės”. 1 takelis - klonas 1D12, turintis “HIV” seką, 2 takelis - klonas 1F1, naujas klonas už ob srities, 3 takelis - klonas 1H3, 4 takelis - klonas 2B2, identiškas 1F1, 5 takelis - klonas 2G7, kuris turi ob egzoną, 6 takelis - klonas 2G11, kuris yra identiškas 1F1, 7 takelis - klonas 2H1, kuris neturi intarpo.

Fig. 10 duota 2G7 klono seka (SEQ ID NO:7), į kuria įeina egzonas, koduojantis dalį OB geno. Pradmens sekos, naudojamos šio egzono amplifikacijai, figūroje yra apibrėžtos stačiakampiu (SEQ ID NO:8 ir 9).

Fig. 11 (A) mRNR iš tos pačios pelės skirtingų audinių atvirkštinė transkripcinė PCR analizė su 267 pradmenimis ir aktino pradmenimis. RT-PCR reakcijos buvo atliktos, naudojant 100 ng bendro RNR reverso, transkribuoto oligo dT kaip pradmeniu pirmos kDNR grandinės sintezei. PCR amplifikacija buvo vykdoma 35 ciklus, atliekant 94° denatūraciją Γ; 55° hibridizaciją Γ ir 72° pailginimą 2’, esant 1’ antrajam pailginimui per ciklą. RT-PCR produktai išskirstyti 2% žemos lydymosi temperatūros agarozės geliuose ΙχΤΒΕ buferyje. (B) mRNR iš įvairių pelės organų notherno blotingas, naudojant PCR žymėtą 267 kaip zondą. Vykdoma 10 pg bendros RNR iš kiekvieno audinio elektroforezė ant agarozės gelio su formaldehidu. Mėginys hibridizuojamas 65° temperatūroje Rapid Hybe (Amersham) aparate. Autoradiografiniai signalai pasirodo po 1 h ekspozicijos; parodyti eksperimentai yra 24 h ekspozicijos rezultatai.

Fig.12 (A) RT-PCR reakcijos su riebalinėmis ląstelėmis (baltasis adipozinis audinys) RNR iš įvairių išvardintų pelių linijų nudažymo etidžio bromidu vaizdas. Bendroji RNR (100 ng) kiekvienam mėginiui buvo atvirkščiai transkribuota, naudojant oligo dT ir atvirkštinę transkriptazę, ir susidariusi viengrandininė kDNR buvo PCR amplifikuota su 267 pradmenimis (apatinės juostos) arba aktino pradmenimis (viršutinės juostos). Ir 267, ir aktino pradmenys dalyvavo toje pačioje PCR reakcijoje. Produktai perleisti per 1% agarozės TBE gelį. (B) Northerno analizė atitinkanti (A). Išskirta 10 gg riebalinių ląstelių (baltojo adipozinio audinio) RNR iš kiekvienos nurodytos linijos ir zonduota su PCR žymėtu 267 zondu, kaip aukščiau nurodyta fig. 11 B. Rastas maždaug 20 kartų 267 mRNR padidėjimas baltojo riebalo RNR iš C57BL/6J ob/ob (1J) linijos, lyginant su liesomis tokiomis pačiomis linijomis. Ir RT-PCR, ir notherno eksperimentuose nėra pastebimo 267 RNR signalo iš SM/Ckc-F^ob²¹/ob²¹ (2J) pelių net ir po dviejų savaičių ekspozicijos. Parodyta 24 h autoradiografinė ekspozicija. Tas pats filtras hibridizuotas su aktino zondu (apatinė figūros dalis).

Fig· B yra papildomų 2J gyvuliukų ir kontrolinių gyvuliukų notherno analizė, kuri patvirtina ob RNR 2J iš gyvuliukų nebuvimą. Notherno analizė atlikta taip, kaip nurodyta fig. 11 ir 12. Šiuo atveju kontrolinė RNR buvo ap2 specifinis transkriptas riebalams. Nėra pastebimo ap2 juostų tankio kitimo.

Fig. 14 palyginama C57BL/6J (normalių) ir C57BF/6J ob/ob (1 J) pelių DNR seka taškinės mutacijos srityje, kurioje atsiranda įterptas priešsubrendęs stop-kodonas (neprasminė mutacija) mutantinės linijos kDNR. ob/ob pelės turi C-»T mutaciją, kurioje yra pakeista arginino liekana 105 padėtyje. Šis bazės pakeitimas parodytas automatizuoto DNR sekų analizatoriaus duodamoje kreivėje. RT-PCR atlikta naudojant baltojo riebalo RNR iš abiejų linijų (+/+ ir ob/ob), naudojant pradmenis iš 5’ ir 3’ netransliuotų sričių. PCR reakcijos produktai valyti, naudojant gelį, ir tiesiogiai sekvenuoti rankiniu būdu, bei naudojant Applied Biosystems, Ine. 373a automatinį sekų analizatorių su pradmenimis išilgai abiejų koduojančių sekų grandinių.

Fig. 15 (A) Genominės DNR iš kiekvienos išvardintos pelės linijos southerno blotingas. Apie 5 μg DNR (išvestos iš genominės DNR, gautos iš kepenų, inkstų arba blužnies) suskaldyta nurodytu restrikcijos fermentu. Tada atlikta DNR elektroforezė 1% agarozės TBE gelyje ir analizuota su PCR žymėtu 267. Restrikcinis skaldymas su Rg/II parodė Bgii\ fragmento SM/Ckc-+ ^Όάζο^/ob²¹ (2J) DNR dydžio padidėjimą apie 9 kb (didžiausias). RFLP negalima nustatyti su kitais restrikcijos fermentais. Preliminarus genominės DNR restrikcijos žemėlapis rodo, kad polimorfinė Bg/11 vieta yra 7 kb prieš transkripcijos starto vietą. Nė vienas iš bandytų fermentų nesitęsia toliau mRNR starto vietos. (B) Bg/11 polimorfizmo segregacija SM/Ckc-+ ^Oacob^2J/ob^2J linijoje. Nustatyti genotipai šešių nutukusių ir penkių liesų progeninių formų toje pačioje koizogeninės

SM/Ckc-+^Daco//^ylok? (2J) kolonijoje, nustatant Bgfll polimorfizmą, kaip parodyta (A).

Visi fenotipiškai nutukę gyvuliukai buvo homozigotiniai didžiąjam aleliniam polimorfiniam Bgfll fragmentui. DNR “kontroliniame” takelyje buvo pagaminta iš negiminingos SM/Ckc- + ^Dac+/+ pelės, išaugintos atskirai nuo SM/Ckc-^^ob^fob²⁷kolonijos.

Fig. 16 yra EcoRI suskaldytos genominės DNR iš išvadinti} rūšių southerno blotingas, naudojant OB kDNR kaip zondą (t.y. zoo-blotą). Kiekvieno stuburinio mėginyje matomi hibridizacijos signalai, net ir po vidutinio stiprumo hibridizacijos. Katės DNR šiame eksperimente buvo šiek tiek degraduota. Suskaldyta DNR buvo perleidžiama per 1% agarozės TBE gelį ir perkelta į imobiloninę membraną zondavimui. Filtras hibridizuotas 65° temperatūroje, plaunamas 2xSSC/0.2% SDS 65° temperatūroje du kartus po 20 min. ir eksponuojamas tris dienas, naudojant Kodak (Rochester, N. Y.) XOMAT filmą.

Fig.17 parodyta vektoriaus pET-15b (Novagen) ekspresijos klonavimo sritis (SEQ ID NOS:11 ir 12).

Fig. 18 parodyta rekombinantinio subrendusio pelės ob suliejimo su His-tag (A) ir subrendusio žmogaus His-tag (B) eliuato iš His-rišančios dervos (Ni) analizė. Bakterijos buvo transformuotos pETM9 ir pETH14 vektoriais. Indukavus 1 mM IPTG optimaliose sąlygose, transformuotos bakterijos galėjo produkuoti 100-300 Mg/ml OB sulieto baltymo pirmiausia inkliuzijos kūneliuose. Inkliuzijos kūneliai soliubilizuoti 6 M guanidino-HCl arba šlapalu, o sulietas baltymas (esantis lizavimo nuopile) buvo supiltas į His-rišančios dervos (Ni) kolonėlę 10-je mJ lxrišančiame buferyje su šlapalu. Kolonėlė laipsniškai plaunama 20 μΜ, 60 μΜ ir 300 μΜ imidazolo 5 ml porcijomis, ir gale - desorbuojančiu buferiu. Porcijos buvo analizuojamos, norint nustatyti, ar yra OB sulietas polipeptidas, naudojant 15% akrilamido gelį. Kiekviename takelyje buvo 100 μΐ bakterinio ekstrakto ekvivalentas.

Fig.19 (A) OB RNR transliacija in vitro. Žmogaus OB kDNR buvo subklonuota į pGEM vektorių. Plazmidė buvo linearizuota, o RNR plius-grandinė buvo sintezuota, naudojant Sp6 polimerazę. Sintezuota in vitro RNR buvo transliuota, esant arba nesant kanino pankreatinėms mikrosominėms membranoms. Apie 16 kD pirminės transliacijos produktas buvo matomas po in vitro transliacijos. Pridėjus mikrosominių membranų į reakciją, pasirodo antrasis transliacijos produktas, kuris yra apie 2 kD mažesnis negu pirminės transliacijos produktas. Interleukino-ΐα RNR transliacijos produkto, kuriame nėra koduojančios signalinės sekos, dydis nepasikeitė, pridėjus mikrosominių membranų. Šie duomenys rodo, kad yra funkcinė signalinė seka. (B) In vitro transliacija, esant arba nesant proteinkinazei K. Apdorojimas proteaze davė pilną 18 kD transliacijos produkto proteolizę, tuo tarpu 16 kD apdorota forma išliko nepakitusi. Mikrosomos pralaidumo padidinimas su 0.1% TRITON-X100 apdorotą formą padaro jautrią proteazei. Šie rezultatai rodo, kad produktas transliuojamas j mikrosomos ertmę.

Fig. 20 (A-E) Žmogaus OB geno seka (SEQ ID Nos:22-24). (F) Pelės OB geno scheminė diagrama. (G) Žmogaus OB geno scheminė diagrama. (F) ir (G) startinis ir stop-kodonai pabraukti. Nėra įrodymo, kad žmogaus gene pirmasis intronas yra homologiškas pelės pirmąjam intronui, bet negalima teigti, kad jis neegzistuoja.

Fig. 21 duotas vienos iš klonavimo strategijų, naudotų rekombinantinei OB ekspresijai Pichia mielėse gauti, scheminis brėžinys. (A) OB ekspresijos vektorius su apersidengimo faktoriaus signaline seka. (B) Rekombinantinio sulieto baltymo, įskaitant aminorūgščių seką (SEQ ID NO:24), struktūros scheminis brėžinys, rodantis Xhol vietą ir numatomas ΚΕΧ-2 ir STE-13 skaldymo vietas bei N-galines perteklines aminorugštis, esančias po ΚΕΧ-2 skaldymo (SEQ ID NO:27). (C) Subrendusio OB gavimo alternatyvi strategija apima gavimą produkto su aminorūgščių seka, atitinkančią Xhol skaldymo vietą ir ΚΕΧ-2 skaldymo vietą, einančią betarpiškai subrendusio ob polipeptido sekos (SEQ ID NO:28) kryptimi.

Fig. 22 Alternatyvi ekspresijos strategija Pichia. (A) OB suliejimo su His-tag ekspresijos vektorius, pritaikytas iš pET ekspresijos sistemos, kontroliuojant apersidengimo faktoriaus signalinę seką (SEQ ID NO:33). (B) Rekombinantinio OB sulieto baltymo, turinčio His-tag, kuriame yra α-persidengimo faktoriaus signalinė seka, ΚΕΧ-2 ir STE skaldymo vietos, His-tag ir trombino skaldymo vietos, kurios turi duoti OB su trimis perteklinių N-galinių aminorūgščių liekanomis, struktūros scheminis brėžinys..

Fig. 23 (A) Pelės OB (abi mikroheterogeninės formos, t.y. turinčios ir neturinčios Gln 49) ekspresijos PAGE analizė transformuotose Pichia mielėse. Transformuotų mielių kultūrų skystyje matoma laukiama apie 16 kD juosta (antrasis ir trečiasis takeliai), bet nematoma heterotransformuotų mielių kultūrų skystyje (pirmasis takelis). (B) Dalinai išvalyto karboksimetilceliulioze rekombinantinio OB PAGE analizė. Apie 16 kD juosta labai gerai matoma išėjusiose iš kolonėlės 3 ir 4-je frakcijose; eliucija buvo vykdoma 250 mM NaCl. 1 takelis - įdėtas mėginys, 2 takelis - pilnas išplovimas; 3-5 takeliai - frakcijos, eliuuotos 250 mM NaCl.

Fig. 24 rodo, kad OB baltymas cirkuliuoja pelės plazmoje. (A) Imunonuosėdos iš pelės kraujo. 0,5 ml pelės plazmos preliminariai nuskaidrinta nekonjuguota sefaroze ir inkubuota per naktį su imunoišvalytais anti-OB antikūnais, konjuguotais su sefarozės 4B rutuliukais. Imunonuosėdos atskirtos, panaudojant 15% SDS-PAGE gelį, perkeltos ir atliktas vesterno blotingas su anti-OB antikūnu. Baltymas, turintis apie 16 kD molekulinį svorį, migravo į tą pačią vietą, kaip ir subrendęs pelės ob baltymas., ekspresuotas mielėse. Baltymo nebuvo C57BL/6J obtob pelių plazmoje, o jo kiekis padidėjo dešimt kartų C57BLB/K.S db/db pelių plazmoje, lyginant su laukinio tipo pelėmis. Laikoma, kad db pelėse vyksta padidintas OB baltymo pasigaminimas. (B) Padidinti OB kiekiai riebiose žiurkėse. Riebi žiurkė yra nutukusi dėl pradingusios mutacijos žiurkės 5 chromosomoje. Genetiniai duomenys leidžia manyti, kad yra defektas tame pačiame gene, mutuotame db pelėse. Buvo imunonusodinta riebių pelių ir jų liesų partnerių plazma ir atlikti vesterno blotingai. Mutantinių gyvuliukų atveju matomas 20 kartų padidintas cirkuliuojančio OB kiekis. (C) OB baltymo kiekio nustatymas pelės plazmoje. Į ob pelių plazmą pridedama vis didėjantys kiekiai rekombinantinio pelės baltymo iki 100 λ ir imunonusodinama. Vesterno blotingo signalų intensyvumai palyginti su 100 λ laukinio tipo pelių intensyvumais. Didėjant rekombinantinio baltymo kiekiui, matomas tiesinis signalo intensyvumo didėjimas, kas rodo, kad imunonusodinimas buvo atliktas, esant antikūno pertekliui. Panašūs signalai matomi laukinio tipo plazmos mėginiuose, o mėginys su 2 ng rekombinantinio baltymo rodo, kad pelės plazmoje cirkuliuojantis kiekis yra apie 20 ng/ml. (D) OB baltymas adipozinio audinio ekstraktuose. Pelės adipozinio audinio citoplazmos ekstraktai buvo pagaminti iš db ir laukinio tipo pelių. Vesterno blotingas rodo, kad ekstraktuose, gautuose iš db pelių, yra padidinti 16 kD baltymo kiekiai.

Fig. 25 rodo, kad žmogaus plazmoje cirkuliuoja įvairūs OB baltymo kiekiai. (A) Žmogaus plazmos vesterno blotingas. Plazmos mėginiai gauti iš šešių liesų savanorių. Imunonusodinimas ir vesterno blotingas rodo, kad yra imunoreaktingas 16 kD baltymas, kurio dydis yra identiškas rekombinantiniam 146 aminorūgščių žmogaus baltymui, ekspresuotam mielėse. Kiekviename iš šešių mėginių matomi skirtingi baltymo kiekiai. (B) Žmogaus ob ELISA. Mikrotitrų plokštelės buvo padengtos anti-žmogaus imunoišgrynintais OB antikūnais. Į plokšteles įdėti žinomi rekombinantinio baltymo kiekiai ir detektuota, naudojant imunoišgrynintus, biotinu paveiktus anti-ob antikūnus. Standartinei kreivei gauti braižoma optinio tankio priklausomybė nuo žinomų OB koncentracijų, esant 414 nm. Gauta standartinė kreivė rodo, kad bandyme galima detektuoti 1 ng/ml arba daugiau žmogaus OB baltymo. (C) OB baltymo kiekio nustatymas žmogaus plazmoje. ELISA imunotyrimas atliktas, naudojant 100 λ plazmos iš šešių liesų savanorių, ir standartai panaudoti B panelyje. Matomi OB baltymo kiekiai yra nuo 2 ng/ml HP1 atveju ir 15 ng/ml HP6 atveju. Šie duomenys koreliuoti su vesterno blotingo duomenimis A panelyje.

Fig. 26 rodo, kad OB baltymas sudaro inter- ir intramolekulinius disulfidinius ryšius. (A) Vesterno blotingas redukuojančiose ir neredukuojančiose sąlygose. Pakartoti pelės ir žmogaus vesterno blotingai, pridėjus ir nepridėjus į mėginio buferį redukcijos agentų. Kai mėginio buferyje nėra β-merkaptoetanolio, db plazmos imunonuosėdos migruoja, esant 16 kD ir32 kD molekulinėms masėms. Pridėjus į buferį βmerkaptoetanolio, 32 kD medžiaga išnyksta (žr. fig. 24). Šis rezultatas pasikartoja, kai pelės baltymas yra ekspresuotas mielėse (Pichia pastoris). Šiuo atveju pelės OB baltymas migruoja į dimero padėtį. Kai yra redukuojančios medžiagos, išvalytas rekombinantinis pelės baltymas migruoja, esant 16 kD apytikrei molekulinei masei, kas rodo, kad 32 kD molekulinė forma yra vienos arba dviejų intermolekulinių disulfidinių ryšių rezultatas. Žmogaus baltymas ekspresuotas in vivo ir Pichia pastoris migruoja, esant 16 kD molekulinei masei tiek redukcinėse, tiek oksidacinėse sąlygose (duomenys neparodyti). (B) Žmogaus baltymas ekspresuotas mielėse turi intramolekulinį disulfidinį ryšį. Sekretuoti baltymai paprastai turi teisingą konformaciją, kai jie ekspresuojami Pichia pastoris ekspresijos sistemoje. Subrendęs žmogaus baltymas iš 146 aminorūgščių buvo ekspresuotas Picia pastoris ir išskirtas iš mielių terpės, naudojant dviejų stadijų gryninimo metodiką, apimančią IMAC ir gel-filtraciją. Išvalytas baltymas analizuotas masių spektrometruos metodu prieš ir po skaldymo bromcianu. Bromcianas skaldo prie metionino liekanos karboksi-galo. Rekombinantinio pelių baltymo molekulinė masė buvo 16024±3 Da (išskaičiuota molekulinė masė= 16024 Da). Bromcianas skaldo baltymą prie trijų metioninų baltymo sekoje prie 75, 89 ir 157 aminorūgščių. Bromciano fragmentas, turintis išmatuotą 8435.6 Da masę atitinka 90-157 ir 158-167 aminorūgštis, sujungtas disulfidiniu ryšiu tarp cys-117 ir cys-167 (išskaičiuota molekulinė masė=8434.5 Da). N.D.= nenustatyta.

Fig. 27 vaizduoja bioaktyvaus rekombinantinio baltymo gavimą. Nukleotidų seka, atitinkanti 145 aminorūgščių subrendusį pelės OB baltymą, buvo klonuota į pET 15b ekspresijos vektorių. Šis pET vektorius įterpia polihistidino traktą (His-tag) klonuotos sekos kryptimi, kas leidžia atlikti efektyvi} gryninimą naudojant imobilizacinę metalų afininę chromatografiją (IMAC). Iš pradžių rekombinantinis bakterinis baltymas paskirstomas netirpioje membraninėje frakcijoje po bakterijų Ūžavimo. Membraninė frakcija soliubilizuojama, panaudojant guanidino hidrochloridą, ir užpilama ant IMAC kolonėlės. Baltymas laipsniškai eliuuojamas vis didinant imidazolo koncentraciją, kaip parodyta figūroje. Eliuuotas baltymas renatūruojamas, ir veikiamas trombinu, kad būtų pašalinamas His-tag, kaip aprašyta žemiau. Galutinė tirpaus baltymo išeiga buvo 45 ng/ml bakterinės kultūros.

Fig. 28 rodo OB baltymo biologinius efektus. Maisto sunaudojimo (A-C paneliai) ir kūno svorio (D-F paneliai) priklausomybė nuo laiko. Dešimties gyvuliukų grupės gavo OB baltymo, kurio dozė buvo 5 mg/kg/per dieną (užtušuoti kvadratėliai), kasdienines PBS injekcijas (užtušuoti skrituliukai) arba negavo preparato (užtušuoti trikampiai). Bandomosios grupės buvo C57B1/6J ob/ob pelės (A ir D paneliai), C57B1/Ks dbldb pelės (B ir E paneliai) ir CBA/J+/+ pelės (C ir F paneliai). Pelių maisto sunaudojimas buvo matuojamas kasdien, o kūno svoris nustatomas kas trys-keturios dienos, kaip nurodyta figūroje. (Kūno svorio skalė gramais buvo skirtinga laukinio tipo pelėms, lyginant su ob ir db pelėmis), ob pelių, gavusių baltymą, maisto sunaudojimas sumažėjo po pirmosios injekcijos ir stabilizavosi po keturių dienų, esant apie 40% kiekiui, imant nuo netikrų injekcijų grupės (p<0.001). Šių gyvuliukų kūno svoris sumažėjo vidutiniškai 1,3 gramų/per dieną ir stabilizavosi po trijų savaičių, esant apie 60% nuo pradinio svorio (p<0,0001). db pelėms baltymo efekto nepastebėta. Nedideli, tačiau reikšmingi kūno svorio efektai pastebėti CBA/J pelėms dviejuose pirmuosiuose taškuose (p<0,02). Kiekvieno matavimo standartinė paklaida pavaizduota brūkšniu, o statistinis šių rezultatų reikšmingumas parodytas 1 lentelėje.

Fig. 29 rodo ob pelių porinio maitinimo rezultatus. (A) keturių C57B1/6J ob/ob pelių grupė buvo maitinama, duodant maisto kiekį, lygų kiekiui, sunaudotam grupės ob pelių, gavusių rekombinantinio baltymo. Abiejų grupių svorio sumažėjimas buvo skaičiuojamas po 5, 6 ir 12 dienų. Pelės, kurioms buvo apribotas maistas (užštrichuoti stačiakampiai), prarado mažiau svorio, negu ob pelės, gavusios baltymo (užtušuoti stačiakampiai) (p<0,02). Šie rezultatai rodo, kad OB baltymo svorį mažinantis efektas yra efektas tiek į maisto, tiek ir į energijos sąnaudas. (B) Paveiktos ob pelės fotografija. Parodytos dvi C57B1/6J ob/ob pelės. Kairioji pelė gavo PBS ir svėrė 65 gramus. Dešinioji pelė gavo rekombinantinio OB baltymo kasdienes injekcijas. Pradinis šio gyvuliuko svoris taip pat buvo 65 gramai, o svoris po trijų savaičių poveikio baltymu buvo 38 gramai. (C) Paveiktų ir nepaveiktų baltymu C57B1/6J ob/ob pelių kepenys. Pelės, gavusios PBS, kepenys buvo didelės ir riebios ir svėrė 5,04 gramo. Pelės, gavusios rekombinantinio ob baltymo, kepenų išvaizda normali ir jos svėrė 2,23 gramo.

Fig. 30 rodo ob adipozinio audinio hibridizaciją in situ. Prasminė ir antiprasminė ob RNR pažymėta in vitro, naudojant Sp6 ir T7 polimerazę ir digoksigeniną. Pažymėtos RNR buvo hibridizuojamos su imobilizuotomis parafine adipizinio audinio iš astuonių savaičių amžiaus C57B1/Ks pelių (pažymėtų laukinis tipas) ir C57B1/Ks db/db pelių (pažymėtų db) antsėklidžio išpjovomis. Figūroje parodyta, kad pasirodo lipidų lašeliai kaip nenudažytos vakuolės ląstelių viduje. Citoplazma yra plonas apvadas ląstelių periferijoje ir nesiskiria nuo ląstelės membranos. Hibridizacija su visais adipocitais šioje srityje buvo nustatyta laukinio tipo pjūviuose tik naudojant antiprasminį zondą ir matomi labai padidinti kiekiai audinio iš db/db gyvuliukų audinio pjūviuose.

Fig. 31 rodo, kad OB RNR yra ekspresuojama adipocituose in vivo ir in vitro. Atlikta visos RNR (10 mikrogramų) iš keleto įvairių šaltinių blotuotų ir hibridizuotų su ob zondų elektroforezė. Pirmiausia, adipocitų gryninimui panaudoti ląstelių plaukiamumo skirtumai po skaldymo kolagenaze. OB RNR buvo tik adipocitų frakcijoje. S takelis rodo stromovaskuliarinę frakciją, o A - adipocitų frakciją. Be to, OB RNR neekspresuojama nediferencijuotų 3T3-442 preadipocitų ląstelių (U takelis). Diferencijuoti adipocitai iš šių ląstelių linijų ekspresuoja aiškiai nustatomus OB mRNR kiekius (D takelis).

Fig. 32 rodo, kad OB RNR yra ekspresuojama visose adipozinio audinio sankaupose. Visos tirtos adipozinio audinio sankaupos ekspresavo ob RNR. Kirkšnies riebalinis audinys ekspresavo šiek tiek mažesnius RNR kiekius, nors buvo signalų lygių skirtumai įvairiuose eksperimentuose. (Fig. 31A) 1 takelis - antsėklidžio, 2 - kirkšnies, 3 pilvo, 4 - priegimdžio riebaliniai audiniai. Rudieji riebalai taip pat ekspresavo nedidelius OB RNR kiekius. (Fig. 31B) OB ekspresijos kiekiai ruduosiuose riebaluose buvo nepakitę gyvuliukų, laikyti} 4 °C temperatūroje vieną savaitę, atveju, nors rudiems riebalams specifinės UCP RNR, žinomos, kad ją sukelia šaltis, kiekis padidėjo penkis kartus.

Fig. 33 atvaizduota OB RNR ekspresija db/db ir aukso tiogliukoze apdorotose pelėse. Atlikta bendros RNR iš aukso tiogliukoze (GTG) apdoroti} pelių ir db/db pelių priegimdžio riebalinio audinio elektroforezė ir northerno blotingas. Yra žinoma, kad apdorojus vienkartine GTG doze, sukeliamas nutukimas, indukuojant specifinius pagumburio pakenkimus. (A) Vieno mėnesio amžiaus CBA žiurkių patelės buvo paveiktos GTG (0,2 mg/g) ir gaunamas >20g apdoroti} gyvuliukų svorio padidėjimas, lyginant su kontroliniais gyvuliukais (<5g). (B) OB mėginio su RNR iš db/db ir GTG apdorotų pelių hibridizacija rodo 20 karti} ob RNR kiekio padidėjimą, lyginant su kontroline RNR (aktinas arba GAPDH).

Fig. 34 vaizduoja žmogaus RNR northerno blotingo analizę. Northerno blotai, turintys 10 mg bendrosios RNR iš žmogaus adipozinio audinio (FAT, A panelis) ir 2 mg poliA+RNR iš kitų žmogaus audinių (B panelis) hibridizuoti su žmogaus ob arba žmogaus β-aktino zondais, kaip nurodyta figūroje. Matomas intensyvus signalas širdies (HE) ir placentos (PL) atveju, tačiau OB RNR nerasta smegenyse (BR), plaučiuose (LU), kepenyse (LI), skeletiniuose raumenyse (SM), inkstuose (Kl) ir kasoje (PA). Kiekvienu atveju nurodyta autoradiografinės ekspozicijos trukmė.

Fig. 35 vaizduoja YAC sankaupą, turinčią žmogaus OB geną ir 8 mikrosatelitinius markerius. Atvaizduota YAC paremta turinčio žmogaus OB geno STS kiekio 7 chromosomos žemėlapis, gautas panaudojant SEGMAP/version 3.29 [Green et ai., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)]. Viršuje išvardinti 19 vienodai išdėstyti STS (žr. 3 lentelę). 8 mikrosatelitams specifiški STS pažymėti žvaigždutėmis (žr. 4 lentelę). Taip pat parodyti STS, atitinkantys Pax4 ir OB genams, o taip pat numatytos centromero (CEN) ir 7q telomero (TEL) padėtys sankaupos atžvilgiu. Kiekvienas iš 43 YAC kloni) pažymėtas horizontaliu brūkšniu, kurio pavadinimas duotas kairėje, o įvertintas YAC dydis (kb, išmatuotas pulsuojančio lauko gel-elektroforezės būdu) duotas skliausteliuose. STS buvimas YAC pažymėtas užtušuotu ratuku atitinkamoje padėtyje. Jei STS atitinka įterptą YAC galą, apie atitinkamą ratuką nubraižytas kvadratas tiek viršuje (prie STS pavadinimo), tiek ir YAC, iš kurio jis buvo išvestas, gale. Penkių YAC apačioje (žemiau horizontalios punktyrinės linijos) vieno arba daugiau STS, kurių buvimo tikėtasi (remiantis nustatyta STS eile), nebuvo rasta (tai buvo nustatyta, testuojant atskiras YAC su atitinkamais STS specifiniais PCR bandymais mažiausiai du kartus), ir jie pažymėti neužtušuotais ratukais atitinkamose padėtyse. Dauguma YAC buvo išskirta iš bibliotekos, išvestos iš žmogaus-žiurkėno hibridinių ląstelių [Green et ai., Genomics, 25:170-183 (1995)]; nurodyti jų pradiniai pavadinimai. Likusios YAC buvo išskirtos iš bendrų žmogaus genomo bibliotekų, ir jų padėtys pradinėje bibliotekoje duotos 3 lentelėje. Trijų YAC, kurio buvo rastos panaudojant FISH analizę, 7q31.3 žemėlapio nustatymui, pavadinimai apibrėžti keturkampiais (yWSS691, yWSS999 ir yWSS2935). Sankaupa parodyta “neišskaičiuotoje” formoje, kur YAC dydžiai nepanaudoti klonų persiklojimo arba STS atstumų įvertinimui, ir todėl parodyti atstumai yra vienodi. “Išskaičiuotoje” formoje, kurioje santykinių atstumų, skiriančių kiekvieną gretimų STS porą, įvertinimui panaudoti YAC dydžiai, o taip pat ir klonų persiklojimo dydis, bendra YAC sankaupa apima net daugiau nei 2 Mb.

SMULKUS IŠRADIMO APRAŠYMAS

Šis išradimas yra susijęs su baltymo, čia vadinamo ob polipeptidų arba leptinu, bei nukleino rūgščių, koduojančių baltymą, įskaitant jų degeneracines variacijas, pvz., kurios įterpia optimalius ekspresijos kodonus į atitinkamą ekspresijos sistemą, išaiškinimu ir atradimu; šis baltymas rodo sugebėjimą dalyvauti žinduolio kūno svorio kontrolėje. Išradimo nukleino rūgštys atstovauja koduojančias sekas, atitinkančias pelės ir žmogaus OB polipeptidą, kuris, kaip manoma, vaidina esminį vaidmenį kūno svorio ir nutukimo reguliavime. Čia pateikti duomenys rodo, kad išradimo nukleino rūgščių polipeptidinį produktą išskiria ląstelės, kurios jį ekspresuoja, ir, kad polipeptidas funkcionuoja kaip hormonas. Papildomi eksperimentiniai duomenys rodo, kad OB polipeptidas yra labai efektyvus, gydant pelių, turinčių ob geno mutaciją, nutukimą. Be to, didelės OB polipeptido porcijinės dozės arba vidutinės tęstinės dozės veikia į normalių (laukinio tipo) pelių svorio sumažėjimą.

Be to, čia pateikti pavyzdžiai rodo, kad OB polipeptidas, kitaip čia vadinamas “leptinu”, cirkuliuoja pelės, žiurkės ir žmogaus plazmoje. Leptino nėra ob/ob pelių plazmoje, db/db pelių plazmoje jo koncentracija yra dešimt kartų didesnė, o fa/fa žiurkių plazmoje - dvidešimt karti} didesnė. Ypatingai svarbu, kad rekombinantinio leptino kasdienės injekcijos drastiškai mažina ob/ob pelių kūno masę, pastebimai veikia laukinio tipo pelių kūno svorį ir neturi įtakos db/db pelėms.

Dar kitu požiūriu, vienų rūšių OB polipeptidas yra biologiškai aktyvus kitose rūšyse. Ypatingai žmogaus OB polipeptidas yra aktyvus pelėse.

Pirmiausiai šis išradimas yra skirtas medžiagų, kurios funkcionuoja kaip žinduolių kūno svorio moduliatoriai, identifikavimui. Šis išradimas yra susijęs su tam tikrų nukleino rūgščių, kurios atitinka OB geną arba jo koduojančią sritį tiek pelėse, tiek ir žmonėse, išskyrimu, išvalymu ir sekų nustatymu, o taip pat ir su atitinkamais polipeptidais, kuriuos ekspresuoja šios nukleino rūgštys. Taigi, šis išradimas apima atradimą nukleino rūgščių, kurios duotos fig. 1A-E (SEQ ID NO:1) ir fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3), jų degeneracinių variantų, alelių ir fragmentų, kurie visi pasižymi kūno svorio ir nutukimo moduliacijos aktyvumu. Šių nukleino rūgščių atitikimas OB genui pranašauja jų didelę įtaką į būsenas, tokias kaip nutukimas, o taip pat ir į kitas ligas ir disfuncijas, kuriose nenormalus kūno svoris yra duodantis įnašą faktorius. Išradimas išsiplečia iki baltymų, kuriuos ekspresuoja išradimo nukleino rūgštys, ypatingai iki tokių baltymų, kurie pavaizduoti fig. 1A-E (SEQ ID NO:2), fig. 3 (SEQ ID NO:4), fig. 5 (SEQ ID NO:5) ir fig. 6 (SEQ ID NO:6), o taip pat išsaugotų variantų, aktyvių fragmentų ir giminingų maži} molekulių.

Kaip buvo minėta anksčiau, svorio kontrolės moduliaciniai peptidai, jų rišantys partneriai arba kiti ligandai bei agentai, pasižymintys jų imitavimu arba antagonizmu jiems, arba kontroliuojantys jų gaminimąsi, gali būti paruošiami farmacinių kompozicijų pavidalu kartu su tinkamu nešikliu, turinčių pakankamą efektyvumą, kad jas būtų galima vartoti įvairiais būdais pacientų, kurie pasižymi nenormaliais kūno svorio nukrypimais arba yra nutukę, kai šie nukrypimai yra atskiri arba jie sudaro dalį nepalankių medicininių būsenų, tokių kaip vėžys arba AIDS, gydymui. Gali būti panaudoti įvairūs vaistų vartojimo būdai, įskaitant oralinį, nazalinį ir kitus transmukozinio vartojimo būdus, parenterines metodikas, tokias kaip subkutanines, intraveninės ir intraperitoninės injekcijos, kateterius ir pan. Atpažinimo faktorių arba jų subvienetų vidutiniai kiekiai gali kisti, konkrečiu atveju jie turi priklausyti nuo kvalifikuoto gydytojo arba veterinoriaus rekomendacijų ir nurodymų.

Išeinant iš to, kas aprašyta aukščiau, gali būti pagaminta test-sistema, skirta potencialių vaistų, galinčių imituoti arba antagonizuoti svorio moduliatorių aktyvumą, skryningui. Svorio moduliatorius gali būti įvestas į test-sistemą, o laukiamas vaistas gali būti taip pat įvestas į gaunamą ląstelių kultūrą, ir po to ši kultūra yra tiriama, stebint ar yra ląstelių aktyvumo pakitimai, atsiradę arba dėl to, kad buvo pridėtas vien tik laukiamas vaistas, arba dėl to, kad buvo pridėti žinomo svorio moduliatoriaus tam tikri kiekiai.

Kaip anksčiau minėta, čia aprašyto OB geno molekulinis klonavimas leido identifikuoti klasę medžiagų, kurio funkcionuoja molekuliniame lygyje, moduliuodamos žinduolio kūno svorį. Moduliatorių pagal išradimą atradimas turi svarbią reikšmę mitybos sutrikimų diagnozavimui ir gydymui, įskaitant, bet neapsiribojant, nutukimą, svorio praradimą, susijusį su vėžiu, ir gydant ligas, susijusias su nutukimu, tokias kaip hipertenzija, širdies ligos ir II tipo diabetas. Be to, šio geninio produkto panaudojimas galimas ir žemės ūkyje, tais atvejais, kai norima moduliuoti naminių gyvulių kūno svorį. Pagaliau, priimant dėmesin, kad vienas arba daugiau šio išradimo moduliatorių yra sekretuotos molekulės, jie gali būti naudojami biocheminiam jų receptorių išskyrimui, naudojant klonavimo ekspresijos technologiją. Toliau duodamas aptarimas apie OB geną gali būti bendrai taikomas klasei moduliatorių, kurie sudaro šio išradimo dalį ir tokiu būdu turi būti suderintas laisvumas ir tokios interpretacijos sfera.

Kaip aukščiau minėta, OB polipeptido funkcinis aktyvumas gali būti įvertintas transgeniniu būdu. Šiuo požiūriu, gali būti panaudotas transgeninis pelės modelis, ob genas gali būti panaudotas komplementacijos tyrimuose, naudojant transgenines peles. Transgeniniai vektoriai, įskaitant virusinius vektorius arba kosmidinius klonus (arba fagų klonus), atitinkantys laukinio tipo kandidatinio geno lokusus, gali būti konstruojami, naudojant išskirtą ob geną. Kosmidės gali būti įvedamos į transgenines peles, naudojant aprašytas metodikas [Jaenisch, Science. 240:1468-1474 (1988)]. Tokie dariniai įvedami į vaisingus kiaušinėlius, gautus iš interkroso tarp F1 C57BL/6J ob/ob X DBA interkroso palikuonių. Tokiems krosams reikia naudoti C57BL/6J ob/ob kiaušidžių transplantantus, norint gauti Fl gyvuliukus. Kaip kontrlinija yra naudojamos DBA/2J pelės, nes jos turi.... plaukų spalvą, kas yra svarbu, naudojant kiaušidžių transplantantus. Genotipas prie ob lokusų kosmidiniuose transgeniniuose gyvuliukuose gali būti nustatytas dauginant gyvuliukus su tampriai surištomis RFLP arba mikrosatelitais, kurie flankuoja mutaciją ir kurie yra polimorfiniai tarp palikuonių linijų. Komplementacija bus pademonstruota tuo atveju, kai tam tikras darinys duos genetiškai nutukusį F2 gyvuliuką (tai galima nustatyti panaudojant RFLP analizę), liesą ir nediabetinį. Šiomis sąlygomis galutiniam komplementacijos patvirtinimui reikia, kad ob/ob arba db/db gyvuliukas, turintis transgeną, būti) sukryžmintas su ob/ob arba db/db kiaušidžių transplantantais. Šiame krose visi N2 gyvuliukai, kurie neturi transgeno, bus nutukę ir turės insulinui rezistentišką diabetą, o tie gyvuliukai, kurie turi transgeną, bus liesi ir turės normalias gliukozės ir insulino koncentracijas plazmoje. Genetine prasme, transgenas veikia kaip supresoriaus mutacija.

Kitu atveju, OB genai gali būti nustatomi, tiriant jų fenotipinius efektus, kai ekspresuojama antiprasminėje orientacijoje laukinio tipo gyvuliukuose. Tokiu atveju slopinama laukinio tipo alelio ekspresija, ir gaunamas mutantinis fenotipas. RNR-RNR duplekso susidarymas (antiprasmė-prasmė) trukdo normaliam mRNR valdymui, ir taip dalinai arba pilnai pašalinamas laukinio tipo geno efektas. Ši metodika buvo panaudota TK sintezės audinio kultūroje inhibavimui ir Kruppel mutacijų Drosophila bei Shiverer mutacijų pelėse fenotipų gavimui [Izant et ai., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et ai., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki et ai., Science, 241:593-595 (1988)]. Svarbus tokio priėjimo privalumas yra tas, kad visos giminingos mRNR ekspresijos efektyviam inhibavimui reikalinga tik nedidelės geno dalies ekspresija. Tuo atveju bus įvestas antiprasminis transgenas, kontroliuojamas nuosavo promotoriaus arba kito promotoriaus, ekspresuoto tinkamo ląstelių tipo ir patalpintas aukščiau SV40 poliA vietos. Šis transgenas bus panaudotas transgeninėms pelėms gauti. Transgeninės pelės taip pat bus paveiktos kiaušidžių transplantantais, norint nustatyti ar ob heterozigotos yra jautresnės antiprasminio darinio efektams.

Toliau, OB geno produkto (OB polipeptido arba baltymo) biocheminės funkcijos išaiškinimas yra naudingas, identifikuojant mažas molekules-agonistus arba -antagonistus, kurios veikia jo aktyvumą.

Šiame aprašyme bus apibrėžti naudojami terminai, kurie yra duodami, pavyzdžiui, žemiau.

Terminas “kūno svorio moduliatorius”, “moduliatorius”, “moduliatoriai” bei kitokie specifiniai neišvardinti variantai, kurie gali būti čia vartojami visame šios paraiškos aprašyme ir apibrėžtyje, atitinka vienu atveju tiek nukleotidus, tiek ir baltyminę medžiagą; pastaroji apima ir atskirus, ir mišrius baltymus. Tiksliau, aukščiau minėti terminai apima nukleotidus ir DNR, kurių sekos čia aprašytos ir pateiktos fig. 1A-E (SEQ ID NO:1) ir fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3). Panašiai, baltymai, turintys čia aprašytus aminorūgščių sekų duomenis, pateiktus fig. 1A-E (SEQ ID NO:2) ir fig. 3 (SEQ ID NO:4) yra panašiai nagrinėjami kaip turintys aktyvumų vaizdą, išdėstytą visų medžiagų atžvilgiu tiek aprašyme, tiek ir apibrėžtyje. Atitinkami nukleotidai, pasižymintys iš esmės tokiu pačiu arba kitokiu aktyvumu, yra panašiai nagrinėjami, įskaitant iš esmės homologiškus jų analogus ir alelinius variantus. Taip pat panašiai nagrinėjami ir baltymai, pasižymintys iš esmės tokiu pačiu arba kitokiu aktyvumu, įskaitant apgalvotai modifikuotus baltymus, tokius kaip, pavyzdžiui, kryptingą mutagenezę, arba atsitiktinai modifikuotus per mutacijas šeimininko, kuris produkuoja moduliatorius, organizme.

Kompozicija, kurioje yra “A” (kur “A” yra vienas baltymas, DNR molekulė, vektorius, rekombinantinio šeimininko ląstelė ir t.t.) laikoma iš esmės neturinti “B” (kur “B” yra vienas arba daugiau užteršiančių baltymų, DNR molekulių, vektorių ir t.t., išskyrus racemines “A” formas), jeigu “A” kompozicijoje yra bent 73% pagal svorį baltymų, DNR, vektorių (priklausomai nuo kategorijos, kuriai priklauso A ir B medžiagos). Geriausia, kai “A” kiekis A+B medžiagų kompozicijoje sudaro bent apie 90% pagal svorį, o dar geriau - jei 99% pagal svorį. Taip pat pageidautina, kad kompozicijoje, kuri iš esmės yra neužteršta, būti} tik vieno molekulinio svorio medžiagos, turinčios dominančių medžiagų aktyvumą arba charakteristikas.

OB polipeptidai

Terminas “baltymas”, kuris reiškia gamtoje atsirandantį polipeptidą ir “polipeptidas” čia naudojami pakaitomis ob geno produkto ir jo variantų atžvilgiu.

Terminas “subrendęs baltymas” arba “subrendęs polipeptidas” ypatingai reiškia OB geno produktą su pašalinta signaline seka (arba sulieto baltymo partneriu).

Kaip aukščiau minėta, specifiniuose realizavimo variantuose ob polipeptidai pagal išradimą apima polipeptidus, turinčius čia parodytas aminorūgščių sekas, pvz., SEQ ID NOS:2, 4, 5, 6 ir t.t., įskaitant ob polipeptidą, modifikuotą pakeičiant konservatyvią aminorūgštį, o taip pat jų biologiškai aktyvius fragmentus, analogus ir jų darinius. Čia naudojamas terminas “biologiškai aktyvus’ reiškia specifinį polipeptido poveikį, įskaitant, bet neapsiribojant, specifinį susirišimą, pvz., su receptoriumi, antikūnu arba kita atpažįstančia molekule; signalo perdavimo kelių aktyvaciją molekuliniame lygyje; ir/arba fiziologinių efektų, kuriuose tarpininkauja ob polipeptidas in vivo, indukciją (arba inhibiciją antagonistais). OB polipeptidai, įskaitant fragmentus, analogus ir darinius, gali būti pagaminti sintezės būdu, pvz., panaudojant gerai žinomas kietafazės arba tirpalo fazės peptidų sintezės metodikas. Pageidautina naudoti kietafazės sintezės metodiką. Kitu būdu, išradimo OB polipeptidai gali būti pagaminti, naudojant gerai žinomas genų inžinerijos metodikas, kaip aprašyta infra. Dar kitame realizavimo variante OB polipeptidas gali būti išskirtas, pvz., imunoafininio valymo būdu iš biologinio skysčio, tokio kaip plazma, serumas arba šlapimas (bet jais neapsiribojant), geriausia iš žmogaus plazmos, serumo arba šlapimo, o dar geriau iš subjekto, turinčio padidintą šio polipeptido ekspresiją, tokio kaip nutukęs asmuo, sergantis dėl OB receptoriaus mutacijos arba nutukimu, susijusiu su mutacija, atitinkančiu “riebumą”.

OB polipeptido fragmentai

Specifiniame realizavimo variante, šiame išradime svarstoma, kad gali būti svarbūs natūraliai atsirandantys OB polipeptido fragmentai. Peptido seka apima daugelį vietų, kurios dažniausiai yra proteolitinio skaldymo taikinys, pvz., arginino liekanos. Yra tikimybė, kad pilno ilgio polipeptidas gali būti suskaldytas vienoje arba keliose tokio skaldymo vietose, susidarant biologiškai aktyviems fragmentams. Tokie biologiškai aktyvūs fragmentai gali arba agonizuoti arba antagonizuoti OB polipeptido funkcinį aktyvumą kūno svorio mažinimo atžvilgiu.

OB polipeptido analogai

Šiame išradime atskirai svarstomas OB peptido analogų, kurie yra charakterizuojami kaip turintys OB polipeptido biologinį aktyvumą, pvz., galintys specifiškai rištis su rišančiu ob peptido partneriu, tokie kaip OB receptorius, gavimas. Viename realizavimo variante analogas agonizuoja OB aktyvumą, t.y. jis funkcionuoja panašiai kaip ob peptidas. Geriau, kai OB agonistas yra efektyvesnis už natyvų baltymą. Pavyzdžiui, OB agonisto analogas gali rištis su OB receptoriumi su didesne trauka arba rodo ilgesnį gyvavimo puslaikį in vivo, arba stebimi abu šie atvejai. Vis tik aptariami ir OB peptido agonisto analogai, kurie yra mažiau efektyvūs, nei natyvus baltymas. Kitame realizavimo variante analogas antagonizuoja OB aktyvumą. Pavyzdžiui, OB analogas, kuris rišasi su OB receptoriumi, bet neindukuoja signalo perdavimo, gali konkuruojančiai inhibuoti natyvaus OB rišimąsi su receptoriumi ir taip sumažinti OB aktyvumą in vivo. Toks OB antagonisto analogas gali taip pat turėti skirtingas nuo ob peptido savybes, pvz., ilgesnį (arba trumpesnį) gyvavimo puslaikį in vivo, didesnę (arba mažesnę) rišimosi su OB receptoriumi trauką, arba gali būti abu šie atvejai.

Viename šio išradimo realizavimo variante OB peptido analogas yra OB peptidas, modifikuotas pakeičiant aminorūgštis polipeptido padėtyse, kurios nėra esminės struktūros arba funkcijos požiūriu. Pavyzdžiui, kadangi yra žinoma, kad žmogaus OB peptidas yra biologiškai aktyvus pelėse, galima laukti, kad skirtingų aminorūgščių liekanų pakeitimas žmogaus sekoje, lyginant su pelės aminorūgščių seka, duos naudingus OB peptido analogus. Pavyzdžiui, serino liekanos 53 padėtyje arba 98 padėtyje arba abejose (nepakeista peptido seka yra pavaizduota fig. 4) žmogaus peptide gali būti pakeistos, pvz., glicinu, alaninu, valiau, cisteinu, metioninu ar treoninu. Panašiai arginino liekana 92 padėtyje (fig.4) gali būti pakeista, pvz., asparaginu, lizinu, histidinu, glutaminu, glutamino rūgštimi, asparto rūgštimi, serinu, treoninu, histidinu ar cisteinu. Dar kartą grįžtant prie fig. 4, kitos aminorūgštys žmogaus OB peptide, kurios gali būti pakeistos, yra histidinas 118 padėtyje, triptofanas 121 padėtyje, alaninas 122 padėtyje, glutmino rūgštis 126 padėtyje, treoninas 127 padėtyje, leucinas 128 padėtyje, glicinas 132 padėtyje, glicinas 139 padėtyje, triptofanas 159 padėtyje, ir glicinas 166 padėtyje. Kitame realizavimo variante gali būti pakeista viena arba daugiau 121-128 liekanų (kaip parodyta fig. 4), pvz., glicinas arba alaninas, arba pakeičiamos kai kurios liekanos, išskyrus seriną 123 padėtyje arba leuciną 125 padėtyje.

Kitame realizavimo variante OB polipeptido analogas, geriausia žmogaus OB polipeptidas, yra sutrumpinta polipeptido forma. Pavyzdžiui, jau buvo parodyta, kad glutamino liekana 49 padėtyje nėra esminė ir ji gali būti pašalinta iš peptido. Panašiai galima pašalinti kai kurias arba visas skirtingas aminorūgščių liekanas 121-128 padėtyse.

Be to, išradime aptariamas OB analogo, turinčio minimalią aminorūgščių seką, reikalingą biologiniam aktyvumui, pagaminimas. Tą galima nesunkiai nustatyti, pvz., tikrinant OB fragmentų aktyvumą jų sugebėjimo susirišti su OB specifiniais antikūnais atžvilgiu, natyvaus OB polipeptido aktyvumo inhibavimą arba natyvaus OB peptido agonizavimą. Viename realizavimo variante išradime siūlomas sutrumpintas OB polipeptidas, turintis kilpinę struktūrą, sudarytą per disulfidinį ryšį, kuris susidaro tarp cisteino liekanų 117 ir 167 padėtyse (kaip parodyta fig. 4). Kitame realizavimo variante sutrumpintas analogas atitinka aminorūgščių seką nuo 22 liekanos (kuri eina po laukiamos signalinio peptido skaldymo vietos) iki 53 liekanos (aminorūgšties liekana, esanti prieš pat lanksčios kilpos sritį, nustatomą limituotos proteolizės būdu, po kurios atliekama OB polipeptido masių spektrometrinė analizė; žr. Cohen et ai., Protein Science, 4:1088 (1995)). Kitame realizavimo variante sutrumpintas analogas atitinka aminorūgščių seką nuo 61 liekanos (liekana einanti tuojau pat po lanksčios kilpos srities; tas buvo nustatyta panaudojant OB polipeptido limituotą proteolizę ir masių spektrometrinę analizę) iki 116 liekanos (liekana, esanti prieš pirmąją cisteino liekaną). Dar viename realizavimo variante sutrumpintas analogas atitinka aminorūgščių seką nuo 61 iki 167 aminorūgšties.

Be to, yra pakeista viena arba daugiau lanksčios kilpos liekanų ties 54 ir 60 liekanomis. Pavyzdžiui, viena arba daugiau liekanų gali būti pakeistos lizinu, glutamino rūgštimi arba cisteinu (geriau lizinu) kryžminiam sujungimui, pvz., su polimeru, nes lanksčios kilpos struktūros yra pageidautinos baltymo darinių susidarymo vietos. Kitu atveju, liekanos lanksčios kilpos padėtyse gali būti pakeistos aminorūgščių liekanomis, kurios yra labiau atsparios proteolizei, bet išlaiko lanksčią struktūrą, pvz., vienu arba keletu prolinų. Dar viename realizavimo variante nagrinėjamas pakeitimas aminorūgščių liekanų, kurios toliau gali būti panaudotos dariniams gauti, kad jie būtų atsparesni degradacijai, pvz., proteolizei.

Šios srities specialistams bus suprantama, kad aukščiau aprašytų fragmentų dydžiai yra apytikriai, ir, kad prie vieno arba dviejų galų gali būti prijungta nuo vienos iki maždaug penkių aminorūgščių, arba minėtuose sutrumpintuose analoguose gali būti įterpiama į polipeptido arba jo fragmentų vidurį, išskyrus tai, kad disulfidiniu ryšiu sujungtuose kilpą turinčiuose analoguose cisteino liekanos turi išlikti.

Buvo nustatyta, kad pelės OB peptidas turi 50% α-spiralinės dalies, o žmogaus OB polipeptidas turi apie 60% α-spiralinės dalies, kas matosi iš rekombinantinių peptidų cirkuliarinio dichroizmo duomenų beveik fiziologinėse sąlygose. Iš to seka, kad kitame realizavimo variante aminorūgščių liekanos gali būti pakeistos liekanomis, kad susidarytų OB polipeptido analogai, kurie turėtų polinkį sudaryti, arba kurie sudarytų stabilesnes aspiralines struktūras. Pavyzdžiui, labiau susidarytų α-spiralinė struktūra, jei Glu, Ala, Leu, His, Trp būtų įvedami kaip pakaitai vietoje natyviame OB polipeptide esančių aminorūgščių liekanų. Geriausiai naudoti įprastus aminorūgščių pakeitimus, pvz., pakeisti asparagino rūgštį 29, 30, 44, 61, 76, 100 ir/arba 106 padėtyje (kaip parodyta fig. 4) glutamino rūgštimi(s) (Glu); pakeisti izoleuciną(us) leucinu; pakeisti gliciną arba valiną arba kitą skirtingą aminorūgštį alaninu (pvz., žmogaus OB polipeptide 53 padėtyje esantį seriną alaninu), pakeisti argininą arba liziną histidinu ir pakeisti tiroziną ir/arba fenilalaniną triptofanu. α-Spiralinės struktūros kiekio arba, kas dar svarbiau, stabilumo padidinimas gali duoti OB analogą, pasižymintį didesniu aktyvumu, padidinta surišimo geba arba ilgesniu gyvavimo puslaikiu. Specifiniame realizavimo variante yra padidintas OB peptido, atitinkančio 22-53 aminorūgštis, dalies spiralinės struktūros susidarymo potencialas. Kitame realizavimo variante yra padidintas 61-116 aminorūgščių liekanų spiralinės struktūros susidarymo potencialas arba stabilumas. Dar viename realizavimo variante yra padidintas disulfidinės kilpinės struktūros, atitinkančios 117-167 aminorūgštis, spiralinės struktūros susidarymo potencialas. Aptariami taip pat ir OB analogai, turintys padidintą α-spiralės susidarymo potencialą arba stabilumą daugiau nei vienoje iš aukščiau minėtų dalių. Dar viename realizavimo variante išskiriami sutrumpinti OB polipeptido analogai, į kuriuos įeina formuojančios struktūrą, pvz., formuojančios spiralę aminorūgščių liekanos, kad būtų kompensuojamas polipeptido fragmentų didesnis polinkis nestabilios struktūros susidarymui.

Analogus, tokius kaip fragmentai, galima gauti, pavyzdžiui, panaudojant svorio moduliatoriaus peptidinės medžiagos skaldymą pepsinu. Kiti analogai, tokie kaip mutacijas turinčios molekulės, gali būti gaunami, panaudojant svorio moduliatorių koduojančių sekų standartinę kryptingą mutagenezę. Analogai, pasižymintys “svorio moduliavimo aktyvumu”, tokie kaip mažos molekulės, funkcionuojančios kaip promotoriai arba inhibitoriai, gali būti identifikuojamos žinomais in vivo ir/arba in vitro bandymais.

Mažos molekulės-analogai ir OB polipeptido peptidiniai imitatoriai

OB polipeptido, geriausiai žmogaus OB polipeptido, struktūra gali būti tiriama įvairiais žinomais būdais. Baltymo seka gali būti charakterizuojama, panaudojant hidrofiliškumo analizę [pvz., Hopp et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. Hidrofiliškumo profilis gali būti panaudotas OB polipeptido hidrofobinių ir hidrofilinių sričių identifikavimui, kuris gali parodyti sritis, paslėptas susilanksčiusio polipeptido viduje, ir sritis, esančias polipeptido išorėje. Be to, gali būti atlikta antrinės struktūros analizė [pvz., Chou et ai., Biochem., 13:222 (1974)], norint nustatyti OB polipeptido sritis, kurios apsprendžia specifines antrines struktūras. Numatytų arba nustatytų struktūrų, įskaitant antrinės struktūros numatymą, manipuliaciją galima atlikti, naudojant šioje srityje žinomas kompiuterines programas.

Apsirūpinus nemažu rekombinantinio OB polipeptido kiekiu pagal šį išradimą, galima atlikti kiekybinį polipeptido struktūros įvertinimą. Ypatingai turint pakankamai medžiagos, galima atlikti branduolių magnetinio rezonanso (BMR), infraraudonųjų spindulių (IR), Ramano ir ultravioletinių spindulių (UV), ypač cirkuliarinio dichroizmo (CD), spektrinę analizę. Ypatingai BMR yra labai galingas molekulių, esančių tirpale, kuriame artimiau priartėjama prie jų natyvaus apsupimo, struktūrinės analizės metodas [Marion et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar et ai, J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimura et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1681-1685 (1980)]. Taip pat gali būti panaudoti ir kiti struktūrinės analizės metodai. Tarp jų patenka, bet neapsiribojama, rentgeno spindulių kristalografija [Engstrom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].

Dar kitame realizavimo variante OB polipeptido analogas gali būti tyrinėjamas, norint nustatyti, ar jis susijungia su antikūnu, specifiniu natyviam OB polipeptidui arba jo specifiniams fragmentams. Susijungimo laipsnis duoda informaciją apie baltymų struktūrinę homologiją arba panašumą, arba apie sričių, atitinkančių polipeptido dalis, kurios buvo panaudotos fragmentams specifiškiems antikūnams gauti, prieinamumą.

OB analogu skryningas

Polipeptidų analogų skryningui yra žinomos įvairios skryningo metodikos. Gaunami įvairių chemikalų rinkiniai. Tuo būdu, šiame išradime nagrinėjamas tokių rinkinių, pvz., sintetinių junginių, sukurtų per ilgą tyrimų laikotarpį, gamtinių junginių rinkinių ir kombinuoti} rinkinių, kaip smulkiau aprašyta, infra, kaip OB polipeptido analogų skryningas. Viename realizavimo variante šiame išradime aptariamas tokių rinkinių, kaip junginių, kurie rišasi su anti-OB polipeptido antikūnais, geriausia anti-žmogaus ob polipeptido antikūnais, skryningas. Kitu požiūriu, jeigu yra identifikuotas OB receptorius (žr. infra), gali būti panaudota bet kokia žinoma skryningo metodika, norint atrinkti OB receptoriaus agonistus arba antagonistus. Šiame išradime aptariama mažų molekuliųligandų arba ligandų analogų ir imitatorių, o taip pat gamtinių ligandų, kurie rišasi arba agonizuoja arba antagonizuoja OB receptoriaus aktyvavimą in vivo, skryningas.

Pirminės receptoriaus sekos žinojimas ir šios sekos panašumas su žinomos struktūros baltymais gali duoti pradinį raktą baltymo agonistų arba antagonistų nustatymui. Antagonistų identifikavimas ir skryningas yra dar labiau palengvinamas, nustatant baltymo struktūrines ypatybes, pvz., panaudojant Rentgeno spindulių kristalografiją, neutronų difrakciją, branduolių magnetinio rezonanso spektrometriją ir kitas struktūros nustatymo metodikas. Tokios metodikos duoda galimybę racionaliai konstruoti arba identifikuoti agonistus ir antagonistus.

Kitame priėjime didelių rinkinių gavimui naudojamas rekombinantinis bakteriofagas. Naudojant šį “fago metodą” [Scott et ai., Science, 249:386-390 (1990); Cwirla et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et ai, Science, 249:404-406 (1990)], gali būti gaminami labai dideli rinkiniai (10⁶-10⁸ cheminių darinių). Antrąjame priėjime pirmiausia naudojami cheminiai metodai, kurių pavyzdžiais gali būti

Geysen metodas [Geysen et ai, Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et ai., J. Imrmtnologic Method, 102:259-274 (1987)] ir neseniai aprašytas Fodor et ai., Science, 251:767-773 (1991) metodas. Furka et ai., 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Pepetide Protein Res., 37:487-493 (1991); Houghton (US patentas Nr. 4631211, publikuotas 1986 m. gruodžio mėn.) ir Rutter et ai. (US patentas Nr. 5010175, publikuotas 1991 m. balandžio mėn.) aprašo peptidų mišinių, kurie gali būti tiriami kaip agonistai arba antagonistai, gavimo būdus.

Kitu aspektu sintetiniai rinkiniai [Needels et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993); Lam et ai., WO 92/00252, abu čia duodami pilnai] ir panašūs gali būti panaudoti OB receptoriaus ligandų pagal šį išradimą skryningui. Esant tokiems rinkiniams, galima nustatyti receptoriaus antagonistus, panaudojant ląstelių, kurios ekspresuoja receptorių, neklonuojant OB receptoriaus.

Kitu būdu, gali būti atlikti tirpaus ligando susijungimo su ląstelėmis, kurios ekspresuoja OB receptoriaus ligando rišančios vietos rekombinantines formas, bandymai. Tirpūs ligandai gali būti lengvai gaunami kaip rekombinantinis arba sintetinis OB polipeptidas.

Galima atlikti skryningą su rekombinantinėmis ląstelėmis, kurios ekspresuoja OB receptorių, arba, kitaip, panaudojant išvalytą receptoriaus baltymą, pvz., gautą rekombinantinių būdu, kaip aprašyta aukščiau. Pavyzdžiui, rinkinių skryningui gali būti panaudotas žymėto, tirpaus arba soliubilizuoto OB receptoriaus, kuris turi ligandą rišančią molekulinę dalį, sugebėjimas surišti ligandą, kaip aprašyta aukščiau duotuose literatūros šaltiniuose.

OB polipeptidų dariniai

Bendrai imant, galima pagaminti šio baltymo (naudojamas terminas “baltymas” čia apima “polipeptidą”, jeigu kitaip nepažymėta) darinius, prijungiant vieną arba daugiau cheminių liekanų prie baltymo liekanos. Chemiškai modifikuoti dariniai toliau gali būti panaudoti intraarterinio, intraperitoninio, intraraumeninio, subkutaninio, intraveninio, peroralinio, nazalinio, rektalinio, bukalinio, poliežuvinio, pulmonalinio, topinio, transderminio vartojimo būdams skirtų kompozicijų gavimui. Buvo rasta, kad biologiškai aktyvių baltymų cheminė modifikacija duoda papildomą naudą, esant tam tikroms aplinkybėms, tokią kaip terapinio baltymo stabilumo ir cirkuliacijos laiko padidėjimas ir imunogeniškumo sumažėjimas. Žr. US patentą Nr. 4179337 (Davis et ai., publikuotas 1979 m. gruodžio 18 d.). Apžvalga duota Abuchowski et ai., “Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, in Enzymes as Dings, pp. 367-383, Holcenberg and Roberts, eds., WileyInterscience, New York, NY, (1981). Apžvalginis straipsnis, aprašantis baltymo modifikaciją ir sulietus baltymus yra Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992).

Cheminės medžiagos dariniams gauti

Cheminės medžiagos, tinkamos dariniams gauti, gali būti pasirinktos iš vandenyje tirpių polimerų. Pasirinktas polimeras turi būti tirpus vandenyje, kad prie jo prijungtas baltymas neiškristų į nuosėdas vandeninėje terpėje, tokioje kaip fiziologinė terpė. Geriausia, kad galutinis produktas, skirtas terapiniam naudojimui, būtų sujungtas su farmaciškai tinkamu polimeru. Šios srities speciaslistas gali parinkti pageidaujamą polimerą, remiantis tokiais svarstymais, ar polimero/baltymo konjugatas bus naudingas terapijoje ir, jeigu taip, pasirinks norimą dozę, cirkuliacijos laiką, atsparumą proteolizei ir t.t. Išradimo baltymams ir peptidams šiuos parametrus galima nustatyti, panaudojant čia duodamus bandymus.

Polimeru molekulės

Vandenyje tirpus polimeras gali būti pasirinktas iš grupės, kurią sudaro, pavyzdžiui, polietilenglikolis, etileno glikolio/propileno glikolio kopolimerai, karboksimetilceliuliozė, dekstranas, polivinilo alkoholis, polivinilpirilidonas, poli-l,3-dioksolanas, poli-1,3,6trioksanas, etileno/maleino anhidrido kopolimeras, poliaminorūgštys (kopolimerai arba bet kokie kopolimerai) ir dekstranas arba poli(n-vinilpirolidon)polietileno glikolis, propileno glikolio kopolimerai, polipropileno oksido/etileno oksido kopolimerai, polioksietilinti polioliai ir polivinilo alkoholis. Polietileno glikolio propionaldehidas turi privalumų gamyboje dėl to, kad vandenyje jis yra stabilus.

Polimeras gali būti bet kokio molekulinio svorio; jis gali būti šakotas arba nešakotas. Polietilenglikolio atveju tinkamiausias molekulinis svoris yra maždaug 2-100 kDa ribose (terminas “maždaug” reiškia, kad polietilenglikolio preparatuose kai kurios molekulės svers daugiau, kai kurios mažiau, nei nurodytas molekulinis svoris); toks svoris palengvina gamybą ir panaudojimą. Gali būti naudojamos ir kitokio dydžio molekulės, priklausomai nuo norimo terapinio profilio (pvz., norimos išskyrimo trukmės, įtakos (jeigu tokia yra) į biologinį aktyvumą, vartojimo palengvinimo, antigeniškumo laipsnio arba jo nebuvimo ir kitų žinomų polietilenglikolio efektų terapiniam baltymui arba analogui).

Polimero/baltymo santykis

Taip prijingtų polimero molekulių skaičius gali būti kintamas, ir šios srities specialistas galės užtikrinti jo efektą į poveikį. Gali būti pagaminti monodariniai, arba di-, tri-, tetradariniai arba jų kombinacijos su ta pačia arba skirtingomis cheminėmis medžiagomis (pvz., polimerais, tokiais kaip skirtingo svorio polietilenglikoliai). Polimero molekulių santykis su baltymo (arba peptido) molekulėmis keisis, keičiantis jų koncentracijoms reakcijos mišinyje. Bendrai imant, optimalus santykis (reakcijos efektyvumo požiūriu, t.y. kad nelieka nesureagavusio baltymo arba polimero) bus apspredžiamas faktoriais, tokiais, kaip norimas darinio sudarymo laipsnis (pvz., mono-, di, tri- ir t.t.), pasirinkto polimero molekulinis svoris, ir priklausis nuo to, ar polimeras yra šakotas ar nešakotas, ir nuo reakcijos sąlygų.

Cheminės medžiagos prijungimas prie baltymo

Polietilenglikolio molekulės (arba kitokios cheminės medžiagos) turi būti prijungiamos prie baltymo, atsižvelgiant į funkcinį poveikį arba baltymo antigenines sritis. Yra daugybė prijungimo būdų, prieinamų šios srities specialistui, pvz., EP 0 401 384 čia duodamas kaip literatūros šaltinis (PEG prijungimas prie G-CSF). Žr. taip pat Malik et a!., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (aprašantį GM-CSF polietilenglikolinimą, naudojant trezilo chloridą). Pavyzdžiui, polietilenglikolis gali būti kovalentiškai prijungtas per aminorūgščių liekanas, panaudojant reaktingas grupes, tokias kaip laisva amino- arba karboksi-grupė. Reaktingos grupės yra tokios, prie kurių gali būti prijungta aktyvuoto polietilenglikolio molekulė. Aminorūgščių liekanos, turinčios laisvą aminogrupę, gali būti lizino liekanos ir N-galinės aminorūgšties liekanos, o liekanos, turinčios laisvą karboksigrupę, gali būti asparto rūgšties liekana, glutamino rūgšties liekana ir C-galinės aminorūgšties liekana. Sulfhidrilo grupės taip pat gali būti panaudotos, kaip reaktingos grupės polietilenglikolio molekulės(ių) prijungimui. Terapiniams tikslams geriausia prijungti prie aminogrupės, tokios kaip N-galinė grupė arba lizino grupė. Jeigu norima, kad susidarytų receptorinis ryšys, reikia vengti prijungimo prie liekanų, svarbių receptorinio ryšio susidarymui.

Baltymai, turintys chemiškai modifikuotą N-gala

Gali būti pageidaujamas baltymas, turintis chemiškai modifikuotą N-galą. Naudojant polietilenglikolį tokių kompozicijų iliustravimui, galima pasirinkti įvairias polietilenglikolio molekules (pagal molekulinį svorį, išsišakojimą ir t.t.), polietilenglikolio molekulių santykį su baltymo (arba peptido) molekulėmis reakcijos mišinyje, vykdomos polietilenglikolinimo reakcijos tipą ir pasirinkto N-gale polietilenglikolinto baltymo gavimo būdą. N-gale polietilenglikolinto preparato gavimo būdas (t.y. šios medžiagos atskyrimas nuo kitų monopolietilenglikolintų medžiagų, jeigu to reikia) gali būti N-gale polietilenglikolintos medžiagos išskyrimas iš polietilenglikolintų baltymo molekulių populiacijos. Selektyvi N-galo cheminė modifikacija gali būti realizuota, panaudojant redukcinį alkilinimą, kuriame naudojamas skirtingų tipų pirminių aminogrupių (lizino lyginant su N-galine aminogrupė) skirtingas reaktingumas, ypatingai tinkamas baltymo dariniams gauti. Esant atitinkamoms reakcijos sąlygoms, galima pasiekti iš esmės selektyvų baltymo N-galinio darinio gavimą su karbonilo grupę turinčiu polimeru. Pavyzdžiui, galima selektyviai polietilenglikolinti baltymo N-galą, vykdant reakciją tokiame pH, kuris leidžia pasinaudoti lizino liekanų ε-aminogrupių ir baltymo N-galinės aminogrupės pKa skirtumais. Tokioje selektyvioje darinių gavimo reakcijoje kontroliuojamas vandenyje tirpaus polimero prijungimas prie baltymo: daugiausia vyksta polimero prijungimas prie baltymo N-galo, o kitos reaktingos grupės, tokios kaip lizino šoninės aminogrupės beveik nėra modifikuojamos. Naudojant redukcinį alkilinimą, vandenyje tirpus polimeras turi būti aukščiau aprašyto tipo ir turi turėti vienintelę reaktingą aldehido grupę susijungimui su baltymu. Gali būti panaudotas polietilenglikolio propionaldehidas, turintis vienintelę reaktingą aldehido grupę.

Nukleino rūgštys, susijusios su OB polipeptidu

Kaip minėta aukščiau, šis išradimas susijęs su nukleino rūgštims, koduojančioms ob polipeptidus, bei su genominėmis nekoduojančiomis sekomis 5’, 3’ ir introninėmis sekomis j OB geną. Taigi, pagal šį išradimą, gali būti naudojamos įprastos molekulinės biologijos, mikrobiologijos ir rekombinantinės DNR metodikos, žinomos šiose srityse. Tokios metodikos pilnai aprašytos literatūroje. Žr., pvz., Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et ai., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et ai., eds., Transcription And Translation, Oxford University Press (1984); Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). Šiam išradimui ypatingai svarbios yra išskyrimo, klonavimo, sekų nustatymo, analizavimo ir geno arba nukleino rūgšties charakterizavimo, panaudojant gerai žinomą polimerazės grandinės reakciją (PCR) metodiką, strategijos.

“Replikonas” yra bet koks genetinis elementas (pvz., plazmidė, chromosoma, virusas), kuris funkcionuoja kaip autonominis DNR replikacijos vienetas in vivo, t.y. gali replikuotis, kontroliuodamas pats save.

“Vektorius” yra replikonas, toks kaip plazmidė, fagas arba kosmidė, prie kurių gali būti prijungtas kitos DNR segmentas taip, kad vykti} prijungto segmento replikacija.

“Kasetė” reiškia DNR segmentą, kuris gali būti įterptas į vektorių specifinėse restrikcijos vietose. DNR segmentas koduoja norimą polipeptidą, o kasetė ir restrikcijos vietos projektuojamos taip, kad kasetė būtų įterpta į reikiamą transkripcijos ir transliacijos nuskaitymo rėmelį “Heterologinė” DNR reiškia DNR, kurios paprastai nėra ląstelėje arba ląstelės chromosominėje vietoje. Geriau, kai heterologinė DNR apima ląstelės svetimą geną.

Ląstelė yra “transfekuota” egzogenine arba heterologine DNR, kai tokia DNR įvesta į ląstelę. Ląstelė yra “transformuota” egzogenine arba heterologine DNR, kai transfekuota DNR veikia fenotipo pakeitimą. Geriausiu atveju, transformuojanti DNR turi būti integruota (kovalentiškai prijungta) į chromosominę DNR, papildant ląstelės genomą.

“Klonas” yra ląstelių, išvesti} iš vienos ląstelės arba bendros kilmės ląstelių, panaudojant mitozę, populiacija.

“Nukleino rūgšties molekulė” reiškia ribonukleozidų (adenozino, guanozino, uridino arba citidino; “RNR molekulės”) arba dezoksiribonukleozidų (dezoksiadenozino, dezoksiguanozino, dezoksitimidino arba dezoksicitidino; “DNR molekulės”) fosfato esterio polimerinę tiek viengrandininę, tiek ir dvigrandininę spiralę. Galimos DNR-DNR, DNR-RNR ir RNR-RNR dvigrandininės spiralės. Terminas “nukleino rūgšties molekulė”, ypatingai DNR arba RNR molekulė, reiškia tik molekulės pirminę arba antrinę struktūrą ir neapsiriboja kokiomis nors ypatingomis tretinėmis arba ketvirtinėmis formomis. Taigi, šis terminas apima dvigrandininę DNR, rastą, tarp kitko, linijinėse arba cirkuliarinėse DNR molekulėse (pvz., restrikcijos fragmentas), plazmidėse ir chromosomose. Aptariant tam tikrų dvigrandininių DNR molekulių struktūrą, sekos gali būti aprašomos pagal įprastą susitarimą, duodant tik seką nuo 5’ į 3’ kryptimi išilgai netranskribuotos DNR grandies (t.y. grandis turi seką homologinę mRNR). “Rekombinantinė DNR molekulė” yra DNR molekulė, su kuria buvo atliktos molekulinės biologijos manipuliacijos.

Nukleino rūgšties molekulė yra “galinti hibridizuotis” su kita nukleino rūgšties molekule, tokia kaip kDNR, genomine DNR arba RNR, jeigu viengrandininė nukleino rūgšties molekulės forma gali susirišti su kita nukleino rūgšties molekule tam tikroje temperatūroje ir esant tam tikrai joninei jėgai (žr. Sambrook et al., 1989, supra). Temperatūra ir joninė jėga apsprendžia hibridizacijos “griežtumą”. Preliminariniam homologinių nukleino rūgščių skryningui gali būti naudojamos nedidelio griežtumo hibridizacijos sąlygos, atitinkančios T_m=55°C, pvz., 5 x SSC, 0.1% SDS, 0.25% pieno ir nenaudojant formamido; arba 30% formamido, 5 x SSC, 0.5% SDS. Vidutinio griežtumo hibridizacijos sąlygos stitinka aukštesnę T_m, pvz., 40% formamido su 5 x arba 6 x SCC.

Hibridizacijai reikalinga, kad dvi nukleino rūgštys turėtų komplementarias sekas, nors priklausomai nuo hibridizacijoa griežtumo, yra galimas atitikimas tarp bazių. Atitinkamas griežtumas besihibridizuojančioms nukleino rūgštims priklauso nuo nukleino rūgšties ilgio ir komplementacijos laipsnio - gerai šioje srityje žinomų kintamųjų. Kuo didesnis dviejų nukleotidų panašumo arba homologijos laipsnis, tuo didesnė nukleino rūgščių, turinčių tokias sekas, hibridų T_m reikšmė. Santykinis nukleino rūgščių hibridizacijų stabilumas (atitinkantis aukštesnę T_m) mažėja tokia tvarka: RNR-RNR, DNR-RNR, DNR-DNR. Buvo išvestos T_m išskaičiavimo lygtys hibridams, kuriuos sudaro daugiau nei 100 nukleotidų (žr. Saambrook et ai., 1989, supra, 9.50-0.51). Kai hibridizuojasi trumpesnės nukleino rūgštys, t.y. oligonukleotidai, pasidaro svarbios atitikimo padėtys, ir nukleotido ilgis apsprendžia jų specifiškumą (žr. Sambrook et ai., 1989, supra, 11.7-11.8). Minimalus besihibridizuojančių nukleino rūgščių ilgis yra maždaug apie 10 nukleotidų, geriau - apie 15 nukleotidų ir geriausia - bent apie 20 nukleotidų.

“Homologinė rekombinacija” reiškia vektoriaus svetimos DNR sekos įterpimą į chromosomą. Geriausia, kai vektorius taiko į specifinę chromosomos vietą homologinei rekombinacijai. Specifinės homologinės rekombinacijos atveju vektorius turi turėti pakankamai ilgas homologinės sritis chromosomos sekoms, kad būtų pasiekiamas vektoriaus komplementarus susijungimas ir įsiterpimas į chromosomą. Ilgesnės homologijos sritys ir didesni sekos panašumo laipsniai gali padidinti homologinės rekombinacijos efektyvumą.

DNR “koduojanti seka” yra dvigrandininė DNR seka, kuri yra transkribuojama ir transliuojama į polipeptidą ląstelėje in vitro arba in vivo, kai ji yra patalpinta joje, esant atitinkamų reguliatorinių sekų kontrolei. Koduojančios sekos ribas nustato start-kodonas 5’ (amino) gale ir transliacijos stop-kodonas 3’ (karboksi) gale. Koduojanti seka gali apimti (bet neapsiriboja) prokariotines sekas kDNR iš eukariotinės mRNR, genomines DNR sekas iš eukariotinės (pvz., žinduolių) DNR ir netgi sintetines DNR sekas. Jeigu koduojanti seka yra skirta ekspresijai eukariotinėje ląstelėje, poliadenilinimo signalas ir transkripcijos nutraukimo seka bus 3’ padėtyje koduojančios sekos atžvilgiu.

OB koduojančiu ir flankuojančiu seku išskyrimas

Kaip buvo pažymėta, išradime nagrinėjamos nukleino rūgštys apima ir kitas nukleino rūgštis, kurios koduoja peptidų ekspresiją, tokias kaip parodyta fig. 1A-D (SEQ ID NO:2), fig. 3 (SEQ ID NO:4), fig. 5 (SEQ ID NO:5) ir fig. 6 (SEQ ID NO:6). Tokiu būdu, kadangi buvo išskirta specifinė DNR ir nustatyta seka, susijusi su ob genu, geno, koduojančio šio išradimo peptidus, molekuliniam klonavimui nukleino rūgšties šaltiniu potencialiai gali būti bet kokio gyvūno ląstelė. Tokia DNR gali būti gaunama pagal žinomas standartines metodikas iš klonuotos DNR (pvz., DNR “bibliotekos”), cheminės sintezės būdu, klonuojant kDNR arba klonuojant genominę DNR arba jos fragmentus ir išskirta iš norimos ląstelės (žr., pavyzdžiui, Sambrook et ai., 1989, supra·, Glover, 1985, supra). Klonai, išvesti iš genominės DNR, be koduojančių sričių gali turėti reguliatorines ir intronines DNR sritis; klonai, išvesti iš kDNR, neturi introninių sekų. Koks bebūti} šaltinis, genas turi būti klonuotas molekuliniu būdu į tinkamą geno dauginimui vektorių.

Geno iš genominės DNR molekuliniame klonavime genominė DNR gali būti pagausinta, naudojant pradmenis, pasirinktus iš kDNR sekų. Kitu atveju, generuojami DNR fragmentai; kai kurie iš jų koduos norimą geną. DNR gali būti suskaldyta specifinėse vietose, naudojant įvairius restrikcijos fermentus. DNR fragmentavimui galima naudoti DNR-azę esant manganui, arba DNR gali būti fiziškai sukarpyta, pavyzdžiui, panaudojant ultragarsą. Tada linijinės DNR fragmentai gali būti atskirti vienas nuo kito pagal jų dydį, panaudojant standartines metodikas, įskaitant, bet neapsiribojant, agarozės ir poliakrilamido gelio elektroforezę ir kolonėlių chromatografiją.

Jeigu DNR fragmentai jau yra generuoti, specifinio DNR fragmento, turinčio norimą ob arba panašų į ob geną, identifikavimą galima atlikti daugeliu būdų. Pavyzdžiui, jeigu gaunamas nemažas kiekis ob arba panašaus į ob geno arba jo specifinės RNR arba jų fragmentų ir galima jį išvalyti bei pažymėti, generuotus DNR fragmentus galima atrinkti, panaudojant nukleino rūgšties hibridizaciją su žymėtu zondu [Benton et ai., Science, 196:180 (1977); Grunstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961 (1975)]. Siame išradime pateikiami tokie nukleino rūgščių zondai, kuriuos galima nesunkiai pagaminti iš čia aprašytų specifinių sekų, pvz., galintį hibridizuotis zondą, turintį nukleotidų seką, atitinkančią sekos, pavaizduotos fig. 1A-E (SEQ ID NIO:1) arba fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3), mažiausiai 10, geriau 15 nukleotidų fragmentų. Pageidautina, kad pasirinktas fragmentas būtų labai charakteringas išradimo moduliatoriniams peptidams.

Hibridizuosis tokie DNR fragmentai, kurie yra labai homologiški zondui. Kaip aukščiau minėta, kuo didesnis homologijos laipsnis, tuo griežtesnes hibridizacijoa sąlygas reikia naudoti. Viename realizavimo variante homologinio moduliatorinio peptido identifikavimui buvo panaudotas nedidelio griežtumo hibridizacijos sąlygos. Tačiau pageidautina, kaip čia buvo eksperimentiškai parodyta, hibridizuoti nukleino rūgštį, koduojančią išradimo moduliatorinį peptidą, su nukleino rūgštimi, turinčią nukleotidų seką, parodytą fig. 1A-E (SEQ ID NO:1) arba fig. 2A ir B (SEQ ID NO:3) arba jos galinčiais hibridizuotis fragmentais, vidutinio griežtumo sąlygose, o dar geriau - labai griežtose sąlygose.

Kitaip, geno buvimą galima nustatyti bandymais, paremtais jo ekspresijos produkto fizikinėmis, cheminėmis arba imunologinėmis savybėmis. Pavyzdžiui, gali būti atrinkti kDNR klonai, arba DNR klonai, kurie selektyviai hibridizuojasi su nuosavomis mRNR. pagal produkuotą baltymą, pvz., turi panašią arba vienodą migraciją elektroforezėje, vienodą elgseną izoelektriniame fokusavime, proteolitinio skaldymo vaizdą, tirozinfosfatazės aktyvumą arba antigenines savybes, kaip ir šie moduliatoriniai peptidai. Pavyzdžiui, moduliatorinių peptidų skryningui iš kitų šaltinių gali būti sėkmingai panaudoti šio išradimo antikūnai.

Genas, koduojantis šio išradimo moduliatorinį peptidą, taip pat gali būti identifikuotas pagal mRNR selekciją, t.y. pagal nukleino rūgšties hibridizaciją, einančią po transliacijos in vitro. Šioje metodikoje komplementarių mRNR išskyrimui, panaudojant hibridizaciją, vartojami fragmentai. Tokiais DNR fragmentais gali būti prieinama išvalyta moduliatorinė DNR. Išskirtų mRNR produktų transliacijos in vitro produktų imunonusodinimo analizė arba funkciniai bandymai, pvz., tirozin-fosfatazės aktyvumas, identifikuoja mRNR, o tuo pačiu ir komplementarius DNR fragmentus, kurie turi norimas sekas. Be to, specifinės RNR gali būti atrinktos pagal polisomų, išskirti) iš ląstelių, adsorbciją ant imobilizuotų antikūnų prieš moduliatorinį peptidą.

Radiožymėta moduliatorinio peptido kDNR gali būti sintezuota, naudojant pasirinktą mRNR (iš adsorbuotų polisomų) kaip matricą. Tada radiožymėta mRNR arba kDNR gali būti panaudota kaip zondas homologinių moduliatorinio peptido DNR fragmentų atskyrimui nuo kitokių genominių DNR fragmentų.

Kaip aukščiau minėta, DNR seka, koduojanti svorio moduliacijos peptidus, kaip čia aprašoma, gali būti pagaminta geriau sintetiniu, negu klonavimo būdu. DNR seka gali būti sukonstruota su atitinkamais kodonais svorio moduliacijos peptido aminorūgščių sekoms. Bendrai imant, galima pasirinkti pageidaujamus kodonus norimam šeimininkui, jeigu ši seka bus naudojama ekspresijai. Pilna seka surenkama iš persidengiančių nukleotidų, gauti} standartiniais metodais, ir sujungiama į pilną koduojančią seką. Žr., pvz., Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et ai., Science, 223:1299 (1984); Jay et ai., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Sintetinės DNR sekos įgalina patogiai konstruoti genus, kurie ekspresuos svorio moduliacijos analogus, kaip aprašyta aukščiau. Kitaip, DNR, koduojanti analogus, gali būti pagaminta, panaudojant natyvių OB genų kryptingą mutagenezę arba kDNR, ir analogai gali būti gaunami tiesiogiai, panaudojant įprastą polipeptidų sintezę.

Bendras specifinės vietai negamtinių aminorūgščių įterpimo į baltymus metodas yra aprašytas Noren et ai., Science, 244:182-188 (1989). Šis metodas gali būti panaudotas ob polipeptido su negamtinėmis aminorūgštimis analogų sukūrimui.

Nekoduoiančios nukleino rūgštys

Šis išradimas apima ir pagaminimą antiprasminių nukleotidų ir ribozimų, kurie gali būti panaudoti svorio moduliacijos baltymų ekspresijos trukdymui transliaciniame lygyje. Šiame priėjime naudojama antiprasminė nukleino rūgštis ir ribozimai specifinės mRNR transliacijos blokavimui, arba blokuojant mRNR antiprasminė nukleino rūgštimi arba suskaldant ją ribozimų.

Antiprasminės nukleino rūgštys yra DNR arba RNR molekulės, kurios yra komplementarios bent daliai specifinės mRNR molekulės [žr. Weintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anai. Biochem., 172:289-295 (1988)]. Ląstelėje jos hibridizuojasi su šia mRNR, susidarant dvigrandininei milekulei. Ląstelė transliuoja sujungtos į tokią dvigrandininę formą mRNR. Todėl antiprasminės nukleino rūgštys trukdo baltymo mRNR ekspresiją. Ypatingai efektyvūs bus oligomerai, sudaryti iš maždaug penkiolikos nukleotidų, ir molekulės, kurios hibridizuojasi su AUG iniciacijos kodonu, kadangi jie yra lengvai sintezuojami, ir atrodo jie kelia mažiau problemų, negu didesnės molekulės, kai jie įvedami į svorio moduliacijos peptidą produkuojančias ląsteles. Antiprasminiai metodai buvo panaudoti daugelio genų ekspresijos inhibavimui in vitro [Marcus-Sekura, 1988 supra·, Hambor et ai., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)].

Ribozimai yra RNR molekulės, galinčios specifiškai skaldyti kitas viengrandinines RNR molekules šiek tiek panašiu į DNR restrikcijos endonukleazes būdu. Ribozimai buvo atrasti pastebėjus, kad tam tikros mRNR gali pašalinti savus intronus. Modifikuodami tokių RNR nukleotidų seką, tyrinėtojai galėjo sukurti molekules, kurios atpažįsta specifines nukleotidų sekas RNR molekulėje ir jas suskaldo [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)]. Kadangi jie yra specifiški sekoms, inaktyvuojamos tiktai tos mRNR, kurios turi specifinių sekų.

Tyrinėtojai identifikavo du ribozimų tipus - tetrahymena-tvpą ir “kūjagalvio”-tipą. Tetrahymena-ύρο ribozimai atpažįsta keturių bazių sekas, “kūjagalvio”-tipo atpažįsta 1118 bazių sekas. Kuo ilgesnė atpažįstama seka, atrodo, kad atpažinimas įvyks išimtinai norimose mRNR. Todėl specifinių mRNR inaktyvavimui ‘kūjagalvio”-tipo ribozimai yra tinkamesni, negu Tetrahymaena-ύρο ribozimai, o 18 bazių atpažinimo sekos yra labiau pageidautinos nei trumpesnės atpažinimo sekos.

Taigi, čia aprašytos DNR sekos gali būti panaudotos antiprasminėms molekulėms, o ribozimai, kurie skaldo mRNR, svorio moduliacijos peptidams ir jų ligandams gauti, tokiu būdu inhibuojant ob geno ekspresiją ir padidinant svorio priaugimą ir nutukimą.

Kitame realizavimo variante pagal šį išradimą pateikiami trumpi oligonukleotidai, kurie yra komplementarūs koduojančioms ir komplementarioms OB nukleino rūgščių grandinėms, arba yra OB geno 5’, 3’ nekoduojančios sritys, arba vidinės (introninės) koduojančios sritys. Tokios nukleino rūgštys yra naudingos kaip zondai, arba kaip tiesiogiai pažymėti oligonukleotidiniai zondai, arba kaip pradmenys polimerazinės grandinės reakcijoms, kai norima nustatyti ob geno mutacijų buvimą arba OB mRNR ekspresijos lygį. Geriausia, kai išradimo nekoduojančios nukleino rūgštys yra iš žmogaus OB geno.

Specifiniame realizavimo variante nekoduojančios nukleino rūgštys duoda homologinę rekombinaciją dauginamo geno ir/arba kitos reguliatorinės sekos prie OB geno integracijai, pvz., duoda didesnius OB polipeptido lygius, arba įveikia mutacijas ob geno reguliatorinėse sekose, kas sumažina OB polipeptido ekspresijos įprastus lygius (žr.

tarptautinę paraišką W0 91/09955 (Chappel, 1991 m. liepos 11 d.); taip pat žr. tarptautinę paraišką WO 90/14092 (Kucherlapati ir Cambel, 1990 m. lapkričio 29 d.)).

OB polipeptido pagaminimas: ekspresija ir sintezė

Transkripcinės ir transliacinės kontrolinės sekos yra DNR reguliatorinės sekos, tokios kaip promotoriai, genai-stiprintojai, terminatoriai ir panašūs, kurie sukelia koduojančios sekos ekspresiją šeimininko ląstelėje. Eukariotinėse ląstelėse poliadenilinimo signalai yra kontrolinės sekos.

Koduojanti seka yra “kontroliuojama” transkripcinių arba transliacinių sekų ląstelėje, kai RNR polimerazė transkribuoja koduojančią seką į mRNR, kuri tada yra sujungiama trans-RNR ir transliuojama į baltymą, koduojamą koduojančios sekos.

“Signalinė seka” yra baltymo, kuris bus ekspresuojamas ant ląstelės paviršiaus, koduojančios sekos pradžioje. Ši seka koduoja signalinį peptidą N-gale prie subrendusio polipeptido, kuris nukreipia šeimininko ląstelę translokuoti polipeptidą. Terminas “translokacinė signalinė seka” taip pat naudojamas šiame aprašyme šios rūšies signalinei sekai apibūdinti. Gali būti rastos translokacinės signalinės sekos, susijusios su įvairiais baltymais, charakteringos eukariotams ir prokariotams ir dažnai funkcionuoja abiejų tipų organizmuose.

DNR seka yra “operatyviai prijungta” prie ekspresijos kontrolinės sekos, kai ekspresijos kontrolinė seka kontroliuoja ir reguliuoja DNR sekos transkripciją ir transliaciją. Terminas “operatyviai prijungta’ reiškia tai, kad yra atitinkamas startinis signalas (pvz. ATG) prieš ekspresuojamą DNR seką ir išlaikymą teisingo skaitymo rėmelio, kuris leistų DNR sekos ekspresiją, kontroliuojamą ekspresijos kontrolinės sekos, ir gaminimąsi norimo produkto, koduojamo DNR sekos. Jeigu genas, kurį norime įterpti į rekombinantinę DNR molekulę, neturi atitinkamo startinio signalo, toks startinis signalas gali būti įterptas aukštyn einančia 5’ kryptimi ir į skaitymo rėmelį su genu.

“Promotoriaus seka” yra DNR reguliatorinė sritis, galinti susijungti su RNR polimeraze ląstelėje ir inicijuoti transkripciją koduojančios sekos žemyn einančia kryptimi (3’ kryptimi). Su šiuo išradimu susijusiems tikslams promotoriaus seka yra prijungta prie jo 3’ galo transkripcijos iniciacijos vietos ir tęsiasi aukštyn einančia kryptimi (5’ kryptimi), apimant minimalų bazių arba elementų, reikalingų inicijuoti transkripcijai, esant didesniems nei fonas kiekiams, skaičių. Promotoriaus sekoje bus randama transkripcijos iniciacijos vieta (ją patogu nustatyti, pavyzdžiui, su nukleaze SI), o taip pat ir baltymą rišančios dalys (konsensuso sekos), atsakingos už RNR polimerazės prijungimą.

Kita šio išradimo ypatybė yra čia aprašyta DNR sekų ekspresija. Gerai žinoma, kad DNR sekos gali būti ekspresuojamos, veiksmingai prijungiant jas prie ekspresijos kontrolinės sekos tinkamame vektoriuje ir naudojant tokį ekspresijos vektorių tinkamo vienaląsčio šeimininko transformavimui.

Toks šio išradimo DNR sekos operatyvusis prijungimas prie ekspresijos kontrolinės sekos žinoma apima, jeigu jis dar nėra DNR sekos dalis, iniciacijos kodono (ATG) sukūrimą teisingame nuskaitymo rėmelyje aukštyn einančia DNR sekos kryptimi.

Šio išradimo DNR sekų ekspresijai gali būti panaudotos įvairiausios šeimininko/ekspresijos vektoriaus kombinacijos. Tinkami ekspresijos vektoriai, pavyzdžiui, gali būti chromosominių, nechromosominių ir sintetinių DNR sekų segmentai. Tinkamiausi vektoriai apima SV40 darinius ir žinomas bakterines plazmidės, pvz, E.coli plazmidės col EI. pCRl, pBR322, pMB9, pUC arba pUC plazmidės darinius, pvz., pGEX vektorius, pET vektorius, pmal-c, pFLAG ir t.t. ir jų darinius, plazmidės, tokias kaip RP4; DNR fagus, pvz., daugybę λ fago darinių, pvz., NM989, arba kitokius DNR fagus, pvz., M13 ir grandininį viengrandininį DNR fagą; mielių plazmidės, tokias kaip 2μ plazmidė arba jos dariniai; vektorius, naudojamus eukariotinėse ląstelėse, tokius kaip vektoriai, naudojami vabzdžių arba žinduolių ląstelėse; vektorius, gautus iš plazmidžių ir DNR fagų kombinacijos, tokius kaip plazmidės, kurios buvo modifikuotos DNR arba kitokių ekspresijos kontrolinių sekų fago panaudojimui; ir panašias. Tinkamiausiame realizavimo variante ob ekspresija gaunama metilotrofinėse mielėse, pvz., Pichia pastoris mielėse (žr., pvz., tarptautinė paraiška WO 90/03431 (Brierley et ai., 1990 m. balandžio 5 d.); tarptautinė paraiška WO 90/10697 (Siegel et ai. 1990 m. rugsėjo 20 d.). Specifiniame realizavimo variante, infra, sukurtas ekspresijos vektorius ob ekspresijai, kontroliuojamas α-sukryžminto faktoriaus signalinės sekos.

Šiuose vektoriuose išradimo DNR sekų ekspresijai gali būti panaudota bet kuri iš daugybės ekspresijos kontrolinių sekų - sekų, kurios kontroliuoja DNR sekos, veiksmingai prijungtos prie jos, ekspresiją. Tokios tinkamos ekspresijos kontrolinės sekos apima, pavyzdžiui, pirmuosius arba vėlyvesniuosius SV40, CMV, vakcinų, poliomų arba adenovirusų lac sistemas, trp sistemas, TAC sistemas, TRC sistemas, LTR sistemas promotorius, daugumą λ fago operatorinių ir promotorinių sričių, fd apvalkalo baltymo kontrolines sritis, 3-fosfogliceratkinazės arba kitų glikolitinių fermentų promotorių, rūgštinės fosfatazės promotorius (pvz., Pho5) ir metilotrofinių mielių ΑΟΧ 1 promotorių mielių α-sukryžminimo faktorių promotorius ir kitokias sekas, kurios, kaip yra žinoma, kontroliuoja prokariotinių arba eukariotinių ląstelių arba jų virusų genų ekspresiją, ir įvairias jų kombinacijas.

Šio išradimo DNR sekų ekspresijai gali būti panaudota daugybė vienaląsčių šeimininkų ląstelių. Tokie šeimininkai gali būti gerai, žinomi eukariotiniai arba prokariotiniai šeimininkai, tokie kaip E.coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces kamienai; grybai, tokie kaip mielės (Saccharomyces ir metilotrofinės mielės, tokios kaip Pichia, Candida, Hansenula ir Torulopsisp ir gyvūnų ląstelės, tokios kaip CHO, Rl.l, B-W ir LM ląstelės, Afrikos žaliosios beždžionės inkstų ląstelės (pvz., COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 ir BMT 10), vabzdžių ląstelės (pvz., Sf9) ir žmogaus bei augalų ląstelės audinio kultūroje.

Aišku, kad ne visi vektoriai, ekspresijos kontrolinės sekos ir šeimininkai funkcionuos vienodai gerai, ekspresuodami šio išradimo DNR sekas. Taip pat ne visi šeimininkai su ta pačia ekspresijos sistema vienodai gerai funkcionuos. Tačiau šios srities specialistas galės pasirinkti tinkamus vektorius, ekspresijos kontrolines sekas ir šeimininkus, neatlikdamas bereikalingų eksperimentų, kad gautų norimą ekspresiją, nenukrypstant nuo išradimo objekto. Pavyzdžiui, pasirenkant vektorių, svarbu paimti tinkamą šeimininką, kadangi vektorius turi funkcionuoti jame. Taip pat reikia atsižvelgti į vektoriaus kopijų skaičių, galimybę kontroliuoti šį kopijų skaičių ir bet kurio kito, vektoriaus koduojamo baltymo, tokio kaip antibiotinis markeris, ekspresiją.

Pasirenkant ekspresijos kontrolinę seką, paprastai reikia atsižvelgti į įvairiausius faktorius. Tokie faktoriai yra, pavyzdžiui, santykinis sistemos stiprumas, jos kontroliuojamumas ir jos suderinamumas su tam tikra DNR seka arba genu, kuriuos reikia ekspresuoti, ypatingai atsižvelgiant į potencialias antrines struktūras. Tinkamus vienaląsčius šeimininkus reikia pasirinkti, atsižvelgiant į, pvz., jų suderinamumą su pasirinktu vektoriumi, jų sekrecijos charakteristikas, jų sugebėjimą teisingai sulankstyti baltymus ir jų fermentacijos reikalavimus, o taip pat j ekspresuojamo produkto, kurį koduoja DNR seka, toksiškumą šeimininkui ir į tai, ar nesunku išskirti ekspresijos produktus.

/Analizuodamas šiuos ir kitus faktorius, patyręs specialistas galės sukonstruoti daugybę vektoriaus/ekspresijos kontrolinės sekos/šeimininko kombinacijų, kurios ekspresuos šio išradimo DNR sekas, atliekant didelės apimties gyvūnų kultūros fermentaciją.

Specialiame realizavimo variante gali būti ekspresuojamas OB sulietas baltymas. OB sulietas baltymas apima bent dalį funkciškai aktyvaus ne-OB baltymo, sujungto peptidine jungtimi su bent funkciškai aktyvia OB polipeptido dalimi. Ne-ob sekos gali būti OB sekų amino- arba karboksi-gale. Geriau, kai proteolitiškai reaktyvaus OB sulieto baltymo stabiliai ekspresijai ne-OB sulieto baltymo dalis yra prijungta peptidine jungtimi prie OB baltymo amino-galo. Rekombinantinė DNR molekulė, koduojanti tokį sulietą baltymą, apima seką, koduojančią bent funkciškai aktyvią dalį ne-OB baltymo, įjungtą į OB koduojančios sekos rėmelį, ir geriausia, kai ji koduoja specifinės proteazės, pvz., trombino arba faktoriaus Xa skaldymo vietą, geriausia ties OB-ne-OB ryšiu. Specifiniame realizavimo variante sulietas baltymas ekspresuojamas Escherichia coli ir P.pastoris.

Specifiniame realizavimo variante, infra, pelės ir žmogaus ob genų ekspresijai buvo pagaminti vektoriai su ir be gln-49 kodonų bakterinėse ekspresijos sistemose ir mielių (Pichia) ekspresijos sistemose sulietiems baltymams gauti. Pagamintas ob genas su endonukleazės skaldymo vieta, pvz., naudojant PCR ir naujus pradmenis. Pageidautina patvirtinti PCR generuotas sekas, nes, naudojant šią metodiką, yra didesnė taškinės mutacijos tikimybė. Panaudota plazmidė, turinti histidino tag (His-tag) ir proteolitinio skaldymo vietą. Histidino buvimas suteikia galimybę selektyviai išskirstyti rekombinantinius baltymus, leidžiant per Ni-chelatų sudarymo kolonėlę arba panaudojant afininį gryninimą. Proteolitinio skaldymo vieta, specialiame realizavimo variante, infra, trombino skaldymo vieta, yra sukonstruota taip, kad apdorojus proteaze, pvz., trombinu, išsiskirs pilno ilgio subredęs (t.y. neturintis signalinės sekos) OB polipeptidas.

Kitu požiūriu, gali būti panaudotas pGEX vektorius [Smith et ai., Gene 67:31-40 (1988)]. Šis vektorius prijungia schistosoma japonicum gliutationin-S-transferazės kDNR prie norimos sekos. Auginami bakteriniai baltymai ir rekombinantiniai baltymai gali būti greitai išskiriami, leidžiant per redukuoto gliutationo afininę kolonėlę. Po to GST nešiklis gali būti atskeliamas nuo sulieto baltymo, skaldant specifine vietai proteaze. Po suskaldymo nešiklis ir nesuskaldytas sulietas baltymas gali būti pašalinti, panaudojant adsorbciją ant gliutationagarozės. Kai kada šioje sistemoje atsiranda sunkumų, jei užkoduotas baltymas yra netirpus vandeniniuose tirpaluose.

Rekombinantinių baltymų ekspresija bakterinėse sistemose gali duoti neteisingą baltymo sulankstymą, reikalaujantį perlankstymo. Rekombinantinis baltymas gali būti perlankstytas prieš arba po skaldymo, kad susidarytų funkciškai aktyvus OB polipeptidas. OB polipeptidas gali būti perlankstytas, panaudojant (i) baltymo inkubavimo denatūruojančiame buferyje, kuriame yra redukuojančio agento, ir po to (ii) baltymo inkubavimo buferyje, kuriame yra oksiduojančio agento ir, pageidautina, kad jame taip pat būtų stabilizuojančio agento arba chaotropinio agento, arba abiejų, stadijas. Tinkamos redoks (redukuojantis/oksiduojantis) agentų poros apima, bet neapsiriboja, redukuotą gliutationą/gliutationdisulfidą, cistiną/cisteiną, cistaminą/cisteaminą ir 2-merkaptoetanolį/ 2-hidroksietildisulfidą. Tam tikrais atvejais, prieš sudedant į redukuojantį buferį, sulietas baltymas gali būti soliubilizuotas denatūrante, tokiame kaip šlapalas. Tinkamiausiame realizavimo variante, prieš sudedant jį į redukuojantį buferį, baltymas išvalomas, pvz., panaudojant jonų mainų arba Ni-chelatų sudarymo chromatografiją. Denatūracijos agentai yra (bet neapsiribojama jais) šlapalas ir guanidino HCI. Tada rekombinantinis baltymas praskiedžiamas maždaug 10 kartų, geriau - 100 karti) oksidaciniu buferiu, kuriame yra oksidacijos agentas, tokiu kaip (bet neapsiribojant juo) 0,1 M Tris-HCI , pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oksiduoto gliutationo. Tada sulietas baltymas inkubuojamas oksidaciniame buferyje 1-24 h, geriau 2-16 h kambario temperatūroje. Oksidaciniame buferyje gali būti baltymą stabiliizuojančio agento, pvz., cukraus, alkoholio arba amonio sulfato. Oksidaciniame buferyje taip pat gali būti nedideli kiekiai chaotropinio agento, kuris destabilizuoja neteisingas tarpmolekulines sąveikas ir skatina teisingą sulankstymą. Tinkamiausi chaotropiniai agentai apima, bet neapsiriboja, detergentą poliolį, L-argininą, guanidino HCI ir polietilenglikolį (PEG). Svarbu, kad chaotropinio agento koncentracijos būti) pakankamai mažos, norint išvengti baltymo denatūracijos. Perlankstytas baltymas gali būti koncentruojamas mažiausiai apie 10 kartų, geriau iki tokio kiekio, koks buvo prieš praskiedžiant oksidaciniu buferiu.

Bakterinės fermentacijos procesai taip pat gali duoti rekombinantinio baltymo preparatus, kurie turi nepriimtinus endotoksinų kiekius. Todėl išradime aptariamas tokių endotoksinų pašalinimas, pvz., naudojant specifinius endotoksinams antikūnus arba kitokias endotoksinus surišančias molekules. Endotoksinų buvimą galima nustatyti pagal standartines metodikas, tokias kaip naudojant Ε-ΤΟΧΑΤΕ Reagents (Sigma, St. Louis, Missouri) arba biologiniais bandymais.

Apart šio specifinio pavyzdžio, šiame išradime nagrinėjama lazdelinių virusų, žinduolių ir mielių ekspresijos sistemų panaudojimas ob baltymo ekspresijai. Pavyzdžiui, lazdelinių virusų ekspresijos sistemose abu nesuliejimo pernešimo vektoriai, tokie kaip (bet jais neapsiribojama) pVL941 (Z?amHl klonavimo vietos; Summers), pVL1393 (BaznHl, Smal, Xbal, EcoRl, Notl, Xmalll, Bglll ir Pstl klonavimo vietos; Invitrogen), pVL1392 (£g/II, Pstl, Notl, Xmalll, EcoRl, Xbal, Smal ir BamHl klonavimo vietos; Summers ir Invitrogen) ir pBlueBacIII (BamHl, Bglll, Pstl, Ncol ir /PzidlII klonavimo vietos su galimu mėlyna/balta rekombinacijos skryningu; Invitrogen) ir suliejimo pernešimo vektoriai, tokie kaip (bet jais neapsiribojama) pAc700 (Ρα/uHl ir Kpnl klonavimo vietos, kuriame BamHl atpažinimo vieta prasideda iniciacijos kodonu; Summers), pAc701 ir pAc702 (toks pat kaip ir pAc700, su skirtingais nuskaitymo rėmeliais), pAc360 (BamHl klonavimo vieta, esanti 36 bazių poromis žemyn einančia kryptimi nuo poliedrino iniciacijos kodono; Invitrogen(195)) ir pBlueBacHisA, B, C (trys skirtingi nuskaitymo rėmeliai su BamHl, Bgfll, Pstl, Ncol ir Hincflll klonavimo vietomis, N-galinis peptidas ProBond valymui ir dėmių mėlyna/balta rekombinacijos skryningas; Invitrogen(220)).

Siame išradime siūlomi naudoti žinduolių ekspresijos vektoriai apima vektorius su indukuojamais promotoriais, tokiais kaip dihidrofolatreduktazės (DHFR) promotorius, pvz., bet koks ekspresijos vektorius su DHFR ekspresijos vektoriumi arba DHFR/ metotreksatokoamplifikacijos vektorius, toks kaip pED (Pstl, Sali, Sbal, Smal ir £coRl klonavimo vietos su vektoriumi, ekspresuojančiu ir klonuotą geną, ir DHFR; žr. Kaufmann, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Kitas atvejis yra glutaminsintetazės/metionino sulfoksimino koamplifikacijos vektorius, toks kaip pEE14 (Hindlll, Xbal, Smal, Sbal, £coRl ir Bell klonavimo vietos, kuriose vektorius ekspresuoja glutaminsintetazę ir klonuotą geną; Celltech). Kitame realizavimo variante gali būti panaudotas vektorius, kuris nukreipia episomalinę ekspresiją, kontroliuojamą Epštein Barr Virus, toks kaip pREP4 (BamHl, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull irKpnl klonavimo vietos konstitutyvinis RSV-LTR promotorius, higromicinui selektyvus markeris; Invitrogen), pCEP4 (BamHl, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, ΡναΙΙ ir Kpnl klonavimo vietos konstitutyvinis hCMV labai ankstyvas genas, higromicinui selektyus markeris; Invitrogen), pMEP4 (Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHl klonavimo vietos, indukuojamas methalotioneino Ha geno promotorius, higromicinui selektyvus markeris; Invitrogen), pREP8 (BamHl, Xhol, Notl, Hindlll, Nhel ir Kpnl klonavimo vietos, RSV-LTR promotorius, histidinoliui selektyvus markeris; Invitrogen), pREP9 (Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil ir BamHl klonavimo vietos, RSV-LTR promotorius, G418 selektyvus markeris; Invitrogen), pEBVHis (RSV-LTR promotorius, higromicinui selektyvus markeris, N-galinis peptidas gryninamas, leidžiant per ProBond dervą ir skaldomas enterokinaze; Invitrogen). Pasirinkti žinduolių ekspresijos vektoriai, skirti naudoti šiame išradime, yra pRc/CMV (Hindlll, RrtHI, Notl, Sbal ir Apal klonavimo vietos, G418 selekcija; Invitrogen), pRc/RSV (Hindlll, Spel, BstXl, Notl, Xbal klonavimo vietos, G418 selekcija; Invitrogen) ir kt. Vaccinia viruso žinduolių ekspresijos vektoriai (žr. Kaufmann, 1991, supra), skirti naudoti pagal šį išradimą, apima, bet neapsiriboja, pSCll (Smal klonavimo vieta, TK- ir β-gal selekcija), pMJ601 (Sali, Smdl, Afll, Narį, RspMII, BamHl, Apal, Nhel, Sarti, Kpnl ir Hindlll klonavimo vietos, TL ir βgal selekcija) ir pTKgptFIS (EcoRl, Pstl, Sali, Accl, Hindll, Sbal, BamHl ir Hpa klonavimo vietos, TK arba XPRT selekcija).

Pagal šį išradimą, OB polipeptido ekspresijai gali būti naudojamos taip pat mielių ekspresijos sistemos. Pavyzdžiui, pagal šį išradimą, paminint tik du, gali būti panaudotas nesuliejantis pYES2 vektorius (Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXl, £coRl, BstXl, BamHl, Sacl, Kpnl ir Hindlll klonavimo vietos; Invitrogen) arba suliejimo vektorius pYESHisA (Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXl, EcoRl, BstXl, BamHl, Sacl, Kpnl ir Hindlll klonavimo vietos; N-galinis peptidas valomas, leidžiant per ProBond dervą ir skaldomas enterokinaze; Invitrogen).

Taip pat manoma, kad kūno svorio moduliavimo peptidų analogai gali būti pagaminti iš nukleotidų sekų, nurodytų šiame išradime.

Apart rekombinantinės OB polipeptido ekspresijos, šiame išradime svarstoma ir laikoma pilnai įmanoma pagaminti OB polipeptidą arba jo fragmentus, naudojant gerai žinomus ir gerai ištobulintus kietafazės peptidų sintezės metodus. OB polipeptidui arba jo fragmentams gauti išradime aptariamos abi plačiai žinomos Boc ir Fmoc bei kitų apsauginių grupių strategijos. Įvairios perlankstymo ir cisteino šoninių grandinių oksidinimo metodikos, norint sudaryti disulfidinį ryšį, taip pat yra gerai žinomos.

Antikūnai OB polipeptidui

Pagal šį išradimą, OB polipeptidas, pagamintas rekombinantiniu būdu arba cheminės sintezės būdu, jo fragmentai arba kiti dariniai arba jo analogai, įskaitant sulietus baltymus, gali būti naudojami kaip imunogenai antikūnams, kurie atpažįsta OB polipeptidą, gaminti. Tokie antikūnai apima, bet neapsiriboja, polikloninius, monokloninius, chimerinius, viengrandininius, Fab fragmentus ir Fab ekspresijos biblioteką.

Molekulė yra “antigeninė”, kai ji gali specifiškai sąveikauti su imuninės sistemos antigeną atpažįstančia molekule, tokia kaip imunoglobulinas (antikūnas) arba T ląstelės antigeninis receptorius. Antigeninis polipeptidas turi mažiausiai 5, geriau bent 10 aminorūgščių. Molekulės antigeninė dalis gali būti tokia dalis, kuri yra imunodominuojanti antikūno arba T ląstelės receptoriaus atpažinimo procese, arba ji gali būti dalis, panaudota generuoti antikūnui prieš molekulę, prijungiant antigeninę dalį prie nešiklio molekulės. Molekulė, kuri yra antigeninė, nebūtinai turi būti imunogeninė, t.y. galinti iššaukti imuninį atsaką be nešiklio.

“Antikūnas” yra bet koks imunoglobulinas, įskaitant antikūnus ir jų fragmentus, kurie suriša specifinį epitopą. Šis terminas apima polikloninius, monokloninius ir chimerinius antikūnus (pastarieji plačiau aprašyti US patentuose Nr. 4816397 ir 4816567), bei antigeną rišančias antikūnų dalis, įskaitant Fab, F(ab’)₂ ir F(v) (įskaitant viengrandininius antikūnus). Taigi, čia vartojamas posakis “antikūno molekulė” įvairiose jo gramatinėse formose reiškia ir visą imunoglobulino molekulę, ir imunoglobulino molekulės imunologškai aktyvią dalį, turinčią antikūno rišančią vietą. “Rišanti antikūno vieta” yra antikūno molekulės struktūrinė dalis, turinti savyje sunkiosios ir lengvosios grandinės kintamas ir hiperkintamas sritis, kurios specifiškai suriša antigeną.

Antikūnų molekulių pavyzdžiai yra nepaliestos imunoglobuluno molekulės, beveik nepaliestos imunoglobulino molekulės ir tokios imunoglobulino molekulės dalys, kurios turi paratopą, įskaitant tokias žinomas dalis, kaip Fab, Fab’, F(ab’)₂ ir F(v); tokios dalys yra tinkamiausios naudoti čia aprašytuose terapiniuose metoduose.

Antikūno molekulės Fab ir F(ab’)? dalys gali būti pagamintos, proteolitiškai skaldant atitinkamai papainu ir pepsinu iš esmės nepaveiktas antikūno molekules pagal gerai žinomas metodikas. Žr., pavyzdžiui, Theofilopolous et ai., US patentas Nr. 4342566. Taip pat gerai žinomos Fab’ antikūno molekulės dalys; jos gaunamos iš F(ab’)₂ dalių, atlikus disulfidinio ryšio, kuris jungia dvi sunkiosios grandinės dalis, redukciją, pavyzdžiui, merkaptoetanoliu, o po to alkilinant gautą merkapto-baltymą tokiu reagentu, kaip jodacetamidas. Pageidautini antikūnai, turintys nepaliestas antikūno molekules.

Posakis “monokloninis antikūnas’ visose jo gramatinėse formose reiškia antikūną, turintį tik vienos formos antikūno jungimosi vietą, galinčią imunoreaguoti su tinkamu antigenu. Taigi, monokloninis antikūnas paprastai turi vienintelę rišimosi galimybę su antigenu, su kuriuo jis imunoreaguoja. Todėl monokloninis antikūnas gali turėti antikūno molekulę, turinčią daug antikūno rišimosi vietų, ir kiekviena iš jų bus specifinė įvairiems antigenams; pvz., bispecifinis (chimerinis) monokloninis antikūnas.

Terminas “stimuliatorius” reiškia junginį arba mišinį, kuris stiprina imuninį atsaką į antigeną. Stimuliatoriumi gali būti audinys, kuris lėtai išskiria antigeną, o taip pat limfoidinės sistemos aktyvatorius, kuris nespecifiškai stiprina imuninį atsaką [Hood et ai., in Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Dažnai pirmasis atsako iššaukimas vien tik antigenu, nesant stimuliatoriaus, nesukelia humoralinio arba ląstelinio imuninio atsako. Stimuliatoriais yra, bet neapsiribojama, pilnas Froindo stimuliatorius, nepilnas Froindo stimuliatorius, saponinas, mineraliniai geliai, tokie kaip aliuminio hidroksidas, paviršiaus aktyvios medžiagos, tokios kaip lizolecitinas, pluroniniai polipolioliai, polianijonai, peptidai, alyvos arba angliavandenilių emulsijos,.....hemocianinai, dinitrofenolis ir potencialiai naudingi žmogaus stimuliatoriai, tokie kaip BCG (bacille Calmette-Guerin) ir Corynebacterium parvum. Geriau, kai stimuliatorius yra farmaciškai tinkamas.

OB polipeptido polikloniniams antikūnams, jų fragmentams, dariniams arba analogams gauti gali būti panaudotos įvairios metodikos. Antikūnams gauti gali būti imunizuojami įvairūs gyvūnai-šeimininkai, įleidžiant OB polipeptido, arba jo darinio (pvz., fragmento arba sulieto baltymo), įskaitant (bet neapsiribojant) triušius, peles, žiurkes, avis, ožkas ir t.t. Viename realizavimo variante OB polipeptidas arba jo fragmentas gali būti sujungtas su imunogeniniu nešikliu, pvz., jaučio serumo albuminu (BSA) arba .... hemocianinu (KLH). Imunologinio atsako padidinimui gali būti panaudoti įvairūs stimuliatoriai, priklausomai nuo šeimininko, įskaitant (bet neapsiribojant) Froindo (pilną ir nepilną) stimuliatorius, mineralinius gelius, tokius kaip aliuminio hidroksidas, paviršiaus aktyviąsias medžiagas, tokias kaip lizolecitiną, polipoliolį, polianijonus, peptidus, alyvos emulsijas,... hemocianinus, dinitrofenolį ir potencialiai naudingus žmogaus stimuliatorius, tokius kaip BCG (bacille Calmette-Guerin) ir Corynebacterium parvum.

Monokloniniams antikūnams prieš OB polipeptidą, jo fragmentą, analogą arba darinį gauti gali būti panaudota bet kokia metodika, kuri leidžia pagaminti antikūno molekules nepertraukiamos ląstelių linijos kultūroje būdu. Tokios metodikos yra (bet neapsiriboja) hibridomos metodika, kurią iš pradžių išvystė Kohler et ai., Nature, 256:495497 (1975), bei triomos metodika, žmogaus β-ląstelės hibridomos metodika (Kozboret ai., Immunology Today, Ą-.T2 (1983)] ir EBV-hibridomos metodika, skirta žmogaus monokloniniams antikūnams gauti [Cole et ai., in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, pp. 77-96, Alau R. Liss, Ine., (1985)]. Gyvybingos, antikūnus produkuojančios ląstelių linijos gali būti sukurtos, panaudojant metodikas, kitokias nei suliejimo, tokias kaip tiesioginį B limfocitų trasformavimą onkogenine DNR, arba transfekavimą EpsteinBarr virusu. Žr., pvz., M.Schreier et ai., “Hybridoma Techniąues” (1980); Hammerling et ai., “Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas” (1980); Kennett et ai., “Monoclonal Antibodies” (1980); žr. taip pat US patentus Nr. 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4451570;4466917; 4472500; 4491632 ir 4493890.

Kitame išradimo realizavimo variante monokloniniai antikūnai gali būti pagaminti steriliuose gyvūnuose, naudojant naują technologiją (PCT/US90/02545). Pagal šį išradimą gali būti panaudoti žmogaus antikūnai ir gali būti gauti, naudojant žmogaus hibridomas [Cote et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983)] arba transformuojant žmogaus ląsteles EBV virusu in vitro (Cole et ai., 1985, supra). Faktiškai, pagal išradimą gali būti panaudotos metodikos, ištobulintos “chimerinių antikūnų” gavimui [Morrison et ai., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neuberger et ai., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et ai., Nature, 314:452-454 (1985)], sujungiant specifinės ob polipeptidui pelės antikūno molekulės genus su žmogaus antikūno atitinkamo biologinio aktyvumo molekulės genais. Tokie žmogaus arba humanizuoti chimeriniai antikūnai yra tinkamesni naudoti žmogaus ligų arba sutrikimų terapijoje (aprašyta infra), kadangi yra mažiau tikėtina, kad patys žmogaus arba humanizuoti antikūnai, kaip ksenogeniniai antikūnai, indukuos imuninį atsaką, ypatingai alerginį atsaką.

Pagal išradimą, metodikos, aprašytos viengrandininiams antikūnams gauti (US patentas Nr.4946778) gali būti pritaikytos OB polipeptidui specifiniams viengrandininiams antikūnams gauti. Papildomame išradimo realizavimo variante naudojamos metodikos, aprašytos Fab ekspresijos bibliotekų sudarymui [Huse et ai, Science, 246:1275-1281 (1989)], leidžiančios greitai ir lengvai identifikuoti monokloninius Fab fragmentus su norimu specifiškumu ob polipeptidui, jo dariniams arba analogams.

Antkūno fragmentai, kurie turi antikūno molekulės idiotipą, gali būti pagaminami pagal įvairias žinomas metodikas. Pavyzdžiui, tokie fragmentai apima (bet neapsiriboja): F(ab’)₂ fragmentą, kuris gali būti pagamintas, panaudojant antikūno molekulės skaldymą pepsinu; Fab’ fragmentus, kurie gali būti gaunami, redukuojant F(ab’)₂ fragmento disulfidinius tiltelius; ir Fab fragmentus, kurie gali būti pagaminami, veikiant antikūno molekulę papainu ir redukcijos agentu.

Antikūnų gamyboje gali būti atliktas pageidaujamo antikūno skryningas pagal šioje srityje žinomas metodikas, pvz., radioimuninė analizė, ELISA, “sumuštinio” imunoanalizė, imunoradiometrinė analizė, gel-difuzijos nusodinimo reakcijos, imunodifuzinė analizė, in situ imunoanalizė (pvz., naudojant koloidinį auksą, fermentą ir radioizotopines žymes), vesterno blotingas, nusodinimo reakcijos, agliutinacijos bandymai (pvz., gel-agliutinacijos bandymai, hemagliutinacijos bandymai), komplementiniai fiksacijos bandymai, imunofluorescentinė analizė, A baltymo bandymai ir iniunoelektroforezės bandymai ir t.t. Viename realizavimo variante antikūno susijungimas nustatomas, nustatant žymę ant pirminio antikūno. Kitame realizavimo variante pirminis antikūnas nustatomas, nustatant antrinio antikūno arba reagento susijungimą su pirminiu antikūnu. Dar kitame realizavimo variante buvo pažymėtas antrinis antikūnas.

Imunobandymuose ryšio susidarymo nustatymui yra žinoma daug priemonių, ir jas apima šis išradimas. Pavyzdžiui, norint atrinkti antikūnus, kurie atpažįsta OB polipeptido specifinį epitopą, galima analizuoti produkto generuotas hibridomas, kurios jungiasi su tokį epitopą turinčiu OB polipeptido fragmentu. Antikūną, specifinį OB polipeptidui iš tam tikros gyvūnų rūšies, galima atrinkti, remiantis teigiamu susirišimu su OB polipeptidų, ekspresuotu arba išskirtu iš tos rūšies gyvūno ląstelių.

Aukščiau minėti antikūnai gali būti panaudoti žinomuose metoduose, susijusiuose su OB polipeptido lokalizacija ir aktyvumu, pvz., vesterno blotinge, OB polipeptido atvaizdavime in šita , jo kiekio tam tikruose fiziologiniuose mėginiuose matavimuose ir pan.

Specifiniame realizavimo variante gali būti generuojami antikūnai, kurie agonizuoja arba antagonizuoja OB polipeptido aktyvumą. Tokie antikūnai gali būti analizuojami, naudojant bandymus, aprašytus infra, ligandų identifikavimui.

Specifiniame realizavimo variante antikūnai pagaminami imunizuojant triušius sintetiniais peptidais, turinčiais numatyto baltymo seką, arba rekombinantiniais baltymais, pagamintais, naudojant bakterinius ekspresijos vektorius. Sintetiniai peptidai parinkti, rūpestingai išanalizavus numatyto baltymo struktūrą, kaip aprašyta aukščiau. Ypatingai pasirenkama peptido seka tarp galimų skaldymo vietų. Sintetiniai peptidai prijungiami prie nešiklio, tokio kaip KLH hemocianinas arba BSA, naudojant karbodiimidą, ir naudojami triušių imunizavimui Froindo stimuliatoriuje. Norint gauti rekombinantinį baltymą, polipeptido ekspresijai gali būti panaudotas pGEX vektorius (Smith et ai., 1988, supra). Kitu atveju sulieto baltymo generavimui galima naudoti tik hidrofilines dalis. Pagaminamas reikiamas ekspresuojamo baltymo kiekis ir naudojamas triušiams imunizuoti Froindo stimuliatoriuje.

Kitame specifiniame realizavimo variante rekombinantinis OB polipeptidas naudojamas viščiukams imunizuoti, o viščiukų anti-OB antikūnai išskiriami iš kiaušinio trynio, pvz., panaudojant afininj valymą per OB kolonėlę. Geriausia, kai imunizacijai vartojami viščiukai laikomi specifinėse nepatogeninėse (SPF) sąlygose.

Kitame realizavimo variante buvo generuoti antikūnai prieš leptiną oblob pelėse, kuriose nėra cirkuliuojančio OB baltymo, ir todėl galima laukti, kad jos galės generuoti anti-OB polipeptidinį atsaką, kadangi jos netoleruos polipeptido, ir laukinio tipo pelėse.

-r ι

Gali būti sulietos abiejų grupių pelių blužnies ląstelės su mielomos ląstelėmis, pagaminant hibridomą monokloniniams antikūnams.

Dar viename realizavimo variante triušių imunizavimui panaudotas rekombinantinis OB polipeptidas, o prieš naudojimą polikloniniai antikūnai buvo išgryninti imuniniu būdu. Išgryninti antikūnai yra ypatingai tinkami pusiau kiekybiniams bandymams, ypatingai, nustatant serume arba plazmoje cirkuliuojančio OB polipeptido buvimą.

Monokloninių antikūnų prieš moduliatorinius peptidus rinkiniai gali būti išskirstomi pagal įvairias savybes, t.y. izotipą, epitopą, afiniškumą ir t.t. Ypatingai įdomūs yra monokloniniai antikūnai, kurie neutralizuoja moduliatorinių peptidų aktyvumą. Tokie monoklonai gali būti lengvai identifikuojami svorio moduliatorių aktyvumo bandymuose. Didelio afiniškumo antikūnai taip pat yra vertingi, kai galima atlikti natyvaus arba rekombinantinio moduliatoriaus imunoafininį valymą.

Geriau, kai anti-moduliatorinis antikūnas, naudojamas šio išradimo diagnostiniuose arba terapiniuose būduose, yra afininio valymo būdu išvalytas polikloninis antikūnas. Dar geriau, kai antikūnas yra monokloninis antikūnas (mAb). Be to, pageidautina, kad čia naudojamos antimoduliatorinio antikūno molekulės būtų Fab, Fab’, F(ab’)? arba F(v) formos arba pilnos antikūno molekulės.

Diagnostinė reikšmė

Šis išradimas taip pat susijęs su įvairiais diagnostiniais pritaikymais, įskaitant sąlygų ir/arba stimulų, kurie veikia į kūno svorio nenormalumus arba nutukimą, buvimo nustatymo metodus, pasinaudojant galimybe išgauti aktyvumus, kuriuose tarpininkauja svorio moduliatoriai. Kaip aukščiau minėta, svorio moduliacijos peptidai gali būti panaudoti antikūnams prieš šiuos peptidus gauti, panaudojant daugybę žinomų metodikų; tada tokie antikūnai gali būti išskiriami ir naudojami tam tikro transkripcinio aktyvumo įtariamose tikslinėse ląstelėse buvimo nustatymui. Kitu atveju, diagnostikoje gali būti taikomos šio išradimo nukleino rūgštys.

Antikūnais paremta diagnostika

Kaip buvo pasiūlyta anksčiau, šiame išradime naudojami diagnostiniai metodai apima ląstelinio mėginio arba terpės tyrimą, atliekant bandymus, apimančius efektyvų kiekį antagonisto moduliatoriniam baltymui, tokio kaip anti-moduliatoriaus antikūno, geriausia polikloninio antikūno, išvalyto afininiu būdu, o dar geriau mAb. Be to, pageidautina, kad čia naudojamo anti-moduliatoriaus antikūno molekulės būtų Fab, Fab’, F(ab’)? arba F(v) dalių formos arba pilnos antikūno molekulės. Kaip buvo aptarta aukščiau, pacientai, kuriems gali būti naudingas šis metodas, yra pacientai, sergantys vėžiu, AIDS, nutukimu arba kitomis ligomis, kurių charakteristika arba faktorius yra nenormalus kūno svoris. Moduliatoriaus išskyrimo ir anti-moduliatoriaus antikūnų indukavimo būdai ir anti-moduliatoriaus antikūnų panaudojimo tikslinių ląstelių tyrimuose būdai yra gerai žinomi šios srities specialistams.

Be to, tam tikrą diagnostinį pritaikymą gali turėti antikūnai, įskaitant tiek polikloninius, tiek ir monokloninius antikūnus, ir vaistai, kurie moduliuoja svorio kontrolės moduliatorių gaminimąsi arba aktyvumą, bei kitokie atpažinimo faktoriai ir/arba jų subvienetai, ir, pavyzdžiui, gali būti panaudoti būsenų, kuriose yra kūno svorio nenormalumai arba jie gali atsirasti, nustatymo ir/arba išmatavimo tikslams. Pavyzdžiui, moduliatoriniai peptidai arba jų aktyvūs fragmentai gali būti panaudoti tiek polikloniniams, tiek monokloniniams antikūnams prieš šiuos peptidus gauti įvairiose ląstelinėse terpėse pagal žinomas metodikas, tokias kaip hibridomos metodika, naudojant, pavyzdžiui, sulietus pelės blužnies limfocitus ir mielomos ląsteles. Ši metodika smulkiau aprašyta žemiau. Panašiai gali būti atrastos arba susintetintos mažos molekulės, kurios imituoja arba antagonizuoja šio išradimo receptoriaus atpažinimo faktorių aktyvumą(us), ir gali būti panaudotos diagnostiniuose ir/arba terapiniuose protokoluose.

Svorio moduliatorių buvimą ląstelėse galima nustatyti, panaudojant įprastas, tokiam nustatymui taikomas imunologines metodikas. Yra žinoma daug tinkamų metodikų. Trys tokios metodikos yra ypatingai tinkamos, naudojant arba receptoriaus atpažinimo faktorių, pažymėtą nustatoma žyme, arba antikūną Ab2, pažymėtą nustatoma žyme. Metodikos gali būti apibendrintos toliau duodamomis lygtimis, kuriose žvaigždutė rodo, kad dalelė yra pažymėta, o “WM” reiškia svorio moduliatorių:

A. WM‘ + Abi = WMAbi

B. WM + Ab\ = WMAb\

C. WM + Abi + Ab₂‘ = AbiWMAb₂’

Metodikos ir jų taikymas yra įprastos šios srities specialistams ir gali būti naudojamos ir šiame išradime. “Konkurencinė” metodika (A metodika) aprašyta US patentuose Nr. 3654090 ir Nr. 3850752. B metodika atstovauja gerai žinamą konkurencinio bandymo metodiką. C metodika (“sumuštinio” metodika) aprašyta US patentuose Nr. RE 31006 ir Nr. 4016043. Žinomos ir kitos metodikos, tokios kaip “dvigubo antikūno” arba “DASP” metodikos.

Kiekvienu atveju svorio moduliatoriai sudaro kompleksus su vienu arba daugiau antikūnų arba rišančių partnerių, ir vienas komplekso narys yra pažymėtas nustatoma žyme. Komplekso susidarymo faktą, ir, jeigu pageidaujama, jo kiekį galima nustatyti pagal žinomus žymių nustatymo metodus.

Iš to, kas pasakyta aukščiau, galima matyti, kad charakteringa Ab₂ savybė yra ta, kad jis reaguoja su Abi. Taip yra todėl, kad Abi, sukeltas žinduolių rūšyse, buvo panaudotas kitose rūšyse kaip antigenas antikūnui Ab₂ sukelti. Pavyzdžiui, Ab₂ gali būti sukeltas ožkose kaip antigenas, naudojant triušio antikūnus. Todėl, Ab₂ bus anti-triušio antikūnas, sukeltas ožkose. Šiame aprašyme ir apibrėžtyje Abi reiškia pirminį arba antsvorio moduliatoriaus antikūną, o Ab₂ - antrinį arba anti-Abi antikūną.

Šiuose tyrimuose plačiausiai naudojamos žymės yra radioaktyvūs elementai, fermentai, cheminės medžiagos, kurios fluorescuoja, apšvietus ultravioletine šviesa, ir kt. Yra žinoma daug fluorescuojančių medžiagų, kurios gali būti panaudotos kaip žymės. Tokios medžiagos, yra, pavyzdžiui, fluoresceinas, rodaminas ir auraminas. Ypatinga detektuojama medžiaga yra anti-triušio antikūnas, pagamintas ožkose, ir sujungtas su fluoresceinu, panaudojant izotiocianatą.

Svorio moduliatoriai arba jų rišantys partneriai taip pat gali būti pažymėti radioaktyviu elementu arba fermentu. Radioaktyvi žymė gali būti nustatyta pagal bet kokią prieinamą skaičiavimo metodiką. Tinkami izotopai gali būti pasirinkti iš Ή, ¹⁴C,

32_p, 35_S, 36_C1, 51_Cr, 58^ 59^ 90_γ? 125^ 13Iį 186_Re

Taip pat tinkamos yra ir fermentinės žymės; jos gali būti nustatomos, naudojant šiuolaikines kolorimetrines, spektrofotometrines, fluorospektrofotometrines, amperometrines arba gazometrines metodikas. Fermentas gali būti sujungtas su pasirinkta dalele, panaudojant tiltelius sudarančių molekulių, tokių kaip karbodiimidas, diizocianatai, gliutaro aldehidas ir pan., reakciją. Yra žinoma ir gali būti panaudota daug fermentų, naudojamų tokiose metodikose. Tinkamiausi yra peroksidazė, β-gliukuronidazė, β-D-gliukozidazė, β-D-galaktozidazė, ureazė, gliukozidazė plius peroksidazė ir šarminė fosfatazė. Kitos žymėjimo medžiagos ir metodai pateikti US patentuose Nr. 3654090; 3850752 ir 4016043.

Dar viename šio išradimo realizavimo variante gali būti pagaminti rinkiniai, kuriuos gali naudoti medicinos specialistai, norėdami nustatyti nulemto transkripcinio aktyvumo arba nulemto transkripcinio aktyvumo galimybės įtariamose tikslinėse ląstelėse buvimą arba nebuvimą. Pagal aukščiau aprašytas tyrimų metodikas, viena tokių rinkinių klasė susidės mažiausiai iš žymėto svorio moduliatoriaus arba jo rišančio partnerio, pavyzdžiui, jam specifinio antikūno, ir instrukcijų, aišku priklausančių nuo pasirinkto metodo, pvz., “konkurencinis”, “sumuštinio”, “DASP” ir pan. Rinkiniuose taip pat gali būti pagalbiniai reagentai, tokie kaip buferiai, stabilizatoriai ir t.t.

Tokiu būdu, gali būti pagamintas test-rinkinys, skirtas ląstelių nulemto transkripcinio aktyvumo galimybės parodymui, susidedantis iš:

(a) bent vieno žymėto imunochemiškai reaktingo komponento iš anksto nustatyto kiekio, gauto tiesiogiai arba netiesiogiai prijungiant šj svorio moduliatorių arba jo specifinį rišantį partnerį prie detektuojamos žymės;

(b) kitų reagentų; ir (c) minėto rinkinio vartojimo instrukcijos.

Tiksliau, į diagnostinį rinkinį gali įeiti:

(a) žinomas kiekis aprašyto svorio moduliatoriaus (arba rišančio partnerio), prijungto prie kietos fazės, susidarant imunosorbentui, arba kitu atveju, prijungto prie tinkamos žymės, arba vieno iš daugelio tokių galimų produktų ir t.t., (arba jų rišančių partnerių);

(b) jeigu reikia, kiti reagentai; ir (c) minėto rinkinio naudojimo instrukcijos.

Kituose variantuose gali būti pagaminti test-rinkiniai aukščiau minėtiems tikslams, kurie dirba pagal iš anksto numatytą protokolą (pvz., “konkurencinį”, “sumuštinio”, “dvigubo antikūno” ir t.t.), kurie susideda iš:

(a) žymėto komponento, kuris buvo gautas sujungiant svorio moduliatorių su detektuojama žyme;

(b) vieno arba daugiau papildomų imunocheminių reagentų; bent vienas iš šių reagentų turi būti ligandas arba imobilizuotas ligandas, kuris yra pasirinktas iš grupės, kurią sudaro:

(i) ligandas, galintis susijungti su žymėtu (a) komponentu (ii) ligandas, galintis susijungti su žymėto (a) komponento rišančiu partneriu;

(iii) ligandas, galintis susijungti su bent vienu komponentu, kurį reikia nustatyti; ir (iv) ligandas, galintis susijungti su bent vieno komponento, kurį reikia nustatyti, bent vienu rišančiu partneriu; ir (c) instrukcijų, kaip vykdyti imunocheminės reakcijos tarp svorio moduliatoriaus ir specifinio rišančio partnerio vieno arba daugiau komponentų detekcijos ir/arba nustatymo protokolą.

Nukleino rūgštimis paremta diagnostika

Kaip parodyta pavyzdžiuose, infra, šio išradimo nukleino rūgštys gali būti panaudotos defektams, susijusiems su defektais OB polipeptide, kurie atsiranda nutukusiuose fenotipuose, nustatyti. Pavyzdžiui, norint nustatyti, ar nutukęs fenotipas yra susijęs su OB mRNR ekspresijos trūkumu, ar su nefunkcionalios OB mRNR ekspresija, pvz., kaip dbldb pelėse (kur nepakankamumas atsiranda dėl OB receptoriaus trūkumo), ar kai mutacijos duoda netranskribuotą mRNR, gali būti panaudoti nukleino rūgščių zondai (pvz., Northerno analizė arba RT-PCR analizė). Be to, nukleino rūgštimis paremtos diagnostikos metodikos pagal šį išradimą gali būti panaudotos kartu su antikūnais paremtomis metodikomis tolesniam nutukusių arba anoreksiškų fenotipų tyrinėjimui molekuliniame lygyje.

Buvo nustatytos neseniai išskirti} žmogaus kDNR klonų sekos. Tai palengvina pilnos žmogaus geno sekos nustatymą (žr. fig. 2A-C; SEQ ID NO:22). Buvo gautos žmogaus OB geno intronų DNR sekos (fig. 20), ir jos buvo panaudotos PCR pradmenims pagaminti geno iš žmogaus genominės DNR koduojančios sekos PCR amplifikacijai, norint nustatyti OB geno mutacijas arba alelinius variantus pagal čia anksčiau smulkiai aprašytas metodikas. Specifiniai PCR pradmenys žmogaus genominio OB amplifikacijai aprašyti specifiniame pavyzdyje, infra.

Pagal dabartinę hipotezę laikoma, kad heterozigotinės mutacijos ob gene yra susijusios su mažu/vidutiniu nutukimu, o homozigotinės mutacijos turėti} būti susijusios su keletu DNR sekomis paremtų nutukimo testų. Jei taip yra iš tikrųjų, būti} galima nustatyti nutukimo atsiradimo riziką žmonėms, ir įgalinti} pritaikyti gydymą vaistais ir/arba gyvenimo įpročių pakeitimus prieš pilnai išsivystant kūno svorio padidėjimui.

Kitu atveju, diagnostikoje gali būti panaudotas mikrosatelitų, kurie atskyla nuo žmogaus OB mutantinių formų, buvimas. Šiuo atveju gali būti panaudoti įvairūs PCR pradmenys, įskaitant pradmenis, paremtus nukleotidų sekomis, duotomis fig. 20 A-C.

OB genas taip pat gali būti naudojamas diagnostikoje jo koduojamos RNR ir baltymo matavimams, esant mitybos sutrikimams. Svarbu žinoti, ypatingai mitybos sutrikimų atveju, ar OB RNR ir/arba jos koduojamo baltymo kiekiai yra padidinti ar sumažinti. Taigi, jei nutukęs asmuo turi padidintus OB kiekius, atrodyti}, kad OB skatina nutukimą, tuo tarpu jei OB kiekis yra sumažintas, atrodytų, kad per daug maži OB kiekiai gali būti nutukimo priežastis (jeigu OB gene yra defektas arba jo nėra). Atvirkščiai, jei vėžiu arba AIDS sergantis pacientas, kuris prarado svorį, turi padidintą OB kiekį, galima daryti išvadą, kad per daug didelė OB ekspresija yra atsakinga už svorio praradimą.

Žmogaus OB RNR kiekiams išmatuoti panaudojama klonuota žmogaus kDNR. Be to, pagaminamas rekombinantinis žmogaus baltymas ir panaudojamas imunobandymuose, įgalinančiuose išmatuoti OB baltymo kiekius riebaluose ir, gal būt, plazmoje.

Terapinė reikšmė

Šio išradimo polipeptidai, nukleino rūgštys ir antikūnai turi nemažą terapinį potencialą. Geriau, kai vartojamas tokio agento terapiškai efektyvus kiekis, esantis farmaciškai tinkamame nešiklyje, skiediklyje arba priede.

Terminas “farmaciškai tinkamas” reiškia molekules ir kompozicijas, kurios yra fiziologiškai toleruojamos ir, jei jas vartoja žmonės, paprastai neduoda alerginių arba panašių neigiamų reakcijų, tokių kaip skrandžio sutrikimai, galvos svaigimas ir pan. Pageidautina, kaip čia ir vartojama, terminas “farmaciškai tinkamas” reiškia, kad jis yra federalinės arba valstijos valdžios aprobuotas arba įrašytas į U.S. Pharmacopeia ir gali būti vartotinas gyvuliams, ypatingai žmonėms. Terminas “nešiklis” reiškia skiediklį, stimuliatorių, priedą arba tirpiklį, su kuriais vartojamas junginys. Tokie farmaciniai nešikliai gali būti sterilūs skysčiai, tokie kaip vanduo ir alyvos, įskaitant naftos, gyvulinės, augalinės arba sintetinės kilmės, tokios kaip riešutų aliejus, sojos aliejus, mineralinė alyva, sezamo aliejus ir pan. Pageidautina nešikliais naudoti vandenį, valgomosios druskos tirpalus ir vandeninius dekstrozės ir glicerolio tirpalus, ypatingai injekcijoms skirtiems tirpalams. Tinkami farmaciniai nešikliai aprašyti Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

Čia naudojamas terminas “terapiškai efektyvus kiekis” reiškia kiekį, kurio reikia, kad būtų galima sumažinti kliniškai reikšmingą aktyvumą, funkcijos arba atsako trūkumą šeimininke apie 15%, geriau bent 50%, geriausia bent 90%. Kitu atveju, terapiškai efektyvus kiekis yra toks kiekis, kurio pakanka, kad būtų gaunamas kliniškai reikšmingas šeimininko būsenos pagerėjimas.

Rekombinantinio OB polipeptido vartojimas sukelia svorio sumažėjimą, ypatingai riebalinio audinio sumažėjimą. OB polipeptidas gali būti pagamintas, naudojant standartinius bakterinius ir/arba žinduolių ekspresijos vektorius, sintetiniu būdu arba išskirtas iš plazmos arba serumo, kaip smulkiau aprašyta aukščiau. Kitu atveju, padidintą natyvaus OB polipeptido ekspresiją galima sukelti homologinės rekombinacijos pagalba, kaip aprašyta supra.

OB polipeptido aktyvumo sumažinimas (antagonistais, inhibitoriais, panaudojant neutralizuojančius antikūnus arba antiprasmines molekules) turėtų skatinti svorio priaugimą, kas gali būti pageidautina gydant svorio praradimą, susijusį su vėžiu, AIDS arba nervine anoreksija. OB aktyvumo moduliavimas gali būti reikalingas kūno svorio mažinimui (didinant jo aktyvumą) arba kūno svorio didinimui (mažinant jo aktyvumą).

Terapinis gydymas, paremtas polipeptidų

Pagal paprasčiausią analizę, OB genas apsprendžia žinduolių, atskiru atveju pelių ir žmogaus, kūno svorį. Pasirodo, kad OB geno produktas, ir atitinkamai giminingos molekulės, yra signalinio kelio dalis, pagal kurį adipozinis audinys susisiekia su smegenimis ir kitais organais. Manoma, kad pats OB polipeptidas yra signalinė molekulė, t.y. hormonas.

OB polipeptidas, jo funkciškai aktyvus fragmentas arba jo antagonistas gali būti vartojamas peroraliniu arba parenteriniu būdais, geriausia parenteriniu. Kadangi metabolinė homeostazė yra nepertraukiamas procesas, tinkamiausias yra kontroliuojamo ob polipeptido išskyrimo vartojimo būdas. Pavyzdžiui, polipeptidas gali būti vartojamas, naudojant intraveninę infuziją, implantuojamą osmotinį siurblį, transderminį pleištą, liposomas arba kitus vaistų vartojimo būdus. Viename realizavimo variante gali būti panaudotas siurblys [Langer et ai., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Press., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et ai., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et ai., N. Engi. J. Med., 321:574 (1989)]. Kitame realizavimo variante gali būti panaudotos polimerinės medžiagos [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen et ai., eds., Controlled Dmg Bioavailability, DrugProduct Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et ai., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); taip pat žr. Levy et ai., Science, 228:190 (1985); During et ai., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et ai., J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. Dar kitame realizavimo variante kontroliuojamo išskyrimo sistema gali būti patalpinta prie pat terapinio taikinio, t.y. smegenų, tokiu atveju reikia tik dalies sisteminės dozės [žr., pvz., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. Kitos kontroliuojamo išskyrimo sistemos aptartos Langer, Science, 249:1527-1533 (1990) apžvalgoje. Dar kitame realizavimo variante terapinis junginys gali būti paduodamas pūslelėse, ypatingai liposomose [žr. Langer, 1990, supra; Treat et ai., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327].

Dar vienu požiūriu, rekombinantines ląstelės, kurios buvo transformuotos OB genu ir kurios ekspresuoja didelius OB polipeptido kiekius, gali būti transplantuotos subjektui, kuriam reikalingas ob polipeptidas. Geriausia, norint išvengti atmetimo, transplantuoti autologines ląsteles, transformuotas OB; kitu atveju, yra žinoma technologija, įgalinanti įterpti neautologines ląsteles, kurios produkuoja tirpius faktorius, į polimerinę matricą, ir taip išvengti imuninio atpažinimo ir atmetimo.

OB polipeptidas gali būti įvedamas intraveniniu, intraarteriniu, intraperitoniniu, intraraumeniniu arba subkutaniniu būdais. Kitu atveju, polipeptidas tinkamoje kompozicijoje gali būti vartojamas nazaliniu arba peroraliniu būdu. Pastovus OB tiekimas gali būti užtikrintas, duodant terapiškai efektyvią dozę (t.y. dozę, kuri gali indukuoti subjekto metabolinius pokyčius) reikiamais intervalais, pvz., kasdien, kas 12 valandų ir t.t. Šie parametrai priklausys nuo ligos, kurią reikia gydyti, sunkumo, kitokių veiksnių, tokių kaip dietos pakeitimų, kuriuos, priklausomai nuo subjekto svorio, amžiaus, lyties ir kitokių kriterijų patyręs specialistas nesunkiai nustatys.

Farmacinės kompozicijos

Pagal dar vieną šio išradimo aspektą yra siūlomos aukščiau minėtos farmacinės kompozicijos. Tokios farmacinės kompozicijos gali būti skirtos injekcijoms, peroraliniam, pulmonariniam, nazaliniam ir kitokiam vartojimui. Bendrai imant, farmacinės kompozicijos, kurias apima šis išradimas, susideda iš išradimo baltymo arba jo darinių produktų efektyvių kiekių ir farmaciškai tinkamų skiediklių, konservantų, tirpimą skatinančių medžiagų, emulgiklių, stimuliatorių ir/arba nešiklių. Į tokias kompozicijas įeina įvairios sudėties (pvz., Tris-HCI, acetatas, fosfatas), pH ir joninės jėgos buferiniai skiedikliai; priedai, tokie kaip detergentai arba tirpimą skatinančios medžiagos (pvz., Tween 80, Polysorbate 80), antioksidantai (pvz., askorbo rūgštis, natrio metabisulfitas), apsauginės medžiagos (pvz., timerzolis, benzilo alkoholis) ir tūrį suteikiančios medžiagos (pvz., laktozė, manitolis); medžiaga gali būti įterpiama į tam tikrą polimerinę medžiagą, tokią kaip polilaktato rūgštis, poliglikolio rūgštis, ir t.t., arba į liposomas. Taip pat gali būti panaudota hilaurono rūgštis. Tokios kompozicijos gali veikti šio išradimo baltymų ir jų darinių fizinę būseną, stabilumą, išsiskyrimo ir pašalinimo greitį in vivo. Žr., pvz., Martin, Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) p. 1435-1712, kuris pridedamas kaip literatūros šaltinis. Pagamintos kompozicijos gali būti skystos arba jas galima išdžiovinti iki miltelių, pvz., liofilizuotos formos.

Peroralinis vartojimas

Šiame išradime aptariamos peroraliniam vartojimui skirtos kietos dozuotos formos, kurios yra aprašytos Martin, Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, chapter 89), kuris čia duodamas kaip literatūros šaltinis. Kietos dozuotos formos apima įvairias tabletes, kapsules, piliules, oblatas arba žirnelius. Šios kompozicijos gali būti įvestos į liposomas, arba panaudojamas jkapsuliavimas į baltymus (tokius kaip, pvz., į baltymines mikrosferas, aprašytas US patente Nr. 4925673). Gali būti panaudotas liposominis kapsuliavimas ir gali būti pagaminti liposomų dariniai su įvairiais polimerais (pvz. US patentas Nr. 5013556). Galimos kitos dozuotos formos, skirtos terapiniam naudojimui, aprašytos Marshall, in Modem Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed., (1979), kuris čia duodamas kaip literatūros šaltinis. Bendru atveju, į kompozicijas įeina baltymas (arba chemiškai modifikuotas baltymas) ir inertiniai ingredientai, kurie apsaugo baltymą nuo skrandžio aplinkos ir išskiria biologiškai aktyvią medžiagą žarnyne.

Specialiai aptariamas peroraliniam vartojimui skirtos aukščiau minėtų baltymų dozuotos formos. Baltymas gali būti chemiškai modifikuotas taip, kad būtų efektyvus darinio peroralinis vartojimas. Bendrai imant, aptariama cheminė modifikacija reiškia bent vienos liekanos prijungimą prie paties baltymo (arba peptido) molekulės, kur minėta liekana užtikrina (a) proteolizės inhibavimą ir (b) įvedimą į kraują iš skrandžio arba žarnyno. Taip pat pageidautina padidinti bendrą baltymo stabilumą ir jo cirkuliacijos laiką kraujyje. Tokių liekanų pavydžiais yra: polietilenglikolis, etilenglikolio ir propilenglikolio kopolimerai, karboksimetilceliuliozė, dekstranas, polivinilo alkoholis, polivinilpirolidonas ir poliprolinas [Abuchowski et ai., 1981, supra·, Newmark et ai., J. Appl. Biochem., 4:185189 (1982)]. Kiti polimerai, kurie gali būti panaudoti, yra poli-l,3-dioksolanas ir poli1,2,6-trioksokanas. Kaip aukščiau minėta, tinkamiausios farmaciniams tikslams yra polietilenglikolio liekanos.

Baltymo (arba darinio) išsiskyrimo vieta gali būti skrandis, mažasis žarnynas (dvylikapirštė žarna, storoji žarna arba klubinė žarna) arba didysis žarnynas. Patyręs specialistas galės sudaryti kompozicijas, kurios netirps skrandyje, o išskirs medžiagą dvylikapirštėje žarnoje arba kitoje žarnyno vietoje. Pageidautina apsaugoti medžiagą nuo skrandžio aplinkos žalingo poveikio, arba apsaugant baltymą (arba darinį), arba išlaisvinant biologiškai aktyvią medžiagą ne skrandyje, o žarnyne.

Norint užtikrinti visišką atsparumą skrandžio aplinkos poveikiui, reikia panaudoti dangas, per kurias neprasiskverbia medžiaga bent iki pH=5.0. Įprastų įnertinių ingredientų, kurie naudojami enteriniam padengimui, pavyzdžiais yra celiuliozės acetato trimetilatas (CAT), hidroksipropilmetilceliuliozės ftalatas (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinilacetato ftalatas (PVAP), Eudragit L30D, Aąuateric, celiuliozės acetato ftalatas (CAP), Eudragit L, Eudragit S ir Shellac. Tokie padengimai gali būti naudojami kaip mišrios plėvelės.

Padengiančios medžiagos arba jų mišiniai gali būti naudojami ir tablečių padengimui, kurios nėra skirtos apsaugojimui nuo skrandžio aplinkos poveikio. Tai gali būti cukraus dangos arba dangos, kurios palengvina tabletės nurijimą. Kapsulės gali būti padarytos iš kieto apvalkalo (tokio kaip želatina) kietų vaistų, t.y. miltelių, įvedimui. Skystoms formoms gali būti panaudotas minkštas želatinos apvalkalas. Oblatų apvalkalo medžiaga gali būti tirštas krakmolas arba valgomas popierius. Piliulėms, kietoms tabletėms arba sutrintoms tabletėms gali būti panaudotos kieto sulipdymo metodikos.

Vaistinė medžiaga gali būti įterpiama į kompozicijas smulkių multidalelių, tokių kaip granulės arba rutuliukai, kurių dalelių dydis yra apie 1 mm, pavidalu. Kapsulių kompozicijų medžiaga taip pat galės būti milteliai, šiek tiek suspausti gabaliukai arba netgi tabletės. Vaistinė medžiaga paruošiama presavimo būdu.

Taip pat gali būti pridėta spalvą ir skonį suteikiančių agentų. Pavyzdžiui, gali būti suformuotas baltymas (arba darinys) (pvz., inkapsuiiuotas į liposomas arba mikrosferas), ir po to dedamas į valgomą produktą, tokį kaiop atšaldytas gėrimas, turintis spalvą ir skonį suteikiančių medžiagų.

Galima praskiesti arba padidinti terapinės medžiagos tūrį inertine medžiaga. Tokie skiedikliai gali būti angliavandeniai, ypač manitolis, α-laktozė, bevandenė laktozė, celiuliozė, sacharozė, modifikuoti dekstranai ir krakmolas. Kaip užpildai taip pat gali būti tam tikros neorganinės druskos, įskaitant kalcio trifosfatą, magnio karbonatą ir natrio chloridą. Kai kurie prekyboje esantys skiedikliai yra Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress ir Avicell.

Į terapines kieti} dozuotų formų kompozicijas gali įeiti kietą formą ardančios medžiagos. Tokios medžiagos yra (bet jomis neapsiribojama) krakmolas, įskaitant prekybines ardančias medžiagas krakmolo pagrindu, tokias kaip Explotab. Taip pat gali būti naudojama krakmolo natrio glikolatas, amberlitas, natrio karboksimetilceliuliozė, ultramilopektinas, natrio alginatas, želatina, apelsinų žievelės, rūgštinė karboksimetilceliuliozė, natūrali kempinė ir bentonitas. Kitokios formos ardančios medžiagos yra netirpios katijonitinės dervos. Kaip ardančios medžiagos ir kaip rišikliai gali būti naudojamos miltelių pavidalo dervos, tokios kaip agaras, karaja arba tragakantas. Algino rūgštis ir jos natrio druska taip pat gali būti vartojamos kaip ardančios medžiagos.

Norint surišti terapinį agentą, suformuojant kietą tabletę, gali būti naudojami rišikliai; jie yra medžiagos iš gamtinių produktų, tokių akip akacija, tragakantas, krakmolas ir želatina. Kitos medžiagos yra metilceliuliozė (MC), etilceliuliozė (EC) ir karboksimetilceliuliozė (CMC). Terapinės medžiagos granuliavimui gali būti naudojami polivinilpirolidono (PVP) ir hidroksipropilmetilceliuliozės (HPMC) tirpalai alkoholyje.

Į terapinių medžiagų kompozicijas gali įeiti medžiagos mažinančios stabilumą, kad būti} išvengiama sulipimo gaminant kompozicijas. Gali būti naudojami tepalai sluoksnio tarp terapinės medžiagos ir matricos sienelės sudarymui; jie yra (bet neapsiriboja): stearino rūgštis, įskaitant jos magnio ir kalcio druskas, politetrafluoretilenas (PTEE), skystas parafinas, augaliniai aliejai ir vaškai. Taip pat gali būti naudojami tirpūs tepalai, tokie kaip natrio laurilsulfatas, magnio laurilsulfatas, įvairių molekulinių svorių polietilenglikolis ir Carbowax 4000 ir 6000.

Galima pridėti medžiagų, lengvinančių slydimą, kad būtų pagerintos vaistų takumo savybės ir jo pasiskirstymas presavimo metu. Tokios slydimą lengvinančios medžiagos yra krakmolas, talkas, pirogeninis silicio dioksidas ir hidratuotas silikoaliuminatas.

Norint palengvinti terapinės medžiagos ištirpimą vandeninėje terpėje, galima įdėti paviršiaus aktyviosios medžiagos, kaip drėkinimo agento. Paviršiaus aktyviosios medžiagos apima anijoninius detergentus, tokius kaip natrio laurilsulfatas, dioktilnatrio sulfosukcinatas ir dioktilnatrio sulfonatas. Gali būti naudojami katijoniniai detergentai, tokie kaip benzalkonio chloridas arba benzetonio chloridas. Į potencialių nejoninių detergentų, kurie gali būti kompozicijose kaip paviršiaus aktyviosios medžiagos, sąrašą įeina lauromakrogolis 400, polioksolio 40 stearatas, polioksietileno hidrintas ricinos aliejus

10, 50 ir 60, glicerolio monostearatas, polisorbatas 40, 60, 65 ir 80, sacharozės riebalinės rūgšties esteris, metilceliuliozė ir karboksimetilceliuliozė. Tokios paviršiaus aktyviosios medžiagos gali būti baltymo arba darinio kompozicijose arba vienos arba jų įvairių santykių mišiniai.

Priedai, kurie gali padidinti baltymo (arba darinio) įsisavinimą, yra, pavyzdžiui, riebalinės rūgštys- oleino, linoleino ir linoleno rūgštys.

Gali būti pageidaujamos kontroliuojamo išsiskyrimo kompozicijos. Vaistas gali būti inkorporuotas į inertinę matricą, kuri leidžia išsiskirti jam arba pagal difuzijos arba pagal išplovimo mechanizmą, t.y. į dervas. Į kompozicijas taip pat gali būti inkorporuotos lėtai degeneruojančios matricos. Kita šio vaisto kontroliuojamo išsiskyrimo forma yra forma, paremta Oros terapine sistema (Alza Corp.), t.y. vaistas yra patalpintas pusiau laidžioje membranoje, į kurią gali įeiti vanduo ir išstumti vaistą per vienintelę mažą skylutę dėl osmoso efektų. Uždelsto veikimo efektus taip pat turi ir kai kurios enterinės dangos.

Kompocizijoms gali būti naudojamos ir kitokios dangos. Tokios dangos gali būti įvairūs cukrus, kurie gali būti panaudoti padengimo formoje. Terapiniai agentai gali būti ir plėvele padengtoje tabletėje; šiuo atveju naudojamos medžiagos skirstomos į 2 grupes. Pirmoji grupė yra neenterinės medžiagos; jos yra metilceliuliozė, etilceliuliozė, hidroksietilceliuliozė, metilhidroksietilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, natrio karboksimetilceliuliozė, providonas ir polietileno glikoliai. Antroji grupė yra enterinės medžiagos, kurios paprastai yra ftalio rūgšties esteriai.

Optimaliam padengimui plėvelėmis galima naudoti medžiagų mišinius. Padengimą plėvelėmis galima gauti, padengiant formose arba skysčio vonelėse arba padengiant presavimo būdu.

Pulmonarinis vartojimas

Šiame išradime taip pat aptariamas baltymo (arba jo darinių) pulmonarinis vartojimo būdas. Baltymas (arba darinys) paduodamas į žinduolio plaučius įkvepiant, ir pereina per plaučių epitelinį apvalkalą į kraują. Tokio tipo vartojimas aprašytas Adjei et ai., Pharmaceutical Research, 7(6):565-569 (1990); Adjei et ai., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (leuprolido acetatas); Braąuet et ai., Journal of

Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (1989) (endotelinas-1); Hubbard et al., Annals of Intemal Medicine, 3(3):206-212 (1989) (αΐ-antitripsinas); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (αΐ-proteinazė); Oswein et al., “Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (March 1990) (rekombinantinis žmogaus augimo hormonas); Debs et al., J. Immunol., 140:34823488 (1988) ir Platz et al., US patentas Nr. 5284656 (granulocitų kolonijų stimuliuojantis faktorius). Šio išradimo praktikoje aptariama daugybė mechaninių įtaisų, skirtų terapinių produktų pulmonariniam vartojimui, įskaitant (bet neapsiribojant) pulverizatorius, dozuojamus inhaliatorius ir miltelių inhaliatorius, kurie yra žinomi šios srities specialistams.

Specifiniais tokių prekyboje esančių šio išradimo praktikoje tinkamų įtaisų pavyzdžiais yra Ultravent pulverizatorius, gaminamas Mallinckrodt, Ine., St. Louis, Missouri; Acorn II pulverizatorius, gaminamas Marąuest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin dozuojamas inhaliatorius, gaminamas Glaxo Ine., Research Triangle Park, North Carolina ir Spinhaler miltelių inhaliatorius, gaminamas Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Visiems šiems įtaisams reikia naudoti kompozicijas, tinkančias baltymo (arba darinio) išskyrimui. Paprastai kiekviena kompozicija yra charakteringa naudojamo įtaiso tipui, ir į ją gali įeiti atitinkama varanti medžiaga, apart įprastų terapijoje naudojamų skiediklių, stimuliatorių ir/arba nešiklių. Taip pat aptariamas liposomų, mikrokapsulių, mikrosferų, inkliuzinių kompleksų arba kitokių nešiklių panaudojimas. Taip pat gali būti pagamintos įvairios chemiškai modifikuoto baltymo kompozicijos, priklausančios nuo cheminės modifikacijos tipo arba nuo naudojamo įtaiso tipo.

Kompozicijos, tinkamos vartoti pulverizatoriais, tiek sroviniais, tiek ultrgarsiniais, paprastai turi baltymą (arba darinį), ištirpintą vandenyje, kuriame 1 ml tirpalo yra apie 0.1-25 mg biologiškai aktyvaus baltymo. Kompozicijose taip pat gali būti buferio ir paprasto cukraus (pvz., baltymo stabilizavimui ir osmoso slėgio reguliavimui). Pulverizatoriaus kompozicijose taip pat gali būti paviršiaus aktyvioji medžiaga, kad būtų sumažinama arba išvengiama paviršiaus sukeliamos baltymo agregacijos, atsirandančios dėl tirpalo pulverizacijos susidarant aerozoliui.

Kompozicijos, skirtos dozuojamam inhaliacijos įtaisui, turi labai susmulkintus miltelius, kuriuose yra baltymas (arba darinys), suspenduotas varančioje medžiagoje, panaudojant paviršiaus aktyvią medžiagą. Varančia medžiaga gali būti bet kokia šiam tikslui tinkama medžiaga, tokia kaip chlorfluoranglis, hidrochlorfluoranglis, hidrofluoranglis arba angliavandenilis, įskaitant trichlorfluormetaną, dichlordifluormetaną, dichlortetrafluoretanolį ir 1,1,1,2-tetrafluoretaną arba jų kombinacijas. Tinkamos paviršiaus aktyvios medžiagos yra sorbitano trioleatas ir sojos lecitinas. Kaip paviršiaus aktyvioji medžiaga gali būti ir oleino rūgštis.

Kompozicijos, skirtos miltelių inhaliacijos įtaisams, turi labai susmulkintus miltelius, kuriuose yra baltymo (arba darinio) ir jose taip pat gali būti užpildai, tokie kaip laktozė, sorbitolis, sacharozė arba manitolis tokiais kiekiais, kurie palengvina miltelių dispergavimą iš įtaiso, pvz., jų gali būti 50-90%, skaičiuojant nuo viso kompozicijos svorio. Geriausia pagaminti susmulkintos formos baltymą, kurio vidutinis dalelių dydis būti} mažesnis nei 10 μπι (arba mikronų), dar geriau 0,5-5 ųm, kad jis efektyviau patektų į distalinius plaučius.

Nazalinis vartojimas

Šiame išradime taip pat aptariamas baltymo (arba darinio) nazalinis vartojimas. Nazalinis įvedimas leidžia patekti baltymui į kraują tiesiog paduodant terapinį produktą į nosį, ir jam nebūtina nusėsti plaučiuose. Nazalinio vartojimo kompozicijose yra dekstrano arba ciklodekstrano.

Gydymo budai, medikamento pagaminimo budai

Dar vienas šio išradimo aspektas yra gydymo ir medikamento pagaminimo būdai. Būsenos, kurias palengvina arba moduliuoja šio išradimo darinių vartojimas, yra paminėtos aukščiau.

Dozės

Bus pateikta informacija apie visas aukščiau minėtas molekules, kurios buvo papildomai ištirtos, leidžianti nustatyti atitinkamus dozių kiekius, reikalingus įvairių būsenų gydymui, ir eilinis patyręs darbuotojas, atsižvelgdamas į terapinį kontekstą, recipiento amžių ir bendrą sveikatos būseną, galės parinkti reikiamą dozę. Bendrai imant, injekcijos arba infuzijos atveju dozės bus tarp 0,01 gg biologiškai aktyvaus baltymo kūno svorio kilogramui (skaičiuojant vien tik baltymo masę, be cheminės modifikacijos) ir 10 mg/kg. Dozavimo režimas gali keistis priklausomai nuo vartojamo baltymo arba darinio cirkuliacijos puslaikio ir nuo to, ar vartojamas polipeptidas įvedamas kaip atskira dozė, ar naudojama nepertraukiama infuzija, o taip pat ir nuo vartojamos kompozicijos.

Vartojimas su kitais junginiais

Su nutukimu susijusioje terapijoje šį baltymą (arba darinius) galima vartoti kartu su viena arba keliomis farmacinėmis kompozicijomis, naudojamomis kitų klinikinių nutukimo komplikacijų, tokių kaip diabeto (pvz., insulinas), aukšto kraujo spaudimo, didelio cholesterolio kiekio ir kiti} nepalankių, su nutukimu susijusių būsenų gydymui. Kartu gali būti skiriami ir kiti apetitą mažinantys vaistai, pvz., amfetaminai. Vaistai gali būti vartojami vienu metu (pvz., skiriamas šio išradimo baltymo ir insulino mišinys) arba gali būti in senatim.

Terapinis gydymas, paremtas nukleino rūgštimis

OB genas gali būti įvestas į žmogaus riebalines ląsteles nutukimo geninei terapijai realizuoti. Galima laukti, kad tokia terapija mažins kūno svorį. Atvirkščiai, įvedus antiprasminius darinius į žmogaus riebalines ląsteles, gali būti sumažinami aktyvaus OB polipeptido kiekiai ir galima laukti kūno svorio padidėjimo.

Viename realizavimo variante OB polipeptidą koduojantis genas įvedamas in vivo į virusinį vektorių. Tokie vektoriai apima sumažintus arba defektinės DNR virusus, tokius kaip paprastosios pūslelinės virusą (HSV), papilomos virusą, Epstein-Barr virusą (EBV), adenovirusą, susijusį su adena virusą (AAV) ir pan., bet jais neapsiribojama. Pageidautini defektiniai virusai, kuriuoe visai nėra arba beveik nėra virusinių genų. Defektiniai virusai, įvedus juos į ląstelę, yra neefektyvūs. Defektinių virusinių vektorių panaudojimas leidžia įvesti juos į ląsteles specifinėje lokalizuotoje vietoje, nesirūpinant, kad vektorius gali infekuoti kitas ląsteles. Tokiu būdu, specifiniu taikiniu yra riebalinis audinys. Tokių ypatingų vektorių pavyzdžiais gali būti (bet neapsiribojama) defektinio pūslelinės viruso 1 (HSV1) vektorius [Kaplitt et ai, Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], susilpninto adenoviruso vektorius, toks kaip vektorius, kurį aprašė Stratford-Perricaudet et ai, J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992) ir defektyvaus susijusio su adena viruso vektorius [Samulski et ai, J. Viroi, 61:3096-3101 (1987); Samulski et ai, J. Viro!., 63:3822-3828 (1989)].

Dar kitame realizavimo variante genas gali būti įvestas į retrovirusinį vektorių, pvz., tokį, kuris aprašytas Anderson et ai, US patentas Nr. 5399346; Mann et ai, Cell, 33:153 (1983); Temin et ai, US patentas Nr. 4650764; Temin et ai, US patentas Nr. 4980289; Markowitz et ai, J. Viroi, 62:1120 (1988); Temin et ai, US patentas Nr. 5124263; tarptautinė paraiška WO 95/07358 (Dougherty et ai, 1995 m. kovo 16 d.) ir Kuo et ai, Blood, 82:845 (1993).

Kitu atveju vektorius gali būti įvestas in vivo, panaudojant lipofekciją. Per praėjusį dešimtmetį nukleido rūgščių transfekcijai ir inkapsuliacijai in vitro buvo vis plačiau naudojamos liposomos. Sukurti sintetiniai katijoniniai lipidai, skirti sunkumų ir pavojų, susijusių su liposomų skatinama transfekcija, mažinimui, gali būti panaudoti pagaminti liposomoms, skirtoms geno, koduojančio markerį, transfekcijai in vivo [Felgner et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987), žr. Mackey et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Katijoninių lipidų panaudojimas gali skatinti neigiamai įkrauti} nukleino rųgščių inkapsuliavimą ir taip padėti neigiamai įkrauti} ląstelių membranų suliejimui [Felgner et ai, Science, 337:387-388 (1989)]. Lipofekcijos panaudojimas egzogeninių genų įvedimui į specifinius organus in vivo turi tam tikrų praktinių privalumų. Liposomų molekulinis įvedimas į specifines ląsteles atstovauja vieną naudingumo sritį. Suprantama, kad transfekcijos nukreipimas į tam tikrų tipų ląsteles, bus ypatingai naudingas audiniuose, kur yra ląstelių heterogeniškumas, tokiuose kaip kasa, kepenys, inkstai ir smegenys. Lipidai gali būti chemiškai sujungti su kitomis molekulėmis įvedimo tikslams (žr. Mackey et ai, 1988, suprai). Tiksliniai peptidai, pvz., hormonai arba neuromediatoriai, ir baltymai, tokie kaip antikūnai arba nepeptidų molekulės, gali būti chemiškai sujungti su liposomomis.

Taip pat galima in vivo įvesti vektorių, kaip gryną DNR plazmidę. Grynos DNR vektoriai genų terapijos tikslams gali būti įvesti į norimas šeimininko ląsteles, panaudojant žinomus metodus, pvz., transfekciją, elektroporaciją, mikroinjekciją, transdukciją, ląstelių suliejimą, DEAE dekstraną, nusodinimą kalcio fosfatu, panaudojant geninį šautuvą arba DNR vektoriaus transporterį [žr., pvz., Wu et ai, J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et ai, J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et ai, Kanados patentas Nr. 2012311, užpildytas 1990 m. kovo 15 d.].

Pritaikymas žemės ūkyje

OB genas taip pat gali būti išskirtas iš naminių gyvulių, ir taip gaunamas atitinkamas OB polipeptidas. Specifiniame pavyzdyje, infra, zondas, išvestas iš pelės OB geno, hibridizuojasi su atitinkama homologine koduojančia seka iš daugelio gyvulių rūšių. Kaip buvo aptarta žmonių terapijos atveju, gali būti pagaminti rekombinantiniai baltymai ir panaudoti naminiams gyvuliams. Polipeptidas gali būti duodamas, norint gauti mažiau riebius maistinius gyvulius, tokius kaip galvijai, kiaulės, paukščiai, avys ir t.t. Geriausia panaudoti autologinį OB polipeptidą, nors išradime aptariamas taip pat ir anti-autologinio peptido panaudojimas. Kadangi OB polipeptidas susideda iš maždaug 160 aminorūgščių liekanų, jis negali būti labai imunogeniškas. Taigi, neautologinio peptido panaudojimas gali neduoti imuninio atsako.

Kitu atveju, klonuotų genų įvedimas į transgeninius naminius gyvulius suteiktų galimybę potencialiai sumažinti kūno svorį ir nutukimą dėl OB transgeno padidintos ekspresijos. Paprasčiausi būdai šiam tikslui pasiekti būtų nukreipti OB transgeną į riebalus, naudojant jo nuosavą arba kitokį riebalams specifinį promotorių.

Atvirkščiai, kitais atvejais gali būti reikalinga padidinti kūno riebalų kiekį, pavyzdžiui, gaunant Kobe jautieną arba riebias kepenis, norint pagaminti foie gras. Tą galima realizuoti, nukreipiant antiprasminį OB transgeną į riebalus, arba panaudojant geninio nokauto technologiją. Kitu būdu, jeigu norima padidinti kūno svorį riebalų padidėjimo sąskaita, gali būti naudojamas OB polipeptido antagonistas. Tokie antagonistai yra (bet jais neapsiribojama) reaguojantys su OB polipeptidų antikūnai ir polipeptido fragmentai, kurie rišasi, bet neaktyvuoja OB receptoriaus, t.y. OB polipeptido antagonistai.

Kosmetinė reikšmė

O B polipeptidas, apart jo medicininės reikšmės, yra labai svarbus ir kosmetikoje. Atskiru atveju, kadangi šio išradimo polipeptidai, įskaitant jų darinius ir antagonistinius analogus, yra tinkami riebalinių ląstelių susikaupimo gyvūnų organizmuose greičio moduliavimui, jie tinka negražiai atrodančių riebalinių audinių, pvz., riebalų sankaupų ant pilvo, šlaunų, kaklo ir smakro kiekio sumažinimui, kurie nebūtinai susiję su nutukimu, bet kurie vis tik gadina individo išvaizdą. Manoma, kad galima sumažinti riebalų kiekį, bent dalinai sumažinant apetitą, t.y. sumažinant maisto sunaudojimą, ir didinant pagrindinį metabolizmą, arba panaudojant abi priemones. Taigi, šį OB polipeptidą, jo darinius arba agonisto analogus galima skirti subjektui, norint gauti kosmetinius pokyčius riebalų sankaupose, moduliuojant riebalų susikaupimą, mažinant apetitą arba naudojant abi priemones.

Be to, tokios kompozicijos ir metodai gali būti naudojami kartu su įvairiais kitais būdais, tokiais kaip kosmetinė chirurgija, skirta pakeisti bendrą kūno išvaizdą (pvz., liposiurbimą arba lazerinę chirurgiją, skirtą kūno masės sumažinimui, aspiruojant arba pašalinant riebalinį audinį), pratimus (ypatingai bėgimą ir svorių kilnojimą), mažai riebalų turinčią dietą, hipnozę, maisto šalinimą, kuriuos galima bandyti naudoti riebalinio audinio kiekio sumažinimui ir kūno išvaizdos pagerinimui.

Tokiu būdu, šis išradimas susijęs su individų kosmetinio riebalinio audinio moduliavimo būdu, kuris apima OB polipeptido, jo darinio arba jo agonistinio analogo, moduliuojančio riebalų kiekį, kiekio skyrimą individui, kuris pageidauja tokios kosmetinės moduliacijos, kad būtų pagerinta bendra kūno išvaizda. Atskiru atveju, riebalinio audinio moduliavimas yra apetito sumažinimo išdava. Geriau, kai riebalinio audinio moduliavimas yra riebalinio audinio sumažinimas.

Dar vienas šio išradimo variantas susijęs su metodu, skirtu kosmetiniam riebalinio audinio pašalinimui, kuris apima kūno išvaizdos pakeitimo procedūros kombinavimą su OB polipeptido, jo darinio arba jo agonisto analogo riebalus moduliuojančio kiekio skyrimui individui, kuris pageidauja tokios kosmetinės riebalinio audinio moduliacijos, kad būti} pagerinta bendra kūno išvaizda.

OB receptorius

OB faktoriaus mažų molekulių-agonistų ir antagonistų sukūrimas bus labai palengvintas, išskyrus jo receptorių. Tai gali būti atliekama, pagaminant aktyvų OB polipeptidų ir naudojant jį ekspresijos bibliotekos skryningui pagal standartinę metodologiją. Receptoriaus susirišimas ekspresijos bibliotekoje gali būti nustatytas, įvedant rekombinantinį polipeptidų, pagamintą naudojant arba bakterinius, arba žinduolių ekspresijos vektorius ir stebint rekombinantinio polipeptido trumpalaikio arba nepertraukiamo įvedimo efektus į ekspresijos bibliotekos ląsteles, arba tiesiogiai nustatant OB polipeptido susirišimą su ląstelėmis.

Kadangi dabar manoma, kad OB receptorius tikriausiai yra pagumburyje ir, gal būt, kepenyse, geriausia konstruoti kDNR bibliotekas iš šių audinių standartinės ekspresijos klonavimo vektoriuose. Po to tokie kDNR klonai galėtų būti įvedami į COS ląsteles, kaip grupės, ir gauti transformantai būtų atrenkami su aktyviu ligandų, norint nustatyti COS ląsteles, ekspresuojančias OB receptorius. Tada gali būti išskiriami teigiami klonai klonuotam receptoriui išgauti. Klonuotą receptorių galima būti} panaudoti kartu su OB ligandų (laikant, kad jis yra hormonas), norint išaiškinti maži} molekulių OB moduliatorių skryningui reikalingus komponentus.

Tam tikra bandyminė sistema, kurią reikia naudoti pagal šį išradimą, yra žinoma kaip receptoriaus tyrimo sistema. Receptoriaus tyrimuose, bandomoji medžiaga yra atitinkamai pažymėta, ir tada tam tikros bandomųjų ląstelių kolonijos inokuliuojamos tam tikru kiekiu žymėtos ir nežymėtos medžiagos, o po to atliekami susirišimo tyrimai, norint nustatyti žymėtos medžiagos susirišimo su ląstelių receptoriais laipsnį. Šiuo būdu galima nustatyti medžiagų afiniškumo skirtumus.

Tokiu būdu, galima radiopažymėti tam tikrą išvalyto svorio moduliatoriaus kiekį ir sumaišyti jį, pavyzdžiui, su antikūnais arba kitais jo inhibitoriais, o po to reikia atlikti susirišimo bandymus. Tada reikia pagaminti tirpalus, kuriuose yra įvairūs nesumaišyto žymėto ir nežymėto svorio moduliatoriaus kiekiai, inokuliuoti ląstelių mėginius, ir inkubuoti. Po to, gauti ląstelių monosluoksniai plaunami, soliubilizuojami ir skaičiuojama gama-skaitliukais tokį laiką, kad standartinė paklaida būtų <5%. Duomenys analizuojami Scatchard metodu ir daromos išvados apie medžiagos aktyvumą. Tai, kas aukščiau aprašyta, yra pavyzdys, iliustruojantis būdą, kaip galima ištirti receptorių ir panaudoti tuo atveju, kai tiriamosios medžiagos ląstelių susirišimo geba gali tarnauti kaip charakteristika. Receptoriaus tyrimas savo ruožtu yra ypatingai naudingas, identifikuojant specifinius receptorius šio išradimo moduliatoriams, tokius kaip db receptorius.

Kitas tyrimas, tinkamas naudoti ir svarstomas šiame išradime, yra žinomas kaip “cis/trans” tyrimas. Trumpai tariant, šiame tyrime naudojami du genetiniai dariniai; vienas iš jų paprastai yra plazmidė, kuri nepertraukiamai ekspresuoja tam tikrą dominantinj receptorių, kai yra transfekuota į atitinkamą ląstelių liniją, o antrasis yra plazmidė, kuri ekspresuoja reporterį, tokį kaip liuciferazė, kontroliuojamą receptoriaus/ligando komplekso. Taigi, pavyzdžiui, jei norima įvertinti junginį, kaip tam tikro receptoriaus ligandą, viena iš plazmidžių turi būti darinys, kuris duoda pasirinktos ląstelių linijos receptoriaus ekspresiją, o antroji plazmidė turi turėti promotorių, prijungtą prie liuciferazės geno, į kurį įterptas atsako elementas tam tikram receptoriui, o gautas kompleksas prjungs atsako elementą ir inicijuos liuciferazės geno ekspresiją. Tada, atsirandanti chemoliuminescencija matuojama fotometriniu būdu, gaunamos dozė-atsakas kreivės ir lyginama su žinomais ligandais. Tokia metodika smulkiai aprašyta US patente Nr. 4981784 ir tarptautinėje paraiškoje WO 88/03168.

Jeigu jau nustatytas rekombinantas, kuris ekspresuoja OB receptoriaus geno seką, galima analizuoti OB receptorių. Tai galima atlikti bandymais, paremtais OB receptoriaus fizikinėmis arba funkcinėmis savybėmis, įskaitant receptoriaus žymėjimą radioaktyviaisiais izotopais, o po to atliekant gel-elektroforezę, imunotyrimus, ligando susirišimą ir t.t. Be to, galima generuoti antikūnus prieš ob receptorių, kaip aprašyta aukščiau.

OB receptoriaus struktūrą galima tirti įvairiais žinomais metodais. Pageidautina ištirti įvairių dalių struktūrą, ypač OB rišančios dalies. Struktūrinę analizę galima atlikti, nustatant sekos panašumą su kitais žinomais baltymais, ypač hormonų ir baltymų receptoriais. Panašumo (arba homologijos) laipsnis gali duoti pagrindą OB receptoriaus arba jo dalies struktūros ir funkcijos numatymui. Specialiame realizavimo variante galima atlikti sekų palyginimą su sekomis, randamomis GenBank, naudojant, pavyzdžiui, FASTA ir FASTP programas [Pearson et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)].

Baltymo seka gali būti papildomai apibūdinta, atliekant hidrofiliškumo analizę (pvz., Hopp et ai., 1981, supra). Hidrofiliškumo vaizdas gali būti panaudotas OB receptoriaus baltymo hidrofobinėms ir hidrofilinėms sritims nustatyti, kurios savo ruožtu gali parodyti ekstracitoplazmines, susirišimo su membranomis ir intracitoplazmines sritis.

Taip pat galima atlikti antrinės struktūros analizę (pvz., Chou et ai., 1974, supra), norint nustatyti OB receptoriaus sritis, kurios sudaro specifines antrines struktūras.

Panaudojant žinomas kompiuterines programas, galima atlikti manipuliaciją, transliaciją ir antrinės struktūros numatymą, o taip pat atviro skaitymo rėmelio numatymą ir atvaizdavimą.

Pasigaminus didesnį rekombinantinio OB polipeptido kiekį ir turint galymybę išskirti OB receptorių (t.y. db geno produktą), šis išradimas įgalina atlikti OB polipeptido ir OB receptoriaus arba jo dalies aktyvios konformacijos kiekybinę struktūrinę analizę. Atskiru atveju, turint pakankamai medžiagos, galima atlikti branduolių magnetinio rezonanso (BMR), Ramano ir ultravioletinių spindulių (UV), ypatingai cirkuliarinio dichroizmo (CD), spektrų analizę. Ypatingai BMR yra labai galingas molekulių, esančių tirpale, kur labiausiai priartėjama prie natyvaus apsupimo, struktūrinės analizės metodas [Marion et ai., 1983, supra·, Bar et ai., 1985, supra·, Kimura et ai., 1980, supra]. Taip pat gali būti naudojami ir kiti struktūrinės analizės metodai. Į tokius metodus įeina (bet neapsiribojama) Rentgeno spindulių kristalografija (Engstrom, 1974, supra).

Dar labiau pageidautina ištirti OB polipeptido ir OB receptoriaus kokristalus. Kokristalų analizė duoda detalią informaciją apie susirišimą, kuri savo ruožtu leidžia racionaliai projektuoti ligandų agonistus ir antagonistus. Taip pat galima panaudoti kompiuterinį modeliavimą, ypač kartu su BMR ir Rentgeno spindulių metodais [Fletterick et ai., eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].

Geno, koduojančio šio išradimo OB receptorių, nustatymas ir išskyrimas duoda galimybę ekspresuoti didesnius nei galima išskirti iš natūralių šaltinių receptoriaus kiekius, arba indikatorinėse ląstelėse, kurios yra specialiai sukurtos receptoriaus, ekspresuoto po ląstelių transfekcijos arba transformacijos, aktyvumo identifikavimui. Tokiu būdu, apart racionalaus agonistų ir antagonistų projektavimo, paremto OB polipeptido struktūra, šiame išradime aptariamas ir alternatyvus metodas specifinių OB receptoriams ligandų identifikavimui, naudojant įvairius žinomus skryningo bandymus.

Išradimas bus geriau suprantamas iš toliau duodamų pavyzdžių, kurie duodami pademonstravimui ir neriboja jo apimties.

PAVYZDŽIAI

Toliau aprašomas metodas, naudojamas genetinės medžiagos identifikavimui, kuris duodamas kaip šį išradimą paaiškinantis pavyzdys. Šis pavyzdys apima keturias viena po kitos einančias stadijas: A) genetinio žemėlapio sudarymą, B) fizikinio žemėlapio sudarymą, C) kandidatinio geno išskyrimą ir D) mutacijos nustatymą. Patvirtinus tikslinio pelės geno išskyrimą (D stadija), buvo ieškoma homologinio žmogaus geno ir charakterizuoti tiek pelės, tiek žmogaus genai bei laukiami baltymai. Šios stadijos smulkiai aprašytos žemiau.

A. Genetinio žemėlapio sudarymas db mutacija buvo suskaldyta genetiniuose hibriduose, ir mutacijos padėties RFLP (restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo) atžvilgiu nustatymui panaudota standartinė sukibimo analizė. Šie duomenys patalpino geną ~5 cM atstumu nuo artimiausios pelės 6 chromosomos (5 cM yra genetinio atstumo matas, atitinkantis 5 aiškius genetinius organizmus, atsirandančius atliekant genetinį sukryžminimą 100 gyvuliukų). Buvo generuota iš viso 771 informatyvi mejozė ir panaudota genetinio žemėlapio sudarymui [Friedman et ai., 1991, supra]. Visi genetiniai lokusai, kurių vieta žemėlapyje nustatyta, buvo publikuoti anksčiau. Du artimiausi aprašyti RFLP buvo nustatyti, panaudojant zondus, išvestus iš karboksipeptidazės ir met onkogeno genų.

Aukščiau aprašytas genetinių eksperimentų atlikimas buvo neadekvatus ob klonui iš principo todėl, kad nė vienas iš genetinių markerių nedavė tampraus surišimo. Norint identifikuoti būtinus tampriai surištus RFLP, būvi išskirti papildomi zondai ir išplėstas genetinis krosas. Atsitiktinių DNR gabaliukų iš artimiausios pelės 6 chromosomos išskyrimui panaudotas žinomas chromosomos mikrodisekcijos metodas [Bahary et ai., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. Ištirta, ar susidaro tamprus ryšys tarp atskirų klonuotų zondų ir ob. Remiantis šiais tyrimais, atrinktas vienas zondas D6Rckl3, dar vadinamas psd3, tolimesnei analizei dėka jo genetinio artumo OB. Sis zondas buvo panaudotas nustatyti 835 ob palikuonių iš interspecifinių ir intersubspecifinių krosų genotipui, ir pasirodė, kad D6Rckl3 yra nerekombinantinis visuose 835 gyvuliukuose, kaip aprašė Bahary ir kt. Sudarant fizikinį žemėlapį, buvo identifikuotas naujas polimorfinis markeris iš kosmidinio subklono, išvesto iš YAC 53A6i Šis naujasis markeris buvo pastatytas tarp D6Rckl3 ir OB geno ir panaudotas papildomų 771 informatyvių mejozių iš interspecifinių interkrosų ir atvirkštinių krosų genotipų nustatymui. Nustatyta, kad vienas gyvuliukas #167 turi rekombinantinį krosingoverį tarp ob ir D6Rck39. Šie tyrimai parodė, kad D6Rckl3/D6Rck39 yra —0,06 cM nuo ob. Buvo identifikuotas papildomas zondas, Pax4, kuris buvo 0,12 cM prie ob. Pax4 buvo rekombinantas dviejuose gyvuliukuose: #111 ir #420. Pax4 yra pseudogenas, kurį anksčiau Gruss ir bendradarbiai rado prie pat pelės 6 chromosomos [Gruss et ai, Genomics, 11:424-434 (1991)]. Remiantis šiais duomenimis, nustatyta, kad OB genas yra —0,2 cM intervale tarp Pax4 ir D6Rckl3. Todėl buvo bandoma klonuoti įvedamą DNR, stengiantis išskirti OB.

B. Fizikinio žemėlapio sudarymas

DNR klonavimui šiame intervale reikėjo panaudoti mielių dirbtines chromosomas (YAC) - santykinai naują klonavimo vektorių, kuris leidžia klonuoti ilgus besiribojančius DNR tarpus, kurių ilgiai dažnai yra daugiau nei milijonas bazių porų.

Mielių dirbtinės chromosomos buvo išskirtos, panaudojant D6Rckl3 ir Pax4. Tai buvo padaryta, pagaminant išvalytas DNR ir panaudojant jas atitinkamų YAC išskyrimui. Buvo išskirti ir apibūdinti tokie YAC (#8, #16, #107 ir #24), ir remiantis gautais analizės duomenimis, buvo padaryta išvada, kad YAC16 yra YAC, kuri yra toliau nutolusi, t.y arčiau ob. Tada buvo regeneruotas YAC#16 raktinis galas, ir buvo nustatyta, kad šis galas yra arčiau ob nei Pax4. Šis galas buvo pavadintas 16M( + ). Tokia išvada buvo padaryta todėl, kadangi buvo parodyta, kad šis mėginys nėra rekombinantinis gyvuliukuose #420 (kaip kad buvo Pax4 atveju). Šis galas buvo sekvenuotas ir panaudotas, atliekant PCR bandymą. PCR bandymas panaudotas YAC bibliotekos skryningui. Išskirti keturi teigiami klonai. Tolimesnis šitų YAC apibūdinimas, panaudojant galo išlaisvinimą, restrikcijos žemėlapio nustatymą, pulsuojančio lauko gel-elektroforezę ir southerno blotingą su genetiniais krosais, parodė, kad dvi iš šių YAC, adų ir aad, yra labai esminės tolimesniems tyrimams. YAC aad yra 550 kB nechimerinė YAC, kuri toliau tęsiasi distališkai. Todėl, šios YAC distalinis galas, aad(pICL), buvo panaudotas fizikinio žemėlapio užbaigimui. YAC adų yra 370 kB nechimerinė YAC, ir buvo nustatyta, kad jos distalinis galas, adu(+), yra nerekombinantinis visuose ob genetinių krosų palikuonyse, įskaitant gyvuliukus #111 ir #167, kas leidžia manyti, kad OB genas gali būti šioje YAC.

Buvo atliktas šių dviejų galų, aad(pICL) ir adu(+), PCR bandymas ir panaudota daugiau YAC ir PI klonų išskyrimui, kad būtų galima toliau tęsti fizikinio žemėlapio sudarymą. Svarbūs PI klonai, išskirti šiuo būdu, buvo 498, 499 ir 500 (išskirti, panaudojant zondą, išvestą iš aad(pICL)) ir 322, 323 ir 324 (panaudojant zondą iš adn(+)).

Dabartiniu metu buvo apibūdintos YAC, išskirtos panaudojant D6Rckl3 (53A8, 25A8, 25A9, 25A10). Iš šių tyrimų nustatyta, kad 53A6 tęsiasi toliau link aad YAC. Nustatyta, kad tarpo tarp 53A6 ir aad dydis yra —70 kB. Tada trijų prieinamų YAC bibliotekų ir PI bibliotekos skryningui panaudotas 53A6, 53(pICL) raktinis galas. Išskirtas esminis PI klonas 325. Šis PI klonas persidengė su PI klonais, išskirtais, panaudojant aaJ(pICL), kaip aprašyta aukščiau, ir todėl jis pasitarnavo tarpo tarp 53(pICL) ir aad(pICL) užpildymui. Pasinaudojant šiais duomenimis, buvo klonuota ištisinė sankaupa, turinti YAC ir PI klonus, —2,5 milijono bazių porų ilgio ir aprėpianti PaxĄ, 16M(+), αάιι(+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 ir D6Rckl3. Rūpestingai sudedant į žemėlapį rekombinacijos vietas, pastebimas gyvuliukuose #111 ir #167, buvo padaryta išvada, kad OB yra 400 kB intervale. Norint gauti dirbančios DNR šaltinį OB geno išskyrimui, buvo išskirta apie 500 kB, dengiančių šią nerekombinaninę sritį iš viso 24-se PI klonuose. Šie PI klonai, įskaitant 322 ir 323, kurie, kaip vėliau nustatyta, yra naudingi klonai, buvo panaudoti egzonu imobilizavimui.

Chromosomos, kurioje yra OB, fizikinio žemėlapio dalis parodyta fig. 7A. Fig. 7B vaizduoja YAC sankaupą. Fig. 7C vaizduoja PI sankaupą.

C. Kandidatiniu genu išskyrimas

Metodas, panaudotas šio intervalo genams išskirti, buvo egzonų imobilizavimas. Šiame metode panaudotas komercinis vektorius egzono DNR (t.y. koduojančių sekų) identifikavimui, pasirenkant funkciniam sujungimui genominės DNR akceptorines ir donorines sekas, įvestas į bandomąjį darinį. Buvo auginama DNR iš šių PI klonų ir subklonuota į egzono imobilizavimo vektorių. Šie klonai buvo trumpi intarpai, klonuoti į Bluescript vektorių. Kiekvienas klonas buvo PCR-amplifikuotas su PCR pradmenimis, atitinkančiais plazmidės sekas, kurios flankuoja intarpą. PCR amplifikacija atlikta tiesiogiai į bakterijas, kurios turi plazmidę. Reakcija atlikta, naudojant Biomek robotą. Atlikta PCR produktų elektroforezė 1% agarozės gelyje TBE buferyje, kuriame buvo etidžio bromido. Buvo modifikuota egzonų imobilizavimo metodika, norint pašalinti E.coli DNR priemaišas iš PI klonų, ir išrinkti gausius artefaktinius egzonus, kurie viršijo 80-90%, skaičiuojant pagal laukiamus egzonus. Egzonų vektorius apima HIV sekas; trumpas šių vektorių sekų segmentas atitinka minėtą artefaktą.

Egzono imobilizavimo eksperimentas buvo atliktas, naudojant įvairius PI klonus. Tada egzono imobilizavimo produktai buvo amplifikuoti PCR metodu, atrinkti ir sekvenuoti. Numatomų “egzonų” sekos buvo palygintos su sekomis GenBank’e, naudojant Blast kompiuterinę programą. Buvo atrinkta apie penkiolika egzonų tolimesniam tyrimui RT-PCR, northerno analizės ir zooblotingo metodais, norint nustatyti, ar yra atitinkamos RNR arba išlaikytos sekos. Buvo rasta, kad septyni iš penkiolikos laukiamų egzonų - 3252, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 ir 2G7 - koduoja RNR transkriptą. 325-2 yra specifinis sėklidės genas; panašu, kad 323-8 ir 323-9 yra du egzonai iš to pačio geno, ekspresuojami pagrindinai smegenyse ir inkstuose. 1H3 ir 322-5 atstovauja dviem žemo lygio smegenų transkriptams. D1-F7 yra egzonas iš anksčiau klonuoto geno, inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), kuris turi visur esančios ekspresijos vaizdą. Pasirodo, kad nei vienas iš šių genų nekoduoja OB. 2G7, kuris yra OB egzonas, aptariamas žemiau.

Po trijvj nesėkmingų bandymų sugauti egzoną OB gene, buvo padarytas mėginimas sulieti DNR iš visų PI iš kritinės OB srities. Tokie PI buvo: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 899, 500, 653, 654 ir kiti. Po to 258, 260, 322, 498 ir 499 PI buvo subklonuoti į egzono gaudymo vektorių, o po to buvo paruoštos kelios plokštelės su bakteriniais klonais, kurių kiekviename buvo numatomas egzonas. Buvo gauti 192 klonai, atstovaujantys numatomus OB kandidatus. Kaip aukščiau minėta, buvo pastebėtas pastovus artefaktas, rodantis kad daug izoliatų turi du sugautus egzonus, išvestus iš vektoriaus. Tokiu būdu, buvo nustatyti klonai tiek pagal jų dydį, tiek ir pagal tai, kad DNR zondai, atitinkantys šį artefaktą, hibridizuojasi su atitinkamomis juostelėmis gelio southerno blotinge. Nebuvo galima atrinkti artefaktų, remiantis vien tik dydžiu, kadangi reikėtų išmesti ir egzoną atitinkantį OB.

Tokiu būdu, iš 192 egzonų tolimesniems tyrimams buvo atrinkti septyni. Buvo paruoštos matricos septynių egzonų sekų nustatymui ir nustatytos sekos. Išanalizuotos septynios egzonų sekos ir rasta, kad septyni buvo identiški, o vienas buvo aiškus artefaktas. Konkrečiau, klonas 1D12 turėjo “HIV seką”, t.y. artefakto juosta. Tolimesnei analizei liko trys egzonai: 1F1, 2G7 ir 1H3. 1F1 buvo eliminuotas, kadangi jis yra už kritinės srities. Abiems 1H3 ir 2G7 egzonams parinkti ir sintezuoti PCR pradmenys.

Nustatyta egzono 2G7 seka; ji parodyta fig. 10 (SEQ ID NO:7). Parinkti ir sintezuoti PCR pradmenys 2G7. Sekų, atitinkančių PCR pradmenis, dalys yra pabrauktos. Panaudoti pradmenys yra:

5’ CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60,0°C) (SEQ ID NO:8)

3’ CAT CCT GGA CIT TCT GGA TAG G (Tm = 60,0°C) (SEQ ID NO:9)

Šie pradmenys amplifikavo genominę DNR, esant tokioms PCR sąlygoms: 25-30 ciklų renatūracija 55°C temperatūroje 2’, 72°C išlyginimas 2’, denatūracija 94°C temperatūroje 1’ standartiniame PCR buferyje. Šie pradmenys taip pat buvo panaudoti žymėti} zondų generavimui, įvedant ³²P-dCTP į PCR reakciją, redukuojant tam tikrame šalto dCTP kiekyje.

RT-PCR atlikta su įvairių audinių RNR, ir buvo padaryta išvada, kad 2G7 ekspresuojamas išimtinai tik baltuosiuose riebaluose (fig. 11 A). Po to ³²P-žymėtas 2G7 buvo hibridizuotas su audinio RNR northerno blotu (fig. 11B), ir pasirodė, kad riebaliniame audinyje ekspresuojami dideli kiekiai jo RNR, o kituose audiniuose arba visai neekspresuojama arba ekspresuojami labai maži kiekiai (tie signalai gali būti dėl audinio preparatų užteršimo riebalais). Atlikta 10 μg bendrosios RNR iš kiekvieno išvardinto audinio elektroforezė agarozės gelyje su formaldehidu. Mėginys hibridizuotas su blotu 65°C temperatūroje standartiniame hibridizacijos buferyje, Rapid Hybe (Amsterdam). RNR dydis buvo apie 4,9 kB. Buvo nuspręsta, kad 2G7 yra gyvybingas OB geno kandidatas, ir jis buvo analizuotas toliau.

D. Mutacijos nustatymas

Norint patvirtinti, kad 2G7 koduoja OB geną, reikia parodyti šio geno DNR sekos RNR ekspresijos lygių skirtumus mutante, lyginant su laukinio tipo gyvuliukais. Yra galymybė atlikti tokius tyrimus su dviem atskiromis ob geno mutacijomis - C57BL/6J ob/ob (1J) ir Cck/Smj ob/ob (2J). Šios mutacijos toliau bus pažymėtos atitinkamai 1J ir 2J. (Tirtų pelių linijoms pažymėti naudojama neformali nomenklatūra. Šiame aprašyme ir brėžiniuose priimama, kad C57BL/6J reiškia C57BL/6J +/+; GKC/smj reiškia SM/Ckc+^DflC-+/+; CKC/smj ob/ob reiškia SM/Ckc-+^-0^/06²⁷). RNR pagaminta iš riebalinio audinio, kuris buvo paimtas iš 1J, 2J ir kontrolinių gyvuliukų. Kiekvieno pavyzdžio bendra RNR apdorota DNRaze, po to atvirkščiai transkribuota, naudojant oligo-dT kaip pradmenį ir atvirkštinę transkriptazę. Tada gauta viengrandininė kDNR PCRamplifikuota arba su 2G7 pradmenimis (sąlygos nurodytos aukščiau), gaunant apatinę juostelę, arba su prekyboje esančiais aktino pradmenimis, gaunant viršutinę juostą. Atlikta RT-PCR produktų elektroforezė 1% agarozės TBE gelyje, kuris buvo dažomas etidžio bromidu (fig. 12A). Naudojant RT-PCR buvo rasta, kad 2G7 mRNR ekspresuojama 1J ir visose kitose kontrolinėse pelėse, jos visai nėra 2J pelėse. Po 30 amplifikacijos ciklų jokio signalo nepastebėta. Šis eksperimentas tiesiogiai parodo, kad 2G7 atitinka egzoną iš OB geno.

Kadangi 2J mutacija yra palyginus nauja mutacija ir yra laikoma kaip koizogeninė linija, šis rezultatas yra pirmas turimas rezultatas, kuris rodo, kad 2G7 yra egzonas iš OB geno. Panašu, kad ši mutacija yra promotoriaus srityje, kuri visiškai sustabdo mRNR sintezę. Tai, kad šiame RT-PCR eksperimente 1J pelėse yra stebimas signalas, rodo, kad 1J gali būti taškinė mutacija, kuri neduoda didelio RNR pavyzdžio dydžio pokyčio. Be to, 2G7 mRNR nebuvo ir dar keturiuose 2J gyvuliukuose, tiriant RT-PCR metodu.

Šį rezultatą patvirtina northerno blotingas (fig. 12B). Iš kiekvienos linijos (C57B1/6J, 1J, CKC/smj ir 2J) paruošta riebalinių ląstelių RNR. 10 /xg šių RNR blotuota. Blotas tirtas su 2G7 zondu, kuris buvo PCR-pažymėtas, amplifikuojant šią medžiagą, t.y. juosta fig. 11, naudojant ³²P-dCTP PCR reakcijoje. Įdėtas RNR kiekis kontroliuojamas aktinu. Aktino signalas yra beveik vienodas visuose mėginiuose. OB signalo nėra smegenyse, kadangi ši mRNR yra būdinga riebalinėms ląstelėms.

Northerno analizės rezulatai patvirtino, kad 2J pelėse nėra 2G7 specifinės RNR. ob RNR nėra CKC/smj ob/ob pelėse, kadangi šioje nutukusio mutanto linijoje genas yra suardytas taip, kad nepasidaro RNR. Be to, 2G7 RNR kiekis 1J bei db/db riebaluose yra padidintas —10-20 kartų. Šie rezultatai patvirtina hipotezę, kad OB arba koduoja cirkuliuojanatį hormoną, arba yra atsakingas už signalo riebalinėse ląstelėse, kuris moduliuoja kūno svorį, generavimą. Šie rezultatai patvirtina išvadą, kad 2G7 yra OB genas, ir leidžia manyti, kad 1J pelėse yra taškinė mutacija, tikriausiai neprasminė mutacija, sukelianti priešsubrendusios transliacijos užbaigimą.

Northerno analizė pakartota, naudojant riebalinės ląstelės RNR preparatus iš 4 skirtingų 2J gyvuliukų (fig. 13). Šiame bandyme ap2 yra specifinis riebalams transkriptas, kuris buvo panaudotas kaip kontrolė, taip pat kaip ir aktinas fig. 12B. ap2 juostos intensyvumų skirtumų nepastebėta. ap2 buvo pažymėti, konstruojant PCR pradmenis iš publikuotos ap2 sekos. Riebalinių ląstelių RNR RT-PCR produktai buvo pakartotinai pažymėti, naudojant tą pačią PCR žymėjimo metodiką. Ši analizė rodo, kad OB RNR yra normaliuose homozigotiniuose ir heterozigotiniuose gyvuliukuose ir jos nėra 2J mutantiniuose gyvuliukuose.

Mutacija nustatyta 1J pelėse. Mutacija yra C bazės pakeitimas T baze, kuri duoda arginino pakeitimą į aiškų priešsubrendusį stop-kodoną prie 108 aminorūgšties ir tikriausiai yra 1J mutacijos priežastis (fig. 14), nežiūrint į didelius ob mRNR ekspresijos kiekius (žr. fig. 12 ir 13, C57BL/6J ob/ob takeliai).

Vėliau, norint padaryti išvadą, kad 2J mutacija yra aptikto DNR pokyčio OB 5’ gale, kuris atrodo pilnai panaikina RNR ekspresiją, rezultatas, buvo panaudotas southerno blotingas. Tikslią šio persigrupavimo prigimtį dar reikia nustatyti.

Norint nustatyti, ar mutantinis OB duoda unikalų fragmento vaizdą, buvo atliktas DNR iš CKC/smj (SM/Ckc- + ^Dac) ir C57BL/6J pelių genominis southerno blotingas, panaudojant keturias skirtingas restrikcijos endonukleazes (fig. 15A). Apie 10 gg DNR (išvestos iš genominės DNR, gautos iš kepenų, inkstų arba blužnies) suskaldyta su minėtu restrikcijos fermentu. Tada atlikta DNR elektroforezė 1% agarozės TBE gelyje. DNR perkelta į imobilono membraną ir hibridizuota su PCR-žymėtu 2G7 zondu. Raktinė juosra yra intensyviausia juosta, gauta panaudojant CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+^ūflC ob^/ob^) DNR skaldymą Bglil. Ši juosta atitinka didesnio molekulinio svorio, nei kitose linijose, juostą ir rodo, kad šioje linijoje yra mutacija.

Fig. 15B yra genominės DNR iš ob²’/-}· x ob^/A kroso palikuonių skaldymo Bglil southerno blotingas. Kai kurios DNR turi tiktai viršutinę juostą, kai kurios tik apatinę juostą, o kai kurios turi abi juostas. Gyvuliukai, kurie turi tik viršutinę juostą, taip pat yra allo-nutukę, t.y. ob^/ob²¹. Šie duomenys rodo, kad polimorfizmas (t.y. mutacija), parodytas fig. 15A, išsiskiria genetine prasme.

PAVYZDYS: kDNR klonavimas ir OB sekos nustatymas

Naudojant žymėtą 2G7 PCR zondą, išskirta 15 pelės kDNR klonų iš pelės riebalinės ląstelės Xgtl 1 kDNR bibliotekos (Clontech 5’-STRETCH kDNR iš Swiss pelės, #ML3005b sėklidės riebalinio audinio) ir 30 krosų, hibridizuojančių žmogaus kDNR klonus iš žmogaus riebalinės ląstelės XgtlO kDNR bibliotekos (Clontech 5’-STRETCH kDNR iš pilvo #HL1108a). Atliktas bibliotekos skryningas naudojant dėmės lifto metodiką. Filtrai iš dėmės lifto denatūruojami, naudojant autoklavos metodą. Po du filtrus hibridizuojama su PCR-žymėtu 2G7 zondu (Rapid Hybe buferis, 65°C, per naktį). Po 24 h prehibridizacijos, filtrai plaunami 2x SSC, 2% SDS du kartus po 30 min. 65°C temperatūroje ir eksponuojami į Rentgeno spindulių juostą. Išgryninta po du pozityvus. Išgrynintas fagas PCR-amplifikuojamas, naudojant prekyboje esančius vektorių pradmenis, pvz., XgtlO ir Zgtll. Gauti PCR produktai atitiko kDNR intarpą kiekvienam fagui su nedideliu kiekiu vektoriaus sekos abiejuose galuose. Juostos grynintos, leidžiant per gelį, ir sekvenuotos, naudojant ABI automatinį sekvenatorių, ir vektorių pradmenis DNR polimerazei nustatyti.

Neapdoroti sekvenavimo duomenys tirti rankiniu būdu, norint ištaisyti kompiuterio išduodamus duomenų netikslumus. Gavus teisingą seką, sintezuoti žemyn einantys pradmenys ir panaudoti tolimesniam sekvenavimui. Tokie eksperimentai kartojami tol, kol nustatomos kiekvieno gaunamo kDNR klono sekos, ir sudedama į sankaupą. Iki šiol surinkta —3000 bazių porų iš mRNR 5’ galo. Vienas kDNR klonų tęsėsi iki mRNR 5’ galo, nes jo seka buvo identiška riebalinio audinio RNR 5’ RAČE produkto sekai (duomenys neparodyti).

Sekų duomenys parodė, kad yra 167 aminorūgščių atviras skaitymo rėmelis (fig. 1). Kozako transliacijos iniciacijos konsensuso seka buvo su adenozino liekanomis trimis bazėmis aukštyn einančia kryptimi nuo ATG. Buvo rastos dvi kDNR klasės, kurios skiriasi vien tik glutamino kodono įterpimu, arba jo pašalinimu. Ši liekana rasta 3’ padėtyje prie pat 2G7 egzono sujungimo akceptoriaus. Gadangi glutamino CAG kodonas apima galimą AG sujungimo akceptoriaus seką, galima manyti, kad prie sujungimo akceptoriaus vietos yra pasislinkimas su aiškia 3 bazių porų delecija kDNR pogrupėje, kaip parodyta žemiau.

Gln Ser Vai ag CAG TCG GTA (su glutaminu) t (sujungimo akceptoriaus vieta) (SEQ ID NO:17)

Ser Vai ag CAG TCG GTA (be glutamino) t (sujungimo akceptoriaus vieta) “ag” aukščiau duotose sekose reiškia galimą introno seką, einančia aukštyn nuo glutamino kodono, o AG yra galima kita susijungimo vieta. Ši glutamino liekana yra labai konservatyvioje molekulės srityje ir jos reikšmė biologiniam aktyvumui dar nežinoma.

Nustatyta galima N-galinė signalinė seka, kurios signalinė skaldymo vieta, kaip galima manyti, yra karboksi-galinė adenino liekana prie 21 padėties aminorūgšties. Ši galima signalinė seka buvo patvirtinta, panaudojant kompiuterinį algoritmą von Heijne metodu. Panaudojant šią metodiką, buvo identifikuota labiausiai tikėtina signalinė seka polipeptido kodavimo srityje, atitinkančioje 1-23 aminorūgštis, kuri yra:

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA t VP (SEQ ID NO.TO) kurioje rodyklė rodo galimą signalinės sekos skaldymo vietą. Likusi aminorūgščių seka buvo labai hidrofilinė ir neturėjo pastebimų struktūrinių motyvų arba membraną apimančių dalių, kitokių nei N-galinė signalinė seka. Konkrečiau, mes neradome konsensuso sekų N-rišančiam glikozilinimui arba dibazinių aminorūgščių sekų, būdingų baltymo skaldymui numatytame gaunamame baltyme [Sabatini et ai., The metabolic basis of inherited disease, pp. 177-223, C.V. Scrivere/aZ. eds., McGraw-Hill, New York]. Paieška duomenų bazėse, panaudojant Blast ir Block programas, nedavė jokios homologinės sekos.

Atliktas žmogaus riebalinio audinio RNR northerno blotingas, ir nustatytos panašios j pelės ob geną RNR formos. kDNR klonų sekvenavimas ir analizė parodė, kad žmogaus OB taip pat koduoja 167 aminorūgščių polipeptidą (fig. 2A ir B, ir fig. 3). Ir žmonių atveju buvo rastos dvi kDNR klasės, turinčios ir neturinčios trijų bazių porų delecijas (fig. 6). Numatytoje klonavimo srityje pelės ir žmogaus OB genai buvo labai homologiški, bet prieinamose 3’ ir 5’ netransliuojamose srityse buvo tik 30% homologijos. Žmogaus OB polipeptide taip pat buvo N-galinė signalinė seka. Žmogaus ir pelės OB polipeptidu sekų palyginimas parodė, kad abi molekulės aminorūgščių sudėties atžvilgiu yra 83% identiškos (fig. 4). Abiejų rūšių subrendusių baltymų N-galai buvo dar labiau homologiški, ir turėjo tik 6 konsrevatyvius ir 3 nekonservatyvius aminorūgščių pakitimus tarp 100 N-galinių aminorūgščių liekanų.

Genominė DNR išskirta iš pelės, žiurkės, triušio, katės, karvės, avies, kiaulės, žmogaus, vištos, ungurio ir drozofilos, ir restriktuota EcoRl. Atlikta suskaldytų mėginių elektroforezė 1% agarozės TBE gelyje. Tada DNR perkeltos į imobilono membraną ir zonduotos PCR-žymėtu 2G7 zondu. Filtras hibridizuotas 65°C temperatūroje, plautas du kartus 2x SSC, 0.2% SDS 65°C temperatūroje; kiekvienas plovimas truko 20 minučių; du kartus buvo keistas buferis. Šie duomenys parodė, kad OB yra stuburiniuose gyvūnuose (fig. 16). Atkreipkite dėmesį, kad yra 2+ signalas ungurio DNR; ungurys yra žuvis.

Reziumuojant gautus duomenis matyti, kad kūno svoris ir nutukimas yra fiziologiškai kontroliuojamas. Prieš 7 metus buvo mėginta identifikuoti du svarbiausios šios sistemos komponentus: oB ir DB genus. Kaip rodo šis pavyzdys, dabar yra identifikuotas OB genas, kaip riebalams specifinis genas, kuris vaidina pagrindinį vaidmenį kūno svorio reguliavime. Šio geno produktas, kuris tikriausiai yra išskiriamas hormonas, turės svarbią reikšmę diagnozuojant ir gydant žmonių ir kitų gyvūnų mitybinius sutrikimus.

PAVYZDYS: OB ekspresija bakterijose

Pelės ir žmogaus kDNR, koduojančios ob, buvo klonuotos į PET-15b ekspresijos vektorių (Novagen). Šis vektorius turi T7 promotorių, sujungtą su lac operatoriumi, ir ekspresuoja sulietą baltymą, turintį histidino tag (His-tag) ir trombino skaldomą vietą, esančią aukštyn einančia kryptimi prie pat koduojančios sekos įterpimo vietos (fig. 17) (SEQ ID NOS:11 ir 12).

Pelės ir žmogaus kDNR buvo modifikuotos taip, kad alaninas signalinės sekos gale buvo nukreiptas į Ndel vietą, o 3’ srityje buvo atskira seka. Ndel įterpimas atliktas, naudojant PCR su naujais pradmenimis:

Mnde-5’ (pelės penki prim pradmuo):

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC

Mnde-3’ (pelės trys prim pradmuo):

TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC

Mnde-5’ (žmogaus penki prim pradmuo):

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC

Mnde-3’ (žmogaus trys prim pradmuo):

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16)

Pradmenys viduryje turi 6 bazių porų neatitikimą, kuris įveda Ndel restrikcijos vietas kiekviename PCR fragmento gale. Fagai, turintys arba pelės, arba žmogaus kDNR, buvo PCR-amplifikuoti, naudojant tokius pradmenis. PCR produktai skaldyti Ndel ir valyti elektroforezės 1% žemos lydymosi temperatūros agarozės gelyje būdu. Gautos išvalytos juostelės subklonuotos į pET vektorių. Susidariusios plazmidės sekvenuotos, norint įsitikinti, ar klonavimo PCR amplifikacijos stadijoje neatsirado mutacijų. Buvo pagaminti pelės ir žmogaus kDNR dariniai, kurie koduoja, ir kurie neturi glutamino 49. Konkrečiau, panaudojant PCR klonavimo metodą, padaryti pET 15b dariniai, turintys arba žmogaus, arba pelės OB koduojančią seką minus signalinė seką, ir sujungti su Histag. Šie dariniai buvo sekvenuoti, norint įsitikinti, ar PCR amplifikacijoje nebuvo įvesta klaidų į OB geno koduojančią sritį.

Bakterinio ekspresijos šeimininko transformavimui atrinkti du gauti plazmidžių dariniai - pETM9 ir pETH14. Indukuojant 1 mM IPTG optimaliomis sąlygomis, transformuotos bakterijos galėjo produkuoti 100-300 Mg/ml sulieto OB. Didžioji dalis OB sulieto baltymo buvo rasta inkliuzijos kūnelyje. Atlikus soliubilizaciją 6 M guanidino-HCl arba šlapalu, sulietas baltymas buvo valytas, leidžiant per His-surišimo (Ni-chelatų sudarymo) dervos kolonėlę. OB sulieto baltymo valymo, leidžiant per kolonėlę, sąlygos (įskaitant surišimą, plovimą ir eliuciją) nustatytos eksperimentiškai. OB sulietas baltymas nesiriša su derva, esant 5 mM imidazolo/ 6 M guanidino-HCl, ir išlieka surištas, esant iki 20 mM imidazolo/ 6 M guanidino-HCl. Baltymas gali būti eliuuojamas iš drevos, esant 60 mM imidazolo/ 6 M guanidino (fig. 18A, B). Po to, žmogaus ir pelės sulieti baltymai buvo dializuoti PBS, norint iš preparato pašalinti guanidino-HCl, ir naudoti polikloniniams antikūnams gauti.

Norint nustatyti sulieto baltymo produktų biologinį aktyvumą, buvo išbandytos ir ištobulintos išvalyto baltymo perlankstymo sąlygos. Šios sąlygos apima pradinę sulieto baltymo dializę 1 M guanidino tirpale, po to praskiedžiama 0,4 M arginino tirpalu. Prieš biologinių funkcijų tyrimą iš sulieto baltymo pašalinama His-tag. Tag pašalinimas pasiekiamas, veikiant sulietą baltymą trombinu iš žmogaus placentos.

Be to, žmogaus ir pelės OB geno koduojančios sekos minus signalinė seka buvo įterptos į pET 12c vektorių, naudojant PCR klonavimo metodą. Šie dariniai gali nukreipti sintezuotus OB sulietus baltymus į bakterinio šeimininko ląstelės periplazminę ertmę. Iš periplazminės ertmės išgautą OB sulietą baltymą reikia tik paprasčiausiai nufiltruoti per gelį, kad jis būtų išvalytas nuo kitų šeimininko baltymų, ir šiame procese jis nebus denatūruojamas.

PAVYZDYS: Antikūnų prieš OB polipeptidą gavimas

Apart rekombinantinio baltymo panaudojimo polikloniniams antikūnams gauti, buvo identidikuotos keturios peptidų sekos iš išvestos pelės OB sekos, naudojant imunogeniškumo diagramos kompiuterinę programą (GCG Package). Keturi karboksigaliniai peptido fragmentai yra:

(SEQ ID NO:18):

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO:19):

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Tlir-Leu-Ala (SEP ID NO:2Q|:

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-GIu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:21):

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Šie peptidai buvo konjuguoti su KLH, ir peptido-KLH konjugatai buvo panaudoti triušių imunizavimui, naudojant standartines metodikas. Iš triušių išskirti polikloniniai antiserumai, specifiški kiekvienam peptidui.

PAVYZDYS: OB polipeptido translokacija in vitro

Funkcinės signalinės sekos buvimo patvirtinimui, žmogaus kDNR, j kurią įeina visas atviras skaitymo rėmelis, buvo subklonuota į pGEM vektorių. Šiame eksperimente naudota tik žmogaus kDNR, kadangi tinkami pelės subklonai nebuvo išskirti. Buvo transkribuota teigiamos grandinės žmogaus ob RNR, naudojant Sp6 polimerazę, ir panaudota in vitro reakcijoje, esant ir nesant šuns kasos mikrosominių membranų. Migravo pirminis transliacijos produktas, kurio molekulinis svoris buvo —18 kD, kuris sutampa su molekuliniu svoriu, numatytu iš kDNR sekos. Mikrosominių membranų įvedimas į reakciją bendrą transliacijos efektyvumą inhibavo —5 kartus. Tačiau esant membranos preparatui nuo apie 50-70% OB pirminio transliacjos produkto buvo atskelta apie 2 kD, kas rodo, kad signalinė seka yra funkcionali (fig. 19A). Pirminio transliacijos produkto interleukino-1-α RNR, kuri nekoduoja signalinės sekos, dydis buvo nepakitęs, kai į reakciją buvo įvestos mikrosominės membranos. Norint patvirtinti, kad įvyko OB baltymo translokacija, in vitro transliacijos produktai buvo veikiami proteinaze-K. Apdorojus proteaze įvyko pilna 18 kD pirminės transliacijos produkto proteolizė, tuo tarpu 16 kD apdorota forma nepakito veikiant fermentu, ir tai rodo, kad ji translokavosi į mikrosomų vidų (fig. 19B). Šie duomenys patvirtina hipotezę, kad OB yra išskiriama molekulė.

Suskaldžius signalinę seką, numatytame baltyme turėtų likti dvi cisteino liekanos; tokiu būdu yra tikimybė, kad molekulė turi disulfidinę jungtį, charakteringą kitiems išskiriamiems polipeptidams [Shen et ai., Science, 224:168-171 (1984)].

PAVYZDYS: OB geno apibūdinimas

Norint nustatyti ryšį tarp nutukimo ir genetinių pokyčių žmonių OB gene, buvo nustatyta žmogaus OB geno seka (fig. 20A-E) (SEQ ID NOS: 22 ir 24). Žmogaus PI bibliotekos skryningui panaudoti specifiniai pradmenys iš žmogaus koduojančios sekos. Buvo gauti trys skirtingi PI klonai, išauginti ir PCR-amplifikuoti, naudojant pradmenis, flankuojančius sujungimo vietą tarp pirmojo ir antrojo koduojančių egzonų. Buvo amplifikuota ir dalinai sekvenuota apie 2 kb ištisinė introno sritis (žr. fig. 20A, kaip parodyta SEQ ID NO:22 ir 24).

Pelės ir žmogaus geno struktūra apibūdinta, naudojant PCR bandymus ir kitas standartines metodikas. Buvo rasta, kad pelės OB genas susideda iš trijų egzonų, iš kurių antrasis ir trečiasis susiję su koduojančia seka (fig. 20D). Žmogaus OB genas turi tą pačią struktūrą, tačiau žmogaus gene nėra 5’ egzono ir introno (fig. 20E).

Buvo pagamintos dvi serijos pradmenų, gautų iš žmogaus geno introninių sekų (fig. 20A-C). Šių pradmenų sekos yra (F ir R reiškia atitinkamai tiesioginę ir atvirkštinę sekas):

HOB lgF HOB lgR HOB 2gF HOB 2gR

5’-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3’

5’-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3’

5’-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3’

5’-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3’ (SEQ ID NO:29) (SEQ ID NO:30) (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32)

Buvo gauti DNR pavyzdžiai iš įvairių šaltinių, ir šie pradmenų rinkiniai panaudoti žmogaus genominės DNR iš labai nutukusių žmonių amplifikacijai. Atlikta PCR produktų elektroforezė žemos lydymosi temperatūros agarozės gelyje, juostelės išpjautos ir skaldytos agaraze. Sekos nustatytos panaudojant ABI 373A DNR sekvenatorių ir Taq didezoksiterminatoriaus rinkinį (ABI, Perkin-Elmer). Dabar nustatyta vieno taško mutacija ob gene iš paciento pavyzdžio. Ši mutacija yra pirmąjame egzone ir nekeičia aminorūgščių sekos. Preliminarūs duomenys rodo, kad kito paciento pirmąjame egzone gali būti įterpimo seka.

Gali būti panaudotas kitoks automatizuotas sekvenavimo metodas, vietoje Taq DNR polimerazės vartojant sekvenazę, kuri duoda lengviau skaitomas sekas mutacijos nustatymui.

PAVYZDYS: OB ekspresija mielėse

Atlikus pozicinį OB klonavimą, svarbu nustatyti fiziologinį mechanizmą, kaip OB baltymas mažina maisto suvartojimą ir kūno svorį. Pirmasis žingsnis šia kryptimi buvo rekombinantinis funkcinio baltymo gavimas, panaudojant ekspresijos sistemą. Šalia sėkmingos bakterinės ekspresijos sistemos, taip pat pasirinkta ir mielių ekspresijos sistema. Ekspresija mielėse turi keletą OB ekspresijai tinkamų privalumų. Svarbiausias iš jų yra tas, kad gali būti gaunami biologiškai aktyvūs eukariotiniai baltymai. OB polipeptidą išskiria žinduolių ląstelės. Baltymo išskyrimas yra labai panašus visiems eukariotams, kas reiškia, kad mielių sekrecinis mechanizmas į panašesnis į žinduolių sekrecinį mechanizmą, negu turėtų būti bakterinis mechanizmas. Konkrečiau, OB baltymo, esančio žinduolių ląstelėse, modifikacijos taip pat turėtų būti matomos mielių ekspresijos sistemos ekspresijoje. Be to, pereinant per sekrecinį mechanizmą, įvyksta baltymo susilankstymas ir todėl gaminantis ob pagal mielių sekrecijos mechanizmą, turėtų gautis reikiamai sulankstytas baltymas, turintis natyvų biologinį aktyvumą. Tai yra svarbu OB atveju, kadangi dvi cisteino liekanos gali sudaryti disulfidinį tiltelį. Priešingai sekreciniams keliams, ląstelės citoplazmos redukuojanti aplinka neleidžia susidaryti disulfidiniams tilteliams; ir todėl svarbu , kad OB pereitų tokį sekrecinį kelią, kad in vivo susidaryti} disulfidinė jungtis. Kiti privalumai yra darbo su mielėmis lengvumas ir greitumas, vektorių ir kamienų prieinamumas ir didelė patirtis mielių rekombinacinėje technologijoje.

Pichia pastoris ekspresijos sistema buvo pasirinkta dėl keturių priežasčių: (1) didesnis heterologinio baltymo ekspresijos lygis, palyginus su kitomis mielių sistemomis, tokiomis kaip S.cerevisiae·, (2) baltymo glikozilinimas yra panašesnis į žinduolių sistemą P.pastoris sistemoje, negu S.cerevisiae (nors, naudojant kompiuterinę paiešką, ir nebuvo rastos ob glikozilinimo vietos, vis tik lieka glikozilinimo galimybė neatpažintose vietose); (3) P.pastoris natyviai išskiria labai daug baltymų, ir todėl yra paprasta išskirti ekspresuotą svetimą baltymą; ir (4) vektoriai ir kamienai yra prekyboje (Invitrogen). Dvi mielių ekspresijos vektorių gavimo strategijos parodytos fig. 21 ir 22.

Buvo pasirinktas vektorius pPIC.9. Šis vektorius turi klonavimo vietą tuojau pat po α-perdengimo faktoriaus prepro koduojančios sekos žemyn einančia kryptimi, kuris nukreipia baltymą, koduojamą geno, klonuoto j klonavimo vietą, kuris turi būti sekretuojamas šiuo skrecijos keliu. Kita svarbi šio vektoriaus ypatybė yra HIS4 genas, kuris leidžia parinkti vektoriaus sugėrimą, naudojant mielių auksotropinį kamieną, auginamą mažą histidino kiekį turinčiose terpėse, o po to transformuoti mieles šiuo vektoriumi. Klonavimo strategija buvo tokia: PCR amplifikacija OB kDNR, naudojant 5’ pradmenį, kuris 3’ gale turi seką, komplementarią OB sekai tuoj pat po numatytos lyderinio peptido skaldymo vietos, ir jo 5’ gale- seką, komplementarią vektoriaus aperdengimo faktoriaus sekos 3’ galui. 5’ pradmuo taip pat turi ATzoI vietą. 3’ pradmuo buvo sukonstruotas taip, kad jis 3’ gale turi seką, komplementarią kelioms paskutinėms aminorūgštims, ir £coRl vietą jo 5’ gale. Po PCR amplifikacijos, PCR produktas skaldytas Xhol ir £coRl ir klonuotas į panašiai suskaldytą pPIC.9. Po pelės ir žmogaus OB kDNR klonavimo, išskirtas kiekvienas (turintis ir neturintis glutamino prie 49 kodono) individualus klonas visiems keturiems dariniams ir sekvenuotas, norint patikrinti ar dariniai buvo klonuoti tinkamoje orientacijoje ir rėmelyje ir ar jie neturi mutacijų, atsiransančiiį PCR amplifikacijos stadijoje. Nustačius klonus, turinčius teisingą seką, jie buvo transformuoti į P.pastoris kamieną GS115 - histidino auksotrofą.

Dviems pelės OB dariniams buvo atrinkti transformuoti mielių klonai baltymo ekspresijai. Norint įsitikinti, kad transformuotos mielės turi OB, atliktas DNR taškinio blotingo ir kolonijos hibridizacijos bandymai, kurie parodė, kad OB seka yra transformuotose mielėse, bet jos nėra netransformuotose mielėse. Be to, dabar transformuotos mielės išskyrė 16 kDa baltymą į kultūrinę terpę, o netransformuotos mielės neišskyrė tokio dydžio baltymo (fig. 23A). Tai yra numatytas OB dydis. Abiem pelės dariniams identifikuoti atskiri klonai, kurie labai gerai ekspresuoja OB, ir buvo ištobulinta valymo metodika ob išgryninimui iki homogeninio. Viena metodika buvo OB valymas, panaudojant katijonų mainų kolonėlę (fig. 23B); preliminarūs duomenys rodo, kad galima naudoti stiprų katijonitą. Tačiau katijoninėje mainų chromatografijoje buvo prarastas laukiamas ob produktas. Tai rodo, kad mėginyje buvo proteazės.

Vienas šios problemos sprendimo būdas yra pagaminti ob-His-tag suliejimo darinį ekspresijai mielėse (fig. 22). Tolimesni bandymai parodė, kad OB be His-tag labai smarkiai asocijuojasi su Ni-chelatų sudarymo kolonėle. OB polipeptido valymas, panaudojant Ni-chelatų sudarymą, ir po to atlikta gel-filtracija davė pakankamo grynumo produktą analizei masių spektroskopijos metodu. Masių spektroskopija patvirtino, kad ekspresuoto baltymo molekulinis svoris yra identiškas laukiamam molekuliniam svoriui, kas labai aiškiai parodo, kad OB yra sėkmingai ekspresuojamas Pichia.

Tačiau Ni-chelatų sudarymo/gel-filtracijos valymo metodika neduoda pakankamai švaraus OB polipeptido. Jame yra kitų mažų molekulių. Pasirodo, kad proteolitinis aktyvumas išsiplauna iš Ni-chelatų kolonėlės j balastinį tūrį. Išeinant iš to, suplanuotas trijų stadijų valymo būdas: Ni-chelatų sudarymas, po to einantys jonų mainai (kurie pašalina mažas užteršiančias molekules), o po to eina gel-filtracija.

Ekspresijos lygio įvertinimas, nudažant SDS-PAGE gelius Coomassie mėliu, rodo, kad yra apie 10 /xg/l, kai mielės auginamos purtomose kolbose. Galima laukti, kad šie lygiai padidės fermentacijos induose, ir mes pradėjome inicijuoti fermentaciją, tikėdamiesi gauti didesnius baltymo kiekius. Imant žmogaus OB darinius, buvo identifikuoti transformuoti mielių klonai, turintys didelį kopijų skaičių, ir tikimasi, kad jie ekspresuos OB baltymą. Kai bus gauti antikūnai, jie bus panaudoti išskirto 16 kDa baltymo identifikavimui patvirtinti.

PAVYZDYS: OB sulieto peptido aukšto lygio ekspresija bakterijose

Užšaldytų įkrovų paruošimas:

Į kiekvieną iš dviejų 4 ml tūrio sterilizuotos M9ZB terpės, neturinčios anglies, mėginį pridedama 40 μ] dekstrozės (0,4 g/ml, steriliai nufiltruotas), 10 μΐ ampicilino (200 mg/ml) ir 5 μΐ chloramfenikolio (34 mg/ml, etanolyje). Šiems mėginiams inokuliuoti panaudota vienintelė kolonija kiekvieno iš E.coli su klonuota pelės ir žmogaus OB1 DNR Novagen pET-14b vektoriuje. Mėgintuvėliai inkubuojami 37°C temperatūroje per naktį.

0,5 ml per naktį išlaikytos kultūros panaudota 50 ml M9ZB terpės su dekstroze, ampicilinu ir chloramfenikoliu inokuliuoti. Mišiniai inkubuoti 30°C temperatūroje ir periodiškai matuojamas optinis tankis, esant 600 nm bangos ilgiui (Aeoo)· Kai Αβοο yra apie

1-1,2, 175 μΐ kultūros sumaišoma su 25 μΐ 60% glicerolio 2 ml talpos ependorfo mėgintuvėliuose, greitai užšaldoma skystame azote ir laikoma -80°C temperatūroje.

Kultūros auginimas:

ml M9ZB terpės su 0,5 ml 40% dekstrozės, 125 μΐ ampicilino ir 50 gi chloramfenikolio įkrovų inokuliuota 1 ml užšaldytos įkrovos ir inkubuota 30°C temperatūroje. Kai A500 buvo 1-1,2,10 ml šios kultūros panaudota kiekvienai iš keturių 2 1 terpės kolbų su 500 ml M9ZB terpės, kurioje yra dekstrozės, ampicilino ir chloramfenikolio, inokuliuoti. Tirpalai inkubuoti 30°C temperatūroje, kol Asoo pasidarė lygus apie 1-1,2, esant galutinei 0,5 mM IPTG koncentracijai. Kultūros inkubuotos per naktį. Ląstelės surinktos, centrifuguojant 20 min, esant 4000 aps/min. Šioje ekspresijos sistemoje gautas rekombinantinis OB polipeptidas, esant gana dideliam bendro baltymo procentiniam kiekiui - gramų/litre E.coli eilės.

Ląstelių Ūžavimas ir inkliūzinių kūnelių resuspendavimas:

Ląstelių masė resuspenduojama minimaliame 20 mM HEPES, pH 7,2, 10% glicerolio, 0,1 M KC1,5 mM MgCL, 1% aprotinino, 1 mM PMSF, 5 Mg/ml leupeptino ir 50 Mg/ml DNRazės I tūryje. Suspesija užšaldoma-atšildoma penkis kartus, naudojant skystą azotą ir drungną vandenį. Lizuotos ląstelės centrifuguojamos 30 min, esant 18000 aps/min, ir resuspenduojamos 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl. Suspensija paveikiama ultragarsu ir pridedama tritono Χ100, kad galutinė koncentracija būti} 2%. Ši suspesija centrifuguojama 15 min, esant 18000 aps/min. Po dar dviejų tokių ciklų, atliekami trys plovimo ciklai be tritono. Po to, centrifugavimo nuosėdos tirpinamos 6 M GdHCl (guanidino HC1), 20 mM HEPES, pH 7,5, panaudojant ultragarsą, o po to centrifuguojama. Nuopilas naudojamas tolimesniam valymui.

OB baltymas valomas nesulankstytoje būsenoje, panaudojant imobilizuotų metalų jonų afininę chromatografiją (IMAC). Tirpalas suleistas į 40 ml talpos Pharmacia chelatų sudarymo greito srauto sefarozės, užkrautos 5 kolonėlės tūriais 50 mM N1SO4, kolonėlę, kuri ekvilibruota 6 M GdHCl, 30 mM imidazolo, 20 mM HEPES, pH 7,5. Po to, baltymas eliuuotas tuo pačiu buferiu, turinčiu 0,2 M imidazolo. Nesulankstytas baltymas 6 M

GdHCl laikomas 4°C temperatūroje, pridėjus natrio acetato (NaAc) iki 10 mM ir acto rūgštimi nureguliavus pH apie 4,5.

Baltymo perlankstymas ir gryninimas:

M GdHCltirpalas, turintis 100 mg baltymo, veikiamas 67 μΐ 1 M ditiotritiolio (DTT) ir praskiedžiamas iki maždaug 67 ml 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4,5. Tirpalas maišomas kambario temperatūroje apie valandą. Tada, maišant, jis praskiedžiamas 4 1 20% glicerolio, 2,5 mM CaCl₂, 20 mM Tris, pH 8,4 buferiu. Gerai sumaišius, tirpalas toliau maišomas kambario temperatūroje apie 8 h. Po to pridedama 2000 vienetų išvalyto jaučio trombino (iš Thrombostat, Parke-Davis produktas), ir tirpalas silpnai maišomas toliau. Po 2,5 h j jį pridedama dar 2000 vienetų trombino ir Histidino-tag skaldymas tęsiamas dar 3 h. Skaldymas trombinu sustabdomas dedant- PMSF, kol jo galutinė koncentracija yra 0,1 mM. Tirpalas nufiltruojamas ir laikomas 4°C temperatūroje.

Suskaldytas baltymas vėl valomas, panaudojant tą pačią, kaip nurodyta aukščiau, kolonėlę, ekvilibruotą 1 M KC1,20% glicerolio, 20 mM HEPES, pH 8,4 buferiu. Supylus baltymo tirpalą, kolonėlė plaunama tuo pačiu buferiu, ir suskaldytas baltymas eliuuojamas 1 M KC1, 20% glicerolio, 40 mM imidazolo, 20 mM HEPES, pH 8,4 buferiu. Nesuskaldytas baltymas eliuuojamas, esant 0,2 M imidazolo.

Išvalytas suskaldytas baltymas koncentruojamas, veikiamas 50-100 mM EDTA, 10 mM kalio fericianidu (kad būtų pilnai suoksiduota) ir gel-iltruojamas per superdekso 75 16/60 kolonėlę. Naudojant šią metodiką, gaunamos 50% išeigos, skaičiuojant pagal pradinį peptidą.

Išgrynintas ekspresuotas baltymas buvo apibūdintas keliais metodais. Fizikinis apibūdinimas apima dinaminę šviesos sklaidą, norint nustatyti struktūros homogeniškumą, ir panaudotas kaip teisingo sulankstymo matas. Šviesos sklaidos duomenys rodo, kad žmogaus OB polipeptidas ekspresuojamas daugiausiai arba išimtinai kaip monomeras, tuo tarpu pelės OB polipeptidas gali būti randamas tiek kaip dimeras, tiek ir kaip monomeras.

Bandymai su Ellmano reagentu ir masių spektroskopijos analizė patvirtina, kad cisteino liekanos baltyme sudaro disulfidinį ryšį. Ši oksiduota polipeptido forma buvo duodama pelėms, kaip aprašyta infra, ir rodė biologinį aktyvumą.

100

Norint apytikriai nustatyti baltymo struktūrinę geometriją, buvo panaudotas cirkuliarinis dichroizmas. CD spektrai fiziologiniame buferyje (pH apie 8, maždaug fiziologinė joninė jėga) rodo, kad žmogaus OB polipeptidas turi maždaug apie 60% aspiralės ir apie 40% mišrios spiralės struktūrą. Pagal CD spektroskopiją rasta, kad pelės OB polipeptidas turi apie 50% α-spiralės ir apie 50% mišrios spiralės struktūrą.

Norint nustatyti OB polipeptido dalis, kurios yra prieinamos proteolizei, buvo panaudota ribota proteolizė, o po jos - masių spektroskopija [Cohen et al., 1995, supra]. Ši analizė parodė, kad 54-60 aminorūgščių liekanos sudaro lanksčią kilpą (pavaizduota fig. 4). Panašu, kad ši lanksti kilpa sujungia dvi nustatytos 2° struktūros vietas, pvz., a-spiralės.

Svarbu pažymėti, kaip parodyta tolimesniuose pavyzdžiuose, kad išvalyto baltymo bioaktyvumas buvo tiriamas, duodant šį baltymą tiek liesiems, tiek ir nutukusiems graužikams, panaudojant osmotinį siurblį (pvz., ALZET osmotinį siurblį iš Alza Corporation, Palo Alto, CA) arba kaip kasdieninę atskirą dozę i.p. bent dviejų savaičių laikotarpyje, ir buvo stebėti efektai į maisto suvartojimą ir kūno svorį.

PAVYZDYS: OB polipeptido (leptino) svori mažinantys efektai

Pelės OB lokuso geno produktas vaidina svarbų vaidmenį kūno svorio reguliavime. Šiame pavyzdyje nustatyta, kad OB baltymas cirkuliuoja pelės, žiurkės, ir žmogaus plazmoje. Visuose trijuose organizmuose cirkuliuojanti forma turi tą patį molekulinį svorį (pagal SDS-PAGE), kaip išvesto polipeptido seka be signalinės sekos, kas duoda pagrindą manyti, kad in vivo baltymas nesigamina, jei atskeliama signalinė seka. OB baltymo nebuvo C57/B16J oblob pelių plazmoje, jo kiekis dbldb pelių plazmoje dešimt karti} didesnis, o fa/fa žiurkių plazmoje - dvidešimt karti} didesnis, lyginant su kontrole. Tai leidžia manyti, kad šie nutukę gyvuliukų mutantai yra atsparūs OB poveikiui. Šešių liesų žmonių grupėje OB baltymo kiekiai plazmoje skyrėsi septynis kartus. Rekombinantinio pelės OB baltymo kasdieninės injekcijos dramatiškai mažino oblob pelių kūno masę, turėjo žymų poveikį laukinio tipo pelių kūno masei ir neveikė db/db pelių. Šie duomenys rodo, kad OB lokuso geno produktas tarnauja kaip endokrininė funkcija kūno svorio reguliavime.

101

Medžiagos ir metodai

Triušiai buvo imunizuoti rekombinantinių baltymu Froindo stimuliatoriuje (URP, Ine.). Imunoišgryninti anti-pelės antikūnai pagaminti, praleidžiant antiserumą per sefarozės 4B, konjuguotos su rekombinantinių baltymu, kolonėlę, kaip aprašyta [Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Pelės plazmos imunonusodinimas buvo atliktas taip: 0,5 ml pelės, žiurkės ir žmogaus plazmos, turinčios apie 2,5 mM EDTA, nuskaidrinta nekonjuguota sefaroze 4B, purtant kambario temperatūroje 2 valandas. Sefarozė pašalinta centrifugavimo būdu, ir pridedama 50 ml konjuguotos su antikūnu sefarozės, turinčios afininiu būdu išvalyto antikūno, kurio koncentracija yra 1 mg/ml sutankintos sefarozės, 50% suspensijos. Pridedama pusė mililitro 2x RIPA buferio, kad galutinės susijungimo sąlygos būtų tokios: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mMNaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natrio dezoksicholato ir 0,025% natrio azido. Reakcija vykdoma, purtant per naktį 4°C temperatūroje. Konjuguota su antikūnu sefarozė plaunama 8 kartus, naudojant RIPA buferį, po to tris kartus skalaujama PBS ir daroma 15% SDS-PAGE elektroforezė. Baltymai uždedami ant nitroceliuliozės ir atliekamas vesterno blotingas su biotilintu imunoišgrynintu antikūnu prieš rekombinantinį baltymą. Naudotas antrinis antikūnas buvo HRP-streptavidinas, o detekcijai naudotas ECL.

Norint nustatyti OB kiekį pelės serume, į 100 λ C57BL/6J ob/ob plazmos pridedami vis didėjantys kiekiai (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15 ng) perlankstyto rekombinantinio pelės OB baltymo ir inkubuojama 4°C temperatūroje su baltymo A, konjuguotu su sefaroze, antikūnu 3 valandas. Gerai išplovus A buferiu (10 mM natrio fosfato buferis, pH 7,4; 100 mM NaCl; 1% tritono K-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF), mėginiai resuspenduojami mėginio buferyje, perleidžiami per 15% SDS-PAGE ir perkeliami į nitroceliuliozės membraną. Vesterno blotingas atliekamas, naudojant imunoišgrynintą biotilintą antiamino-galo antikūną, kaip pirminį antikūną, ir HRP-streptavidiną, kaip antrinį antikūną, o po to detektuojama ECL.

Citoplazminiai ekstraktai pagaminti, homogenizuojant adipozinį audinį NDS buferyje (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0,15 mM spermino, 0,5 mM spermidino, 14 mM β-merkaptoetanolio, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40)

102 panaudojant politroninę ir ... homogenizaciją, o branduoliai pašalinami centrifuguojant (700 g).

Imunonusodinimas atliekamas taip kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad naudojami imunoišvalyti anti-žmogaus OB antikūnai. ELISA bandymui, 100 ml 1 mg/ml imunoišgryninto anti-žmogaus OB antikūno ištirpinama borato buferyje PBS tirpale, ir laikoma per naktį ant mikrofiltro (Corning cat. #2595) plokštelių 4°C temperatūroje. Tada plokštelės plaunamos 4 kartus borato-natrio chlorido tirpalu, turinčiu 0,05% Tween 20 ir pašalinamas skysčio perteklius. Plokštelės blokuojamos, inkubuojant kambario temperatūroje 2 valandas 240 ml/duobutei borato-natrio chlorido buferiu, turinčiu 0,3% želatinos, po to plaunama ir džiovinama. Atskirose duobutėse inkubuojama per naktį 4°C temperatūroje arba žinomi kiekiai žmogaus OB perlankstyto baltymo arba plazmos mėginių 100 ml tūryje. Perplovus, plokštelės inkubuojamos su 100 ml biotilinto imunoišgryninto anti-žmogaus antikūno (0,1 mg/ml želatinos-borato buferio tirpalas) 4 valandas kambario temperatūroje. Perplovus į plokšteles pridedama krienų peroksidazės (HRP)-streptavidino (0,1 mg/ml boratinio buferio, 0,3% želatinos). Detekcijai naudojamas HRP substrato tirpalas (ABTS, 0,3 mg/ml ir Η₂Ο₂, 0,01% citrinos rūgštyje) ir antikūno susirišimo kiekiui nustatyti matuojamas optinis tankis esant 414 nm.

Pelės ir žmogaus OB geną koduojančios sekos buvo PCR-amplifikuotos iš plazmidžių, turinčių OB kDNR sekas, ir subklonuotos į pPIC.9 plazmidę (Invitrogen). Naudotas žmogaus 5’ pradmuo buvo:

5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3’ (SEQ ID NO:34), o 3’ pradmuo buvo:

5’ GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3’ (SEQ ID NO:35).

Pelės atveju, 5’ pradmuo buvo:

5’ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3’ (SEQ ID NO:36), o 3’ pradmuo buvo:

5’ GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3’ (SEQ ID NO:37).

Tiek pelės, tiek ir žmogaus 5’ pradmuo turi Xhol vietą 5’ gale ir a-persidengimo faktoriaus signalinės sekos, esančios pPIC.9 vektoriuje, 4 paskutines aminorugštis

103 koduojančias sekas. Šis vektorius nukreipia heterologiškai ekspresuotų genų sekreciją iš ląstelės į kultūrinę terpę. 5’ PCR pradmenyje taip pat yra OB geno atviro skaitymo rėmelio pirmieji 19 nukleotidų po signalinės sekos skaldymo vietos prieš alaniną, esantį 21-je aminorūgšties padėtyje. 3’ pradmuo turi EcoRI vietą 5’ gale, po kurio tuoj pat eina sekos, komplementarios laukiamam OB stop-kodonui. PCR sąlygos buvo tokios: 1 min trukmės denatūravimas 94°C temperatūroje, 1 min trukmės renatūravimas 55°C temperatūroje ir 2,5 min trukmės išplėtimas 72°C temperatūroje. PCR-generuotų mutacijų skaičiui apriboti naudota nedidelio skaičiaus ciklų (15 ciklų) PCR ir nuskaitymo patikrinimo polimeraze PFU (Stratagene). PCR produktai skaldyti Xhol ir EcoRI ir klonuoti į panašiai suskaldytą vektorių pPIC.9. Sekvenuotos abi visų darinių grandinės, norint įsitikinti, ar nėra PCR-generuotų mutacijų. Klonai transformuoti į Pichia pastoris (His ) sferoplastų metodu ir atrinkti mažą histidino kiekį turinčioje terpėje. Panaudojant kolonijos hibridizacijos eksperimentą, atrinkta apie 200 pelės ir žmogaus klonų didelės kopijų skaičiaus integracijai. Ištirta didelės kopijų skaičiaus klonų OB ekspresija, iš pradžių panaudojant nudažymą Coomassie; bandymas parodė, kad transformuotų mielių kultūrinėje terpėje yra naujas 16 kD baltymas. Buvo patvirtinta, kad 16 kD juosta yra OB, naudojant antikūnus prieš bakterijų ekspresuotą OB baltymą. Rekombinantiniai baltymai valyti, panaudojant žemiau aprašytą dviejų stadijų valymo metodą. Išmatuoti masių spektrai ir atliktas bandymas su bromcianu pagal Beavis et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990) aprašytą metodiką.

Visa pelės ir žmogaus OB genų OB koduojanti seka, C-galinė signalinės sekos atžvilgiu, buvo subklonuota į pET156b ekspresijos vektorių (Novagen) ir perekspresuota Escherichia coli [BL21(DE3)plYsS], naudojant T7 RNR polimerazės sistemą [Studier et ai., Meth. Erizimology, 185:80-89 (1990)]. Ląstelės, išaugintos 30°C temperatūroje iki optinio tankio 0,7, kai bangos ilgis yra 595 nm, ir indukuotos 0,5 mM izopropil-3-Dtiogalaktopiranozidu per naktį, surinktos panaudojant nedidelio greičio centrifugavimą. Lizuota, panaudojant tris sušaldymo-atšildymo ciklus, o DNR suskaldyta DNRaze. Membranų ekstrakcija vykdyta, panaudojant ultragarsą ir soliubilizaciją detergentais, ir gauta inkliuzijos kūnelių tabletė ištirpinta 6 M guanidino-HCl, 20 mM HEPES, pH 8,4. Rekombinantinis OB baltymas valytas denatūruojančiomis sąlygomis IMAC metodu, naudojant Ni-jonų afininę kolonėlę ir plaunant vis didėjančių koncentracijų imidazolo

104 tirpalais. Tada išvalytas denatūruotas OB baltymas laikomas 6 M guanidino-HCl, 10 mM natrio acetato (NaAc), pH 5 tirpale ir redukuojamas 1 mM DTT kambario temperatūroje 1 valandą. Denatūracija atliekama, skiedžiant redukuotą baltymą 20% glicerolio, 5 mM CaCl₂, 5 mM NaAc, pH 5 tirpalu, maišant ir inkubuojant kambario temperatūroje 8-12 valandų. Po denatūracijos tirpalo pH padidinamas iki 8,4, pridedant Tris iki 10 mM koncentracijos, o heksa-histidino tag pašalinamas, panaudojant skaldymą trombinu. Suskaldytas renatūruotas baltymas vėl valomas IMAC metodu, norint atskirti produktą nuo trombino ir nesuskaldyto sulieto baltymo. Suskaldytas renatūruotas baltymas išsiplauna iš Ni jonų afininės kolonėlės, esant 40 mM imidazolo, o trombinas nėra sulaikomas, ir nesuskaldytas sulietas baltymas išsiplauna, esant 0,2 mM imidazolo. Tada produktas koncentruojamas, veikiamas 100 mM EDTA ir 10 mM fericianido ir vėl valomas gel-filtracijos būdu, naudojant Pharmacia superdekso 75 16/60 kolonėlę.

Atliktas Ellmano bandymas, pagal Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959) aprašytą metodiką. Ellmano reagentas pagamintas, ištirpinant 39,6 mg 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoinės rūgšties) (DTNB) 10 ml 0,05 M fosfato, pH 8. Gauta kalibracinė kreivė 10-120 mM laisvo sulfhidrilo koncentracijų intervale (naudojant redukuoto DTT 1 mM pagrindinį tirpalą), esant 412 nm bangos ilgiui. Kiekvienam bandymui imama 0,02 ml Ellmano reagento ir bendras reakcijos mišinio tūris yra 0,5 ml. Išmatuotas laisvos sulfhidrilo grupės ekstinkcijos koeficientas buvo 12974 M^cm'¹ (koreliacijos koeficientas 0.99987), kuris 5% ribose atitinka anksčiau pateiktą reikšmę (13600 M ^cm'¹).

Ellmano bandymui panaudota 15 ml 2 mg/ml koncentracijos gryno gel-nufiltruoto baltymo, atitinkančio galimą laisvo sulfhidrilo apie 24 mM koncentraciją galutiniame reakcijos mišinyje. Gauto tirpalo A412 buvo apie 0,02, kas rodo, kad dvi baltymo cisteino liekanos yra oksiduotoje būsenoje, sudarydamos cistiną, arba kad jo laisvos sulfhidrilo grupės yra pilnai paslėptos neprieinamoje sulankstyto baltymo dalyje. Tokie patys rezultatai gauti, atliekant tą patį bandymą su nesulankstytu baltymu, esant 6 M guanidinoHCl.

Po vieną pelę patalpinama į nepatogeninės aplinkos narvelius ir jos pripratinamos prie maisto, susidedančio iš 35% (pagal svorį) Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Ine.), 5,9% (pagal svorį) tapioka pudingo mišinio (General Foods) ir 59,1% vandens, kurio energetinė vertė yra 1,30 kkal/g. Maistas sterilizuojamas autoklavoje ir

105 supakuojamas j 60 mm plastikines lėkšteles, kurios pritvirtinamos ant 100 mm petri lėkštelių viršaus. Tapioka turi pastos pavidalą, todėl gyvuliukui sunku šį maistą išbarstyti po narvą. 100 mm dangteliai sulaiko nedidelį gyvuliuko išbarstyto maisto kiekį. Šviežia maisto lėkštelė įdedama į narvą kiekvieną rytą, o praėjusios dienos lėkštelė išimama ir pasveriama. Svorio skirtumas parodo per dieną suvartoto maisto kiekį. Rekombinantinio baltymo poveikis į maisto suvartojimą ir kūno svorį matuotas trims pelių linijoms: C57B1/6J oblob, C57B1/K.S db/db ir CBA/J +/+, gautomis iš Jackson Laboratory. Trisdešimt kiekvienos linijos pelių padalinta į grupes po dešimt pelių. Viena kiekvienos linijos grupė gavo perlankstyto bakterinio ob baltymo injekcijas intraperitonines (i.p.), esant 5 mg/g/per dieną 300 μΐ PBS buferyje dozei. Antroji grupė gavo to paties tūrio PBS i.p. injekcijas. Šios kontrolinės pelės gavo rekombinantinio baltymo PBS dializato injekcijas. PBS buvo išvalytas nuo endotoksino, naudojant Acticlean ΕΤΟΧ kolonėlę. Trečioji gyvuliukų grupė negavo injekcijų. Maisto suvartojimas buvo matuojamas kasdien, o kūno svorio matavimai atliekami reguliariai iš viso 3,5 savaitės. Porinio maitinimo eksperimentuose atskiros ob pelių grupės maisto suvartojimas lyginamas su ob pelių, gavusių baltymo, kasdieniniu maisto suvartojimu.

Rezultatai

OB baltymas cirkuliuoja pelės, žiurkės ir žmogaus plazmoje.

Rekombinantinis pelės ir žmogaus OB baltymas buvo pagamintas, naudojant pET15b bakterinį ekspresijos vektorių (Novagen) ir klonuojant į Pichia pastoris- mielių ekspresijos sistemą, kuri išskiria rekombinantinius baltymus tiesiai į kultūrinę terpę. Mielėse eksprešuotas ob baltymas turi 146 aminorūgštis C-gale prie signalinės sekos. Triušiai buvo imunizuoti bakteriniais baltymais (HRP, Ine.). Antikūnai buvo imunoišgryninti (Research Genetics) ir naudoti adipozinio audinio baltymo iš plazmos imunonusodinimo bandymuose ir vesterno blotinge.

Pelės plazmos OB baltymas migruoja, esant 16 kD molekuliniam svoriui (pagal SDS-PAGE). Jo elektroforetinis judrumas yra toks pats, kaip ir mielių išskiriamo rekombinantinio OB baltymo, kuriame pašalinta signalinė seka, judrumas (fig. 24A). C57BL/6J ob/ob pelių, kurios turi neprasminę mutaciją prie 105 kodono, plazmoje šio

106 baltymo nerasta. Kai kuriuose kituose antiserumuose nepavyko identifikuoti iš 105 liekanų susidedančio sutrumpinto polipeptido grandinės, kurios galima laukti pagal kDNR seką.

dbldb pelėse, lyginant su kontroliniais gyvuliukais, pastebėtas 10 karti} padidintas cirkuliuojančio baltymo kiekis (fig. 24A). Laukinio tipo ir fa/fa žiurkių plazmos imunonusodinimo bandymai parodė, kad mutantinių žiurkių plazmoje, lyginant su laukiniu tipu, yra 20 karti} padidintas OB baltymo kiekis (fig. 24B). db mutacija duoda nutukusį fenotipą, identišką fenotipui ob pelėse (Bahary et ai., 1990, supra). Riebios (fatty) žiurkės yra nutukusios dėl recesyvinės mutacijos gene, homologiškame db (Truett et ai., 1991, supra). Norint nustatyti OB kiekius pelės plazmoje, į serumą buvo dedami vis didėjantys rekombinantinio baltymo kiekiai ir imunonusodinama (fig. 24C). Didėjant rekombinantinio baltymo kiekiui, vesterno blotinge matomas tiesiškas signalo intensyvumo didėjimas. Natyvaus baltymo pelės plazmoje signalo intensyvumo palyginimas su standartais parodė, kad cirkuliuojančio OB baltymo kiekis laukinio tipo pelėse yra apie 20 ng/ml. Šie duomenys rodo, kad imunonusodinimai ir vesterno blotingai atlikti, esant antikūno pertekliui. Padidinti OB baltymo kiekiai taip pat randami adipozinio audinio iš db/db pelių baltyminiuose ekstraktuose, lyginant su kontrole (fig. 24D). Kaip galima laukti sekvenuoto baltymo atveju, baltymas iš adipozinio audinio frakcionuotas, imant nevalytą membraninę frakciją (duomenys neparodyti).

Buvo imunonusodinti šešių liesų žmonių, kurių kūno masės indeksas (BMI) yra mažesnis už 25 (BMI=svoris/ūgis²), plazmos mėginiai, naudojant imunoišgrynintus antikūnus prieš žmogaus baltymą. Imunonusodinta medžiaga migravo, esant elektroforetiniam judrumui, tokiam pačiam kaip ir 146 aminorūgščių žmogaus baltymo, ekspresuoto mielėse, judrumas. Signalų intensyvumai šešiuose pavyzdžiuose buvo labai skirtingi (fig. 25A). Autoradiografinė densitometrija parodė, kad šie kiekiai HP1 ir HP6 individuose skiriasi apie 5 kartus, o kituose subjektuose yra tarpiniai kiekiai. Atliktas fermentinis imunobandymas (ELISA), naudojant imunoišgrynintą antikūną ir perlankstytą bakterinį baltymą kaip standartą (žr. žemiau). Gauta standartinė kreivė parodyta fig. 25B. Pagal šį tyrimą, OB baltymo kiekiai šešių žmonių plazmoje buvo 2-15 ng/ml ribose (fig. 25C). OB baltymo kiekis HP6 plazmoje buvo už imunobandymo tiesinio intervalo ribų, ir yra >15 ng/ml. Šie kiekybiniai skirtumai koreliuojasi su vesterno blotingo duomenimis.

107

Preliminarūs duomenys leidžia manyti, kad leptinas gali cirkuliuoti (bent jau dalinai) susikompleksavęs su kitu baltymu arba baltymais. Ši išvada paremta serumo titravimo kreivės formos heterogeniškumu, lyginant su rekombinantiniu standartu. Didelio kiekio leptino, imunoišgryninto per triušio anti-OB kolonėlę HPLC gel-filtracijos būdu denatūruojančiose ir nedenatūruojančiose sąlygose, analizė, stebint ELISA ir SDS-PAGE metodais, leidžia manyti, kad OB polipeptidas elgiasi kaip didelio molekulinio svorio kompleksas. Tačiau šie duomenys yra preliminarūs; OB rišantį baltymą, jei toks iš viso yra, dar reikia apibūdinti.

OB baltymo struktūrinės ypatybės

Kadangi OB baltymas turi dvi cisteino liekanas, jis gali sudaryti arba vidines, arba tarpmolekulines disulfidines jungtis in vivo oksidacijos sąlygose. Buvo pakartotas vesterno blotingas, į mėginio buferį pridėjus arba nepridėjus redukuojančio agento. Abiem atvejais žmogaus serumo OB baltymas migravo kaip monomeras (duomenys neparodyti). Neredukuojančiomis sąlygomis baltymas, imunonusodintas iš db pelės serumo, buvo rastas padėtyse, atitinkančiose tiek 16 kD monomerą, tiek ir apie 32 kD dimerą (fig. 26A). Didesnio molekulinio svorio baltymas išnyko redukuojančiose sąlygose, kas leidžia manyti, kad pelės OB frakcija cirkuliuoja kaip didesnio molekulinio svorio formos, atsiradusios dėl tarpmolekulinės disulfidines jungties susidarymo. Apie 80% pelės OB cirkuliuoja kaip 16 kD baltymas ir 20% - kaip 32 kD forma.

Tos pačios molemulės formos randamos ir tada, kai pelės ir žmogaus baltymai ekspresuojami Pichia pastoris [Abrams et ai, Immunol. Rev., :5-24 (1992)]. Šiuose tyrimuose DNR seka, atitinkanti 146 aminorūgščių subrendusį baltymą, klonuota mielių α-persidengimo faktoriaus signalinės sekos žemyn einančia kryptimi pPIC.9 vektoriuje (Invitrogen). OB baltymas, išskirtas iš mielių štamų, ekspresuojančių pelės ir žmogaus baltymus, terpės, ir atlikta jo elektroforezė redukuojančiomis ir neredukuojančiomis sąlygomis (fig. 26A). Neredukuojančiose sąlygose mielėse ekspresuotas pelės baltymas pagrindinai buvo dimero formoje, o esant redukcijos agentų - tik monomero formoje. Rekombinantinis žmogaus baltymas abejose sąlygose migravo kaip monomeras (duomenys neparodyti).

108

Ekspresuotas Pichia išvalytas žmogaus baltymas, pagal masių spektroskopijos duomenis, turėjo 16024±3 Da molekulinę masę [Beavis, 1990, supra]. Ši reikšmė sutampa su masės reikšme, išskaičiuota pagal baltymo, turinčio vieną vidinį disulfidinį tiltelį, aminorūgščių seką (16024 Da). Baltymo skaldymo bromcianu produktų Matrikso lazerinės desorbcinės spektrometrijos analizė rodo, kad cisteinai 117 ir 167 padėtyse yra sujungti vidine disulfidine jungtimi (fig. 26B). Bromcianas skaldo prie karboksi-galo esančias metionino liekanas.

Bioaktyvaus rekombinantinio baltymo gavimas ir apibūdinimas

Pelės OB baltymas buvo ekspresuotas E.coii iš pET 15b plazmidės kaip netirpus sulietas baltymas, turintis 20-oje padėtyje N-galinį heksa-histidino tag, kuriame yra trombino skaldymo vieta. Bakteriniai inkliuzijos kūneliai soliubilizuoti, naudojant guanidino-HCl ir išskirti denatūruojančiose sąlygose, naudojant imobilizuoto metalo jono afininę chromatografiją (IMAC) (fig. 27). Išvalytas denatūruotas sulietas baltymas redukuojamas, praskiedžiamas ir perlankstomas vandeniniame tirpale kambario temperatūroje. Po skaldymo trombinu, renatūruotas pelės OB baltymas, turintis 4 papildomas N-galines liekanas (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO:38), vėl valomas IMAC metodu, kad jo homogeniškumas būtų >98%, sprendžiant pagal SDS-PAGE ir masių spektrometrijos duomenis. Pagal Matrikso lazerinę desorbcinę masių spektrometriją jo masė yra 16414±3 Da (numatyta masė yra 16415 Da). SDS-PAGE redukuojančiose ir neredukuojančiose sąlygose parodė, kad yra tik vienos rūšies forma, kurios molekulinė masė yra 16 kD (duomenys neparodyti).

Dinaminė šviesos sklaida, naudojant DP801 molekulės dydžio detektorių (Protein Solutions, Ine.) parodė, kad renatūruotas pelės OB baltymas yra daugiausia monomerinis, turintis šiek tiek aukštesnės eilės agregatų. Baltymas apdorotas EDTA ir chemiškai oksiduotas. Po to, gel-filtracijos būdu pašalintos didesnio molekulinio svorio formos. Tolimesnė dinaminė šviesos sklaida patvirtino, kad išvalytas renatūruotas rekombinantinis pelės OB baltymas yra monodispersinis. Atlikus dializę fosfatiniame buferyje su NaCl (PBS), pašalintas bakterinis endotoksinas, panaudojant Acticlean ΕΤΟΧ kolonėlę (Sterogene Bioseparations, Ine.). Galutinė baltymo išeiga 45 ml/1.

109

Norint nustatyti oksidacijos būseną, atliktas išvalyto renatūruoto rekombinantinio pelės OB baltymo Ellmano bandymas [Ellman, 1959, supra]. Ir renatūruotas baltymas, ir perlankstytas baltymas panaudojant 6 M guanidino-HCl, parodė, kad jame yra <0.5% laisvų sulfhidrilo grupių, kas rodo, kad monomerinis produktas turi vidinę disulfidinę jungtį. Tą patvirtina ir perlankstyto bakterinio baltymo skaldymo bromcianu produktų masių spektrometrija (duomenys neparodyti).

OB baltymo bioaktyvumas.

Išvalytas renatūruotas rekombinantinis pelės OB baltymas buvo duodamas C57B1/6J ob/ob (16 savaičių amžiaus), C57B1/Ks db/db (12 savaičių amžiaus) ir CBA/j +/+ (8 savaičių amžiaus) pelių grupėms (po 10 pelių), kasdien suleidžiant į pilvą 5 mg/kg/per dieną. Toks pat gyvuliukų skaičius gavo kasdienines PBS injekcijas. Kontrolinėms injekcijoms naudotas PBS buvo gautas iš dializato, pasiekus baltymo pusiausvyrą. Po dešimt gyvuliukų iš kiekvienos minėti} trijų pelių linijų negavo injekcijų. Atskirų gyvuliukų maisto suvartojimas buvo kontroliuojamas kasdien, o gyvuliukų kūno svoris nustatytas kas 3-4 dienas. Visų 9 pelių grupių maisto suvartojimo ir kūno svorio bendri rezultatai parodyti fig. 28A-F, o statistikinis duomenų reikšmingumas parodytas 1 lentelėje. C57B16J ob/ob pelių, kurioms buvo leidžiamas baltymas, maisto suvartojimas žymiai sumažėjo po pirmosios injekcijos ir toliau mažėjo iki 5-os dienos, o tada stabilizavosi, ir tada jų maisto suvartojimo kiekis sudarė apie 40%, lyginant su gyvuliukais, gavusiais PBS injekcijas (p< 0,001). Pelės, kurioms buvo leista ne OB baltymas, per trijų Savičių tyrimo laikotarpį neprarado kūno svorio. C57B1/ ob/ob pelės, gavusios baltymą, po 5 dienų prarado apie 10% kūno svorio (p<0,001). Šių gyvuliukų kūno svoris per trijų savaičių poveikio baltymu laikotarpį laipsniškai mažėjo, o po 3 savaičių ob gyvuliukų, gavusių baltymo, svoris vidutiniškai sumažėjo iki 60% jų pradinio svorio (p<0,0001). Buvo šeriama atskira gaunančių ir negaunančių baltymą ob pelių porų grupė. Fig. 29B rodo, kad suporuotai šeriamos pelės prarado daug mažiau svorio, nei gyvuliukai, gavę rekombinantinio baltymo (p<0,02). Dviejų pelių, gavusių arba baltymo, arba tirpiklio injekcijas, fotografija rodo didelį jų išvaizdos skirtumą, atsirandantį dėl baltymo poveikio (fig. 28B). Norint dar labiau įsitikinti, kad tai yra baltymo poveikis, padarytos dviejų kiekvienos grupės pelių autopsijos. ob pelių, gavusių baltymo, apžiūrėjimas parodė, kad jose labai smarkiai sumažėjo riebalų kiekis, o taip pat ir kepenų dydis. Paveikus baltymu,

110 db pelių ir laukinio tipo pelių kepenų svoris nepakito, ob pelių, gavusių PBS injekcijas, kepenys svėrė 5,04 ir 5,02 g. o gyvuliukų, gavusių baltymo - 2,23 ir 2,03 gramų, ob pelių kepenys buvo blyškiai riebalingos, o ob pelių, gavusių baltymo, kepenys buvo tamsesnės spalvos, būdingos normalioms kepenims (fig. 29C). Kepenų histologiniai pjūviai parodė, kad neapdoroti gyvuliukai turi riebalingas kepenis, kurios žymiai pagerėja, kai gyvuliukai gauna baltymo (duomenys neparodyti).

Priešingai negu ob pelių atveju, C57BL/Ks db/db pelių, gavusių baltymą, lyginant su kontroline grupe, gavusią tirpiklį, žymių kūno svorio arba maisto suvartojimo skirtumų nebuvo (fig. 28A-F, 1 lenetelė). Visos trys db/db pelių grupės apdorojimo laikotarpyje prarado 2-5 gramus kūno svorio. Panaudojant gliukometrą, išmatuotas db pelių vidutinis gliukozės kiekis kraujyje; visoms pelėms jis buvo 500 mg/dl, kas rodo, kad šiuose gyvuliukuose išsivystė antrinio tipo diabetas. Injekcijos db pelėms nutrauktos po dviejų savaičių.

Laukinio tipo pelių, gavusių rekombinantinio OB baltymo, atveju stebimas nedidelis, bet reikšmingas kūno svorio sumažėjimas (fig. 28 A-F, 1 lentelė). Po penkių dienų, per kurias buvo leidžiamas baltymas, pelės prarado vidutiniškai 0,5 g svorio, tuo tarpu kontrolinės pelės priaugo 0,4 g (p<0,02). Dviejuose vienas po kito einančiuose laiko taškuose baltymą gavę gyvuliukai svėrė daug mažiau, negu pelės, gavusios kasdienes PBS injekcijas. Svorio pokytis buvo mažesnis vėlesniuose laiko taškuose. Gyvuliukų, kurie prarado svorį, maisto suvartojimas nelabai skyrėsi nuo kontrolinių gyvuliukų. PBS injekcijos turėjo nedidelį, bet reikšmingą poveikį į ob, db ir laukinio tipo pelių maisto suvartojimą ir kūno svorį, lyginant su pelėmis, negavusiomis injekcijų (p<0,05).

lentelė

Gyvuliukų grupė	Poveikio grupė	Dienos	SVORIO POKYTIS	P
n	Vidurkis	Stand. paklaida
ob/ob	baltymas	1-5	10	-6,38000000	0,47628190	<0,001
	tirpiklis		9	-0,14444444	0,24444444
	baltymas	1-12	10	-14,45000000	0,70793126	<0,001
	tirpiklis		9	0,98888889	0,38058597
	baltymas	1-27	6	-24,28333333	0,69924563	<0,0001
	tirpiklis		5	4,30000000	0,79874902
db/db	baltymas	1-5	10	-1,47000000	0,36939891	0,240
	tirpiklis		10	-2,00000000	0,23142073

111

	baltymas tirpiklis	1-12	10 10	-3,75000000 -4,19000000	0,77348418 0,34655447	0,610
CBA/J	baltymas	1-5	10	-0,48000000	0,17876117	0,006
	tirpiklis		10	0,38000000	0,21489015
	baltymas	1-12	10	-0,12000000	0,45748103	0,015
	tirpiklis		10	1,20000000	0,18378732
	baltymas	1-27	5	1,98000000	0,48723711	<0,651
	tirpiklis		6	2,23333333	0,20763215

Aptarimas

OB lokuso baltymo produkto endokrininę funkciją pirmasis pasiūlė Coleman, kuris parodė, kad ob/ob pelės kūno svoris sumažėja po parabiotinio sujungimo su normaliomis arba db pelėmis [Coleman et ai., 1978, supra]. Aukščiau parodyti rezultatai patvirtina šią hipotezę, nes jie rodo, kad OB baltymas cirkuliuoja kraujuje, o rekombinantinio baltymo injekcijos mažina kūno masę. Geno produkto, koduojamo OB geno, molekulinis svoris yra apie 16 kD, kuris atitinka 146 aminorūgščių seką, esančią karboksi-gale signalinės sekos atžvilgiu. Rekombinantinis OB baltymas nėra modifikuojamas, kai jis ekspresuojamas Pichia pastoris. Žinduolių genų ekspresijoje Pichia suformuojama teisinga baltymo struktūra [Cregg et ai., Bio/Technology, 11:905-914 (1993)]. Šie duomenys leidžia manyti, kad OB baltymas nėra glikozilintas ir nėra post-transliuojamas in vivo. Duomenys nepašalina galimybės, kad OB baltymas yra kovalentiškai susijungęs pats su savimi arba kitais plazmos arba adipozinio audinio baltymais. Nors baltymo proteolitinis skaldymas nėra negalimas, nebuvo rasta mažesnio molekulinio svorio OB baltymo formų, imant bet kokį naudotą antiserumą, įskaitant 4 antipeptidinius antikūnus.

OB baltymas turi dvi cisteino liekanas, ir žmonėse cirkuliuoja kaip monomeras, o pelės - kaip monomeras ir kaip dimeras. Tipiška sekretuotoms molekulėms vidinė disulfidine jungtis rasta tuo atveju, kai žmogaus baltymas yra ekspresuojamas Pichia pastoris, kas leidžia manyti, kad ji yra in vivo. Tai patvirtina rekombinantinio bakterinio baltymo, kuris turi vidinę disulfidinę jungtį, bioaktyvumas. Pelės OB baltymas plazmoje gali būti randamas kaip monomeras ir dimeras. Monomerai ir dimerai randami tuo atveju, kai pelės OB baltymas yra ekspresuojamas mielėse, kas rodo, kad pelės baltymo polinkis sudaryti dimerą yra dėl pirminės sekos skirtumų, lyginant su žmogaus seka. Visiškai aišku, kad monomeras pasižymi biologiniu aktyvumu, bet dimero funkcinis aktyvumas nėra žinomas.

112

OB baltymo poveikis į maisto suvartojimą ir kūno svorį ob pelių atveju yra labai didelis. Po 3-jų savaičių ob pelės, gavusios kasdienines rekombinantinio baltymo injekcijas, prarado 40% jų kūno svorio ir suvartojo 40% maisto, lyginant su kontrolinėmis pelėmis. Be to, paveiktų baltymu ob pelių svoris per eksperimento laiką dar nepasiekė pusiausvyrinės reikšmės. Porinio maitinimo eksperimento rezultatai rodo, kad svorio praradimas susijęs tiek su maisto suvartojimu, tiek ir su energijos sąnaudomis. Tokiu būdu, atskira ob pelių grupė, kurios kalorijų sunaudojimas buvo apribotas, lyginant su gavusiomis baltymo ob pelėmis, prarado daug mažiau svorio, nei gyvuliukai, gavę baltymo. ob/ob pelių maisto suvartojimo sumažėjimas iki kiekio, mažesnio, nei laukunio tipo pelių, gavusių OB baltymo, rodo, kad jos yra ypatingai jautrios šiems efektams. Iš tikrųjų šiuose gyvuliukuose gali būti padidinta OB receptoriaus reguliacija, ob pelių maisto sunaudojimas pasidaro beveik pastovus po 5 baltymo leidimo dienų. Jeigu šis faktas susijęs su tuo, kad susidarė pusiausvyriniai kiekiai baltymo, galima manyti, kad baltymas turi palyginus didelį išsilaikymo puslaikį [The Pharmacological Basis of Therapeutics, pp. 19-45, Goodman and Gilman eds., Pergamon Press, New York, (1990)]. Ši išvada sutampa su parabiozės eksperimentų duomenimis [Coleman et ai., 1978, supra·, Weigle, Int. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].

Rekombinantinio baltymo poveikis į laukinio tipo pelių kūno svorį buvo nedidelis, bet statistiškai reikšmingas per pirmąsias dvi tyrimo savaites. PBS įtaka išsilaikė vėlesniuose laiko taškuose, bet statistinis duomenų reikšmingumas labai sumažėjo po trijų savaičių. Pradinis kūno svorio praradimas negali būti paaiškinamas maisto suvartojimo skirtumais. Matyt maisto suvartojimo matavimai nebuvo pakankamai tikslūs, kad jie galėti} parodyti sumažėjimą, kuris tesudaro 1 gramo kūno svorio skirtumą eksperimento metu. Šie duomenys skiriasi nuo ankstesnių eksperimentų rezultatų, kuriuose laukinio tipo graužikai buvo sujungti parabiotiniu ryšiu su db pelėmis, fa žiurkėmis, žiurkėmis su pagumburio pakenkimais ir žiurkėmis, nutukintomis panaudojant labai kaloringą maistą [Coleman et ai., 1978, supra; Harris et ai., 1987, supra; Harris et ai., “Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats”, in Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. Visais atvejais laukinio tipo gyvuliukai pasidarė anoreksiški ir prarado daug svorio. Kadangi db pelių ir fa žiurkių OB baltymo kiekiai yra

113 padidinti, ir pelių su pagumburio pažeidimais OB RNR kiekis yra padidintas, galima manyti, kad laukinio tipo pelės gali reaguoti j OB tik tada, kai jo kiekis plazmoje yra gana didelis. Čia aprašyti duomenys paremia galimybę, kad įvedamo baltymo kiekiai buvo žemesni už endogeninius kiekius, ir todėl pusiausvyrinis kūno svoris yra šiek tiek mažesnis. Cirkuliuojančių apdorotose pelėse OB baltymo kiekių nustatymas turėtų išspręsti šią problemą. Nors dar nėra prieinamas pelės baltymo imunotyrimas, imunonusodinimo tyrimai leidžia manyti, kad cirkuliuojančio OB baltymo kiekiai gavusiose baltymą laukinio tipo pelėse nėra labai padidinti.

Mažesnis baltymo poveikis į laukinio tipo peles ir atsako į jį nebuvimas db pelėse leidžia manyti, kad šis poveikis baltymu nėra susijęs su nespecifiniais arba nepalnkiais efektais. Visos db pelės poveikio baltymu laikotarpyje prarado šiek tiek svorio, nepriklausomai nuo to, ar jos gavo ar negavo baltymo, db gyvuliukai buvo pastebimai hiperglikemiški, ir svorio praradimas greičiausiai yra dėl diabeto, o ne dėl eksperimento metodikos. C57BL/Ks db/db pelėse dažnai atsiranda diabetas, ir šiame eksperimente naudoto amžiaus pelės pradeda prarasti šiek tiek svorio [Coleman et ai., 1978, supra]. Panašaus amžiaus C57B1/6J ob/ob pelėse neatsiranda pastebimos glikemijos. Manoma, kad tokie fenotipų skirtumai yra genetiniai skirtumai linijų, kurios turi mutacijas (C57B1/6J palyginus su C57B1/Ks) [Coleman et ai., 1978, supra].

Tai, kad nepavyko nustatyti sutrumpinto 105 aminorūgštis turinčio baltymo, kuris turėtų būti, išeinant iš OB geno kDNR sekos, leidžia manyti, kad mutantinis baltymas yra arba degraduojamas, arba netransliuojamas. Tačiau negalima atmesti galymybės, kad panaudoti antiserumai neparodo tokio sutrumpinto baltymo. Pastebėtas dešimties kartų ob baltymo kiekio padidėjimas db pelėse, lyginant su laukiniu tipu, leidžia manyti, kad produkuojama daug šio baltymo ir yra pasipriešinimas jo poveikiui. Šie duomenys koreliuojasi su mRNR tyrimais. Kaip jau buvo minėta, ankstesni eksperimentai prodė, kad mutacijos db pelės ir fa žiurkės genuose, kurios patenka į homologinės chromosomos sritis, duoda plazmos faktoriaus, kuris mažina kūno svorį, perprodukciją [Truett et ai., 1991, supra·, Coleman et ai., 1978, supra·, Hervey, 1959, supra]. Abiem atvejais buvo priimama, kad mutantiniai gyvuliukai yra rezistentiški OB baltymo efektams. Šią galimybę patvirtina duomenys, kad OB baltymas neveikia db pelių kūno svorio ir maisto sunaudojimo.

114

Žmonių nutukimas gali būti susijęs su dideliais kiekiais OB baltymo individo, kuris palyginus silpnai reaguoja į šį hormoną, plazmoje. Kita vertus, sumažinta OB ekspresija taip pat gali duoti nutukimą, kurio atveju gali būti rasti “normalūs” (t.y. neatitinkamai maži) šio baltymo kiekiai. Taigi, OB baltymo kiekiai žmogaus plazmoje gali būti skirtingų nutukimo formų rodiklis. Nedidelėje subjektų grupėje, kurių BMI<25, ELISA metodu nustatyti nedideli nanogramų eilės cirkuliuojančio OB baltymo kiekiai. Svarbu pažymėti, kad buvo pastebėtos įvairios koncentracijos, kas leidžia manyti, kad apsprendžiant kūno svorį gali turėti reikšmę ekspresijos lygis ir/arba jautrumas šiam baltymui.

OB baltymo veikimo vieta yra nežinoma. Baltymas veikia tiek maisto sunaudojimą, tiek ir energijos sąnaudas - rezultatai sutampantys su klinikiniais tyrimais, rodančiais, kad pokyčiai abejose sistemose veikia į kūno svorio reguliavimą [Leibel et ai., N. Engi. J. Med., 332:621-628 (1995); Keesey et ai., “Metabolic defense of the body weight set-point”, Association for Research in Nervous and Mental Disease, pp. 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York. (1984)]. Panašu, kad OB kūno svorio reguliavimo kelyje pagumburis yra toliau, nors taip pat yra galimi ir tiesioginiai efektai į įvairius organus.

PAVYZDYS: Padidinta OB RNR ekspresija pelių su pagumburio pakenkimais ir mutacijomis db lokuse adipocituose

Šio klonuoto pelės nutukimo geno (OB) produktas vaidina svarbų vaidmenį adipozinio audinio masės reguliavime. OB RNR specifiškai ekspresuojamas pelės adipocituose in vivo kiekvienoje iš keleto įvairių riebalinių ląstelių sankaupų, įskaitant ruduosius riebalus. Jis taip pat ekspresuojamas kultūrinėse 3T3-442A preadipocitų ląstelėse, kuriose buvo indukuota diferenciacija. Pelės su pagumburio pakenkimais bei pelės, turinčios mutaciją db lokuse, ekspresuoja dvidešimt kartų didesnį OB RNR kiekį adipoziniame audinyje. Šie duomenys rodo, kad ir db genas, ir pagumburis yra po OB geno adipozinio audinio masės reguliavimo kelyje, ir sutampa su ankstesniais eksperimentais, leidžiančiais manyti, kad db lokusas koduoja OB receptorių, db/db ir pakenkimus turinčiose pelėse. Kiekybiniai OB RNR ekspresijos lygių skirtumai koreliuojasi su adipocitų lipidų kiekiu. Panašu, kad, apsprendžiant kūno svorį, svarbų vaidmenį vaidina molekulės, kurios reguliuoja OB geno ekspresijos lygį adipocituose, o taip pat ir molekulės, kurios yra OB efektų jo veikimo vietoje tarpininkai.

115

Medžiagos ir metodai

Hibridizacija in situ.

Baltieji riebaliniai audiniai iš laukinio tipo (wt) ir db pelių tų pačių pilvo vietų tuo pačiu metu apdoroti pagal modifikuotą metodą, kurį aprašė Richardson et ai., Growth, Development & Aging, 56:149-157 (1992). Trumpai tariant, audiniai buvo fiksuoti Bouin tirpale 2 h 4°C temperatūroje. Po to audiniai dehidratuojami, panaudojant serijinį apdorojimą vis didėjančiomis etanolio koncentracijomis nuo 10% iki 100%, kiekvieną kartą po 5 min. 4°C temperatūroje. Po to audiniai inkubuoti su ksilenu (1 h) ir parafinu (2 h) 65°C temperatūroje. Imobilizuoti wt ir dbldb riebaliniai audiniai supjaustomi ir vėliau paruošiami tyrimams tomis pačiomis sąlygomis. Pjūviai kaitinami 65°C temperatūroje ir apdorojami ksilenu ir etanoliu nuo 100% iki 50% serijinio skiedimo tirpalais kambario temperatūroje; kiekvienas apdorojimas trunka 3 min. OB geno antiprasminis zondas sintezuotas, panaudojant linearizuotos OB geno koduojančios sekos, kuri yra aukštyn einančia kryptimi nuo Sp6 RNR polimerazės promotoriaus, transkripciją in vitro. Hibridizacija in situ atlikta tiksliai pagal Schaeren-Wiemers et ai., Histochemistry, 100:431440 (1993).

RNR pagaminimas ir ląstelių kultūra

Bendra RNR ir northerno blotai pagaminti taip, kaip buvo aprašyta. Strominės vaskuliarinės ląstelės ir adipocitai pagaminti pagal Rodbell, o RNR iš abiejų frakcijų pagaminta pagal Dani et ai, Mol, Cell. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell J. Biol Chem. 239:375-380 (19 ). Atlikus subklonavimą, 3T3-F442 ląstelės auginamos Duelbecco modifikuotoje Eagle terpėje, turinčioje 10% fetalinio jaučio serumo (vadinamo standartine terpe) [Dani et ai., “Molecular biology techniųues in the study of adipocyte differentiation”, in Obesity in Europe vol 88, pp. 371-376, Bjorntorp and Rossner Eds., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. Kai įvyksta susiliejimas, ląstelės apdorojamos standartinėje terpėje, turinčioje 2 nM trijodtrionino (T3) ir 17 nM insulino. Po dvylikos dienų gaunama RNR, taip kaip aprašyta aukščiau.

Apdorojimas aukso tiogliukoze (GTG)

116

Dviejų mėnesių amžiaus CBA/J pelių patelės paveikiamos viena aurotiogliukozės (Sigma catalog No. A0632) 0,2 mg/g normaliame fiziologiniame tirpale doze, suleidžiama į pilvą. Kontroliniams gyvuliukams suleistas normalus fiziologinis tirpalas. Pelės pasveriamos, praėjus 1 mėnesiui po apdorojimo. Išskiriama adipozinio audinio RNR iš tų apdoroti) gyvuliukų, kurių svoris padidėjo daugiau kaip 20 g po apdorojimo GTG.

Rezultatai

Neseniai buvo rasta, kad adipoziniame audinyje ekspresuojamas OB genas [Zhang et al, Nature, 372:425-432 (1994)]. Kadangi adipozinis audinys yra sudarytas iš daugelio ląstelių tipų, įskaitant adipocitus, preadipocitus, fibroblastus ir vaskuliarinės ląsteles, in situ hibridizacija atlikta su normalių gyvuliukų antisėklidinių minkštųjų audinių pjūviais su prasminiais ir antiprasminiais OB ribozondais [Richardson et al., 1992, supra·, Wasserman, “The concept of the fat organ” in Rodahl, Issekutz, fat as a tissue”, pp. 22-92, McGraw Hill, New York (1964)]. Naudojant antiprasminį zondą, visuose pjūviuose adipocituose matomi teigiami signalai (fig. 30, pažymėta wt). Signalų nepastebėta, kai antiprasminis zondas hibridizuotas su smegenų pjūviais (duomenys neparodyti). Antiprasminio zondo hibridizacija su C57B1/Ks dbldb pelių adipozinio audinio pjūviais buvo labai padidinta, kas patvirtina būdingą adipocitams OB RNR ekspresiją ir parodo didelį OB RNR kiekio viename adipocite padidėjimą šiuose gyvuliukuose (fig. 30, pažymėta dbldb). Pelės, turinčios mutaciją db lokuse, yra labai nutukę; tai yra dalis sindromo, kuris yra fenotipiškai būdingas ir C57B1/6J oblob pelėms (Bahary et al., 1990, supra).

Adipozinio audinio stromos ląstelės, atskirtos nuo adipocitų, nesintezavo OB RNR. Kaip ir buvo galima laukti, ląstelės adipocitų frakcijoje ekspresavo OB RNR, naudojant northerno blotus (fig. 31). Tas pats rezultatas gautas ir naudojant RT-PCR (duomenys neparodyti). Šie duomenys paremia išvadą, kad tik adipocitai ekspresuoja OB geną. Kultūrinių adipocitų duomenys patvirtina šią išvadą. Šiuose tyrimuose 3T3-F442A ląstelės buvo kultyvuotos, naudojant sąlygas, kurios duoda lipidų akumuliaciją, kaip dalis ląstelinės programos, vedančios prie diferenciacijos į adipocitus. OB RNR neekspresuojama eksponentiškai augančiose ląstelėse, neekspresuojama ir susiliejusiose 3T3 F442A preadipocitų ląstelėse, kurios ekspresuoja ankstyvuosius markerius, tuo tarpu šių ląstelių diferenciacija į adipocitus duoda pastebimų OB RNR kiekių ekspresiją (fig. 31) [Daili et

117 ai., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989)]. OB RNR kiekis yra ypatingai jautrus kultivavimo sąlygoms, kadangi signalų nebuvo vėlesnėse, nepaveiktose insulinu sulietose ląstelėse.

Hibridizacijos tyrimai parodė, kad OB RNR ekspresuojama in vivo keliose skirtingose riebalų sankaupose, įskaitant antsėklidžio, priegimdžio, pilvo, esančius aplink inkstą ir kirkšnies riebalinius audinius (fig. 32A). Tikslus ekspresijos lygis kiekvienoje sankaupoje šiek tiek skyrėsi; kirkšnies ir priegimdžio riebalai ekspresavo mažesnius OB RNR kiekius. OB RNR ekspresuoja ir rudasis adipozinis audinys, nors ekspresijos lygis yra apie 50 kartų mažesnis ruduosiuose riebaluose, lyginant su kitų adipozinių audinių sankaupomis. Šie kiekybiniai skirtumai šiek tiek koreliuojasi su anksčiau aprašytais ląstelių dydžio įvairiose riebalinių ląstelių sankaupose skirtumais [Johnson et ai., J. Lipid Res., 13:2-11 (1972)]. OB RNR kiekio ruduosiuose riebaluose neveikia poveikis šalčiu (fig. 32B). Šiame eksperimente nesujungto baltymo (UCP) RNR kiekis padidėjo ruduosiuose riebaluose, paveikus šalčiu, tuo tarpu kai ob RNR kiekis nepakito [Jacobsson et ai., J. Biol. Chem., 260:16250-16254 (1985)]. Bendrai imant, šie duomenys patvirtina, kad visi adipocitai gali produkuoti OB RNR, ir rodo kintamą ekspresijos lygį įvairiose riebalinėse sankaupose. Šie duomenys patvirtina tikimybę, kad koduojamo baltymo kiekis koreliuoja su visa adipozinio audinio mase.

Buvo išmatuoti OB RNR kiekiai db/db pelėse ir pelėse su pgumburio pakenkimais. Ventramedialinio pagumburio (VMH) pakenkimai duoda nutukimą, kaip sindromo dalį, panašų į ob/ob ir db/db pelių nutukimą [Bray et ai., Metabolism, 24:99-117 (1975)]. Parabiosės eksperimentai duoda pagrindą manyti, kad pakenkimai duoda kraujuje atsiradusio faktoriaus padidintą ekspresiją, kuris mažina maisto suvartojimą ir kūno svorį [Hervey, 1959, supra]. Panašūs rezultatai pastebėti ir tuo atveju, kai pelės, turinčios mutaciją db lokuse, sujungiamos su normaliomis pelėmis, kas leidžia manyti, kad OB receptorius gali būti koduojamas db lokuse [Coleman et ai., 1978, supra], Taigi, nutukimas dėl VMH pakenkimų ir db mutacijos gali būti atsparumo OB baltymo poveikiui rezultatas. Jei taip yra iš tikrųjų, reiktų laukti OB RNR kiekių adipoziniame audinyje antrinio padidėjimo.

Pagumburio pakenkimai buvo sukelti CBA pelių patelėms, panaudojant cheminę aukso tiogliukozę (GTG) [Debons et ai., Fed. Proc., 36:143-147 (1977)]. Toks apdorojimas lis duoda specifinius pagumburio pakenkimus, pagrindinai ventramedialinio pagumburio (VMH), ir po to po keleto savaičių atsiranda nutukimas. Paparastai viena intraperitoninė 0,2 mg/g kūno svorio GTG injekcija per keturias savaites sukelia nutukimą. Mėnesio amžiaus CBA/J pelių patelių (20-25 g), apdorotų GTG ir apdorotų ir kontrolinių gyvuliukų tolimesnis svorio augimas parodytas 2 lenetlėje. Buvo pagaminta dbjdb pelių ir GTG apdorotų gyvuliukų, kurie priaugo >20 g, adipozinio audinio RNR. Northerno blotingas parodė, kad OB RNR kiekis dviejų mėnesių amžiaus db/db ir GTG apdorotose pelėse, lyginant su normaliais gyvuliukais, padidėjo dvidešimt kartų (fig. 33).

lentelė Aukso tiogliukoze apdorotų pelių svorio priaugimas

Kontrolė (n=41) GTG (n=93) <10 g 41,(100%) 4,(4%)

10g-20g 0,(0%) 15,(16%) >20 g 0,(0%) 74,(80%)

Dviejų mėnesių amžiaus CBA/J pelių patelės buvo paveiktos aukso tiogliukoze (GTG). Aukso tiogliukoze (Sigma A0632). suleista intraperitoniniu būdu normaliame fiziologiniame tirpale, imant 2,0 mg/g dozę. Kontrolinių ir gavusių injekciją gyvuliukų svoris nustatytas prieš injekciją ir praėjus mėnesiui po injekcijos. Gyvuliukai apgyvendinti po 5 viename narve ir šeriami ad libitam. Priaugtas svoris, praėjus mėnesiui po injekcijos, parodytas 2 lentelėje. Gyvuliukai, kurie per šį mėnesį priaugo daugiau nei 20 g, atrinkti tolimesniems tyrimams.

Aptarimas

Pelės OB geno produktas cirkuliuoja pelės ir žmogaus plazmoje, kur jis gali reguliuojančiai veikti adipozinio audinio masę. Tolimesni ekspresijos reguliacijos ir OB poveikio mechanizmų tyrimai turės labai svarbią reikšmę fiziologinio kelio, kuriuo vyksta kūno svorio reguliavimas, supratimui.

Šis pavyzdys rodo, kad OB geno produktą ekspresuoja tik adipocitai visose adipozinio audinio sankaupose. Šis rezultatas paremia galimybę, kad OB geno baltymo

119 produktas koreliuojasi su kūno lipidų gausumu. Be to, OB RNR reguliacija yra padidinta dvidešimt kartų db pelėse ir pelėse su pagumburio pakenkimais. Šiuose gyvuliukuose tikrasis OB RNR kiekio/ ląstelei padidėjimas, matyt, yra dar didesnis nei dvidešimt kartų, kadangi šiuose gyvuliukuose adipocitinės ląstelės dydis yra padidintas apytikriai penkis kartus (žr. fig. 30) [Debons et ai., 1977, supra]. Šie duomenys rodo, kad db geno ir pagumburio padėtys yra žemyn einančia kryptimi nuo OB kelyje, kuris kontroliuoja kūno svorį, ir sutampa su hipoteze, kad OB receptorius yra užkoduotas db lokuse [Coleman et ai., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. OB receptoriaus ir/arba db geno molekulinis klonavimas turėtų išspręsti šią problemą. OB RNR kiekio db/db ir GTG apdorotose pelėse padidėjimas taip pat leidžia manyti, kad OB geno produktas riebalinėse ląstelėse funkcionuoja neautonomiškai. [Ashwell et ai., Proc. R. Soc. Lond., 195:343-353 (1977); Ashwell et ai., Diabetologia, 15:465-470]. Tokiu būdu, jei užkoduotas baltymas tiesiogiai veiktų riebalines ląsteles, inhibuodamas augimą arba diferenciaciją, laukinio tipo OB geno GTG apdorotose pelėse padidinta ekspresija duotų liesą fenotipą.

Trumpiausias šių duomenų paaiškinimas yra toks, kad OB baltymas funkcionuoja kaip endokrininė signalinė molekulė, kurią išskiria adipocitai, ir veikia pagumburį arba tiesiogiai, arba netiesiogiai. Tiesioginis poveikis į pagumburį reikalautų, kad egzistuojantis mechanizmas leistų OB geno produktui pereiti hematoencefalinį barjerą. Mechanizmai, apimantys apsupamą ventrikulinį organą ir/arba specifinius transporterius turėti} leisti pasiekti smegenis tokio dydžio molekulei, kurią koduoja OB genas [Johnson et ai., FASEB J., 7:678-686 (1983); Baura et ai., J. Clin. Invest., 92:1824-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7:314-330 (1968)]. Tačiau šią hipotezę reika priimti atsargiai, kol nėra nustatyti būdai, kaip šis baltymas galėti} pereiti hematoencefalinį barjerą. Be to, reikia įvertinti galimus efektus ir į kitus tikslinius organus.

Riebalinių ląstelių signalas(ai), kuris yra atsakingas už OB geno ekspresijos lygio kiekybines variacijas, dar nežinomas, bet koreliuojasi su adipocito ląstelės dydžio skirtumais, db/db pelių adipocitai yra 5 kartus didesni už normalių pelių adipocitus, ir ląstelės dydis yra apie 1,0 Mg lipido/ląstelei [Johnson et ai., 1972, supra]. Ankstesni duomenys parodė, kad kiekviena riebalinė ląstelė ekspresuoja nedidelį OB RNR kiekį, kuris toliau didėja proporcingai ląstelės dydžiui. Taip pat gali būti, kad ląstelės dydis nėra reikšmingas parametras, bet tiesiog koreliuojasi su intraląsteliniu signalu, kuris didina OB

120 geno ekspresiją db/db ir pelėse su pakenktu VMH adipocituose. Bet kuriuo atveju atrodo, kad signalo perdavimo kelio, reguliuojančio OB RNR sintezę, komponentai yra svarbūs, apsprendžiant kūno svorį. Genetiniai ir aplinkos poveikiai, kurie mažina OB ekspresijos lygį, turėtų veikti didindami kūno svorį, taip pat kaip ir poveikiai, kurie mažina jautrumą užkoduotam baltymui. Specifinės molekulės, kurios reguliuoja OB geno ekspresiją, iki šiol dar nežinomos, ir dar reikia nustatyti geno kontrolės, kuri sukelia OB RNR kiekių variacijas, lygius, ir ištirti OB geno reguliuojančius elementus. Molekulių, kurios reguliuoja OB geno ekspresiją adipocituose, nustatymas, o taip pat molekulių, kurios perneša koduojamo baltymo efektus į jo veikimo vietą(as), nustatymas labai padidins mūsų žinias apie fiziologinį kūno svorio reguliavimo mechanizmą.

PAVYZDYS: RNR ekspresijos vaizdas ir vietos fizikiniame, citogeniniame ir genetiniame žemėlapiuose nustatymas

Dideli kiekiai OB RNR yra ekspresuojami žmogaus adipoziniame audinyje ir daug mažesni - placentoje ir širdyje. Žmogaus OB genas patenka prie didžiosios dirbtinės mielių chromosomos (YAC) sankaupos, išvestos iš chromosomos 7q31.3. Apart geno santykinės padėties patvirtinimo, paremto pelės ir žmogaus palyginamųjų žemėlapių nustatymu, šiame darbe identifikuoti 8 nustatyti mikrosatelitiniai markeriai labai arti žmogaus OB geno. Kadangi pelės OB mutacijos gali duoti sindromą, kuris yra labai panašus į žmonių patologinį nutukimą, šie genetiniai markeriai yra svarbūs įrankiai, tiriant galimą OB geno vaidmenį paveldėto žmonių nutukimo formose.

Medžiagos ir metodai

Northerno blotingas.

Bendra RNR buvo gauta iš adipozinio audinio, panaudojant Chirgwin et ai., Biochem., 18:5294-5299 (1979) metodą. Northerno blotingas, radiožymių įvedimas ir hibridizacijos atliktos taip, kaip aprašyta Zhang et ai., 1994, supra. PoliA⁺ RNR northerno blotai (žmogaus MTN, žmogaus MTN II ir žmogaus fetalinė MTN II) gautos iš CLONETECH (Palo Alto, CA), o taip pat ir PCR pradmenys, panaudoti radiožymėto žmogaus aktino zondo gavimui.

121

STS išaiškinimas.

Buvo ištobulinti ir optimizuoti sekų žmogaus vietoms specifiški (STS) PCR bandymai pagrindinai taip, kaip aprašė [Green et ai., PCR Methods Applic., 1991; Green et ai., Genomics, 11:548-564 (1991); Green “Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites”, in Methods in Molecular Genetics Vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A), pp. 192-210, Adolph ed., Academis Press, Ine., San Diego (1993); Green et ai, Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)]. Kiekviena STS pavadinta, panaudojant priešdėlį ‘sWSS’, o po to eina būdingas skaičius. Devyniolikos čia aprašytų STS detalės duotos 3 lentelėje kartu su papildoma informacija (pvz., PCR reakcijos sąlygos, pilna DNR seka) randama Genbank ir/arba Genome Data Base (GDB). Mikrosatelitams specifinių STS atveju PCR bandymuose naudoti oligonukleotidiniai pradmenys (3 lentelė), atitinka arba pradmenis, naudotus genotipo analizėje (4 lentelė), arba pradmenis, sukonstruotus (dažniausiai panaudojant kompiuterinę programą OSP) [Hillier et ai., PCR Methods Applic., 1: 124-128 (1991)], naudojant DNR seką, randamą Genbank’e. 3 lentelė iliustruoja STS YAC sankaupoje, turinčioje žmogaus OB geną.

122

C\ LA LM Ui

O so 00

LA LA LA LA Ui W

LA LA tsJ

LA

O

-U

-P+

-J

-PLA

-PpLP

LP

N) O Ό

STS pavadinimas Kitas pavadinimas Lokusas Rūšis PCR pradmenys (bp) SEQ ID NO:

C	C	C
o	o	o
o	o	o
K	0j	i-
LA	o	LA
LA	-J	LA
N)	ii	N)
	O	LP
1—k	o	00

C	O	c	O
O	o	o	o
o	o	o	o
	ua	0j	K
LP	-P-	o	LA
-P*	-P.		LA
00	o	ii	N)
LP	-p.	LP
O		LP

C	O	O	C
o	o	o	o
o	o	o	o
K	.L	LP	-k
LA	LA	LP	LA
LA	LA	-U	LA
tsJ	N>	-U	N>
U	σ\	O	LP
-J	M	-P*	LA

C □

1—4

O z

o

123

cn	©\	un	CN	©\	Ό	1-H	©
un	un		un		un	un	un
CN	CN	00	\o		CN	CN	CN
un	un	r—	r*	4	un	4	un
un	un	©	©	cn	un	cn	un
^1“	^j·	cn	cn	cn	tĮ-	cn	rr
©	©	©	o	©	©	©	©
©	©	©	©	©	©	©	©
O	O	O	O	O	O	O	O

Dydis

STS pavadinimas Kitas pavadinimas Lokusas Rūšis PCR pradmenys (bp) SLQ ID

O zl

CN s© C cn un

UO s© S© V© r- oo

S© o ©>

<5 o (N r- r— Γόη r* rUn \O r- run ro \o \c ©

(N n

co

O <

>

H	U	<	O u	< l·
c	<	c	o <	H 0
H	U	H	o <	H O
O	<	l·	< 5	O G
H	o	<	U <	O H

cs c

SJ u

Λ

C

JO

Ξ

Λ

Ό

X ε

J

SJ

Ui ε

SJ c

o

C r* oc

CN

OO rO un n

S©

	cn		Ό	un
			un	Γ-
un	© T~*	C3	o f—·	ΟΟ
C/0	oo	O	00	00
»—	r-			r-
Q	G		Q	Q

-± i

X

SJ

X s©

O (N

X x

o o

s

U<

©s o

£ un cn

S %

00	OC i“·	(N	00	©S	©s
00	©s		CN
un	«ta·* X 00 oo	cn	r-*	un	S©	rf
CN		T-H	T“H	CN	CZO CO
OO	c/3	OO	00	00
00	OO	OO	00	oo
£		£	£	£	£	£ V)
«Λ		V)	CZ5	V,	V5

rs© cn

CN oo

124

Išvardinta 19 chromosomai 7-specifinių STS, išdėstytų YAC sankaupoje, turinčioje žmogaus OB geną (fig. 35). Kiekvienu atveju nurodytas sukurtas “sWSS” pavadinimas, atitinkamas kitas pavadinimas, GDB priskirto lokuso pavadinimas, STS šaltinis, PCR pradmenų sekos, STS dydis ir GDB identifikacijos numeris. STS šaltiniai buvo tokie: “YAC” galas (išskirtas YAC intarpo galas) [Green, 1993, supra], “Lambda clone” (bet koks chromosomai 7-specifinis lambda klonas) [Green et ai., 1991, supra·, Green, 1993, supra], “Genetic marker” (mikrosatelitinis markeris, žr. 2 lentelę) [Green et ai., 1994, supra], “YAC insert” (bet koks segmentas iš YAC intarpo) ir “Gene” (genui specifinė STS). Atkreipkite dėmesį, kad kai kuriems genetiniams markeriams specifiniai STS PCR pradmenys, panaudoti YAC identifikavimui (duoti šioje lentelėje), skiriasi nuo pradmenų, panaudotų genotipo analizėje (4 lentelė), kadangi genetinį markerį turinčios YAC nustatymui nereikalinga paties polimorfinio trakto amplifikacija. Visuose nurodytuose PCR bandymuose naudota 55°C renatūracijos temperatūra, išskyrus sWSS494, sWSS883, sWSS1529 ir sWSS2619 (kuriems naudota 50°C temperatūra), sWSS999 ir sWSS1174 (kuriems naudota 60°C temperatūra) ir sWSS808 (kuriam naudota 65°C temperatūra). Papildomas detales apie STS specifinius PCR bandymus galima gauti GDB.

125 ra

Ω

O

Ό	CO	co	co	+t·	o	o	o
	UO	Ό	oc	o	+fr	00	U0
+t	04	04	04		04	04	04
04	o~	o-	ό	00	- cA	00	o«
	CO	co	o	00		00	CO
CO	+t	T}·	04			’T	+t
0	0	ώ	O	ό	o	o	O
O	O	o	o	o	o	o	o
<3	C	o	O	C	C	c	C

O

Z

Ω o

tn oo

Mikrosatelitiniai markeriai YAC sankaupoje, turinčioje žmogaus ob gena.

r* oo r- ro o r* oo ·—· 04 00 00 co.

00 uo ό 00 00 r- oo 00 00 o o 00 o c^r o

ε •o «i

ς/5	00	co		U0
o	r-	Γ-	o	Tf	uo	ΈΓ	θ'
į	+t	00	ΟΟ	00	1—M	co	o	00
	r-m		i—H	Ό	U0		uo
•X	00			00	<70	00	<Z4	00
9	θ'	θ'	θ'		r-	θ'	r-	r-
	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω

5Λ

Λ

Q.

t-

o.

co

N

U0

Ό

O uo n

o o

S

X σ\ o

CJ b

uo +t co

Λ

126

Išvardinti 8 mikrosatelitiniai markeriai, kurių vietos nustatytos YAC sankaupoje, turinčioje žmogaus OB geną (fig. 35). Kiekvienu atveju nurodytas markerio pavadinimas (3 lentelėje duotas kaip kitas pavadinimas), mikrosatelitinio motyvo tipas (tetranukleotidas “tetra” pasikartojimas arba (CN)„ pasikartojimas, GDB - priskirto lokuso pavadinimas, pradmenų sekos, naudojamos PCR paremtoje genotipo analizėje ir GDB identifikacijos numeris. Papildomas detales apie PCR analizę ir polimorfizmą galima gauti GDB.

Žmogaus OB specifinė STS (sWSS2619) buvo sukonstruota, naudojant DNR seką, gautą iš kDNR 3’ netransliuotos srities. Žmogaus Azr4-specifinė STS (sWSS808) buvo gauta, naudojant tokią strategiją: oligonukleotidiniai pradmenys, būdingi pelės Pax4 genui (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO:63) ir (GGGAGCCTTGTCCT GGGTACAAAG) (SEQ ID NO:93) [Walther et ai., 1991, Genomics 11:424-434 (1991)], panaudoti 204 bp fragmento iš žmogaus genominės DNR (kuri buvo to paties dydžio produktas, kaip ir gautos iš pelės genominės DNR) amplifikacijai. Šis PCR bandymas netiko atitinkamų YAC identifikavimui, nes mielių DNR taip pat amplifikuoja panašaus dydžio produktą (200 bp). Tačiau PCR produkto, generuoto iš žmogaus DNR, sekos analizė parodė, kad 20-je vietų iš 156 bazių yra pakitimai (duomenys neparodyti). Naudojant šią žmogui būdingą seką, sukurtas naujas pradmuo (TTGCCAGGCAAAGAG GGCTGGAC) (SEQ ID NO:64) ir panaudotas su pirmuoju iš aukščiau minėtų pelės Pax4-specifiniu pradmeniu (žr. 3 lentelėje). Šiame žmogaus Pax4-specifiniame PCR bandyme nebuvo žymios produkto iš mielių DNR amplifikacijos, ir todėl šis bandymas panaudotas atitinkamų YAC identifikavimui.

YAC identifikavimas, panaudojant PCR paremtą skryningą Dauguma fig 35 pavaizduoti} YAC buvo išvesta iš klonų labai praturtinti} žmogaus chromosomos 7 DNR (“chromosomos 7 YAC šaltinis”) rinkinio [Green et ai., 1995, supra], naudojant PCR paremto skryningo strategiją [Green et ai., 1995, supra·, Green et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217 )1990)]. Kai kuriais atvejais klonai buvo išskirti, panaudojant prieinamos bendros žmogaus genominės YAC bibliotekos, kurią sukūrė CEPH [Dausset et ai, Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4256-4260 (1990)] arba ICI [Anand et ai., Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et ai, Nucl. Acids Res., 18:1951-1956 (1990)], PCR paremtą skryningą [Green et ai,

127

1990, supra]. Kiekviena YAC pavadinta, naudojant priešdėlį “yWSS”, po kurio duodamas būdingas skaičius.

Rezultatai ir aptarimas

Žmogaus OB geno ekspresijos audiniuose tyrimas, panaudojant northerno blotingą, parodė, kad didelis kiekis OB RNR yra ekspresuojamas žmogaus adipoziniame audinyje ir daug mažesni kiekiai - placentoje ir širdyje (fig. 34). RNR dydis (apie 4,5 kb) yra vienodas žmonių ir pelių atveju, o taip pat jis vienodas ir visuose ekspresuojančiuose audiniuose. Pagal šių tyrimų duomenis, penkis kartus didesni signalai matomi 10-je gg bendros adipozinio audinio RNR, kaip 2-se μ-g poli A⁺ placentinės RNR. Penkis kartus mažesnis signalas matomas širdies poli A⁺ RNR, lyginant su placentos. Nustatyta, kad OB RNR kiekis placentoje yra apie 250 kartų mažesnis nei adipoziniame audinyje. Šiame eksperimente nerasta OB RNR nė viename iš kiti} analizuotų audinių, įskaitant smegenis, plaučius, kepenis, skeletinius raumenis, inkstus ir kasą. Papildomi eksperimentai neparodė OB RNR buvimo blužnyje, užkrūčio liaukoje, prostatoje, sėklidėse, gimdoje, plonosiose žarnose, storojoje žarnoje, periferinio kraujo limfocituose arba fetalinėse smegenyse, kepenyse arba inkstuose (duomenys neparodyti). Gali būti, kad pastaruosiuose audiniuose OB ekspresuojamas nenustatomais kiekiais (pagal northerno blotingą) arba ekspresuojamas kituose netyrinėtuose audiniuose. Stebėtas ekspresijos žmoguje vaizdas šiek tiek skiriasi nuo pelės, kurios atveju OB RNR nustatyta beveik išimtinai tik adipoziniame audinyje.

Palyginamasis OB geno srities vietos nustatymas pelės ir žmogaus genomuose

Pelės OB genas yra 6 chromosomoje - srityje, kuri yra homologinė žmogaus 7q chromosomos daliai. Šiame segmente esantys genai yra (nuo artimiausio iki tolimiausio): Met protoonkogenas, cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorius (C/r), porinis boxturintis genas 4 (Pax4), OB ir karboksipeptidazė A (Cpa) [Zhang et ai., 1994, supra·, Friedman et ai., 1991, supra]. Pelės atveju genetinio žemėlapio nustatymas, panaudotas parodymui, kad PaxĄ yra tvirtai prijungtas prie ob [Walther et ai., 1991, supra·, Zhang et ai., 1994, supra]. Rasta, kad fizikinis atstumas tarp OB ir Pax4 yra apie viena megabazių pora (Mb) [Zhang et ai., 1994, supra]. Remiantis šiais palyginamaisiais žemėlapių tyrimais, buvo laukiama, kad žmogaus OB genas turėtų būti tarp Pax4 ir CPA 7q chromosomoje. Be to, kadangi žmogaus

128

CFTR [Heng et ai., Cell. Genei, 62:108-109 (1993)] ir Λ»4 [Tamura et ai, Cytogenet. Cell Genei., 66:132-134 (1994)] vietos buvo nustatytos, panaudojant fluorescentinę in situ hibridizaciją (FISH) su atitinkamai 7q31.3 ir 7q32, labiausiai patikima žmogaus OB geno padėtis turėti} būti arti 7q31.3-q32 ribos.

OB geno padėties nustatymas žmogaus 7 chromosomoje.

YAC klonų kolekcijos, kuri labai praturtinta žmogaus 7 chromosomos DNR, skryningui panaudota STS (sWSS2619), amplifikuojanti mažą žmogaus OB geno 3’ netransliuotos srities segmentą [Green et ai., 1995a, Genomics 25:170-183] ir nustatyti 9 YAC (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 ir yWSS5004). Norint patikrinti, ar šios YAC turi autenišką žmogaus OB geną, atlikti dar du eksperimentai. Pirmiausia, kiekviena YAC patikrinta antruoju žmogaus OB-specifiniu PCR bandymu, ir rasta, kad visi bandymai yra teigiami (duomenys neparodyti). Antra, kiekvieno klono mielių DNR skaldyta EcoRI ir analizuota gelio pernešimo hibridizacijos būdu, naudojant žmogaus OB kDNR išvestą zondą. Visais atvejais matoma tik viena hibridizacijos juostelė, ir ši juostelė yra to paties dydžio ir YAC, ir PI klone, kuris, kaip yra žinoma, turi žmogaus OB geną (duomenys neparodyti).

Naudojant kompiuterinę programą SEGMAP [Green and Green, 1991, supra] ir kitus YAC paremtus STS sumarinius duomenis, kuriuos mes gavome 7 chromosomos atveju [Green et ai., 1991, supra·, Green et ai., 1994, supra·, Green et ai., 1995, supra], buvo rasta, kad žmogaus OB genas yra YAC sankaupoje, pavaizduotoje fig 35. Tiksliau sakant, ši sankaupa susideda iš 43 persiklojančių YAC ir 19 vienodai išdėstytų STS. Smulkesnė informacija apie kiekvieną iš 19 STS duota 3 lentelėje. Apart OB-specifinių STS, sankaupoje taip pat yra STS (sWSS808), būdinga žmogaus Pax4 genui [Tamura et ai., 1994, supra·, Stapleton et ai., 1993, Nature Genet. 3:292-298]. 7 STS, išvestos iš 7 chromosomai būdingų YAC, 2 STS, išvestos iš 7 chromosomai būdingų lambda klonų ir, kas ypač svarbu, 8 mikrosatelitams būdingų STS. Papildoma informacija apie šiuos 8 genetinius markerius, įskaitant pradmenų, panaudotų genotipo analizėje, sekas, duota 2 lentelėje. Atkreipkite dėmesį, kad sankaupoje yra perteklinis YAC-paremtas sujungimas (t.y. yra 2 arba daugiau YAC, jungiančių kiekvieną gretimą STS porą), kas labai paremia fig 35 parodytą santykinę STS eilę.

129

Kaip parodyta fig 35, numatyta žmogaus OB turinčio YAC sankaupos orientacija yra tokia, kad sWSS1734 yra labiausiai centromerinė STS (t.y. artimiausia CFTR), o sWSS2367 yra labiausiai telomerinė STS (t.y. artimiausia CPA). Ši orientacija daugiausiai paremta palyginamaisiais žemėlapio sudarymo duomenimis, kuriame Pax4 patalpinamas artimiausioje padėtyje, o OB tolimiausioje padėtyje sintetinio bloko, esančio žmogaus DNR, viduje [Zhang et ai., 1994, supra]. OB genas patenka prie sankaupos telomerinio galo, remiantis OB būdingos STS (sWSS2619) patalpinimu.

Kadangi fig. 35 parodyta sankaupa buvo išvesta SEGMAP būdu, neatsižvelgiant į YAC dydžius (taigi išdėstant STS vienodu atstumu vienas nuo kito), panaši duomenų analizė SEGMAP būdu, kurioje įskaitomi YAC dydžiai, parodė, kad srities, kurią apima sankaupa, visas dydis yra daugiau nei 2 Mb (duomenys neparodyti). Taigi, kadangi visos 8 mikrosatelitams būdingos STS (4 lentelė) yra genominiame intervale, kuris tęsiasi apie 2 Mb, trys artimiausios prie sankaupos telomerinio galo (sWSS1392, sWSS1148 ir sWSS2367) yra ypatingai arti prie paties OB geno (tikriausiai tik apie 500 kb intervalo ribose). Faktiškai visos 3 pastarosios STS yra mažiausiai viename žmogaus OB turinčiame YAC. Atkreipkite dėmesį, kad yra nustatyta, kad tarpas tarp žmogaus Pax4 (sWSS808) ir ob (sWSS2619) yra apie 400 kb, tuo tarpu kai pelės atveju manoma, kad ši sritis tęsiasi apie 1 Mb [Zhang et ai., 1994, supra]. Be to, 3 iš YAC sankaupoje (yWSS691, yWSS999 ir yWSS2935) taip pat buvo analizuoti FISH metodu, ir rasta, kad kiekvienas iš jų hibridizuojasi tik su 7q31.3. Viena iš šių YAC (yWSS691) turi OB būdingą STS, o kiti du klonai turi Pax4 būdingą STS. Pastarieji rezultatai, bendrai imant, sutampa su ankstesniu citogenetiniu žmogaus Pax4 priskyrimu 7q32 [Tamura et ai., 1994, supra]. Remiantis šiais duomenimis, žmogaus OB genas gali būti priskirtas7q31.3 citogenetiniam ruožui.

PAVYZDYS: Žmogaus OB polipeptidas yra biologiškai aktyvus pelėse

Grupėms po 10 ob/ob pelių į pilvą leidžiama 10 gg/g/per dieną rekombinantinio (bakterinio) žmogaus ir pelės OB polipeptido arba fiziologinio tirpalo. Po 4 dienų, grupė, gavusi fiziologinį tirpalą, priaugo 0,3 g. Grupė, gavusi pelės OB, prarado 3,2 g. Grupė, gavusi žmogaus OB, prarado 2 g (p<0,01 lyginant su fiziologinio tirpalo kontrole). Tirtas šių grupių

130 maisto suvartojimas. Maisto suvartojimo duomenys parodyti 5 lentelėje; kūno masės duomenys parodyti 6 lentelėje.

lentelė

Apdorotu ob/ob pelių maisto suvartojimas g/per diena (vertė±standartinis nukrypimas)

Apdorojimas	0 diena	1 diena	2 diena	3 diena	4 diena	5 diena	6 diena	7 diena Π
Fiziologinis tirpalas	13,4±2,6	12,8	12,8	13,1	14,0	12,3	12,4	8,3
Pelės OB	14,9	3,7	4,4	5,1	8,9	8,1	8,7	3,5
Žmogaus OB	14,3	10,3	8,7	7,0	8,9	5,3	3,8	13,0

lentelė

Apdorotu ob/ob pelių kūno svoris ir svorio pokytis (vertė±standartinis nukrypimas)

Apdorojimas	Kūno svoris (0 diena)	Kūno svoris (4 diena)	Procentinis pokytis (0-4 dienos)	Kūno svoris (6 diena)	Procentinis pokytis (0-6 dienos
Fiziologinis tirpalas	39,9 ± 1,8	40,7 ± 1,6	0,8 ± 0,5	41,1 ± 2,2	1,2 ± 1,1
pelės OB	39,5 ± 2,1	36,2 ± 2,0	-3,3 ± 1,2	36,3 ± 2,2	-3,1 ± 1,2
žmogaus OB	39,5 ± 2,0	37,6 ± 1,7	-2,0 ± 1,0	36,1 ± 1,3	-3,5 ± 1,3

Šie duomenys rodo, kad žmogaus OB yra biologiškai aktyvus pelėse.

PAVYZDYS: Didelės OB dozėsveikia laukinio tipo peles

Laukinio tipo pelėms (C57B16J +/?) daromos 10 Mg/g/per dieną rekombinantinio pelės OB i.p. injekcijos, ir kas keturios dienos matuojama kūno masė. Rezultatai parodyti 7 lentelėje.

lentelė

Normaliu pelių, gaunančiu OB, kūno masė fg)

Poveikis	0 diena	4 diena	8 diena	12 diena	16 diena 1
Fiziologinis tirpalas	22,6 ±1,4	22,2 ±1,2	22,5 ±1,3	23	22,5
Pelės OB	22,4±1,5	20,6 ±1,5	20,8 ±1,3	20,8	21,8

Šie duomenys rodo, kad OB veikia laukinio tipo pelių svorį taip pat kaip ir nutukusių (ob/ob) pelių, tik daug mažesniu laipsniu.

131

PAVYZDYS: OB polipeptidas vartojamas nepertraukiamos siurblio infuzijos būdu

Šis pavyzdys rodo, kad nepertraukiama OB polipeptido infuzija sukelia normalių pelių svorio sumažėjimą. Normalioms (nenutukusioms) pelėms duodamas pelės ob polipeptidas, panaudojant osmotinj siurblį. 0,5 mg baltymo/kg kūno svorio/per dieną dozė sukėlė 4,62% sumažėjimą (+/-1,34%) skaičiuojant nuo bazinės svorio linijos 6-tą infuzijos dieną.

Medžiagos ir metodai

Gyvuliukai

Šiame pavyzdyje naudotos laukinio tipo (+/+) C57B16 pelės. Pelės apgyvendinamos po vieną ir laikomos žmoniškomis sąlygomis. Pradiniu laiko momentu gyvuliukai buvo 8 savaičių amžiaus, o jų svoris buvo stabilizuotas. Kiekvienam atvejui imama po 10 pelių (tirpiklio palyginimas su baltymu).

Šėrimas ir svorio matavimas

Pelėms duodamas sumaltas graužikų maistas (PMI Feeds Ine.) miltelių tipo žindamuose indeliuose (Allentown Caging and Eąuipment), kurie leidžia tiksliau ir jautriau išmatuoti maisto suvartojimą, nei naudojant paprastą blokinį maistą. Svoris matuojamas tuo pačiu laiku kiekvieną dieną (2:00 po pietų) 6 dienas. Kūno svoris prieš infuziją priimamas kaip bazinės linijos svoris.

Pelės OB DNR klonavimas

Pelės OB DNR klonavimas E.coli ekspresijai atliktas taip. DNR seka, išvesta iš aprašyto peptido sekos [Zhang et ai., 1994, supra, pvz., 1 pavyzdys, supra] atvirkščiai transliuota, naudojant E.coli optimalius kodonus. Galinės kodavimo vietos buvo Xba\ iki BamHI. Prieš kodavimo sritį įvesta ribosominis surišimo stiprintuvas ir stipri ribosominė surišimo vieta. Dviguba DNR seka sintezuota naudojant standartines metodikas. Teisingi

132 klonai patvirtinti, parodant rekombinantinio baltymo ekspresiją ir OB DNR sekos teisingumą turimoje plazmidėje. Aminorūgščių seka (ir DNR seka) yra tokia:

Rekombinantinės pelės Met OB (dviejų grandinių) DNR ir aminorūgščių seka (SEQ. ID. NOS:94 ir 95):

T C T AGAT T T GAG TTT T AAC TTT T AGAAGGAGGAAT AAC AT AT GGT AC C GAT C C AG AAAG T 9- +---------+---------+---------+---------+---------+--------68

AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTC.CTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA M V P I Q K V

TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA 69- +---------+---------+---------+---------+---------+--------28

AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT QDDTKTLIKT IVTRINDISHCACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA

9- +---------+---------+---------+---------+---------+--------188

GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT

TQSVSAKQRVTGLDFIPGLH

CCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC

9- + -·--------+---------+---------+---------+---------+--------248

GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG

PILSLSKMDQTLAVYQQVLT

CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT

4 9- +---------+---------+---------+---------+---------+--------308

GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA

SLPSQNVLQIANDLENLRDL

GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGAAGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA

9- +---------+---------+---------+---------+---------+--------3 68

CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT

LHLLAFSKSCSLPQTSGLQK

ACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT

69- +---------+---------+---------+---------+---------+--------428

TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA

PESLDGVLEASLYSTEVVAL

GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG

9- +---------+---------+---------+---------+---------+--------488

CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC

SRLQGSLQDILQQLDVSPEC

TTAATGGATCC 489 -+--------AATTACCTAGG

Ekspresijos vektorius ir šeimininko kamienas

133

Baltymui gauti vartotas plazmidinis ekspresijos vektorius buvo pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC) depozito Nr. 69576. Aukščiau minėta DNR liguota į ekspresijos vektorių pCFM1656, kuris buvo linearizuotas Xbal ir BamHl, ir transformuota j E.coli šeimininko kamieną FM5. E.coli FM5 ląstelės išvestos Amgen Ine., Thousand Oaks, Ca iš E.coli K-12 kamieno [Bachmann et ai., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976)] ir turi integruotą lambda fago represorinį geną cls57 [Sussman et ai., C.R. Acad. Sci., 254:1517-1579 (1962)]. Vektoriaus gavimas, ląstelės transformacija ir kolonijos atranka atlikta standartiniais metodais, pvz., Sambrook et ai., 1989, supra. Šeimininko ląstelės augintos LB terpėje.

Baltymo arba tirpiklio vartojimo būdas

Šiuose eksperimentuose panaudotas rekombinantinis pelės OB polipeptidas, kurio koncentracijos buvo apie 0,9 mg/ml fosfatinio buferio ir NaCl tirpale, pH 7,4. Panaudota aminorūgščių seka (ir DNR seka) parodytos aukščiau. Baltymas arba tirpiklis (fosfatinio buferio ir NaCl tirpalas, pH 7,4) įvedami, panaudojant infuziją osmotiniu siurbliu. Alzet osmotiniai minisiurbliai (Alza, Palo Alto, CA, modelio Nr. 1007D) chirurginiu būdu įvedami į kiekvienos pelės subkutaninę kišenę po mente. Siurbliai sukalibruoti taip, kad būtų įvedama 0,5 ml baltymo tirpalo per valandą, susidarant 0,5 mg baltymo/kg kūno svorio/per dieną. Kontroliniams gyvuliukams fosfatinio buferio ir NaCl tirpalas (pH 7,4) įvedamas Alzet osmotiniu minisiurbliu.

Fermentacijos procesas. Baltymui gauti panaudota trijų fazių fermentacijos metodika, žinoma kaip “serijinio maitinimo” procesas. Terpių sudėtys duotos žemiau.

Serija. Azoto ir fosfato šaltinis sterilizuotas (keliant temperatūrą iki 122°C 35 minutes, 18-20 psi slėgyje) fermentacijos inde (Biolafitte, 12 litrų talpos). Atšaldžius, aseptinėmis sąlygomis įvedami anglies, magnio, vitaminų ir mikroelementų šaltiniai. 500 ml per naktį (16 h arba daugiau) išlaikytos aukščiau minėtos rekombinantinį pelės baltymą gaminančios bakterijų kultūros (išaugintos LB buljone) supilama į fermentatorių.

I maistas. Pasiekus optinį tankį ODeoo lygų 4,0-6,0, į kultūras pridedama I maisto. Augimo greičiui (μ) kontroliuoti ribotu greičiu dedama gliukozė. Augimo greičiui, kuris turi būti 0,15

134 generacijų/h, kontroliuoti naudojama programuojama automatinė sistema (vadinama Distributive Control System).

II maistas. Kai OD pasiekia 30, temperatūra lėtai keliama iki 42°C ir maistas pakeičiamas II maistu, kuris aprašytas žemiau. Tada fermentuojama toliau dar 10 h, kas 2 h surenkant mėginius. Po 10 valandų fermentatoriaus turinys atšaldomas žemiau 20°C ir centrifuguojama.

Terpių sudėtis:
Serija	10 g/l	Mielių akstrakto
	5,25 g/l	(NH₄)₂SO₄
	3,5 g/l	k₂hpo₄
	4,0 g/l	kh₂po₄
	5,0 g/l	Gliukozės
	1,0 g/l	MgSO₄.7H₂O
	2,0 ml/1	Vitamino tirpalo
	2,0 ml/1	Mikroelementų tirpalo
	1,0 ml/1	P2000 Antifoam
I maistas	50 g/l	Baktotriptono
	50 g/l	Mielių ekstrakto
	450 g/l	Gliukozės
	8,75 g/l	MgSO₄.7H₂O
	10 ml/1	Vitaminų tirpalo
	10 ml/1	Mikroelementų tirpalo
II maistas	200 g/l	Baktotriptono
	100 g/l	Mielių ekstrakto
	110 g/l	Gliukozės

Vitaminų tirpalas (Serija, I maistas): 0,5 g biotino, 0,4 g folinės rūgšties ir 4,2 g riboflavino ištirpinama 450 ml H₂O ir 3 ml 10 N NaOH ir supilama į 500 ml H2O. 14 g piridoksino-HCl ir 61 g niacino ištirpinama 150 ml H₂O ir 50 ml 10 N NaOH ir supilama j

135

250 ml Η₂Ο. 54 g pantoteninės rūgšties ištirpinama 200 ml H2O ir supilama į 250 ml. Visi trys tirpalai sumaišomi ir praskiedžiama iki 10 litrų tūrio.

Mikroelementų tirpalas (Serija, I maistas):

Geležies(III) chloridas (FeCl3*6H₂O): 27 g/1 Cinko chloridas (ZnCl₂*4H2O): 2 g/1 Kobalto chloridas (CoCl₂*6H₂O): 2 g/1 Natrio molibdatas (NaMoO₄*2H₂O): 2 g/1 Kalcio chloridas (CaCl₂*2H₂O): 1 g/1 Vario sulfatas (CuSO4«5H₂O): 1,9 g/1 Boro rūgštis (H3BO3): 0,5 g/1

Mangano chloridas (MnCl2*4H₂O): 1,6 g/1

Natrio citrato dihidratas: 73,5 g/1

Pelės OB polipeptido valymo būdas

Valymas atliekamas pagal tokias stadijas (jei kitaip nenurodyta, šios stadijos atliktos 4°C temperatūroje):

1. Ląstelių pasta. E.coli ląstelių pasta suspenduota 5 kartus didesniame 7 mM EDTA, pH 7,0, tūryje. EDTA tirpale esančios ląstelės toliau skaldytos, du kartus praleidžiant pro mikroskystintuvą. Suskaldytos ląstelės centrifuguojamos esant 4,2k aps/min 1 h Beckman JB6 centrifūgoje su J5-4.2 rotoriumi.

2. Inkliuzijos kūnelių plovimas #1. Aukščiau minėto centrifugavimo nuopilas pašalintas, o nuosėdos resuspenduotos 5 kartus didesniame 7 mM EDTA, pH 7,0, tirpalo tūryje ir homogenizuotos. Mišinys centrifuguojamas taip, kaip aprašyta 1 stadijoje.

3. Inkliuzijos kūnelių plovimas #2. Nuopilas nuo aukščiau minėto centrifugavimo pašalinamas, o nuosėdos resuspenduojamos 10 karti} didesniame 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT ir 1% deoksicholato tirpalo tūryje ir homogenizuojamos. Šis mišinys centrifuguojamas taip, kaip aprašyta 1 stadijoje.

4. Inkliuzijos kūnelių plovimas #3. Nuopilas po aukščiau minėto centrifugavimo pašalinamas, o nuosėdos resuspenduojamos 10 karti} didesniame distiliuoto vandens tūryje ir homogenizuojamos. Šis mišinys centrifuguojamas taip, kaip aprašyta 1 stedijoje.

136

5. Renatūravimas. Nuosėdos renatūruojamos 15 kartų didesniame 10 mM HEPES, pH 8,5, 1% natrio sarkozino (N-laurilsarkozino) tirpalo tūryje, kambario temperatūroje. Po 60 minučių j tirpalą pridedama vario sulfato iki 60 mM ir maišoma per naktį.

6. Sarkozino pašalinimas. Renatūruotas mišinys praskiedžiamas 5 tūriais 10 mM Tris buferio, pH 7,5, ir centrifuguojamas taip, kaip aprašyta 1 stadijoje. Nuopilas surenkamas ir maišomas maišikliu 1 valandą su 20-50 mešų Dowex 1-Χ4 dervos chlorido forma (0,006% bendro praskiesto renatūruoto mišinio tūrio). Šis mišinys supilamas į kolonėlę ir surenkamas išbėgęs skystis. HPLC metodu patikrinamas sarkozino pašalinimas.

7. Nusodinimas rūgštimi. Ankstesnės stadijos išbėgęs skystis surenkamas, parūgštinama iki pH 5,5 ir laikoma kambario temperatūroje 30 min. Šis mišinys centrifuguojamas taip, kaip aprašyta 1 stadijoje.

8. Katijonų mainų chromatografija. Ankstesnės stadijos nuopilas parūgštinamas iki pH 4,2 ir supilamas ant CM Sepharose Fast Flow. Naudojamas 20 kolonėlės tūrių druskos gradientas, esant 20 mM NaOAc, pH 4,2, 0-1,0 M NaCl.

9. HIC chromatografija. Į sumaišytos ankstesnės stadijos CM sefarozės pikų frakcijas (nustatyta pagal UV analizės duomenis) pridedama amonio sulfato iki 0,2 M. Panaudojamas 20 kolonėlės tūrių atvirkščias druskų gradientas, esant 5 mM NaOAc, pH 4,2, 0,4-0 M amonio sulfato. Ši medžiaga koncentruojama ir diafiltruojama į PBS.

Rezultatai

Žemiau duodami C57B16J pelių (8 savaičių amžiaus) procentiniai (%) svorio skirtumai, lyginant su bazine linija.:

lentelė

Svorio mažėjimas, esant nepertraukiamai infuzijai

Laikas (dienos)

Tirpiklis (PBS)

Rekombinantinis OB polipeptidas

1-2 dienos

3-4 dienos

5-6 dienos

3,24 ± 1,13 4,3 ± 0,97 4,64 ± 0,96

1,68 ±1,4 -2,12 ± 0,79 -4,62 ± 1,3

137

Kaip matyti iš lentelės, po 6 dienų nepertraukiamos infuzijos, gyvuliukų, gavusių OB polipeptidą, kūno svoris sumažėjo daugiau nei 4%, lyginant su bazine linija. Tai yra daug greitesnis svorio mažėjimas, lyginant su mažėjimu, esant intrperitoninėms (i.p.) injekcijoms. Laukinio tipo (normalių) pelių, gavusių rekombinantinio OB polipeptido 10 mg/kg dozės i.p. injekcijas, svorio sumažėjimas po 32 dienų injekcijų laikotarpio buvo tik 2,6-3,0% ir nebuvo didesnis nei 4% bet kuriuo metu per dozavimo laikotarpį (duomenys neparodyti). Šie duomenys rodo, kad esant nepertraukiamai infuzijai, 20 kartų mažesnė dozė (0,5 mg/kg lyginant su 10 mg/kg) duoda didesnį svorio sumažėjimą per trumpesnį laikotarpį.

Pateikti rezultatai yra statistiškai reikšmingi, pvz., -4,62% su p<0,0001.

PAVYZDYS: Rekombinantinio žmogaus OB polipeptido klonavimas ir ekspresija

Šiame pavyzdyje duodamos rekombinantinio žmogaus versijos OB polipeptido analogo gavimo metodai ir kompozicijos.

Žmogaus versijos OB DNR sukonstruota iš pelės OB DNR taip, kaip aprašyta aukščiau duotame 13 pavyzdyje, pakeičiant sritį tarp Mlul ir BamHl vietų dvigrandinine DNR (padaryta iš sintetinių oligonukleotidų), kurioje buvo sukonstruota 20 kodonų. Pelės 35 subrendusios padėties arginino ir pelės subrendusios 74 padėties leucino kodonai buvo nepakeisti. Mlul vieta parodyta po ištisine linija žemiau duodamoje sekoje. Ši DNR perkelta į pCFM 1656 vektorių (ATCC, depozito Nr. 69576) tokiu pačiu būdu, kaip ir rekombinantinio pelės baltymo atveju, kaip aprašyta aukščiau.

Rekombinantinės žmogaus met OB (dvigrandės) DNR ir aminorūgščių sekos (SEQ ID NOS: 96 ir 97)

CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT 1 ----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------f 60

GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAA

MVPIQKVQDDTKTLIKTIV

ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC

61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG

TRINDISHTQSVSSKQRVTG

CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG 121----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------+18 0

138

GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGAC

LDFIPGLHPILTLSKMDQTL

GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC

181---------+---------+---------+---------+---------+---------+2 40

CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG

AVYQQILTSMPSRNVLQISN

GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG

241---------+---------+---------+---------+---------+---------+300

CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC

DLENLRDLLHVLAFSKSCHL

CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT

01----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------h 3 6 0

GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA

PWASGLETLDSLGGVLEASG

TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG

361---------+---------+---------+---------+---------+---------+420

ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC

YSTEVVALSRLQGSLQDMLW

CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC 421---------+---------+---------+---- 454

GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG

QLDLSPGC*

Fermentacija

Aukščiau minėto šeimininko ląstelių fermentacija, norint gauti rekombinantinį žmogaus OB polipeptidą, atlikta aukščiau aprašytomis rekombinantinės pelės OB medžiagos gavimo sąlygomis. Analizuota ir koreliuota rekombinantinės žmogaus OB medžiagos (ir nedidelių bakterinio baltymo kiekių) išeiga (gramais litrui) ir pradinis valymas, tiriant bakterinę ekspresiją:

lentelė

Žmogaus OB polipeptido ekspresijos analizė

Laikas	OD	Išeiga	Ekspresija
	(@600 nm)	(g/L)	(mg/OD-l)
Ind. + 2 h	47	1,91	41
Ind. + 4 h	79	9,48	120
Ind. + 6 h	95	13,01	137
Ind. + 8 h	94	13,24	141

139

Ind. + 10 h 98

14,65

149

Sutrumpinimai: Ind. + _ h reiškia valandas po baltymo ekspresijos indukcijos, kaip aprašyta 13 pavyzdyje rekombinantinės pelės medžiagos ekspresijos atveju, naudojant pCFM 1656.

O.D.: optinis tankis, išmatuotas spektrofotometru miligramai O.D. vienetui litrui mg/O.D·!: ekspresija mg baltymo O.D. vienetui litrui.

Rekombinantinio žmogaus OB polipeptido valymas Rekombinantinis žmogaus baltymas gali būti valomas, panaudojant metodus, panašius j tuos, kurie buvo naudoti rekombinantinio pelės baltymo valymui, kaip aprašyta aukščiau duotame 13 pavyzdyje. Rekombinantinio žmogaus OB polipeptido gavimui 8 stadija buvo atlikta, parūgštinant 7 stadijos nuopilą iki pH 5,0 ir užpilant jį ant CM sefarozės greito srauto kolonėlės. 20 kolonėlės tūrių druskos gradientas realizuotas esant 20 mM NaOAc, pH 5,5, 0-0,5 M NaCl. 9 stadijoje skiedžiamas iš CM sefarozės kolonėlės išbėgęs skystis 4 tūriais vandens, ir nustatomas pH=7,5. Į šį mišinį dedama amonio sulfato iki 0,7 M. Panaudojamas 20 kolonėlės tūrių atvirkščias druskos gradientas, esant 5 mM NaOAc, pH 5,5, 0,2-0 M amonio sulfato. Pirnmosios stadijos buvo identiškos.

PAVYZDYS: Dozės-atsako tyrimai

Papildomas tyrimas parodė, kad yra nuo dozės priklausantis atsakas į nepertraukiamą OB baltymo įvedimą. Šiame tyrime laukinio tipo pelėms (nenutukusios, CD-I pelės, sveriančios 35-40 g) įvedamas rekombinantinis pelės OB baltymas, naudojant panašius į 12 ir 13 pavyzdžiuose aprašytus metodus. Rezultatai buvo tokie (kūno svorio sumažėjimo %, lyginant su bazine linija, išmatuoti taip, kaip aprašyta aukščiau):

lentelė

Dozė-atsakas, esant nepertraukiamam įvedimui

Dozė	Laikas	Kūno svorio sumažėjimo %
0,03 mg/kg/per dieną	2 diena	3,5%
1 mg/kg/per dieną	2 diena	7,5%
1 mg/kg/per dieną	4 diena	14%

140

Iš lentelės matyti, kad didinant dozę nuo 0,03 mg/kg/per dieną iki 1 mg/kg/per dieną, svorio praradimas padidėjo nuo 3,5 iki 7,5. Taip pat svarbu pažymėti, kad 14-tą dieną 1 mg/kg/per dieną dozė sukėlė 14 % kūno svorio sumažėjimą.

PAVYZDYS: Leptino Įtaka i ob/ob pelių kūno sudėti

Šešiolikos savaičių amžiaus C57B1/6J ob/ob pelės 33 dienas buvo veikiamos 5 /xg/kg/per dieną pelės leptino doze, tirpikliu arba negavo preparato. Antrąjame eksperimente 7 savaičių amžiaus ob/ob pelės 12 dienų buvo veikiamos 10 μg/kg/peΓ dieną žmogaus leptino, pelės leptino dozėmis arba tirpikliu. Tada pelės buvo numarintos ir įvertintas bendras kūno svoris, kūno sudėtis, insulino ir gliukozės kiekiai. Šių eksperimentų duomenys yra pateikti 11 lentelėje

141 lentelė

Paveiktu leptinu pelių kūno svoris, sudėtis, ir insulino ir gliukozės kiekiai

142

Kūno sudėties duomenys rodo leptino poveikį į tris kūno dalis: riebalų masę, lieso kūno masę ir vandens masę. Šie duomenys rodo, kad leptinas labai mažina riebalų masę ir turi ribotą poveikį į liesą kūno masę. Tačiau poveikis į liesą kūno masę yra statistiškai nepatikimas.

Insulino ir gliukozės kiekių palyginimas paveiktose leptinu ir kontrolinėse (nepaveiktose) pelėse rodo, kad leptinas mažina cukraus ir insulino kiekius kraujuje ir tokiu būdu gerina šiuos diabeto rodiklius.

PAVYZDYS: Dideliu leptino dozių poveikis laukinio tipo pelėms

Norint atlikti liesumo kontrolę, ob/ob pelėms (C57B1/6J +/?) vieną kartą per dieną i.p. būdu buvo leidžiama 10 /zg/g pelės leptino arba tirpiklio (PBS) ir kitas dvi savaites matuojamas kūno svoris ir maisto suvartojimas. Pradedant nuo 4-tos dienos, pastebimas žymus kūno svorio mažėjimas ir žymus maisto suvartojimo mažėjimas pirmąją savaitę. Tačiau po vienos savaitės abiejų pelių grupių maisto suvartojimas buvo vienodas. Antrosios savaitės gale gyvuliukai buvo numarinti ir nustatyta jų kūno sudėtis. Kūno sudėties analizės rezultatai parodyti 12 lentelėje. Šie duomenys rodo leptiną gavusių gyvuliukų riebalų kiekio sumažėjimą, lyginant su PBS gavusiais gyvuliukais.

Laukinio tipo pelių (+/?) kūno sudėtis ir kūno svoris

143

Vanduo Iš viso %	foo^ocrį’r'^rt^r^^ooo σό'τ-Ι'σό'ιρσό'ο'οο’ο'νο'σο C Ό Ο Ό Ο ΙΟ Ό P Ό Ό	£ Pi X m	p to p tj- to co -r to to x Tj-c\Oi-^oo''rooocpįo c + + P- + pi <)* vo P* to OOO'ZOCOOi/'lO'-C	62,45 % 3,83 %
oooooooooo o r- oc m rp m oo o o rf N (N —¹ (N N o i r—< O t—t t—i —· t-H t—i r— r-* r—♦	11,62 0,74	oooooooooo ι/o o t—· pį c/γ oo αγ «/y σγ co rt c” r-' r^' —* o pi — + pi 1-< t—< T—( 5-* T—* T—C ,—1 1—1 t—t ,—1	11,66 0,72
Liesa kūno masė Iš viso %	trcppcotrzp σγ-^τ— oc o’ oo oc 00 D+ oc’ p-’ oc ΓΊ N N N N M N Γ1 M	27,79 % 1,05%	ΧΓΟΡΡ'ΙΡΙΌ^'Κ’Τ ITl P ITi >Τ, ΙΛι ΓΊ o p o θ' iri ir? ro ir? \c θ' to /c PI Pi PJ PJ P) PI pi PI PI	25,54 % 1,10 %
Oi-'OOO-'O-mi-’t'O^ P Ρ_κ ~ p z uo -O ι/ό'ιητ/'νΐ'ττ'τΓ'-'+'τΤ'ςτ'	4,87 0,30	OfOrH^irirrrTTrr-i O tp <O MD P~~ VO O Ch P;	4,75 0,20
Reibalai Iš viso %	- $ p M £i cc po ρ X p ό τι ¹ .n p c τ—ι τ—i ’tf PT P4 ,^-1 */0	5,04 4,52	_r ~ -3- υη pi co. -~ S fT <Λ ro J2 vo 2 2 £ £ c< ° so	12,09 % 5,08 %
o p n- p -t op p m p, to to χ ρ «ο η pi χ o d o’ o’ o pi o’ o’ o’	0,93 0,90	op-ooupoocooo oo Pį Pro p to ~ o~ 1—¹ PI n to (N r-1 ,—- P 1	oc P- Pi ρΓ τ-t
Kūno svoris	f'i p f'į t\ P/t IC P t> o’ oo¹ oo P-’ oc’ v+ v©¹ ve? --1 CT 1-1 T—1 T-i ,—1 T—t .-1 T—1 T—i	<Λ vo p· ,-?	oc \© o o o rn ro p^ vo oc’ pf oo’ σ-C oo’ p>’ oo’ o’ p·’ oo T—* .—t T—* i—1 T—1 1 ,—1 C'l r—· i—·	'G. oo
C57B1/6J	- N to T Ti C > Z P 2	Vidurkis Stand. Nukryp.	n x o>c T—< T—t r—* r—l T—t r—( t—4 t—' r—H f\J	Vidurkis Stand. Nukryp.
Grupė	Baltymas	Tirpiklis

144

Antrame eksperimente parodyta du kartus per dieną leidžiamų 12,5 ųg/g pelės leptino i.p. dozių poveikis laukinio tipo C57B1/6J pelėms. Pastebėtas labai didelis kūno svorio ir maisto suvartojimo sumažėjimas, susijęs su du kartus per dieną leidžiamomis polipeptido injekcijomis. Siame eksperimente gyvuliukai buvo patalpinti metabolinėse kamerose. Maistas buvo miltelių pavidalo Purina #5001 dieta. Šis maistas skyrėsi nuo ankstesnių eksperimentų maisto, kuriuos sudarė dieta, susidedanti iš kramtomo maisto, tapiokos ir vandens. Taigi, metabolinėse kamerose naudotas maistas buvo kaloringesnis, ir tai paaiškina, kodėl suvartoto maisto kiekis skiriasi nuo gyvuliukų suvartoto maisto, kuriame buvo vandens.

Toliau duodamos literatūros šaltinių, susijusių su aukščiau duodamu aprašymu ir ypatingai eksperimentinėmis metodikomis ir aptarimais, sąrašas

Bahary ez ai, Genimics, 11:33-47 (1991).

Bahary et ai., Genomics, 13:761-769 (1992).

Bahary et ai., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Ūse of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991).

Blank et ai., Mammalian Genome, 1: s51-s78 (1991).

Bogardus et ai., Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100-115 (1991). Friedman et ai., Mammalian Genome, 1:130-144 (1991).

Harris, FASEBJ., 4:3310-3318 (1990).

Jacobowitz et ai., N. Engi. J. Med., 315:96-100 (1986).

Kessey, in Obesity, pp. 144-166, Stunkard ed., Philadelphia, W.B. Sauders Co. (1980). Kessey et ai., Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22 (1986).

Leibel et ai., “Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity”, in Genetic Variation and Nutrition, pp. 90-101.11, Simopoulos and Childs eds., S. Karger, Basei (1990).

Siegel et ai., Cytogenet. Cell Genet., 61(3):184-185 (1992).

Šis išradimas gali būti realizuotas kitokiomis formomis arba kitokiais būdais, nenukrypstant nuo jo esmės arba jo esminių charakteristikų. Todėl aprašymą reikia laikyti

145 visokiais požiūriais kaip iliustracinį, o ne apribojantį; išradimo apimtis yra nustatyta pridedamoje apibrėžtyje, ir turima galvoje, kad jame apimami visokie pakeitimai, kurie įeina į jo prasmės ir ekvivalentiškumo sferą.

Šiame aprašyme cituojami įvairūs literatūros šaltiniai, jie visi čia pridedami pilnai. Siūlomą išradimą galima įgyvendinti pagal aukščiau duodamą aprašymą, lengvai prieinamus literatūros šaltinius ir pradines medžiagas. Vis dėlto, pareiškėjai 1995 m. rugpjūčio 9 d. deponavo Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, USA) pagal Budapešto sutartį apie mikroorganizmų deponavimą patentavimo tikslais tokius mikroorganizmus: E. coli H14, turinčią ρΕΤΉ14 plazmidę (depozito Nr. 69880) ir E. coli M9, turinčią pETM9 plazmidę (depozito Nr. 69879).

(1) PAGRINDINĖ INFORMACIJA (I) PAREIŠKĖJAS: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY (ii) IŠRADIMO PAVADINIMAS: KŪNO SVORIO MODULIATORIAI, ATITINKAMOS NUKLEINO RŪGŠTYS IR BALTYMAI, IR JŲ DIAGNOSTINIS IR TERAPINIS PANAUDOJIMAS (iii) SEKŲ SKAIČIUS: 99 (iv) KORESPONDENCIJOS ADRESAS:

(A) ADRESAS: Klauber & Jackson (B) GATVĖ: 411 Hackensack avenue (C) MIESTAS: Hackensack (D) VALSTIJA: New Jersey (E) ŠALIS: JAV (F) ZIP: 07601 (v) KOMPIUTERINĖ SKAITYMO FORMA:

(A) TERPĖS TIPAS: minkštas diskas (B) KOMPIUTERIS: IBM PC (C) OPERACINĖ SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versija #1.25 (vi) EINAMOJI PARAIŠKOS DATA:

(A) PARAIŠKOS NUMERIS:

(B) UŽPILDYMO DATA:

(C) KLASIFIKACIJA:

(vii) ANKSTESNĖ PARAIŠKOS DATA:

(A) PARAIŠKOS NUMERIS: 08/483, 211 (B) UŽPILDYMO DATA: Birželio 7, 1995 (C) KLASIFIKACIJA:

(vii) ANKSTESNĖ PARAIŠKOS DATA:

(A) PARAIŠKOS NUMERIS: 08/438, 431 (B) UŽPILDYMO DATA: Gegužės 10, 1995 (C) KLASIFIKACIJA:

(vii) ANKSTESNĖ PARAIŠKOS DATA:

(A) PARAIŠKOS NUMERIS: 08/347, 563 (B) UŽPILDYMO DATA: Lapkričio 30, 1994 (C) KLASIFIKACIJA:

(vii) ANKSTESNĖ PARAIŠKOS DATA:

(A) PARAIŠKOS NUMERIS: 08/292, 345 (B) UŽPILDYMO DATA: Rugpjūčio 17, 1994 (C) KLASIFIKACIJA:

147 (viii) ĮGALIOTINIO/AGENTO INFORMACIJA:

(A) VARDAS: Jackson Esq., David A.

(B) REGISTRACIJOS NUMERIS: 26,742 (C) IŠRAŠO/NURODYMO NUMERIS: 600-1-087 PCT (ix) TELEKOMUNIKACINĖ INFORMACIJA:

(A) TELEFONAS: 201 487-5800 (B) TELEFAKSAS: 201 343-1684 (C) TELEKSAS: 133521 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:1:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 2793 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (A) APRAŠYMAS: ob kDNR (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 57..560 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:1:

GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAA 56

ATG TGC TGG AG A CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG 104

Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu

10 15

TCT TAT GTT CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG G AT GAC ACC AAA 152

Ser Tyr Vai Gln Ala Vai Pro Ile Gln Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys

25 30

ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG 200

Thr Leu Ile Lys Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr

40 45

CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT 248

Gln Ser Vai Ser Ala Lys Gln Arg Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro

55 60

GGG CTT CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA 296

Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala

148

70 75 80

GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344

Vai Tyr Gln Gln Vai Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Vai Leu Gln

90 95

ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392

Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala

100 105 110

TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440

Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro

115 120 125

GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488

Glu Ser Leu Asp Gly Vai Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Vai

130 135 140

GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG 536

Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln 145 150 155 160

TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA 588

Leu Asp Vai Ser Pro Glu Cys *

165

ATCATGTAGA	GGGAAGAAAC	CTTGGCTTCC	AGGGGTCTTC	AGGAGAAGAG	AGCCATGTGC	648
ACACATCCAT	CATTCATTTC	TCTCCCTCCT	GTAGACCACC	CATCCAAAGG	CATGACTCCA	708
CAATGCTTGA	CTCAAGTTAT	CCACACAACT	TCATGAGCAC	AAGGAGGGGC	CAGCCTGCAG	768
AGGGGACTCT	CACCTAGTTC	TTCAGCAAGT	AGAGATAAGA	GCCATCCCAT	CCCCTCCATG	828
TCCCACCTGC	TCCGGGTACA	TGTTCCTCCG	TGGGTACACG	CTTCGCTGCG	GCCCAGGAGA	888
GGTGAGGTAG	GGATGGGTAG	AGCCTTTGGG	CTGTCTCAGA	GTCTTTGGGA	GCACCGTGAA	948
GGCTGCATCC	ACACACAGCT	CGAAACTCCC	AAGCAGCACA	CGATGGAAGC	ACTTATTTAT	1008
TTATTCTGCA	TTCTATTTTG	GATGGATCTG AAGCAAGGCA	TCAGCTTTTT	CAGGCTTTGG	1068
GGGTCAGCCA	GGATGAGGAA GGCTCCTGGG	GTGCTGCTTT	CAATCCTATT	GATGGGTCTG	1128
CCCGAGGCAA	ACCTAATTTT	TGAGTGACTG GAAGGAAGGT	TGGGATCTTC	CAAACAAGAG	1188
TCTATGCAGG	TAGCGCTCAA	GATTGACCTC	TGGTGACTGG	TTTTGTTTCT	ATTGTGACTG	1248
ACTCTATCCA	AACACGTTTG	CAGCGGCATT GCCGGGAGCA	TAGGCTAGGT	TATTATCAAA	1308
AGCAGATGAA	TTTTGTCAAG	TGTAATATGT	ATCTATGTGC	ACCTGAGGGT	AGAGGATGTG	1368
TTAGAGGGAG	GGTGAAGGAT	CCGGAAGTGT	TCTCTGAATT	ACATATGTGT	GGTAGGCTTT	1428
TCTGAAAGGG	TGAGGCATTT	TCTTACCTCT	GTGGCCACAT	AGTGTGGCTT	TGTGAAAAGG	1488
ACAAAGGAGT	TGACTCTTTC	CGGAACATTT	GGAGTGTACC	AGGCACCCTT	GGAGGGGCTA	1548
AAGCTACAGG	CCTTTTGTTG	GCATATTGCT	GAGCTCAGGG	AGTGAGGGCC	CCACATTTGA	1608
GACAGTGAGC	CCCAAGAAAA	GGGTCCCTGG	TGTAGATCTC	CAAGGTTGTC	CAGGGTTGAT	1668
CTCACAATGC	GTTTCTTAAG	CAGGTAGAC	TTTGCATGCC	AATATGTGGT	TCTCATCTGA	1728
TTGGTTCATC	CAAAGTAGAA	CCCTGTCTCC	CACCCATTCT	GTGGGGAGTT	TTGTTCCAGT	1788
GGGAATGAGA	AATCACTTAG	CAGATGGTCC	TGAGCCCTGG	GCCAGCACTG	CTGAGGAAGT	1848
GCCAGGGCCC	CAGGCCAGGC	TGCCAGAATT	GCCCTTCGGG	CTGGAGGATG	AACAAAGGGG	1908
CTTGGGTTTT	TCCATCACCC	CTGCACCCTA	TGTCACCATC	AAACTGGGGG	GCAGATCAGT	1968

149

GAGAGGACAC TTGATGGAAA CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA TCCCTGTGGT TAGACCCTAC GAAGTACAGT GCTGTCTTCA GGGGAACCCT GCTTGCAGTC CACTCCTATG GTAGCACACT TCCAAAATGC TTGGGACTAG TTTGAGTATA TATAAAATGA ATTTATATTT CATAATACCG AATAACGTTG TATGCATGAA CTCAAAAACC TTGGGGTTTT AGCTTATACC TAAAACCATA TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA

GCAATACACT TTAAGACTGA

GAGAAGCTC CCACATACAT

TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGGTGTGA AAGAACCTGA TATTGCATTT ACATACCGCA GTTGACAATA GGACAAGGGA AAGAGTTTTG GATTTTAGAG GATATCTTGG GGATGGGGCC TATAGACACT GCTTGAAGTG AGACGTTTTT ACAGCATGAA GGAGCAGTTT ]GGATCTTGGG ATGGCAAAC GGCTGCAGGA AGGTCATACC CTGTGGAGGT GGTAGATTTT GGAGGATCTG

GCACAGTTTC

ATAAAAATCA

ACAGCAGCAC

GCTGAGGGTG

TTTCAGGGCA

TAGGGGTTGA

TCTTTTCAGG

CAAGTATAAA

TAGTTTTATA

CCTGTCTACT

TTTTCTGTTA

CCAGACTGGA

GAGCGGGATC

AGGGC

GTGCTCAGCT 2028 GAGGCTCATG 2088 CGCACCGCTG 2148 ACAGTGCCCA 2208 CATTAGCATC 2268 CTATCCCTTA 2328 CATAGGTATA 2388 CATGAAGTTC 2448 CAGTGTTTTA 2508 CATGCCAGCA 2568 AGAGATGGTT 2628 TCCTCAGCCC 2688 AGGTTTTGTG 2748

2793 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:2:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 168 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorugštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: pelės ob polipeptidas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:2:

Met

Cys

Trp

Arg

Pro

Leu

Cys

Arg

Phe

Leu

Trp

Leu

Trp

Ser

Tyr Leu

1

5

10

15

Ser

Tyr

Vai

Gln

Ala

Vai

Pro

Ile

Gln

Lys

Vai

Gln

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Vai

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His '

Thr

35

40

45

Gln

Ser

Vai

Ser

Ala

Lys

Gln

Arg

Vai

Thr

Gly

• Leu

Asp Phi

e Ile

Pro

50

55

60

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gln

Thr

Leu

Ala

65

70

75

80

Vai

Tyr

Gln

Vai

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gln

Asn

Vai

Leu

Gln

85

90

95

Ile

Ala Asn Asp

Leu Glu ,

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Leu

Ala

100

105

110

Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro

150

115

120

125

Glu

Ser 130

Leu

Asp

Gly

Vai

Leu 135

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr 140

Ser

Thr

Glu

Vai

Vai 145

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 150

Gln

Gly

Ser

Leu

Gln 155

Asp

Ile

Leu

Gln

Gln 160

Leu

Asp

Vai

Ser

Pro 165

Glu

Cys

*

(2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:3:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 700 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: kDNR (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob kDNR, kur N reiškia bet kokį nukleotidą (iii) HIPOTETIŠKA: Ne (iv) ANTIPRASMINĖ: Ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 46..546 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:3:

NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG 54

Met His Trp

GGA ACC CTG TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT CTG 102

Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Vai

10 15

CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 150

Gln Ala Vai Pro Ile Gln Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 20 25 30 35

AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC 198

Lys Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Vai

45 50

TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAG 246

Ser Ser Lys Gln Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His

60 65

CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA 294

Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Vai Tyr Gln

75 80

151

CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 342

Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Ile Gln Ile Ser Asn

90 95

GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG 390

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser Lys 100 105 110 115

AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG 438

Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu

120 125 130

GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 486

Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu

135 140 145

AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 534

Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu

150 155 160

AGC CCT GGG TGC TGAGGCCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT 585

Ser Pro Gly Cys

165

TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTGCATGGACACC 645 CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG 700 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:4:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 167 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob polipeptidas (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:4:

152

Met 1	His Trp Gly	Thr 5	Leu	Cys	Gly Phe	Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu
10	15
Phe	Tyr Vai Gln 20	Ala	Vai	Pro	Ile Gln 25	Lys Vai Gln	Asp Asp Thr Lys 30
Thr	Leu Ile Lys 35	Thr	Ile	Vai	Thr Arg Ile Asn Asp 40	Ile Ser His Thr 45
Gln	Ser Vai Ser 50	Ser	Lys	Gln 55	Lys Vai	Thr Gly Leu 60	Asp Phe Ile Pro 1
Gly 65	Leu His Pro	Ile	Leu 70	Thr	Leu Ser	Lys Met Asp 75	Gln Thr Leu Ala 80
Vai	Tyr Gln Gln	Ile 85	Leu	Thr	Ser Met	Pro Ser Arg 90	Asn Vai Ile Gln 95
Ile	Ser Asn Asp 100	Leu	Glu	Asn	Leu Arg 105	Asp Leu Leu	His Vai Leu Ala 110
Phe	Ser Lys Ser 115	Cys	His	Leu	Pro Trp 120	Ala Ser Gly	Leu Glu Thr Leu 125
Asp	Ser Leu Gly 130	Gly	Vai	Leu 135	Glu Ala	Ser Gly Tyr 140	Ser Thr Glu Vai
Vai 145 Leu	Ala Leu Ser Asp Leu Ser	Arg Pro	Leu 150 Gly	Gln Cys	Gly Ser	Leu Gln Asp 155	Met Leu Trp Gln 160

165 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:5:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 166 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: pelės ob polipeptidas neturintis Gln 49 padėtyje (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:5:

Met 1

Cys

Trp

Arg

Pro 5

Leu

Cys

Arg

Phe

Leu 10

Trp

Leu Trp

Ser

Tyr 15

Leu

Ser

Tyr

Vai

Gln 20

Ala

Vai

Pro

Ile

Gln 25

Lys

Vai

Gln Asp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 35

Lys

Thr

Ile

Vai

Thr 40

Arg

Ile

Asn

Asp Ile 45

Ser

His

Thr

Ser

Vai 50

Ser

Ala

Lys

Gln

Arg Vai 55

I Thr Gly

Leu Asp Phe Ile 60

Pro

Gly

Leu 65

His

Pro

Ile 1

Leu

Ser 70

Leu

Ser

Lys

Met

Asp 75

Gln Thr

Leu

Ala

Vai 80

153

Tyr	Gln	Gln	Vai	Leu 85	Thr	Ser	Leu	Pro Ser 90	Gln Asn Vai Leu Gli 95	n Ile
Ala	Asn	Asp	Leu	Glu Asn	Leu j	Arg	Asp Leu	Leu His Leu Leu Ala	Phe
			100					105	110
Ser	Lys	Ser	Cys	Ser	Leu	Pro	Gln	Thr Ser	Gly Leu Gln Lys Pro	Glu
		115					120		125
Ser	Leu	Asp	Gly	Vai	Leu	Glu	Ala	Ser Leu	Tyr Ser Thr Glu Vai	Vai
	130					135			140
Ala	Leu	Ser	Arg	Leu	Gln Gly	Ser	Leu Gln	Asp Ile Leu Gln Gln	Leu
145					150			155	160
Asp	Vai	Ser	Pro	Glu	Cys

165 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:6:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 167 amino rūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob polipeptidas neturintis Gln 49 padėtyje (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:6:

Met 1

His

Trp

Gly

Thr 5

Leu

Cys

Gly

Phe

Leu 10

Trp

Leu

Trp

Pro Tyr Leu 15

Phe

Tyr

Vai

Gln 20

Ala

Vai

Pro

Ile

Gln 25

Lys

Vai

Gln

Asp

Asp Thr Lys 30

Thr

Leu

Ile 35

Lys

Thr

Ile

Vai

Thr 40

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 45

Ser His Thr

Ser

Vai 50

Ser

Lys

Gln

Lys 55

Vai

Thr

Gly

Leu

Asp 60

Phe

Ile Pro Gly

Leu Leu 65

His

Pro

Ile Leu Thr 70

Leu

Ser

Lys

Met

Asp 75

Gln

Thr Leu Ala

Tyr

Gln

Ile

Leu 85

Thr

Ser

Met

Pro

Ser 90

Arg

Asn

Vai

Ile Gln Ile 95

Ser

Asn

Asp

Leu Glu 100

Asn

Leu Arg

Asp 105

Leu Leu

His

Vai

Leu Ala Phe 110

Ser

Lys

Ser 115

Cys

His

Leu

Pro

Trp Ala Ser 120

Gly Leu (

Glu 125

Thr Leu Asp

Ser

Leu 130

Gly

Vai

Leu

Glu 135

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser 140

Thr

Glu Vai Vai

Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu

154 (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (A) APRAŠYMAS: 2G7 egzonas (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:7:

GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCTG TGTCGGGTCC NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG

120

165

155 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:8:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (praimeris) (A) APRAŠYMAS: 2G7 egzono PCR 5’ pradmuo (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:8:

CCAGGGCAGG AAAATGTG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:9:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 22 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: 2G7 egzono PCR 3’ pradmuo (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:9:

CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 22 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:10:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 23 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (A) APRAŠYMAS: N-galinis signaUnis peptidas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:10:

Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu

156

10 15

Ser Tyr Vai Gln Ala Vai Pro 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:11:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 287 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: cirkuliarinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (plazmidė) (A) APRAŠYMAS: pET-15b ekspresijos vektorius (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: T7 promotorius (B) PADĖTIS: 20..37 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: lac-operatorius (B) PADĖTIS: 39..64 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 108..243 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: His-Tag (B) PADĖTIS: 123..137 (i.x) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: trombino skaldymo vieta (B) PADĖTIS: 184..196 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:11:

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA 60

TTCCCCTCT A C AAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG AT AT ACC ATG GGC AGC 116

Met Gly Ser 1

AGC C AT C AT C AT C AT C AT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC 164

Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro Arg Gly Ser

10 15

C AT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG 212

His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu

157

25 30 35

TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT 263

Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln *

AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG 287 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:12:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 45 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:12:

Met 1

Gly

Ser

His 5

His

His 10

Ser

Gly

Leu

Vai 15

Pro

Arg

Gly

Ser

His 20

Met

Leu

Glu

Asp

Pro 25

Ala

Asn

Lys

Ala 30

Arg

Lys

Glu

Ala

Glu 35

Leu

Ala

Thr 40

Ala

Glu

Gln

(2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:13:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: pelės 5’ pradmuo (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:13:

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC 32 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:14:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba

158 (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: pelės 3’ praimeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:14:

TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC 32 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:15:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: žmogaus 5’ pradmuo (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:15:

TCTATGTCC A TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:16:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (praimeris) (A) APRAŠYMAS: žmogaus 3’ praimeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:16:

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA 32 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:17:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

159 (A) ILGIS: 11 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: kDNR (A) APRAŠYMAS: akceptoriaus susijungimo vieta ob (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: akceptoriaus susijungimo vieta (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:17:

AGCAGTCGGTA 11 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:18:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 16 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (A) APRAŠYMAS: ob peptido fragmentas (v) FRAGMENTO TIPAS: vidinis (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS:

Vai Pro Ile Gln Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 15 10 15 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO: 19:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 15 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (A) APRAŠYMAS: ob peptido fragmentas (v) FRAGMENTO TIPAS: vidinis (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

160 (A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:19:

Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 15 10 15 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:20:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (A) APRAŠYMAS: ob peptido fragmentas (v) FRAGMENTO TIPAS: vidinis (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:20:

Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu 15 10 15

Ser Leu Asp (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:2l:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (A) APRAŠYMAS: ob peptido fragmentas (v) FRAGMENTO TIPAS: karboksilo galas (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:21:

Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Vai 15 10 15

Ser Pro Glu Cys 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:22:

161 (i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 414 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dvibuba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob geno dalis, turinti nekoduojančią seką aukščiau pirmo egzono, koduojančią pirmojo egzono seką ir pirmojo introno 5’ sritį (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 38..181 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: pirmojo introno 5’ sritis (B) PADĖTIS: 182..414 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: žmogaus ob geno 5’ nekoduojanti seka, iš kurios buvo generuotas HOB lgF DNR pradmuo (B) PADĖTIS: 11..28 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: žmogaus ob geno introninė seka, iš kurios buvo generuotas HOB lgR pradmuo (B) PADĖTIS: 241..260 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:22:

GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55

Met His Trp Gly Thr Leu

5

TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG 103

Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Vai Gln Ala Vai

15 20

CCC ATC C AA AAA GTC CAA G AT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG AC A ATT 151

Pro Ile Gln Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile

30 35

GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201

Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr

45

CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261

162

AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321 TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381

GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:23:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 48 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob baltymo, koduojančio pirmą egzoną, N-galinė dalis (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:23:

Met 1

His

Trp

Gly

Thr 5

Leu

Cys

Gly

Phe

Leu 10

Trp

Leu

Trp

Pro

Tyr 15

Leu

Phe

Tyr

Vai

Gln 20

Ala

Vai

Pro

Ile

Gln 25

Lys

Vai

Gln

Asp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 35

Lys

Thr

Ile

Vai

Thr 40

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 45

Ser

His

Thr

(2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:24:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 801 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob geno daUs, turinti pirmo introno 3’ sritį, antrojo egzono koduojančią seką ir 3’ nekoduojančią seką (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 291..648 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: pirmojo introno 3’ (B) PADĖTIS: 1..290

163 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: žmogaus ob geno HOB introninė seka, iš kurios buvo generuotas HOB 2gF pradmuo (B) PADĖTIS: 250..269 (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: žmogaus ob geno nekoduojanti 3’ seka, iš kurios buvo generuotas HOB 2gR DNR pradmuo (B) PADĖTIS: 707..72S (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:24:

CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT 60 GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120 CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180 AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240

CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296

Gln Ser 1

GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC 344

Vai Ser Ser Lys Gln Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu 5 10 15

CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC 392

His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Vai Tyr

25 30

C AA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC 440

Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Ile Gln Ile Ser 35 40 45 50

AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT 488

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser 55 60 65

AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC 536

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser

75 80

CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC 584

Leu Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala

90 95

CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632

Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp

100 105 110

CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA 688

Leu Ser Pro Gly Cys

115

GGGAAGG AAC TCTGGCTTTC C AGGT ATCTC C AGG ATTGAA GAGCATTGC A TGGACACCCC 748 TT ATCC AGG A CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801

164 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:25:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 119 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: žmogaus ob baltymo C-galinė dalis (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:25:

Gln 1

Ser

Vai

Ser

Ser 5

Lys

Gln

Lys

Vai

Thr 10

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile 15

Pro

Gly

Leu

His

Pro 20

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser 25

Lys

Met

Asp

Gln

Thr 30

Leu

Ala

Vai

Tyr

Gln 35

Gln

Ile

Leu

Thr

Ser 40

Met

Pro

Ser

Arg

Asn 45

Vai

Ile

Gln

Ile

Ser 50

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn 55

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu 60

His

Vai

Leu

Ala

Phe 65

Ser

Lys

Ser

Cys

His 70

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser 75

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu 80

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly 85

Vai

Leu

Glu

Ala

Ser 90

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu 95

Vai

Ala

Leu

Ser 100

Arg

Leu

Gln

Gly

Ser 105

Leu

Gln

Asp

Met

Leu 110

Trp

Gln

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

115 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:26:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 8 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (v) FRAGMENTO TIPAS: vidinis (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: mielės pichia (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:26:

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 1 5 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:27:

165 (i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 4 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: nežinoma (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (v) FRAGMENTO TIPAS: vidinis (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: mielės pichia (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:27:

Glu Ala Glu Ala 1 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:28:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ORGANIZMAS: mielės pichia (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:28:

Leu Glu Lys Arg 1 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:29:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: HOB lgF DNR pradmuo, generuotas iš žmogaus ob geno 5’ nekoduojančios sekos (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:29:

CCCAAGAAGC CCATCCTG

166 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:30:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: HOB lgR DNR pradmuo, generuotas žmogaus ob geno pirmos introninės sekos (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:30:

GACTATCTGG GTCCAGTGCC 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:31:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (praimeris) (A) APRAŠYMAS: HOB lgF DNR pradmuo, generuotas iš žmogaus ob geno pirmos introninės sekos (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:31:

CCACATGCTG AGCACTTGTT 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:32:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 22 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: HOB 2gr DNR pradmuo, generuotas iš žmogaus ob geno 3’ nekoduojančios sekos (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO32:

CTTCAATCCT GGAGATACCT 22 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:33:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 51 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: cirkuliarinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (A) APRAŠYMAS: pPIC.9 klonavimo vieta (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:33:

CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G 51 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:34:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 40 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: PCR 5’ pradmuo žmogaus ob kDNR sekos amplifikacijai (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:34:

GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG 40 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:35:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 31 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė

168 (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: PCR 3’ pradmuo žmogaus ob kDNR sekos amplifikacijai (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:35:

GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTG AGGT C 31 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:36:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 40 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: PCR 5’ pradmuo pelės ob kDNR sekos amplifikacijai (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:36:

GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:37:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 31 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: PCR 3’ pradmuo pelės ob kDNR sekos amplifikacijai (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: taip (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:37:

GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C 31 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:38:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 4 aminorūgštys

169 (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: N-galinis renatūruoto pelės ob baltymo tetrapeptidas po trombino skaldymo (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:38:

Gly Ser His Met 1 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:39:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1734 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:39:

CAAGACAAAT GAGATAAGG 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:40:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1734 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

170 (A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:40:

AGAGTTACAG CTTTACAG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:41:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS494 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:41:

CTAAACACCT TTCCATTCC 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:42:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 22 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS494 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:42:

TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC 22 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:43:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

171 (A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS883 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:43:

TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:44:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS883 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:44:

GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:45:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2359

172 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:45:

AGTGTTGTGT TTCTCCTG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:46:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2359 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:46:

AAAGGGGATG TGATAAGTG 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:47:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2336 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:47:

173

GGTGTTACGT TTAGTTAC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:48:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2336 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:48:

GGAATAATGA GAGAAGATTG 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:49:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1219 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:49:

GCTCAACTGA CAGAAAAC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:50:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis

174 (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1218 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:50:

GACTATGTAA AAGAAATGCC 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:51:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1402 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:51:

AAAGGGCTTC TAATCTAC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:52:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1402 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne

175 (vi) originalus Šaltinis:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:52:

CCTTCCAACT TCTTTGAC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:53:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS999 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:53:

TAAACCCCCT TTCTGTTC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:54:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS999 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:54:

TTGCATAATA GTCACACCC 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:55:

176 (i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 22 bazių porOS (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1751 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:55:

CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG 22 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:56:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1751 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:56:

AAACCGAAGT TCAGATACAG 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:57:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo)

177 (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1174 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:57:

AATATCTGAC ATTGGCAC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:58:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1174 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:58:

TTAGACCTGA GAAAAGAG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:59:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2061 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:59:

178

GTTGCACAAT ACAAAATCC 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:60:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2061 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:60:

CTTCCATTAG TGTCTTATAG 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:61:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2588 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:61:

ATCACTACAC ACCTAATC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:62:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų

179 (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2588 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:62:

CCATTCTACA TTTCCACC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:63:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 24 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS808 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:63:

GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA 24 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:64:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 23 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS808 (iii) HIPOTETIŠKA: ne

180 (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:64:

TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC 23 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:65:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINES TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1392 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:65:

CTCAGGTATG TCTTTATC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:66:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1392 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:66:

TGTCTCTGCA TTCTTTTC

181 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:67:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1148 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:67:

GACACATACA AACACAAG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:68:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1148 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:68:

ATTGAGTTGA GTGTAGTAG 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:69:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė

182 (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1529 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:69:

CAGGGATTTC TAATTGTC (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:70:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS1529 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:70:

AAAAGATGGA GGCTTTTG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:71:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2619 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus

183 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:71:

CGTTAAGGGA AGGAACTCTG G 21 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:72:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2619 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:72:

TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:73:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS404 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:73:

ACCAGGGTCA ATACAAAG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:74:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų

184 (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS404 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:74:

TAATGTGTCC TTCTTGCC 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:75:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2367 (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:75:

CAATCCTGGC TTCATTTG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:76:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: Sekos surišimo vietai specifinis PCR pradmuo sWSS2367 (iii) HIPOTETIŠKA: ne

185 (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:76:

AAGGTGGGTA GGATGCTA 18 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:77:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:UT528 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:77:

TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:78:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS :UT528 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:78:

GTGCAGCTTT AATTGTGAGC

186 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:79:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFMaO65zg9 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:79:

AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:80:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFMaO65zg9 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:80:

GGTCAGCAGC ACTGTGATT 19 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:81:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė

187 (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFMal25whl markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:81:

TCACCTTGAG ATTCCATCC (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:82:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFMal25whl markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:82:

AACACCGTGG TCTTATCAAA 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:83:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM309yfl0 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus

188 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:83:

CATCCAAGTT GGCAGTTTTT 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:84:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM309yfl0 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:84:

AGATGCTGAATTCCCAGACA 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:85:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 16 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM218xflO markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:85:

TGGGCAACAC AGCAAA 16 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:86:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų

189 (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM218xflO markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:86:

TGCAGTTAGT GCCAATGTCA 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:87:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 16 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM206xcl markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:87:

CCAGGCCATGTGGAAC 16 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:88:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM206xcl markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne

190 (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:88:

AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT ²⁰ (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:89:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 16 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM199xhl2 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:89:

TCTGATTGCT GGCTGC 16 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:90:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 17 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFM199xhl2 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:90: ^GC

GCGCGTGTGT ATGTGAG

191 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:91:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS:AFMa345wc9 markeris (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:91:

AGCTCTTGGC AAACTCACAT 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:92:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:92:

GCCTAAGGGA ATGAGACACA 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:93:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 24 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: vienguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė

192 (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (pradmuo) (A) APRAŠYMAS: pelės Pax4 geno pradmuo (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:93:

GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG 24 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:94:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 491 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: Unijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: kDNR (A) APRAŠYMAS: Rekombinantinis pelės met ob (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: pelė (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 41 „478 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:94:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG 55

Met Vai Pro Ile Gln 1 5

AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT 103

Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Vai Thr Arg

15 20

ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GTT 151

Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Vai Ser Ala Lys Gln Arg Vai

30 35

ACC CGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC TTG TCC 199

Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser

45 50

AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG 247

Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Vai Tyr Gln Gln Vai Leu Thr Ser Leu

60 65

193

CCG TCC CAG AAC GTT CIT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC 295

Pro Ser Gln Asn Vai Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg 70 75 80 85

GAC CTG CTG C AC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343

Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln

95 100

ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA 391

Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Vai Leu Glu Ala

105 110 115

TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439

Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser

120 125 130

CTT CAG GAC ATC CTT CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG GAA TGT TAATGGA 488

Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Vai Ser Pro Glu Cys

135 140 145

TCC 491 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:95:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 146 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: rekombinantinis pelės met ob baltymas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:95:

Met 1

Vai

Pro

Ile

Gln 5

Lys

Vai

Gln

Asp

Asp 10

Thr Lys

Thr

Leu

Ile Lys 15

Thr

Ile

Vai

Thr 20

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 25

Ser

His Thr

Gln

Ser 30

Vai Ser

Ala

Lys

Gln 35

Arg

Vai

Thr

Gly

Leu 40

Asp

Phe

Ile Pro

Gly 45

Leu

His Pro

Ile

Leu 50

Ser

Leu

Ser

Lys

Met 55

Asp

Gln

Thr

Leu Ala 60

Vai

Tyr

Gln Gln

Vai 65

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro 70

Ser

Gln

Asn

Vai

Leu Gln 75

Ile

Ala

Asn Asp 80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

His

Leu 90

Leu Ala

Phe

Ser

Lys Ser 95

Cys

Ser

Leu

Pro 100

Gln

Thr

Ser

Gly

Leu 105

Gln

Lys Pro

Glu

Ser Leu Asp 110

Gly

Vai

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr 120

Ser

Thr

Glu Vai

Vai 125

Ala

Leu Ser

Arg

Leu 130

Gln

Gly

Ser

Leu

Gln 135

Asp

Ile

Leu

Gln Gln 140

Leu

Asp

Vai Ser

Pro Glu Cys

194

145 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:96:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 454 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) GRANDINĖS TIPAS: dviguba (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (A) APRAŠYMAS: Rekombinantinis žmogaus ob (iii) HIPOTETIŠKA: ne (iv) ANTIPRASMINĖ: ne (vi) ORIGINALUS ŠALTINIS:

(A) ORGANIZMAS: žmogus (ix) BRUOŽAS:

(A) PAVADINIMAS/RAKTAS: CDS (B) PADĖTIS: 4..444 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:96:

CAT ATG GTA CCG ATC CAG AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT 48

Met Vai Pro Ile Gln Lys Vai Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile

10 15

AAA ACG ATC GTT ACG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTG 96

Lys Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Vai

25 30

AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC 144

Ser Ser Lys Gln Arg Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45

CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192

Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Vai Tyr Gln 50 55 60

CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC 240

Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Leu Gln Ile Ser Asn 65 70 75

GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA 288

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser Lys 80 85 90 95

TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336

Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu

100 105 110

GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG 384

Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu

115 120 125

TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG 432

195

Ser Srg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu 130 135 140

TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC

Ser Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:97:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 147 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: baltymas (A) APRAŠYMAS: Rekombinantinis žmogaus met ob baltymas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:97:

454

Met 1

Vai

Pro

Ile

Gln 5

Lys

Vai

Gln

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 15

Lys

Thr

Ile

Vai

Thr 20

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 25

Ser

His

Thr

Gln

Ser 30

Vai

l Ser

Ser

Lys

Gln 35

Arg

Vai

Thr

Gly

Leu 40

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 45

Leu

His

Pro

Ile

Leu 50

Thr

Leu

Ser

Lys

Met 55

Asp

Gln

Thr

Leu

Ala 60

Vai

Tyr

Gln Gln

Ile 65

Leu

Thr

Ser

Met

Pro 70

Ser

Arg

Asn

Vai

Leu 75

Gln

Ile

Ser

Asn

Asp 80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

His

Vai 90

Leu

Ala

Phe

Ser 1

Lys 95

Ser

Cys

His

Leu

Pro 100

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu 105

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser 110

Leu

Gly

Vai

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

Vai

Vai 125

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gln

Gly

Ser

Leu

Gln

Asp

Met

Leu

Trp

Gln

Leu

Asp

Leu

Ser

130 135 140

Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:98:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 21 aminorūgštis (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas

196 (v) FRAGMENTO TIPAS: N-galinis His-tag (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:98:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro 1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met 20 (2) INFORMACIJA APIE SEQ ID NO:99:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:

(A) ILGIS: 20 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (v) FRAGMENTO TIPAS: N-galinis His-tag (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:99:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro 1 5 10 15

Arg Gly Ser Pro 20

197

Claims

1. Nutukimo (OB) polipeptidas, kuriame yra 145-167 aminorūgštys, galintis moduliuoti gyvūnų kūno svorį, turintis aminorūgščių seką, pavaizduotą SEQ ID NO:2 arba SEQ ID NO:4 arba jo aleliniai variantai, analogai arba fragmentai, turintys tą patį biologinį aktyvumą.

2. OB polipeptidas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis turi aminorūgščių seką SEQ ID NOS: 5 arba 6.

3. OB polipeptido pagal 1 punktą imunogeninis fragmentas.

4. OB polipeptido imunogeninis fragmentas, besiskiriantis tuo, kad jis yra pasirinktas iš:

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID

NO: 18);

Leu-His Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO:

19);

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20) ir

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-ProGlu-Cys (SEQ ID NO: 21).

5. Žmogaus OB polipeptido analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame viena arba daugiau aminorūgščių, pasirinktų iš 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110,118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 ir 166 aminorūgščių (pagal SEQ ID NO:4 numeraciją), yra pakeista kita aminorūgštimi.

6. Žmogaus OB polipeptido analogas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame pakeičiama nesutampančiomis su pelės OB polipeptido aminorūgštimis, kaip parodyta SEQ ID NO: 2.

7. Žmogaus OB polipeptido analogas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad pakeičiama alaninu.

8. Žmogaus OB polipeptido analogas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame:

198 (a) serino liekana 53 padėtyje yra pakeista glicinu, alaninu, valinu, cisteinu, metioninų arba treoninu;

(b) serino liekana 98 padėtyje yra pakeista glicinu, alaninu, valinu, cisteinu, metioninų arba treoninu; arba (c) arginino liekana 92 padėtyje yra pakeista asparaginu, lizinu, histidinu, glutaminu, glutamino rūgštimi, asparto rūgštimi, serinu, treoninu, metioninų arba cisteinu.

9. OB polipeptido analogas pagal 1 ir 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis turi 83 procentų arba didesnę aminorūgščių sekos homologiją su žmogaus OB polipeptido aminorūgščių seka, kuri parodyta SEQ ID NOS: 4 arba 6.

10 Žmogaus OB polipeptido analogas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame:

(a) viena arba daugiau asparto rūgšties liekanų yra pakeista glutamino rūgštimi;

(b) viena arba daugiau izoleucino liekanų yra pakeista alaninu;

(c) viena arba daugiau glicino arba valino liekanų yra pakeista alaninu;

(d) viena arba daugiau arginino liekanų yra pakeista histidinu;

(e) viena arba daugiau tirozino arba fenilalanino liekanų yra pakeista triptofanu;

(f) viena arba daugiau iš 121-128 liekanų (pagal SEQ ID NO: 4 numeraciją) yra pakeista glicinu arba alaninu; arba (g) viena arba daugiau liekanų, esančių 54-60 arba 118-166 padėtyse (pagal SEQ ID NO: 4 numeraciją) yra pakeista lizinu, glutamino rūgštimi, cisteinu arba prolinu.

11. OB polipeptidas pagal bet kurį iš 1, 2, 3, 5, 6 arba 9 punktų, besiskiriantis tuo, kad:

(a) jis turi pašalintas 1-21 liekanas; ir (b) jis yra (a) poskyrio polipeptidas, turintis metioniną 21 padėtyje; arba turintis glicino-serino-histidino-metionino seką (SEQ ID NO: 38) 18-21 padėtyse; arba turintis metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidinoserino-serino-glicino-leucino-valino-prolino-arginino-glicino-serino-histidino-metionino seką (SEQ ID NO: 98) 1-21 padėtyse.

12. OB polipeptidas, besiskiriantis tuo, kad jis turi SEQ ID NO:4 pavaizduotas 22167 aminorūgštis, ir, esant reikalui, N-galinį metioniną.

199

13. OB polipeptidas pagal bet kurį iš 1, 2, 3, 5, 6 arba 9 punktų, besiskiriantis tuo, kad:

(a) jis turi pašalintas 1-21 liekanas; arba (b) jis yra (a) poskyrio polipeptidas, turintis leucino-glutamino rūgšties-lizinoarginino- glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino seką (SEQ ID NO: 26) 14-21 padėtyse; arba turintis glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino seką (SEQ ID NO: 27) 18-21 padėtyse; arba turintis leucino-glutamino rūgšties-lizino-arginino seką (SEQ ID NO: 28) 18-21 padėtyse; arba turintis metionino-glicino-serino-serinohistidino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidino-serino-serino-glicino-leucinovalino-prolino-arginino-glicino-serino-prolino seką (SEQ ID NO: 99) 2-21 padėtyse; arba turintis glicino-serino-prolino seką 18-21 padėtyse.

14. OB polipeptidas pagal bet kurį iš 7, 8 arba 10 punktų, besiskiriantis tuo, kad:

(a) jis turi pašalintas 1-21 liekanas; arba (b) jis yra (a) poskyrio polipeptidas, turintis metioniną 21 padėtyje; arba turintis glicino-serino-histidino-metionino seką (SEQ ID NO:. 38) 18-21 padėtyse; arba turintis metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidinoserino-serino-glicino-leucino-valino-prolino-arginino-glicino-serino-histidino-metionino seką (SEQ ID NO:98) 1-21 padėtyse; arba turintis leucino-glutamino rūgšties-lizinoarginino-glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino seką (SEQ ID NO: 26) 1421 padėtyse; arba turintis glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino seką (SEQ ID NO: 27) 18-21 padėtyse; arba turintis leucino-glutamino rūgšties-lizino-arginino seką (SEQ ID NO: 28) 18-21 padėtyse; arba turintis metionino-glicino-serino-serinohistidino-histidino-histidino-histidino-histidino-histidino-serino-serino-glicino-leucinovalino-prolino-arginino-glicino-serino-prolino seką (SEQ ID NO: 99) 2-21 padėtyse; arba turintis glicino-serino-prolino seką 18-21 padėtyse.

15. OB polipeptido sutrumpintas analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame (pagal SEQ ID NO: 4 numeraciją):

(a) pašalinta viena arba daugiau liekanų, esančių 121-128 padėtyse;

(b) pašalintos 1-116 liekanos;

(c) pašalintos 1-21 ir 54-167 liekanos;

200 (d) pašalintos 1-60 ir 117-167 liekanos;

(e) pašalintos 1-60 liekanos;

(f) pašalintos 1-53 liekanos;

(g) pašalinta viena arba daugiau liekanų 121-128 padėtyse ir pašalintos 1-21 liekanos, arba (h) jis yra (a)-(g) poskyrių analogas, turintis N-galinę aminorūgštj arba aminorūgščių seką, pasirinktą iš grupės, susidedančios iš:

(1) metionino, (2) glicino-serino-histidino-metionino sekos (SEQ ID NO: 38), (3) metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidinohistidino-histidino-histidino-serino-serino-glicino-leucino-valino-prolino-arginino-glicinoserino- histidino-metionino sekos (SEQ ID NO:98), (4) leucino-glutamino rūgšties-lizino-arginino-glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino sekos (SEQ ID NO: 26), (5) glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino sekos (SEQ

ID NO: 27), (6) leucino-glutamino rūgšties-lizino-arginino sekos (SEQ ID NO: 28), (7) metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidinohistidino-histidino-histidino-serino-serino-glicino-Ieucino-valino-prolino-arginino-glicinoserino-prolino sekos (SEQ ID NO: 99); ir (8) glicino-serino-prolino sekos.

16. Rekombinantinis OB polipeptidas pagal bet kurį iš 1-15 punktų.

17. Chemiškai sintezuotas OB polipeptidas pagal bet kurį iš 1-15 punktų.

18. OB polipeptido pagal bet kurį iš 1-17 punktų chimerinė forma.

19. OB polipeptido darinys pagal bet kurį iš 1-18 punktų, besiskiriantis tuo, kad jame yra viena arba daugiau prie jo prijungtų cheminių grupių.

20. Darinys pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad prijungta cheminė grupė yra vandenyje tirpus polimeras.

21. Darinys pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis vandenyje tirpus polimeras yra polietilenglikolis.

201

22. Darinys pagal 21 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra mono-, di-. tri- arba tetra-polietilenglikolintas darinys.

23. Darinys pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra monopolietilenglikolintas N-gale.

24. Darinys pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra OB polipeptidas, turintis sekos SEQ ID NO:4 22-167 aminorūgščių liekanas, arba SEQ ID NO:6 22-166 aminorūgščių liekanas.

25. Darinys pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra OB polipeptidas, turintis sekos SEQ ID NO:4 22-167 aminorūgščių liekanas, arba sekos SEQ ID NO:6 22166 aminorūgščių liekanas ir turi metioniną 21 padėtyje.

26. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, besiskirianti tuo, kad ji koduoja OB polipeptidą pagal bet kurį iš 1-6, 9 arba 11 punktų.

27. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, besiskirianti tuo, kad ji koduoja OB polipeptidą pagal bet kurį iš 7, 8,10,13,14 arba 15 punktų.

28. DNR molekulė, skirta OB polipeptido, pasižyminčio žinduolio kūno svorio moduliavimo biologiniu aktyvumu, ekspresijai gauti, besiskirianti tuo, kad šią DNR pasirenka iš:

(a) DNR molekulių, parodytų SEQ ID NOS: 1 ir 3 arba jų fragmentų;

(b) DNR molekulių, kurios hibridizuojasi su DNR molekulėmis, apibrėžtomis (a) poskyryje, arba galinčių hibridizuotis jų fragmentų; ir (c) DNR molekulių, kurios koduoja aminorūgščių sekos, koduojamos bet kurios iš aukščiau minėti} DNR molekulių, ekspresiją.

29. DNR molekulė pagal 28 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra žmogaus genominė DNR molekulė, kurios seka yra SEQ ID NO: 22 ir 24.

30. DNR molekulė pagal 28 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja polipeptidą, turintį aminorūgščių seką, pasirinktą iš aminorūgščių sekų, kurios yra:

(a) SEQ ID NO:2;

(b) SEQ ID NO:2 22-167 aminorūgštys;

(c) SEQ ID NO:4;

(d) SEQ ID NO:4 22-167 aminorūgštys;

(e) SEQ ID NO:5

202 (f) SEQ ID NO:5 22-166 aminorūgštys;

(g) SEQ ID NO:6 (h) SEQ ID NO:6 22-166 aminorūgštys; ir (i) (b), (d), (f) arba (h) poskyrių aminorūgščių sekos, turinčios N-galinę aminorūgštj arba aminorūgščių seką, pasirinktą iš:

(1) metionino, (2) glicino-serino-histidino-metionino sekos (SEQ IID NO: 38), (3) metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidinohistidino-histidino-histidino-serino- serino-glicino-leucino-valino-prolino-arginino-glicinoserino-histidino-metionino sekos (SEQ ID NO:98).

31. DNR molekulė pagal 30 punktą, besiskirianti tuo, kad ji koduoja (b), (d), (f) arba (h) poskyrių aminorūgščių sekas, turinčias N-galinę aminorūgščių seką, pasirinktą iš:

(1) leucino-glutamino rūgšties-lizino-arginino-glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino sekos (SEQ ID NO: 26), (2) glutamino rūgšties-alanino-glutamino rūgšties-alanino sekos SEQ ID NO: 27), (3) leucino-glutamino rūgšties-lizino arginino sekos (SEQ ID NO: 28), (4) metionino-glicino-serino-serino-histidino-histidino-histidino-histidinohistidino-histidino-serino- serino-glicino-leucino-valino-prolino-arginino-glicino-serinoprolino sekos (SEQ ID NO: 99), ir (5) glicino-serino-prolino sekos.

32. DNR molekulė pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad ji turi seką, išdėstytą kaip baltymą koduojanti SEQ ID NO:3 seka.

33. DNR molekulė pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad ji turi seką, išdėstytą kaip SEQ ID NO:3 22-167 aminorūgštis koduojanti seka.

34. Detektuojama žyme pažymėta nukleino rūgšties molekulė, besiskirianti tuo, kad ji gali hibridizuotis su DNR molekule pagal bet kurį iš 26-33 punktų.

35. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad jame yra DNR molekulė pagal bet kurį iš 26-33 punktų.

36. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jame yra DNR molekulė pagal bet kurį iš 26, 28, 32 arba 33 punktų, operatyviai sujungta su ekspresijos kontroline seka.

203

37. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jame yra DNR molekulė pagal 29 arba 31 punktą, operatyviai sujungta su ekspresijos kontroline seka.

38. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jame yra DNR molekulė pagal 27 punktą, operatyviai sujungta su ekspresijos kontroline seka.

39. Vienaląstis šeimininkas, besiskiriantis tuo, kad jis yra transformuotas arba transfekuotas DNR molekule pagal 26 arba 27 punktą arba ekspresijos vektoriumi pagal bet kurį iš 35-38 punktų.

40. Vienaląstis šeimininkas pagal 39 punktą, besiskiriantis tuo, kad šį vienaląstį šeimininką pasirenka iš bakterijų, mielių, žinduolių ląstelių, augalų ląstelių, vabzdžių ląstelių ir žmogaus ląstelių audinio kultūroje.

41. Vienaląstis šeimininkas pagal 40 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis vienaląstis šeimininkas yra bakterija, pasirinkta iš E. coli, Pseudomonas, Bacillus, ir Streptomyces, žinduolio ląstelė, pasirinkta iš CHO, Rl.l, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 ir vabzdžio Sf9 ląstelės.

42. Vienaląstis šeimininkas pagal 40 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis vienaląstis šeimininkas yra mielės, pasirinktos iš Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula ir Torulopsis.

43. Žinduolio ląstelė, besiskirianti tuo, kad ji turi OB polipeptidą koduojančią DNR seką, ir yra modifikuota in vitro taip, kad duoti} didesnę OB polipeptido ekspresiją homologinės rekombinacijos, kurią sudaro ekspresijos reguliatorinės sekos įterpimas betarpiškai prie OB polipeptidą koduojančios sekos, būdu.

44. Ląstelė pagal 43 punktą, besiskirianti tuo, kad joje esanti ekspresijos reguliatorinė seka, ir homologinė rekombinacija pakeičia mutantinio OB polipeptido ekspresijos reguliatorinę seką.

45. Ląstelė pagal 43 punktą, besiskirianti tuo, kad joje esančios ekspresijos reguliatorinės sekos intarpas nėra OB polipeptido reguliatorinė seka.

46. OB polipeptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina:

(a) ląstelės pagal bet kurį iš 39-45 punktų kultivavimas sąlygose, kuriose vyksta OB polipeptido ekspresija; ir (b) ekspresuoto OB polipeptido išskyrimas.

204

47. Būdas pagal 46 punktą, besiskiriantis tuo, kad ląstelė yra bakterija arba mielės.

48. Būdas pagal 46 arba 47 punktą, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina dar ir:

(c) OB polipeptido chromatografavimas per Ni-chelatus sudarančią kolonėlę; ir (d) OB polipeptido valymas, panaudojant gel-filtraciją.

49. Būdas pagal 48 punktą, besiskiriantis tuo, kad po (c) stadijos ir prieš (d) stadiją dar atliekamas OB polipeptido chromatografavimas per stiprių katijonitų kolonėlę.

50. Antikūnas, besiskiriantis tuo, kad jis yra specifinis OB polipeptidui pagal bet kurį iš 1-18 punktų, arba polipeptidui, gautam 46-49 punktuose apibrėžtu būdu.

51. Antikūnas pagal 50 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra monokloninis arba polikloninis antikūnas.

52. Antikūnas pagal 51 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra pažymėtas detektuojama žyme.

53. Gyvybingų ląstelių linija, besiskirianti tuo, kad ji produkuoja monokloninį antikūną pagal 51 punktą.

54. OB polipeptidui specifinio antikūno gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina:

(a) OB polipeptido pagal bet kurį iš 1-18 punktų ir/arba polipeptido, gauto 4649 punktuose apibrėžtu būdu, konjugavimas su baltymu-nešikliu;

(b) gyvulio-šeimininko imunizavimas (a) stadijos O B polipeptido fragmentobaltymo-nešiklio konjugatu, sumaišytu su stimuliatoriumi; ir (c) antikūno išgavimas iš imunizuoto gyvulio-šeimininko.

55. OB polipeptido buvimo nustatymo mėginyje būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina:

(a) mėginio, kuriame gali būti OB polipeptido, sąlytis su antikūnu, kuris specifiškai jungiasi su OB polipeptidu sąlygose, leidžiančiose susidaryti reakcijos kompleksams tarp antikūno ir OB polipeptido; ir (b) antikūno ir mėginyje esančio OB polipeptido reakcijos kompleksų susidarymo nustatymas; šis reakcijos kompleksų susidarymas rodo, kad mėginyje yra OB polipeptido.

205

56. Būdas pagal 55 punktą, besiskiriantis tuo, kad antikūną prijungia prie kieto pagrindo.

57. OB polipeptido kiekio biologiniame mėginyje nustatymo in vitro būdas, besiskiriantis tuo, kad j jj įeina:

(a) reakcijos kompleksų biologiniame mėginyje susidarymo detektavimas pagal 55 arba 56 punktą; ir (b) susidariusių kompleksų kiekio įvertinimas; šis reakcijos kompleksų kiekis atitinka OB polipeptido kiekį biologiniame mėginyje.

58. Žinduolių ligos, susijusios su padidintais arba sumažintais OB polipeptido kiekiais, nustatymo arba diagnozavimo in vitro būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina:

(a) OB polipeptido kiekio įvertinimas biologiniame mėginyje iš žinduolio organizmo pagal 57 punktą; ir (b) kiekio, nustatyto (a) stadijoje, palyginimas su OB polipeptido kiekiu, esančiu normaliame subjekte, arba tiriamame subjekte ankstesniu laiku; OB polipeptido kiekio padidėjimas, lyginant su normaliais kiekiais, rodo ligą, susijusią su padidintais OB polipeptido kiekiais, o OB polipeptido kiekio sumažėjimas, lyginant su normaliais kiekiais, rodo ligą, susijusią su sumažintais OB polipeptido kiekiais.

59. Žinduolių ligos, susijusios su padidintais arba sumažintais OB polipeptido kiekiais, terapinio gydymo kontroliavimo in vitro būdas, besiskiriantis tuo, kad biologinių mėginių, gautų iš žinduolio, kuris yra gydomas nuo ligos, susijusios su padidintais arba sumažintais OB polipeptido kiekiais, serijoje nustato OB polipeptido kiekius pagal 57 punktą.

60. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina OB polipeptidas pagal bet kurį iš 1-18 punktų, arba OB polipeptidas, gautas 46-49 punktuose apibrėžtu būdu ir farmaciškai tinkamas nešiklis.

61. Farmacinė kompozicija pagal 60 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra skirta gyvūno kūno svorio sumažinimui.

62. Farmacinė kompozicija, skirta gyvūno kūno svorio padidinimui, besiskirianti tuo, kad į ją įeina OB polipeptido pagal bet kurį iš 1-18 punktų arba OB polipeptido, gauto 46-49 punktuose apibrėžtu būdu, antagonistas ir farmaciškai tinkamas nešiklis.

63. Farmacinė kompozicija pagal 62 punktą, besiskirianti tuo, kad antagonistą pasirenka iš antikūno, kuris susijungia ir neutralizuoja OB polipeptido aktyvumą, OB polipeptido fragmento, kuris susijungia, bet neaktyvuoja OB polipeptido receptoriaus, ir OB polipeptido antagonisto, kuris yra maža molekulė.

64. Antiprasminės nukleino rūgšties molekulės, hibridizuojamos su nukleino rūgštimi, koduojančia OB polipeptidą pagal bet kurį iš 1-4 arba 9 punktų, panaudojimas vaisto, skirto žinduolių kūno svorio modifikavimui, gamyboje.

65. Nukleino rūgšties molekulės, koduojančios OB polipeptidą pagal bet kurį iš 118 punktų ir/arba OB polipeptidą, gautą 46-49 punktuose apibrėžtu būdu, panaudojimas genų terapijos vaisto, skirto gyvūno kūno svoriui modifikuoti, gamyboje.

66. OB polipeptido pagal bet kurį iš 1-18 punktų, ir/arba OB polipeptido, gauto 46-49 punktuose apibrėžtu būdu, panaudojimas vaisto, skirto gyvūno kūno svoriui modifikuoti, gamyboje.

67. OB polipeptido panaudojimas pagal 66 punktą vaisto skirto sutrikimų, pasirinktų iš diabeto, aukšto kraujospūdžio ir aukšto cholesterolio kiekio, gydymui, gamyboje.

68. OB polipeptido panaudojimas pagal 66 punktą vaisto kombinacijoje su vaistu, skirtu diabeto, aukšto kraujospūdžio ir aukšto cholesterolio kiekio gydymui, gamyboje.

69. OB polipeptido pagal bet kurį iš 1-18 punktų, ir/arba OB polipeptido, gauto 46-49 punktuose apibrėžtu būdu, antagonisto panaudojimas vaisto, skirto gyvūno kūno svoriui padidinti, gamyboje.

70. Panaudojimas pagal 69 punktą, besiskiriantis tuo, kad antagonistą pasirenka iš antikūno, kuris jungiasi ir neutralizuoja OB polipeptido aktyvumą, OB polipeptido fragmento, kuris jungiasi, bet neaktyvuoja OB receptoriaus, ir OB polipeptido antagonisto, kuris yra maža molekulė.

71. Panaudojimas pagal bet kurį iš 66-70 punktų, besiskiriantis tuo, kad vaistas yra skirtas intraveniniam, intraarteriniam, intraperitoniniam, intraraumeniniam, subkutaniniam, peroraliniam arba pulmonariniam vartojimui.