PT777732E

PT777732E - Moduladores de peso de corpo, ácidos nucleicos e proteínas correspondentes e usos diagnóstico e terapêutico dos mesmos

Info

Publication number: PT777732E
Application number: PT95929591T
Authority: PT
Inventors: Jeffrey M Friedman; Yiying Zhang; Ricardo Proenca; Margherita Maffei; Jeffrey L Halaas; Ketan Gajiwala; Stephen K Burley
Original assignee: Univ Rockefeller
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 2012-01-09
Also published as: LT4265B; US20030040039A1; US7994301B2; CN102002102A; ATE526408T1; US20090318677A1; SI0777732T1; EP2402444A1; US8173793B2; CO4410343A1; US5935810A; US6734160B2; US6001968A; LT97020A; US20110218332A1; ZA956868B; IL188522A0; IL162093A; US20040214214A1; US7521258B2

Description

ΡΕ0777732 1

DESCRIÇÃO

"MODULADORES DE PESO de corpo, ÁCIDOS NUCLEICOS E PROTEÍNAS CORRESPONDENTES E USOS DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICO DOS MESMOS"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se de um modo geral ao controle de peso de mamíferos incluindo animais e seres humanos, e mais particularmente a materiais identificados aqui como moduladores de peso, e aos usos diagnóstico e terapêutico para os quais tais moduladores podem ser postos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Obesidade, definida como um excesso de gordura de corpo em relação à massa de corpo magra, está associada com importantes morbidades psicológicas e médicas, as últimas incluindo hipertensão, teor elevado de lipídios no sangue, e diabetes melitUs do Tipo II ou não-dependentes de insulina (NIDDM). Há 6 - 10 milhões de indivíduos com NIDDM nos E.U.A., incluindo 18% da população de 65 anos de idade [Harris e outros., Int. J. Obes., 11:275-283(1987)]. Cerca de 45% de homens e 70% das mulheres com NIDDM são obesos, e sua diabetes é substantialmente aperfeiçoada ou eliminada 2 ΡΕ0777732 por redução de peso [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648 (1991)]. Como descrito abaixo, tanto a obesidade quanto a NIDDM são fortemente herdáveis, embora os genes de predisposição não tenham sido identificados. A base genética molecular desses distúrbios metabolicamente relacionados é um problema importante, pobremente entendido. A assimilação, o armazenamento, e a utilização de energia nutriente constituem um complexo sistema homeostá-tico central para a sobrevivência de metazoários. Entre mamíferos que vivem na terra, o armazenamento, em tecido adiposo, de grandes quantidades de combustível metabólico como triglicerídeos é crucial para a sobrevivência de períodos de privação de alimento. A necessidade de se manter um nível fixo de reservas de energia sem alterações contínuas no tamanho e na forma do organismo requer que se atinja um equilíbrio entre absorção e gasto de energia. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam o equilíbrio de energia permanecem à espera de serem elucidados. 0 isolamento de moléculas que transduzem informação nutricional e controlam o equilíbrio de energia serão críticos para um entendimento da regulação de peso de corpo na saúde e na doença. 0 nível de adiposidade de um indivíduo é, em uma grande extensão, geneticamente determinado. 0 exame das taxas de concordância de peso de corpo e adiposidade entre gêmeos mono- e dizigotos ou aceitáveis e seus pais biológicos tem sugerido que a hereditabilidade de obesidade (0,4 3 ΡΕ0777732 - 0,8) excede aquela de muitos outros traços que comumente se pensa que têm um componente genético substancial, tais como esquizofrenia, alcoolismo, e aterosclerose [Stunkard e outros, N. Engl. J. Med., 322 : 1483 - 1487 (1990)]. Similaridades familiares nas taxas de gasto de energia têm sido também relatadas [Bogardus e outros., Diabetes, 35 : 1 - 5 (1986)]. Análise genética em populações geograficamente delimitadas tem sugerido que um número relativamente pequeno de genes pode ser responsável pelos 30 - 50% de variância na composição de corpo [Moll e outros., Am. J. Hum. Genet. , 49 : 1243 - 1255 (1991)]. No entanto, nenhum dos genes responsáveis por obesidade na população em geral foi geneticamente mapeado para uma localização cromossomal definida.

Modelos de obesidade em roedores incluem sete mutações de aparentemente um único gene. As mutações de obesidade de murino mais intensamente estudadas são os genes de OB (obeso) e db (diabetes) . Quando presentes na mesma base de cepa genética, OB e db resultam em indistinguíveis fenótipos metabólicos e comportamentais, sugerindo que esses genes podem funcionar na mesma trajetória fisiológica [Coleman e outros., Diabetologia, 14 : 141 - 148 (1978)]. Murinos homozigotos para qualquer mutação são hiperfágicos e hipometabólicos, levando a um fenótipo obeso que é notável a um mês de idade. O peso desses animais tende a se estabilizar em 60 - 70 g (comparado com 30 - 35 g em murinos de controle) . Animais OB e db manifestam uma miríade de outras mudanças hormonais 4 ΡΕ0777732 e metabólicas que tornaram difícil a identificação do defeito primário atribuível à mutação [Bray e outros., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].

Cada um dos modelos de obesidade em roedores é acompanhado por alterações no metabolismo de carbohidratos semelhantes àquelas na diabetes Tipo II no ser humano. Em alguns casos, a severidade da diabetes depende em parte da cepa de murino de base [Leiter, Endocrinology, 124 : 912 -922 (1989)] . Para ambos OB e db, murinos congênicos C57BL/Ks desenvolvem uma severa diabetes com necrose de célula beta final e atrofia de ilhota, resultando em uma relativa insulinopenia. Inversamente, murinos congênicos C57BL/6J OB e db desenvolvem uma diabetes transiente insulina-resistente que é finalmente compensada por hipertrofia de célula beta que se assemelha a diabetes humana do Tipo II. 0 fenótipo de murinos de OB e de db assemelha-se à obesidade humana em caminhos diferentes do desenvolvimento de diabetes - os murinos mutantes comem mais e gastam menos energia do que os controles (como o fazem os obesos seres humanos) . Este fenótipo é também bastante similar àquele visto em animais com lesões do hipotálamo ventro-medial, o que sugere que ambas as mutações podem interferir com a capacidade de adequadamente integrar ou responder à informação nutricional dentro do sistema nervoso central. Suporte para esta hipótese vem dos resultados de experiências de parabiose [Coleman, Diabetologia, 9 : 294 - 5 ΡΕ0777732 298 (1973)] que sugerem que murinos de OB são deficientes em um fator de saciedade circulante e que murinos de db são resistentes aos efeitos do fator de OB (possivelmente devido a um defeito do receptor de OB). Essas experiências levaram à conclusão de que a obesidade nesses murinos mutantes pode resultar de diferentes defeitos em um centro aferente de loop e/ou integrativo do postulado mecanismo de feedback que controla a composição de corpo.

Usando-se marcadores genéticos clássicos e moleculares, os genes de OB e genes de db foram mapeados para o cromossoma 6 proximal e midcromossoma 4, respectivamente [Bahary e outros., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 87 : 8642 -8646 (1990); Friedman e outros., Genomics, 11 : 1054 - 1062 (1991)]. Em ambos os casos, as mutações mapeiam para regiões do genoma de murino que são sintênicas com seres humanos, sugerindo que, se há homólogos seres humanos de OB e db, eles provavelmente devem mapear, respectivamente, para os cromossomas seres humanos 7q e lp. Defeitos no gene de db podem resultar em obesidade em outras espécies de mamíferos: em cruzamentos genéticos entre ratos Zucker fa/fa e ratos Brown Norway + / +, a mutação fa (cromossoma de rato 5) é flanqueada pelos mesmos locais que flanqueiam db em murinos [Truett e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 : 7806 - 7809 (1991)] .

Devido à miríade de fatores que parecem impactar o peso de corpo, não tem sido possível predizer quais fatores e, mais particularmente, quais mecanismos homeos- 6 ΡΕ0777732 táticos, são principalmente determinativos de peso de corpo. Assim, o principal problema subjacente à presente invenção é prover moduladores de peso de corpo que permitam o controle de adiposidade e o teor de gordura de mamíferos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção o problema de controle de adiposidade e teor de gordura de animais, particularmente mamíferos, foi resolvido através da provisão de polipeptídeos de obesidade (OB), capazes de modular o peso de corpo, seleccionados a partir do grupo: (a) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ou 6; (b) um fragmento biologicamente activo do polipeptídeo de (a), em que o referido fragmento biologicamente activo modula o peso de corpo do animal. A presente invenção diz ainda respeito a moléculas de ácido nucleico que codificam para um polipeptídeo OB como descrito anteriormente, assim como vetores que compreendem uma molécula de DNA respectiva e hospedeiros unicelulares transformados ou transfectados com uma molécula de DNA respectiva.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a métodos para a preparação de um polipeptídeo de 7 ΡΕ0777732 OB, tal como anteriormente definido, que é capaz de modular o peso de corpo, em que o método compreende: (a) cultivar uma célula que comprende uma sequência de DNA que codifica para um polipeptídeo OB da presente invenção como descrito acima sob condições que provejam expressão do polipeptídeo de OB; e (b) recuperar o polipeptídeo de OB expresso.

De acordo com um outro modelo de realização, a presente invenção provê anticorpos específicos para um polipeptídeo OB que consiste numa sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ou 6, linhas de células imortais que produzem os respectivos anticorpos e métodos para a preparação dos respectivos anticorpos com especificidade para um polipeptídeo de OB, tal como anteriormente definido, em que o método compreende: (a) a conjugação de um polipeptídeo de OB, tal como anteriormente definido, para uma proteína veículo; (b) a imunização de um animal hospedeiro com o conjugado de proteína veículo - fragmento de polipeptídeo de OB da etapa (a) misturado com um auxiliar; e c) a obtenção de anticorpo a partir do animal hospedeiro imunizado. ΡΕ0777732 A presente invenção provê também métodos para a medição da presença de um polipeptídeo de OB, tal como anteriormente definido, em uma amostra, em que o método compreende: (a) o contacto de uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo de OB com um anticorpo que específicamente se liga ao polipeptídeo de OB sob condições que permitem a formação de complexos de reação que compreende o anticorpo e o polipeptídeo de OB; e (b) a deteção da formação de complexos de reação que compreendem o anticorpo e o polipeptídeo de OB na amostra, em que a deteção da formação de complexos de reação indica a presença de polipeptídeo de OB na amostra.

Outro modelo de realização da invenção diz respeito a métodos in vitro para a avaliação do nível de polipeptídeo de OB, tal como anteriormente definido, em uma amostra biológica, em que o método compreende: (a) a deteção da formação de complexos de reação em uma amostra biológica de acordo com o método indicado acima; e (b) a avaliação da quantidade de complexos de reação formados, quantidade de complexos de reação essa que corresponde ao nível de polipeptídeo de OB na amostra biológica. 9 ΡΕ0777732

De acordo com um modelo de realização alternativo, a presente invenção proporciona métodos in vitro para a deteção ou do diagnóstico da presença de uma doença associada com níveis elevados ou aumentados de polipeptídeo de OB num indivíduo mamífero que compreende: (a) avaliação do nível de polipeptídeo de OB numa amostra biológica de um indivíduo mamífero como descrito acima; (b) comparação do nível detectado na etapa (a) com o nível de polipeptídeo de OB presente em indivíduos normais ou no indivíduo em um tempo anterior, em que um aumento no nível de polipeptídeo de OB quando comparado com níveis normais indica uma doença associada com níveis elevados de polipeptídeo de OB e um nível diminuído de polipeptídeo de OB quando comparado com níveis normais indica uma doença associada com níveis diminuídos de polipeptídeo de OB.

Outro método in vitro para a monitoração de tratamento terapêutico de uma doença associada com níveis elevados ou diminuídos de polipeptídeo de OB, como definido acima, em um indivíduo mamífero, compreende a avaliação dos níveis de polipeptídeo de OB em uma série de amostras biológicas obtidas em pontos de tempo diferentes a partir de um indivíduo mamífero sofrendo de um tratamento 10 ΡΕ0777732 terapêutico de uma doença associada com níveis elevados ou diminuídos de polipeptídeo de OB, como definido acima.

Outro aspecto da incenção dei respeito a composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo de OB como descrito acima juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também provê composições cosméticas de aperfeiçoamento de aparência de corpo para redução de peso de corpo de um indivíduo que compreendem um polipeptídeo de OB como descrito acima juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Alternativamente, invenção é dirigida para uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de OB como descrito acima para a modificação de peso de corpo de um animal.

Num outro modelo de realização a invenção provê um polipeptídeo de OB como descrito acima para utilização na modificação do peso de corpo de um animal. O polipeptídeo pode ser utilizado para o tratamento de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diabetes, pressão sanguínea alta e colesterol alto.

Outros modelos de realização da presente invenção são descritos nas reivindicações. 11 ΡΕ0777732

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 (A até E) mostra a sequência de ácido nucleico (SEQ ID N°:l) e sequência de aminoácidos deduzidos (SEQ ID N°:2) derivado para cDNA de OB de murino. Um lider 5' de 39 pares de base foi seguido por um quadro de leitura aberto de aminoácido 167 previsto e uma sequência não-traduzida 3' de aproximadamente 3,7 kb. (No pedido de patente anteriormente depositado n° de série 08/347/563, depositado em 30 de novembro de 1994 e n° de série 08/438.431, depositado em 10 de maio de 1995, uma sequência de não-codificação 5' de 58 bases adicionais foi determinada, subsequentemente, a ser um artefato de clonagem. Este artefato não tem nenhuma conexão sobre a região de codificação, a região de não-codificação 5' de 39 bases presentemente mostrada na figura 1, ou região de não-codificação 3' do gene). Um total de cerca de 2500 pares de base da sequência não-traduzida 3' é mostrada. Análise da sequência de proteínas previstas por observação e por uso do programa de computador SigSeq indica a presença de uma sequência de sinais (sublinhado). Microheterogenidade do cDNA foi observado em que cerca de 70% do cDNAs tem um códon de glutamina no códon 49 e 30% não (ver as figuras 5 e 6, infra) . Este aminoácido é sublinhado, como é o códon de arginina que é mutado em murinos de C57BL/6J de OB/OB (murinos de 1J). A FIGURA 2 (A e B) mostra a sequência de ácido nucleicos (SEQ ID N°:3) derivada para o cDNA de OB ser 12 ΡΕ0777732 humano. Os nucleotídeos são numerados a partir de 1 a 701 com um sítio incial no nucleotídeo 46 e uma terminação no nucleotídeo 550. A FIGURA 3 mostra a sequência de aminoácidos totalmente deduzida (SEQ ID N°:4) derivada do gene de OB ser humano correspondendo à sequência de ácido nucleicos da figura 2A e B. Os aminoácidos são numerados de 1 a 167. Um sitio de clivagem de sequência de sinal é localizado depois do aminoácido 21 (Ala) de modo que a proteína madura estende-se a partir do aminoácido 22 (Vai) para o aminoácido 167 (Cys). A FIGURA 4 mostra a comparação entre as sequências de aminoácidos de (SEQ ID N°:2) de murino e de (SEQ ID N°:4) ser humano. A sequência da sequência de aminoácidos deduzidos de OB ser humano era altamente homóloga àquela de murino. Mudanças conservadoras são observadas por um hífen, e mudanças não conservadoras por um asterisco. 0 códon de glutamina variável é sublinhado, quando está na posição da mutação sem sentido em murinos de C57B1/6J de OB/OB (1J). Além de tudo, há 83% de identidade no nível de aminoácido, embora apenas oito substituições fossem encontradas entre a valina no códon 22 (imediatamente a jusante do excesso de sequência de sinais) e a cisteína na posição 117. A FIGURA 5 mostra a sequência de aminoácidos de comprimento completo (SEQ ID N°:5) derivada para o gene de 13 ΡΕ0777732 OB de murino como mostrado na figura 3, mas faltando glutamina na posição 49. Os aminoácidos são numerados a partir de 1 a 166. Um sitio de clivagem de sequência de sinais é localizado depois do aminoácido 21 (Ala) (e assim, antes da deleção de glutamina 49) de modo que a proteína madura se estende a partir do aminoácido 22 (Vai) para o aminoácido 166 (Cys). A FIGURA 5 mostra a sequência de aminoácidos de comprimento completo deduzido (SEQ ID N° : 6) derivada para o gene de OB de murino como mostrado na figura 4, mas faltando glutamina na posição 49 . Os aminoácidos são numerados a partir de 1 a 16 6. Um sítio de clivagem de sequência de sinais é localizado depois do aminoácido 21 (Ala) (e assim, antes da deleção de glutamina 49) de modo que a proteína madura se estende a partir do aminoácido 22 (Vai) para o aminoácido 166 (Cys). A FIGURA 7 (A) mapa físico da localização de OB no cromossama de murino, e os mapas de clonagem de YAC e de PI. "M e N" correspodem a sítios de restrição MulI ou NotI. Os números correspondem a animais individuais que eram recombinantes na região de OB das 1606 meioses que são contadas. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl3, e Cpa referem-se a localizações na região de OB que se ligam às sondas de DNA. YACs foram isolados usando-se D6Rckl3 e Pax-4 como sondas, e as extremidades foram recuperadas usando-se PCR "vectorette" e/ou resgate de extremidade de plasmídeo e usadas, por sua vez, para isolar novos YACS. (B) O "contig" 14 ΡΕ0777732 de YAC resultante. Um dos YACs neste "contig", Y902A0925, era quimérico. Cada uma das sondas usadas para genotipar os animais recombinantes é indicada entre parênteses. (6) Corresponde a YAC 107; (5) corresponde a M16(+) (ou M16(pLUS)); (4) corresponde a adu(+); (3) corresponde a aad(pICL); (2) corresponde a 53(pICL); e (1) corresponde a 53( + ) . (c) O "contig" de PI de bacteriófagos de clones PI isolados com sondas de extremidade de YAC isoladas. O gene OB foi isolado em um clone PI isolado usando-se a extremidade distai de YAC YB6S2F12 (extremidade (4)) (alternativamente designado aqui adu(+)). A FIGURA 8 apresenta uma fotografia de uma cepa de brometo de etideo de 192 isolados independentes da quarta experiência de captura de éxon que foram ampliados por PCR e foram caracterizados. A FIGURA 9 é uma fotografia de uma cepa de brometo de etideo de clones ampliados por PCR suspeitos de portar OB. Cada um dos 7 clones que não portava o artefato foi reampliado usando-se PCR e foi submetido a eletroforese sobre um gel de agarose a 1 % em TBE e foi manchado com brometo de etideo. O tamanho dos marcadores (raia não-numerada na extrema esquerda) são os comercialmente disponíveis "ladder 1 kB ". Raia 1 -- clone 1D12, contendo uma "sequência de HIV ." Raia 2 -- clone 1F1, um clone novo do lado de fora da região. Raia 3 - clone 1H3. Raia 4 clone 2B2, que é idêntico a 1F1. Raia 5 -- clone 2G7, que contém um éxon OB. Raia 6 -- clone 2G1 1, que é idêntico a 1F1. Raia 7 — clone 2H1, que não contém um iserto. 15 ΡΕ0777732 A FIGURA 10 apresenta a sequência de clone 2G7 (SEQ ID N°:7), que inclui um éxon que codifica para uma parte do gene de OB. As sequências de iniciadores usadas para ampliar este éxon são colocadas em destaque na figura (SEQ ID N°:8 e 9). A FIGURA 11 (A) análise de transcrição de PCR reversa de mRNA a partir de tecidos diferentes do mesmo murino com os iniciadores de 2G7 e iniciadores de actina. As reações de RT-PCR foram realizadas usando-se 100 ng de RNA total reverso transcrito com oligo dT como um iniciador para o primeiro filamento de síntese de cDNA. Ampliação de PCR foi realizada por 35 ciclos com desnaturação a 94° para 1'; hibridização a 55° para 1'; e extensões a 72°C para 2' com uma segunda autoextensão de 1' por ciclo. Produtos de RT-PCR foram analisados em um gel de agarose de ponto de fusão baixo de 2% corrido em tampão 1 x TBE. (B) Northern blot de mRNA de diferentes órgãos do murino usando 2G7 marcado por PCR como uma sonda. Dez μg de RNA total de cada um dos tecidos foi submetido a eletroforese sobre um gel de agarose com formaldeído. A sonda foi hibridizada a 65°C em Rapid Hybe (Amersham). Sinais auto-radiográficos eram evidentes depois de 1 hora de exposição; a experiência mostrada foi o resultado de uma exposição de 24 horas. A FIGURA 12 (A) Uma mancha de brometo de etídeo de uma reação de RT-PCR sobre RNA de célula de gordura (tecido adiposo branco) de cada uma das cepas de murino 16 ΡΕ0777732 listadas. RNA total (100 ng) para cada amostra foi reversamente transcrito usando oligo DT e transcriptase reversa, e o cDNA de filamento único resultante foi ampliado por PCR com os iniciadores 2G7 (faixas inferiores) ou iniciadores de actina (faixas superiores). Tanto os iniciadores 2G7 quanto os iniciadores de actina foram incluídos na mesma reação de PCR. Os produtos foram corridos sobre um gel de agarose TBE a 1%. (B) Análise

Northern correspondendo a (A) . Dez μρ de RNA de célula de gordura (tecido adiposo branco) de cada uma das cepas indicadas foram corridos e sondados com a sonda 2G7 marcada por PCR como na Figura 11B, acima. Um aumento de cerca de 2 0 vezes no nível de mRNA de 2G7 era evidente em RNA de gordura branca da cepa C57BL/6J de OB/OB (1J) relativa a companheiros de ninhada magros. Tanto nas experiências de RT-PCR quanto nas experiências Northern não houve sinal detectável em RNA de 2G7 de murinos de SM/Ckc-+Dacob2/J/ob2/J (2J) mesmo depois de uma exposição de 2 semanas. Uma exposição auto-radiográfica é mostrada. 0 mesmo filtro foi hibridizado para uma sonda de actina (porção de fundo do painel). A FIGURA 13 é uma análise Northern de animais 2J adicionais e animais de controle que confirma a ausência do mRNA OB de animais 2J. A análise Northern foi realizadas como nas Figuras 11 e 12. Nesse caso, o RNA de controle era ap2, um transcrito específico de gordura. Não houve significância para a densidade variável das faixas de ap2. 17 ΡΕ0777732 A FIGURA 14 compara a sequência de DNA dos murinos de C57BL/6J (normais) e os murinos de C57BL/6J de OB/OB (1J) na região da mutação de ponto que leva à introdução de um códon de parada prematuro (mutação sem sentido) no cDNA de cepa mutante. Os murinos de OB/OB tinham uma mutação C^-T que mudou um resíduo de arginina na posição 105. Essa mudança de base é mostrada como a produção do sequenciador de DNA automatizado. RT-PCR foi realizado usando RNA de gordura branca de ambas as cepas (+/+ e OB/OB) usando-se iniciadores das regiões 5'e 3' não-traduzidas. Os produtos de reação de PCR foram purificados com gel e diretamente sequenciados manualmente e usando um sequenciador automatizado 373A da Applied Biosystems, Inc. com iniciadores ao longo de ambos os filamentos da sequência de codificação. A FIGURA 15 (A) Southern blot de DNA genômico de cada uma das cepas de murino listadas. Cerca de 5 μρ de DNA (derivado de DNA genômico preparado a partir de fígado, rim ou baço) foi digerido por restrição com a enzima de restrição indicada. O DNA foi então submetido a eletroforese em gel de agarose de TBE a 1% e sondado com 2G7 marcado por PCR. Digestão de restrição com BglII revelou um aumento no tamanho de um fragmento de BglII de cerca de 9kB (o maior) em DNA de SM/Ckc-+Dacob2/J/ob2/J (2J). RFLPs não eram detectáveis com qualquer outra enzima de restrição. Mapeamento de restrição preliminar de DNA genômico indicou que o sítio BglII polimórfico está cerca de 7 kB a montante do sítio de partida de transcrição. 18 ΡΕ0777732

Nenhuma das outras enzimas testadas estendeu-se além do sítio de partida de mRNA. (B) Segregação de polimorfismo de BglII na cepa de SM/Ckc-+Dacob2/ob2. Seis proles obesas e cinco proles magras da mesma geração da colónia de SM/Ckc-+Dacob2/J/ob2/J (2J) coisogênica foram genotipadas por contagem do polimorfismo de BglII como mostrado em (A). Todos os animais fenotipicamente obesos eram homozigotos para o alelo maior do fragmento de BglII polimórfico. 0 DNA da raia de "controle" foi preparado a partir de um murino de SM/Ckc-+Dac+/+, criado separadamente da colónia de SM/Ckc-+Dacob2/ob2. A FIGURA 16 é uma Southern blot de DNA genômico digerido com EcoRI de espécies listadas, usando um cDNA OB como uma sonda (isto é, um "zoo blot"). Sinais de hibridização eram detectáveis em cada amostra de vertebrado, mesmo depois de uma hibridização de severidade moderada. 0 DNA de gato nessa experiência estava levemente degradado. 0 DNA restringido foi corrido em um gel de agarose TBE a 1%, e transferido para uma membrana de imobilona para sondagem. 0 filtro foi hibridizado a 65°C e lavado em 2X SSC/SDS a 0,2% a 65°C duas vezes por vinte minutos e exposto por 3 dias usando-se filme X-OMAT da Kodak (Rochester, N.Y.). A FIGURA 17 apresenta a região de clonagem de expressão de vetor pET-15b (Novagen) (SEQ ID N°S: 11 e 12). A FIGURA 18 apresenta a análise do eluato de uma 19 ΡΕ0777732 coluna de resina (Ni) de ligação de His para uma fusão de OB de murino maduro recombinante a um His-tag (A) e fusão de OB ser humano maduro a um His-tag (B) . Bactérias foram transformadas com vetores pETM9 e pETH14, respectivamente. Após indução com IPTG a 1 mM em condições ótimas, as bactérias transformadas eram capazes de produzir 100 - 300 μρ/ml de proteína de fusão de OB, principalmente nos corpos de inclusão. Os corpos de inclusão foram solubilizados com HCl-guanidina a 6M ou uréia, e proteina de fusão (presente no sobrenadante de lise) foi carregada sobre a coluna de resina de ligação de His (Ni) em 10 ml de 1 x tampão de ligação com uréia. A coluna foi eluída por etapas com alíquotas de 5 ml de imidazol a 20 μΜ, 60 μΜ e 300 μΜ, e finalmente com tampão de tira. As alíquotas foram analisadas quanto a presença de fusão de polipeptídeo de OB sobre um gel de acrilamida a 15%. Cada raia contém o equivalente de 100 μΐ de extrato bacteriano. A FIGURA 19 (A) Tradução in vitro de RNA de OB. Um cDNA de OB foi subclonado para dentro do vetor de pGEM. O plasmídeo foi linearizado e mais RNA de filamento foi sintetizado usando polimerase de Sp6. O RNA sintetizado in vitro foi traduzido na presença ou ausência de membranas microssomais pancreáticas caninas. Um produto de tradução primária de 18 kD foi visto depois de tradução in vitro. A adição de membranas microssomais à reação levou ao aparecimento de um segundo produto de tradução cerca de 2 kD menor do que o produto de tradução primária. O tamanho do produto de tradução de RNA de interleucina-lalfa, que 20 ΡΕ0777732 carece de uma sequência de sinal codificada, não foi mudado pela adição de membranas microssomais. Esses dados indicaram a presença de uma sequência de sinal funcional. (B) Tradução in vitro na presença ou ausência de proteínase K. Tratamento com protease resultou em completa proteólise do produto de tradução primária de 18 kD, enquanto que a forma de 16 kD processada não foi afetada. Permeabilização da microssoma com TRITON-X100 a 0,1% tornou sensível a protease a forma processada. Esses resultados indicam que o produto tinha se traduzido no lúmen do microssoma. A FIGURA 20 (A até E) A sequência do gene de OB ser humano (SEQ ID N°s: 22 e 24). (F) um diagrama esquemático do gene de OB de murino. (G) Um diagrama esquemático do gene de OB ser humano. Tanto em (F) quanto em (G) os códons de partida e de parada estão sublinhados. Não há evidência de um primeiro íntron homólogo para o primeiro íntron de murino no gene ser humano, mas sua existência não pode ser excluída. A FIGURA 21 apresenta um desenho esquemático de uma das estratégias de clonagem empregada para atingir expressão recombinante de OB em levedura Pichia. (A) Vetor de expressão de OB com uma sequência de sinal de fator de acasalamento alfa. (B) Desenho esquemático da estrutura da proteína de fusão recombinante, incluindo a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°:26) mostrando o sítio de Xhol e os sítios de clivagem putativa KEX-2 e STE-13, e os aminoácidos em excesso N-terminais presentes depois de 21 ΡΕ0777732 clivagem de KEX-2 (SEQ ID N°:27). (c) Uma estratégia alternativa para a produção de OB maduro envolve a preparação de uma sequência de aminoácidos correspondente a um sitio de clivagem de Xhol e um sítio de clivagem de KEX-2 imediatamente a montante da sequência de polipeptídeo de OB maduro (SEQ ID N°:28). A FIGURA 22 Estratégia de expressão alternativa em Pichia. (A) Vetor de expressão de uma fusão OB com um

His-tag adotado a partir do sistema de expressão de pET sob controle da sequência de sinal de fator de acasalamento alfa (SEQ ID N°:33). (B) Desenho esquemático da estrutura da proteína de fusão de OB recombinante contendo um His-tag, que inclui a sequência de sinal de fator de acasalamento alfa, os sítios de clivagem putativa de KEX-2 e STE-13, o His-tag, e um sítio de clivagem de trombina, que forneceria OB com três resíduos de aminoácidos N-terminais em excesso. A FIGURA 23 (A) análise de PAGE de expressão de OB de murino (ambas as formas microheterogêneas, isto é contendo e carecendo de Gin 49) em levedura de pichia transformada. A tira esperada de cerca de 16 kD é visível no fluido de cultura de levedura (segunda e terceira raias), mas não em fluido de cultura de levedura não transformada (primeira raia). (B) análise de PAGE de polipeptídeo de OB recombinante parcialmente purificado sobre carboximetil celulose, um trocador de cátion fraco. Um tira de cerca de 16 kD é muito visível em frações de 3 e 22 ΡΕ0777732 4 a partir da coluna, que foi eluida com NaCl a 250 mM.

Raia 1 --- amostra carregada; raia 2 --- fluxo passa; raia 3 - 5 -- frações eluidas com NaCl a 250 mM. A FIGURA 24 mostra que a proteína de OB circula em plasma de murino. (A) Imunoprecipitações de sangue de murino. 0,5 ml de plasma de murino foi pré-depurado com sefarose conjugadas e foi incubada de uma dia para o outro com anticorpos de anti-OB imunopurifiçados conjugados para contas de 4B de sefarose. O imunoprecipitado foi separado em gel de SDS-PAGE a 15%, foi transferido em Western blotted com um anticorpo de anti-OB. A proteína migrada com um peso molecular de cerca de 16 kD, na mesma posição que a proteína de OB de murino maduro expressou em levedura. A proteína estava ausente no plasma de murinos de C57B1/6J de OB/OB e foi aumentada dez vezes no plasma de murinos de C57B1B/Ks de db/db em relação a murinos de tipo selvagem. Murinos de db foram sugeridos a superprodução da proteína de OB, secundário a resistência de seus efeitos. (B) Níveis aumentados de OB em ratos gordurosos. O rato gordo é obeso como um resultado de uma mutação recessiva sobre o cromossoma 5 de rato. Dados genéticos têm sugeridos um defeito no mesmo gene mutado em murinos de db. Plasma de ratos gordurosos e companheiros de ninhada magros foi imunoprecipitado e foi corrido sobre Western blots. Um aumento de vinte vezes no nível de OB circulante é visto nos animais mutantes. (c) Quantificação da proteína de OB em plasma de murino. Quantidades aumentadas de proteína de murino recombinante foram adicionadas a 100 λ de plasma de 23 ΡΕ0777732 murinos de OB e foram imunuoprecipitadas. A intensidade de sinal em Western blots foi comparada com aquela de 100 λ de plasma de murinos de tipo selvagem. Um aumento linear em intensidade de sinal foi visto com quantidades aumentando de proteína recombinantes demonstrando que as imunoprecipi-tações foram realizadas sobre condições de excesso de anticorpo. Sinais similares foram vistos em amostra de plasma de tipo selvagem e a amostra com 2 ng de uma proteína recombinante indicando o nível de circulação em plasma de murino é cerca de 20 ng/ml. (D) proteína OB em extratos de tecido adiposo. Extratos citoplasmáticos de tecido adiposo de murino foram preparados de murinos de tipo selvagem e de db. Western blots mostraram níveis aumentados de proteína de 16 kD em extratos preparados de murinos de db. A FIGURA 25 mostra que a proteína de OB circula em níveis variáveis em plasma ser humano. (A) Western blots de plasma ser humano. Amostras de plasma foram obtidas de 6 voluntários magros. Imunoprecipitação e Western blotting revelaram a presença de um proteína de 16 kD imunorreativa, idêntica em tamanho a uma proteína humana de 146 aminoácidos recombinante expressa em levedura. Níveis variáveis da proteína foram vistos em cada uma das seis amostras. (B) Um ELISA (Imunoensaio ligado com enzima) para OB ser humano. Placas de microtítulos foram revestidas com anticorpos de OB de anti-ser humano purificados. Quantidades conhecidas de proteína recombinante foram adicionadas às placas e foram detectadas usando-se anticorpos de anti-OB biotinilados, imunopurifiçados. Absorbância em 414 nm 24 ΡΕ0777732 foi representada graficamente contra as concentrações conhecidas de OB para fornecer uma curva padrão. A curva padrão resultante mostrou que o ensaio foi capaz de dectar 1 ng/ml ou mais da proteína de OB humana. (C) Quantificação de proteína de OB em plasma ser humano. Um imunonensaio ELISA foi realizado usando 100 λ de plasma de seis voluntários magros e os padrões usados no painel B. Níveis da proteína de OB variando de 2 ng/ml em HPl a 15 ng/ml em HP6 foram vistos. Esses dados correlacionaram-se com os dados de Western blot no painel A. A FIGURA 26 mostra que a proteína de OB forma ligações de dissulfeto inter- e intramoleculares. (A) Western blots sob condições de redução e de não-redução. Os Western blots de plasma de murino e ser humano foram repetidos com e sem a adição de agentes de redução ao tampão de amostra. Quando β-mercaptoetanol é omitido do tampão de amostra, imunoprecipitado de plasma de db migra com uma massa molecular aparente de 16 kD e de 32 kD. Adição de β-mercaptoetanol ao tampão leva ao desaparecimento da porção de 32 kD (ver Figura 24) . O resultado é recapitulado quando a proteína de murino é expressa na levedura, Pichia pastoris. Nesse caso, a proteína de OB de murino migra para a posição de um dímero. Sob condições de redução, a proteína de murino recombinante purificada migra com um peso molecular aparente de 16 kD, indicando que a forma molecular de 32 kD é o resultado de uma ou duas ligações de dissulfeto intermoleculares. A proteína humana expressa in vivo e em Pichia pastoris migra com uma massa 25 ΡΕ0777732 molecular de 16 kD sob condições de redução e de não-redução (dados não-mostrados). (B) A proteína humana expressa em levedura contém uma ligação de dissulfeto intra-molecular. Proteínas secretadas em geral assumem sua conformação correta quando expressas no sistema de expressão de Pichia pastoris. A proteína humana madura de 146 aminoácidos foi expressa em Pichia pastoris e foi purificada a partir dos meios de levedura por um protocolo de purificação de duas etapas envolvendo IMAC e filtração de gel. A proteína recombinante purificada foi submetida a espetrometria de massa antes e depois de clivagem de brometo de cianogênio. Brometo de cianogênio cliva no terminal carbóxi dos resíduos de metionina. A massa molecular da proteína de levedura recombinante era de 16.024±3 Da (massa molecular calculada = 16.024 Da). Brometo de cianogênio cliva depois as três metioninas na sequência de proteína nos aminoácidos 75, 89 e 157. O fragmento de brometo de cianogênio com massa medida de 8.435,6 Da corresponde aos aminoácidos 90 - 157 e 158 - 167 unidos por uma ligação de dissulfeto entre cys-117 e cys-167 (massa molecular calculada = 8.434,5 Da). N.D. = nota detectada. A FIGURA 27 mostra a preparação da proteína recombinante bioativa. A sequência de nucleotídeos correspondente à proteína de OB de murino de 145 aminoácidos foi clonada no vetor de expressão de 15b pET. O vetor pET insere um trato de polihistidina (His-tag) a montante da sequência clonada que permite purificação eficiente usando Cromatografia de Afinidade de Metal 26 ΡΕ0777732

Imobilizado (IMAC). A proteína bacteriana recombinante inicialmente separou-se na fração de membrana insolúvel depois de lise bacteriana. A fração de membrana foi solubilizada usando cloridrato de guanidínio e carregada sobre uma coluna de IMAC. A proteína foi eluída por etapas com concentrações crescentes de imidazol como mostrado. A proteína eluída foi redobrada e tratada com trombina para se remover o His-tag, como descrito abaixo. 0 rendimento final de proteína solúvel foi de 45 ng/ml de cultura bacteriana. A FIGURA 28 mostra os efeitos biológicos da proteína OB. 0 curso, no tempo, de ingestão de alimento (painéis A-C) e de peso de corpo (painéis D-F) . Grupos de dez animais receberam ou diariamente injeções intraperito-niais da proteína de OB a uma dose de 5 mg/kg/dia (quadrados sólidos), injeções diárias de PBS(círculos sólidos) ou nenhum tratamento (triângulos sólidos). Os grupos de tratamento incluíam murinos de C57B1/6J de OB/OB (painéis A e D) , murinos de C57B1/Ks de db/db (painéis B e E) e murinos de CBA/J +/+ (painéis C e F). A ingestão de alimento dos murinos foi medida diariamente e o peso de corpo foi registrado em intervalos de 3 a 4 dias como indicado. (A escala de peso de corpo em gramas é diferente para os murinos do tipo selvagem versus os murinos de OB e de db). A ingestão de alimento dos murinos de OB foi reduzida depois da primeira injeção e foi estabilizada depois do quarto dia em um nível de cerca de 40% daquele visto no grupo injetado simulado (p < 0,001). O peso do corpo 27 ΡΕ0777732 desses animais diminuiu com uma média de 1,3 gramas/dia e estabilizou-se após três semanas a um nivel aproximadamente 60% do peso inicial (p < 0,0001). Nenhum efeito da proteína foi demonstrável em murinos de db. Efeitos pequenos mas significativos sobre o peso de corpo foram observados em murinos de CBA/J em dois pontos de tempo anteriores (p < 0,02) . O erro padrão de cada medida é indicado por uma barra e a significância estatística desses resultados é mostrada na Tabela 1. A FIGURA 29 mostra os resultados de alimentação de murinos de OB. (A) Um grupo de quatro murinos de C57B1/6J de OB/OB foram alimentados com uma quantidade de alimento igual àquela consumida pelo grupo de murinos de OB recebendo proteína recombinante. A perda de peso para ambos os grupos foi calculada depois de cinco, oito e doze dias. Os murinos de alimentação restrita perdem (barra tracejada) menos peso do que os murinos de OB recebendo proteína (barra sólida) (p < 0,02). Este resultado indica que o efeito de redução de peso da proteína de OB é o resultado dos efeitos sobre tanto o alimento ingerido quanto o gasto de energia. (B) Fotografia de um murino de OB tratado. Mostrados são dois murinos de C57B1/6J de OB/OB. O murino da esquerda recebeu PBS e pesava 65 gramas, que era o peso inicial. 0 murino da direita recebeu injeções diárias da proteína de OB recombinante. O peso inicial deste animal era também de 65 gramas, e o peso depois de três semanas de tratamento de proteína era de 38 gramas, (c) Fígados de murinos de OB tratados e não-tratados. Mostrados são 28 ΡΕ0777732 fígados de murinos de C57B1/6J de OB/OB tratados e não-tratados. 0 fígado do murino que recebeu PBS tinha a aparência gorda de um fígado gorduroso e pesava 5,04 gramas. O fígado do murino que recebeu a proteína de OB recombinante tinha uma aparência normal e pesava 2,23 gramas. A FIGURA 30 mostra a hibridização in situ de OB para tecido adiposo. RNA de OB de sentido e de sem sentido foi marcado in vitro usando-se polimerase de T7 e Sp6 e digoxigenina. Os RNAs marcados foram hibridizados para parafinar seções assentadas de tecido adiposo a partir de almofadas de gordura epididimal de murinos de C57B1/Ks de oito semanas de idade (tipo selvagem marcado) e murinos de C57B1/Ks de db/db (db marcado). Na figura, as goticulas de lipídios aparecem como vacúolos não-manchados dentro das células. O citoplasma é um aro fino na periferia das células e é indistinguível a partir da membrana de célula. Hibridização de todos os adipócitos no campo foi dectada nas seções de tipo selvagem apenas usando-se a sonda sem sentido e níveis grandemente aumentados foram vistos nas seções de tecido de animais de db/db. A FIGURA 31 mostra que RNA de OB é expresso em adipócitos in vivo e in vitro. RNA total (10 microgramas) de várias fontes diferentes foi eletroforado no "blotted" e hibridizado para uma sonda de OB. Primeiramente, diferenças em flutuabilidade depois da digestão de colagenase ter sido usada para purificar adipócitos. RNA de OB estava presente apenas na fração adipócita. Raia S indica a ração 29 ΡΕ0777732 estromovascular e A indica a fração adipócita. Além disso, RNA de OB não foi expresso na raia U de células pré-adipócitas 3T3-442 não diferenciadas. Adipócitos diferenciados destas linhas de célula expressam níveis claramente detectáveis de mRNA de OB (raia D). A FIGURA 32 mostra que RNA de OB é expresso em todos os depósitos de tecido adiposo. Todos os depósitos de tecido adiposo testados expressaram RNA de OB. A almofada de gordura inguinal expressou quantidade de níveis de RNA menores, embora houvesse variabilidade no nível de sinais em experiências diferentes, (figura 31A) Raias (1), almofadas de gordura epididimal (2) inguinal (3) abdominal (4) parametrial. Gordura marrom também expressou um baixo nível de RNA de OB. (figura 31B) . 0 nível de expressão de OB em gordura marrom era inalterado em animais alojados a 4°C por uma semana enquanto a abundância do RNA de UPC específico de gordura marrom, conhecido como sendo induzível a frio, aumentou 5 vezes. A FIGURA 33 mostra a expressão de RNA de OB em murinos tratados com tioglicose amarelo-ouro e db/db. RNA total das almofadas de gordura parametrial de murinos tratados com db/db e tioglicose amarelo-ouro (GTG) foi eletroforado e Northern blotted. GTG administrado como uma dose única é conhecido causar obesidade por indução de lesões hipotalâmicas específicas. (A) murinos fêmeas de CBA de um mês de idade foram tratados com GTG (0,2 mg/g), com um aumento resultante de > 20 g em animais tratados em 30 ΡΕ0777732 relação aos animais de controle (< 5 g) . (B) hibridização de uma sonda de OB para RNA de murinos tratados com db/db e GTG revelaram um aumento de 2 0 vezes na abundância de RNA de OB em relação ao RNA de controle (actina ou GAPDH). A FIGURA 34 representa uma análise de Northern blot de RNA ser humano. Northern blots contendo 10 mg de RNA total de tecido adiposo ser humano (FAT, painel A) e 2 mg de polyA + RNA de outros tecidos seres humanos (painel B) foram hibridizados para OB ser humano ou para sondas de β-actina humana como indicados. Um sinal intenso em cerca de 4,5 kb foi visto com o RNA total de tecido adiposo. Hibridização para o polyA + RNA revelou sinais detectáveis no coração (HE) e na placenta (PL), enquanto que RNA de OB não foi detectado no cérebro (BR), no pulmão (LU), no fígado (LI), no músculo esquelético (SM), mo rim (Kl) e no pâncreas (PA) . Em cada caso, o comprimento da exposição autoradiográfica é indicado. Note-se que a origem das tiras moleculares menores vista no RNA de placenta (por exemplo, união alternada, degradação de RNA) não é conhecida. A FIGURA 35 representa "contig" de YAC contendo o gene de OB ser humano e 8 marcadores de microssatélite. O mapa de teor de STS com base em YAC da região do cromossoma 7 contendo o gene de OB ser humano é mostrado, como deduzido por SEGMAP/Versão 3.29 [Green e outros, PCR Methods Applic., 1: 77 - 90 (1991) ] . Os 19 STSs exclusivamente ordenados (ver tabela 3) são listados ao longo do topo . Os 8 STSs de microssatélite específicos são 31 ΡΕ0777732 indicados com estrelas (ver tabela 4). Também indicados são os STSs correspondendo aos genes de OB e de Pax4 bem como as posições previstas do centrômero (CEN) e 7q telômero (TEL) em relação ao "contig". Cada um dos 43 clones de YAC é mostrado por uma barra horizontal, com seu nome dado à esquerda e o tamanho de YAC estimado (em kb, medido por eletroforese de gel de campo pulsado) provido entre parênteses. A presença de um STS em um YAC é indicado por um circulo escurecido na posição apropriada. Quando um STS corresponde à extremidade de inserto de um YAC, um quadrado é colocado em volta do circulo correspondente, tanto ao longo do topo (perto do nome de STS) quanto na extremidade do YAC a partir do qual ele foi derivado. Para os 5 YACs no fundo (abaixo da linha de hífen horizontal) , 1 ou mais STS(s) esperado(s) estar(em) presente(s) (com base na ordem de STS estabelecido) não foi detectado (como avaliado por testagem dos YACs individuais com o(s) ensaio(s) de PCR de STS específico(s) correspondente(s) em pelo menos duas vezes), e estes são mostrados como círculos abertos nas posições apropriadas. A maior parte dos YACs foram isolados a partir de uma biblioteca de célula derivada de híbrido de hamster e de ser humano [Green e outros, Genomics, 25:170 -183 (1985)], com seus nomes originais como indicados. Os YACs restantes foram isolados a partir de bibliotecas genômicas humanas totais, e suas localizações de biblioteca original são providas na tabela 3. Caixas são colocadas em volta dos nomes dos 3 YACs. (yWSS691, yWSS999, e yWSS2935) que foram encontrados por análise de FISH para mapear para 7q31.1. O "contig" é exibido em sua forma "não-computada", 32 ΡΕ0777732 onde tamanhos de STSs são portanto separados em uma forma equidistante. Na forma "computada", onde tamanhos de YAC são usados para estimar a separaração de distância em relação a cada par de STSs adjacente bem como a extensão de clone sobreposto, o "contig" de YAC total parece se estender só sobre 2 Mb.

Descrição Detalhada A presente invenção refere-se à elucidação e à revelação de uma proteína, chamada aqui de polipeptídeo de OB ou leptina, ácidos nucleicos que codificam a proteína, incluindo suas variações degeneradas, por exemplo, que incorporam ótimos códons para a expressão em uma sistema de expressão particular, cuja proteína demonstra a capacidade de participar no controle de peso de corpo de mamíferos. Os ácidos nucleicos em objeto representam as sequências que codificam correspondendo ao polipeptídeo de OB ser humano e de murino, que é postulado a demonstrar um papel crítico na regulação de peso de corpo e de adiposidade. Dados apresentados aqui indicam que o produto de polipeptídeo de um ácido nucleico da invenção é secretado pelas células que o expressam e que as funções de polipeptídeo como um hormônio. Dados experimentais adicionais demonstram que o polipeptídeo de OB é muito eficaz no tratamento de obesidade em murinos portando uma mutação do gene de OB. Além disso, altas doses de bólus ou doses contínuas moderadas de polipeptídeo de OB efetuam redução de peso em murinos (tipo selvagem) normais. 33 ΡΕ0777732

Além disso, os exemplos aqui demonstram que os polipeptídeo de OB, alternativamente chamados aqui "leptina", circula no plasma de murino, de rato e de ser humano. Leptina está ausente no plasma de murinos de OB/OB, e está presente em concentrações 10 vezes maior no plasma de murinos de db/db, e concentrações 20 vezes maior em ratos de fa/fa. Mais significativamente, injeções diárias de leptina recombinante reduz dramaticamente a massa de corpo de murinos de OB/OB, significativamente afeta o peso de corpo de murinos de tipo selvagem, e não tem efeito sobre murinos de db/db.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo de OB de uma espécie é biologicamente ativo em uma outra espécie. Em particular, o polipeptídeo de OB ser humano é ativo em murinos.

Em seu aspecto primário, a presente invenção refere-se à identificação de materiais que funcionam como moduladores de peso de corpo de mamíferos. Em particular, a invenção refere-se a isolamento, a purificação e a sequenciação de certos ácidos nucleicos que correspondem ao gene de OB ou a sua região de codificação em tanto murinos quanto seres humanos, bem como aos polipeptídeos correspondentes expressos por estes ácidos nucleicos. A invenção assim compreende a revelação de ácidos nucleicos tendo as sequências de nucleotídeos indicadas na FIGURA IA até E (SEQ ID N° : 1) e na FIGURA 2A e B (SEQ ID N°:3), e para 34 ΡΕ0777732 degenerar, variantes alelas e seus fragmentos, todos possuindo atividade de modulação de peso de corpo e adiposidade. A correspondência dos ácidos nucleicos presentes ao gene de OB faz um prognóstico de seu impacto significativo sobre condições tais como obesidade bem como outras enfermidades e disfunções onde anormalidade em peso de corpo são um fator contribuidor. A invenção estende-se as proteínas expressas pelos ácidos nucleicos da invenção, e particularmene àquelas proteínas indicadas na FIGURA IA até E (SEQ ID N°:2), na FIGURA 3 (SEQ ID N°:4) na FIGURA 5 (SEQ ID N°:5) e na FIGURA 6 (SEQ ID N°:6) bem como para variantes, fragmentos ativos e moléculas pequenas cognatas conservadas .

Como discutido anteriormente, os peptídeos moduladores de controle de peso ou seus pares de ligação ou outros ligandos ou agentes exibindo ou mimestismo ou antagonismos a eles ou controle sobre sua produção, podem ser preparados em composições farmacêuticas, com um veículo adequado e em resistência eficaz para a administração por vários meios a um paciente experienciando flutuações em peso de corpo ou adiposidade, ou sozinho ou como parte de uma condição médica adversa tal como câncer ou AIDS, para o seu tratamento. Uma variedade de técnicas administrativas podem ser utilizadas, entre elas administração oral, nasal e outras formas de administração transmucosal, técnicas parenterais, tais como injeções subcutânea, intravenosa e intraperitoneal, cateterizações e semelhantes. Quantidades médias dos fatores de reconhecimento ou suas subunidades 35 ΡΕ0777732 podem variar e em particular devem ser com base nas recomendações e nas prescrição de um médico ou um veterinário qualificado.

De acordo com o acima, um sistema de ensaio para separação de drogas potenciais eficazes para imitar ou antagonizar a atividade do modulador de peso pode ser preparado. 0 modulador de peso pode ser introduzido para dentro de um sistema de teste, e a droga em prospectiva pode também ser introduzida para dentro da cultura de célula resultante, e a cultura depois disso examinada, para se observar quaisquer mudanças na atividade das células, devido ou à adição da droga sozinha em prospectiva, ou devido ao efeito de quantidades adicionadas do modulador de peso conhecido.

Como anteriormente afirmado, a clonagem molecular do gene de OB descrita aqui tem levado à identificação de uma classe de materiais que funciona no nivel molecular para modular peso de corpo de mamíferos. A revelação dos moduladores da invenção tem importante implicações para o diagnóstico e tratamento de distúrbios nutricionais incluindo, mas não limitados a, obesidade, perda de peso associada com câncer e o tratamento de doenças associadas com obesidade tais como hipertensão, doenças de coração, e diabetes do tipo II. Além disso, há usos agrícolas potenciais para o produto de gene em casos onde alguém pode desejar modular o peso de corpo de animais domésticos. Finalmente, na extensão em que um ou mais dos moduladores 36 ΡΕ0777732 da invenção são moléculas secretadas, elas podem ser usadas bioquimicamente para isolar seu receptor usando-se a tecnologia de clonagem de expressão. A discussão que se segue com referência especifica ao gene de OB traz aplicabilidade geral à classe de moduladores que compreendem uma parte da presente invenção, e deve portanto estar de acordo com tal latitude e escopo de interpretação.

Como observado acima, a atividade funcional do polipeptideo de OB pode ser avaliada transgeneticamente. Neste aspecto, um modelo de murino transgênico pode ser usado. 0 gene de OB pode ser usado em estudos complementares empregando murinos transgênicos. Vetores transgê-nicos, incluindo vetores virais, ou clones de cosmideo (ou clones de fago) correspondendo ao local de tipo selvagem de gene do candidato, pode ser construído usando-se o gene de OB isolado. Cosmídeos podem ser introduzidos para dentro do murinos transgênicos usando-se procedimentos publicados [Jaenisch, Science, 240:1468 - 1474 (1988)]. Os construtos são introduzidos para dentro de ovos fertilizados derivados de um cruzamento entre progênia de F1 de um cruzamento de C57BL/6J de OB/OB X DBA. Estes cruzamentos necessitam o uso de transplantes ovarianos de C57BL/6J de OB/OB para gerar os animais Fl. Murinos de DBA/2J são usados como a contra-cepa uma vez que eles têm uma cor de revestimento "nonagouti" que é importante quando do uso dos transplantes ovarianos. Genótipo no local de OB em animais transgênicos de cosmídeos podem ser determinados por tipagem de animais com RFLPs fortemente ligados ou microssatélites que 37 ΡΕ0777732 flanqueiam a mutação e que são polimórficas entre as cepas genitoras. Complementação será demonstrada quando um construto particular torna um animal de F2 geneticamente obeso (como registrado por análise de RFPL) em magro e não-diabético. Sob estas circunstâncias, prova final de complementação necessitará que o animal de OB/OB ou de db/db portando o transgene seja unido aos transplantes ovarianos de OB/OB ou de db/db. Nestes cruzamentos, todos os animais de N2 que não portam o transgene serão obesos e resistentes a insulina/diabéticos, enquanto aqueles que portam o transgene serão magros e terão concentrações de glicose e de insulina normais no plasma. Em um sentido genético, o transgene atua como uma mutação supressora.

Alternativamente, genes de OB podem ser testados por exame de seus efeitos fenotípicos quando expressos em orientação sem sentido em animais de tipo selvagem. Nesta abordagem, expressão do alelo de tipo selvagem é suprimida, que leva a um fenótipo mutante. Formação de dúplex de RNA-RNA (sem sentido) previne manipulação normal de mRNA, resultando em eliminação completa ou parcial de efeito de gene de tipo selvagem. Esta técnica foi usada para inibir a síntese de TK em cultura de tecido e para produzir fenótipos da mutação de Kruppel em Drosophila, e a mutação de Shiverer em murinos Izant e outros, Cell, 36:1007 - 1015 (1984); Green e outros, Annu. Rev. Biochem., 55:569 - 597 (1986): Katsuki e outros, Science, 241: 593 - 595 (1988). Uma importante vantagem desta abordagem é que apenas uma pequena porção do gene necessita ser expresso para a 38 ΡΕ0777732 inibição eficaz de expressão do mRNA cognato total. 0 transgene sem sentido será colocado sob controle de seu próprio promotor ou um outro promotor expresso no tipo de célula correta, e será colocado a montante do sítio SV40 polyA. Esta transgene será usada para produzir murinos transgênicos. Murinos transgênicos também serão unidos a transplantes ovarianos para testar se heterozigotos de OB são mais sensíveis aos efeitos do construto sem sentido. A longo prazo, a elucidação da função bioquímica do produto de gene de OB (proteína e polipeptídeo de OB) é útil para a identificação de agonistas de molécula pequena e antagonistas que afetam sua atividade. Vários termos usados através de todo este relatório deve ter as definições dadas aqui, por exemplo, abaixo. 0 termo "modulador de peso de corpo", "modu-lador", "moduladores", e quaisquer variantes não específicamente listadas, podem ser usadas aqui intercambeavel-mente, e quando usado durante a presente invenção e reivindicações refere-se em um caso tanto a nucleotídeos quanto a material proteináceo, o último incluindo ambas as proteínas únicas ou múltiplas. Mas especificamente, os termos acima mencionados estendem-se aos nucleotídeos e ao DNA tendo as sequências descritas aqui e apresentadas na figura 1 A até E (SEQ ID N°:l) e na figura 2A e B (SEQ ID N°:3). Do mesmo modo, as proteínas tendo dados de sequência 39 ΡΕ0777732 de aminoácidos descritos aqui e apresentados na figura IA até E (SEQ ID N°:2) e na figura 3 (SEQ ID N° : 4) são do mesmo modo comtempladas, como são perfil de atividades indicadas com relação aos materiais tanto aqui quanto nas reivindicações. Correspondentemente, nucleotideos exibindo substancialmente atividade alterada ou equivalente são do mesmo modo contemplados, incluindo substancialmente análogos homólogos e variações alélicas. Do mesmo modo, proteínas exibindo substancialmente atividade alterada ou equivalente, incluindo proteínas deliberadamente modificadas, como por exemplo, por mutagênese de sitio dirigido ou acidentalmente através de mutações em hospedeiros que produzem os moduladores são do mesmo modo comtemplados.

Uma composição que compreende "A" (onde "A" e uma proteina única, molécula de DNA, vetor, célula de hospedeiro recombinante, etc) está substancialmente livre de "B" (onde "B" compreende uma ou mais proteínas contaminantes, moléculas de DNA , vetores, etc., mas excluindo formas racêmicas de A) quando pelo menos cerca de 75% em peso das proteínas, DNA, vetores (dependendo da categoria da espécie a qual A e B pertencem) na composição está "A". De preferência, "A" compreende pelo menos cerca de 90% de peso das espécies A + B na composição, mais de preferência pelo menos cerca de 99% de peso. É também preferido que uma composição, que está substancialmente livre de contaminação, contenha apenas uma espécie de peso molecular tendo a atividade ou característica da espécie de interesse. ΡΕ0777732 40

Os Polipeptídeos de OB

Os termos "proteína" que refere-se à polipeptídeo de ocorrência natural, e "polipeptídeo" são usados aqui intercambeavelmente em relação ao produto de gene de OB e suas variantes. 0 termo "proteína madura" ou "polipeptídeo maduro" particularmente refere-se ao produto de gene de OB com a sequência de sinal (ou um par de proteína de fusão) removida.

Como observado acima, em modalidades específicas polipeptídeos de OB da invenção incluem aqueles tendo sequências de aminoácidos dadas aqui, por exemplo, SEQ ID N°S: 2, 4, 5, 6, etc., incluindo o polipeptídeo de OB modificado com substituições de aminoácidos conservadoras, bem como seus derivados, análogos e fragmentos biologicamente ativos. O termo "biologicamente ativo", é usado aqui para se referir a um efeito específico do polipeptídeo, incluindo mas não limitado a ligação específica, por exemplo, a um receptor, a um anticorpo, ou a uma outra molécula de reconhecimento; ativação de trajetória de transdução de sinal sobre um nível molecular: e/ou indução (ou inibição por antagonistas) de efeitos fisiológicos mediados pelo polipeptídeo de OB natural in vivo. Polipeptideos de OB, incluindo fragmentos, análogos e derivados podem ser preparados sinteticamente, por exemplo, usando-se as técnicas bem conhecidas de síntese de peptídeo de fase de solução ou de fase sólida. De preferência, técnicas sintéticas de fase sólida são empregadas. 41 ΡΕ0777732

Alternativamente, polipeptídeos de OB da invenção podem ser preparados usando-se técnicas de engenheiramento genético bem conhecidas, como descrito infra. Em ainda uma outra modalidade, o polipeptídeo de OB pode ser purificado, por exemplo, por purificação de imunoafinidade, a partir de um fluido biológico, tal como mas não limitado a plasma, soro, ou urina, de preferência plasma, soro ou urina humana, e mais de preferência de um indivíduo que superexpressa o polipeptídeo, tal como uma pessoa obesa sofrendo de uma mutação no receptor de OB ou de obesidade relacionada com uma mutação correspondente a "gorduroso".

Fragmentos do Polipeptídeo de OB

Em uma modalidade particular, a presente invenção contempla que fragmentos de ocorrência natural do polipeptídeo de OB podem ser importantes. A sequência de peptídeos inclui numerosos sítios que são frequentemente o alvo para a clivagem proteolítica, por exemplo, resíduos de arginina. É possível que o polipeptídeo de comprimento completo possa ser clivado em um ou mais sítios para formar fragmentos biologicamente ativos. Tais fragmentos biologicamente ativos podem ou agonizar ou antagonizar a atividade funcional do polipeptídeo de OB para reduzir o peso de corpo.

Análogos do Polipeptídeo de OB A presente invenção específicamente contempla a 42 ΡΕ0777732 preparação de análogos do peptídeo de OB, que são caracterizados por serem capazes de uma atividade biológica de polipeptideo de OB, por exemplo, de ligar a um par de ligação específico de peptídeo de OB, tal como o receptor de OB. Em uma modalidade, o análago agoniza atividade de OB, isto é, funciona similarmente para o peptídeo de OB. De preferência, um agonista de OB é mais eficaz do que a proteína natural. Por exemplo, um análogo de agonista de OB pode se ligar ao receptor de OB com afinidade muito mais alta, ou demonstrar uma meia-vida mais longa in vivo, ou em ambos. No entanto, análogos de agonista de peptídeo que são menos eficazes do que a proteína natural são também comtemplados. Em uma outra modalidade, o análogo de antagoniza de atividade de OB. Por exemplo, um análogo de OB que se liga ao receptor de OB mas não induz transdução de sinal pode competitivamente inibir a ligação de OB natural ao receptor, assim diminuindo atividade de OB in vivo. Tal análogo de antagonista de OB pode também demonstrar propriedades diferentes a partir do peptídeo de OB, por exemplo, meia-vida mais longa (ou menor) in vivo, afinidade de ligação maior (ou menor) para o receptor de OB, ou ambos.

Em uma modalidade, um análogo de peptídeo de OB é o peptídeo de OB modificado por substituição de aminoácidos nas posições no polipeptideo que não são essenciais para a etrutura ou função. Por exemplo, uma vez que é conhecido que peptídeo de OB ser humano é biologicamente ativo em murino, substituição de resíduos de aminoácidos divergentes 43 ΡΕ0777732 na sequência humana quando comparado com a sequência de aminoácidos de murino fornecerá provavelmente análogos úteis de peptídeo de OB. Por exemplo, o resíduo de serina na posição 53 ou na posição 98, ou ambas (na sequência de peptídeos não-processados mostrados na figura 4) ser humano pode não estar substituído, por exemplo, glicina, alanina, valina, cisteína, metionina, ou treonina. Similarmente, o resíduo de arginina no número de posição 92 (figura 4) pode estar substituído, por exemplo, com asparagina, lisina, histidina, glutamina, ácido glutâmico, ácido aspártico, serina, treonina, metionina ou cisteína. Referindo-se ainda à figura 4, outros aminoácidos no peptídeo de OB humano que parecem ser capazes de substituição são histadina na posição 118, triptofano na posição 121, alanina na posição 122, ácido glutâmico na posição 126, treonina na posição 127, leucina na posição 128, glicina na posição 132, glicina na posição 139, triptofano na posição 159, e glicina na posição 166. Em uma outra modalidade, pode ser possível substituir um ou mais resíduos 121 a 128 (como mostrado na figura 4), por exemplo, com glicinas ou alaninas, ou substituição de alguns dos resíduos com as excessões de serina na posição 123, ou leucina na posição 125.

Em uma outra modalidade, um análogo de poli-peptídeo de OB, de preferência o polipeptídeo de OB ser humano, é uma forma truncada do polipeptídeo. Por exemplo, já foi demontrado que a glutamina no resíduo 49 não é essencial, e pode ser deletada do peptídeo. Similarmente, 44 ΡΕ0777732 pode ser possível deletar alguns ou todos os resíduos de aminoácidos divergentes nas posições 121 - 128. Além disso, a invenção contempla prover um análogo de OB tendo a sequência de aminoácidos mínima necessária para uma atividade biológica. Isto pode ser prontamente determinado,

por exemplo, por testar a atividade de fragmentos de OB quanto à capacidade de se ligar aos anticorpos de OB específicos, inibir a atividade do polipeptídeo de OB

natural, ou agonizar a atividade do peptídeo de OB natural. Em uma modalidade, a invenção provê um polipeptídeo de OB truncado consistindo na estrutura de laço formada por ligação de dissulfeto que se forma entre os resíduos de cisteína 117, e 167 (como mostrado na figura 4) . Em uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos do resíduo 22 (que segue o sítio de clivagem de peptídeo de sinal putativo) até 53 (o resíduo de aminoácido imediatamente precedendo a uma região de laço detectada com proteólise limitada seguida por análise espectrométrica de massa do polipeptídeo de OB; ver Cohen e outros, Protein Science, 4:1088 (1985). Em uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos do resíduo 61 (o resíduo imediatamente após a região de laço flexível como detectado com a análise de espec. de proteólise/massa limitada do polipeptídeo de OB) até o resíduo de aminoácido 116 (o resíduo imediatamente precedendo o primeiro resíduo de cisteína). Em ainda uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos de resíduo 61 até o resíduo de aminoácido 167. 45 ΡΕ0777732

Além do mais, um ou mais resíduos do laço flexível putativo em resíduos números 54 a 60 estão substituídos. Por exemplo, uma ou mais dos resíduos podem estar substituídos com lisina, ácido glutâmico, ou cisterna (de preferência lisina) para a reticulação, por exemplo, a um polímero, uma vez que as estruturas de laço flexíveis são sítios preferidos para a derivatização de uma proteína. Alternativamente, os resíduos nas posições de laço flexível podem estar substituídos com resíduos de aminoácidos que são mais resistentes à proteólise mas que retêm uma estrutura flexível, por exemplo, uma ou mais prolinas. Em ainda uma outra modalidade substituições com resíduos de aminoácidos que podem ser ulteriormente derivatizados para produzi-los mais resistentes à degradação, por exemplo, proteólise, é contemplada.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que o tamanho de fragmento precedente é aproximado, e que a partir de um a cerca de cinco aminoácidos podem ser incluídos ou deletados a partir de cada uma ou de ambas as extremidades, ou a partir do interior do polipeptídeo ou de seus fragmentos, dos análogos truncados recitados, com a exceção que nos análogos de laço ligados a dissulfeto, os resíduos de cisteína devem ser mantidos.

Verificou-se que peptídeo de OB de murino contém 50% de teor α-helicoidal, e que o polipeptídeo de OB ser humano contém cerca de 6 0% de teor de α-helicoidal, como descrito por dicroismo circular dos peptídeos recombinantes 46 ΡΕ0777732 sob condições proximamente fisiológicas. Correspondentemente, em uma outra modalidade, residuos de aminoácidos podem estar substituídos com resíduos para formar análogos de polipeptídeo de OB que demonstram tendência aumentada para a formação, ou que formam estruturas de a-hélice, mais estáveis. Por exemplo estrutura de α-hélice seria preferida se Glu, Ala, Leu, His, Trp fossem introduzidos como substituintes para resíduos de aminoácidos encontrados no polipeptídeo de OB nativo. De preferência substituições de aminoácidos conservadoras são empregadas, por exemplo, substituições de resíduo(s) de aminoácido(s) 29, 30, 44, 61, 76, 100 e/ou 106 (como mostrado na figura 4) com ácido(s) glutâmico(s) (Glu); substituição de isoleucina(s) com leucina; substituição de glicina ou valina, ou qualquer aminoácido divergente, com alanina (por exemplo, serina na posição 53 do polipeptídeo de OB ser humano com alanina), substituição de arginina ou lisina com histidina, e substituição de tirosina e/ou fenilalanina com triptofano. 0 aumento do grau, ou mais importantemente, a estabilidade de estrutura de α-hélice pode fornecer um análogo de OB com atividade maior, afinidade de ligação aumentada, ou meia-vida mais longa. Em uma modalidade específica, o pontencial formador de hélice da porção do peptídeo de OB correspondendo aos resíduos de aminoácidos 22 até 53 é aumentado. Em uma outra modalidade, o potencial de formador de hélice ou a estabilidade dos resíduos de aminoácidos 61 - 116 é aumentado. Em ainda uma outra modalidade, o potencial formador de hélice da estrutura de laço de dissulfeto correspondente aos aminoácidos 117 a 167 é 47 ΡΕ0777732 aumentado. Também contemplados são análogos de OB contendo potencial de α-hélice aumentado ou estabilidade em mais do que um dos domínios precedentes. Em uma outra modalidade são gerados análogos de polipeptídeo de OB truncados que incorporam resíduos de aminoácidos formadores de estrutura, por exemplo, formadores de hélice, para compensar a tendência maior de fragmentos de polipeptídeo carecer de estrutura estável.

Análogos, tais como fragmentos, podem ser produzidos, por exemplo, por digestão de pepsina de material de peptídeo modulador de peso. Outros análogos, tais como muteínas, podem ser produzidos por mutagênese de sítio dirigido padrão de sequências codificadoras de peptídeo modulador de peso. Análogos exibindo "atividade moduladora de peso" tais como pequenas moléculas, funcionando como promotoras ou inibidoras, podem ser identificadas por ensaios in vivo e/ou in vitro conhecidos.

Análogos de Moléculas Pequenas e Peptidomiméticos de Polipeptídeo de OB A estrutura do polipeptídeo de OB, de preferência polipeptídeo de OB ser humano, pode ser analisada por vários métodos conhecidos na técnica. A sequência de proteínas pode ser caracterizada por uma análise de hidro-filicidade (por exemplo, Hopp e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:3824 (1981)]. Um perfil de hidrofilicidade pode ser usado para identificar as regiões hidrofóbicas e 48 ΡΕ0777732 hidrofílicas do polipeptídeo de OB, que pode indicar regiões enterradas no interior do polipeptídeo dobrado, e regiões acessíveis no exterior do polipeptídeo. Além disso, análise estrutural secundária [por exemplo, Chou e outros, Biochem., 13:222 (1974)] pode também ser feita, para identificar regiões de polipeptídeo de OB que assumem estruturas secundárias específicas. Manipulação da estrutura determinada ou predita, pode ser realizada usando-se programas de software de computador disponíveis na técnica.

Por prover uma fonte abundante de polipeptídeo de OB recombinante, a presente invenção possibilita a determinação estrutural quantitativa do polipeptídeo. Em particular, bastante material é provido para ressonância magnética nuclear (RMN), infravermelho (IV), Raman, e ultravioleta (UV), especialmente dicroísmo cicular (DC) , análise espectroscópica. Em particular RMN provê análise estrutural muito poderosa de moléculas em solução, que mais proximamente se aproxima de seu ambiente natural [Marion e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 113:967 - 974 (1983); Bar e outros, J. Magn. Reson., 65:355 - 360 (1985); Kimura e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:1681 - 1685 (1980)]. Outros métodos de análise estrutural podem também ser empregados. Estes incluem mas não são limitados à cristalografia de raios X [Engstom, Biochem. Exp. Biol, 11:7 -13 (1974] .

Em ainda uma outra modalidade, um análogo de polipeptídeo de OB pode ser testado para se determinar se 49 ΡΕ0777732 ele sofre reação cruzada com um anticorpo específico para o polipeptídeo de OB natural, ou seus fragmentos específicos. 0 grau de reatividade cruzada provê informação sobre homologia estrutural ou similaridade de proteínas, ou sobre a acessabilidade de regiões correspondendo a porções do polipeptídeo que foram usadas para gerar anticorpos de fragmento específicos.

Separação para Análogos de OB Várias técnicas de separação são conhecidas na técnica para a separação de análogos de polipeptideos. Várias bibliotecas de substâncias químicas estão disponíveis. Correspondentemente, a presente invenção contempla a separação de tais bibliotecas, por exemplo, bibliotecas de compostos sintéticos gerados durante anos de pesquisa, bibliotecas de compostos naturais, e bibliotecas combinatórias, como descritas em maiores detalhes, infra, para análogos de polipeptídeo de OB. Em uma modalidade, a invenção contempla separação de tais bibliotecas para compostos que se ligam aos anticorpos de polipeptídeo de anti-OB, de preferência anticorpos de polipeptídeo de OB anti-ser humano. Em um outro aspecto, uma vez que o receptor de OB é identificado (ver infra), qualquer separação de técnica conhecida na técnica pode ser usada para antagonistas e agonistas de receptor de OB. A presente invenção contempla separações para imitadores e análogos de ligantes de moléculas pequenas, bem como separeções para ligantes naturais que se ligam a e agonizam ou antagonizam receptor de OB ativo in vivo. 50 ΡΕ0777732

Conhecimento da sequência primária do receptor, e a similaridade daquela sequência com proteínas de função conhecida, pode prover um vestígio inicial sobre os agonistas ou os antagonistas da proteína. Identificação e separação de antagonistas são ulteriormente facilitadas por determinação de características estruturais, por exemplo, usando-se cristalografia de raios X, difração de nêutron, espectometria de ressonância magnética nuclear, e outras técnicas para a determinação de estrutura. Estas técnicas provêem a identificação ou o desenho apropriado de agonistas e de antagonistas.

Uma outra abordagem usa bacteriófago recombinante para produzir grandes bibliotecas. Usando-se o "método de fago" [Scott e outros, Science, 249:386 - 390 (1990); Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378 -6382 (1990); Devlin e outros, Science, 249:404 - 406 (1990)], bibliotecas muito grandes podem ser construídas ( 106 - 108 entidades químicas). Uma segunda modalidade usa principalmente métodos químicos, dos quais o método de Geysen [Geysen e outros, Molecular Immunology, 23:709 - 715 (1986); Geysen e outros, J. Immunologic Method, 102:259 -274 (1987)] e o método recente de Fodor e outros, Science, 251:767 - 773 (1991) são exemplos. Furka e outros. 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res, 37:487 -493 (1991)]; Houghton (a patente USA n° 4,631,211, issued December 1986); e Rutter e outros. (patente U.S. n° 51 ΡΕ0777732 5.010.175, expedida em 23 de abril de 1991) descrevem métodos para produzir uma mistura de peptideos que podem ser testadas como agonistas ou antagonistas.

Em um outro aspecto, bibliotecas sintéticas [Needels e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:10700 -10704 (1993); Lam e outros, publicação do pedido de patente internacional n° WO 92/00252, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade], e os semelhantes podem ser usados para separar ligandos de receptor de OB de acordo com a presente invenção. Com tais bibliotecas, antagonistas de receptor podem ser detectados usando-se células que expressam o receptor sem realmente clonar o receptor de OB.

Alternativamente, ensaios para a ligação de ligando solúvel às células que expressam formas recombinantes do domínio de ligador de ligando de receptor de OB podem ser realizados. Os ligandos solúveis pode ser providos prontamente como polipeptídeo de OB sintético ou recombi-nante. A separação pode ser realizada com células recombinantes que expressam o receptor de OB, ou alternativamente, usando-se proteína de receptor purificada, por exemplo, recombinamente produzida, como descrita acima. Por exemplo, a capacidade de receptor de OB marcado, solúvel ou solubilizado, que inclui a porção de ligante de ligação da molécula, para ligar ligando pode ser usada para separar bibliotecas, como descrito nas referências anteriores. 52 ΡΕ0777732

Derivados de Polipeptídeos de OB

Em geral, a presente proteína (aqui o termo "proteína" é usado para incluir polipeptídeo" a não ser que de outra maneira indicado) pode ser derivatizada pela fixação de uma ou mais porções químicas à porção de proteína. Os derivados quimicamente modificados podem ser ulteriormente formulados para intraarterial, intraperito-neal, intramuscular, subcutânea, intravenosa, oral, nasal, retal, bucal, sublingual, pulmonar, tópica, transdermal, ou outras rotas de administração. Modificação química de proteínas biologicamente ativas foram encontrads para prover vantagens adicionais sob certas circunstâncias, tal como aumentar o tempo de estabilidade e de circulação de proteína terapêutica e diminuição de imunogenecidade. Ver a patente U.S. n° 4.179.337, Davis e outros, expedida em 18 de dezembro de 1979. Para uma revisão, ver Abuchowski e outros, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", em Enzymes as Drugs, págs. 367 - 383, Holcenberg e Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY (1981) . Um artigo de revista descrevendo modificação de proteína e proteínas de fusão é Francis, Focus on Growth Factors, 3:4 - 10 (1992).

Porções Químicas para Derivatização

As porções químicas adequadas para derivatização podem ser selecionadas dentre os polímeros solúveis em água. 0 polímero selecionado deve ser solúvel de modo que a 53 ΡΕ0777732 proteína à qual ele está ligado não se precipita em uma ambiente aquoso, tal como ambiente fisiológico. De preferência, para o uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar o polímero desejado com base em tais considerações, quanto a se o conjugado de polímero/proteína será usado terapeuticamente, e, se for, a desejada dosagem, tempo de circulação, resistência a proteólise, e outras considerações. Para as presentes proteínas e peptídeos, estas podem ser determinadas usando-se os ensaios providos aqui.

Moléculas de Polímero 0 polímero solúvel em água pode ser selecionado do grupo que consiste em, por exemplo, polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboxi-metil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copo-límero de etileno/anidrido maléico, poliaminoácidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipro-pileno/óxido de etileno, polióis polioxietilado e álcool polivinilico. Propionaldeído de polietileno glicol pode prover vantagens na produção devido à sua estabilidade em água. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular, e 54 ΡΕ0777732 pode ser ramificado ou não-ramifiçado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferido é entre cerca de 2 KDa e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indicando que nas preparações de polietileno glicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular afirmado) para facilidade na manipulação e na produção. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação sustentada desejada, os efeitos, se algum, sobre a atividade biológica, na facilidade na manipulação, no grau ou na falta de antigenicidade e nos outros efeitos conhecidos do polietileno glicol a uma proteína ou análogo terapêutico).

Razão de Polímero/Proteína O número de moléculas de polímero assim ligadas podem variar, e aqueles versados na técnica serão capazes de determinar o efeito sobre a função. Pode-se mono-derivatizar, ou pode prover uma di-, tri-, tetra- ou alguma combinação de derivatização, com as mesmas ou porções químicas diferentes (por exemplo, polimeros tais como pesos diferentes de polietileno glicóis). A proporção de moléculas de polímero para moléculas de proteína (ou peptídeo) variará, como o farão suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a razão ótima (em termos de eficácia de reação em que não há nenhum excesso de proteína ou de polímero não reagido) será determinada por fatores tal como o grau desejado de derivatização (por exemplo, mono, di-, tri-, etc.), o peso molecular do polímero selecionado, se o 55 ΡΕ0777732 polímero é ramificado ou nao-ramifiçado, e as condiçoes de reação.

Fixação da Porção Química à Proteína

As moléculas de polietileno glicol (outras porções químicas) devem estar ligadas à proteína sob consideração de efeitos sobre domínios antigênicos ou funcionais da proteína. Há numerosos métodos disponíveis para aqueles versados na técnica, por exemplo, EP 0 401 384 aqui incorporado aqui por referência (acoplamento de PEG para G-CSF). Ver também Malik e outros, Exp. Hematol, 20:1028 - 1035 (1992) (relatando pegilação de GM-CSF usando-se cloreto de tresila). Por exemplo, polietileno glicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácidos via um grupo reativo, tal como um grupo carboxila ou amino livre. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietileno glicol ativado pode ser ligada. Os resíduos de aminoácidos tendo um grupo amino livre pode incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácidos terminal N, aqueles tendo um grupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido terminal C. Grupos sulfidrila podem também ser usados como um grupo reativo para a ligação da(s) molécula(s) de polietileno glicol. Preferida para finalidades terapêuticas é a fixação em um grupo amino, tal como fixação em terminal N ou em grupo lisina. Fixação em resíduos importantes para ligação de receptor deve ser evitada se ligação de receptor é desejada. 56 ΡΕ0777732

Proteínas Quimicamente Modificadas N-Terminalmente

Pode-se específicamente desejar proteína quimicamente modificada N-terminalmente. Usando-se polietileno glicol como uma ilustração das presentes composições, pode-se selecionar a partir de uma variedade de moléculas de polietileno glicol (por peso molecular, por ramificação, etc.)/· a proporção de moléculas de polietileno glicol para moléculas proteína (ou peptídeo) na mistura de reação, o tipo de reação de pegilação a ser realizada, e o método de obtenção da proteína pegilada N-terminalmente. 0 método de obtenção da preparação de pegilado N-terminalmente (isto é, separação desta porção de outras porções monopegiladas se necessário) pode ser por purificação do material pegilado N-terminalmente a partir de uma população de moléculas de proteína pegiladas. Modificação química terminal N seletiva pode ser realizada por alquilação redutiva que explora reatividade de tipos diferentes de grupos amino primários (lisina versus terminal N) disponíveis para derivatização em uma proteína particular. Sob as condições de reação apropriadas, derivatização substancialmente seletiva da proteína no terminal N com um grupo carboxila contendo polímero é conseguida. Por exemplo, pode-se substancialmente pegilar N-terminalmente a proteína por realização da reação em um pH que permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo α-amino do resíduo terminal N da proteína. Por tal derivação seletiva, fixação de um polímero solúvel 57 ΡΕ0777732 em água a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína e nenhuma modificação significativa de outros grupos reativos, tais como grupos amino de cadeia lateral de Usina, ocorre. Usando-se alquilação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo descrito acima, e deve ter um único aldeído reativo para acoplamento da proteína. Propionaldeído e polietileno glicol, contendo um único aldeído reativo, podem ser usados.

Ácidos Nucleicos Associados com Polipeptídeo de OB

Como observado acima, a presente invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de OB, bem como sequências de não-codificação genômicas 5', 3', e intrônicas ao gene de OB. Assim, de acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas de DNA recombinante, de biologia molecular e de microbiologia dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames e outros, eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames e outros, eds. Transcription And Translation, Oxford University Press (1984)]; Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford 58 ΡΕ0777732

University Press (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986)]; Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). De particular relevância para a presente invenção são estratégias para isolamento, clonagem, sequenciação, análise e caracterização de um gene ou ácido nucleico com base nas técnicas de reação de polimerase bem conhecidas (PCR).

Um replicon é qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autónoma de replicação de DNA ín vivo, isto é, capaz de replicação sob seu próprio controle.

Um "vetor" é um replicon, tais como um plasmídeo, um fago, ou um cosmídeo, ao qual um outro segmento de DNA pode estar ligado de modo a provocar a replicação do segmento ligado.

Um cassete refere-se a um segmento de DNA que pode ser inserido para dentro de um vetor em sítios de restrição específicos. 0 segmento de DNA codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e os sítios de restrição são destinados a assegurar a inserção do cassete no quadro de leitura adequado para transcrição e tradução. DNA "heterólogo" refere-se a DNA não-naturalmente localizado na célula, ou em um sítio cromossomal da célula. De preferência, o DNA heterólogo inclui um gene estranho à célula. 59 ΡΕ0777732

Uma célula foi "transfectada" por DNA exógeno ou heterólogo quando tal DNA foi introduzido dentro da célula. Uma célula foi "transformada" por DNA exógeno ou heterólogo quando o DNA transfectado efetua uma mudança fenotipica. De preferência, a transformação de DNA deve ser integrada (covalentemente ligada) no DNA cromossomal que produz o genoma da célula.

Um "clone" é uma população de células derivadas de uma única célula ou antepassado comum por mitose.

Uma "molécula de ácido nucleico" refere-se à forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleosideos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; "moléculas de RNA") ou desoxirribonucleosideos (desoxiadenosina, desoxi-guanosina, desoxitimidina ou desoxicitidina; "moléculas de DNA") ou em forma de filamento único, ou em uma forma de hélice dupla. Hélices de DNA-DNA, de DNA-RNA e de RNA-RNA de filamentos duplos são possíveis. 0 termo molécula de ácido nucleico, e em particular molécula de DNA ou de RNA, refere-se apenas à estrutura primária ou secundária da molécula, e não limita a quaisquer formas terciárias ou quaternárias particulares. Assim, este termo inclui DNA de filamento duplo encontrado, entre outros, em moléculas de DNA circulares ou lineares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos e cromossomas. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de filamento duplo particular, sequências podem ser descritas aqui de acordo 60 ΡΕ0777732 com a convenção normal de dar apenas a sequência na direção 5' a 3' ao longo do filamento não-transcrito de DNA (isto é, o filamento tendo uma sequência homóloga ao mRNA). Uma "molécula de DNA recombinante" é uma molécula de DNA que sofreu uma manipulação biológica molecular.

Uma molécula de ácido nucleico é "hibridizável" a uma outra molécula de ácido nucleico, tal como um cDNA, um DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de filamento único da molécula de ácido nucleico pode se anelar à outra molécula de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e concentração iônica de solução (ver Sambrook e outros, 1989, supra). As condições de temperatura e concentração iônica determinam a "severidade" da hibri-dização. Para separação preliminar de ácidos nucleicos homólogos, condições de hibridização de baixa severidade, correspondendo a um Tm de 55°C, podem ser usadas, por exemplo, 5 x SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leite, e nenhuma formamida; ou 30% de formamida, 5x SSC, 0,5% de SDS). Condições de hibridização de severidade moderada correspondem a um Tm mais alto, por exemplo, 40% de formamida, com 5x ou 6x SCC. Condições de hibridização de severidade alta correspondem ao Tm mais alto, por exemplo, 50% de formamida, 5x ou 6x SCC. A hibridização exige que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora, dependendo da severidade de hibridização, do desemparelhamento entre as bases sejam possíveis. A severidade apropriada para a hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do 61 ΡΕ0777732 grau de complementação, das variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotideos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos tendo aquelas sequências. A estabilidade relativa (correspondendo a Tm mais alto) de hibridizações de ácido nucleico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais do que 100 nucleotideos de comprimento, equações para o cálculo de Tm foram derivadas (ver Sambrook e outros, 1989, supra 9.50 -0,51). Para hibridização com ácidos nucleicos menores, isto é, oligonucleotídeos, a posição dos desemparelhamentos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonu-cleotídeo determina sua especificidade (ver Sambrook e outros, 1989, supra 11.7 - 11.8). De preferência um comprimento mínimo para uma ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotideos; mais de preferência de pelo menos cerca de 15 nucleotideos; mais de preferência o comprimento é de pelo menos cerca de 20 nucleotideos. "Recombinação homóloga" refere-se à inserção de uma sequência de DNA estranho de um vetor em um cromossoma. De preferência, o vetor atinge um sítio cromossomial específico para recombinação homóloga. Para recombinação homóloga específica, o vetor conterá regiões suficientemente longas de homologia para com as sequências do cromossoma permitir a ligação complementar e a incorporação do vetor para dentro do cromossoma. Regiões mais longas de homologia, e graus maiores de similaridade de sequência, podem aumentar a eficiência de recombinação de homologia. 62 ΡΕ0777732

Uma "sequência que codifica" DNA (ou "sequência de codificação" de DNA) é uma sequência de DNA de filamento duplo que é transcrita e é traduzida para dentro de um polipeptideo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência que codifica são determinados por um códon inicial no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3' (carboxila). Uma sequência que codifica pode incluir, mas não é limitada a, sequências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genômicos oriundas de DNA eucariótico (por exemplo de mamífero), e mesmo sequências de DNA sintéticos. Se a sequência que codifica é destinada a expressão em uma célula eucariótica, uma sequência de terminação de transcrição e de sinal de poliadenilação usualmente serão localizadas 3' à sequência que codifica.

Isolamento de Sequências de Flangueamento e de Codificação.

Os ácidos nucleicos contemplados pela presente invenção estendem-se como indicado, a outros ácidos nucleicos que codificam quando da expressão para peptídeos tais como aqueles indicados na figura IA até D (SEQ ID N°:2), na figura 3 (SEQ ID N°:4), na figura 5 (SEQ ID N°:5) e na Figura (SEQ ID N°:6) aqui. Correspondentemente, enquanto DNA específico foi isolado e foi sequenciado em relação ao gene de OB, qualquer célula animal potencialmente pode servir como fonte de ácido nucleico para a 63 ΡΕ0777732 clonagem molecular de gene que codifica os peptídeos da invenção. 0 DNA pode ser obtido por procedimentos padrão conhecidos na técnica de DNA clonado (por exemplo, uma biblioteca de DNA), por síntese química, por clonagem de cDNA, ou pela clonagem de DNA genômico, ou seus fragmentos, purificado a partir da célula desejada (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, supra; Glover, 1985, supra). Clones derivados a partir de DNA genômico podem conter regiões de DNA intrônico e regulador além de regiões que codificam; clones derivados de cDNA não conterão sequências de íntrons. Qualquer que seja a fonte, o gene deve ser molecularmente clonado para dentro de um vetor adequado para a propagação do gene.

Na clonagem molecular do gene de DNA genômico, o DNA genômico pode ser ampliado usando-se iniciadores selecionados das sequências de DNA. Alternativamente, fragmentos de DNA são gerados, alguns dos quais codificarão o gene desejado. 0 DNA pode ser clivado em sítios específicos usando-se várias enzimas de restrição. Pode-se também usar DNase na presença de manganês para fragmentar o DNA, ou o DNA pode ser fisicamente cisalhado, como por exemplo, por sonicação. Os fragmentos de DNA linear podem então ser separados de acordo com o tamanho por técnicas padrão, incluindo, mas não se limitando a, eletroforese de gel de poliacrilamida e de agarose e de cromatograf ia de coluna.

Uma vez que os fragmentos de DNA sao gerados, a 64 ΡΕ0777732 identificação do fragmento de DNA contendo o gene de OB ou o tipo de OB desejado pode ser realizada de numerosas maneiras. Por exemplo, se uma quantidade de uma porção de gene de tipo OB ou OB ou seu RNA especifico, ou um seu fragmento, está disponível e pode ser purificado e marcado, os fragmentos de DNA gerados podem ser separados por hibridização de ácido nucleico para uma sonda rotulada [Benton e outros, Science, 196:180 (1977); Grunstein e

outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961 (1975)]. A presente invenção provê tais sondas de ácido nucleico, que podem ser convenientemente preparadas a partir das sequências específicas descritas aqui, por exemplo, uma sonda hibridizável tendo uma sequência de nucleotídeos correspondendo a pelo menos um fragmento de 10, e de preferência 15 nucleotídeos das sequências mostradas na figura IA até E (SEQ ID N°:l) ou na figura 2A e B (SEQ ID N°:3). De preferência, é selecionado um fragmento que é altamente único (altamente especial) para os peptídeos moduladores da invenção. Aqueles fragmentos de DNA com homologia substancial para com a sonda hibridizar-se-ão. Como observado acima, quanto maior o grau de homologia, mais rigorosa as condições de hibridização que podem ser usadas. Em uma modalidade, condições de hibridização de baixa severidade são usadas para identificar um peptídeo modulador homólogo. No entanto, em um aspecto preferido, e como demonstrado experimentalmente aqui, um ácido nucleico que codifica um peptídeo modulador da invenção hibridizará para um ácido nucleico tendo sequências de nucleotídeos tais como mostradas na figura IA até E (SEQ ID N°:l) ou na 65 ΡΕ0777732 figura 2A e B (SEQ ID N°:3), ou um seu fragmento hibri-dizável, sob condições moderadamente rigorosas; mais de preferência, hibridizará sob condições de alta severidade.

Alternativamente, a presença do gene pode ser detectada por ensaios com base nas propriedades físicas, químicas ou imunológicas do seu produto expresso. Por exemplo, podem ser selecionados clones de cDNA, ou clones de DNA que selecionam hibridamente os mRNAs adequados, que poduzem uma proteína que tem migração eletroforética similar ou idêntica, comportamento de focalização isoelétrica, mapas de digestão porteolítica, atividade de fosfatase alcalina ou propriedades antigênicas como conhecidos para os presentes peptídeos moduladores. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem convenientemente ser usados para fazer a separação de homólogos de peptídeos moduladores oriundos de outras fontes.

Um gene que codifica um peptídeo modulador da invenção pode ser identificado por seleção de mRNA, isto é, por hibridização de ácido nucleico seguida por tradução in vitro. Nesse procedimento, fragmentos são usados para isolar mRNAs complementares por hibridização. Tais fragmentos de DNA podem representar DNA modulador purificado disponível. Análise de imunoprecipitação ou de ensaios funcionais (por exemplo, atividade de fosfatase alcalina) dos produtos de tradução in vitro dos produtos dos mRNAs identifica o mRNA e, portanto, os fragmentos de DNA complementares, que contêm as sequências desejadas. Além disso, -66 - ΡΕ0777732 mRNAs específicos podem ser selecionados de polissomas isolados a partir de células a anticorpos imobilizados específicamente direcionados contra um peptídeo modulador.

Um cDNA de peptídeo modulador radiormarcado pode ser sintetizado usando o mRNA selecionado (a partir de polissomas adsorvidos) como um modelo. 0 cDNA ou o mRNA radiormarcado pode então ser usado como uma sonda para identificação de fragmentos de DNA de peptídeo modulador homólogo a partir dentre outros fragmentos de DNA genômico.

Como mencionado acima, uma sequência de DNA que codifica peptídeos moduladores de peso como descrito aqui pode ser preparada sinteticamente ao invés de clonada. A sequência de DNA pode ser projetada com os códons adequados para as sequências de aminoácido de peptídeo modulador de peso. Em geral, serão selecionados códons preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência será usada para expressão. A sequência completa é montada de nucleotídeos de superposição preparada por métodos padrão e são montados em uma sequência de codificação completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair e outros, Science, 223:1299 (1984); Jay e outros, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984) .

Sequências de DNA sintéticas permitem construção conveniente de genes que expressarão análogos moduladores de peso, como descrito acima. Alternativamente, análogos que codificam DNA podem ser produzidos por mutagênese de 67 ΡΕ0777732 sítio direcionado de genes de OB naturais ou cDNAs, e análogos podem ser produzidos diretamente usando-se síntese de polipeptídeo convencional.

Um método geral para incorporação de sítio específico de aminoácidos não-naturais para dentro de proteínas é descrito em Noren e outros, Science, 244: 182 -188 (1989). Este método pode ser usado para criar análogos do polipeptídeo de OB com aminoácidos não-naturais. Ácidos Nucleicos de Não-codificação A presente invenção estende-se à preparação de nucleotideos sem sentido e ribozimas que podem ser usados para interferir com a expressão das proteínas moduladoras de peso no nível traducional. Esta abordagem utiliza ácido nucleico sem sentido e ribozimas para bloquear a tradução de um mRNA específico, ou por mascaramento que mRNA com um ácido nucleico sem sentido ou clivagem dele com uma ribozima. Ácidos nucleicos sem sentido são moléculas de DNA ou de RNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica [ver, Weintraub, Sei. Am., 162: 40 - 46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289 295 (1988)]. Na célula, eles hibridizam àquele mRNA, formando uma molécula de filamento duplo. A célula não traduz um mRNA complexo nesta forma de filamento duplo. Portanto, ácidos nucleicos sem sentido interferem com a 68 ΡΕ0777732 expressão de mRNA na proteína. Oligômeros de cerca de quinze nucleotídeos e moléculas que hibridizam para o códon de iniciação de AUG serão particularmente eficientes, uma vez que eles são fáceis de sintetizar e são prováveis de apresentar menos problemas do que moléculas maiores quando da introdução delas em células produtoras de peptídeo modulador de peso. Métodos sem sentido foram usados para inibir a expressão de muitos genes in vitro [(Marcus-Sekura, 1988, supra} Hambor e outros, J. Exp. Med., 168:1237 - 1245 (1988)].

Ribozimas são moléculas de RNA possuindo a capacidade para específicamente clivar outras moléculas de RNA de filamento único de uma maneira um tanto análoga para endonucleases de restrição de DNA. Ribozimas foram reveladas a partir da observação que que certos mRNAs têm a capacidade de extirpar seus próprios íntrons. Por modificação da sequência de nucleotídeos destes RNAs, pesquisadores foram capazes de engenheirar moléculas que reconhecem sequências de nucleotídeos específicas em um molécula de RNA e clivá-las [Cech. J. Am. Med. Assoe., 260:3030 - 3034 (1988)]. Uma vez que elas são específicas de sequência, apenas mRNAs com sequências particulares são inativados.

Investigadores identificaram dois tipos de ribozimas, ribozimas de tipo tetrahimena e de tipo de "cabeça de martelo". Ribozimas de tipo tetrahimena reconhecem sequências de quatro bases, enquanto de tipo "cabeça de martelo" reconhecem sequências de oito a onze bases. Quanto 69 ΡΕ0777732 mais longa a sequência de reconhecimento, mais provável é de ocorrer exclusivamente na especíe de mRNA alvo. Portanto, ribozimas de tipo cabeça de martelo são de preferência para ribozimas de tipo Tetrahimena para a inativação de uma espécie de mRNA especifico, e dezoito sequências de reconhecimento de bases são de preferência para sequências de reconhecimento menores.

As sequências de DNA descritas aqui podem assim ser usadas para preparar moléculas sem sentido contra e ribozimas que clivam mRNAs para proteínas modeladores de peso e seus ligantes, assim a inbição de expressão do gene de OB, e levando à adiposidade e ao ganho de peso aumentado.

Em uma outra modalidade, oligonucleotídeos curtos complementares à codificação e filamentos complementares do ácido nucleico de OB, ou regiões de não-codificação do gene de OB 5', 3' ou interno (intrônico) à região de codificação são providos pela presente invenção. Tais ácidos nucleicos são úteis como sondas, ou como sondas de oligonucleotídeos diretamente marcados, ou como iniciadores para a reação de cadeia de polimerase, para avaliação da presença de mutações no gene de OB, ou o nível de expressão de mRNA de OB. De preferência, os ácidos nucleicos de não-codificação da invenção são a partir do gene de OB ser humano.

Em uma modalidade específica, os ácidos nucleicos de não-codificação provêem para a recombinação homóloga 70 ΡΕ0777732 para a integração de um gene ampliável e/ou outras sequências reguladoras em proximidade ao gene de OB, por exemplo, para prover para níveis mais alto de expressão do polipeptídeo de OB, ou para superar uma mutação nas sequências reguladoras de gene de OB que previnem níveis adequados de expressão do polipeptídeo de OB (ver Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 91/06666, publicado em 16 de maio de 1991 por Skoultchi; Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 91/09955, publicado em 11 de julho de 1991 por Chappel; ver também Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/14092, publicado em 29 de novembro de 1990, por Kucherlapati e Campbell).

Produção de Polipetídeo de OB: Expressão e Síntese

Sequências de controle traducionais e transcri-pcionais são sequências reguladoras de DNA, tais como promotores, aumentadores, terminadores, e semelhantes, que provêem a expressão de uma sequência que codifica em uma célula de hospedeiro. Em células eucarióticas, sinais de poliadenilação são sequências de controle.

Uma sequência de codificação está "sob o controle" de sequências transcripcionais e traducionais em uma célula quando polimerase de RNA transcreve a sequência de codificação para dar mRNA, que é então trans-RNA fatiado e traduzido na proteína codificada pela sequência de codificação. 71 ΡΕ0777732

Uma "sequência de sinal" é incluído no inicio da sequência de codificação de uma proteína a ser expressa sobre a superfície de uma célula. Esta sequência codifica um peptídeo de sinal, terminal-N ao polipeptídeo maduro, que dirige a célula de hospedeiro para transloca o polipeptídeo. 0 termo "sequência de translocação de sinal" é também usado aqui para se referir a esta espécie de sequência de sinal. Sequências de translocação de sinal podem ser encontradas associadas com uma variedade de proteínas naturais para eucariótes e procariótes, e são frequentemente funcionais em ambos os tipos de organismos.

Uma sequência de DNA é "operativamente ligada" a uma sequência de controle de expressão quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e tradução daquela sequência de DNA. 0 termo "operativamente ligado" inclui tendo um sinal inicial apropriado (por exemplo, ATG) em frente da sequência de DNA a ser expressa e mantendo o quadro de leitura correto para permitir expressão da sequência de DNA sob o controle da sequência de controle de expressão e produção do produto desejado pela sequência de DNA. Se um gene que se deseja inserir em uma molécula de DNA recombinante não contém um sinal inicial apropriado, tal sinal inicial pode ser inserido a montante (5') de e em quadro de leitura com o gene.

Uma "sequência promotora" é uma região reguladora de DNA capaz de ligar polimerase de RNA em uma célula e inciar transcrição de uma sequência de codificação a 72 ΡΕ0777732 jusante (direção 3')· Para finalidades de definição da presente invenção, a sequência de promotor é ligada em seu terminal 3' pelo sitio de iniciação de transcrição e estende-se a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar trancrição em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da sequência promotora será encontrada um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por mapeamenteo com nuclease Sl), bem como domínios de ligação de proteína (sequências de consenso) responsável para a ligação de polimerase de RNA.

Uma outra característica desta invenção é a expressão das sequências de DNA descritas aqui. Como é bem conhecida na técnica, sequências de DNA podem ser expressas por operativamente ligá-las a uma sequência de controle de expressão em um vetor de expressão apropriado e empregando aquele vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.

Tais ligações operativas de uma sequência de DNA desta invenção a uma sequência de controle, naturalmente, inclui, se já não é parte da sequência de DNA, o fornecimento de um códon de iniciação, ATG, no quadro de leitura correto a montante da sequência de DNA.

Uma ampla variedade de combinações de vetor de hospedeiro/expressão podem ser empregados na expressão das sequências de DNA desta invenção. Vetores de expressão 73 ΡΕ0777732 úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA cromossomais, não cromossomais e sintéticos. Vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmideos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmideo de E. coli, col El, pCRl, pBR322, pMB9, pUC ou derivados de plasmideo pUC, por exemplo, vetores de pGEX, vetores de pET, pmal-c, pFLAG, etc., e seus derivados, plasmideos tal como RP4; DNAs de fagos, por exemplo, os derivados numerosos de fago λ, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, DNA de fago de filamento único e filamentoso e M13; plasmideos de levedura tais como o plasmideo de 2 μ ou seus derivados: vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de mamíferos ou de insetos; vetores derivados a partir de combinações de plasmideos e DNAs de fagos, tais como plasmideos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e semelhantes. Em uma modalidade, expressão de OB é conseguida em levedura de metilotrófica, por exemplo, levedura Pichia pastoris (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/03431, publicada em 5 de abril de 1990, por Brierley e outros; Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/10697, publicado em 20 de setembro de 1990, por Siegel e outros) . Em uma modalidade especifica, infra, um vetor de expressão é engenheirado para expressão de OB sob controle de sequências de sinais de fator de acasalamento alfa.

Qualquer de uma ampla variedade de sequências de 74 ΡΕ0777732 controle de expressão—sequências que controlam a expressão de uma sequência de DNA operativamente ligada a ela-pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências de DNA desta invenção. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, promotores prematuros ou tardios de SV40, CMV, vacínia, polioma ou adenovírus, o sistema de lac, o sistema de trp, o sistema de TAC, o sistema de TRC, o sistema de LTR, cL s principais regiões operadoras e promotoras de fago λ, as regiões de controle de proteína revestida de fd, o promotor para quinase de 3-fosfoglicerato ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase de ácido (por exemplo, Pho5), o promotor de AOX 1 de levedura de metilotrófica, os promotores de fatores de acasalamento alfa de levedura, e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células eucarióticas ou procarióticas ou seus vírus, e suas várias combinações.

Uma ampla variedade de células de hospedeiro unicelulares são também úteis em expressão das sequências de DNA desta invenção. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros procarióticos e eucarióticos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; fungos tais como leveduras (Saccharomyces e levedura metilotrópica tais como Pichia, Candida, Hansenula e Torulopsis); e células de animais, tais como CHO, células de Rl.l, e B-W e células LM, células de rim de macacos verde africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9), e células humanas e células de plantas em cultura de tecido. 75 ΡΕ0777732

Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros funcionaram igualmente bem para expressar as sequências de DNA desta invenção. Tampouco todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um versado na técnica será capaz de selecionar os vetores, sequências de controle de expressão, e hospedeiros adequados sem experimentação imprópria para realizar a expressão desejada sem se afastar do escopo desta invenção. Por exemplo, na seleção de um vetor, o hospedeiro deve ser considerado uma vez que o vetor deve funcionar nele. 0 número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópia, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos serão considerados.

Na seleção de uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores normalmente serão considerados. Estes incluem, por exemplo, a concentração relativa do sistema, sua capacidade de controlar, e sua compatibilidade com a sequência ou o gene de DNA particular a ser expresso, particularmente com relação as estruturas secundárias potenciais. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consideração de, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, suas caracteristicas de secreção, sua capacidade para dobrar proteínas corretamente, e suas necessidades de fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas 76 ΡΕ0777732 sequências de DNA expresso, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.

Considerando estes e outros fatores, uma pessoa versada na técnica será capaz de construir uma variedade de combinações de vetor/seqiiência de controle de expres-sao/hospedeiro que expressarão as sequências de DNA desta invenção sobre fermentação ou em cultura de animal em grande escala.

Em uma modalidade especifica, uma proteína de fusão de OB pode ser expressa. Uma proteína de fusão de OB compreende pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma proteína de não-OB unida via uma ligação de peptídeo a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de um polipeptídeo de OB. As sequências de não OB podem ser amino- ou carbóxi-terminal às sequências de OB. Mais de preferência, para a expressão estável de uma proteína de fusão de OB proteoliticamente ativa, a porção da proteína de fusão de não OB é unida via uma ligação de peptídeo ao amino-terminal do proteína de OB. Uma molécula de DNA recombinante que codifica tal proteína de fusão compreende uma sequência que codifica pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma proteína de não OB unida em quadro à sequência de codificação de OB, e de preferência codifica um sítio de clivagem para uma protease específica, por exemplo, trombina ou Fator Xa, de preferência na junta de OB e de não-OB. Em uma modalidade específica, a proteína de fusão é expressa em Escherichia coli ou em P. pastoris. 77 ΡΕ0777732

Em uma modalidade específica, infra, vetores foram preparados para expressar os genes de OB ser humano e de murino, com ou sem o códon para gen-49, em sistemas de expressão bacteriana e sistemas de expressão de levedura (Pichia) como proteínas de fusão. 0 gene de OB é preparado com um sítio de clivagem de endonuclease, por exemplo, usando-se iniciadores novos e PCR. É desejável confirmar sequências geradas por PCR, uma vez que a probabilidade de incluir uma mutação de ponto é maior com esta técnica. Um plasmídeo contendo uma histidina tag (His-tag) e um sítio de clivagem proteolítico é usado. A presença da histidina torna possível o isolamento seletivo de proteínas recom-binantes sobre uma coluna de quelação de Ni, ou por purificação de afinidade. 0 sítio de clivagem proteolítico, em uma modalidade específica, infra, um sítio de clivagem de trombina, é engenheirado de modo que o tratamento com a protease, por exemplo, trombina, liberará o polipeptídeo de OB madura de comprimento completo (isto é, faltando uma sequência de sinal).

Em um outro aspecto, o vetor de pGEX [Smith e outros, Gene 67:31 - 40 (1988)] pode ser usado. Este vetor funde o cDNA de S-transferase de glutationina de schistosoma japonicum à sequência de interesse. Proteínas bacterianas são cultivadas e proteínas recombinantes podem ser rapidamente purificadas sobre uma coluna de afinidade de glutationa reduzida. O veículo de GST pode subsequentemente ser clivado de proteínas de fusão por digestão com 78 ΡΕ0777732 proteases de sítio específico. Depois da clivagem, o veículo e a proteína de fusão não-clivada podem ser removidos por absorção sobre agarose de glutationa. Dificuldade com o sistema ocasionalmente aumenta quando a proteína codificada é insolúvel em soluções aquosas.

Expressão de proteínas recombinantes em sistemas bacterianos podem resultar em dobramento da proteína expressa, necessitando de redobramento. A proteína recombi-nante pode ser redobrada antes ou depois da clivagem para formar um polipeptídeo de OB funcionalmente ativo. 0 polipeptídeo de OB pode ser redobrado pelas etapas de (i) incubação da proteína em um tampão de desnaturação que contém um agente de redução, e então (ii) a incubação da proteína em um tampão que contém um agente de oxidação, e de preferência também contém um agente de solubilização de proteína ou um agente caotrópico, ou ambos. Pares de agente de redóxi adequados (redução/oxidação) incluem, mas não são limitados a, glutationa/dissulfeto de glutationa, cisti-na/cisteina, cistamina/cisteamina, e 2-mercaptoetanol/2-hidroxietildissulfeto reduzidos. Em um aspecto particular, a proteína de fusão pode ser solubilizada em um desna-turante, tal como uréia, antes da troca no tampão de redução. Em uma modalidade preferida, a proteína é também purificada, por exemplo, por cromatografia de Ni-quelação ou troca de íons, antes da troca no tampão de redução. Agentes de desnaturação incluem mas não são limitados a uréia e guanidina-HCl. A proteína recombinante é então diluída cerca de pelo menos 10 vezes, mais de preferência cerca de 100 vezes, em um tampão de oxidação que contém um 79 ΡΕ0777732 agente oxidante, tais como mas nao limitado a Tris-HCl a 0,1 mM, pH 8,0, EDTA a 0,1 M, NaCl a 0,15 M, glutationa oxidada a 0,3 Μ. A proteína de fusão é então incubada para cerca de 1 a cerca de 24 horas, de preferência cerca de 2 a cerca de 16 horas, à temperatura ambiente no tampão de oxidação. O tampão de oxidação pode compreender um agente de estabilização de proteína, por exemplo, um açúcar, um álcool ou um sulfato de amónio. O tampão de oxidação pode ulteriormente compreender um agente caotrópico em concentração baixa, para desestabilizar interações intramo-leculares incorretas e assim promover dobramento adequado. Agentes caotrópicos adequados incluem mas não são limitados a um detergente, um poliol, uma L-arginina, um guanidina-HC1 e um polietileno glicol (PEG) . É importante usar uma concentração bastante baixa do agente caotrópico para evitar desnaturação da proteína. A proteína redobrada pode ser concentrada por pelo menos cerca de 10 vezes, mais de preferência pela quantidade que ela foi diluída no tampão de oxidação.

Processos de fermentação bacteriana podem também resultar em uma preparação de proteína recombinante que contém níveis inaceitáveis de endotoxinas. Portanto, a invenção contempla a remoção de tais endotoxinas, por exemplo, por uso de anticorpos de endotoxinas específicas ou outras moléculas de ligação de endotoxina. A presença de endotoxinas podem ser determinada por técnicas padrão, tais como por emprego de Reagentes de E-TOXATE (Sigma, St. Louis, Missouri), ou com bioensaios. 80 ΡΕ0777732

Além do exemplo específico, os presentes inventores contemplam o uso de sistemas de expressão baculo-vírus, de mamíferos e de levedura para expressar a proteína de OB. Por exemplo, em sistemas de expressão de baculo-vírus, ambos os vetores de transferência de não-fusão, tais como mas não limitados a pVL941 (sítio de clonagem de BamHl; Summers), pVL1393 (sítio de clonagem de BamHl, Smal, Xbal, EcoRl, Notl, XmalII, BglII, e PstI; Invitrogen), pVL1392 (sito de clonagem de BglII, PstI, notll, XmalII, EcoRl, Xbal, Smal, e BamHl; Summers e Invitrogen), e pBlueBacIII (sítio de clonagem de BamHl, BglII, PstI, Ncol e HindIII, e com possível separação de recombinante azul/branco; Invitrogen), e vetores de transferência de fusão, tal como mas não limitado a pAc700 (sitio de clonagem de BamHl e Kpnl, em que o sítio de reconhecimento de BamHl se inicia com o códon de iniciação; Summers), pAc701 e pAc702 (mesmo que pAc700, com quadros de leitura diferentes), pAc360 (sítio de clonagem de BamHl de 36 pares de bases a jusante de um códon de iniciação de polihedrina; Invitrogen (195)), e pBlueBacHisA, B, C (três quadros de leitura diferentes, com sítio de clonagem de BamHl, BglII,

PstI, Ncol, e HindIII, um peptídeo de N terminal para purificação de ProBond, e separação de recombinante de azul/branco de placas; Invitrogen (220)).

Vetores de expressão de mamíferos para o uso na invenção incluem vetores com promotores induzíveis, tal como promotor de redutase di-hidrofolato (DHFR), por exemplo, qualquer vetor de expressão com um vetor de expressão 81 ΡΕ0777732 de DHFR, ou um vetor de co-ampliação de DHFR/metotrexato, tal como pED (sítio de clonagem PstI, Sall, Sbal, Smal, e EcoRI, com o vetor expressando tanto o gene clonado quanto o DHFR; ver Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Alternativamente, um vetor de co-ampliação de síntese glutamina/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sítio de clonagem de HindIII, Xbal, Smal, Sbal, EcoRI, and Bell, em que o vetor expressa síntase de glutamina e o gene clonado; Celltech). Em uma outra modalidade, um vetor que dirige expressão epissomal sob controle de Epstein Barr Virus (EBV) pode ser usado, tal como pREP4 (sítio de clonagem de BamHl, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindIII, Nhel, PvuII, e Kpnl, promotor de RSV-LTR constitutivo, marcador selecionável de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sítio de clonagem de BamHl, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindIII, Nhel, PvuII, e Kpnl, gene precoce imediato de hCMV constitutivo, marcador selecionável de higromicina Invitrogen), pMEP4 (sítio de clonagem de Kpnl, Pvul, Nhel, HindIII, Notl, Xhol, Sfil, BamHl, promotor de gene de metalotioneina lia induzível, marcador de selecionável higromicina; Invitrogen), pREP8 (sítio de clonagem de BamHl, Xhol, Notl, HindIII, Nhel e Kpnl, promotor de RSV-LTR, marcador selecionável de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sítio de clonagem de Kpnl, Nhel, HindIII, Notl, Xhol, Sfil e BamHl, promotor de RSV-LTR, marcador selecionável de G418; Invitrogen), e pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador selecionável de higromicina, peptídeo de N terminal purificável via resina ProBond e clivado por enteroquinase; Invitrogen). Vetores de expressão de 82 ΡΕ0777732 mamíferos selecionáveis para o uso na invenção incluem pRc/CMV (sítio de clonagem de HindIII, BstXI, Notl, Sbal e Apal, seleção de G418; Invitrogen), pRc/RSV (sítio de clonagem de HindIII, Spel, BstXI, Notl, Xbal, seleção de G418; Invitrogen), e outros. Vetores de expressão de mamíferos de vírus de vacínia (ver Kaufman, 1991, supra) para o uso de acordo com a invenção incluem mas não são limitados a pSCll (sítio de clonagem de Smal, seleção de TK- e β-gal), pMJ601 (sitio de clonagem de Sall, Smal, Afll, NarI, BspMII, BamHI, Apal, Nhel, SacII, Kpnl e HindIII; seleção de TK- e β-gal), e pTKgFIS (sítio de clonagem de EcoRI, PstI, Sall, Accl, HindII, Sbal, BamHI, e Hpa, seleção de TK ou XPRT).

Sistemas de expressão de levedura podem ser usados de acordo com a invenção para expressar polipeptídeo de OB. Por exemplo, o vetor de pYES2 de não-fusão (sítio de clonagem de Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, Saci, Kpnl e HindIII; Invitrogen) ou o pYESHisA, B, C de fusão (Xbal, Sphl, Shol, Notl, BstXI, EcoRI, BamHI, Saci, Kpnl, e HindIII, peptídeo de N terminal purificado com resina de ProBond e clivado com enteroquinase; Invitrogen), para mencionar apenas dois, podem ser empregados de acordo com a invenção. É ulteriormente pretendido que análogos de peptídeo modulador de peso de corpo pode ser preparado a partir de sequências de nucleotídeos derivados dentro do escopo da presente invenção. 83 ΡΕ0777732

Além da expressão recombinante de polipeptídeo de OB, a presente invenção prevê e totalmente possibilita a preparação de polipeptídeo de OB, seus fragmentos, usando-se as técnicas altamente desenvolvidas e bem conhecidas de síntese de peptídeo de fase sólida. A invenção contempla usando-se tanto o popular Boc quanto o Fmoc, bem como outras estratégias de grupo de proteção, para a preparação de seus fragmentos ou polipeptídeo de OB. Várias técnicas para redobramento e oxidação das cadeias laterais de cisterna para formar uma ligação de dissulfeto são bem conhecidas na técnica.

Anticorpos ao Polipeptídeo de OB

De acordo com a invenção, polipeptídeo de OB produzido recombinamente ou por síntese química, e fragmentos ou outros derivados ou seus análogos, incluindo proteínas de fusão, podem ser usadas como um imunógeno para gerar anticorpos que reconhecem o polipeptídeo de OB. Tais anticorpos incluem mas não são limitados a fragmentos policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia única, Far, e uma biblioteca de expressão de Fab.

Uma molécula é "antigênica" quando é capaz de específicamente interagir com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imuno-globulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T. Um polipeptídeo antigênico contém pelo menos cerca de 5 e 84 ΡΕ0777732 de preferência pelo menos cerca de 10 aminoácidos. Uma porção antigênica de uma molécula pode ser aquela porção que é imunodominante para o reconhecimento de receptor de célula T ou de anticorpo ou ela pode ser uma porção usada para gerar um anticorpo para a molécula por conjugação da porção antigênica a uma molécula de veiculo para imunização. Uma molécula que é antigênica não necessita ser por ela própria imunogênica, isto é, capaz de eliciar uma resposta imune sem um veiculo.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobina, incluindo anticorpos e seus fragmentos, que liga um epítopo especifico. O termo inclui anticorpos policonais, monoclonais e quiméricos, o último mencionado descrito em outros detalhes nas patentes U.S. nos. 4.816.397 e 4.816.567, bem como porções de antigeno de anticorpos, incluindo Fab, F(ab')2 e F(v) (incluindo anticorpos de cadeia única). Correspondentemente, a frase "molécula de anticorpo" em suas várias formas gramaticais como usada aqui contempla tanto uma molécula de imunoglubulina intacta quanto uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglubulina contendo o sitio de combinação de anticorpo. Um "sitio de combinação de anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída de cadeia leve e pesada variável e regiões hipervariáveis que especificamente liga o antigeno.

Exemplarmente moléculas de anticorpo são moléculas de imunoglubulina intactas, substancialmente 85 ΡΕ0777732 moléculas de imunoglubulina intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contém o paratope, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v), porções essas que são preferidas para o uso nos métodos terapêuticos descritos aqui.

Porções de Fab e F(ab')2 de molécula de anticorpos são preparadas pela reação proteolítica de papaina e pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticorpo substancialmente intactas por métodos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, a patente U.S. n° 4.342.566 por Theofilopolous e outros. Porções de molécula de anticorpo Fab' são bem conhecidos na técnica e são produzidos de porções de F(ab')2 seguidas por redução das ligações de dissulfeto ligando as duas porções de cadeia pesadas como com mercaptoetanol, e seguidas por alquilação do mercaptano de proteína resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intactas é preferido aqui. A frase "anticorpo monoclonal" em suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo tendo apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antígeno particular. Um anticorpo monoclonal assim tipicamente exibe uma afinidade de ligação única para qualquer antígeno com que ele imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada imunoespecífico para um antígeno diferente; por exemplo, um anticorpo monoclonal bisespecifico (quimérico). 86 ΡΕ0777732 0 termo " auxiliar" refere-se a um composto ou mistura que aumenta a resposta imune para um antigeno. Um auxiliar pode servir como um depósito de tecido que lentamente libera o antigeno e também como um ativador de sistema linfóide que não específicamente aumenta a resposta imune [Hood e outros, em Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Califórnia (1984)]. Frequentemente, um desafio primário com um antigeno sozinho, na ausência de um auxiliar, fracassará para eliciar uma resposta imune celular ou humoral. Auxiliares incluem, mas não são limitados a, auxiliar de Freund completo, auxiliar de Freund incompleto, saponina, géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo ou de hidrocarbonetos, hemocianinas de lapa keyhole, dinitrofenol e auxiliares potencialmente úteis tal como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacte-rium parvum. De preferência, o auxiliar é farmaceuticamente aceitável. Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para polipeptídeo de OB, ou seu derivado análogo ou fragmento. Para a produção de anticorpo, vários animais de hospedeiro podem ser imunizados por injeção com o polipeptídeo de OB, ou um seu derivado (por exemplo, fragmento ou proteína de fusão), incluindo mas não limitados a coelhos, murinos, ratos, carneiros, cabras, etc. Em uma modalidade, o seu 87 ΡΕ0777732 fragmento ou polipeptídeo de OB podem ser conjugados a um veículo imunogênico, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) ou hemocianina de lapa de keyhole (KLH) . Vários auxiliares podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, incluindo mas não limitado a geís minerais, de Freund (completo e incompleto) tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de lapa de keyhole, dinitrofenol e auxiliares seres humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Para a preparação de anticorpos monoclonais empurrados em direção ao polipeptídeo de OB, ou seu derivado, fragmento, análogo, qualquer técnica que provê para a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas podem ser usadas. Estas incluem mas não são limitadas à técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e outros, Nature, 265:495 - 497 (1975), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de B-célula [Kozbor e outros, Immunology Today, 4:72 (1983)], e a técnica de EBV-hibridoma para produzir anticorpos monoclonais seres humanos [Cole e outros, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, págs. 77 - 96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Linhas de células de produção de anticorpos, imortais podem ser criados por técnicas outras que não-fusão, tais como transformação direta de linfócitos de B com DNA oncogênico, ou transfecção com 88 ΡΕ0777732 vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier e outros, "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling e outros, "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" (1981); Kennett e outros, "Monoclonal Antibodies" (1980); ver também as patentes U.S. nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; e 4.493.890.

Em uma modalidade adicional da invenção, anticorpos monoclonais podem ser produzidos em animais livres de germe utilizando tecnologia recente (PCT/US90/02545). De acordo com a invenção, anticorpos seres humanos podem ser usados e podem ser obtidos por uso de hibridomas seres humanos [Cote e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:2026 - 2030 (1983)] ou por transformação de células B com vírus de EBV in vitro (Cole e outros, 1985, supra). De fato, de acordo com a invenção, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" [Morrison e outros, J. Bacteriol. 159 - 870 (1984); Neuberger e outros, Nature, 312:604 - 608 (1984); Takeda e outros, Nature, 314:452 -454 (1985)] por união dos genes a partir de uma molécula de anticorpo de murino específica por um polipeptídeo de OB juntamente com genes a partir de uma molécula de anticorpo ser humano de atividade biológica apropriada pode ser usada; tais anticorpos estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos quiméricos seres humanos ou humanizados são preferidos para o uso em terapia de doenças ou distúrbios humanos (descritas infra), uma vez que os anticorpos seres humanos ou humanizados são muito menos prováveis do que 89 ΡΕ0777732 anticorpos xenogênicos para induzir uma resposta imune, em particular uma própria resposta alérgica.

De acordo com a invenção, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (patente U.S. n° 4.946.778) podem ser adaptados para produzir anticorpos de cadeia única de polipeptídeo de OB específicos. Uma modalidade adicional da invenção utiliza as técnicas descritas para a contrução de bibliotecas de expressão de Fab [Huse e outros, Science, 246:1275 - 1281 (1989)] para permitir identificação fácil e rápida de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada para um polipeptídeo de OB, ou seus derivados ou análogos.

Fragmentos de anticorpos que contêm o idiotipo da molécula de anticorpo pode ser gerada por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não são limitados à: fragmento F(ab')2 que pode ser produzido por digestão de pepsina da molécula de anticorpo; aos fragmentos de Fab' que podem ser gerados por redução das pontes de dissulfeto do fragmento de F(ab')2, e aos fragmentos de Fab que podem ser gerados por tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente de redução.

Na produção de anticorpos, a separação para o anticorpo desejado pode ser realizada por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunossorvente ligado com enzima), imunoensaios de "sanduíches", ensaios de imunorradiométricos, reações de 90 ΡΕ0777732 precipitina de difusão por gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando-se marcas de amarelo-ouro coloidal, de enzima ou de radioisótopo, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação, ensaios de hemaglutinação), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, ensaios de iminoeletroforese, etc. Em uma modalidade, ligação de anticorpo é detectada por deteção de uma marca no anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo primário é detectado por deteção de ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo secundário é marcado. Muitos meios são conhecidos na técnica por deteção de ligação de um imunoensaio e estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, selecionar anticorpos que reconhecem um epítopo específico de um polipeptídeo de OB, um pode-se analisar hibridomas gerados para um produto que se liga a um fragmento de polipeptídeo de OB contendo tal epítopo. Para seleção de um anticorpo específico a um polipeptídeo de OB a partir de uma espécie particular de animal, pode-se selecionar na base de ligação positiva com polipeptídeo de OB expresso por ou isolado de células daquela espécie de animal.

Os anticorpos expostos acima podem ser usados em métodos conhecidos na técnica relativo à localização e à atividade do polipeptídeo de OB, por exemplo, para Western blotting, imagem de polipeptídeo de OB in situ, seus níveis de medição em amostras fisiológicas apropriadas, etc. 91 ΡΕ0777732

Em uma modalidade específica, anticorpos que agonizam ou antagonizam a atividade de polipeptídeo de OB podem ser gerados. Tais anticorpos podem ser testados usando-se os ensaios descritos infra para identificação de ligantes.

Em uma modalidade específica, anticorpos são desenvolvidos para imunizar coelhos com peptídeos sintéticos previstos pela sequência de proteína ou com proteínas recombinantes produzidas usando-se vetores de expressão bacteriana. A escolha de peptídeos sintéticos é produzido depois de análise cuidadosa da estrutura de proteína prevista, como descrita acima. Em particular, sequências de peptídeos entre sítios de clivagem putativos são escolhidos. Peptídeos sintéticos são conjugados a um veículo tal como hemocianina de KLH ou BSA usando-se carbodiimida e usado em auxiliar e Freunds para imunizar coelhos. A fim de preparar proteína recombinante, o vetor de pGEX pode ser usado para expressar o polipeptídeo (Smith e outros, 1988, supra). Alternativamente, pode-se usar apenas domínios hidrofílicos para gerar a proteína de fusão. A proteína expressa será preparada em quantidade e usada para imunizar coelhos em auxiliares de Freunds.

Em uma outra modalidade específica, polipeptídeo de OB recombinante é usado para imunizar galinhas, e os anticorpos de anti-OB de galinha são recuperados a partir de gema de ovo, por exemplo, por purificação de afinidade 92 ΡΕ0777732 sobre uma coluna de OB. De preferência, galinhas usadas em imunização são mantidas sob condições livres de patógenos específicos (SPF).

Em uma outra modalidade, anticorpos contra a leptina são gerados em murinos de OB/OB, que carecem de circulação de proteína de OB, e assim são esperados serem capazes de gerar uma resposta de antipolipeptídeo de OB uma vez que eles não serão tolerados para o polipeptídeo, e murinos de tipo selvagem. Células de baço de ambos os grupos de murinos podem ser fundidas com células de mieloma para preparar hibridomas para anticorpos monoclonais.

Em uma outra modalidade, polipeptídeo de OB recombinante é usado para imunizar coelhos, e os anticorpos policlonais são imunopurifiçados antes de outro uso. Os anticorpos purificados são particularmente úteis para ensaios semiquantitativos, particularmente para a deteção da presença de circulação de polipeptídeo de OB em soro ou em plasma.

Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra os peptídeos moduladores podem ser separados para várias propriedades; isto é, isótipo, epítopo, afinidade etc. De particular interesse são anticorpos monoclonais que neutralizam a atividade dos peptídeos moduladores. Tais monoclonais podem ser prontamente identificados em ensaios de atividades para os moduladores de peso. Anticorpos de alta afinidade são também úteis quando purificação de 93 ΡΕ0777732 imunoafinidade de modulador recombinante ou natural é possível.

De preferência, o anticorpo antimodulador usado nos métodos diagnósticos e terapêuticos desta invenção é um anticorpo policlonal purificado por afinidade. Mais de preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal (mAB). Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo antimodulador usados aqui estejam na forma de porções de Fab, Fab', F(ab')2 ou F(v) de moléculas de anticorpo inteiras.

Implicações Diagnósticas A presente invenção também refere-se a uma variedade de aplicações diagnósticas, incluindo métodos para a deteção da presença de condições e/ou estímulo que têm impacto sobre anormalidades em adiposidade ou peso de corpo, por referência a sua capacidade para eliciar as atividades que são medidas pelos presentes moduladores de peso. Como mencionado anteriormente, os peptídeos moduladores de peso podem ser usados para produzir anticorpos para eles mesmos por uma variedade de técnicas conhecidas, e tais anticorpos poderiam então ser isolados e utilizados como em testes para a presença de atividade transcripcional particular em células alvos suspeitas. Alternativamente, os ácidos nucleicos da invenção podem ser empregados em diagnósticos. 94 ΡΕ0777732

Diagnósticos com base em Anticorpo

Como sugerido anteriormente, um método diagnóstico útil na presente invenção compreende o exame de uma amostra ou um meio celular por meio de um ensaio incluindo uma quantidade eficaz de um antagonista para uma proteína moduladora, e mais de preferência um mAb. Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo de antimodulador usadas aqui estejam na forma de porções de Fab, Fab', F(ab')2 ou F(v) ou moléculas de anticorpo inteiras. Como anteriormente discutido, pacientes capazes de se beneficiarem deste método incluem aqueles que sofrem de câncer, AIDS, obesidade ou outras condições onde peso de corpo anormal é uma característica ou fator. Métodos para o isolamento do modulador e a indução de anticorpos antimo-duladores para a determinação e a otimização da capacidade de anticorpos antimoduladores auxiliar no exame das células alvos são bem conhecidos na técnica.

Também, anticorpos incluindo tanto anticorpos monoclonais quanto policlonais, e drogas que modulam a produção ou a atividade dos moduladores de controle de peso e outros fatores de reconhecimento e/ou suas sub-unidades podem possuir certas aplicações de diagnóstico e podem, por exemplo, ser utilizados para a finalidade de detectar e/ou medir condições onde anormalidades em peso de corpo são ou podem ser prováveis de desenvolver. Por exemplo, os peptídeos moduladores ou seus fragmentos ativos podem ser usados para produzir tanto anticorpos monoclonais quanto 95 ΡΕ0777732 policlonais por eles próprios em uma variedade de meios celulares, por técnicas conhecidas, tal como a técnica de hibridoma utilizando, por exemplo, células de mieloma e linfócitos de baço de murino. Estas técnicas são descritas em detalhes abaixo. Do mesmo modo, pequenas moléculas que imitam ou antagonizam a(s) atividade(s) dos fatores de reconhecimento de receptor da invenção podem ser descobertas ou sintetizadas, e podem ser usadas em protocolos de diagnósticos e/ou terapêuticos. A presença de moduladores de peso em células pode ser determinada pelos procedimentos imunológicos usuais aplicáveis para tais determinações. Numerosos procedimentos úteis são conhecidos. Três tais procedimentos que são especialmente úteis utilizam ou o fator de reconhecimento de receptor rotulado com um rótulo detectável, anticorpo de Abl rotulado com um rótulo detectável, ou anticorpo de Ab2 marcado com uma marca detectável. Os procedimentos podem ser sumarizados pelas seguintes equações em que o asterisco indica que a partícula é rotulada, e filamentos de "WM" para o modulador de peso: A. WM* + Abi = WM*Abi B. WM + Ab*i = WMAbi* C. WM + Abi + Ab2* = AbiWMAb2*

Os procedimentos e sua aplicação são todos familiares para aqueles versados na técnica e correspondentemente podem ser utilizados dentro do escopo da presente invenção. 0 procedimento "competitivo", Procedimento A, é 96 ΡΕ0777732 descrito nas patentes U.S. nos. 3.654.090 e 3.850.752. Procedimento B é representativo de técnicas de ensaio competitivos bem conhecidas. Procedimento C, o procedimento de "sanduíche", é descrito nas patentes U.S. nos. RE31.006 e 4.016.043. Ainda outros procedimentos são conhecidos tal como o procedimento de "anticorpo duplo" ou "DASP".

Em cada caso, os moduladores de peso a partir de complexos com um ou mais anticorpo(s) ou pares de ligação e um membro do complexo é rotulado com um rótulo detectável. O fato que um complexo se formou e, se desejado, a sua quantidade, pode ser determinada por métodos conhecidos aplicáveis à deteção de marcas.

Será visto a partir do exposto acima, que uma propriedade característica de Ab2 é que ele reagirá com Abi. Isto se deve ao fato de que Abl, criado em uma espécie de mamífero, foi usado em uma outra espécie com um antígeno para criar o anticorpo, Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser criado em cabras usando-se anticorpos de coelho como antígenos. Ab2 portanto seria anticorpo de anti-coelho criado em cabras. Para finalidades desta descrição e reivindicações, Abl será mencionado como um anticorpo modulador de antipeso ou primário, e Ab2 será mencionado como um anticorpo de anti-Abl ou secundário.

As marcas mais comumente empregadas para estes estudos são elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que fluorescem quando expostos a luz ultravioleta, e outros. 97 ΡΕ0777732

Numerosos materiais fluorescentes são conhecidos e podem ser utilizados como rótulos. Estes incluem, por exemplo, fluoresceina, rodamina e auramina. Um material de deteção particular é anticorpo de anticoelho preparado em cabras e conjugados com fluoresceína através de um isotiocianato.

Os moduladores de peso ou seus pares de ligação podem também ser marcados com um elemento radioativo ou com uma enzima. A marca radioativa pode ser detectada por qualquer dos procedimentos de contagem atualmente disponíveis. 0 isótipo preferido pode ser selecionado de 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, e 186Re. Rótulos de enzima são desse modo úteis, e podem ser detectados por quaisquer das presentemente técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluorospectrofotomé-tricas, amperométricas, ou gasométricas. A enzima é conjugada à partícula selecionada por reação com moléculas de ponte tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaral-deído e semelhantes. Muitas enzimas que podem ser usadas nestes procedimentos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-gluco-sidase, β-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. Nas patentes U.S. nos. 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043 são mencionados por meio de exemplo para sua revelação de material e método de rotulação substituta. 98 ΡΕ0777732

Em uma outra modalidade desta invenção, kits de teste para o uso por um especialista médico podem ser preparados para se determinar a presença ou a ausência de atividade transcripcional predeterminada ou capacidade de atividade transcripcional predeterminada em células alvos suspensas. De acordo com as técnicas de testagem discutidas acima, uma classe de tais kits conterá pelo menos um modulador de peso rotulado ou seu par de ligação, por exemplo, um anticorpo especifico para o mesmo, e direções, naturalmente, dependendo do método selecionado, por exemplo, "competitivo", "sanduíche", "DASP" e semelhantes. Os kits podem também conter reagentes periféricos tais como tampões, estabilizadores, etc.

Correspondentemente, o kit de teste pode ser preparado para a demonstração da presença ou capacidade de células para atividade transcripcional predeterminada, que compreende: (a) uma quantidade predeterminada de pelo menos um componente imunoquimicamente reativo obtido pela fixação direta ou indireta do presente modulador de peso ou um par de ligação específico para o mesmo, para um rótulo detectável; (b) outros reagentes; e (c) instruções para o uso do dito kit.

Mais específicamente, o kit de teste de diagnóstico pode compreender: 99 ΡΕ0777732 (a) uma quantidade conhecida do modulador de peso como descrita acima (ou um par de ligação) em geral ligado a uma fase sólida para formar um imunossor-vente, ou na alternativa, ligada a uma etiqueta adequada, ou de mais de um de tais produtos finais, etc. (ou seus pares de ligação) um de cada; (b) se necessário, outros reagentes; e (c) instruções para o uso do dito kit de teste.

Em uma outra variaçao, o kit de teste pode ser preparado e usado para as finalidades afirmadas acima, que opera de acordo com um protocolo predeterminado (por exemplo, "competitivo" , "sanduíche", "anticorpo duplo", etc.) e compreende: (a) um componente rotulado que foi obtido por acoplamento do modulador de peso para um rótulo detectável; (b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais pelo menos um reagente é um ligante ou um ligante imobilizado, ligante esse que é selecionado do grupo que consiste em: (i) um ligante capaz de ligar o componente rotulado (a); (ii) um ligante capaz de se ligar com um par de ligação do componente rotulado (a); (iii) um ligante capaz de se ligar com pelo menos um do(s) componente(s) a se determinar; e (iv) um ligante capaz de se ligar com pelo 100 ΡΕ0777732 menos um dos pares de ligação ou pelo menos um do(s) componente(s) a serem determinados; e (c) instruções para o desempenho de um protocolo para a deteção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reação imunoquímica entre o modulador de peso e um par de ligação especifico para o mesmo.

Diagnóstico Com Base de Ácido Nucleico

Como demonstrado nos exemplos, infra, ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para detectar defeitos associados com defeitos no polipeptideo de OB que resultam em fenótipos obesos. Por exemplo, sondas de ácido nucleico (por exemplo, em análise de Northern ou análise de RT-PCR) podem ser usadas para se determinar se um fenótipo é associado com a falta de expressão de mRNA de OB, ou expressão de mRNA de OB não-funcional, por exemplo, como murinos de db/db (onde a deficiência resulta da falta de um receptor de OB) ou onde uma mutação fornece um mRNA não-transcrito. Além do mais, as técnicas de diagnósticos à base de ácido nucleico da invenção podem ser usadas em combinação com técnicas à base de anticorpos para ulterior-mente desenvolver uma compreensão molecular de fenótipos anoréxicos ou obesos.

Os clones de cDNA ser humano que foram recentemente isolados, foram sequenciados como apresentados aqui. Isto facilita a determinação da sequência completa do 101 ΡΕ0777732 gene ser humano (ver figura 20A até C; SEQ ID N°:22) . Sequências de DNA a partir dos itrons do gene de OB foram obtidas (figura 20), e estas foram usadas para preparar iniciadores de PCR para ampliar por PCR a sequência de codificação do gene de OB de DNA genômico ser humano de modo a identificar mutações ou variantes alélicas do gene de OB, todos de acordo com os protocolos descritos em detahes anteriores aqui. Iniciadores de PCR para aplificar OB genômico ser humano são descritos em um exemplo especifico, infra. A hipótese atual é que mutações heterozigotas no gene de OB serão associadas com obesidade suave/moderada enquanto mutações homozigotas seriam associadas com testes de diagnósticos com base na sequência de DNA para obesidade. Se isto é verdadeiro, permitiria a determinação de pessoas em risco para o desenvolvimento e obesidade e tornaria possível a aplicação de tratamento de droga e/ou mudanças no estilo de vida antes que um peso de corpo aumentado seja totalmente desenvolvido.

Alternativamente, a presença de microssatélites que segregam com formas mutantes de OB ser humano podem ser usados para diagnose. Vários iniciadores de PCR, incluindo aqueles à base da sequência de nucleotideos providos na figura 20A até C, possam ser usados neste aspecto. O gene de OB pode também ser útil diagnosti-camente para medições de sua proteína e RN A codificado em 102 ΡΕ0777732 distúrbios nutricionais particulares, se RNA de OB e/ou sua proteina codificada está não-regulado ou regulado por baixo. Assim, se uma pessoa obesa têm niveis aumentados de OB, pareceria que o problema é a ajusante de OB, enquanto se OB é reduzido, pareceria que niveis inapropriadamente baixos de OB poderiam ser a causa de obesidade (se ou não o defeito está no gene de OB) . De modo inverso, se um paciente de câncer ou de AIDS cuja perda de peso tinha níveis elevados de OB, pode ser concluído que inapropriadamente alta expressão de OB é responsável para a perda de peso. O cDNA ser humano clonado será de uso para a medição dos níveis de RNA de OB ser humano. Além disso, proteina humana recombinante será preparada e usada para desenvolver imunoensaios para possibilitar a medição da gordura e talvez níveis de plasma da proteína de OB.

Implicações Terapêuticas

Os polipeptídeos, os ácidos nucleicos e os anticorpos da invenção têm potencial terapêutico significativo. De preferência, uma quantidade terapeuticamente eficaz de tal agente é administrado em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a composições e entidades moleculares que são fisiologicamen-te toleráveis e não tipicamente produzem uma reação similarmente adversa ou alérgica, tais como distúrbio gástrico, 103 ΡΕ0777732 vertigem, e semelhantes, quando administradas a um ser humano. De preferência, como usado aqui, o termo "farma-ceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do govêrno federal ou estadual ou listada na U.S. Pharmacopeia ou outras farmacopeias em geral rec-nhecidas para o uso em animais, e mais particularmente em seres humanos. O termo "veiculo" refere-se a um diluente, auxiliar, excipiente ou veiculo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintético, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e semelhantes. Água ou soluções de salmoura em solução e dextrose aquosa e soluções de glicerol são de preferência empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmaceuticamente adequados são descritos em Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990). A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada aqui para significar uma quantidade suficiente para reduzir por pelo menos cerca de 15%, de preferência por pelo menos 50%, mais de preferência por pelo menos 90%, e mais de preferência prevenir, um déficit clinicamente significativo na atividade, função e resposta do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar melhora em uma condição clinicamente significativa no hospedeiro. 104 ΡΕ0777732

Administração de polipeptídeos de OB recombinante resulta em perda de peso, em particular, um diminuição em tecido de gordura. 0 polipeptídeo de OB pode ser preparado usando-se vetores de expressão bacterianos e/ou de mamíferos padrão, sinteticamente, ou purificados a partir do plasma ou do soro, todos como indicados em detalhes anteriormente aqui. Alternativamente, expressão aumentada de polipeptídeo de OB natural pode ser induzida por técnicas de recombinação homóloga, como descritas supra.

Redução de atividade de polipeptídeo de OB (por desenvolvimento de antagonistas, inibidores, uso de anticorpos de neutralização, ou moléculas sem sentido) resultaria em ganho de peso como deve ser desejável para o tratamento da perda de peso associada com câncer, AIDS ou anorexia nervosa. Modulação de atividade de OB pode ser útil para a redução de peso de corpo (por aumento de sua atividade) ou aumentando peso de corpo (por diminuição de sua atividade).

Tratamento Terapêutico com Base em Polipeptídeo

Na análise mais simples, o gene de OB determina o peso de corpo em mamíferos, em particular murinos e homens. 0 produto de gene de OB, e, correspondentemente, moléculas cognatas, parecem ser parte de uma trajetória de sinalização pela qual o tecido adiposo se comunica com o cérebro e outros órgãos. Acredita-se que o polipeptídeo de OB é por ele próprio uma molécula de sinalização, isto é, um hor-mônio. 105 ΡΕ0777732 O polipeptídeo de OB, ou seu fragmento funcionalmente ativo, ou um seu antagonista, pode ser administrado oralmente ou parenteralmente, de preferência parente-ralmente. Uma vez que homeostase metabólica é um processo continuo, administração de liberação controlada de polipeptídeo de OB é preferida. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado usando-se infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, um emplastro transdermal, lipossomas, ou outros modos de administração. Em uma modalidade, um bomba pode ser usada [Langer e outros, eds., Medicai Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald e outros. Surgery. 88:507 (1980); Saudek e outros, N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen e outros, eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger e outros, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); ver também Levy e outros, Science, 228:190 (1985); During e outros, Ann. Neurol, 25:351 (1989); Howard e outros, J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. Em ainda uma outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, o cérebro, assim necessitando apenas uma fração da dose sistémica [ver, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, vol. 2, págs. 115 - 138 (1984)]. Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por 106 ΡΕ0777732

Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Em uma outra modalidade, o composto terapêutico pode ser fornecido em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, 1990 supra); Treat e outros, em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353 - 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317 - 327; ver em geral ibid.)

Em um outro aspecto, células recombinantes que foram transformadas com o gene de OB e que expressam altos níveis do polipeptídeo podem ser transplantadas em um indivíduo que necessita de polipeptídeo de OB. De preferência células autólogas transformadas com OB são transplantadas para evitar rejeição; alternativamente, a tecnologia está disponível para proteger células não-autólogas que produzem fatores solúveis dentro de uma matriz de polímero que previne rejeição e reconhecimento imune. 0 polipeptídeo de OB pode ser fornecido por rotas intravenosas, intraarteriais, intraperitoniais, intramusculares ou subcutâneas de administração. Alternativamente, o polipeptídeo de OB, formulado adequadamente, pode ser administrado por administração nasal ou oral. Um fornecimento constante de OB pode ser assegurado por prover um dose terapeuticamente eficaz (isto é, uma dose eficaz para induzir mudanças metabólicas em um indivíduo) nos intervalos necessários, por exemplo, diariamente, a cada 12 horas, etc. Estes parâmetros dependerão da severidade da 107 ΡΕ0777732 condição de doença a ser tratada, de outras ações, tal como modificação de dieta, que são implementadas, do peso, da idade, e do sexo do indivíduo, e de outros critérios, que possam ser protamente determinados de acordo com a boa prática médica por aqueles versados na técnica.

Composições Farmacêuticas

Em ainda um outro aspecto da presente invenção, são providos composições farmacêuticas dos materiais acima. Tais composições farmacêuticas podem ser para a administração por injeção, ou por formas orais, pulmonares, nasais ou outras formas de administração. Em geral, compreendido pela invenção são composições farmacêuticas que compreendem quantidades eficazes de produtos derivados ou proteína da invenção juntamente com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, auxiliares e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de vários conteúdos de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e concentração iônica; aditivos tais como detergentes e agentes de solubilização (por exemplo, Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabis-sulfito de sódio), conservantes (por exemplo, timerosol, álcool benzílico) e substâncias de aumento de volume (por exemplo, lactose, manitol); incorporação do material para dar preparações em partículas de compostos poliméricos tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. ou para dar lipossomas. Ácido hilaurônico pode também ser usado. 108 ΡΕ0777732

Tais composições podem influenciar a taxa, estabilidade, estado físico de liberação in vivo, e a taxa de liberação in vivo das presentes proteínas e derivados. Ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) págs. 1435 - 1712 que são incorporados aqui por referência. As composições podem ser preparadas em forma líquida, ou pode ser em pó seco, tal como a forma liofilizada.

Fornecimento Oral e ingredientes

Comtemplado para o uso aqui são formas de dosagem sólidas orais, que são descritas em geral em Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co. , Easton, PA 18042) em Chapter 89, que é incorporado aqui por referência. Formas de dosagem sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, comprimidos ou pastilhas, hóstias ou péletes. Também, encapsulação proteinóide ou lipossomal pode ser usada para formular as presentes composições (como, por exemplo, microesferas proteinóides relatadas na patente U.S. n° 4.925.673). Encapsulação lipossomal pode ser usada e os lipossomas podem ser derivados com vários polímeros (por exemplo, na patente U.S. n° 5.013.556). Uma descrição possível de formas de dosagem sólidas para a terapêutica é dada por Marshall, em Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed. (1979), incorporado aqui por referência. Em geral, a formulação incluirá a proteína (ou proteína quimicamente modificada) , e ingredientes inertes que 109 ΡΕ0777732 permitem a proteção contra o ambiente estomocal, e liberção do material biologicamente ativo no intestino.

Também específicamente contemplado são formas de dosagem orais das proteínas derivadas. Proteína pode ser quimicamente modificada de modo que o fornecimento oral do derivado seja eficaz. Em geral, a modificação química contemplada é a fixação de pelo menos uma porção à própria molécula de proteína (ou peptideo), onde a dita porção permite (a) inibição de proteólise; e (b) absorção para dentro da corrente sanguínea a partir do estômago ou do intestino. Também desejado é o aumento na estabilidade global da proteína e aumento no tempo de circulação no corpo. Exemplos de tais porções incluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e poliprolina. Abuchowski e outros, 1981, supra; Newmark e outros, J. Appl. Biochem., 4:185 -189 (1982). Outros polímeros que poderiam ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano. Preferido para o uso farmacêutico, como indicado acima, são porções de polietileno glicol.

Para a proteína (ou derivado) o local de liberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno ou o íleo), ou o intestino grosso. Aquele versado na técnica tem formulações disponíveis que não se dissolverão no estômago, ainda liberarão o material no duodeno ou em outra parte no intestino. De preferência, a 110 ΡΕ0777732 liberação evitará os efeitos nocivos do ambiente do estômago, ou por proteção da proteina (ou derivado) ou por liberação do material biologicamente ativo além do ambiente de estômago, tal como no intestino.

Para assegurar resistência gástrica, um revestimento impermeável para pelo menos pH 5,0 é essencial. Exemplos dos ingredientes inertes comuns que são usados com revestimento entéricos são trimetilato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulose (CAP) , Eudragit L, Eudragit S, e "Shellac". Estes revestimentos podem ser usados como películas mistas.

Um revestimento ou uma mistura de revestimentos podem também ser usados sobre comprimidos, os quais não têm a finalidade de proteção contra o estômago. Isto pode incluir revestimentos de açúcar, ou revestimentos que podem produzir o comprimido mais fácil para engolir. Cápsulas podem consistir em uma casca dura (tal como gelatina) para o fornecimento de terapêutica seca, isto é, pó; para formas líquidas, uma casca de gelatina mole pode ser usada. 0 material de casca de hóstias poderia ser amido grosso ou outro papel coméstivel. Para pílulas, pastilhas, tabeletes moldados ou comprimidos triturados, técnica de massa úmida podem ser usados. 111 ΡΕ0777732 0 terapêutico pode ser incluído na formulação como múltiplas partículas finas na forma de grânulos ou péletes de tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para a administração de cápsula poderia também ser como um pó, buchas levemente comprimidas ou mesmo como comprimidos. 0 terapêuctico poderia ser preprado por compressão.

Agentes aromatizantes e corantes podem todos serem incluídos. Por exemplo, a proteína (ou derivado) pode ser formulada (tal como por encapsulação de lipossoma ou de microesfera) e então ulteriormente contida dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada contendo agentes aromatizantes e corantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do terapêutico com um material inerte. Estes diluentes poderiam incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactose, lactose anidra, celulose, sacarose, dextranos e amidos modificados. Certos sais inorgânicos podem também ser usados como materiais de enchimento trifosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.

Desintegrantes podem ser incluídos na formulação da terapêutica em uma forma de dosagem sólida. Materiais usadas como desintegrantes incluem mas não são limitados a amido incluindo o desintegrante comercial com base em 112 ΡΕ0777732 amido, Explotab. Glicolato de amido de sódio, Amberlite, carboximetilcelulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, carboximetil celulose de ácido, esponja natural, e bentonita podem ser usados. Uma outra forma dos desintegrantes são resinas de troca catiônicas insolúveis. Gomas em pó podem ser usadas como desintegrantes e como aglutinantes e estes podem incluir gomas em pó tal como ágar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínico e seu sal de sódio são também úteis como desintegrantes.

Aglutinantes podem ser usados para se manter o agente terapêutico juntos para formar um comprimido duro e incluem materiais a partir de produtos naturais tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC), etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC) . Polivinil pirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetil celulose (HPMC) poderiam ser usados em soluções alcóolicas para granular o terapêutico.

Um agente antifriccional pode ser incluido na formulação do terapêutico para prevenir agarramento durante o processo de formulação. Lubrificantes podem ser usados como uma camada entre o terapêutico e a parede de matriz, e estes podem incluir mas não são limitados ao: ácido esteárico incluindo seu sais de magnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina liquida, óleos e ceras vegetais. Lubrificantes solúveis podem também ser usados tais como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de 113 ΡΕ0777732 magnésio, polietileno glicol de vários pesos moleculares, e Carbowax 4000 e 6000.

Deslizantes que devem aperfeiçoar as propriedades de fluxo da droga durante a formulação e auxiliar a redisposição durante a compressão devem ser adicionados. Os deslizantes podem incluir amido, talco, silica pirogênica e silicoaluminato hidratado.

Para auxiliar a dissolução do terapêutico no ambiente aquoso, um tensoativo deve ser adicionado como um agente umectante. Tensoativos podem incluir detergentes aniônicos tais como lauril sulfato de sódio, sulfossucci-nato de sódio de dioctila e sulfonato de sódio de dioctila. Detergentes catiônicos devem ser usados e poderiam incluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetômio. A lista de detergente não iônicos potenciais que poderiam ser incluídos na formulação com tensoativos são lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose, e carboximetil celulose. Estes tensoativos poderiam estar presentes na formulação da proteína ou do derivado ou sozinho ou como uma mistura em razões diferentes.

Aditivos que potencialmente aumentam a absorção de proteína (ou derivado) são, por exemplo, os ácidos graxos, ácido oléico, ácido linoléico e ácido linolênico. 114 ΡΕ0777732

Formulação de liberação controlada pode ser desejável. A droga poderia ser incorporada em uma matriz inerte que permite liberação por ou mecanismos de difusão ou de lixiviação, isto é, gomas. Matrizes de degeneração lenta podem também ser incorporadas na formulação. Uma outra forma de uma liberação controlada deste terapêutica é por um método com base no sistema terapêuticos de Oros (Alza Corp.), isto é, a droga é encerrada em uma membrana semipermeável que permite a água entrar e empurrar a droga para fora através de uma única abertura pequena devido a efeitos osmóticos. Alguns revestimento entéricos também têm efeito de liberação retardada.

Outros revestimentos podem ser usados para a formulação. Estes incluem uma variedade de açúcares que poderiam ser aplicados em uma panela de revestimento. 0 agente terapêutico poderia também ser dado em um comprimido de película revestida; os materiais usados neste caso são divididos em 2 grupos. 0 primeiro são os materiais não entéricos e incluem metil celulose, etil celulose, hidro-xietil celulose, metilhidróxi-etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil-metil celulose, carbóxi-metil celulose de sódio, providona e polietileno glicóis. 0 segundo grupo consiste nos materiais entéricos que são comumente ésteres de ácido ftálico.

Uma mistura de materiais devem ser usados para prover o ótimo revestimento de película. 115 ΡΕ0777732

Revestimento de película pode ser realizado em um revestidor de panela ou em um leito fluidizado ou por revestimento de compressão.

Fornecimento Pulmonar

Também contemplado aqui é o fornecimento pulmonar da presente proteína (ou seus derivados). A proteína (ou derivado) é fornecida aos pulmões de um mamífero enquanto inalando e passagens através do revestimento epitelial do pulmão para a corrente sanguínea. Outros relatos desta incluem Adjei e outros, Pharmaceutical Research, 7(6):565-569 (1990); Adjei e outros, International Journal of Pharmaceutics, 63:135 -144 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet e outros, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143 - 146 (1989) (endotelina-1); Hubbard e outros, Annals of Internai Medicine, 3(3):206 - 212 (1989) (al-antitripsina); Smith e outros, J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (al-proteinase); Oswein e outros, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (março de 1990) (hormônio de crescimento ser humano recombinante); Debs e outros, J. Immunol., 140:3482 - 3488 (1988) e Platz e outros, na patente U.S. n° 5.284.656 (fator de estimulação de colónia de granulócito). Contemplado para o uso na prática desta invenção são uma ampla faixa de dispositivos mecânicos destinados para fornecimento pulmonar de produtos terapêuticos, incluindo mas não 116 ΡΕ0777732 limitados a nebulizadores, inaladores de dose medida, e inaladores em pó, todos dos quais são familiares por aqueles versados na técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis para a prática desta invenção são o nebulizador Ultravent, produzido por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; e o nebulizador Acorn II, produzido por Marquest Medicai Products, Englewood, Colorado; o inalador de dose medida Ventolin, produzido por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, produzido por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos os tais dispositivos de uso de formulações adequadas para a distribuição de proteína (derivado). Tipicamente, cada formulação é específica ao tipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso de um material propelente apropriado, além dos diluentes auxiliares e/ou veículos usuais úteis na terapia. Também, o uso de lipossomas, microcápsulas ou microesferas, complexos de inclusão, ou outros tipos de veículos são contemplados. Proteína quimicamente modificada pode ser também preparada em formulações diferentes dependendo do tipo de modificação quimica ou do tipo de dispositivo empregado.

Formulações adequadas para o uso com um nebulizador, ou a jato ou ultra-sônica, tipicamente compreenderão proteína (ou derivado) dissolvidos em água em 117 ΡΕ0777732 uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de proteína biologicamente ativa por ml de solução. A formulação pode também incluir tampão e um simples açúcar (por exemplo, para estabilização e regulação de proteína de pressão osmótica). A formulação de nebulizador pode também conter um tensoativo, para reduzir ou prevenir agregação de superfície induzida da proteína causada por atomização da solução na formação do aerosol.

Formulações para o uso com um dispositivo inalador medido por dose em geral compreenderão um pó finamente dividido contendo a proteína (ou derivado) suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para esta finalidade, tais como um clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodi-fluorometano, diclorotetrafluoroetanol, e 1,1,1,2-tetra-fluoroetano, ou suas combinações. Tensoativos adequados incluem triolato de sorbitano e lecitina de soja. Ácido oléico também pode ser útil como um tensoativo.

Formulações para dispersão a partir de um dispositivo inalador de pó compreenderão um pó seco dividido contendo proteína (ou derivado) e podem também incluir um agente de aumento de volume, tal como lactose, sorbitol, sacarose ou manitol em quantidades que facilitam a dispersão do pó a partir do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da formulação. A proteína (ou derivado) deve 118 ΡΕ0777732 mais vantajosamente ser preparada em forma de partículas com um tamanho médio de partícula de menos do que 10 μπι (ou micra), mais de preferência 0,5 a 5 μιτι, para fornecimento mais eficaz ao pulmão distai.

Fornecimento Nasal

Fornecimento nasal da proteína (ou derivado) é também contemplado. Fornecimento nasal permite a passagem da proteína para a corrente sanguínea diretamente depois da administração do produto terapêutico ao nariz, sem a necessidade de deposição do produto no pulmão. Formulações para o fornecimento nasal incluem aquelas com dextrano ou ciclodextrano. Métodos de Tratamento, Métodos de Preparação de um Medi-camento

Em ainda um outro aspecto da presente invenção, são providos métodos de tratamento e produção de um medicamento. Condições aliviadas por ou modulado pela administração dos presentes derivados são aqueles indicados acima.

Dosagens

Para todas as moléculas acima, como ulteriores estudos são conduzidos, informação emergirão com referência aos níveis de dosagens apropriados para o tratamento de várias condições em vários pacientes, e o trabalhador 119 ΡΕ0777732 normalmente versado, considerando o contexto terapêutico, a idade e a saúde geral do receptor, serão capazes de determinar a dosagem adequada. Em geral, para injeção ou infusão, a dosagem será entre 0,01 μρ de proteína biologicamente ativa/kg de peso de corpo, (o cálculo da massa da proteína sozinha, sem modificação química), e 10 mg/kg (com base na mesma). A escala de dosagem pode variar, dependendo da meia-vida de circulação da proteína ou do derivado usado, se o polipeptídeo é derivado por dose de bólus ou infusão contínua, e a formulação usada.

Administração com Outros Compostos

Para terapia associada com obesidade, pode-se administrar a presente proteína (ou derivados) em combinação com uma ou mais composições farmacêuticas usadas para o tratamento de outras complicações clínicas de obesidade, tais como aquelas usados para o tratamento de diabetes (por exemplo, insulina), pressão sanguínea alta, colesterol alto, e outras condições adversas incidentes à obesidade. Também, outros supressores de apetite podem ser co-adminitrados, por exemplo, anfetaminas. Administração pode ser simultânea (por exemplo, administração de uma mistura da presente proteína e insulina) ou pode ser em série.

Tratamento Terapêutico com Base de Ácido Nucleico O gene de OB poderia ser introduzido para dentro de células de gordura humana para desenvolver terapia de 120 ΡΕ0777732 gene para a obesidade. Tal terapia seria esperada diminuir o peso de corpo. De modo inverso, a introdução de cons-trutos sem sentidos em células de gordura humana reduzem os niveis de polipeptídeo de OB ativo e seria previsto aumentar adiposidade do corpo.

Em uma modalidade, um gene que codifica um polipeptídeo de OB é introduzido in vivo em um vetor virai. Tais vetores incluem um vírus de DNA defeituoso ou atenuado, tais como mas não limitados a vírus de herpes simplex (HSV), papillomavírus, vírus Epstein Barr (EBV), adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), e semelhantes. Vírus defeituosos, que totalmente ou quase totalmente carecem de genes virais, são preferidos. Vírus defeituoso não é contagioso depois da introdução para dentro de uma célula. Uso de vetores virais defeituosos permite a administração a células em uma área localizada específica, sem preocupação que o vetor pode infectar outras células. Assim, tecido adiposo pode ser específicamente visado. Exemplos de vetores particulares incluem, mas não são limitados a, um vetor de vírus de herpes defeituoso 1 (HSV1) [Kaplitt e outros, Molec. Cell. Neurosci. 2:320 -330 (1991)], um vetor de adenovírus atenuado, tal como o vetor descrito por Stratford-Perricaudet e outros, J. Clin. Invest. 90:626 - 630 (1992), e um vetor de vírus de adeno-associado defeituoso [Samulski e outros, J. Virol., 61:3096 - 3101 (1987); Samulski e outros, J. Virol., 63:3822 - 3828 (1989) ] . 121 ΡΕ0777732

Em uma outra modalidade, o gene pode se introduzido em um vetor retroviral, por exemplo, como descrito por Anderson e outros, a patente U.S. n° 5.399.346; Mann e outros, Cell, 33:153 (1983); Temin e outros, a patente U.S. n° 4.650.764; Temin e outros, a patente U.S. n° 4.980.289; Markowitz e outros, J. Virol., 62:1120 (1988); Temin e outros, a patente U.S. n° 5.124.263; Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 95/07358, publicado em 16 de março de 1995, por Dougherty e outros; and Kuo e outros, Blood, 82:845 (1993).

Alternativamente, o vetor pode ser introduzido in vivo por lipofecção. Nas últimas décadas, houve um aumento de uso de lipossomas para a encapsulação de transfecção de ácidos nucleicos in vitro. Lipídios catiônicos sintéticos para limitar as dificuldades e perigos encontrados com transfecção mediada por lipossoma pode ser usada para preparar lipossomas para transfecção in vivo de um gene codificando um marcador [Felgner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7413 - 7417 (1987); ver Mackey e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8027-8031 (1988)]. O uso de lipídios catiônicos podem promover encapsulação de ácido nucleicos negativamente carregados, e também promovem fusão com membranas de célula negativamente carregadas [Felgner e outros, Science 337:387 - 388 (1989)]. 0 uso de lipofecção para introduzir genes exógenos em organismos específicos in vivo tem certas vantagens. O alvo molecular de lipossomas para células específicas representa uma área de benefício. É claro que a direção de transfecção para tipos de células 122 ΡΕ0777732 particulares seria particularmente vantajosa em um tecido com heterogeneidade celular, tais como pâncreas, fígado, rim e cérebro. Lipídios pode ser quimicamente acoplados a outras moléculas para a finalidade de alvo (ver Mackey e outros, 1988, supra) . Peptídeos visados, por exemplo, hormônios, neurotransmissores, e proteínas tais como anticorpos, ou moléculas de não-peptídeos poderiam ser acoplados a lipossomas quimicamente. É também possível introduzir o vetor in vivo como um plasmídeo de DNA exposto. Vetores de DNA expostos para a terapia de gene podem ser introzudidos dentro das células de hospedeiros desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão de célula, DEAE dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, uso de uma goma de gene, ou uso de um transportador de vetor de DNA (ver, por exemplo, Wu e outros, J. Biol. Chem., 267:963 - 967); Wu e outros, J. Biol. Chem. 263:14621 - 14624 (1988); Hartmunt e outros, no pedido de patente canadense n° 2.012.311, depositado em 15 de março de 1990) .

Aplicações Agrícolas 0 gene de OB pode também ser isolado de animais domésticos, e o polipeptídeo de OB correspondente obtido desse modo. Em um exemplo específico, infra, a sonda derivada de gene de OB de murino hibridiza as sequências de codificação homólogas correspondentes de numerosas espécies 123 ΡΕ0777732 de animais. Como discutido para terapias humanas, proteínas recombinantes podem também ser preparadas e administradas a animais domésticos. Administração do polipeptídeo pode ser implementada para produzir animais alimentícios mais magros, tais como gado de corte, suíno, aves domésticas, carneiro, etc. De preferência, um polipeptídeo de OB autólogo é administrado embora a invenção contempla a administração também de polipeptídeo anti-autólogo. Uma vez que o polipeptídeo de OB consiste em cerca de resíduos de 160 aminoácidos, ele pode não ser altamente imunogênico. Assim, a administração de polipeptídeo não-autólogo pode não resultar em uma resposta imune.

Alternativamente, a introdução dos genes clonados em animais domésticos transgênicos permitiria diminuir potencialmente adiposidade e peso de corpo por superexpressão de um transgene de OB. O meio mais simples de conseguir isto seria visar um transgene de OB por uso de sua própria gordura ou um outro promotor de gordura específico.

De modo inverso, aumentos em gordura de corpo devem ser desejáveis em outras circunstâncias para o desenvolvimento de carne kobe ou fígado gorduroso para produzir "foie gras". Isto poderia ser realizado por visar um transgene sem sentido para engordar, ou por uso de tecnologia de inativação de gene. Alternativamente, onde um aumento em peso de corpo em percentagem de gordura é desejado, um inibidor ou um antagonista do polipeptídeo de 124 ΡΕ0777732 OB pode ser administrado. Tais inibidores ou antagonistas incluem mas não são limitados a, anticorpos reativos com o polipeptideo, e fragmentos do polipeptídeo que se ligam mas não ativam o receptor de OB, isto é, antagonistas do polipeptideo de OB.

Implicações Cosméticas 0 polipeptideo de OB tem valor significativo para o uso cosméstico, além dos benefícios de saúde. Em particular, uma vez que os polipeptídeos de OB da invenção, incluindo derivados e seus agonistas análogos, são úteis para a modulação da taxa e quantidade de deposição de célula no animal, eles são úteis para a redução de tecido de gordura disforme, por exemplo, depósitos de gordura no abdomem, no quadril, nas coxas, no pescoço, e no queixo que não necessariamente equivalem a uma condição obesa, mas que no entanto depreciam uma aparência individual. 0 efeito de redução de gordura é pensado ser realizado, em parte, por uma redução no apetite, isto é, uma redução em ingestão de alimento, por um aumento no metabolismo basal, ou ambos. Assim, o presente polipeptídeo de OB, ou seus derivados, ou análogos antagonistas, são úteis para a administração a um indivíduo para efetuar mudanças cosméticas em depósitos de tecido de gordura, se por modulação da deposição de gordura, redução de apetite, ou ambas.

Além disso, as presentes composições e métodos podem ser usados em combinação com vários procedimentos, 125 ΡΕ0777732 tais como cirurgias cosméticas destinadas a alterar a aparência global de um corpo (por exemplo, cirurgias de lipossucção ou a laser destinadas a reduzir a massa de corpo por aspiração ou a remoção de tecido de gordura), exercícios (especialmente corrrida e treinamento com peso), dieta de baixa gordura, hipnose, biofeedback, como exemplos de meios que podem tentar diminuir a percentagem de tecido de gordura em melhorar a aparência do corpo.

Correspondentemente, a presente invenção refere-se a um método de efetuar modulação de tecido de gordura cosmética em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade moduladora de gordura de um polipeptídeo de OB, ou seu agonista análogo ou deriviado, a um indivíduo que deseja modulação de tecido de gordura cosmética para melhorar a aparência de corpo global. Em um aspecto particular, a modulação de tecido de gordura é uma consequência de supressão de apetite. De preferência, a modulação de tecido de gordura é uma redução em tecido de gordura.

Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de efetuar perda de tecido de gordura cosmética compreendendo a combinação de um procedimento para a mudança de aparência de corpo com administração de uma quantidade de modulador de gordura de um polipeptídeo de OB, ou seu agonista análogo ou derivado, a um indivíduo que deseja modulação de tecido de gordura cosmética para melhorar a aparência global de corpo. 126 ΡΕ0777732

0 receptor de OB

Desenvolvimento de pequenas moléculas agonistas e antagonistas do fator de OB serão grandemente facilitadas pelo isolamento de seu receptor. Isto pode ser realizado por preparação de polipeptídeo de OB ativo e o uso dele para separar uma biblioteca de expressão usando-se metodologia padrão. Ligação de receptor na biblioteca de expressão pode ser testada por administração de polipeptídeo recombinante preparado usando-se ou vetores de expressão bacteriano ou de mamíferos, e observação dos efeitos da administração contínua e de curto prazo do polipeptídeo recombinante sobre as células da biblioteca de expressão, ou por diretamente detectar ligação de polipeptídeo de OB às células.

Como recentemente, acredita-se que o receptor de OB é provável ser localizado no hipotálamo e talvez no fígado, de preferência bibliotecas de cDNA a partir destes tecidos serão construídas em vetores de clonagem de expressão padrão. Estes clones de cDNA logo seriam introduzidos em células de COS como misturas e os transformantes resultantes seriam separados com ligante ativo para identificar as células de COS expressando o receptor de OB. Clones positivos podem então ser isolados de modo a recuperar o receptor clonado. 0 receptor clonado pode ser usado em combinação com o ligante de OB (admitindo-se que ele é um hormônio) para desenvolver a 127 ΡΕ0777732 necessidade de componentes para separaçao de moduladores de moléculas pequenas de OB.

Um sistema de ensaio particular que deve ser utilizado de acordo com a presente invenção, é conhecido como um ensaio de receptor. Em um ensaio de receptor, o material a ser analisado é apropriadamente rotulado e então certas colónias de teste celular são inoculadas com uma quantidade tanto de material rotulado quanto de não-rotulado depois que estudos de ligação são conduzidos para se determinar a extensão a qual o material rotulado se liga aos receptores de célula. Deste modo, diferenças em afinidade entre os materiais podem ser determinadas.

Correspondentemente, uma quantidade purificada do modulador de peso pode ser radiorrotulado e combinada, por exemplo, com anticorpos ou outros inibidores para os mesmos, depois que estudos de ligação forem realizados. Soluções seriam então preparadas que continham várias quantidades de modulador de peso não-combinado rotulado e não-rotulado, e amostras de células seriam então inoculada e depois disso incubadas. As monocamadas de células resultantes são então lavadas, são solubilizadas e então são contadas em um contador gama por um comprimento de tempo suficiente para fornecer um erro padrão de < 5%. Estes dados são então submetidos à análise de Scarchard depois que observações e conclusões referentes à atividade de material pode ser tirada. Embora o exposto acima seja exemplar, ele ilustra a maneira em que um ensaio de 128 ΡΕ0777732 receptor pode ser realizado e utilizado no caso onde a capacidade de ligação celular do material analisado pode servir como uma caracteristica de distinção. Por sua vez, um ensaio de receptor será particularmente útil na identificação dos receptores específicos para os presentes moduladores, tal como o receptor de db.

Um outro ensaio útil e contemplado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio "cis/trans". Resumidamente, este ensaio emprega dois construtos genéticos, um dos quais é tipicamente um plasmídeo que continuamente expressa um receptor particular de interesse quando transfectado para dentro de uma linha de célula apropriada e o segundo dos quais é um plasmídeo que expressa um receptor tal como luciferase, sob o controle de um complexo de receptor/ligante. Assim, por exemplo, se é desejado avaliar um composto como um ligantes para um receptor particular, um dos plasmideos seria um construto que resulta em expressão do receptor na linha de célula escolhida, enquanto que o segundo plasmídeo possuiria um promotor ligado ao gene de luciferase em que o elemento de resposta ao receptor particular é inserido. Se o composto sob teste é um agonista para o receptor, o ligante complexará com o receptor, e o complexo resultante ligará o elemento de resposta e iniciará transcrição do gene de luciferase. A quemiluminescência resultante é então medida fotometricamente, e curvas de resposta de dose são obtidas e são comparadas com aqueles de ligantes conhecidos. 0 protocolo exposto acima é descrito em detalhes na patente 129 ΡΕ0777732 U.S. n° 4.981.784 e na publicação de pedido de patente internacional PCT n° WO 88/03168, para cuja finalidade do especialista é referida.

Logo que um recombinante que expressa a sequência de gene de receptor de OB é identificado, o receptor de OB recombinante pode ser analisado. Isto é conseguido por ensaios com base nas propriedas físicas ou funcionais do receptor de OB, incluindo rotulação radioativa do receptor seguida por análise por eletroforese de gel, ligação de ligante de imunoensaio, etc. Além do mais, anticorpos para o receptor de OB poderiam ser gerados como descrito acima. A estrutura do receptor de OB pode ser analisada por vários métodos conhecidos na técnica. De preferência, a estrutura dos vários domínios, particularmente o sítio de ligação de OB, é analisado. Análise estrutural pode ser realizada por identificação de similaridade de sequência com outras proteínas conhecidas, receptores de proteína e hormônio particular. O grau de similaridade (ou homologia) pode prover uma base para prever a estrutura e funcção do receptor de OB, ou um seu domínio. Em uma modalidade específica, comparações de sequências podem ser realizadas com sequências encontradas em GenBank, usando-se, por exemplo, os programas FASTA e FASTP [Pearson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:2444-48 (1988)]. A sequência de proteínas pode ser ulteriormente caracterizadas por uma análise de hidrofilicidade (por 130 ΡΕ0777732 exemplo, Hopp e outros, 1981, supra) . Um perfil de hidrofilicidade pode ser usado para identificar as regiões hidrofóbicas e hidrofilicas da proteína de receptor de OB, que pode por sua vez indicar regiões extracitoplásmicas, de ligação de membrana e intracitoplásmicas.

Análise estrutural secundária (por exemplo, Chou e outros, 1974, supra) pode ser feita, para identificar regiões do receptor de OB que assumem estruturas secundárias específicas.

Manipulação, tradução e prognóstico de estrutura secundária, bem como prognóstico e representação gráfica de quadro de leitura aberto, podem também ser realizados usando-se os programas de software disponíveis na técnica.

Por prover uma fonte abundante de polipeptídeo de OB recombinante, e a oportunidade de isolar o receptor de OB (isto é, o produto de gene de db) , a presente invenção possibilita a determinação estrutural quantitativa da conformação ativa do polipeptídeo de OB e do receptor de OB, ou seus domínios. Em particular material suficiente é provido para ressonância magnética nuclear (RMN), para infravermelho (IR), para Raman, e para ultravioleta (UV) , especialmente dicroísmo circular (CD), análise espectroscó-pica. Em particular RMN provê análise estrutural muito poderosa de moléculas em solução, que mais proximamente se aproxima de seu ambiente natural (Marion e outros, 1983, supra, Bar e outros, 1985, supra; Kimura e outros, 1980, 131 ΡΕ0777732 supra). Outros métodos de análise estrutural podem também ser empregados. Estes incluem mas não são limitados à cristalografia de raios X (Engstom, 1974, supra).

Mais de preferência, co-cristais de polipeptídeo de OB e de receptor de OB podem ser estudados. Análise de co-cristais provê informação detalhada sobre ligação, que por sua vez permite o projeto apropriado de agonistas e antagonistas de ligante. Modelação por computador pode também ser usada, especialmente em combinação com RMN ou métodos de raios X [Fletterick e outros, eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, em Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor, Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].

Identificação e isolamento de um gene que codifica um receptor de OB da invenção provê para expressão do receptor em quantidades maiores do que podem ser isoladas das fontes naturais, ou em células indicadoras que são especialmente engenheiradas para indicar a atividade de um receptor expresso depois da transfecção e da transformação das células. Correspondentemente, além do projeto apropriado de agonistas e antagonistas com base na estrutura do polipeptídeo de OB, a presente invenção contempla um método alternativo para identificação de ligantes específicos de receptor de OB usando-se vários ensaios de separação conhecidos na técnica. A invenção pode ser melhor compreendida por 132 ΡΕ0777732 referência aos seguintes exemplos, que têm a finalidade de exemplificar a invenção e não de limitá-la.

Seção de Exemplo 0 que se segue descreve o método usado para identificar o material genético que é exemplar da presente invenção. Este eforço compreende quatro etapas sequenciais: A) Mapeamento genético, B) Mapeamento físico, C) Isolamento de gene de candidato, e D) Deteção de mutação. A seguir confirmação que o gene de murino em objetivo foi isolado (etapa D), o gene ser humano homólogo foi procurado, e tanto os genes de murino quanto seres humanos e proteínas putativas são caracterizados. As etapas são sumarizadas em maior detalhes, abaixo. A. Mapeamento Genético A mutação de OB foi segregada em cruzamentos genéticos, e análise de ligação padrão foi usado para posicionar a mutação em relação ao RFLPs (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição). Estes dados colocaram o gene de OB em um intervalo de ~ 5cM sobre o cromossoam 6 de murino proximal. (5cM é uma medição de distância genética correspondendo aos 5 cruzamentos genéticos aparentes por 100 animais) . Um total de 771 meioses informativas foram geradas e foram usadas em mapeamento genético subsequente (Friedman e outros, 1991, supra). Os locais genéticos que são mapeados em relação ao OB foram 133 ΡΕ0777732 anteriormente publicados. Os dois RFLPs mais próximos descritos foram definidos por sondas derivadas dos genes de met oncogene e de carboxipeptidase. A resolução genética das experiências descritas acima foi inadequada para clonar OB, principalmente uma vez que nove dos marcadores genéticos estavam em ligação firme. A fim de se identificar a necessidade de RFLPs firmemente ligado, sondas adicionais foram isoladas e o cruzamento genético foi expandido. Um método conhecido como microdissecação de cromossoma foi usado para isolar peças aleatórias de DNA de cromossoma 6 de murino proximal [Bahary e outros, Mammalian Genome, 4:511 - 515 (1993)]. Sondas clonadas individuais, D6Rckl3, também chamada psd3, foi selecionada para ulterior análise devido a sua proximidade genética para OB.

Esta sonda foi usada para genotipar uma ninhada (progenia) de OB 835 de cruzamentos intersubespecificos e interespecificos, que indicaram que D6Rckl3 é não recombinante em todos os 835 animais como relatado em Bahary e outros. No curso do mapeamento físico, um novo marcador polimórfico foi identificado a partir de um subclone cosmídeo derivado de YAC 53A6. Este novo marcador foi posicionado entre D6Rckl3 e o gene de OB e foi usado para genotipar as meioses informativas adicionais 771 recruzamentos e intercruzamentos intraespecíficos. Um único animal n° 167 foi identificado por trazer uma passagem de recombinação entre o OB e o D6Rck39. Estes estudos 134 ΡΕ0777732 indicaram que D6Rcd39/D6RcKl3 é ~ 0,06 cM de OB. Uma sonda adicional, Pax4, foi identificado que era de 0, 12 cM proximal para OB. Pax4 era recombinante em dois animais; n° 111 e n° 420. Pax4 é um pseudogene que foi anteriormente mapeado para o cromossoma 6 de murino proximal por Gruss e co-trabalhadores [Gruss e outros, Genomics, 11:424 - 434 (1991)]. Nesta base, foi determinada que os resíduos de gene de OB intervalo de ~ 0,2cM entre Pax4 e D6Rckl3. Isto levou a esforços para clonar a interposição de DNA em um esforço para isolar OB. B. Mapeamento Físico A clonagem de DNA neste intervalo produziu o uso de cromossomas artificiais de levedura (YACs), um vetor de clonagem relativamente novo que permite a clonagem de estiramentos longos de DNA contíguo frequentemente mais do que um milhão de pares de base de comprimento.

Cromossomas artificiais de levedura foram isoladas usando-se D6Rckl3 e Pax4. Isto foi realizada por preparação de sondas de DNA purificadas e usando-as para isolar os YACs correspondentes. Estes YACs ( n° 8, n° 16, n° 107 e n° 24) foram isolados e inicialmente caracte-rizados, e na base das análises resultantes foi concluído que YAC 16 foi o YAC que se estendeu distalmente mais afastado, isto é, mais próximo a OB. 0 código final de YAC n° 16 foi então recuperado, e foi determinado que esta extremidade era mais próxima a OB do que Pax4. Esta 135 ΡΕ0777732 extremidade foi chamada 16M(+). Esta conclusão foi conseguida uma vez que foi mostrado que esta sonda não era recombinante em animal n° 420 (como era Pax4). Esta extremidade foi sequenciada e usada para desenvolver um ensaio de PCR. Este ensaio de PCR foi usado para separar um biblioteca de YAC. Quatro clones positivos foram isolados. Caracterização subsequente destes YACs por resgate terminal, mapeamento de restrição, eletroforese de gel de campo de pulso, e Southern blots com os cruzamentos genéticos determinou que dois destes YACs, adu e aad, foram críticos para os estudos subsequentes. YAC aad é um YAC não-quimérico de 550 kB que se estendeu distalmente mais afastado. Portanto, a extremidade distai deste YAC, aad(pICL) foi usado para completar o mapa físico. YAC adu é YAC não-quimérico e 370 kb e sua extremidade distai, adu(+), foi determinado ser não recombinante em toda a progenia de OB dos cruzamentos genéticos incluindo animais n° 111 e n° 167 sugerindo que o gene de OB deve residir neste YAC.

Um ensaio de PCR para estas duas extremidades aad(pICL) e adu(+) foi desenvolvido e foi usado para o isolamento de mais clones de PI e YACs para continuar o mapeamento físico. Os clones de Pl importantes isolados por este esforço incluíram 498, 499, 500 (isolados usando-se uma sonda derivada de aad(pICL) e 322, 323 e 324 (usando-se uma sonda de adu(+)).

Entretanto YACs isolados por D6Rckl3 (53A6, 136 ΡΕ0777732 25Α8, 25Α9, 25Α10) foram caracterizados. Estes estudos determinaram que 53A6 estendeu-se proximamente mais afastado em direção à aad YAC. 0 tamanho do intervalo entre 53A6 e aad foi determinado ser ~70 kB. 0 código final de 53A6, 53(pILC) foi então usado para separar três bibliotecas de YAC disponíveis e um biblioteca de Pl. Um clone de Pl critico, 325, foi isolado. Assim clone de Pl sobreposto com os clones de Pl isolados por aad(pICL) como descrito acima, e portanto serviu para fechar o intervalo entre 53(pILC) e o aad(pICL) como um resultado, o "contig" total, contendo clones de Pl e YACs, de ~ 2,5 milhões de pares de base de comprimento, e alcançando Pax4, 16M(+), adu(+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 e D6Rckl3 foi clonado. Por mapeamento cuidadoso dos sitios de recombinação aparente em animal n° 111 e n° 167, foi concluído que OB foi situado em um intervalo de 400 kB. Para prover um trabalho de fonte de DNA para isolamento do gene de OB, cerca de 500 kB cobrindo esta região de não-recombinação foi isolada em um total de 14 clones de Pl. Estes clones de Pl, incluindo 322 e 323, que mais tarde demonstraram serem clones úteis, foram usados para aprisionamento de éxon. O mapa físico da porção do cromossoma portanto OB é mostrado na figura 7A. A figura 7B representa o "contig" de YAC. A figura 7C representa o "contig" de Pl. C. Isolamento de Genes de Candidatos 0 método usado para isolar genes neste intervalo 137 ΡΕ0777732 foi o aprisionamento de éxon. Este método usou um vetor comercial para identificar DNA de éxon (isto é, sequências de codificação) por seleção de sequências doadoras e receptoras de união funcional em DNA genômico introduzido em um construto de teste. 0 DNA a partir destes clones de Pl foram desenvolvidos e foram subclonados em um vetor de aprisionamento de éxon. Estes clones eram insertos curtos clonados em um vetor Bluescript. Cada clone foi ampliado por PCR com iniciadores de PCR correspondendo a sequências de plasmideos que flanquearam o inserto. A ampliação de PCR foi realizada diretamente sobre as bactérias que portavam o plasmideo. As reações foram estabelecidas usando-se um robô Biomek. Os produtos de PCR foram eletroforados sobre um gel de agarose a 1% em tampão de TBE que continha brometo de etideo. A técnica de aprisionamento de éxon foi modificada para eliminar DNA de E. coli contaminante a partir dos clones de Pl, e para separar por separação dos éxons arificiais abundantes, que se excederam a 80 - 90% dos éxons putativos aprisionados. 0 vetor aprisionando éxon inclui sequências de HIV; um segmento curto destas sequências de vetor corresponde a este artefato. A experiência aprisionamento de éxon foi realizada usando-se clones de Pl. Produtos de aprisionamento de éxon foram ampliados por PCR, foram selecionados, e foram sequenciados. Sequências de "éxons" putativos foram comparadas com aqueles em Genbank usando-se o programa de computador de Blast. Cerca de quinze éxons foram selecionados para ulterior exame por análise de Northern, RT-PCR, 138 ΡΕ0777732 e zoo blot quanto à presença de RNA correspondente ou sequências conservadas. Sete dos quinze éxons putativos, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3, e 2G7, demonstraram codificar um RNA transcrito. 325-2 é um gene especifico de testiculo; 323-8 e 323-9 são dois éxons prováveis do mesmo gene expresso principalmente no cérebro e no rim. IH3 e 322-5 representam dois transcritos de baixo nível. Dl-FT é um éxon de um gene anteriormente clonado, inosina mono-fosfato desidrogenase (IMPDH), que tem padrão de expressão ubíquo. Nove destes genes pareceram codificar OB. 2G7, que é o éxon de OB, é discutido ulteriormente abaixo.

Depois de três esforços mal sucedidos para aprisionar o gene de OB, uma outra tentativa foi feita por combinação de DNA a partir do Pis da região de OB crítica. Estes incluíram Pis: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 e outros. Depois disso Pis 258, 260, 322, 498 e 499 foram subclonados no vetor de aprisionamento de éxon, e subseqiientemente várias placas foram preparadas com clones bacterianos, cada uma das quais portou um éxon putativo. Cerca de 192 clones representando candidatos de OB putativos foram obtidos. Como observado acima, um artefato consistente tal que muito dos isolados continham dois éxons aprisionados derivados a partir do vetor foi observado. Assim, clones foram identificados tanto por seu tamanho quanto pelo fato que hibridização de sondas de DNA correspondennte a este artefato hibridizou às tiras correspondentes sobre um Southern blot do gel. Deste modo, 185 de 192 clones foram excluídos a partir de ulterior 139 ΡΕ0777732 avaliação. Exclusão dos artefatos na base de tamanho apenas não foi possível, como isto poderia ter, na extremidade, levaram a exclusão do éxon correspondendo a OB.

Assim, dos 192 éxons, um total de sete éxons foram selecionados para ulterior estudo. Modelos para sequenciação dos sete éxons foram preparados, e a sequen-ciação foi realizada. As sequências para os sete éxons foram analisadas e verificou-se que sete eram idênticas e uma era um artefato aparente. Em particular, clone de 1D12 continha a "sequência de HIV" isto é, a tira de artefato. Isto deixou três éxons para ulterior análise: 1F1, 2G7 e 1H3. 1F1 foi eliminado uma vez que ele mapeou o lado de fora da região crítica. Iniciadores de PCR para tanto 1H3 quanto 2GT foram selecionados e foram sintetizados. A sequência do éxon em 2G7 foi determinada, e é mostrada na figura 10 (SEQ ID N°:7). Iniciadores de PCR para 2G7 foram selecionados e foram sintetizados. As porções da sequência correspondendo aos iniciadores de PCR são sublinhadas. Os iniciadores usados foram: 5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60,0°C) (SEQ ID N°:8) 3'CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60,0°C) (SEQ ID N°:9)

Estes iniciadores ampliaram DNA de genoma com condições de PCR como se segue: 25 - 30 ciclos a 55°C anelando para 2', 72° extrusão para 2', 94°C desnaturação para 1' em tampão de PCR padrão. Estes inciadores foram ·32 também usados para gerar um sonda rotulada por incluir P- 140 ΡΕ0777732 dCTP na reação de PCR com uma redução correspondente na quantidade de dCTP frio.

Um RT-PCR foi realizado em uma variedade de RNAs de tecido e foi concluído que 2G7 foi expresso exclusivamente em gordura branca entre os tecidos examinados (figura 11A) . Depois disso, 2G7 de 32P-marcado foi hibri-dizado para um Nothern blot de RNAs de tecido (figura 11B) e foi mostrado que seu RNA foi expresso em alto nível em tecido de gordura mas foi não-expresso ou expresso em vários níveis baixos em todos os outros tecidos (onde os sinais podem ser o resultado de gordura contaminando as preparações de tecido) . Dez μρ de RNA total a partir de cada um dos tecidos listados foi eletroforado sobre um gel de agarose com formaldeído. A sonda foi hibridizada ao blot a 65°C em tampão de hibridização, Rapid Hybe (Amersham). O tamanho do RNA foi cerca de 4,9 kB. Neste ponto 2G7 foi considerado ser um gene de candidato viável para OB e foi ulteriormente analisado . D. Deteção de Mutação A fim de confirmar que 2G7 codificou o gene de OB, foi necessário demonstrar diferenças nos níveis de expressão de RNA da sequência de DNA deste gene em mutante quando comparado com animais de tipo selvagem. Duas mutações separadas do gene de OB estão disponíveis para estudo, C57B1/6J de OB/OB (1J) e Ckc/Smj de OB/OB (2J). Esses serão referidos aqui em seguida como 1J e 2J, 141 ΡΕ0777732 respectivamente. (Nomenclatura informal é usada para se referir às cepas de murino estudadas. Através de todo esse relatório descritivo e nos desenhos, será entendido que C57B1/6J refere-se a C57B1/6J +/+; Ckc/smj refere-se a SM/Ckc-+Dac- +/ + ; CKC/smj OB/OB refere-se a SM/Ckc-+Dac-ob2J/ob2J) . RN A foi preparado a partir de tecido de gordura que tinha sido isolado a partir de 1J, 2J, e animais de controle. RNA total para cada amostra foi tratado com DNase e então reversamente transcrito usando oligo-dT como um iniciador e transcriptase reversa. 0 cDNA de filamento único resultante foi então ampliado por PCR ou com os iniciadores 2G7 (condições mostradas acima) para a tira ou faixa inferior ou com iniciadores de actina comercialmente disponíveis para a faixa ou tira superior. Os produtos de RT-PCR foram corridos sobre um gel de agarose a 1% que foi manchado com brometo de etídeo (Figura 12A). Usando RT-PCR verificou-se que enquanto mRNA de 2G7 foi expresso em 1J e todos os outros murinos de controle, ele estava faltando completamente no murino 2J. Nenhum sinal foi detectado depois de 30 ciclos de ampliação. Essa experiência proveu evidência direta de que 2G7 correspondia a um éxon do gene de OB.

Uma vez que a mutação 2J é relativamente recente e é mantida como uma cepa coisogênica, esse resultado foi a primeira evidência disponível que indicou que 2G7 é um éxon do gene de OB. A mutaçao é provavelmente localizada na região promotora que leva ao abortamento da síntese de mRNA. A presença de um sinal em murino de 1J nesta 142 ΡΕ0777732 experiência de RT-PCR sugeriu que 1J poderia portar um ponto de mutação em uma grande mudança no tamanho da amostra de RNA. Além disso, mRNA de 2G7 estava ausente, quando testado por RT-PCR, a partir de quatro animais de 2J adicionais.

Este resultado foi confirmado sobre uma Northen blot (Figura 12B) . RNA de célula gorda foi preparado a partir de cada uma das cepas (C57B1/6J, 1J, CKC/smj, e 2J). Dez μg de RNAs foram corridos e foram ("blotted"). 0 "blot" foi sondado com a sonda de 2G7 que estava rotulada por PCR, por ampliação do material (isto é, faixa ou tira, na Figura 11 usando 32P-dCTP na reação de PCR. Actina é controlada para a quantidade de RNA carregado. 0 sinal de actina é fracamente similar em todas as amostras. 0 sinal de OB está ausente no cérebro porque o mRNA é especifico para células de gordura.

Os resultados da análise Northern confirmam que o RNA especifico de 2G7 está ausente em murinos de 2J. 0 RNA de OB está ausente em murinos de CKC/smj de OB/OB porque nessa cepa mutante obesa o gene é rompido de modo que não é produzido nenhum RNA. Além disso, o nível de RNA de 2G7 foi aumentado ~10 a 20 vezes em 1J bem como gordura de db/db. Esses resultados são compatíveis com a hipótese de que OB ou codifica hormônio circulante ou é responsável pela geração de um sinal de células de gordura que modula peso de corpo. Esses resultados suportaram a conclusão de que 2G7 é o gene de OB e predisseram que murinos de 1J têm um 143 ΡΕ0777732 ponto de mutaçao, provalmente uma mutaçao de nao sentido que leva a um término de tradução prematuro.

Esses resultados de Northern foram replicados usando preparações de RNA de célula de gordura a partir de quatro diferentes animais de 2J (Figura 13). Neste ensaio, ap2 é um transcrito especifico de gordura que foi usado como um controle da mesma maneira que actina na Figura 12B. Não há qualquer significância para a densidade variável da faixa ap2. ap2 foi rotulada por designação dos iniciadores de PCR da sequência de ap2 publicada. Os produtos de RT-PCR de RNA de célula de gordura foram então re-rotulados usando o mesmo protocolo para a rotulação de PCR. Essa análise demonstra a presença de mRNA de OB em animais normais homozigotos ou heterozigotos, e sua ausência de animais mutantes de 2j. A mutação foi indicada em murinos de 1J. A mutação é uma mudança de base de C para T que resulta em uma mudança de uma arginina para um códon de parada prematura aparente nos 108 aminoácidos, e tem toda a probabilidade de responder pela mutação de 1J (Figura 14) apesar da expressão de alto nivel do mRNA de OB (ver as Figuras 12 e 13, raias de C57B1/6J de OB/OB).

Mais recentemente, Southern blots foram usados para concluir que a mutação de 2J é o resultado de uma mudança de DNA detectável na extremidade 5'de OB que parece abolir completamente a expressão de RNA. A natureza exata desse possível rearranjo permanece sem determinação. 144 ΡΕ0777732

Um Southern blot genômico de DNA a partir de murinos de CKC/smj (SM/Ckc-+Dac) e de C57B1/6J usando quatro diferentes endonucleases de restrição foi realizado a fim de se determinar se ο OB mutante fornecia um padrão de fragmento único (Figura 15A). Cerca de 10 μg de DNA (derivado de DNA genômico preparado a partir de fígado, rim, ou baço) foram digeridos com a enzima de restrição indicada. O DNA foi então submetido a eletroforese em um gel de agarose TBE a 1%. O DNA foi transferido para uma membrana de "imobilon" e foi hibridizado para a sonda de 2G7 rotulada por PCR. A faixa chave é a faixa mais alta no digerido de BglII para o DNA de CKC/smj de OB/OB (SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J). Essa faixa é de peso molecular maior do que na outra cepa, indicando uma mutação nessa cepa. A Figura 15B é uma Southern blot de um digerido de BglII de DNA genômico da progenia de um cuzamento de ob2J/+x ob2J/+. Alguns dos DNAs têm só a faixa superior, alguns só a faixa inferior, e alguns têm amabas as faixas. Os animais com só a faixa superior são halo-obesos, isto é, ob2J/ob2J. Esses dados mostram que o polimorfismo (isto é, mutação) mostrada na Figura 15A segrega em um sentido genético.

EXEMPLO 1: Clonagem de cDNA e Determinação de Sequência de OB

Usando-se a sonda de PCR 2G7 rotulada, um total 145 ΡΕ0777732 de cinquenta clones de cDNA de murino a partir de uma biblioteca de cDNA de Xgtll de célula de gordura de murino (cDNA de 5'-STRETCH de Clonetech oriundo de almofadas de gordura testicular de murinos suiço, n° ML3005b) e trinta clones de cDNA ser humano de hibridização cruzada a partir uma biblioteca de cDNA de XgtlO de célula de gordura humana (cDNA de 5'-STRETCH de Clonetech oriundo de abdomem n° HLll08a) foram isolados. Separação de biblioteca foi realizada usando-se um procedimento de elevação de placa. Os filtros a partir da elevação de placa foram desnaturados usando-se o método de autoclave. Os filtros foram hibridizados em duplicata com a sonda 2G7 rotulada por PCR (tampão de Rapid Hybe, 65°C, de um dia para o outro) . Depois de uma pré-hibridização de 1 - 4 horas, os filtros foram lavados em 2x SSC, SDS a 2%, duas vezes por 30 minutos a 65°C e foram expostos a película de raios X. Positivos em duplicatas foram purificados em placa. Fago purificado em placa foram ampliados por PCR usando-se iniciadores de vetor comercialmente disponíveis, por exemplo, XgtlO e Àgtll. Os produtos de PCR resultantes corresponderam ao inserto de cDNA para cada fago com uma pequena quantidade de sequência de vetor em cada extremidade. As tiras foram sequenciadas e purificadas por gel usando-se o sequenciador automatizado ABI e os iniciadores de vetor para investigar a polimerase de DNA.

Os dados de sequenciação bruta foram então manualmente examinados base por base para corrigir "mishearing" do programa de computador. Quando a sequência 146 ΡΕ0777732 correta tornou-se disponível, os iniciadores a jusante foram sintetizados e foram usados para continuar a sequenciação. Tais experiências foram repetidas até que cada clone de cDNA disponível fosse sequenciado e fosse sintetizado em um "contig". Para contar, ~ 3000 pares de base da extremidade de 5' do mRNA foi compilado. Um dos clones de cDNA estendeu-se para a extremidade de 5' do mRNA como sua sequência era idêntica àquela do produto RACE 5' de RNA de tecido de gordura (dados não-mostrados).

Os dados de sequência revelados que é um quadro de leitura aberto de 167 aminoácidos (figura 1). Uma sequência de consenso de iniciação de tradução de Kozak estava presente com um resíduo de adenosina de três bases a montante do ATG. Duas clases de cDNA foram encontradas se diferenciando por inclusão ou por exclusão de um único códon de glutamina. Este resíduo é encontrado em uma posição imediatamente 3' ao aceitador de união do éxon de 2G7. Uma vez que o códon de CAG de glutamina inclui uma sequência aceitante de união possível, parece que há deslizamento no sítio de aceitante de união com uma deleção de 3 pares de base aparentes em uma sub-série do cDNA, como mostrado abaixo. gin ser vai ag CAG TCG GTA (com glutamina) (SEQ ID N°:17)

T (sitio aceitante de união) 147 ΡΕ0777732 ser vai ag CAG TCG GTA (sem glutamina)

T (sítio aceitante de união) 0 "ag" nas sequências acima corresponde à sequência de íntron admitida a montante do códon de glutamina, e AG é o sítio alternativo putativo. Este residuo de glutamina é localizado em uma região altamente conservada da molécula e sua importância para a atividade biológica é ainda desconhecida.

Uma sequência de sinal N-terminal foi detectada, o sitio de clivagem de sinal do qual é previsto ser carbóxi-terminal ao resíduo de alarina na posição 21 de aminoácido. Esta sequência de sinal putativo foi confirmada por aplicação de um algoritmo ao método de von Heijne. Usando-se esta técnica, a sequência de sinal mais provável foi identificada na região de codificação de polipeptídeo aos aminoácidos 1-23 tendo a sequência: MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA T VP (SEQ ID N°:10) em que a seta indica o sítio de clivagem de sequência de sinal putativo. 0 resto da sequência de aminoácidos era grandemente hidrofílica não tinha quaisquer pedaços ou membrana estruturais observáveis alcançando domínios outros que não a sequência de sinal N-terminal. Específicamente, não encontraram sequências de consenso para as sequências 148 ΡΕ0777732 de aminoácidos dibásicos ou glicolisação N-ligada indicativos de clivagem de proteina na proteína processada prevista (Sabatini etal, The metabolic basis of inherited disease, págs. 177 - 223, C. V. Scriver e outros, ed., McGraw-Hill, New York). Pesquisas de base de dados usando-se programas de Blast e de Block não identificaram quaisquer sequências homólogas. RNA de tecido de gordura ser humano foi analisado em Northern blots, espécie de RNA de um tamanho similar ao gene de OB de murino foi detectado. Sequenciação e análise de clones de cDNA revelaram que OB ser humano também codifica um polipeptídeo de 167 aminoácidos (figura 2A e B e figura 3) . Duas classes de cDNA, com ou sem deleções de três pares de base, foram também encontradas em ser humano (figura 6) . Os genes de OB de murino e ser humano eram altamente homólogos na região de codificação prevista, mas tinham apenas 30% de homologia nas regiões não-traduzidas 3' e 5' disponíveis. Uma sequência de sinal N-terminal estava também presente no polipeptídeo de OB. Comparação das sequências de polipept ídeos de OB de murino e ser humano mostraram que as duas moléculas compartilham uma identidade de 83% total ao nível de aminoácidos (figura 4). Os terminais N das proteínas maduras de ambas as espécies compartilham ainda homologia mais alta, com apenas seis substituições de aminoácidos conservadoras e três não conservadoras entre os 100 resíduos de aminoácidos N-terminais. 149 ΡΕ0777732 DNA genômico foi isolado a partir de murino, de rato, de coelho, de rato silvestre, de gato, de vaca, de carneiro, de porco, de ser humano, de galinha, de enguia, e de Drosophila, e foi digerido por restrição com EcoRl. Os digeridos foram eletroforados sobre gel de TBE de agarose a 1%. DNA foi então transferido para uma membrana de "immobilon" e foi sondado com a sonda 2G7 rotulada por PCR. 0 filtro foi hibridizado a 65°C e foi lavado com 2x SSC, SDS a 0,2% a 65°C duas vezes por 20 minutos a cada lavagem, isto é, houve duas mudanças de tampão. Os dados indicam que OB é conservado entre os vertebrados (figura 16) . Observação a este respeito é uma sinal 2+ no DNA de enguia; enguia é um peixe.

Em resumo, evidência disponível sugere que peso de corpo e adiposidade são fisiologicamente controladas. Há sete anos esforços começaram a identificar dois dos componentes chave deste sistema; Os genes de OB e de DB. Como mostrado neste exemplo, o gene de OB foi agora identificado como um gene específico de gordura que desempenha um papel na regulação de peso de corpo. O produto deste gene, que é mais provavelmente um hormônio secretado, terá importantes implicações para o diagnóstico e o tratamento de distúrbios nutricionais em animais não-humanos e seres humanos.

Exemplo 2: Expressão de OB em Bactérias

Tanto cDNAs seres humanos quanto de murino 150 ΡΕ0777732 codificando OB foram clonados em um vetor de expressão de pET-15b (Novagen). Este vetor contém um promotor de T7 em combinação com um operador de lac, e expressa uma proteína de fusão contendo uma etiqueta de histidina (His-tag) e um sítio de clivagem de trombina imediatamente a montante do sítio de inserção de sequência de codificação (figura 17) (SEQ ID N°:11 e 12).

Os cDNAs de murino e ser humano foram modificados de modo que a alanina na extremidade da sequência de sinal foi transformada em um sítio de Ndel, como o foi uma sequência separada na região 3'. Inserção do sítio de Ndel foi realizada usando-se PCR com novos iniciadores:

Mnde-5'- (iniciador de início cinco de murino) CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID N°:13)

Mnde-3'- (iniciador de início três de murino) TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID N°:14)

Hnde-5'- (iniciador de início cinco de ser humano) TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID N°:15)

Hnde-3'- (iniciador de início três de ser humano) TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID N°:16)

Os iniciadores contêm um desemparelhamento de 6 pares de base no meio que introduz sítios de restrição de Ndel em cada extremidade do fragmento de PCR. Fago portando 151 ΡΕ0777732 ou cDNA de murino ou ser humano foram ampliados por PCR usando-se aqueles iniciadores. 0 produto de PCR foi digerido com Ndel e purificado por gel em um gel de agarose de ponto de fusão baixo a 1%. As tiras purificadas por gel foram subclonadas no vetor de pET. Os plasmídeos resultantes foram sequenciados para assegurar que mutações não foram introduzidas durante a etapa de ampliação de PCR de clonagem. Construtos para o cDNA de murino e ser humano que codificam e que carecem de glutamina 49 foram preparados. Em particular, construtos de pET 15 b contendo ou a sequência de codificação de OB ser humano ou de murino, a menos sequência de sinal e fundidos para um His-tag, foram produzidos usando-se um método de clonagem de PCR. Os construtos foram sequenciados para assegurar que nenhum erro de sequência fosse introduzido na região de codificação do gene de OB durante a etapa de ampliação de PCR.

Dois construtos de plasmideo resultante, pETM9 e pETH14, foram selecionados para transformar um hospedeiro de expressão bacteriana. Na indução com IPTG a 1 mM sob condições ótimas, as bactérias transformadas eram capazes de produzir 100 - 300 μρ/πιΐ da fusão de OB. A maioria da proteína de fusão de OB foi encontrada no corpo de inclusão. Depois da solubilização com guanidina-HCl a 6 M ou uréia, a proteína de fusão foi purificada através de uma coluna de resina de ligação de His (Ni-quelação) . As condições para purificação de coluna da proteína de fusão de OB (incluindo ligação, lavagem, e eluição) foram 152 ΡΕ0777732 estabelecidas experimentalmente. A proteína de fusão de OB se liga à resina em imidazol a 20 mM/guanidina-HCl a 6 Μ. A proteína pode ser eluída a partir da resina em imidazol a 60 mM/guanidina a 6M (figura 18A,B). Tanto as proteínas de fusão de OB de ser humano quanto de murino foram ulteriormente dialisadas em PBS para se remover guanidina-HC1 a partir da preparação, então foram usadas para criar anticorpos policlonais. A fim de testar a atividade biológica dos produtos de proteína de fusão, as condições de redobramento para a proteína purificada foram testadas e foram desenvolvidas. Isto envolve diálise inicial da proteína de fusão em uma solução de guanidina a 1 M, seguida por diluição com uma solução de arginina a 0,4 Μ. O His-tag foi removido a partir das proteínas de fusão antes da análise quanto à função biológica. A remoção da etiqueta foi conseguida por tratamento da proteína de fusão com trombina da placenta humana.

Além disso, sequências de codificação de gene de OB de murino e ser humano menos a sequência de sinal são cada uma sendo inserida em um vetor de pET 12c usando-se método de clonagem de PCR. Estes construtos podem dirigir as proteínas de fusão de OB sintetizadas no espaço periplásmico da célula de hospedeiro bacteriana. A proteína de fusão de OB recuperada a partir do espaço periplásmico pode apenas necessitar uma filtração de gel simples para ser purificada a partir de outras proteínas de hospedeiro e não será desnaturada durante tal processo. 153 ΡΕ0777732

Exemplo 3: Preparação de Anticorpos para o Polipeptídeo de OB

Além do uso da proteína recombinante para gerar anticorpos policlonais, um conjunto de quatro sequências de peptídeos a partir da sequência de OB de murino deduzida foi identificado usando-se software de plotagem de imunogenicidade (Pacote de GCG) . Os quatros fragmentos de peptideos terminais em carboxila são: (SEQ ID N°:18)

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-

Lys-Thr (SEQ ID N°:19)

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID N°:20)

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-

Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID N°:21)

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-

Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Estes peptídeos foram conjugados para KLH, e os conjugados de peptídeo-KLH foram usados para imunizar coelhos usando-se técnicas padrão. Anti-soros policonais 154 ΡΕ0777732 específicos para cada peptídeo é recuperado a partir dos coelhos.

Exemplo 4: Translocação In Vítro de um Polipeptídeo de OB A fim de confirmar a presença de uma sequência de sinal funcional, um cDNA ser humano que incluiu o quadro de leitura aberto total foi subclonado no vetor de pGEM. Apenas o cDNA ser humano foi usado nesta experiência uma vez que subclones de camungongo adequados não foram recuperados. RNA de OB ser humano de filamento positivo foi transcrito usando-se polimerase de Sp6 e foi usado em uma reação de tradução in vitro com ou sem membranas micros-somais pancreáticas de canino. 0 produto de tradução primário migrou com um peso molecular evidente de ~ 18 kD, que é consistenete com aquele previsto pela sequência de cDNA. Inclusão das membranas microssomais na reação inibiu a eficiência global de tradução ~ 5 vezes. Não obstante, cerca de 50 - 70% do produto de tradução primário de OB foi truncado por cerca de 2 kD na presença da preparação de membrana sugerindo que a sequência de sinal é funcional (figura 19A) . O tamanho do produto de tradução primário de RNA de interleucina-lalfa, que não-codifica uma sequência de sinal, ficou inalterada quando membranas microssomais foram incluídas na reação. A fim de confirmar que translocação da proteína de OB tinha ocorrido, os produtos de tradução in vitro foram tratados com Proteinase-K. Tratamento por protease resultou na proteólise completa do produto de tradução primário de 18 kD enquanto a forma 155 ΡΕ0777732 processada de 16 kD não foi afetada pelo tratamento de enzima, indicando que ele tinha se translocado para dentro do lúmen dos microssomas (figura 19B) . Estes dados são compatíveis com a hipótese que OB é uma molécula secretada.

Depois da clivagem de sequência de sinal, resíduos de duas cisternas permaneceriam dentro da proteina prevista criando a possibilidade que a molécula contém uma ligação de dissulfeto característica de outros polipeptí-deos secretados [Shen e outros, Science, 224:168 - 171 (1984)] .

Exemplo 5: Caracterização do Gene de OB

Para estabelecer a relação entre obesidade e alterações genéticas no gene de OB em seres humanos, a sequência do gene de OB ser humano foi determinada (figura 20A até C) (SEQ ID N°:22 e 24) . Iniciadores específicos a partir da sequência de codificação ser humana foram usados para separar uma biblioteca de PI ser humano. Três clones de PI diferentes foram obtidos, foram desenvolvidos, e PCR ampliados usando-se iniciadores flanqueando o sítio de união entre o primeiro e segundo éxons de condificação. A região de íntron total, por volta de 2 kb, foi ampliada e parcialmente sequenciada (ver figura 20A; e como indicado em SEQ ID N°:22 e 24). A estrutura de gene de tanto os genes de murino quanto ser humano foi caracterizada usando-se ensaios de 156 ΡΕ0777732 PCR e outras técnicas padrão. 0 gene de OB de murino foi demonstrado consistir em três éxons, o segundo e o terceiro dos quais representam a sequência de codificação (figura 20D) . A região de codificação do gene de OB ser humano partilha a mesma estrutura; no entanto, o gene ser humano carece de um intron e éxon de 5' (figura 20E).

Dois conjuntos de iniciadores gerados a partir das sequências intrônicas do gene ser humano foram preprados (figura 20A até C). As sequências dos iniciadores se seguem (F e R referem-se a direção para frente e reverso, respectivamente): (SEQ ID N°:29) (SEQ ID N°:30) (SEQ ID N°:31) (SEQ ID N°:32) HOB lgF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' HOB IgR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3'

Amostras de DNA foram obtidas de várias fontes, e estes conjuntos de iniciadores estão sendo usados para ampliar DNA genômico ser humano de pessoas severamente obesas. Os produtos de PCR foram realizados sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão, e as tiras foram cortadas e foram digeridas com agarase. As sequências foram obtidas usando-se o sequenciador de DNA ABI 373A e kit terminador de dideóxi Taq (ABI, Perkin-Elmer). Uma mutação de ponto em um gene de OB a partir de uma amostra de paciente foi detectada para começar. Esta mutação é o primeiro éxon e não muda a sequência de aminoácidos. Dados preliminares 157 ΡΕ0777732 indicam que uma sequência de inserção pode estar presente no primeiro éxon de um outro paciente.

Um método de sequenciação automatizado diferente usando-se Sequenase em vez de polimerase de DNA de Taq pode ser empregado para fornecer sequências mais facilmente legíveis para deteção de mutação.

Exemplo 6: Expressão de OB em Levedura

Depois da clonagem posicionai de OB, tornou-se importane para não cobrir o mecanismo fisiológico pelo qual a proteína de OB reduz a ingestão de alimento e o peso de corpo. A primeira etapa nesta direção foi produzir recombinantemente uma proteína funcional usando-se um sistema de expressão. Além do sistema de expressão bacteriana bem sucedido, um sistema de expressão de levedura foi também selecionado. Expressão de levedura tem várias características atrativas para expressão de OB. 0 mais importante é que proteína eucariótica biologicamente ativa são mais prováveis de serem produzidas. 0 polipeptídeo de OB é secretado por células de mamífero. Secreção de proteína é muito similar para todos os eucariótes, o que significa que o aparelho secretório de levedura é muito mais similar ao caminho secretório de mamífero do que aos caminhos secretórios bacterianos seriam. Em particular, modificações de proteína de OB visto em células de mamífero prováveis também de seriam vistas na expressão através do sistema secretório de levedura. Além 158 ΡΕ0777732 disso, dobramento de proteína é realizado na passagem através do aparelho secretório e assim, fornecendo OB através do aparelho secretório de levedura é provável dar uma proteína adequadamente dobrada com atividade biológica natual. Isto é significativo para OB uma vez que os dois resíduos de cisteína podem formar uma ponte de dissulfeto. Em contraste a caminhos secretórios, a redução de ambiente do citoplasma de célula previne a formação de pontes de dissulfeto; e portanto, é essencial que OB passe através do caminho secretório na ordem para esta ligação de dissulfeto para formar in vivo. Outras vantagens têm a ver com a facilidade e rapidez de manipulação de levedura, a disponibilidade de vetores e de cepas, e a vasta experiência em tecnologia recombinante de levedura.

Um sistema de expressão Pichia pastoris foi escolhido por quatro razões: (1) tem níveis maiores de expressão de proteína heteróloga do que outros sistemas de levedura tal como S. cerevisiae; (2) glicolisação de proteína é mais similar ao sistema de mamíferos em P. pastoris do que em S. cerevisiae (embora sítios de glicolisação não fossem detectados em OB usando-se uma pesquisa de computador, ainda permaneceu a possibilidade de glicolisação em sítios desconhecidos): (3) P. pastoris secreta naturalmente muitas proteínas, e assim é em geral direta para purificar a proteína estranha expressa: e (4) os vetores e cepas de levedura estão comercialmente disponíveis (de Invitrogen). Duas estratégias para gerar vetores 159 ΡΕ0777732 de expressão de levedura sao conhecidos nas figuras 21 e 22 . 0 vetor escolhido foi pPIC.9. Este vetor contém um sitio de clonagem exatamente a jusante da sequência de codificação prepro de fator de acasalamento alfa que dirige a proteina codificada pelo gene clonado no sitio de clonagem para ser secretado pelo caminho secretório. A outra caracteristica importante do vetor é um gene de HIS4 que permite a seleção para absorção do vetor usando-se uma cepa auxotrófica de levedura desenvolvida em meio de histidina deficiente seguindo transformação da levedura com o vetor. A estratégia de clonagem foi como se segue: ampliar por PCR cDNA de OB usando-se um iniciador de 5' que contém em sua extremidade 3', sequência complementar à sequência de OB exatamente seguinte ao sítio de clivagem de peptídeo líder previsto, e em sua extremidade 5' máxima, uma sequência complementar à extremidade 3' da sequência de fator de acasalamento alfa do vetor. 0 iniciador de 5' também contém um sitio de Xhol. 0 iniciador 3' foi projetado para ter em sua extremidade 3' uma sequência complementar aos últimos poucos aminoácidos de OB e um sítio de EcoRI em sua extremidade 5'. Depois de ampliação de PCR, o produto de PCR foi digerido com Xhol e EcoRI e foi clonado em pPIC.9 similarmente digerido. Depois da clonagem de tanto cDNAs de OB ser humano quanto de murino, cada um com e sem a glutamina no códon 49, clones individuais foram isolados para todos os quatros construtos e foram sequenciados para verificar que os contrutos foram 160 ΡΕ0777732 clonados na orientação correta, e no quadro, e não cotinham mutações a partir da etapa de ampliação de PCR. Depois da identificação de clones com a sequência correta, estes foram transformados em cepa GS115 de P. pastoris, uma histidina auxótrofo.

Para os dois construtos de OB de murino, clones de levedura transformados foram separados para expressão de proteina. Como evidência de que a levedura transformada contém OB, um ensaio de dot-blot de DNA e uma colónia de hibridização de ensaio foram feitos os quais ambos mostraram sequência de OB dentro da levedura transformada, mas não dentro da levedura não transformada. Além do mais, a levedura transformada agora secretada uma proteina de 16 kDa nos meios de cultura, enquanto que a levedura não transformada não secreta uma proteina deste tamanho (figura 23A) . Isto é o tamanho previsto de OB. Clones individuais para ambos os construtos de murino foram identificados que são altos expressores para OB, e atualmente uma estratégia de purificação está sendo desenvolvidos para purificar OB até homogeneidade. Uma estratégia foi para purificar OB sobre uma coluna trocadora de cátion (figura 23B); dados preliminares sugerem que um trocador de cátions fortes pode ser útil. No entanto, depois da cromatografia de troca de cátions, o produto de OB putativo é perdido. Isto indica a presença de uma protease na amostra.

Uma estratégia para superar este problema é preparar fusões de OB-His-tag para expressão em levedura 161 ΡΕ0777732 (figura 22) . Outra avaliação demostrou que OB sem um His-tag associa firmemente com uma coluna de Ni-quilação. Purificação do polipeptídeo de OB por Ni-quelação, seguido por filtração com gel, fornecido um produto de pureza suficiente para análise espectral de massa. Spectometria de massa confirma que o peso molecular da proteína expresso é idêntico ao peso molecular esperado que fortemente confirma que OB foi expresso com sucesso em Pichia.

No entanto, a purificação de protocolo de filtração de Ni-quelação/gel não fornece um polipeptídeo de OB em forma suficientemente pura. Moléculas pequenas adicionais estão presentes. Parece que a atividade proteo-lítica elui a partir da coluna de Ni-quelação no volume vazio. Correspondentemente, um processo de purificação de três etapas é planejado: Ni-quelação, seguido por troca de cátions (que elimina os contaminantes de molécula pequena) seguido por filtração de gel.

Avaliação do nível de expressão por manchamento de Coomassie blue de géis de SDS-PAGE revela cerca de 10 mg/1 quando levedura são desenvolvidas em frascos agitadores. Estes níveis são esperados aumentar em recipientes de fermentação, e está prestes a inciar fermentação com as esperanças de obter quantidades maiores de proteína. Referente a construtos de OB ser humano, clones de levedura transformados contendo altos números de cópias do gene de OB foram identificados, e estes são esperados expressar a 162 ΡΕ0777732 proteína de OB. Como anticorpos são desenvolvidos, estes serão usados para cofirmar a identidade da proteína de 16 kDa secretada.

Exemplo 7: Alta Expressão de Nível de um Peptídeo de OB em Bactérias

Preparaçao de estoques de congelador:

Para cada um das duas alíquotas de 4 ml de meios de M9ZB esterilizados sem a fonte de carbono, 40 μΐ de dextrose em estoque (0,4 g/ml, esterilizado por filtro) 10 μΐ de estoque ampicilina (200 mg/ml, e 5 μΐ de estoque cloranfenicol (34 mg/ml, em etanol) foram adicionado. Uma única colónia cada uma de E. coli com DNA de 0B1 de ser humano e de murino clonado em um vetor de Novagen pET-14 b foi usado para incular estes. Os tubos foram inocubados em 37°C de um dia para o outro. 0,5 ml das culturas de um dia para o outro foi usado para inocular 50 ml de meios de M9ZB com dextrose, ampicilina e cloranfenicol. Estes foram incubados a 30°C e a absorbância em 600 nm (A600) foi periodicamente monitorada. Em A600 de cerca de 1 - 1,2, alíquotas de 175 μΐ da cultura foram misturadas com 25 μΐ de glicerol a 60% em tubos eppendorf de 2 ml, congelados a jato com nitrogénio líquido e foram armazenados a -80°C. 163 ΡΕ0777732

Desenvolvimento de Cultura 50 ml de meios de M9ZB com 0,5 ml de dextrose a 40%, 125 μΐ de estoque de ampicilina e 50 μΐ de estoque de cloranfenicol foram incoculados com 1 ml de estoque de geladeira e foram incubados a 30°C. Em A600 de 1 - 1,2, 10 ml desta cultura foram usadas para inocular cada um dos quatro frascos com 500 ml de meios de M9ZB com dextrose, ampicilina e cloranfenicol. Estes foram incubados a 30°C até a indução em A6 0 0 de cerca de 1 - 1,2 com uma concentração final de IPTG a 0,5 mM. As culturas foram incubadas de um dia para o outro. As células foram cultivadas por centrifugação em 4000 rpm por 20 minutos. Esta sistema de expressão fornece um polipeptideo de OB recombinante como uma percentagem razoavelmente alta de proteína total; na ordem de grama/litro de E. coli.

Lise de célula e ressuspensão de corpos de inclusão:

Pasta de célula foi ressuspensa em um volume mínimo de HEPES a 20 mM, pH 7,2, glicerol a 10%, KCI a 0,1 M, MgC12 a 5 mM, aprotinina a 1%, PMSF a 1 mM, 5 μg/ml de leupeptina e 50 μρ/πιΐ de DNase I. A suspensão foi congelada e descongelada 3 vezes usando-se nitrogénio líquido e água morna. Células lisadas foram centrifugadas em 18000 rpm por 30 minutos e foram ressuspensas em HEPES a 20 mM, pH 7,5, NaCl a 0,1 Μ. A suspensão foi sonicada e Triton X100 foi adicionado a uma concentração final de 2%. Esta foi centrifugada por 15 minutos em 18000 rpm. Depois de mais 164 ΡΕ0777732 dois tais ciclos, três ciclos de lavagens livres de Triton foram dados. Finalmente, o pélete foi dissolvido em GdHCI a 6 M (guanidina-HCl) , HEPES a 20 mM, pH 7,5 por sonicação seguido por centrifugação. 0 sobrenadante foi usada para ulterior purificação. A proteina de OB foi purificada no estado não dobrado por afinidade de íon de metal imobilizado (IMAC). A solução foi aplicada a uma coluna de 40 ml de sefarose de fluxo rápido de quelação de Farmácia carregada por 5 volumes de coluna de NiSCg a 50 mM e foi equilibrada em GdHCI a 6 M, HEPES a 20 mM, pH 7,5. A coluna foi lavada com GdHCI a 6 M, imidazol a 30 mM, HEPES a 20 mM, pH 7,5. Finalmente, a proteina foi eluída com o mesmo tampão contendo imidazol a 0,2 M. Proteina não dobrada em GdHCI a 6 M foi armazenada a 4°C depois da adição de acetato de sódio (NaAc) a 10 mM e ajustar o pH para cerca de 4,5 com ácido acético.

Redobramento e a purificação da proteína:

Solução de GdHCI a 6 M contendo 100 mg de proteína foi tratada com 67 μΐ de ditiotreitol (DTT) a 1 M e foi diluída para cerca de 67 ml com GdHCI a 6 M, NaAc a 10 mM, pH 4,5. Ela foi deixada se agitar à temperatura ambiente por cerca de uma hora. Ela foi então diluída em 4 L de glicerol a 20%, CaC12 a 2,5 mM, Tris a 20 mM, tampão pH 8,4 com agitação. Depois da misturação adequada, a solução foi deixada à temperatura ambiente por cerca de 8 165 ΡΕ0777732 horas sem outra agitação. Então 2000 unidades de trombina bovina purificada (a partir de trombostato, um produto da Parke-Davis) foram adicionadas, e a solução foi deixada com agitação suave. Depois de 2,5 horas ela foi redosada com 2000 unidades de trombina e a clivagem da histidina-tag foi continuada por mais 3 horas. A clivagem de trombina foi controlada por adição de PMSF a uma concentração final de 0,1 mM. A solução foi filtrada e foi armazenada a 4°C. A proteina clivada foi ulteriormente puficada sobre a mesma coluna de IMAC como acima, foi equilibrada em KC1 a 1 M, glicerol a 20%, HEPES a 20 mM, tampão de pH 8,4. Depois do carregamento da solução de proteina, ela foi lavada com o mesmo tampão e a proteína clivada foi eluida com KC1 a 1 M, glicerol a 20%, imidazol a 40 mM, HEPES a 20 mM, pH 8,4. Proteína não-clivada eluida em imidazol 0,2 M.

Proteína clivada purificada foi concentrada, foi tratada com EDTA a 50 - 100 mM, ferricianeto de potássio a 10 mM (para completar qualquer oxidação incompleta) e gel foi filtrado sobre uma coluna 16/60 superdex 75. Rendimentos usando-se este procedimento aproximaram-se 50% do peptídeo de partida.

Uma vez purificada, a proteina expressa foi caracterizada por vários métodos. Caracterização física inclui dispersão de luz dinâmica para se determinar homogeneidade de estrutura e é usada como uma medição de dobramento adequado. Dados de dispersão de luz indicam que ΡΕ0777732 - 16 6 - o polipeptídeo de OB ser humano é expresso predominantemente ou exclusivamente como um monômero, enquanto o polipeptídeo de OB de murino pode ser formado como um dímero bem como um monômero.

Ensaios com reagente de Ellman e análise espectroscópica de massa confirmam que os resíduos de cisteína formam uma ligação de dissulfeto na proteína. Esta forma oxidada do polipeptídeo foi administrada a murinos, como descrita infra, e demonstrou atividade biológica.

Dicronismo circular foi usado para grosseiramente se determinar a geometria estrutural da proteína. Espectro de CD em um tampão fisiológico (pH cerca de 8, aproxima-damente concentração iônica fisiológica) indica que o polipeptídeo de OB tem cerca de 60% de estrutura alfa-helicoidal e cerca de 40% de estrutura de espiral aleatória. O polipeptídeo de OB de murino foi encontrado ter cerca de 50% de alfa-hélice e 50% de espiral aleatória por espectroscopia de CD.

Proteólise limitada, seguida por espectrometria de massa (Cohen e outros, 1995, supra) foi empregada para identificar porções do polipeptídeo de OB que são acessíveis à proteólise. Esta análise tem domonstrado a presença de uma estrutura de alça flexível de resíduos de aminoácidos 54 a 60 (como mostrado na figura 4). É provável que esta alça flexível ligue dois domínios de estrutura de 2o definidos, por exemplo, alfa-hélice. 167 ΡΕ0777732

Importantemente, como mostrado nos seguintes exemplos, bioatividade da proteína purificada foi analisada por administração da proteína tanto a roedores magros quanto a roedores obesos via uma bomba osmótica (por exemplo uma bomba osmótica ALZET da Alza Corporation, Paio Alto, CA) ou por uma dose diária de bólus i.p. por um período de pelo menos duas semanas e efeitos sobre o comportamento de alimentação e sobre o peso de corpo foram observados.

Exemplo 8: Efeitos de Redução de Peso do Polipeptídeo de OB (Leptina) 0 produto de gene do locus de OB de murino desempenha um importante papel na regulação de peso de corpo. 0 presente exemplo estabelece que a proteína de OB circula em plasma de murino, de rato e de ser humano. A forma circulante em todas as três espécies tem um peso molecular idêntico por SDA-PAGE para a sequência de polipeptídeo deduzida sem a sequência de sinal, sugerindo que, in vivo, a proteína não é processada após clivagem da sequência de sinal. A proteína de OB estava ausente em plasma de murinos de C57/B16J de OB/OB e presente em concentrações dez vezes superiores em plasma de murinos de db/db e níveis vinte vezes superiores em plasma de ratos de fa/fa com relação a controles. Sugere-se que esses mutantes de animais obesos são resistentes aos efeitos de OB. Houve diferenças de sete vezes em níveis de plasma da proteína de 168 ΡΕ0777732 OB dentro de um grupo de seis indivíduos seres humanos magros. Injeções diárias da proteína de OB de murino recombinante reduziram dramaticamente a massa de corpo em murinos de OB/OB, tiveram efeitos significativos sobre peso de corpo de murinos do tipo selvagem e não tiveram qualquer efeito sobre os murinos de db/db. Esses dados sugerem que o produto de gene do locus de OB serve a uma função endócrina para regular peso de corpo.

Materiais e Métodos

Coelhos foram imunizados com proteína recombinante em adjuvante de Freund (HRP, Inc.). Anticorpos de OB de anti-murino imunopurifiçados foram prepardos por passagem de anti-soro sobre uma coluna de sefarose 4B conjugada para a proteína recombinante como descrito [Harlow e outros., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Imunoprecipitação de plasma de murino foi realizada como se segue: 0,5 ml de plasma de murino, rato e ser humano contendo EDTA a cerca de 2,5 mM foi pré-clarif içado com sefarose 4B não conjugada à temperatura ambiente com oscilação por 2 horas. A sefarose foi removida por rotação e 50 ml de uma pasta fluida a 50% de sefarose conjugada a anticorpo contendo anticorpo purificado por afinidade a uma concentração de 1 mg/ml de sefarose condensada foram adicionados. Meio ml de um tampão de RIPA 2x foi adicionado para dar condições de ligação final como se segue: Tris HC1 a50 mM, pH 7,5, NaCl a 100 mM, NP-40 a 1%, SDS a 0,1% 169 ΡΕ0777732 desoxicolato de sódio a 0,5% e 0,025% de azida de sódio. A reação foi realizada por toda a noite a 4°C com oscilação. A sefarose conjugada a anticorpo foi lavada 8 vezes usando tampão de RIPA, seguida por enxaguamento três vezes com PBS, e corrida sobre um SDS-PAGE a 15%. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e submetidas a Western blotting com um anticorpo imunopurifiçado, biotinilado, contra a proteína recombinante. O anticorpo secundário usado foi HRP-estreptavidina e usou-se ECL para deteção.

Para quantificar a quantidade de OB em soro de murino, quantidades crescentes da proteína de OB de murino recombinante redobrada (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) foram adicionadas a 100 λ de plasma de C57BL/6J OB/OB e incubadas a 4°C por 3 horas dentro do anticorpo conjugado a sefarose de proteína A. Após extensiva lavagem com tampão A (tampão de fosfato de sódio a lOmM, pH 7,4; NaCl a 100 mM; Triton X-100 a 1%, EDTA a 5 mM, PMSF a 1 mM) , amostras foram ressuspensas em tampão de amostra, foram carregadas sobre um SDS-PAGE a 15% e foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Western blotting foi realizada usando um anticorpo de terminal de antiamino imunopurifiçado, biotinilado, como um anticorpo primário e HRP-estreptavidina como um anticorpo secundário, seguida por deteção de ECL.

Extratos citoplásmicos foram preparados por homogeneização de tecido adiposo em tampão de NDS (Tris a lOmM, pH 7,5 NaCl a 10 mM, ICCI a 60 mM, espermina a 0,15 mM, espermidina a 0,5 mM, β-mercaptoetanol a 14 mM, EGTA a 170 ΡΕ0777732 a 0,5 m, EDTA a 2 mM, NP-40 a 0,5%) por politron e homogeneização "dounce", e remoção de núcleos foi realizada por centrifugação a 700 g.

Imunoprecipitações foram realizadas como descrito acima exceto que foram usados anticorpos de OB de anti-ser humano imunopurifiçados. Para o ELISA, 100 ml de uma solução a lmg/ml de anticorpo de OB de anti-ser humano imunopurifiçado foram dissolvidos em uma solução de PBS tamponada com borato e foram aplicados durante toda noite a placas de microtitulação (Corning cat. n° 2595) a 4°C. As placas foram então lavadas com solução salina de borato contendo 0,05% de Tween 20 e removeu-se líquido em excesso. Placas foram bloqueadas por incubação à temperatura ambiente por 2 horas com 240 ml por cavidade de tampão salino de borato contendo 0,3% de gelatina e então foram lavadas e foram secas. Ou quantidades conhecidas de uma proteína de OB humana redobrada ou amostras de plasma em um volume de 100 ml foram incubadas em cavidades individuais por toda noite a 4°C. Depois de lavagem, as placas foram incubadas com 100 ml de um anticorpo de anti-ser humano imunopurifiçado, biotinilado (0,1 mg/ml em uma solução tamponada com gelatina-borato) por 4 horas à temperatura ambiente. Depois de lavagem, peroxidase de rábano silvestre (HRP)- estreptavidina foi adicionada às placas (0,1 mg/ml em tampão de borato, gelatina a 0,3%). Solução de substrato de HRP (ABTS, 0,3 mg/ml e H2O2, 0,01% em ácido cítrico) foi então usada para deteção e o O.D. foi medido a 414 nM para quantificar a ligação de anticorpo. 171 ΡΕ0777732

As sequências de codificação de gene de OB ser humano e de murino foram apliadas por PCR a partir de plasmídeos contendo sequências de cDNA de OB e foram subclonadas no plasmideo pPIC.9 (Invitrogen). 0 iniciador 5' ser humano usado era 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3' (SEQ ID N°:34) e no iniciador 3' era 5' GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3' (SEQ ID N°:35).

Para murino, o iniciador 5'era 5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3' (SEQ ID N°:36) e o iniciador 3' era 5' GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3' (SEQ ID N°:37). 0 iniciador 5' tanto para murino quanto para o ser humano contém um sitio Xhol na extremidade de 5' e as sequências de codificação para os últimos 4 aminoácidos da sequência de sinal de fatores de acasalamento alfa presentes no vetor de pPIC.9. 0 vetor dirige secreção de genes heterologamente expresso a partir da célula nos meios 172 ΡΕ0777732 de cultura. 0 iniciador de PCR de 5' também inclui os primeiros 19 nucleotideos do quadro de leitura aberto de gene de OB depois do sitio de clivagem de sequência, antes da alanina na posição 21 de aminoácido. 0 iniciador 3' contém um sitio de EcoRI na sua extremidade 5', que é imediatamente seguido por sequências complementares ao códon de parada de OB putativo. As condições de PCR foram como se segue: desnaturação por 1 min. a 94°C, cozimento por 1 min. a 55°C e extensão por 2,5 minutos a 72°C. PCR de baixo ciclo (15 ciclos) e PFU de polimerase de leitura de prova (Stratagene) foram usados para limitar numerosas mutação geradas por PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com Xhol e EcoRI e foram clonados em vetor similarmente digerido, pPIC.9. Todos os construtos foram sequenciados sobre ambos os filamentos para assegurar a ausência de quaisquer mutações geradas por PCR . Clones foram transformados em Pichia pastoris (His) pelo método esferoplasto e foram selecionados em meios deficientes de histidina. Cerca de 200 clones seres humanos e de murinos foram separados para integração de alto número de cópias por um ensaio de hibridização de colónia. Os clones de alto número de cópias foram então analisados para a expressão de OB, inicialmente, por manchamento de Coomassie mostrando a presença de uma nova proteína 16 kD presente nos meios de cultura de levedura transformada. A tira de 16 kD foi confirmada ser OB usando-se anticorpos criados contra a proteína de OB bacterialmente expressa. As proteínas recombinantes foram purificadas por um método de purificação de duas etapas descrito abaixo. Espectrometria de massa e tratamento de 173 ΡΕ0777732 brometo de cianogênio foram realizados como descrito em Beavis e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6873 - 6877 (1990) . A sequência de codificação de OB total dos genes de murino e ser humano C-terminal para a sequência de sinal foi subclonada no vetor de expressão de pET15b (Novagen) e superexpressa em Escherichia coli [BL21(DE3)plYsS] usando-se o sistema de polimerase de RNA de T7 [Studier e outros, Meth. Enzymology, 185:80 - 89 (1990)]. Células desenvolvidas a 30°C para uma absorbência de 0,7 a 595 nM e induzidas com isopropil-P-D-tiogalacto-piranosideo a 0,5 mM de uma dia para o outro foram coletadas por centrifugação de baixa velocidade. Lise foi realizada por três ciclos de congelamento e descongelamento e digestão de DNA foi realizada com DNasel. Extração de membrana foi realizada por sonicação e solubilização de detergente, o pélete de corpo de inclusão final foi dissolvido em guanidina-HCl a 6 M, HEPES a 2 0 mM, pH 8,4. Proteínas de OB recombinantes foram purificadas sob condições de desnaturação por IMAC usando-se uma coluna de afinidade de íon de Ni e lavagem com aumento de quantidades de imidazol. Proteína de OB desnaturada, purificada foi então armazenada em guanidina-HCl a 6 M, acetato de sódio a 10 mM (NaAc) , pH 5, e reduzida usando-se DTT a 1 mM à temperatura ambiente por 1 hora. Desnaturação foi realizada por diluição da proteína reduzida em glicerol a 20%, CaC12 a 5 mM, NaAc a 5 mM, pH 5, através de misturação e de incubação à temperatura ambiente por 8-12 horas. Depois da desnaturação o pH foi 174 ΡΕ0777732 ajustado para 8,4 por adição de Tris a 10 mM, e a etiqueta de hexa-histidina foi removida por clivagem de trombina. Proteina clivada, renaturada foi repurificada por IMAC para separar o produto a partir de proteina de fusão não-clivada e trombina. Proteina renaturada, clivada elui a partir da coluna de afinidade de ion de Ni em imidazol a 40 mM, enquanto que trombina não-retida e proteina de fusão não-clivada elui em imidazol a 0,2 mM. 0 produto foi então concentrado, foi tratado com EDTA a 100 mM e ferricianeto de potássio a 10 mM e ulteriormente foi purificado por filtração de gel usando-se coluna de Pharmacia superdex 75 16/60.

Um ensaio de Ellman foi conduzido como descrito em Ellman, Arch, Biochem, Biophys, 82:70 - 77 (1959). Reagente de Ellman foi preparado por dissolução de 39,6 mg de 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) em 10 ml de fosfato a 0,05 M, pH 8. Uma curva de calibração foi construída na faixa de concentração de 10 - 120 mM de sulfidrila livre a 412 nm (usando-se uma solução de estoque a 1 mM de DTT reduzido). Cada ensaio foi realizado usando-se 0,02 ml de reagente de Ellman e uma mistura reação total de 0,5 ml. Um coeficiente de extinção medido era de 12974 M^1 cirT1 para grupo de sulfidrila livre (coeficiente de correlação 0,99987), que está dentro de 5% do valor relatado anteriormente de 13600 M_1 cm-1.

Cinquenta ml de 2 mg/ml de proteina filtrada de gel puro, correspondendo a uma possível concentração 175 ΡΕ0777732 sulfidrila livre de cerca de 24 mM na mistura de reação final, foi submetida a ensaio de Ellman. A solução resultante deu A412 de cerca de 0,02, sugerindo que os dois resíduos de cisteína na proteína estão em um estado oxidado formando cistina ou que seus grupos de sulfidrila livres estão completamente enterrados dentro do núcleo inacessível da proteína dobrada. Resultados idênticos foram obtidos por condução do mesmo ensaio sobre proteína redobrada na presença de guanidina-HCl a 6 M.

Camundongos foram individualmente engaiolados em um ambiente livre de patógeno e foram aclimatados a uma dieta contendo 35% (p/p) de Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9% (p/p) de mistura de pudim de tapioca (General Foods) e 59,1% de água, que tem um teor de energia de 1,30 kcal/g. A dieta foi esterilizada por autoclave e foi embalada em pratos de plástico de 60 mm, que foram fixados aos topos de placas petri. A tapioca deu a dieta uma textura pastosa tornado-a difícil para o animal espalhar na gaiola. A tampa de 100 mm recupera a pequena quantidade de alimento espalhada pelo animal. Um prato novo de alimento foi colocado dentro da gaiola a cada manhã e o prato do dia anterior foi removido e foi pesado. A diferença em peso proveu uma medida de consumo de alimento diário. Efeitos de proteina recombinante em ingestão de alimento e peso de corpo foram medidos em três cepas de camundogongos; C57B1/6J de OB/OB, C57 Bl/Ks de db/db e CBA/J +/+, adquiridas da Jackson Laboratory. Trinta murinos de cada cepa foram divididos em grupos de 10. Um grupo de 176 ΡΕ0777732 cada cepa recebeu diariamente injeções intraperitoniais (i.p.) da proteina de OB bacteriana redobrada em uma dose de 5 mg/g/dia em 300 μΐ de PBS. Um segundo grupo recebeu injeções i.p. do mesmo volume de PBS. Estes murinos de controle receberam injeções do dialisado de PBS da proteina recombinante. O PBS foi depurado de endotoxina usando-se uma coluna de Acticlena ETOX. Um terceiro grupo de animais não recebeu injeções. A ingestão de alimento foi registrada diariamente e medições de peso corpo foram registradas regularmente durante um intervalo 3,5 semanas. Para experiência de alimentação aos pares, a ingestão de alimento de um grupo separado de murinos de OB foi comparada em uma base diária com aquela consumida pelos murinos que receberam proteina.

Resultados A Proteína de OB Circula em Plasma de Murino, de Rato e de Ser humano.

Proteína de OB humana e de murino recombinante foi preparada usando-se o vetor de expressão bacteriano pET 15b (Novagen) e por clonagem em Pichia pastoris, um sistema de expressão de levedura que secreta proteínas recombi-nantes diretamente dentro dos meios de cultura. A proteina de OB expressa em levedura inclui os 146 aminoácidos carbóxi-terminais à sequência de sinal. Coelhos foram imunizados com as proteínas bacterianas (HPR, Inc.). Anticorpos foram imunopurifiçados (Research Genetics) e 177 ΡΕ0777732 foram usados para imunoprecipitaçoes e Western blots de proteína de plasma e de tecido adiposo. A proteína de OB de plasma de murino migra com um peso molecular aparente de 16 kD por SDS-PAGE. A mobilidade eletroforética é idêntica à proteína de OB recombinante secretada por levedura depois da remoção de sequência de sinal (figura 24A). A proteína não foi detectada em plasma de murinos C57B1/6J de OB/OB que têm mutação sem sentido no códon 105. Vários anti-soros diferentes falharam para identificar a cadeia de polipeptídeo de resíduo truncado 105 prevista pela sequência de cDNA.

Um aumento de dez vezes no nível de proteína ciruclante foi observado em murinos de db/db em relação a um animal de controle (figura 24A) . Imunoprecipitação de plasma de ratos de tipo selvagem e de fa/fa revelaram um aumento de 20 vezes no nível de proteína de OB no rato mutante em comparação com o tipo selvagem (figura 24B). Os resultados de mutação de db em um fenótipo obeso idêntico àquele visto em murinos de OB (Bahary e outros, 1990, supra) . Ratos gordos são obesos como um resultado de uma mutação recessiva em um gene homólogo para db (Truett e outros, 1991, supra). A fim de quantificar o nível de OB em plasma de murino, aumentando quantidades de proteína recombinante foram adicionadas ao soro e foram imunopre-cipitadas (figura 24C). Um aumento linear da intensidade de sinal em Western blot foi visto com o aumento de quantidades de proteína recombinante. Comparação da 178 ΡΕ0777732 intensidade de sinal da proteína natural em plasma de murino para os padrões indicaram que o nível de proteína circulante de OB em murinos de tipo selvagem é cerca de 20 ng/ml. Esses dados demonstram que as imunoprecipitações e os Western blots foram realizados sob condições de excesso de anticorpo. Níveis aumentados da proteína de OB foram também vistos em extratos de proteína de tecido adiposo de murinos de db/db em relação a controles (Figura 24D). Como esperado para uma proteína secretada, a proteína do tecido adiposo se fracionou com a fração de membrana bruta (dados não-mostrados).

Amostras de plasma de seis indivíduos magros com um índice de Massa de Corpo de menos do que 25 (BMI = peso/comprimento2) foram imunoprecipitados usando-se anticorpos imunopurifiçados para a proteína humana. O material imunoprecipitado migrou com uma mobilidade eletroforética idêntica àquela vista para a proteína humana de 146 aminoácidos expressa em levedura. A intensidade dos sinais variou significativamente entre as seis amostras (Figura 25A) . Densitometria da audio-radiografia revelou uma diferença de cerca de cinco vezes nos níveis em indivíduos de HP1 e de HP6, com níveis intermediários nos outros indivíduos. Um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) foi desenvolvido usando o anticorpo imunopurifiçado e a proteína bacteriana redobrada como um padrão (ver abaixo). A curva padrão resultante está mostrada na Figura 25B. Usando este ensaio, os níveis de plasma da proteína de OB nas seis amostras de plasma humano variaram entre 2-15 179 ΡΕ0777732 ng/ml (Figura 25C). 0 nível da proteína de OB de HP6 estava fora da faixa linear do imunoensaio e é igual ou inferior a 15 ng/ml. Essas diferenças quantitativas correlacionaram-se com aquelas vistas em Western blots.

Dados preliminares sugerem que leptina pode circular, pelo menos em parte, complexado a outra proteína ou proteínas. Essa conclusão foi baseada na heterogeneidade da forma da curva de titulação para soro comparada com padrão recombinante. Análise de uma grande quantidade de leptina imunopurifiçada sobre uma coluna de anti-OB de coelho por HPLC de filtração de gel sobre condições de desnaturação e de não-desnaturação, com monitoração por ELISA e SDS-PAGE sugeriu que o polipeptídeo de OB comporta-se como um complexo de alto peso molecular. No entanto, esses dados permanecem preliminares; a proteína de ligação de OB, se existente, tem, no entanto, de ser caracterizada.

Características Estruturais da Proteína de OB

Uma vez que a proteína de OB tem dois resíduos de cisteína, ela pode formar ligações de dissulfeto ou intra-ou intermoleculares sob condições de oxidação in vivo. Western blots foram repetidos com e sem a adição de agentes de redução ao tampão de amostra. Sob ambas as condições, a proteína de OB em soro ser humano migrou como um monômero (dados não-mostrados). Sob condições de não-redução, proteína imunoprecipitada a partir de soro de murino de OB foi detectada em posições consistentes com aquela de tanto 180 ΡΕ0777732 um monômero de 16 kD quanto de um dímero de cerca de 32 kD (Figura 26A) . A porção de peso molecular superior desapareceu sob condições de redução sugerindo que uma fração de OB de murino circula como uma espécie de peso molecular superior via formação de uma ligação de dissulfeto intermolecular. Cerca de 80% de OB de murino circula como a proteína de cerca de 16 kD e 20% como a forma de cerca de 32 kD.

As mesmas formas moleculares são vistas quando as proteínas de murino e de ser humano são expressas em Pichia pastoris {Abrams e outros., Immunol. Rev., :5-24 (1992)}. Nesses estudos, a sequência de DNA correspondente à proteína de OB madura de 146 aminoácidos foi clonada a jusante da sequência de sinal de fator de acasalamento alfa no vetor de pPIC.9 (Invitrogen). A proteína de OB foi purificada a partir dos meios de levedura de cepas que expressam as proteínas de murino e de ser humano e foi submetida a eletroforese sob condições de redução e de não-redução (Figura 26A). A proteína de murino foi expressa em levedura como um dímero sob condições de não-redução, e só como um monômero na presença de agentes de redução. A proteína humana recombinante migrou para a posição de um monômero sob ambas as condições (dados não-mostrados). A proteína de ser humano não-purifiçada expressa em Pichia tinha uma massa molecular de 16.024 ± 3 Da como determinada por espectrometria de massa 1990 (Beavis, 1990, supra) . Esse valor está de acordo com a massa calculada a 181 ΡΕ0777732 partir da sequência de aminoácidos da proteína contendo uma única ponte de dissulfeto intramolecular (16.024 Da). Análise, espectrométrica de massa de desabsorção a laser auxiliada por matriz, de produtos de clivagem de brometo de cianogênio a proteína indica que cisteínas 117 e 167 estão ligadas através de uma ponte de dissulfeto intramolecular (Figura 26B). Brometo de cianogênio cliva carboxiterminal a resíduos de metionina.

Preparação e Caracterização de Proteína Recombinante Bioativa

Proteína de OB de murino foi expressa em E. coli a partir de um plasmídeo de pET 15b como uma proteína de fusão insolúvel, com uma etiqueta de hexa-histidina, N-terminal, de 20 resíduos, etiqueta de N-terminal hexa-histidina"), contendo um sítio de clivagem de trombina. Corpos de inclusão bacteriana foram solubilizados usando guanidina - HC1 e foram purificados sob condições de desnaturação usando cromatografia de afinidade de íon de metal imobilizado (IMAC) (Figura 27) . Proteína de fusão desnaturada, purificada, foi reduzida, foi diluída e foi permitida se redobrar em solução aquosa à temperatura ambiente. Após clivagem de trombina, proteína de OB de murino renaturada contendo quatro resíduos N-terminais adicionais (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID N°:38) foi repurificada por IMAC para homogeneidade superior a 98%, como julgado por SDS-PAGE e espectrometria de massa. Espectrometria de massa de dessorção a laser assistida por matriz deu uma 182 ΡΕ0777732 massa medida de 16.414±3 Da (massa estimada = 16.415 Da). Tanto géis de SDS-PAGE de redução quanto de não-redução demonstraram uma única espécie molecular com peso molecular e aparente de 16 kD (dados não-mostrados).

Dispersão de luz dinâmica usando um Detetor de Tamanho Molecular DP801 (Protein Solutions, Inc.) demonstrou que a proteína de OB de murino renaturada era grandemente monomérica, com alguns agregados de ordem superior. A proteína foi tratada com EDTA e foi quimicamente oxidada. Espécies de peso molecular superior foram então removidas por filtração de gel. Ulterior dispersão de luz dinâmica confirmou que a proteína de OB de murino recombinante renaturada estava monodispersa. Após diálise contra salmoura tamponada por fosfato (PBS), endotoxina bacteriana foi removida usando uma coluna Acticlean ETOX (Sterogene Bioseparations, Inc.). 0 rendimento final de proteína foi de 45 mg/1.

Ensaio de Ellman foi realizado sobre a proteína de OB de murino recombinante renaturada, purificada, para avaliar seu estado de oxidação (Ellman, 1959, supra). Tanto proteína renaturada quanto proteína não-dobrada por HC1 -guanidina a 6M demonstraram teor de sulfidrila livre inferior a 0,5%, demonstrando que o produto monomérico contém uma ligação de dissulfeto intramolecular. Isso foi confirmado por espectrometria de massa dos produtos de clivagem de brometo de cianogênio da proteína bacteriana redobrada (dados não-mostrados). 183 ΡΕ0777732

Bioatividade da Proteína de OB. A proteína de OB de murino recombinante renaturada, purificada, foi administrada como uma injeção intraperitoneal diária de 5 mg/kg/dia a grupos de murinos C57B1/6J de OB/OB (idade, 16 semanas), C57B1/Ks de db/db (idade, 12 semanas) e CBA/J +/+ (idade, 8 semanas) . Um número igual de animais receberam PBS como uma injeção diária. A PBS usada para controlar as injeções era derivada do dialisado depois de equilíbrio da proteína. Dez animais adicionais oriundos das três cepas de murinos não recebram injeções. A ingestão de alimento de animais individuais foi monitorada diariamente e os pesos dos animais foram registrados em intervalos de três ou quatro dias. Os resultados cumulativos para ingestão de alimento e peso de corpo a partir de cada um dos 9 grupos de murinos estão mostrados nas Figuras 28A até F, e a significância estatística dos dados está mostrada na Tabela 1. A ingestão de alimento dos murinos C57B1/6J de OB/OB injetados com proteína foi significativamente diminuída após a primeira injeção e continuou a diminuir até o quinto dia, quando ele se estabilizou em um nível igual a cerca de 40% da ingestão dos animais que recebram injeções de PBS (p < 0,001). Os murinos de OB injetados com simulado não perderam peso durante o período de estudo de três semanas. Os murinos C57B1/6J de OB/OB que receberam proteína perderam cerca de 10% de peso de corpo depois de cinco dias (p < 0,001) . Esses animais continuaram a perder peso durante o tratamento de três semanas em cujo ponto o peso dos animais de OB que receberam proteína tinha diminuído 184 ΡΕ0777732 para uma média de 60% do seu peso de corpo inicial (p < 0,0001). Um grupo separado de murinos de OB foi alimentado aos pares para os murinos de OB que receberam proteína. Os dados na Figura 29B mostram que os murinos alimentados aos pares perderam significativamente menos peso do que os animais que receberam a proteína recombinante (p < 0,02). Uma fotografia de dois murinos que receberam injeção ou de proteína ou de veículo mostra a grande diferença na aparência resultante do tratamento com proteína (Figura 29B) . A fim de se determinar ulteriormente os efeitos da proteína, autópsias de dois murinos em cada um dos grupos foram realizadas. Inspeção grosseira dos murinos de OB que recebram proteína revelou uma diminuição dramática na gordura de corpo bem como no tamanho do fígado. Os pesos de fígado dos murinos de db e de murinos do tipo selvagem não foram alterados com o tratamento. Os fígados dos murinos de OB que receberam injeções de PBS pesaram 5,04 e 5,02 gramas versus 2,23 e 2,03 gramas nos animais que reberam a proteína recombinante. Em contraste com o fígado gordo pálido característico dos murinos de OB, o fígado dos murinos de OB que receberam proteína adquiriram a cor mais escura característica do fígado normal (Figura 29C). Seções histológicas do fígado indicam que os animais não-tratados tinham um fígado gordo que estava marcado melhorado em animais tratados com proteína (dados não-mostrados).

Em contraste com os murinos de OB, não houve diferenças significativas no peso de corpo ou na ingestão de alimento nos murinos C57BL/Ks que receberam proteína em 185 ΡΕ0777732 relação ao grupo de controle que recebeu veículo (Figuras 28A até F, Tabela 1) . Todos os três grupos de murinos de db/db perderam entre 2 a 5 gramas durante o período de tratamento. A glicose média no sangue dos murinos de db foi medida usando um glucômetro, e era superior ou igual a 500 mg/dl em todos os murinos indicando que esses animais tinham desenvolvido diabetes secundária à obesidade. As injeções dos murinos de db foram terminadas depois de duas semanas.

Em murinos de tipo selvagem houve uma diminuição pequena mas significativa no peso de corpo após a administração de proteína de OB recombinante (Figuras 28A -F, Tabela 1). Depois de cinco dias de injeção de proteína, os murinos tratados perderam uma média de 0,5 grama enquanto que os murinos de controle ganharam 0,4 grama (p < 0,02). Em dois pontos de tempo subsequentes os animais que receberam proteína pesavam significativamente menos do que os murinos que receberam injeções diárias de PBS. A significância de mudança de peso foi reduzida nos pontos de tempo posteriores. Nos animais que perderam peso, a ingestão de alimento não era significativamente diferente dos animais de controle. As injeções de PBS tiveram um efeito pequeno mas significativo sobre a ingestão de alimento e sobre o peso de corpo em murinos de OB, de db e do tipo selvagem quando comparados com murinos que não recebram injeções (p < 0,05). 186 ΡΕ0777732

Tabela 1

Grupo Grupo de Mudança de peso de animal tratamento Dias n Médio Erro padrão P OB/OB veículo de 1-5 10 -6,38000000 0,47628190 <0,001 proteína 9 -0,14444444 0,24444444 veículo de 1-12 10 -14,4500000 0,70793126 <0,001 proteína 9 0,988888889 0,38058597 veículo de 1-27 6 -24,2833333 0,69924563 <0,0001 proteína 5 4,300000000 0,79874902 db/db veículo de 1-5 10 -,470000000 0,36939891 0,240 proteína 10 -2,00000000 0,23142073 veículo de 1-12 10 -3,75000000 0,77348418 0,610 proteína 10 -4,19000000 0,34655447 CBA/J veículo de 1-5 10 -0,48000000 0,17876117 0,006 proteína 10 0,380000000 0,21489015 veículo de 1-12 10 0,120000000 0,45748103 0,015 proteína 10 1,200000000 0,18378832 veículo de 1-27 5 1,980000000 0,48723711 <0,651 proteína 6 2,233333333 0,20763215

Discussão

Uma função endócrina para o produto de proteína do local de OB foi sugerido por Coleman, o qual mostrou que o peso de corpo de murinos de OB/OB foi reduzido depois de união parabiótica para murinos de db ou normais (Coleman e outros, 1978, supra). Os resultados indicados acima suportam esta hipótese por mostrar que a proteína de OB circula na corrente sanguínea e que injeções de proteína recombinante reduzem o peso de corpo. 0 peso molecular do produto gene codificado pela gene de OB é cerca de 16 kD, 187 ΡΕ0777732 que é igual as 146 sequências de aminoácidos carbóxi-terminais para a sequência de sinal. A proteína recombinante de OB não é modificada quando expressa em Pichia pastoris. Expressão de genes de mamíferos em Pichia em geral resulta na formação da estrutura de proteína correta [Cregg e outros, Bio/Technology, 11:905 - 914 (1993)]. Estas constatações sugerem que a proteína de OB não é glicosilada e não é pós-traducionalmente processada in vivo. Os dados não excluem a possibilidade que a proteína de OB é não covalentemente ligada por ela própria ou por outras proteínas em plasma ou em tecido adiposo. Embora clivagem proteolítica da proteína não tenha sido excluída, formas de peso molecular mais baixos da proteína de OB não foram detectados por quaisquer dos anti-soros usados, incluindo quatro anticorpos de antipeptídeo. A proteína de OB tem dois resíduos de cisteína e circula como um monômero em ser humano, e como um monômero e um dímero em murino. Uma ligação de dissulfeto intramolecular típica de moléculas secretadas é demonstrada quando a proteína humana é expressa em Pichia pastoris sugerindo que deve provavelmente estar presente in vivo. Isto é suportado pela bioatividade do proteína bacteriana recombinante, que tem uma ligação de dissulfeto intramolecular. A proteína de OB de murino pode ser encontrada em plasma como um monômero e como um dímero. 0 monômero e o dímero são vistos quando a proteína de OB de murino é expressa em levedura mostrando que a tendência da proteína de murino para formar um dímero é o resultado de diferenças 188 ΡΕ0777732 na sequência primária em relação ao homem. Embora esteja claro que o monômero tem bioatividade, a atividade funcional do dimero é desconhecida. 0 efeito da proteína de OB sobre ingestão de alimento e peso de corpo em murinos de OB é dramático. Depois de três semanas de tratamento, os murinos de OB que receberam injeções diárias de proteína recombinante tinham perdido 40% do seu peso e estavam consumindo 40% da quantidade de alimento os animais de controle. Além do mais, o peso dos murinos de OB tratados não tinha ainda equilibrado na época que a experiência terminou. Os resultados do par de experiência de alimentação indicam que a perda de peso é um resultado de efeitos sobre tanto a ingestão de alimento quanto de energia gasta. Assim, um grupo separado de murinos de OB cuja ingestão calórica foi restrita àqueles murinos de OB recebendo proteína, perderam significativamente menos peso do que os animais recebendo proteína. A redução na ingestão de alimento em murinos de OB/OB para um nível menor do que de murinos de tipo selvagem, dentro de um dia de recebendo a proteína de OB, indica que eles são especialmente sensíveis aos seus efeitos. De fato, o receptor de OB pode ser regulado para cima nestes animais. Ingestão de alimento de murinos de OB tratados tornou-se relativamente constante depois de cinco dias de tratamento. Se isto é o resultado da proteína ter atingido níveis de estado constante, seria sugerido que a proteína tem uma meia-vida relativamente longa [The Pharmacological Basis of Therapeutics, págs. 19 - 45, 189 ΡΕ0777732

Goodman e Gilman, eds., Pergamon Press, New York, (1990)]. Esta conclusão é consistente com os dados das experiências de parabiose [Coleman e outros, 1978, supra, Weigle, Int. J. Obesity, 12:567 - 578 (1988)].

Efeitos de proteína recombinante no peso de corpo de murinos de tipo selvagem foram pequenos mas estatisticamente significativos durante as primeiras duas semanas do estudo. Enquanto a diferença em peso entre os murinos de tipo selvagem recebendo proteína versus PBS foi sustentado em pontos de tempo posteriores, a significância estatística dos dados grandemente diminuídos depois de três semanas. A perda de peso prematura poderia não ser explicada por uma diferença em ingestão de alimento. Presumidamente, a medição de ingestão de alimento não foi precisa o bastante para detectar uma diminuição resultante em uma diferença de um grama em peso de corpo durante o tratamento. Estas observações diferem-se a partir dos resultados de experiências anteriores em que roedores foram unidos por união parabiótica para murinos de db, ratos de fa, ratos com lesões hipotalâmicas e ratos tornados obesos por uma dieta de alta caloria [Coleman e outros, 1978, supra; Harris e outros, 1978, supra, Harris e outros "Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats", em Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physicol., 145:336 - 352 (1959]. Em cada caso os animais de tipo selvagem tornaram-se anoréticos e perderam quantidades copiosas de peso. 190 ΡΕ0777732

Quando os níveis de proteína de OB são aumentados em murinos de db e em ratos de fa e o nível de RNA de OB é aumentado em murinos com lesões hipotalâmicas, é provável que murinos de tipo selvagem possam responder a OB quando ele circula em plasma e um nível suficientemente alto. As constatações relatadas aqui são consistentes com a possibilidade que os niveis da proteína administrada eram abaixo dos níveis endógenos, levando ao equilíbrio de um peso de corpo levemente menor. Quantificação dos niveis de circulação da proteína de OB nos murinos tratados resolverá esta questão. Embora um imunoensaio da proteína de murino não esteja ainda disponível, imunoprecipitações sugeriram que os níveis da proteína circulante de OB não eram substancialmente elevados nos murinos de tipo selvagem recebendo proteína. 0 menor efeito da proteína em murinos de tipo selvagem e ausência de uma resposta em murinos de db torna-se improvável que o tratamento tenha efeitos não-específicos ou adversos. Todos os murinos de db perderam uma quantidade pequena de peso durante o período de tratamento, se ou não eles estivessem recebendo a proteína de OB. Os animais de db eram marcadamente hiperglicêmicos e a perda de peso deve provavelmente ser o resultado de diabetes e não o protocolo experimental. Murinos de C57BL/Ks de db/db frequentemente desenvolvem diabetes e começam a perder quantidades pequenas de peso quando tem a idade dos animais usados neste estudo (Coleman e outros, e outros, 1978, supra) . Murinos de C57BL/Ks de OB/OB de uma 191 ΡΕ0777732 idade similar não desenvolveram hiperglicemia significativa. Estas diferenças fenotipicas são pensadas serem o resultado de diferenças genéticas nas cepas (C57B1J versus C57B1/Ks) portanto as mutações (Coleman e outros, 1978, supra). A falha para detectar a proteína de 105 de aminoácidos truncada prevista pela sequência de cDNA do gene de OB em murinos de C57B1/Ks de OB/OB sugere que a proteína mutante é ou degradada ou não é traduzida. No entanto, a posibilidade que os anti-soros usados para não-detectar esta proteína truncada não pode ser excluída. O aumento dez vezes observado nos níveis da proteína de OB em murinos de db em comparação com tipo selvagem sugere que a proteína de OB é superproduzida quando há resistência a seus efeitos. Estes dados correlacionam-se com estudos do mRNA de OB. Como mencionado, experiências anteriores têm mostrado que mutações dos genes de db de murino e de fa de rato, que mapeam as regiões cromossomiais homólogas, resultam em superprodução de um fator de plasma que suprime peso de corpo (Truett e outros, 1991, supra: Coleman, 1978, supra, Hervey, 1959, supra). Em ambos os casos, foram sugeridos que os animais mutantes são resistentes aos efeitos da proteína de OB. Isto possivelmente é confirmado pela observação que a proteína de OB não tem efeito sobre o peso de corpo ou sobre a ingestão de alimento quando administrada a murinos de db. 192 ΡΕ0777732

Obesidade em seres humanos poderia estar associada com níveis aumentados da proteína de OB em plasma em indivíduos que são relativamente não-responsivos ao hormônio. Por outro lado, expressão reduzida de OB poderia também levar a obesidade caso esse em que níveis "normais" (isto é, inapropriadamente baixo) da proteína devem ser encontrados. Assim, os níveis de proteína de OB em plasma ser humano poderia ser um marcador para diferentes formas de obesidade. Em um pequeno grupo de indivíduos magros com BMI < 25, níveis baixos de nanograma de circulação de proteína de OB são detectáveis por ELISA. Significativamente, concentrações variáveis foram observadas sugerindo que o nível de expressão e/ou sensibilidade à proteína pode desempenhar um papel na determinação de peso de corpo. 0 sítio de ação da proteína de OB é desconhecido. A proteína afeta tanto a ingestão de alimento quanto a energia gasta, uma constatação consistente com estudos clínicos indicando que alterações de ambos os sistemas atuam para regular peso de corpo [Leibel e outros, N. Engl. J. Med., 332:621 - 628 (1995); Keesey e outros, "Metabolic defense of the body weight set-point", em Association for Research in Nervous and Mental Disease, págs. 87 - 96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York. (1984)]. 0 hipotálamo deve provavelmente ser a justante de OB na trajetória que controla peso de corpo, embora efeitos diretos sobre uma variedade de órgãos sejam possíveis. 193 ΡΕ0777732

Exemplo 9: Expressão Aumentada em Adipócitos de RNA de OB em Murinos com Lesões do Hipotálamo e com Mutações no Local de db 0 produto de gene do gene de obeso de murino recentemente clonado (OB) desempenha um papel importante na regulação da massa de tecido adiposo. RNA de OB é expresso específicamente por adipócitos e murino in vivo em cada um dos diferentes depósitos de células pré-adipócitas que foram induzidas a diferenciar. Murinos com lesões do hipotálamo, bem com murinos mutantes no local de db, expressam um nível vinte vezes maior de RNA de OB em tecido adiposo. Estes dados sugerem que tanto o gene de db quando o hipotálamo são a jusante do gene de OB na trajetória que regula a massa de tecido adiposo e são consistentes com as experiências anteriores sugerindo que o local de db codifica o receptor de OB. Nos murinos de db/db e lesionados, diferenças quantitativas no nível de expressão de RNA de OB correlacionadas com o teor de lipídio de adipócitos. As moléculas que regulam o nível de expressão do gene de OB em adipócitos são prováveis a desempenhar um papel importante na determinação de peso de corpo, como são as moléculas que mediam os efeitos de OB em seu sítio de ação.

Materiais e Métodos

Hibridização in situ

Tecidos de gordura branca de regiões abdominais 194 ΡΕ0777732 idênticas de murinos de tipo selvagem e de db foram processados simultaneamente de acordo com o método modificado descrito por Richardson e outros, Growth, Development & Aging, 56:149 - 157 (1992). Resumidamente, tecidos foram fixados em solução de Bouin por 2 horas a 4°C. Eles foram então hibridizados por tratamento em série de aumentar concentrações de etanol de 10% para 100%, cada um por 5 min. a 4°C. Outra incubação de tecidos com xileno (1 h) e parafina (2 h) foram realizadas a 65°C. Tecidos de gordura de db/db e de wt assentados foram seccionados e foram montados pelas mesmas condições anteriores. Seções foram cozidas a 65°C por 1 hora e foram tratadas com xileno e diluições em série de etanol de 100% para 50%, cada uma por 3 min. à temperatura ambiente. Uma sonda de RNA de sem sentido de gene de OB foi sintetizada por transcrição in vitro de sequência de codificação de gene de OB linearizado a montante de um promotor de polimerase de RNA de Sp6. Hibridização in situ foi realizada exatamente de acordo com Schaeren-Wiemers e outros., Histochemistry, 100: 431 - 440 (1993) .

Preparação de RNA e Cultura de Células RNA total e Northern blots foram preparados como descrito. Células vasculares estromais e adipócitos foram preparadas de acordo com Rodbell, e RNA de ambas as frações foram preparadas de acordo com Dani e outros., Mol. Cell. Endocrinol., 63: 199 - 208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem. 239: 375 - 380 (19 ) . Depois de subclonagem, células de 3T3-F442 foram desenvolvidas em meio de Eagle modificado 195 ΡΕ0777732 contendo soro bovino fetal a 10% (definido como meio padrão) [Dani e outros., "Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation", em Obseity in Europe, vol. 88, págs. 371 - 376, Bjorntorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., Londres, Inglaterra) (1989)]. Em confluência, células foram tratadas em meio padrão suplementado com triiodotironina (T3) a 2 nM e insulina a 17 nM. Doze dias depois, RNA foi preparado como acima.

Tratamento de Tioglicose de Ouro

Murinos de CBA/J fêmeas com dois meses de idade foram tratados com uma única injeção intraperitoneal de aurotioglicose (Sigma Catalog n° A0632) em uma dose de 0,2 mg/g em salmoura normal. Animais de controle foram injetados com salmoura normal. Murinos foram pesados um mês depois do tratamento. RNA de tecido adiposo foi isolado a partir daqueles animais tratados cujo peso tinha aumentado mais do que 20 gramas pós-tratamento de GTG.

Resultados O gene de OB recentemente demonstrou ser expresso em tecido adiposo [Zhang e outros., Nature, 372: 425 - 432 (1994)]. Uma vez que o tecido adiposo é composto de muitos tipos de célula incluindo adipócitos, preadipócitos, fibroblastos e células vasculares, hibridização in situ foi realizada para seções de almofadas de gordura epidimal oriundas de animais normais com ribossondas de OB de 196 ΡΕ0777732 sentido e de sem sentido [Richardson e outros., 1992, supra; Wasserman, "The concept of the fat organ" em Rodahl, Issekutz, fat as a tissue, págs. 22 - 92, McGraw Hill, Nova Iorque (1964)] . Quando do uso da sonda de sem sentido, sinais positivos eram detectáveis em todos os adipócitos na seção (Figura 30 - rotulado Wt) . Sinais não eram notados quando a sonda sem sentido foi hibridizada para seções de cérebro (dados não-mostrados). Hibridização da sonda de sem sentido para seções de tecido adiposo de murinos de C57B1/Ks de db/db foi grandemente aumentada, confirmando a expressão de RNA de OB e demonstrando um grande aumento no nivel de RNA de OB por adipócito nesses animais (Figura 30 - marcado de db/db). Murinos mutantes no local de db são maciçamente obesos como parte de uma síndrome que é fenotipicamente idêntica àquela vista em murinos de C57B1/6J de OB/OB (Bahary e outros., 1990, supra). RNA de OB não foi sintetizado por células estromais de tecido adiposo separadas a partir de adipócitos. Como esperado, células na fração de adipócito expressou RNA de OB usando Northern blots (Figura 31) . 0 mesmo resultado foi obtido usando-se RT-PCR (dados não-mostrados) . Esses dados suportam a conclusão de que apenas adipócitos expressam o gene de OB. Dados de adipócitos cultivados confirmam essa conclusão. Nesses estudos, células de 3T3-F442A foram cultivadas usando condições que levam à acumulação de lipídio, como parte de um programa celular que leva à diferenciação em adipócitos. RNA de OB não foi expresso em células de crescimento exponencial, nem em células de pré-adipócito de 3T3-F442A, que expressam 197 ΡΕ0777732 marcadores precoces, enquanto que diferenciação dessas células levou à expressão de niveis detectáveis de RNA de OB (Figura 31). [Dani e outros., J. Biol. Chem., 264: 10119 - 10125 (1989). O nivel de RNA de OB é extremamente sensivel às condições de cultura, uma vez que nenhuma mensagem foi observada tardiamente, células pós-confluentes não expostas à insulina.

Estudos de hibridização mostraram que o RNA de OB é expresso in vivo em diversos depósitos de gordura diferentes incluindo as almofadas de gordura epididimais, parametriais, abdominais, peri-renais e inguinais (Figura 32A). 0 nivel preciso de expressão em cada um dos depósitos foi um pouco variável, com gordura inguinal e parametrial expressando niveis inferiores de RNA de OB. RNA de OB é também expresso em tecido adiposo marrom, embora o nivel de expressão seja cerca de 50 vezes inferior em gordura marrom em relação aos outros depósitos de tecido adiposo. Essas diferenças quantitativas correlacionam-se soltamente com diferenças anteriormente relatadas em tamanho de célula entre diferentes depósitos de célula de gordura [Johnson e outros., J. Lipid Res., 13: 2-11 (1972)]. A quantidade de RNA de OB em gordura marrom não é afetada por exposição a frio (Figura 32B) . Nessa experiência, o nivel de RNA de proteina de OB (UCP) aumentou em gordura marrom depois de exposição a frio ao passo que o nivel de RNA de OB não mudou [Jacobson e outros., J. Biol. Chem., 260: 16250 -16254 (1985)]. Em agregado, esses dados confirmam que todos os adipócitos são capazes de produzir RNA de OB e demonstram um nivel variável de expressão em diferentes 198 ΡΕ0777732 depósitos de gordura. Esses dados suportam a possibilidade de que o nível de proteína codificada correlaciona-se com a massa de tecido adiposo total. Níveis de RNA de OB em murinos de db/db e murinos com lesões do hipotálamo foram medidos. Lesões do hipotálamo ventromediais (VMH) resultam em obesidade como parte de uma síndrome semelhante àquela vista em murinos de OB/OB e de db/db [Bray e outros., Metabolism, 24: 99 - 117 (1975)]. Experiências de parabiose sugerem que lesões resultam em superexpressão de um fator de origem sanguínea que suprime ingestão de alimento e peso de corpo (Hervey, 1959, supra). Resultados similares são notados quando murinos mutantes no local de db são parabiosados para murinos normais, sugerindo que o receptor de OB pode ser codificado pelo local de db (Coleman e outros, 1978, supra). Assim, obesidade resultante de lesões de VMH e a mutação de db pode ser o resultado de resistência aos efeitos da proteína de OB. Se assim for, um aumento secundário nos níveis de RNA de OB em tecido adiposo seria previsto.

Lesões do hipotálamo foram induzidas em murinos de CBA fêmeas usando a tioglicose de ouro (GTG) [Debons e outros., Fed. Proc., 36: 143 - 147 (1977)]. Esse tratamento resulta em lesões do hipotálamo específicas, principalmente no hipotálamo ventromedial (VMH) com o subsequente desenvolvimento de obesidade dentro de diversas semanas. Usualmente, uma única injeção intraperitoneal de GTG de 0,2 mg/g de peso de corpo resulta no desenvolvimento de 199 ΡΕ0777732 obesidade dentro de quatro semanas. Murinos de CBA/J fêmeas de um mês de idade (20 - 25 gramas) foram tratados com GTG e o subsequente ganho de peso de animais tratados e animais de controle é mostrado (Tabela 2) . RNA de tecido adiposo foi preparado a partir de murinos de db/db e a partir daqueles animais tratados com GTG que ganharam mais de 20 gm. Northern blots mostraram um aumento de 20 vezes no nivel de RNA de OB em murinos tratados com GTG e murinos db/db de dois meses de idade em comparação com animais normais (Figura 33).

Tabela 2. Ganho de peso em murinos tratados com tioglicose de ouro

Controle (n = 41) GTG (n = 93) < 10 g 41, (100%) 4, (4%) 10 g-20 g 0, (0%) 15, (16% > 20 g 0, (0%) 74, (80%

Murinos de CBA/J fêmeas de dois meses de idade foram tratados com tioglicose de amarelo-ouro (GTG). Tioglicose de ouro (Sigma A0632) foi administrada intrape-ritonealmente em solução de salmoura normal a uma dosagem de 2,0 mg/g. Peso de corpo de animais de controle e de animais injetados foi registrado antes e depois de um mês depois da injeção. Animais foram alojados em cinco em uma gaiola e foram alimentados ad libitum. A quantidade de peso ganho um mês depois da injeção está mostrada na tabela 2. Animais com um ganho de peso de corpo superior a 20 g um mês depois da injeção foram selecionados para ulterior estudo. 200 ΡΕ0777732

Discussão O produto de gene de OB de murino circula em plasma de murino e em plasma ser humano onde ele pode agir para regular a massa de tecido adiposo. Estudos ulteriores sobre a regulação de expressão e mecanismo de ação de OB terão importantes implicações para o nosso entendimento do caminho fisiológico que regula o peso de corpo. O presente Exemplo mostra que o produto de gene de OB é expresso exclusivamente por adipócitos em todos os depósitos de tecido adiposo. Esse resultado é consistente com a possibilidade de que o produto de proteína do gene de OB correlaciona-se com as reservas de lipídio do corpo. Além do mais, RNA de OB é regulado para cima 20 vezes em murinos de db e murinos com lesões de hipotálamo. Nesses animais, o aumento real no nível de RNA de OB por célula é provável de ser ainda superior a vinte vezes uma vez que o tamanho de célula de adipócito é aumentado de cerca de 5 vezes nesses animais (ver Figura 30) (Debons e outros., 1977, supra) . Esses dados posicionam o gene de db e o hipotálamo a jusante de OB no caminho que controla o peso de corpo e é consistente com a hipótese de que o receptor de OB está codificado no local de db [Coleman e outros., Diabetologia 14: 141 - 148 (1978)]. A clonagem molecular do receptor de OB e/ou do gene de db resolverão esta questão. O aumento do nível de RNA de OB em murinos de db/db e tratados com GTG também sugere uma função não-autônoma de célula do gene de OB em células de gordura [Ashwell e 201 ΡΕ0777732 outros., Proc. R. Soc. Lond., 195: 343 - 353 (1977); Ashwell e outros., Diabetologia, 15: 465 - 470]. Assim, se a proteína codificada atuou diretamente sobre células de gordura para inibir crescimento ou diferenciação, a ultra-expressão do gene de OB do tipo selvagem em murinos tratados com GTG resultaria em um fenótipo magro. A explicação mais parcimoniosa desses dados é de que a proteína de OB funciona como molécula sinalizadora endócrina que é secretada por adipócitos e age, direta ou indiretamente, sobre o hipotálamo. Efeitos diretos sobre o hipotálamo requeririam que existissem mecanismos para perimitir a passagem do produto de gene de OB através da barreira de cérebro ao sangue. Mecanismos envolvendo o órgão circunventricular e/ou transportadores específicos o acesso ao cérebro de uma molécula do tamanho daquela codificada pelo gene de OB [Johnson e outros., FASEB J., 7: 678 - 686 (1983); Baura e outros., J. Clin. Invest. , 92: 1824 - 1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7: 314 -330 (1986)]. No entanto, a hipótese precisa ser considerada com cuidado até que tenha sido identificado o meio pelo qual a proteína possa cruzar a barreira de cérebro ao sangue. Além do mais, possíveis efeitos sobre os outros órgãos alvos precisarão ser avaliados.

Os sinais (sinal) de célula de gordura que sao responsáveis pela variaçao quantitativa no nível de expressão do gene de OB nao sao ainda conhecidos mas se correlacionam com diferenças no tamanho de célula de adipócito. Adipócitos a partir de murinos de db/db sao 202 ΡΕ0777732 cinco vezes tão grandes quanto aqueles a partir de murinos normais, com um tamanho de célula de cerca de 1,0 μρ de lipidio/célula (Johnson e outros, 1972, supra). Evidência anterior indicou que o teor e/ou o tamanho de célula de gordura é um importante parâmetro na determinação de peso de corpo [Faust e outros, Am. J. Physiol., 235: 279 - 286 (1978); Faust e outros., Science, 197: 393 - 396 (1977)].

Poderia ser que cada célula de gordura expresse um baixo nível de RNA de OB que ulteriormente aumenta em proporção com o tamanho de célula. É também possível que o tamanho de célula não seja o parâmtero sentido mas sim meramente se correlacione com o sinal intracelular que aumenta a expressão do gene de OB em adipócitos de murinos de db/db e lesados em VMH. Em qualquer caso, os componentes do caminho de transdução de sinal que regula a síntese de RNA de OB são prováveis de ser importantes na determinação de peso de corpo. Influências genéticas e ambientais que reduzem o nível de expressão de OB agiriam para aumentar o peso de corpo, como o fariam influências que diminuíssem a sensibilidade à proteína codificada. As moléculas específicas que regulam o nível de expressa do gene de OB são até agora desconhecidas, e esperam uma determinação do(s) nível (níveis) de controle de gene que leva à variação quantitativa no nível de RNA de OB, e um exame dos elementos reguladores do gene de OB. A identificação das moléculas que regulam a expressão do gene de OB em adipócitos, e daquelas que mediam os efeitos da proteína codificada em seu(s) sítio(s) de ação, aumentarão grandemente o nosso entendimento dos mecanismos fisiológicos que regulam o peso de corpo. 203 ΡΕ0777732

Exemplo 10: Padrão de Expressão de RNA e Mapeamento sobre os Mapas Físicos, Citogenéticos e Genéticos do Cromossoma 7 RNA de OB é expresso em altos níveis em tecido adiposo ser humano, e em níveis substancialmente inferiores em placenta e coração. 0 gene de OB ser humano mapeia para um grande "contig" de cromossoma artificial de levedura (YAC) derivado de cromossoma 7q31.3. Além de confirmar a localização relativa do gene com base no mapeamento comparativo de murino - ser humano, este estudo identificou 8 marcadores microssatélites estabelecidos em intima proximidade física com o gene de OB ser humano. Uma vez que mutações em OB de murino podem resultar em uma síndrome que se assemelha intimamente com a obesidade mórbida em seres humanos, esses marcadores genéticos representam importantes ferramentas para o estudo do possível papel do gene de OB em formas herdadas de obesidade humana.

Materiais e Métodos

Análise de Northern blot RNA total foi preparado a partir de tecido adiposo usando o método de Chirgwin e outros., Biochem., 18: 5294 - 5299 (1979). Northern blots, radiorrotulação, e hibridizações foram realizadas como descrito (Zhang e outros., 1994, supra). Northern blots de RNA de polyA+ (MTN ser humano, MTN ser humano II, e MTN fetal ser humano II) 204 ΡΕ0777732 foram obtidos a partir de CLONETECH (Paio Alto, CA), como o foram iniciadores de PCR usados para gerar a sonda de actina humana radiorrotulação.

Desenvolvimento de STS

Ensaios de PCR específicos de sítio etiquetado por sequência (STS) foram desenvolvidos e otimizados essencialmente como descrito [(Green e outros., PCR Methods Applic., 1991; Green e outros., Genomics , 11: 548 - 564 (1991); Green, "Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites", em Methods in Molecular Genetics Vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A), págs. 192 - 210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green e outros., Hum. Mol. Genet., 3: 489 - 501 (1994)]. Cada STS é nomeado usando o prefixo 'sWSS' seguido por um único número. Detalhado acerca dos 19 STSs reportados aqui são providos na Tabela 3, com informação adicional (por exemplo, condições de reação de PCR, sequência de DNA completa) disponíveis em GenBank e/ou Genome Data Base (GDB). Para os STSs específicos de microssatélite, os iniciadores de oligonucleotídeos usados nos ensaios de PCR (Tabela 3) correspondiam ou àqueles empregados para análise de genótipo (Tabela 4) ou àqueles projetados (a maior parte frequentemente com o programa de computador OSP) [Hillier e outros, PCR Methods Applic., 1: 124 - 128 (1991)] usando a sequência de DNA disponível em GenBank. A tabela 3 ilustra STSs no "contig" de YAC contendo o gene de OB ser humano. - 205 - ΡΕ0777732

Tabela 3

Nome de Psudônimo Local Fonte Iniciadores de PCR Tama- SEQ ID GDB ID N°: SIS nho tF: (pb) SWSS1734 D7S2185 Extremi CAAGACAAAT GAGATAAGG 72 39 G00-455-235 dade YAC AGAGTTACAGCTTTACAG 40 SWSS494 D7S2016 Clone CTAAACACCIIIICCAIICC 112 41 G00-334-404 lambda TTATATTCACTTTTCCCCTCTC 42 sWSS883 UT528 D7S1498 Marcador TGCAGTAAGCTGTGATTGAG 490 43 G00-455-262 genético GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 44 SWSS2359 AFMa065zg9 D7S1873 Marcador AGTGTTGTGTTTCTCCTG 142 45 G00-455-247 genético AAAGGGGATGTGATAAGTG 46 5WSS2336 AFMal25whl D7S1874 Marcador GGTGTTACGTTTAGTTAC 112 47 G00-455-244 genético GGAATAATGAGAGAAGATTG 48 SWSS1218 AFM309y£l D7S680 Marcador GCTCAACTGACAGAAAAC 154 49 G00-307-733 genético GACTATGTAAAAGAAATGCC 50 5WSS1402 D7S1916 Extremi- AAAGGGCTTCTAATCTAC 137 51 G00-344-044

dade YAC

CCTTCCAACTTCTTTGAC 52 ΡΕ0777732 - 206 - (continuação)

Nome de Psudônimo Local Fonte Iniciadores de PCR Tama- SEQ ID GDB ID N°: SIS nho N°: (pb) SWSS999 D7S1674 Inserção TAAACCCCCIIICIGIIC 105 53 G00-334-839 de YAC IIGCATAATAGTCACACCC 54 5WSS1751 D7S2186 Extremi C CAAAAT CAGAAITGTCAGAAG oo 55 G00-455-238 dade YAC AAACCGAAGIICAGAIACAG 56 SWSSH74 AFM2l8xf10 D7S514 Marcador AAT ATC T GAC AT TGGC AC 144 57 G00-307-700 genético TTAGACCIGAGAAAAGAG 58 5WSS2061 D7S2184 Extremi GIIGCACAATACAAAATCC 200 59 G00-455-241 dade YAC CTTCCAIIAGIGICIIAIAG 60 SWSS2588 D7S2187 Extremi ATCACIACACACCIAAIC m 61 G00-455-253 dade YAC CCATTCIACAIIICCACC 62 SWSS808 Pax-4 PAX4 Gene GGCTGTGIGAGCAAGAICCIAGGA 153 63 G00-455-259

917 U

TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC 64 ΡΕ0777732 - 207 - (continuação)

Nome de Psudônimo Local Fonte Iniciadores de PCR Tama- SEQ ID GDB ID N°: SIS nho N°: (pb) SWSS1392 AFM206xcl D7S635 Marcador CTCAGGTATGTCTTTATC 75 65 G00-307-815 genético TGTCTCIGCAIICIIIIC 66 5WSS1148 AFM199xhl2 D7S504 Marcador GACACATACAAACACAAG 60 67 G00-307-652 genético ATTGAGTTGAGTGTAGTAG 68 SWSS1529 D7S1943 Extremi CAGGGATTTCTAATTGTC 116 69 G00-334-119 dade YAC AAAAGATGGAGGCTTTTG 70 5WSS2619 OB OB Gene CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG 106 71 G00-455-256 TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA 72 SWSS404 D7S1956 Clone de ACCAGGGTCAATACAAAG 122 73 G00-334-251 lambda TAATGTGTCCTTCTTGCC 74 5WSS2367 AFMa345wc9 D7S1875 Marcador CAATCCTGGCTTCATTTG 81 75 G00-455-250 genético AAGGTGGGTAGGATGCTA 76 208 ΡΕ0777732

Os 19 STSs específicos de cromossoma 7 mapeados para o "contig" de YAC contendo o gene de OB ser humano (figura 35) são listados. Em cada caso, o nome de "sWSS" designado, pseudónimo relevante, nome de local determinado por GBD, fonte de STS, sequências de iniciadores de PCR, tamanho de STS, e número de identificação de GDB são indicados. As fontes de STSs são como se segue: "Extremidade de YAC" (extremidade de inserto isolado de um YAC) (Green, 1993, supra), "Clone lambda" (clone lambda de especifico cromossoma 7 aleatório) (Green e outros, 1991 supra; Green, 1993, supra), "Marcador genético) (marcador de microssatélite, ver tabela 2) (Green e outros, 1994, supra), "Inserto de YAC" (segmento aleatório de inserto de YAC), e "Gene" (STS de especificogene ). Observe-se, que para alguns STSs específicos de marcador genético, os iniciadores de PCR usados para a identificação de YACs (listados nesta tabela) são diferentes daqueles usados para realizar análise de genótipo (tabela 4) , uma vez que a deteção de YACs contendo um marcador genético não necessita de ampliação do próprio trato polimórfico. Todos os ensaio de PCR indicados utilizaram uma temperatura de anelamento de 55°C, exceto para sWSS1174, sWSS883, sWSS1529, e sWSS2619 (que usaram 50°C), sWSS999 e sWSS1174 (que usado a 60°C), e sWSS808 (que usado a 65°C). Detalhes adicionais referentes aos esaios de PCR de STS específicos estão disponíveis em GDB. 209 ΡΕ0777732

Tabela 4

Marcadores de microssatélites no "contig" de YAC contendo o gene de OB ser humano • Nome de Tipo Local Iniciadores SEQ ID N°: GDB ID N° marcador UT528 Tetra. D7S1498 TGCAGTAAGCTGTGATTGAG 77 G00-312-446 GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 78 AFMa065zg9 (CA) n D7S1873 AGCTTCAAGACTTTNAGCCT 79 G00-437-153 GGTCAGCAGCACTGTGATT 80 AFMal25whl (CA) n D7S1874 TCACCTTGAGATTCCATCC 81 G00-437-263 AACACCGTGGTCTTATCAAA 82 AFM309yf10 (CA) n D7S680 CATCCAAGTTGGCAGTTTTT 83 G00-200-283 AGATGCTGAATTCCCAGACA 84 AFM218xf10 (CA) n D7S514 TGGGCAACACAGCAAA 85 G00-188-404 TGCAGTTAGTGCCAATGTCA 86 AFM206xcl (CA) n D7S635 CCAGGCCATGTGGAAC 87 G00-199-240 AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT 88 AFM199xhl2 (CA) n D7S504 TCTGATTGCTGGCTGC 89 G00-188-280 GCGCGTGTGTATGTGAG 90 AFMa345wc9 (CA)n D7S1875 agctcttggcaaactcacat 91 G00-437-259 gcctaagggaatgagacaca 92

Oito marcadores de microssatélites mapeados ao "contig" de YAc contendo o gene de OB ser humano (figura 35) são listados. Em cada caso, o nome de marcador (indicado como o pseudónimo na tabela 3), tipo de pedaço de microssatélite (tetranucleotídeo-'Tetra' repetição ou (CA)n repetição), nome de local atribuído a GDB, sequências de iniciadores utilizadas para análise de genótipo com base em PCR, e número de identificação de GDB são indicados. 210 ΡΕ0777732

Detalhes adicionais referentes a ensaios de PCR e os polimorfismos estão disponíveis em GDB. 0 STS específico de OB ser humano (sWSS2619) foi projetado usando-se a sequência de DNA obtida a partir da região 3' não-traduzida do cDNA. O STS específico de Pax4 de ser humano (sWSS808) foi desenvolvido usando-se a seguinte estratégia. Iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de Pax4 de murino (GGCTGTGTGAGCAAGATC-CTAGGA) (SEQ ID N°:63) e (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG (SEQ ID N°:93) [Walther e outros, Genomics 11:424 - 434) (1991)] foram usados para ampliar um fragmento de 204 bp de DNA genômico ser humano (que era o mesmo produto de tamanho que aquele gerado de DNA genômico de murino) . Este ensaio de PCR não era adequado para identificar YACs correspondentes, uma vez que um produto de similaridade de tamanho (200 bp) foi também amplificado a partir de DNA de levedura. No entanto, análise de sequência de DNA do produto de PCR gerado de DNA ser humano revelou substituições em 20 posições entre as 156 bases analisadas (dados não-mostrados). Usando-se esta sequência humana não específica, um novo iniciador (TTGCCAGGCAAAGAGGGGTGGAC) (SEQ ID N°:64) foi projetado e usado como o primeiro dos iniciadores de pax4 especifico acima (ver tabela 3) . 0 ensaio de PCR de

Pax4 específico ser humano não ampliou um produto significativo de DNA de levedura e foi assim usado para identificar YACs correspondentes. 211 ΡΕ0777732

Identificação de YACs por separaçao com base em PCR A maior parte de YACs mostrados na figura 35 foram derivados de uma coleção de clones altamente enriquecidos para DNA de cromossoma 7 ser humano (recurso de YAC de cromossoma 7) (Green e outros, 1995, supra) usando-se estratégia de separação com base em PCR [Green e outros, 1995, supra; Greena e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:1213 - 1217 (1990)]. Em poucos casos, clones foram isolados por separação com base em PCR (Greena e outros, 1990, supra) de bibliotecas de YAC genômicos ser humano totais disponíveis contruidos em CEPH [Dausset e outros, Behring Inst. Mitt., 91:13 - 20 (1992); Albertsen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:4256 - 4260 (1990)] ou ICI [Anand e outros, Nucl. Acids. Res., 17:3425 - 3433 (1989) ; Anand e outros, Nucl. Acids Res. 18:1951 - 1956 (1990) ]. Cada YAC é chamado usando-se o prefixo "yWSS" seguido por um único número.

Resultados e Discussão

Exame da expressão de tecido do gene de OB por análise de Northern blot revelou que RNA de OB é expresso em um alto nível em tecido adiposo ser humano e níveis muito baixos na placenta e no coração (figura 34). O tamanho do RNA (cerca de 4,5 kb) era equivalente em ser humano e em murino bem como em cada um dos tecidos de expressão. Nestes estudos, sinais cinco vezes maiores foram vistos em 10 μρ de RNA de tecido adiposo total, como em 2 212 ΡΕ0777732 μg de RNA placental de poliA+. Um sinal cinco vezes menor foi visto em RNA de poliA+ de coração em comparação com a placenta. É estimado que o nível de RNA de OB é cerca de 250 vezes menor na placenta do que no tecido adiposo. Nesta experiência, RNA de OB não foi detectado em quaisquer dos tecidos analisados, incluindo cérebro, pulmão, fígado, músculo esquelético, rim, e pâncreas. Experiências adicionais não revelaram RNA de OB no baço, timo, próstata, testículo, ovário, intestino delgado, cólon, leucócitos de sangue periférico ou no cérebro fetal, fígado ou rins (dados não-mostrados. É possível que OB seja expresso em um nível não-detectável (por análise de Northern blot) nestes últimos tecidos ou em outros tecidos que não foram estudados. O padrão observado de expressão em ser humano difere um tanto de murino, em que RNA de OB é detectado quase exclusivamente em tecido adiposo.

Mapeamento comparativo da região de gene de OB nos genomomas ser humano e de murino. O gene de OB de camundongo é localizado no cromossoma 6 proximal em uma região homóloga com uma porção de cromossoma 7q ser humano. Genes dentro deste segmento incluem (de proximal para distai): protooncogene de Met, regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (Cftr), gene 4 contendo caixa emparelhada (Pax4), de OB, e de carboxipeptidase A (Cpa) (Zhang e outros, 1994, supra, Friedman e outros, 1991, supra). No murino, mapeamento genético foi usado para demonstrar que Pax4 é 213 ΡΕ0777732 fortemente ligado a OB [Walther e outros, 1991, supra, Zhang e outros, 1994, supra]. A distância fisica entre OB e Pax4 demonstrou ser cerca de um par de megabase (Mb) (Zhang e outros, 1994, supra). Com base nestes estudos de mapeamento comparativos, era esperado que o gene de OB ser humano residiria entre Pax4 e CPA no cromossoma 7q. Além do mais, uma vez que CFTR ser humano [Heng e outros, Cell Genet., 62:108 - 109 (1993)] e Pax4 [Tamura e outros,

Cytogenet. Cell Genet., 66:132 - 134 (1994)] foram mapeados por fluorescência de hibridização in situ (FISH) para 7q31,3 e 7q32, respectivamente, a posição citogênica mais provável do gene de OB ser humano seria na proximidade do limite de 7q31.3-q32.

Mapeamento de gene de OB no cromossoma ser humano 7

Um STS (sWSS2619) ampliando um pequeno segmento da região 3 ' não-traduzido do gene de OB ser humano foi usado para separar uma coleção de clones de YAC que é altamente enriquecida para DNA de cromossoma ser humano 7 (Green e outros, 1995a, Genomics 25:170 - 183), e 9 YACs foram identificados (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 E yWSS5004). Para verificar que estes YACs contêm o gene de OB ser humano autêntico, duas experiências foram realizadas. Primeiro, cada um dos YACs foi testado com um segundo ensaio de PCR de OB especifico ser humano, e todos demostraram ser positivos (dados não-mostrados). Segundo, o DNA de levdura de cada clone foi digerido com EcoRI e foi analisado por 214 ΡΕ0777732 hibridização de transferência de gel, usando-se uma sonda derivada de cDNA de OB. Em todos os exemplos, uma tira de hibridização única foi vista; e esta tira era do mesmo tamanho nos YACs e um clone de PI conhecido conter o gene de OB ser humano (dados não-mostrados).

Usando-se um programa de computador SEGMAP (Green and Green, 1991, supra e outros dados de teor de STS com base em YAC que foi gerado para o cromossoma 7 (Green e outros, 1991, supra; Green e outros 1994, supra; Green e outros, 1995, supra) , o gene de OB ser humano foi encontrado por residir dentro do "contig" de YAC mostrado na figura 35. Especificamente, este "contig" consiste em 43 YACs em sobreposição e 19 STSs igualmente ordenados. Detalhes sobre cada um dos 19 STSs são providos na tabela 3. Além do STS de OB especifico, o "contig" também contém um STS (sWSS808) especifico para o gene de Pax4 (Tamura e outros, 1994, supra, Stapleton e outros, 1993, Nature Genet. 3:292 - 298), 7 STSs derivado de YACs de cromossoma 7 especifico, 2 STSs derivado de clones lambda de cromossoma 7 especifico, e, importantemente, 8 STSs de microssa-tétilite especifico. Detalhes adicionais sobre estes 8 marcadores genéticos, incluindo as sequências de iniciadores usados para análise de genótipo são providos na tabela 2. Notavelmente, há conectividade com base em YAC redundante através de todo o "contig" (isto é, há 2 ou mais YACs ligando cada par adjacente de STSs), dando forte suporte para a ordem relativa de STSs mostrado na figura 35. 215 ΡΕ0777732

Como mostrado na figura 35, a orientação prevista do "contig" de YAC contendo OB ser humano é tal que sWSS1734 é o STS mais centromérico (isto é, mais próximo a CFTR) enquanto que sWSS2367 é o STS mais telomérico (isto é, mais próximo a CPA ). Esta orientação é predominantemente baseados dados de mapeamento comparativo, que coloca Pax4 proximal e OB distai dentro do bloco sintético presente em DNA de murino e ser humano (Zhang e outros, 1994, supra) . 0 gene de OB mapeia perto da extremidade telomérica do "contig", na colocação do STS de específico OB (sWSS2619) .

Enquanto o "contig" mostrado na figura 35 foi deduzido por SEGMAP sem consideração de tamanhos de YAC (desse modo exibindo STSs equidistante uns dos outros), uma análise similar dos dados para SEGMAP que representaram tamanhos de YAC indicaram que o tamanho total da região coberta pelo "contig" é quase cerca de 2 Mb (dados não-mostrados). Assim, enquanto todos os 8 STSs específicos de microssatélite (Tabela 4) são contidos dentro de um intervalo genômico alcançando grosseiramente 2 Mb, o 3 mais próximo à extremidade telomérica do "contig" (sWSS1392, sWSS1148, e sWSS2367) são particularmente perto do próprio gene de OB (talvez dentro de um intervalo tão pequeno quanto cerca de 500 kb) . De fato, todos os 3 dos últimos STSs estão presentes em pelo menos 1 do YACs contendo OB ser humano. Notavelmente, o intervalo entre Pax4 (sWSS808) e OB (sWSS2619) ser humano é estimado ser cerca de 400 kb, enquanto que esta região foi prevista para alcançar cerca 216 ΡΕ0777732 de 1 Mb em murino (Zhang e outros, 1994, supra). Finalmente, 3 dos YACs dentro do "contig" (yWSS691, yWSS999, e yWSS2935) foi também analisado por FISH, e cada um foi encontrado para hibridizar exclusivamente para 7q31,3. Um destes YACs (yWSS691) contém o STS específico de OB, enquanto os outros 2 clones contêm o STS específico de Pax4 .

Os últimos resultados são em geral consistentes com a designação citogenética anterior de Pax4 ser humano para 7q32 (Tamura e outros, 1994, supra) . Com base nos dados, o gene de OB ser humano pode ser atribuído à tira citogenética 7q31.3.

Exemplo 11: Polipeptídeo de OB Ser humano é Biologica- mente Ativo em Murinos

Grupos de 10 murinos de OB/OB foram tratados por injeção i.p. com 10 \iq/q/d±a. de polipeptídeo de OB de murino e ser humano (bacteriano) recombinante ou salmoura. Depois de 4 dias, o grupo recebendo salmoura ganhou 0,3 g. O grupo recebendo OB de murino perdeu 3,2 g. O grupo recebendo OB ser humano perdeu 2 g (p < 0,01 em comparação com os controles de salmoura). Estes grupos foram também testados quanto à ingestão de alimento. Os dados para ingestão de alimento são mostrados na tabela 5; os dados para massa de corpo são mostrados na tabela 6. 217 ΡΕ0777732

Tabela 5

Ingestão de alimento/dia (g) de murinos de OB/OB tratados(valor +/- desvio padrão)

Tratamento Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 Salmoura 13,4 12,8 12,8 13,1 14, 0 12,3 12, 4 8,3 ±2,6 OB de murino 14,9 3,7 4,4 5,1 8,9 8,1 8,7 3,5 OB de ser 14,3 10,3 8,7 7,0 8,9 5,3 3,8 13,0 humano

Tabela 6

Peso de corpo e mudança de peso nos murinos de OB/OB tratados (valor +/- desvio padrão)

Tratamento Peso de Peso de Mudança em Peso de Mudança em corpo corpo percentagem corpo percentagem (dia 0) (dia 4) (dia 0 a 4) (dia 6) (dia 0 a 6) Salmoura 39,9± 40,7± 0,8±0,5 41, 1± 1,2±1,1 1,8 1,6 2, 2 OB de murino 39,5± 36,2± -3,3±1,2 36,3± -3,1±1,2 2,1 2, 0 2, 2 OB de ser 39,5± 37,6± -2,0±1,0 36,1± -3,5±1,3 humano 2, 0 1,7 1,3 218 ΡΕ0777732

Estes dados demonstram que OB ser humano é biologicamente ativo em murinos.

Exemplo 12: Uma Alta Dose de OB Afeta Murinos de Tipo

Selvagem

Murinos de tipo selvagem (C57B16J +/?) foram tratados com 10 μg/g/dia i.p. de OB de murinos recombinantes, e massa de corpo foi medida todos os quatro dias. Os resultados são mostrados na tabela 7.

Tabela 7

Massa de Corpo (g) de murinos normais recebendo OB

Tratamento Dia 0 Dia 4 Dia 8 Dia 12 Dia 16 Salmoura 22,6±1,4 22,2±1,2 22,5±1,3 23 22,5 OB de murino 22,4±1,5 20,6+1,5 20,8±1,3 20,8 21,8

Estes dados demonstram que OB afeta a massa de corpo de tipo selvagem bem como murinos obesos (OB/OB), embora para um grau muito menor.

Exemplo 13: Polipeptídeo de OB Administrado por Infusão de Bomba Continua

Este exemplo demonstra que infusão continua de polipeptídeo de OB resulta em perda de peso em murinos normais. Murinos normais (não obesos) foram administrados 219 ΡΕ0777732 polipeptídeo de OB de murinos via infusão de bomba osmótica. Uma dosagem de 0,5 mg de proteina/kg de peso de corpo/dia resultou em uma perda de 4,62% (+/- 1,34%) de peso de linha de base pelo sexto dia de infusão.

Materiais e Métodos

Animais

Murinos de C57B16 ( + / + ) de tipo selvagem foram usados neste exemplo. Murinos foram alojados sozinhos, e foram mantidos sob condições humanas. A idade dos murinos no ponto de tempo inicial era de 8 semanas, e os animais tinham peso estabilizados. Dez murinos foram usados para cada grupo (veiculo versus proteína).

Alimentação e Medição de Peso A murinos foi dada comida moida para roedores (PMI Feeds, Inc. ) em alimentadores de alimento em pó (Allentown Caging and Equipament), que permitiam uma medição mais correta e sensível de ingestão de alimento do que o uso de comida regular de blocos. Peso foi medido na mesma hora a cada dia (2:00 da tarde), por um período de 6 dias. Peso de corpo no dia anterior da infusão foi definido como peso de linha de base.

Clonagem de DNA de OB de murinos A clonagem de DNA de OB de murinos para expressão 220 ΡΕ0777732 de E. coli foi realizada como se segue. A sequência de DNA como deduzida a partir da sequência de peptídeos que apareceu em (Zhang e outros, 1994, supra, isto é, exemplo 1, surpra) foi traduzida de modo reverso usando códons ótimos de E. coli. Os sítios de clonagem terminais eram Xbal a BamHI. Um aumentador de ligação ribossomal e um sítio de ligação ribossomal forte foram incluídos em frente da região de codificação. A sequência de DNA dúplex foi sintetizada usando-se técnicas padrão. Clones corretos foram confirmados por demonstração de expressão da proteína recombinante da presença da sequência de DNA de OB correta no plasmídeo residente. A sequência de aminoácidos (e sequência de DNA) é como se segue: DNA de OB de met de murino recombinante e sequência de aminoácidos (SEQ ID N°S:94 e 95):

T CTAGATTTGAGITrTAACTrrTAGAAGCAGGAATAACATATGGTXCCGATCCftGAAAGT 9 - + .....- +.......-- +---------+.........+--------- + ..... 68

AGATCTAAACTCAAAATrGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTACjGTCTTTCA Μ V P I Q K V - tcaggacgacaccaaaaccttaattaaaacgatcgttacgcgtatcaacgacatcagtca 69 -♦·.*------ +---------+---------+ ·-----...+....-----+---..... 128

AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAArrnCCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT QDDTKTLIKTIVTRINDISH-

CACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTGTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA

GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT T Q S VSAKQRVTGLDFI PGLK-

C C CGATC CTAAGCTTGT C CAAAATGGACCAGAC C CTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC

GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCAGAATTG PILSLS KMDQTLAVYQQVLT -

CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATGGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT 249 - +.........+-------- -+-----..-. +---------+ -.-------+ --------

GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA 308 221 ΡΕ0777732 SLP sqnvlqiandleulrdl.

GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA 309 · +.........+.........«.........+.........+........· +........ 368

CGACGTGGACGAC CGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGAC GG CGTCTGGAGTC CAGAAGTCTT LHLLAFSKSCSLPQTSGLQK-

ACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT 369 - +----------------+.........+------··· + ·--------+--------428

TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATCrrCGTGGCTTCAACAACGAGA pesldgvleaslystevval-

GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTITCTCCGGAATG 429 - + ---------+.........+ -·-------+---------+.........+--------488

CAGGGCAGACGTCCOVAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCrTAC SRLQGSLQDILQQLDVSPEC-

TTAATGGATCC 489 -+.........

AATTACCTAGG

Vetor de Expressão e Cepa de Hospedeiro 0 vetor de expressão de plasmídeo usado para produzir a proteína foi pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC) número de acesso 69576. 0 DNA acima foi ligado no vetor de expressão pCFM1656, que foi linearizado com Xbal e BamHI, e foi transformado na cepa de hospedeiro de E. coli, Fm5, células de FM5 de E. coli foram derivadas em Amgen Inc. , Thousand Oaks, CA de cepas de K-12 de E. coli [Bachmann e outros, Bacteriol, Rev. 40:116 - 167 (1976)] e contêm o gene repressor de fago de lambda integrado, cl857 [Sussman e outros, C.R. Acad. Sei., 254:1517 - 1579 (1962)]. Produção de vetor, transformação de célula, e seleção de colónia foram realizadas por métodos padrão, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, supra. Células de hospedeiro foram desenvolvidas em meio de LB. 222 ΡΕ0777732

Administração de Proteína ou Veículo

Polipeptídeo de OB de murino recombinante foi usado para as presentes experiências, em geral em uma concentração de 0,9 mg/ml de salmoura tamponada por fosfato, pH 7,4. A sequência de aminoácidos (e sequência de DNA ) usada é indicada imediatamente acima. Proteína e veículo (salmoura tamponada por fosfato, pH 7,4) foram administrados por infusão de bomba osmótica. Minibombas osmóticas de Alzet (Alza, Paio Alto, CA, modelo n° 1007D) foram cirurgicamente colocadas em cada murino em uma bolsa subcutânea na área subescapular. As bombas foram calibradas para administrar 0,5 ml de proteína em solução por hora para um dosagem de 0,5 mg de proteína/kg de peso de corpo/dia. Animais de controle foram infundidos com salmoura tamponada por fosfato (pH 7,4) via uma minibomba osmótica de Alzet.

Processo de Fermentação. Um protocolo de fermentação de três fases conhecido com um processo de batelada alimentada foi usado para preparar a proteína. Composições médias são indicadas abaixo.

Batelada. Uma fonte de fosfato e de nitrogénio foi esterilizada (por aumento da temperatura para 122°C por 35 minutos, 1,26 - 1,4 kg/cm2 (18 - 20 psi)) no recipiente de fermentação (Biolafitte, capacidade de 12 litros). Depois de resfriamento, fontes de carbono, de magnésio, de vitaminas e de metal em traços foram adicionadas 223 ΡΕ0777732 assepticamente. Uma cultura de um dia para o outro (16 horas ou mais) das bactérias produzindo proteína de murino recombinante de 500 ml (desenvolvida em caldo de LB) foi adicionada ao fermentador.

Alimentação I. Depois de se atingir entre 4,0 -6,0 de O. D. 6oo, Alimentação I foi adicionada às culturas. A glicose foi adicionada em uma taxa de limitação a fim de se controlar a taxa de desenvolvimento (μ) . Um sistema automatizado (chamado de Sistema de Controle Distribuitivo) foi programado para se controlar a taxa de desenvolvimento em 0,15 gerações hr-1.

Alimentação II. Quando o O.D. atingiu 30, a temperatura foi lentamente aumentada para 42°C e a alimentação foi mudada para a Alimentação II, descrita abaixo. A fermentação foi então permitida continuar por 10 horas com amostragem a cada 2 horas. Depois de 10 horas, o conteúdo do fermentador foi resfriado para abaixo de 20°C e foi colhido por centrifugação.

Composição dos Meios 10 g/1 extrato de levedura 5,25 g/1 (NH4)2S04 3,5 g/1 k2hpo4 4,0 g/1 kh2po4 5,0 g/1 glicose 1,0 g/1 MgS04.7H20 ΡΕ0777732 2, 0 ml/1 2, Ο ml/1 1, Ο ml/1

Alimentação I: 50 g/1 50 g/1 450 g/1 8,75 g/1 10 ml/1 10 ml/1

Alimentação II: 200 g/1 100 g/1 110 g/1 - 224 -

Solução de vitamina Solução de Metal em Antiespuma P2000 Bacto-triptona Extrato de levedura Glicose MgS04.7H20

Solução de vitamina Solução de metal em Bacto-triptona Extrato de levedura Glicose

Traços traço

Solução de vitamina (Batelada, Alimentação I): 0,5 g de biotina, 0,4 g de ácido fólico, e 4,2 g de riboflavina, foi dissolvida em 450 ml de água e 3 ml de NaOH a 10 N, e foi levada para 500 ml com H20. Quatorze gramas de piridoxina-HCl e 61 gramas de niacina foram dissolvidos 150 ml de água e 50 ml de NaOH a 10 N, e foram levados para 250 ml com água. Quarenta gramas de ácido pantotênico foram dissolvidos em 200 ml com água, e foram levados para 250 ml. As três soluções foram combinadas e foram levadas para 10 litros de volume total.

Solução de Metal em Traços (Batelada, Alimentação I):

Cloreto férrico (FeCl3.6H20) : 27 g/1 Cloreto de Zinco (ZnCl2.4H20) : 2 g/1 Cloreto de cobalto (CoCl2.6H20) : 2 g/1 225 ΡΕ0777732

Molibdato de sódio (NaMo04.2H20) : 2 g/1 Cloreto de cálcio (CaCl2.2H20) : 1 g/1 Sulfato cúprico (CuSCh.5H20) : 1,9 g/1 Ácido bórico (H3BO3) : 0,5 g/1 Cloreto de manganês (MnCl2.4H20) : 1,6 g/1 Di-hidrato de citrato de sódio: 73,5 g/1

Processo de purificação para polipeptídeo de OB de murino

Purificação foi realizada pelas seguintes etapas (a não ser que de outra maneira observado, as seguintes etapas foram realizadas a 4°C) : 1. Pasta de célula. Pasta de célula de E. coli foi suspensa em volume de 5 vezes de 7 mM de EDTA, pH 7,0. As células no EDTA foram ulteriormente quebradas por duas passagens através de um microfluidizador. As células quebradas foram centrifugadas em 4,2 rpm por 1 hora em um centrífuga de Beckman JB-6 com um rotor de J5-4,2. 2. Lavagem de corpo de inclusão n° 1. O sobrenadante de acima p. 155 foi removido, e o pélete foi ressuspenso com volume de 5 vezes de EDTA a 7 mM, pH 7,0, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1. 3. Lavagem de corpo de inclusão n° 2. 0 sobrenadante de cima foi removido, e o pélete foi ressuspenso em volume de 10 vezes de Tris a 20 mM, pH 8,5, DTT a 10 mM, e desoxicolato a 1%, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1. 226 ΡΕ0777732 4. Lavagem de corpo de inclusão n° 3. 0 sobrenadante de cima foi removido, e o pélete foi ressuspenso em volume de 10 vezes de água destilada, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1. 5. Redobramento. O pélete foi redobrado com 15 volumes de HEPES a 10 mM, pH 8,5, sarcosina de sódio a 1% (N-lauril sarcosina), à temperatura ambiente. Depois de 60 minutos, a solução foi produzida para ser sulfato de cobre a 60 mM, e então foi agitada de um dia para o outro. 6. Remoção de sarcosina. A mistura de redobramento foi diluída com 5 volumes de tampão de Tris a 10 mM, pH 7,5, e foi centrifugada como na etapa 1. O sobrenadante foi coletado, e foi misturado com agitação por uma hora com resina Dowex 1-X4, 20 - 50 mesh, forma de cloreto (em volume total de 0,066% de mistura de redobramento diluída). Esta mistura foi despejada em uma coluna e o eluente foi coletado. Remoção de sarcosina foi determinada por HPLC. 7. Preparação de ácido. O eluente da etapa anterior foi coletado, e o pH foi ajustado para 5,5, e foi incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1. 8. Cromatograf ia de troca de íons. O pH do sobrenadante da etapa anterior foi ajustado para 4,2, e foi carregado sobre Fluxo Rápido de sefarose CM ("CM Sepharose Fast Flow"). Vinte volumes de coluna de gradiente de sal foram usados em NaOAc a 20 mM, pH 4,2, NaCl a 0 M até 1,0 M. 9. Cromatograf ia de HIC. A combinação de CM sefarose de frações de pico (determinada a partir de análise de 227 ΡΕ0777732 ultravioleta) da etapa acima foi ajustada a ser sulfato de amónio a 0,2 M. Um gradiente de sal reverso de 20 volumes de coluna foi feito em NaOAc a 5 mM, pH 4,2, com sulfato de amónio a 0,4 M a 0 M. Este material foi concentrado e foi diafiltrado em PBS.

Resultados

Apresentados abaixo são as diferenças em por cento (%) do peso de linha de base em murinos C57B16J (8 semanas de idade)

Tabela 8

Perda de Peso na Infusão Contínua

Tempo (dias) Veículo (PBS) Polipeptídeo de OB recombinante dias 1-2 3,24 +/- 1,13 1,68 +/- 1,4 dias 3-4 4,3 +/- 0,97 -2,12 +/- 0,79 dias 5-6 4,64 +/- 0,96 -4,62 +/- 1,3

Como pode ser visto, no final de um regime de infusão continua de 6 dias, animais recebendo o polipeptídeo de OB perderam acima de 4% de seu peso de corpo, quando comparado com a linha de base. Isto é uma perda de peso substancialmente mais rápida do que foi observado com injeção intraperitoneal (i.p.). Perda de peso 228 ΡΕ0777732 de apenas 2,6 - 3,0% foi vista no final de um período de injeção de 32 dias, em murinos de tipo selvagem (normais), com injeções de i.p. diárias de polipeptídeo de OB de murino recombinante em uma dose de 10 mg/kg, e não tinham mais do que 4% em qualquer tempo durante a escala de dosagem (dados não-mostrados). Os dados presentes indicam que com infusão contínua, uma dosagem 20 vezes menor (0,5 mg/kg versus 10 mg/kg) consegue mais perda de peso em um período mais curto.

Os resultados vistos aqui são estatisticamente significativos, por exemplo, -4,62% com p < 0,0001.

Exemplo 14: Clonagem e Expressão de um Análogo de

Polipeptídeo de OB ser humano Recombinante

Este exemplo provê composições e métodos para a preparação de um análogo de versão recombinante ser humana do polipeptídeo de OB. A versão humana de DNA de OB foi construído do DNA de murinos, como no exemplo 13, acima, por substituição da região entre os sítios de MluI e BamHI com DNA dúplex (produzido de oligonucleotídeos sintéticos) em que 20 substituições de códon tinham sido projetadas. Códons para arginina em posição madura de murino 35 e leucina em posição madura de murino 74, foram inalterados. 0 sítio de MluI é mostrado sob a linha sólida na sequência abaixo. 229 ΡΕ0777732

Este DNA foi posto dentro do vetor pCFM 1656 (ATCC n° de acesso 69576), na mesma forma que a proteína de murino recombinante, como descrito abaixo.

Sequência de DNA (filamento duplo) de OB de met ser humano recombinante e de aminoácidos(SEQ ID N°S: 96 e 97)

CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT 1 .........,--------- + -- -- -- -- — — + 6 0

GTATACCATGG CTAGGTCTTT CAAGTC CTG CTGTGGTTTTGGAATTAA J.TJ.TGCTAGCAA

MVPIQKVQDDTKTLIKTIV acgcgtatcaacgacatcagtcacacccagtcggtgaqctctaaacagcgtgttacaggc 61 --------- + --------- + ----------h---------+----------I----------+ 120

TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG

TRINDI SHTQSVSSKQRVTG

CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCOATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG

121 ------- —--------------+ IdO

GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTTTTACCrGGTCTGGGAC

LDFIPGLHPILTLSKMDQTL

GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC 181 -.......- +---------+.........+---------+---------+.........+ 240

CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG

AVYQQILTSMPSRNVLQISN

GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG 241 ---------+---------+.........+ --.......+---------+.........+ 300

CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC

DLENLRDLLHVLAFSKSCHL

CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT 301 ------- - —h----------+---------360

GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA

PWASGLETLDSLGGVLEASG

TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCnTGG 361 — - * - *---- — ----+ 420

ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC

YSTEVVALSRLQGSLQDMLW

CAGCTGGACCTGTCTCCGGGTTGTTAATGGATCC 421 .........+.........+.........+---- 454

GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG QLDLSFGC* 230 ΡΕ0777732

Fermentação A fermentação das células de hospedeiro acima para produzir polipeptídeo de OB ser humano foi realizada usando-se as condições e as composições como descritas acima para material de murino recombinante. Os resultados foram analisados para fornecer (gramas/litro), pré-purificação, do material de OB ser humano recombinante (e quantidades menores de proteína bacteriana) , e foram correlacionados para analisar expressão bacteriana:

Tabela 9

Análise de Expressão de Polipeptídeo de OB Ser humano

Ponto de tempo OD (@600 nm) Rendimento Expressão (g/i) (mg/OD-L) Ind. + 2 horas 47 1,91 41 Ind. + 4 horas 79 9,48 120 Ind. + 6 horas 95 13,01 137 Ind. + 8 horas 94 13,24 141 Ind. + 10 horas 98 14,65 149 abreviações:

Ind + - horas significa as horas depois da indução de expressão de proteína, como descrito no exemplo 13 para o material de murino recombinante usando-se pCFM 1656; O.D.: densidade ótica, como medida por espectrofotômetro, miligramas por unidade de O.D. por litro; 231 ΡΕ0777732 mg/O.D. . L: expressão em termos de mg de proteína por unidade de O.D. por litro.

Purificação do polipeptídeo de OB ser humano recombinante

Proteína humana recombinante pode ser purificda usando-se método similar àquele usado para purificação de proteína de murino recombinante, como no exemplo 13, acima.

Para a preparaçao de polipeptídeo de OB ser humano recombinante, a etapa 8 foi realizada por ajustamento do pH do sobrenadante a partir da etapa 7 para pH 5,0, e carregamento deste sobre a coluna de fluxo rápido de sefarose CM. 0 gradiente de sal de 20 volumes de coluna foi realizado em NaOAC a 20 mM, pH 5,5, em NaCl a 0 M a 0,5 M. A etapa 9 foi realizada por diluição da mistura de sefarose CM quatro vezes com água, e ajustamento do pH para 7,5. Esta mistura foi produzida para sulfato de amónio a 0,7 M. Um gradiente de sal reverso de 20 volumes de coluna foi feito em NaOAc a 5 mM, pH 5,5, sulfato de amónio a 0,2 M até 0 M. Em outras circunstâncias, as etapas acima eram idênticas.

Exemplo 15: Estudos de Resposta de Dose

Um estudo adicional demonstrou que houve uma resposta de dose para a administração contínua de proteína de OB. Neste estudo, murinos de tipo selvagem (não obeso, murinos de CD-I, pesando 35 - 40 g) foram administrados proteína de OB de murino recombinante usando-se métodos 232 ΡΕ0777732 similares aos exemplos 12 e 13. Os resultados foram como se segue (com perda de peso em por cento quando comparada com a linha de base, medida como acima):

Tabela 10

Resposta de Dose com Administração Continua

Dose Tempo % de redução em peso de corpo 0,03 mg/kg/dia dia 2 3,5% 1 mg/kg/dia dia 2 7,5% 1 mg/kg/dia dia 4 14%

Como pode ser visto, aumentando a dose de 0,03 mg/kg/dia para 1 mg/kg/dia aumentou a perda de peso de 3,5% a 7,5%. É também notável que no dia 14, a dosagem de 1 mg/kg/dia resultou em 14% de redução de peso de corpo.

Exemplo 16: Efeitos de Leptina sobre a Composição de

Corpo de Murinos de OB/OB

Murinos de 16 semanas de idade de C571/6J de OB/OB foram tratados com 5 μq/q/dia de leptina de murino, veiculo, ou não receberam nenhum tratamento por 33 dias. Em uma segunda experiência, murinos OB/OB de 7 semanas de idade foram tratados com 10 μg/g/dia de leptina humana, leptina de murino, ou veículo por 12 dias. Os murinos foram 233 ΡΕ0777732 sacrificados e peso de corpo, composição de corpo, níveis de insulina, e níveis de glicose totais foram avaliados. Os dados a partir destas experiências são relatados na tabela 11 .

Tabela 11

Peso de Corpo, Composição, Níveis de Insulina, e Níveis de Glicse de Murinos Tratados

Grupo de tratamento Murinos de 16 semanas de idade, 5 Murinos de 7 semanas de idade, 10 pg/g/dia de leptina |ag/g/dia de leptina Tratamento Leptina de Veículo Controle Leptina de Leptina de Veículo murino ser humano murino Peso de corpo total 31,90±2,8 64,10+4,5 67,50+6,2 31,00+1,3 33,40+2,4 42,70+1,5 Gordura Total (g) 9,10±1,7 38,30+4,0 40,87+6,1 28,40±3,4 59,70+2,1 60,34+3,7 Massa Total (g) 6,8011,0 7,60+0,4 7,73+0,5 magra % 21,3011,7 11,90+1,2 11,57+1,6 Água Total (g) 16,00+0,8 18,20+0,7 18,90+1,0 o, "o 50,30+4,2 28,40+1,0 28,10+2,2 Insulina (UlU/ml) <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 21,4 Glicose (mg/dl) 170,0+20,9 337+30,3 317,5+51,0 258,3+26,8 320, 0+44, 0 789,01152, 1

Os dados de composição de corpo de demonstraram o efeito de leptina sobre três compartimento do corpo: massa de gordura, e massa de água. Os dados indicam que leptina significativamente diminui massa de gordura de corpo e tem 234 ΡΕ0777732 um efeito marginal sobre a massa de corpo magra. No entanto, os efeitos sobre a massa de corpo magra não foram estatisticamente significativos.

Comparação dos niveis de glicose e de insulina em murinos de controle (não-tratados) e tratados com leptina indica que leptina reduz niveis de açúcar e insulina no sangue, e assim melhora estes indícios de diabete.

Exemplo 17: Efeitos de Altas doses de Leptina em Camundogos de Tipo Selvagem

Controles magros dos murinos de OB/OB (C57B1/6J + /?) foram injetados uma vez por dia i.p. com 10 [ig/g de leptina de murino ou veículo (PBS), e peso de corpo e ingestão de alimento foram medidos durante as próximas duas semanas. Houve uma diminuição significativa em peso de corpo a partir do dia 4 para a frente e uma diminuição significativa em ingestão de alimento para a primeira semana. No entanto, depois de uma semana, o níveis de ingestão de alimento tornaram-se indistinguíveis entre ambos os grupo de murinos. Os animais foram sacrificados no fim das duas semanas e a composição de corpo foi determinada. Os resultados da análise de composição de corpo são mostrados na tabela 12. Os dados mostram em gordura de corpo dos animais recebendo leptina versus os animais recebendo PBS. 235 ΡΕ0777732

Tabela 12

Composição e Peso de Corpo de Murinos de Tipo Selvagem ( + /?)

Grupo C57B1/6J Peso de corpo Gordura total o. Massa de corpo rragra o. Água total o. Proteína 1 17,3 0,30 1,71% 5,00 28,93% 12,00 69,36% 2 20,5 2,39 11,65% 5,41 26,40% 12,70 61,95% 3 16,9 0,34 1,99% 4,76 28,19% 11,80 69,82% 4 18,3 0,84 4,62% 5,16 28,17% 12,30 67,21% 5 17,7 0,44 2,51% 4,96 28,00% 12,30 69,49% 6 18,7 2,56 13,72% 4,84 25,86% 11,30 60,43% 7 15,7 0,37 2,38% 4,53 28,83% 10,80 68,79% 8 16,4 0,29 1,79% 4,51 27,48% 11,60 70,73% 9 16,5 0,83 5,05% 4,67 28,29% 11,00 66,67% 10 14,9 10,40 69,80% Desvio 17,3 0,93 5,04% 4,87 21,19% 11,62 67,43% padrão 1,6 0,90 4,52% 0,30 1,05% 0,74 3,52% médio Veículo 11 18,8 1,30 6,93% 5,00 26,58% 12,50 66,49% 12 17,6 2,17 12,34% 4,53 25,73% 10,90 61,93% 13 18,0 2,29 12,74% 4,61 25,59% 11,10 61,67% 14 19,6 3,79 19,34% 4,61 23,52% 11,20 57,14% 15 18,6 2,35 12,65% 4,75 25,52% 11,50 61,83% 16 17,3 1,96 11,32% 4,54 26,25% 10,80 62,43% 17 19,3 1,38 7,12% 5,02 26,04% 12,90 66,84% 18 20,6 4,16 20,19% 4,94 23,98% 11,50 55,83% 19 17,7 1,08 6,13% 4,72 26,64% 11,90 67,23% 20 19,5 12,30 63,08% Desvio 18,7 2,28 12,09% 4,75 25,54% 11,66 62,45% padrão 1,1 1,07 5,08% 0,20 1,10% 0,72 3,83% médio

Uma segunda experiência mostrou os efeitos de duas vezes ao dia de injeções i.p. de 12,5 μρ/g de leptina 236 ΡΕ0777732 de murino sobre murinos de C57B1/6J de tipo selvagem. Houve uma diminuição significativa em peso de corpo e ingestão de alimento associada com injeções duas vezes diariamente do polipeptideo. Para esta experiência, os animais foram colocados em câmaras metabólicas. 0 alimento consistiu de uma dieta de comida Purina n° 5001 em pó. Esta dieta diferenciou-se de experiências anteriores, que usaram a dieta consistindo em dieta de comida, tapioca e água. Assim o alimento usado nas câmaras metabólicas tinha um teor calórico mais alto, que explica porque a quantidade de alimento consumida difere daqueles animais sobre a dieta contendo água. A seguir tem-se uma lista de referências relacionadas com a revelação acima e particularmente aos procedimentos e discussões experimentais.

Bahary e outros, Genomics, 11:33 - 47 (1991).

Bahary e outros, Genomics, 13:761 - 769 (1992).

Bahary e outros, Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6 : Use of a f low - sorted Robertsonian chromosome (1991) .

Blank e outros, Mammalian Genome, 1: s51 - s78 (1991) .

Bogardus e outros, Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100 - 115 (1991). 237 ΡΕ0777732

Friedman e outros, Mammalian Genome, 1: 130 - 144 (1991). Harris, FASEB J., 4:3310 - 3318 (1990).

Jacobowitz e outros, N. Engl. J. Med., 315:96 - 100 (1986).

Kessey, in Obesity, págs. 144 - 166, Stunkard ed.,

Philadelphia, W.B. Sauders Co. (1980).

Kessey e outros, Ann. Rev. Psychol., 37:109 - 133.22 (1986) .

Leibel e outros, "Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity", in Genetic Variation and Nutrition, págs. 90 - 101.1,

Simopulos and Childs eds., S. Karger, Basel (1990).

Siegel e outros, Cytogenet. Cell Genet. , 61(3) : 184 - 185 (1992) . A invenção como reivindicada é habilitada de acordo com o relatório acima e referências e materiais de partida prontamente disponíveis. No entanto, as requerentes fizeram, em 9 de agosto de 1995, os seguintes depósitos com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, USA, de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para as Finalidades de Procedimento de Patentes: E. coli H14 abrigando plasmídeo pETH14, n° de acesso 69.880; e E. coli M9 abrigando plasmídeo pETM9, n° de acesso 69879. ΡΕ0777732 238

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAL:

(i) REQUERENTE: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MODULADORES DE PESO DE CORPO, CORRESPONDENTES ÁCIDOS NUCLEICOS E PROTEÍNAS, E USOS DIAGNÓSTICOS E TERAPÊUTICOS DOS MESMOS (iii) NÚMERO DE SEQÚÊNCIAS: 99 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIA: Klauber & Jackson (B) RUA: 411 Hackensack Avenue (C) CIDADE: Hackensack (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: USA (F) ZIP: 07601 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release n° 1.0, Versão n° 1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NUMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/483.211 (B) DATA DE DEPÓSITO: 7 de junho de 1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/438.431 (B) DATA DE DEPÓSITO: 10 de maio de 1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/347.563 (B) DATA DE DEPÓSITO: 30 de novembro de 1994 (C) CLASSIFICAÇAO: (vii)DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NUMERO DO PEDIDO: 08/292.345 (B) DATA DE DEPÓSITO: 17 de agosto de 1994 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii)INFORMAÇÕES SOBRE PROCURADOR/AGENTE: 239 ΡΕ0777732 (A) NOME: Jackson Esq., David A. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 26.742

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PASTA: 600-1-087 PCT (ix)INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 201 487-5800 (B) TELEFAX: 201 343-1684 (C) TELEX: 133521 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÚÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2793 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (A) DESCRIÇÃO: cDNA de OB de murino

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: De murino (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 57..560 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÚÊNCIA: SEQ ID N°:l: GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA 56 ATG TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG 104 Het Cys Trp Arg Pro Leu Cya Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 TCT TAT GTT CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA 152 Ser Tyr Vai Gin Ala Vai Pro Ile Gin Lys Vai Gin Aap Aap Thr Lya 20 25 30 ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG 200 Thr Leu Ile Lye Thr Ile Vai Thr Arg Ile Aan Aap Ile Ser Hia Thr 35 40 45 CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT 248 Gin Ser Vai Ser Ala Lys Gin Arg Vai Thr Gly Leu Aap Phe Ile Pro 50 5S 60 GGG CTT CAC ccc ATT CTG AST TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA 296 Gly Leu Hia Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lya Met Aap Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80 240 ΡΕ0777732 GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344

Vai Tyx Gin Gin Vai Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Aen Vai Leu Gin $5 90 95 ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392

Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440

Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pra Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro 115 120 125 GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488

Glu Ser Leu Asp Gly Vai Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Vai 130 135 140 GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG 536

Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin 145 150 155 160 TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA 588

Leu Asp Vai Ser Pro Glu Cys * 165 ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC 648 ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA 708 CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG 768 AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG 828 TCCCACCTGC TCCGGGTACA TG1TCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA 888 GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA 948 GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT 1008 TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT CAGGCTTTGG 1068 GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG 1128 CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG 1188 TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG 1248 ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA 1308 AGCAGATGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG 1368 TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT 1428 TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG 1488 ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA 1548 241 ΡΕ0777732 AAGCTACAGG CCTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACATTTGA 1608 GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTIGAT 1668 CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA 1726 TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCATTCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT 1786 GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT 1848 GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG 1906 CTTGGGTTTT TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT 1966 GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT 2026 CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG 2066 TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG 2148 GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA 2208 GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TATTGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC 2268 CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA 2328 TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTG GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA 2388 TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA catgaagttc 2448 ATTTATATTT CATAATACCG TATAGACACT gcttgaagtg TAGTTTTATA CAGTGTTTTA 2508 AATAACGTTG TATGCATGAA AGACGTTTTT ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA 2568 CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT 2628 AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC 2668 TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTITTGTG 2748 GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC 2793 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 168 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: Polipeptídeo de murino OB (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:2: 242 ΡΕ0777732

Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Vai Gin Ala Val Pro Xle Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr lie Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gin Ser Vai Ser Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu Kis Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 6S 70 75 80 Vai Tyr Gin Gin Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn val Leu Gin 85 90 95 Xle Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro 115 120 125 Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin 145 150 155 160 Leu Asp Vai Ser Pro Glu Cys + 165 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQtíÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 700 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA (A) DESCRIÇÃO: cDNA OB ser humano onde N representa qualquer nucleotidio

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Humano (ix) CARACTERÍ STICA: 243 ΡΕ0777732

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 46..546 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3: NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG 54

Met His Trp 1 GGA ACC CTG TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC 102 Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr val 5 10 15 CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 150 Gin Ala Vai Pro Ile Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 20 25 30 35 AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC 198 Lys Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val 40 45 50 TCC tcc AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC 246 Ser Ser Lys Gin Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 55 60 65 ccc ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA 294 Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai Tyr Gin 70 75 80 CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 342 Gin lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai ile Gin Ile Ser Asn as 90 95 GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG 390 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser Lye 100 105 110 115 AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG 438 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp ser Leu 120 125 130 GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 486 Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu 135 140 145 AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 534 Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu 150 155 160

A3C CCT GGG TGC TGAOGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT 58S

Ser Pro Gly Cys 165 TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC 645 CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG 700 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: 244 ΡΕ0777732 (A) COMPRIMENTO: 167 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: Polipeptídeo de OB ser humano (vi) FONTE ORIGINAL: humana (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:4:

Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 15

Phe Tyr Vai Gin Ala Vai Pro lie Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30

Thr Leu Ile Lys Thr ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Xle Ser Hie Thr 35 40 45

Gin Ser Vai Ser Ser Lys Gin Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60

Gly Leu His Pro ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80

Vai Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Ile Gin 85 90 95

Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala 100 105 110

Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125

Asp Ser Leu Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai 130 135 140

Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 145 150 155 160

Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 166 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 245 ΡΕ0777732 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: Polipeptídeo de murino de OB carecendo de Gin na posição 49 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Murino (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5:

Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 15 10 15

Ser Tyr Vai Gin Ala Vai Pro Xle Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lys 20 25 30

Thr Leu Ile Lys Thr Xle Vai Thr Arg Xle Asn Asp Xle Ser Kis Thr 35 40 45

Ser Vai Ser Ala Lys Gin Arg Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 50 55 60

Leu His Pro Xle Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai 65 70 75 80

Tyr Gin Gin Vai Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Vai Leu Gin Ile 85 90 95

Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe 100 105 110

Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu 115 120 125 . Ser Leu Asp Gly Vai Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Vai Vai 130 135 140

Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile I<eu Gin Gin Leu 145 150 155 160

Asp Vai Ser Pro Glu Cys 165 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 167 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 246 ΡΕ0777732 (A) DESCRIÇÃO: polipeptídeo ser humano OB carecendo Gin na posição 49 (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: SER HUMANO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:6:

Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 15

Phe Tyr Vai Gin Ala Vai Pro IIe Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lye 20 25 30

Thr Leu Xle Lys Thr Xle Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45

Ser Vai Ser Ser Lys Gin Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 50 55 60

Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser LyB Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai 65 70 75 B0

Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Ile Gin Ile 85 90 95

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe 100 105 110

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 115 120 125

Ser Leu Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai 130 135 140

Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu 145 150 155 160

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (A) DESCRIÇÃO: éxon 2G7 247 ΡΕ0777732

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:7: GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC 60 NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG 120 ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGAHATTTCA CACACG 175 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador ) (A) Iniciador 5' PCR para éxon 2G7

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:8: 18 y 22

CCAGGGCAGG AAAATGTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:9: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: Único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador ) (A) iniciador 3' PCR para éxon 2G7

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N° : 9 :

CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 248 ΡΕ0777732 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: peptideo (A) DESCRIÇÃO: peptideo de sinal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:10:

Mec Cys Trp Arg Pr o Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 15 10 15

Ser Tyr Vai Gin Ala Vai Pro 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:ll: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 287 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (plasmídeo) (A) DESCRIÇÃO: vetor de expressão pET-15b

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: Promotor T7 (B) LOCALIZAÇÃO: 20..37 (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: operador lac (B) LOCALIZAÇÃO: 39..64 (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 108..243 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: His-Tag (B) LOCALIZAÇÃO: 123..137 249 ΡΕ0777732 (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: Sítio de clivagem de trombina (B) LOCALIZAÇÃO: 184..196 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll: AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA £0 TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC 116

Mee Gly Ser 1 AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC 164 Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro Arg Gly Ser 5 10 15 CAT ATG CTC GAG GAT ccc GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG 212 His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lye Ala Arg Lys Glu Ala Glu 20 25 30 35 TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT 263 Leu Ala Ala Ala Thr 40 Ala Glu Gin *· AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG 2Ô7 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12:

Met Gly Ser Ser His His His Hls His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro 15 10 15

Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lye Ala Arg Lys 20 25 30

Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gin 35 40 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear 250 ΡΕ0777732 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador ) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador de 5'de murino

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:13: CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC 32 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE MOLÉCULA: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador 3' de murino

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:14: TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC 32 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:15: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador 5' ser humano

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:15: TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32 251 ΡΕ0777732 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador ) (A) DESCRIÇÃO: Humano 3' iniciador (iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:16 TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA 32 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(A) DESCRIÇÃO: Sítio receptor de emenda em OB

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Sítio receptor de emenda (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:17: AGCAGTCGGT A 11 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:18: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo 252 ΡΕ0777732

(A) DESCRIÇÃO: fragmento de peptídeo OB (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Murino (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18:

Vai Pro Ile Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lya Thr Leu Xle Lys Thr 1 5 10 is (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(A) DESCRIÇÃO: fragmento de peptídeo OB (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Camondongo (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:19:

Leu Hís Pro ile Leu Ser Leu Ser Lye Met Asp Gin Thr Leu Ala 1 5 10 1S (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptideo

(A) DESCRIÇÃO: fragmento de peptídeo OB (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Camondongo (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:20: ΡΕ0777732 - 253 -

Ser Lye Ser Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lye Pro Glu 15 10 IS

Ser Leu Asp (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (A) DESCRIÇÃO: fragmento de peptídeo OB (v) TIPO DE FRAGMENTO: Terminal carboxila (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Camondongo (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:21:

Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Vai 1 5 10 is

Ser Pro Glu Cys 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:22: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 414 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (A) DESCRIÇÃO: porção do gene OB ser humano incluindo sequência de não-codificação a montante do primeiro éxon, sequência de codificação de primeiro éxon, e região 5' de primeiro intron (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: ser humano 254 ΡΕ0777732 (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 38..181 (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: região 5' de primeiro intron (B) LOCALIZAÇÃO: 182..414 (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência de não-codificação 5' do gene OB ser humano a partir de que foi gerado o iniciador HOB lgF (B) LOCALIZAÇÃO: 11..28 (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência intrônica do gene OB ser humano a partir de que foi gerado o iniciador HOB IgR (B) LOCALIZAÇÃO: 241..260 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:22: GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA. ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55

Met His Trp Gly Thx Leu 1 5 TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG 103

Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Vai Gin Ala Vai 10 15 20 CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT 151

Pro Ile Gin Lya Vai Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr Ile 25 30 35 GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201

Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 40 45 CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261 AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321 ITGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381 GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:23: (i) CARACTERÍ ST ICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 255 ΡΕ0777732 (A) DESCRIÇÃO: Porção N-terminal da proteína OB humana codificada pelo primeiro éxon (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:23:

Met Hie Trp GXy Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 IS

Phe Tyr Vai Gin Ala vai Pro Ile Gin Lye Vai Gin Asp Asp Thr Lye 20 25 30

Thr Leu Ile Lys Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser Kie Thr 35 40 45 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 801 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (A) DESCRIÇÃO: porção do gene OB ser humano incluindo região 3' de primeiro íntron, sequência de codificação do segundo éxon, e sequência de não-codificação 3'

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: SER HUMANO (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 291..648 (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: 3' de primeiro íntron (B) LOCALIZAÇÃO: 1..290 (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência intrônica do gene HOB OB ser humano a partir de que foi gerado o iniciador HOB 2gF (B) LOCALIZAÇÃO: 250..269 256 ΡΕ0777732 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência de não-codificação 3' do gene OB ser humano a partir de que foi gerado o iniciador HOB 2gR (B) LOCALIZAÇÃO: 707..728 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:24: CTGGTTCITT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATO3GCCT 60 GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120 CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGAJíACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180 AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240 CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296

Gin Ser 1 GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC 344

Vai Ser Ser Lys Gin Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu 5 10 IS CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC 392

His Pro zie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai Tyr 20 25 30 CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC 440

Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Ile Gin Ile Ser 35 40 45 50 AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT 488 Αβη Αβρ Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser 55 60 65 AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC 536

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 70 75 80 CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC 584

Leu Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala 85 90 95 CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Txp Gin Leu Asp 100 105 110 CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA 688

Leu Ser Pro Gly Cys 115 GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC 748 TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: 257 ΡΕ0777732 (A) COMPRIMENTO: 119 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A)DESCRIÇÃO: porção C-terminal da proteína OB humana codificada pelo segundo éxon (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:25:

Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 1 5 10 15 Gly Leu His Fro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Mac Asp Gin Thr Leu Ala 20 25 30 Vai Tyx Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin 35 40 45 Ile Ser Asn ASp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 50 55 50 Fhe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu €5 70 75 80 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Θ5 90 95 Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 100 105 110 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 115 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Levedura pichia (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:26:

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 1 5 258 ΡΕ0777732 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: levedura pichia (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:27:

Glu Ala Glu Ala 1 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:28: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (v) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: levedura pichia (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:28:

Leu Glu Lys Arg 1 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:29: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: Iniciador de DNA HOB lgF gerado a partir da sequência de não-codificação 5' do gene ser humano de OB 259 ΡΕ0777732

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:29:

CCCAAGAAGC CCATCCTG lo (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍjÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: HOB IgR DNA iniciador gerado a partir da primeira sequência intrônica do gene ser humano de OB

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:30: GACTATCTGG GTCCAGTGCC 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: DNA iniciador de DNA HOB 2gF gerado a partir da primeira sequência intrônica do gene ser humano de OB

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:31: CCAesTGCTG AGCACTTGTT 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:32: 260 ΡΕ0777732 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: iniciador de DNA HOB 2gR gerado a partir da sequência de não-codificação 3' do gene ser humano de OB

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:32: CTTCAATCCT GGAGATACCT GG 22 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (A) DESCRIÇÃO: Sítio de clonagem pPIC.9

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO 51

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:33: CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) Iniciador 5'PCR para ampliar sequência de cDNA OB ser humano 261 ΡΕ0777732 (iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:34 GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG 40 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) PCR 3 ' iniciador para ampliar sequência de cDNA OB ser humano

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:35: GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C 31 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:36: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) Iniciador 5'PCR para ampliar sequência de cDNA OB de murino

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:36: GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:37: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : 262 ΡΕ0777732

(A) COMPRIMENTO : 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) Iniciador 3 'PCR para ampliar sequência murino (iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: SIM 31 N de proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:37: 6CGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:38: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: tetrapeptídeo no terminal OB de murino renaturada após clivagem de trombina (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Camondongo (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:38:

Gly Ser His Met 1 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:39: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1734 DE PCR específico de sítio etiquetado por sequência 263 ΡΕ0777732

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 19

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:39: CAAGACAAAT GAGATAAGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:40: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1734 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:40: AGAGTTACAG CTTTACAG 10 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:41: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS494 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 264 ΡΕ0777732 (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:41: CTAAACACCT TTCCATTCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:42: (i) CARACTERISTICAS DE SEQÚENCIA: (A) COMPRIMENTO : 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS494 etiquetado por sequência PCR especifico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQ(jÊNCIA: SEQ ID N° : 42 : TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:43: (i) CARACTERISTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS883 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 20ΡΕ0777732 265

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N° : 43 : TGCAOTAAGC TGTGATTGAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:44: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍJÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS 8 83 sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:44: GTGCAGCHT AATTGTGAGC 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:45: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS2359 sítio etiquetado por sequência (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:45: 18 18 266 ΡΕ0777732 AGTGTTGTGT TTCTCCTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:46: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2359 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N° : 46 : AAAGGGGATG TGATAAGTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:47: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2336 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:47: 18 ggtgttacgt ttagttac 267 ΡΕ0777732 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:48: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2336 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:48:

GGAATAATGA GAGAAGATTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:49: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS1218 sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:49:

GCTCAACTGA CAGAAAAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:50: 268 ΡΕ0777732 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1218 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:50: 20

GACTATOTAA AAGAAATGCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:51: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1402 etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:51: AAAGGGCTTC TAATCTAC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:52: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : 269 ΡΕ0777732 (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1402 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:52: CCTTCCAACT TCTTTGAC 19 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:53: (i) CARACTERISTICAS DE SEQljENCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS999 etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:53: TAAACCCCCT TTCTGTTC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:54: (i) CARACTERISTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 270 ΡΕ0777732 (C) (D) TIPO DE FILAMENTO: único TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) etiquetado DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS999 DE por sequência (iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano PCR específico de 13

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:54: TTGCATAATA GTCACACCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:55: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1751 sítio etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:55: CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:56: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único 22 ΡΕ0777732 271 (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: : DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1751 DE sítio etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 20

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:56: AAACCGAAGT TCAGATACAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:57: (i) CARACTERISTICAS DE SEQÍJÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1174 etiquetado por sequência DE PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:57: AATATCTGAC ATTGGCAC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:58: (i) CARACTERISTICAS DE SEQÍjÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) 272 ΡΕ0777732 (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1174 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:58: 1Θ 19

TTAGACCTGA GAAAAGAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:59: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO (B) TIPO: ácido (C) TIPO DE FIL (D) TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: (A) DESCRIÇÃO: sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:59: GTTGCACAAT ACAAAATCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:60: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS2061 DE PCR específico de sítio etiquetado por sequência 273 ΡΕ0777732

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:60: CTTCCATTAG TGTCTTATAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:61: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2588 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:61: ATCACTACAC ACCTAATC la (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:62: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2588 etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NAO

(iv) SEM SENTIDO: NÃO 274 ΡΕ0777732 (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:62: CCATTCTACA TTTCCACC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:63: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS808 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:63: GGCTGTGTGA GCAAGATCCT AGGA 24 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:64: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) sitio (A) etiquetado DESCRIÇÃO: Iniciador por sequência sWSS808 DE PCR especifico de

(iii) HIPOTÉTICO: NAO (iv) SEM SENTIDO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:64: (xi) ΡΕ0777732 275 TTGCCAGGCA AAGAGGGCTG GAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:65: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : 23 (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS1392 sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:65: CTCAGGTATG TCTTTATC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:66: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS1392 sítio etiquetado por sequência (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:66: TGTCTCTGCA TTCTTTTC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:67: 18 276 ΡΕ0777732 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1148 DE PCR específico de sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 18

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:67: GACACATACA AACACAAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:68: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS1148 DE sítio etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:68: ATTGAGTTGA GTGTAGTAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:69: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 19 277 ΡΕ0777732 (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS1529 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:69: CAGGGATTTC TAATTGTC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:70: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS1529 DE PCR especifico de sitio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:70: AAAAGATGGA GGCTTTIG 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:71: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) 278 ΡΕ0777732 (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2619 DE PCR especifico de sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍJÊNCIA: SEQ ID N°:71: CGTTAAGGGA AQGAACTCTG G 21 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:72: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍJÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador SWSS2619 DE PCR específico de sítio etiquetado por sequência

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍJÊNCIA: SEQ ID N° : 72 : 20

TGGCTTAGAG GAGTCAGGGA (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:73: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUENCIA :

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS404 etiquetado por sequência (iii) HIPOTÉTICO: NAO 279 ΡΕ0777732 (iv) SEM SENTIDO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: 18

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:73: ACCAGGGTCA ATACAAAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:74: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS404 etiquetado por sequência PCR especifico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:74: TAATGTGTCC TTCTTGCC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:75: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2367 etiquetado por sequência DE PCR especifico de

(iii) HIPOTÉTICO: NAO

(iv) SEM SENTIDO: NAO 280 ΡΕ0777732 (vi) FONTE ORIGINAL: 1Θ

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:75: CAATCCTGGC TTCATTTG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:76: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Iniciador sWSS2367 etiquetado por sequência PCR específico de

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N° : 76 : AAGGTGGGTA GGATGCTA 18 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:77: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador UT528

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:77: 281 ΡΕ0777732

TGCAGTAAGC TGTGATTGAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:78: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador UT528

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:78: GTGCAGCTTT AATTGTGftGC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:79: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii)TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMa065zg9

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:79: AGCTTCAAGA CTTTNAGCCT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:80: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : 282 ΡΕ0777732 (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMa065zg9

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:80: GGTCAGCAGC ACTGTGATT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:81: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMal25whl

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi)FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:81:

TCACCTTGAG ATTCCATCC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:82: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii)TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMal25whl ΡΕ0777732 283

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍiÊNCIA: SEQ ID N°:82: AACACCGTGG TCTTATCAAA 20

(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:83: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍiÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii)TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM309yfl0 (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi)FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍiÊNCIA: SEQ ID N° : 83 : CATCCAAGTT GGCAGTTTTT 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:84: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍENCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM309yfl0

(iii) HIPOTÉTICO: NAO

(iv) SEM SENTIDO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: 284 ΡΕ0777732

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:84 AGATGCTGAA TTCCCAGACA (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:85: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FIO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM218xflO

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:85 TGGGCAACAC AGCAAA (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:86: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍÍÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador)

(A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM218xflO

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍÍÊNCIA: SEQ ID N°:86 285 ΡΕ0777732 1 TdCAjSTTApT gccaatgtca (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 16 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM206xcl

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N° : 8 CCAGGCCATG TGGAAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:88: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM206xcl

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N° : 8 AGTTCTTGGC TTGCGTCAGT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:89: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : 286 ΡΕ0777732 (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM199xhl2

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 16

(A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:89: TCTGATTGCT GGCTGC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:90: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFM199xhl2

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:90: GCGCGTGTGT ATGTGAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:91: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear 17 287 ΡΕ0777732 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMa345wc9

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:91: AGCTCTTGGC AAACTCACAT 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:92: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: Marcador AFMa345wc9

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Ser humano (xi) DESCRIÇÃO DE SEQljÊNCIA: SEQ ID N°:92: GCCTAAfiGGA ATGAGACACA 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:93: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iniciador) (A) DESCRIÇÃO: iniciador para gene de murino

Pax4 288 ΡΕ0777732

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: camondongo (xi) DESCRIÇÃO DE SEQOÊNCIA: SEQ ID N°:93: GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:94: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 491 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (A) DESCRIÇÃO: met OB de murino recombinante

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: camondongo (ix) CARACTERÍ STICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 41..478 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:94:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG

Met Vai Fro Ile Gin 1 S

AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC ΤΓΑ ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT

Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Vai Thr Arg 10 15 20

ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTC TCC GCT AAA CAG CGT GTT

Xle Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Vai Ser Ala Lys Gin Arg Vai 25 30 35 24 (2) 55 103 151 289 ΡΕ0777732 ACC GGT CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC CCG ATC CTA AGC TTG TCC 199 Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser 40 45 50 AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG 247 Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai Tyr Gin Gin val Leu Thr Ser Leu 55 60 65 CCG TCC CAG AAC GTT CTT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC 295 Pro Ser Gin Asn vai Leu Gin Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg 70 75 80 85 GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343 Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin 90 95 100 ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA 391 Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala 105 110 115 TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439 Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser 120 125 130 CTT CAG GAC ATC CTT CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG GAA TGT TAATGGA 488 Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Vai Ser Pro Glu Cys 135 140 145 TCC 491 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:95: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 146 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: Proteína OB met de murino recombinante DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:95: (xi)

Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 1 5 10 15 Thr Ile Val Thr Arg Ile Aan Asp Ile Ser HiB Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30 Ala Lys Gin Arg val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin so 55 60 290 ΡΕ0777732

Vai Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin 6S 70

Leu Glu Aan Leu Arg Asp Leu Leu 85

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly 100

Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr 115 120

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp 130 135

Pro Glu Cys 145

Asn Val Leu Gin Xle Ala Aan Asp 75 80

Hia Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 90 95

Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp 105 110

Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 125

Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser 140 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:96: (i) CARACTERISTICAS DE SEQUENCIA : (A) COMPRIMENTO: 454 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (A) DESCRIÇÃO: met OB ser humano recombinante

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) SEM SENTIDO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: ser humano (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO X: 4..444 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N° : 96 :

CAT ATG gta ccg atc cag aaa gtt cag gac gac acc aaa ACC TTA ATT

Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 S 10 15

AAA ACG ATC GTT A CG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TOG GTG

Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val 20 25 30

AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC

Ser Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 48 96 144 291 ΡΕ0777732 CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192 Pro Zle Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai Tyr Gin 50 55 60 CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC 240 Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Leu Gin Ile Ser Asn 65 70 75 GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA 2SS Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi8 Vai Leu Ala Phe Ser Lya 80 S5 90 95 TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336 Ser Cyg Kls Τ.ΛΜ Pro Ala Caj* Gly Leu Glu Thr Leu Zken --r gar Leu 100 105 110 GGC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG 384 Gly Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu 115 120 125 TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG 432 Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu 130 135 140 TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC 454

Ser Pro Gly Cys 145 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:97: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQljÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 147 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (A) DESCRIÇÃO: Proteína met OB humana recombinante (xi) DESCRIÇÃO DE SEQOÊNCIA: SEQ ID N°:97:

Met Vai Pro Ile Gin Lye Vai Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 1 5 10 15 Thr Ile Vai Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Vai Ser 20 25 30 Ser Lye Gin Arg V&l Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Vai Tyr Gin Gin 50 55 60 Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vai Leu Gin Ile Ser Asn Asp 65 70 75 80 292 ΡΕ0777732

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Vai Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Vai Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Vai Vai Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:98: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÍjÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro 15 10 15

Arg Gly Ser His Met 20 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°:99: (i) CARACTERÍ STICAS DE SEQÍjÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (v) TIPO DE FRAGMENTO: His-tag N-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÍjÊNCIA: SEQ ID N°:99:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Vai Pro 1 5 10 15

Arg Gly Ser Pro 20

Lisboa, 21 de Dezembro de 2011

Claims

1 ΡΕ0777732 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeos de OB, capaz de modular o peso de corpo, seleccionado a partir do grupo: (a) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ou 6; (b) um fragmento biologicamente activo do polipeptídeo de (a), em que o referido fragmento biologicamente activo modula o peso de corpo do animal.

2. Um fragmento biologicamente activo de um polipeptídeo de OB de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fragmento activo é um fragmento imunogênico de qualquer das sequências de amino ácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ou 6, e ainda em que o referido fragmento imunogênico tem de comprimento pelo menos 10 aminoácidos e é capaz de gerar anticorpos específicos de polipeptídeo de OB.

3 . Um polipeptídeo de OB de acordo com a reivindicação 1, selecionado do grupo que consiste de polipeptídeos de SEQ ID NOS: 2, LO ou 6, em que (de acordo com numeração da SEQ ID NO: 4): (a) um ou mais resíduos nas posições 121 a 128 estão deletados; (b) resíduos 1 - 116 estão deletados; 2 ΡΕ0777732 (C) resíduos 1 - 21 e 5 4 , a 167 estão deletados; (d) resíduos 1 - 60 e 117 a 167 estão deletados; (e) resíduos 1 - 60 estão deletados; ou (f) resíduos 1 - 53 estão deletados. 4 . Um de OB de acordo com a reivindicação que o referido polipeptíde compreende ainda uma metionina N-terminal.

5. Um polipeptideo de OB recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6 . Um polipeptideo de OB quimicamente sintetizado acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

7. Um polipeptideo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 tendo uma ou mais porções químicas ligadas ao mesmo, em que a porção química é um polímero solúvel em água.

8. Um polipeptideo de OB da reivindicação 7, em que o polímero solúvel em água é polietileno glicol.

9. Um polipeptideo de OB da reivindicação 8 que está mono-, di-, tri- ou tetrapegilado.

10. Um polipeptideo de OB da reivindicação 9 que está N-terminal monopegilado. 3 ΡΕ0777732

11. Um polipeptídeo de OB da reivindicação 10 que é um polipeptídeo de OB compreendendo os resíduos de amino ácidos 22 a 167 da SEQ ID NO: 4 ou resíduos 22 a 166 da SEQ ID NO: 6.

12. Um polipeptídeo de OB da reivindicação 1 ou 10 que é um polipeptídeo de OB compreendendo a sequência de amino ácidos de resíduos 22 a 167 da SEQ ID NO: 4 ou resíduos 22 a 166 da SEQ ID NO: 6 e tendo ainda uma metionina na posição 21.

13. Uma molécula de ácido nucleico isolada, que codifica um polipeptídeo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 13 que compreende a sequência de codificação de proteína da SEQ ID NO: 3.

15. Uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 13 que compreende a sequência de codificação de amino ácidos 22 a 167 da SEQ ID NO: 3.

16. Uma molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que a referida molécula de ácido nucleico está marcada detectavelmente. 4 ΡΕ0777732

17. Um oligonucleotídeo, que é selecionado do grupo que consiste de: HOB IgF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO. 29); HOB IgR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO. 30); HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NO. 31); e HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO. 32).

18. Um vetor que compreende uma molécula de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15.

19. Um vetor de acordo com a reivindicação 18, que é um vetor de expressão que compreende uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 13, operativamente associada com uma sequência de controle de expressão.

20. Um hospedeiro unicelular transformado ou transfectado com uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 13 ou um vetor de expressão da reivindicação 19.

21. Um hospedeiro unicelular de acordo com a reivindicação 20, em que o hospedeiro unicelular é selecionado do grupo que consiste de bactérias, levedura, células de mamífero, células de planta, células de inseto, e células de seres humanos em cultura de tecido.

22. O hospedeiro unicelular de acordo com a reivindicação 21, em que o hospedeiro unicelular é 5 ΡΕ0777732 selecionado do grupo que consiste de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levedura, CHO, RI.I, B-W, LM, COSI, COS7, BSC1, BSC40 e BMT10 e células de Sf9, .

23 . Um hospedeiro unicelular de acordo com a reivindicação 21, em que o hospedeiro unicelular é um hospedeiro de levedura selecionado do grupo que consiste de Saccharomyces , Pichia, Candida, Hansenula e Torulopsis. 24. Um célula hospedeira de acordo com a reivindicação 21, em que a sequência de controle de expressão é uma sequência de controle de expressão de polipeptideo < de OB • 25. Um célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24, em que a inserção da sequência de controle de expressão é heteróloga relativamente à uma sequência de codificação de polipeptídeo de OB.

26. Um método para a preparação de um polipeptideo de OB, de qualquer uma das reivindicações 1-4, capaz de modular o peso de corpo, que compreende: (a) o cultivo de uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 20-25 sob condições que provêem expressão do polipeptideo de OB; e (b) a recuperação do polipeptideo de OB expresso. 6 ΡΕ0777732 27. 0 método de acordo com a reivindicação 26, em que a célula é uma bactéria ou uma levedura. 28. 0 método de acordo com a reivindicação 26 ou 27 que ulteriormente compreende: (c) cromatograf ar o polipeptídeo de OB em uma coluna de quelação de Ni; e (d) purificar o polipeptídeo de OB por filtração com gel. 29. 0 método de acordo com a reivindicação 28, que ulteriormente compreende, após a etapa (c) e antes da etapa (d) , cromatografar o polipeptídeo de OB em uma coluna de trocador de cátions forte.

30. Um anticorpo específico para o polipeptídeo de OB consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ou 6.

31. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 30, que é um anticorpo monoclonal ou policlonal.

32. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 31, marcado com uma marca detectável.

33. Uma linha de células imortais que produz um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 32. 7 ΡΕ0777732

34. Um método para a produção de um anticorpo específico para um polipeptídeo de OB, de qualquer uma das reivindicações 1 a 19, que compreende: (a) a conjugação de um polipeptídeo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou produzido pelo método das reivindicações 28 a 31 com uma proteína portadora; (b) a imunização de um animal hospedeiro com o conjugado de fragmento de polipeptídeo de OB-proteína portadora da etapa (a) misturado com um adjuvante; e (c) a obtenção de anticorpo a partir do animal hospedeiro imunizado.

35. Um método para medir a presença de um polipeptídeo de OB, de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em uma amostra, que comprende: (a) o contacto de uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo de OB com um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de OB sob condições que permitem a formação de complexos de reação que compreendem o anticorpo e o polipeptídeo de OB; e (b) a deteção da formação de complexos de reação que compreendem o anticorpo e o polipeptídeo de OB na amostra, em que a deteção da formação de complexos de reação indica a presença de polipeptídeo de OB na amostra. 8 ΡΕ0777732 36. 0 método de acordo com a reivindicação 35, em que o anticorpo é ligado a um suporte de fase sólida.

37. Um método in vitro para a avaliação do nivel de polipeptideo de OB, de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em uma amostra biológica, que compreende: (a) a deteção da formação de complexos de reação em uma amostra biológica de acordo com o método da reivindicação 34 ou 35; e (b) a avaliação da quantidade de complexos de reação formados, quantidade de complexos de reação essa que corresponde ao nivel de polipeptideo de OB na amostra biológica.

38. Um método in vitro para a deteção ou o diagnóstico da presença de uma doença associada com niveis elevados ou diminuídos de polipeptideo de OB em um indivíduo mamífero, que compreende: (a) a avaliação do nível de polipeptideo de OB em uma amostra biológica de um indivíduo mamífero de acordo com a reivindicação 35; e (b) a comparação do nível detectado na etapa (a) com um nível de polipeptideo de OB presente em indivíduos normais ou no indivíduo em uma época anterior, em que um aumento no nível de polipeptideo de OB quando comparado com níveis normais indica uma doença associada com niveis elevados de polipeptideo de OB, e 9 ΡΕ0777732 um nível diminuído de polipeptídeo de OB quando comparado com níveis normais indica uma doença associada com niveis diminuídos de polipeptídeo de OB.

39. Um método in vitro para a monitoração de um tratamento terapêutico de uma doença associada com níveis elevados ou diminuídos de polipeptídeo de OB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em um indivíduo mamífero, que compreende a avaliação dos níveis de polipeptídeo de OB em uma série de amostras biológicas, obtidas em diferentes pontos no tempo a partir de um indivíduo mamífero que está submetido a um tratamento terapêutico para uma doença associada com níveis elevados ou diminuídos de polipeptídeo de OB de acordo com o método da reivindicação 37.

40. Uma composição farmacêutica, que compreende um polipeptídeo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

41. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40 para a redução do peso de corpo de um animal.

42. Uma composição cosmética para melhoramento da aparência do corpo, para a redução do peso de corpo de um indivíduo, que compreende um polipeptídeo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um veículo aceitável. 10 ΡΕ0777732

43. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização na modificação do peso de corpo de um animal.

44. Polipeptideo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização na modificação do peso de corpo de um animal.

45. Polipeptideo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização na modificação do peso de corpo de um mamífero em tratamento de uma desordem selecionada do grupo que consiste de diabetes, pressão sanguínea alta e alto colesterol.

46. Polipeptideo de OB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização na modificação do peso de corpo de um mamífero para utilização em combinação com um medicamento para tratamento de diabetes, pressão sanguínea alta e alto colesterol.

47. Polipeptideo de OB da reivindicação 12, em que o polipeptideo de OB é SEQ ID NO. 97. Lisboa, 21 de Dezembro de 2011